Les techniques de la Les techniques de la biologie moléculairebiologie moléculaireLes techniques de la Les techniques de la biologie moléculairebiologie moléculaire
IntroductionIntroductionIntroductionIntroduction
• "Chercher une aiguille dans une meule de foin" ?
• Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...
•La réponse a ce problème :
Les techniques de la biologie moléculaire
L’électrophorèseL’électrophorèseL’électrophorèseL’électrophorèse
L’électrophorèse des acides nucléiques
• Déplacements de fragments d’acides nucléiques chargés selon leur taille sur un gel soumis a un champ électrique
Le gel utilisé
L’agarose pourles fragments d’ADN
de taille (0,5-20kb)
L’acrylamide pour lesfragments de moins
de 1000 pairesde base
L’électrophorèse en champs alternées
Principe• On change périodiquement
l’orientation du champ par a port au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .
Visualisation par autoradiographie
But
Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques
Remarque
• Les fragments d’acides nucléiques peuvent être séparer selon leur structure ;par exemple les différents formes d’un plasmide (ouvert ,linéaire ,surenroulé)
Remarque
• Elle permet aussi d’étudier des interactions des acides nucléiques avec des protéines
La centrifugationLa centrifugationLa centrifugationLa centrifugation
Centrifugation en gradient de saccharose
• Principe:
• Séparer les macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur
forme
Utilisations majeurs• Purification des phages• Sélection des fragments d’ADN
voulus• Isolement des polysomes• Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,
…)
Un exemple d'utilisation de la
centrifugation zonale : le fractionnement de
molécules d'ARN
Centrifugation en gradient de chlorure de
césium1. /Centrifugation isopycnique
(gradient continu)Utilisation d’une:
Solution de chlorure de césium(CsCl)
Utilisations majeurs• Préparation de plasmides et de
phages
Exemple: La purification des plasmides
2/ .Centrifugation sur coussin (gradient
discontinu)
Utilisation majeure
• préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.
• Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur coussin : la
purification des phages
La PCRLa PCRLa PCRLa PCR
Historique• En 1960 dans les sources de
Yellowstone aux U.S.A. « Thermus aquaticus » est découverte vivant à 70°C, trente ans plus tard son ADNpoly <Taq > est utilisée dans la PCR
• (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de molécule de l’année à la Taq polymérase)
Définition
• PCR « polymérase chain reaction ») technique d’amplification in vitro mis au point par le chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)
Principe
Faire progresser nos capacité d’analyse des gènes
Composés utilisés• L’ADN matrice• Amorces d’oligonucléotides • Une ADN polymérase• Des désoxyribonucléotides
triphosphate (dNTP)
Déroulement des cycles
d’amplification
• La dénaturation• L’appariement des primers• Elongation
Schéma de la PCR
ApplicationsLa PCR a apportée d’importantes
contributions dans beaucoup de domaines:
• Les maladies héréditaires• La recherche contre le cancer• Les sciences médico-légales • Les biotechnologies
L’hybridationL’hybridationL’hybridationL’hybridation
Généralités
Les techniques de l’hybridation reposent sur :
Complémentarité des
bases successives de
l’ADN
La réversibilité du processus de séparations deux brins d’ADN
Les cas possibles pour une hybridation
1. Hybridation stable (100%) 2. Pas d’hybridation3. Hybridation partielle (50%)
But
Repérer une molécule d’ADN ou d’ARN spécifique dans une
population hétérogène
Les différentes techniques
d’hybridation• Hybridation ADN/ADN :
Southern blotting • Hybridation ARN/ADN :
Northern blotting• Hybridation Dot-blotting et
slot-blotting
Southern
• Sonde ADN
• Cible ADN (nucléaire,
phagique plasmidique ou autres,…)
Northern
• Sonde ADN
• Cible ARN
Dot-blotting & Slot-blotting
• Sonde ADN
• Cible ARN ou ADN Monocaténaire
Conclusion
• Grace aux techniques de la biologie moléculaire les chercheurs ont pu établir une partie de la carte des gènes humains, et espèrent obtenir le séquençage de tous le génome humain a des fins thérapeutique, médicales, a titre de prévention
Référence• *Cours de l’institut national de recherche pédagogique • *Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007 Université de Paris –VI
Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie • *Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach’, (2), J. Mantz(1),
J.M. Desmontsl(1) (1) ‘Département d’anesthésie-réanimation chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ;
• (2)Laboratoire de neurologie du développement Paris • * Thèse de Licence d’informatique Année 2001-2002 Option :
Introduction à la biologie moléculaire • *Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D.
Tagu, C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris)• *Article du magazine La recherche édition spéciale < Les frontières
du vivant > N°317 Février 1999• * Participation à l’établissement d’une phylogénie moléculaire de
requins d’eau profonde de l’ordre des Squaliformes de L’Université de Nantes Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines
• *L’essentiel en génétique Edition : BERTI • *Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne &
Eric Clauser Edition Masson• *Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck