THESE DE DOCTORAT DE
L'UNIVERSITE DE NANTES
COMUE UNIVERSITE BRETAGNE LOIRE
ECOLE DOCTORALE N° 602
Sciences pour l'Ingénieur
Spécialité : « (Génie des Procédés) »
« Optimisation de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur » Thèse présentée et soutenue à « Nantes », le « 01/07/2019 » Unité de recherche : Laboratoire GEPEA, UMR CNRS 6144 Thèse N° :
Par
« Rémi NGHIEM-XUAN »
Rapporteurs avant soutenance : Réjean Tremblay Professeur, Université du Québec à Rimouski UQAR Ingrid Fruitier-Arnaudin Maître de conférences HDR, Université La rochelle
Composition du Jury :
Président : Philippe Michaud Professeur, Université Clermont-Auvergne Examinateurs : Philippe Michaud Professeur, Université Clermont-Auvergne
Ian Probert Docteur, Station Biologique de Roscoff Dir. de thèse : Pascal Jaouen Professeur, Université de Nantes Co-dir. de thèse : Jérémy Pruvost Professeur, Université de Nantes Co-enc. de thèse : Vincent Turpin Maître de conférences, Université de Nantes
Invité(s) Isabelle Rouillard Docteur, école Centrale de Nantes
Remerciements
La thèse est une expérience exceptionnelle et bien plus riche en enseignements que
ce à quoi je m’attendais et remercier toutes les personnes qui m’ont accompagné dans ce
projet me semble être une bonne conclusion, que vous lirez certainement en premier.
Tout d’abord, rien n’aurait pu être possible sans le professeur Pascal Jaouen qui
m’a accueilli au GEPEA et m’a permis de réaliser cette thèse passionnante. Un très grand
merci à mon co-directeur Jérémy Pruvost qui m’a beaucoup appris scientifiquement, m’a
apporté ses conseils et a su m’encourager dans cette épreuve. J’exprime également toute
ma gratitude à mon co-encadrant de thèse le docteur Vincent Turpin pour avoir fourni les
souches d’Haslea ostrearia, son encadrement sur sa culture ainsi que sa patience pour mes
erreurs d’orthographe. J’exprime également toute ma gratitude au professeur Jean-Luc
Mouget pour m’avoir prodigué ses conseils et son expertise sur cette souche de
microalgue.
Je remercie sincèrement les membres du jury de m’avoir fait l’honneur d’examiner
et d’évaluer mon travail. Merci au professeur Réjean Tremblay et au docteur Ingrid
Fruitier-Arnaudin d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse. Merci au docteur Ian
Probert et au professeur Philippe Michaud ainsi qu’à notre invité, le docteur Isabelle
Rouillard pour leur intérêt et leur disponibilité.
Merci à l’administration du GEPEA et plus particulièrement à Carole, Laurette et
Marie-Pierre pour leur aide, leur bonne humeur ainsi que leur efficacité.
Je remercie chaleureusement tout le service technique sans qui le laboratoire ne
fonctionnerait pas, Hélene, Emmanuel, Benjamin, Raphaëlle, Catherine, Jordan, Guillaume,
Delphine, Laurence, Franck et Sébastien Chollet, Merci pour tout.
Un grand merci à tous les maîtres de conférences qui m’ont aidé dans les
différentes étapes de cette expérience : Olivier Gonçalves, Luc Marchal, Estelle Couailler
ainsi que Vona Meleder.
Je remercie particulièrement Christophe Lombard, merci de m’avoir permis de
faire cette thèse et pour nos longues discussions scientifiques et personnelles toujours
très riches.
Je tiens à exprimer également tous mes remerciements à la formidable équipe de
doctorants du GEPEA qui ont permis de créer une ambiance inoubliable. Merci à Vladimir,
ce poète philosophe qui reste une des plus belles rencontres de cette expérience et bien
sûr Jérémy sans qui les aventures en terre d’hyborée seraient évidemment moins
amusantes (Pfff se marier à une danseuse itinérante… Même pas Kithane). Je remercie
tous les autres avec qui j’ai vécu aussi d’incroyables moments, Alexandra (pour toute ta
joie), Philippe (j’espère que tu prends bien soin de mes plantes ?!), Lisa, Antoinette (c’est
grâce à toi que les corrections se sont terminées), Aumaya, Astrid, Marlène, Antoine
(Houm posso !), Guillaume, Eglantine, Armel, Dounia, Fernando, Brieuc, Rozine, Razmig,
Rémy, Erica, Charlène, mais aussi les nouveaux venus, Julien, Joris, et Sim, je vous souhaite
tout le meilleur pour vos thèses.
Merci à ceux qui m’ont prêté main forte durant mes expériences, Ikha pour son
positivisme et sa joie de vivre ainsi que tous les week-ends qu’elle a donné pour ce projet
et pour moi (ne perds jamais ça, c’est unique !), Rebiha pour sa bonne humeur et Gaetan
pour son investissement dans le projet. Merci aussi à Edouard Duliège de l’école
supérieure de physique et de chimie industrielle pour ses échanges et encouragements.
Je tiens à remercier Algosource avec Olivier Lepine et Christophe Lombard qui
m’ont orienté vers cette thèse et aussi à mon époque Thomas, Stéphanie, Sébastien
Jubeau, Arnaud, François, Fanny et Jérôme, je vous souhaite le meilleur.
Je vais remercier ma famille pour tout ce qu’elle a fait pour moi. Papa, Maman,
merci pour avoir supporté de toutes vos ressources, mon humeur, mes doutes, mes
excentricités, mes études et mes peines. Anicq ma tati préférée, merci à toi d’être présente
dans les moments douloureux et de rendre les choses plus simples de ton sourire. Zazou,
Nico, merci de votre présence et votre bonheur, qui suffit au mien. Merci de m’avoir donné
ma petite licorne Kim qui me donne le plaisir de la gâter. Merci à feu ma grand-mère
Fernande, qui m’a transmis sur mon visage d’abord timide et fermé, la joie et la chaleur
du nord de la France. Pour finir, Adrick mon ami, tu es celui qui m’a soutenu et inspiré
durant ces trois ans, je ne sais comment te remercier mais sans toi, je n’aurais sûrement
pas été au bout de cette expérience. J’ai conscience de ce que je t’ai fait vivre, ce qui rend
ma gratitude d’autant plus grande, merci pour tout.
Je n’oublie pas mes chers amis des univers parallèles, Incérion, Gendhis, Phygorn,
Meaban, ma sista Phaere, Tenkeï (quand est-ce qu’on la voit ?), Samanosuké, Irinie,
Zenyatta, Ashrogdan, BB-H et tellement d’autres.
Merci Val et Seb d’avoir trouvé et cultivé chez moi quelques choses que je ne
pensais pas posséder.
Bref, alors que ces remerciements semblent annoncer la fin d’une histoire, affûtez
vos lames ! Sortez vos flèches ! Car en réalité, pour moi, elle ne fait que commencer...
Listes des communications
Conférences :
- EXOBIO 10 juin 2016, Nantes, France: R. Nghiem Xuan, J. L. Mouget, J. Pruvost, V.
Turpin, P. Jaouen. Développement d'un bio-procédé d'immobilisation cellulaire
passif et actif d’haslea ostrearia pour la production de marennine en continu
(Orateur)
- AG AMI 22 mars 2016, Nantes, France: R. Nghiem Xuan, J. L. Mouget, J. Pruvost, V.
Turpin, P. Jaouen. Développement d’un bio-procédé de production en continu de
marennine issue d’une culture immobilisée d’Haslea ostrearia (Orateur)
- Séminaire GEPEA 13 octobre 2016, Saint-Nazaire, France: R. Nghiem Xuan, J. L.
Mouget, J. Pruvost, V. Turpin, P. Jaouen. Développement d’un bio-procédé de
production en continu de marennine issue d’une culture immobilisée d’Haslea
ostrearia (Orateur)
- EABA December 2017 Berlin, Allemagne: R. Nghiem Xuan, A. Busnel, J. Pruvost, P.
Jaouen. From lab to industry; a universal methodology to overcome the scaling-up
challenge of sensitive diatoms and cyanobacteria strains cultures (Orateur)
Poster
- International Society of Applied Phycology (ISAP) juin 2017 Nantes: R. Nghiem
Xuan, J. L. Mouget, J. Pruvost, V. Turpin, P. Jaouen. Bioprocess development for
marennine production with the diatom Haslea ostrearia
Publications
- R. Nghiem Xuan, I. Safitri, J. L. Mouget, J. Pruvost, V. Turpin, P. Jaouen. Design of an
artificial culture medium to optimize Haslea ostrearia biomass and marennine
production. Algal Research (Accepté sous conditions de corrections mineures
08/05/2019)
- R. Nghiem Xuan, J. L. Mouget, J. Pruvost, V. Turpin, P. Jaouen. Investigation of Haslea
ostrearia cellular fragility and consequences on stirring strategy in conventional
photobioreactor culture. (En cours de rédaction)
- R. Nghiem Xuan, J. L. Mouget, J. Pruvost, V. Turpin, P. Jaouen. Haslea ostrearia
culture in mixed photobioreactor: growth parameters gathering and marennine
production optimization. (En cours de rédaction)
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE 1
Chapitre I : 6
Etude bibliographique 6
7 LA DIATOMEE HASLEA OSTREARIA (SIMONSEN, 1974) 7
7.1 TAXONOMIE 7
7.2 CYTOLOGIE 8
7.3 REPRODUCTION 9
7.3.1 REPRODUCTION ASEXUEE 10
7.3.2 REPRODUCTION SEXUÉE 11
7.4 L’ECOSYSTEME EN CLAIRE OSTREICOLE 11
7.5 PHOTOSYNTHESE 14
7.6 LA COMPOSITION PIGMENTAIRE 19
8 LA MARENNINE 21
8.1 LA STRUCTURE CHIMIQUE 21
8.2 LES PROPRIETES PHYSICO-BIOCHIMIQUES DE LA MARENNINE 22
8.2.1 LES PROPRIETES BIOCHIMIQUES 22
8.2.2 LES PROPRIETES PHYSIQUES 26
8.3 LE METABOLISME DE PRODUCTION DE MARENNINE 27
9 VALORISATION DE LA BIOMASSE 30
9.1 LES PIGMENTS 30
9.1.1 LA MARENNINE INTRACELLULAIRE 30
9.1.2 LA FUCOXANTHINE 30
9.2 LES LIPIDES 31
10 CARACTERISATION DE LA FRAGILITE CELLULAIRE 32
10.1 NOTIONS DE CISAILLEMENT 32
10.1.1 LA DEFORMATION D’UN FLUIDE : L’ECOULEMENT LAMINAIRE ET TURBULENT 32
10.1.2 LES FLUIDES NEWTONIENS ET LA VISCOSITE 33
10.2 LES CONTRAINTES DE CISAILLEMENT EN PHOTOBIOREACTEUR 34
10.2.1 TECHNOLOGIE AIRLIFT 35
10.2.2 TECHNOLOGIE TORIQUE 38
10.3 L’IMPACT DES CISAILLEMENTS SUR LES ORGANISMES MICROSCOPIQUES UNICELLULAIRE LIBRE ET EN TISSUS 41
10.3.1 LA SENSIBILITE DES MICROALGUES/CYANOBACTERIES/TISSUS D’ORGANISMES PLURICELLULAIRES 41
10.3.2 LA CARACTERISATION DE LA FRAGILITE D’HASLEA OSTREARIA 50
11 LA CULTURE MICROALGALE EN PHOTOBIOREACTEUR 59
11.1 LES SYSTEMES DE CULTURE OUVERTS 60
11.2 LES SYSTEMES DE CULTURE FERMES 63
11.3 FACTEURS LIMITANTS DE LA CROISSANCE MICRO-ALGALE 65
11.3.1 LA LUMIERE 65
11.3.2 LA TEMPERATURE 69
11.3.3 LE PH 71
11.3.4 LA COMPOSITION DU MILIEU DE CULTURE 73
11.3.5 L’AGITATION 76
11.4 LA CULTURE D’HASLEA OSTREARIA EN PHOTOBIOREACTEUR 77
11.4.1 CULTURE EN CELLULES LIBRES AGITEE 77
11.4.2 CULTURE EN CELLULE IMMOBILISEES 79
CONCLUSION 86
Chapitre II: 90
Matériel et méthodes 90
1 MATERIEL BIOLOGIQUE 91
1.1 HASLEA OSTREARIA 91
1.2 NANNOCHLOROPSIS GALITANA 92
1.3 CHLORELLA VULGARIS 92
2 TECHNIQUES DE MESURE 93
2.1 SUIVI DE LA DENSITE NUMERIQUE EN CELLULES 93
2.1.1 COMPTAGE CELLULAIRE 93
2.2 SUIVI PIGMENTAIRE 95
2.2.1 MESURE DE LA CHLOROPHYLLE A, C ET DES PIGMENTS CAROTENOÏDES 95
2.2.2 MESURE DE LA MARENNINE 96
2.3 SUIVI DE LA COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE 97
2.3.1 DOSAGE DES IONS NITRATE ET PHOSPHATE DISSOUS 97
2.3.2 DOSAGE DES IONS SILICATES 97
2.3.3 DOSAGE DU CARBONE ORGANIQUE DISSOUS 97
2.4 MESURE DU RENDEMENT PHOTOSYNTHETIQUE FV/FM 98
3 MATERIEL DE CULTURE 99
3.1 LES MILIEUX DE CULTURES 99
3.2 SYSTEMES DE CULTURE 101
3.2.1 CULTURES EN VERRERIE CHIMIQUE 101
3.2.2 CULTURE EN FLASQUES 101
3.2.3 CULTURE EN PHOTOBIOREACTEUR 102
3.3 MODES DE CULTURE 109
3.3.1 CULTURE EN BATCH 109
3.3.2 CULTURE EN MODE SEMI-CONTINU 110
3.3.3 CULTURE EN CONTINU 110
3.4 APPLICATION DU FLUX D’ENERGIE LUMINEUX 111
3.5 METHODE D’IMMOBILISATION CELLULAIRE PAR INCLUSION EN GEL D’AGAR 112
3.6 METHODE D’IMMOBILISATION CELLULAIRE PAR INCLUSION EN BILLES D’ALGINATE 113
3.7 TECHNIQUES DE STERILISATION DES PBRS 113
3.8 APPLICATION DES CONTRAINTES DE CISAILLEMENT EN RHEOMETRE 113
Chapter III: 115
Design of an artificial culture medium to optimize Haslea
ostrearia biomass and marennine production 115
1 ABSTRACT: 116
2 INTRODUCTION 117
3 MATERIAL AND METHODS 118
3.1 ORGANISM AND CULTURE MAINTENANCE 118
3.2 THE CULTURE MEDIA TESTED 119
3.3 MACRO AND MICRO NUTRIENTS CONCENTRATION TESTS 119
3.4 GENERAL APPROACH TO INVESTIGATE MIXOTROPHIC AND AUTOTROPHIC GROWTH 120
3.5 MATERIAL FOR THE NEW MEDIUM ASSESSMENT AND PRODUCTIVITY VALIDATION 122
3.6 STATISTICS 122
4 RESULTS 123
4.1 DETERMINATION OF KEY NUTRIENTS RESPONSIBLE FOR HASLEA OSTREARIA GROWTH 123
4.2 EFFECT OF ORGANIC AND INORGANIC SOURCES OF CARBON AND PHOSPHORUS ON HASLEA GROWTH 124
4.3 DETERMINATION OF INORGANIC C AND P SOURCE CONCENTRATION IN NATURAL SEAWATER CULTURE MEDIUM
127
4.4 COMPONENT INTERACTION AND MEDIUM PRECIPITATION 130
4.5 STUDY OF THE IMPACT OF MICRONUTRIENTS ON BIOMASS AND MARENNINE PRODUCTION IN ARTIFICIAL
SEAWATER MEDIUM 132
4.6 VALIDATION OF THE ARTIFICIAL SEAWATER NX MEDIUM IN A PHOTOBIOREACTOR 134
5 DISCUSSION 136
6 CONCLUSION 139
7 SUPPLEMENTAL INFORMATION 141
ARTIFICIAL SEAWATER CULTURE MEDIUM (NX) FOR PBR CULTURE 141
8 REFERENCES 146
Chapter IV: 151
Investigation of Haslea ostrearia cellular fragility and
consequences of stirring strategy in conventional
photobioreactor culture 151
1 ABSTRACT: 152
2 INTRODUCTION 153
3 MATERIALS AND METHODS 155
3.1 INOCULUM AND CULTURES FOR PRELIMINARY EXPERIMENTS IN RHEOMETER AND FLASKS 155
3.2 MEASUREMENT OF CELL VIABILITY 156
3.3 PHOTOSYNTHETIC EFFICIENCY AND PIGMENTS MEASUREMENT 157
3.4 DETERMINATION OF MEAN RATE OF PHOTON ABSORPTION (MRPA) 158
3.5 CHARACTERIZATION OF SHEAR STRESS INFLUENCE ON H. OSTREARIA 160
3.5.1 INVESTIGATION IN RHEOMETER 160
3.5.2 EFFECT OF SHEAR STRESS IN STIRRED FLASKS 161
3.5.3 INVESTIGATION IN TORUS-SHAPED PBR 162
3.6 STATISTICS 163
4 RESULTS 164
4.1 EFFECT OF SHORT-TERM APPLICATION OF HOMOGENEOUS AND CONSTANT SHEAR STRESS 164
4.1.1 INVESTIGATION OF EXPERIMENT DURATION IN RHEOMETER TREATMENT 164
4.1.2 EFFECT OF VISCOSITY ON CELL VIABILITY BY RHEOMETER TREATMENT 165
4.1.3 INVESTIGATION IN DAY/NIGHT CYCLES 167
4.2 EFFECT OF LONG-TERM APPLICATION OF HYDRODYNAMICS SHEAR STRESS IN TURBULENT FLOW 169
4.2.1 INVESTIGATION OF STIRRING AND DARK/NIGHT ILLUMINATION EFFECTS ON H. OSTREARIA IN FLASK CULTURE
169
4.2.2 INVESTIGATION OF MIXING EFFECT IN TORUS SHAPED PHOTOBIOREACTOR 170
5 DISCUSSION 176
6 CONCLUSIONS 178
7 REFERENCES 180
Chapter V: 185
Haslea ostrearia culture in photobioreactor: growth
parameters gathering and marennine production
optimization 185
1 ABSTRACT: 186
2 INTRODUCTION 188
3 MATERIALS AND METHODS 189
3.1 CULTURE MEDIA FOR PRODUCTION IN PBR 189
3.2 CELLS DENSITY AND BIOMASS CONCENTRATION MEASUREMENT 189
3.3 DETERMINATION OF PIGMENT CONCENTRATION 190
3.4 NUTRIENTS CONCENTRATION MEASUREMENT 190
3.5 DETERMINATION OF THE MEAN RATE OF PHOTONS ABSORPTION (MRPA) 190
3.6 STATISTICS ANALYSIS 191
3.7 HASLEA OSTREARIA CULTURE 191
3.7.1 INOCULUM 191
3.7.2 IMMOBILIZED CELL PBR 191
3.7.3 AIRLIFT PBR 1L AND 6L 192
3.7.4 AIRLIFT CRYSTAL PBR 194
4 RESULTS 195
4.1 IMMOBILIZED-CELL CULTURE 195
4.2 HASLEA OSTREARIA CULTURE IN CRYSTAL PBR 197
4.2.1 INVESTIGATION OF CO2 TOLERANCE OF HASLEA OSTREARIA IN BATCH CULTURE 197
4.2.2 ASSESSMENT OF HALSEA OSTREARIA GROWTH IN CONTINUOUS MIXED CULTURE 199
4.3 INVESTIGATION OF NUTRIENT CONSUMPTION IN PBR CULTURE 200
4.3.1 CARBON CONSUMPTION 200
4.3.2 SILICON, NITROGEN AND PHOSPHORUS CONSUMPTION 202
4.4 THE INGATHERING OF OPTIMAL GROWTH PARAMETERS FOR BIOMASS AND EMN PRODUCTIONS 205
4.4.1 LIGHT TOLERANCE AND CELL RESPONSE 205
4.4.2 PH 207
4.4.3 TEMPERATURE 209
4.4.4 PHYSIOLOGIC STRESS FOR EMN OVERPRODUCTION 211
4.5 TOWARDS AN OPTIMIZED PRODUCTION PROTOCOL 214
4.5.1 EMN CONCENTRATION IMPACT ON PROCESS PRODUCTIVITY 214
4.5.2 IMPLEMENTATION OF EMN CONTINUOUS PRODUCTION PROCESS 217
5 DISCUSSION 219
6 CONCLUSIONS 222
7 REFERENCES 224
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 229
NOMENCLATURE 237
BIBLIOGRAPHIE 239
Table des figures
Figure 1: La phylogénie d'Haslea ostrearia au sein des Eucaryotes des grandes Classes
d’algues ................................................................................................................................................................ 7
Figure 2: Haslea ostrearia au microscope optique, légendé ........................................................... 8
Figure 3: Représentation connective du frustule des diatomées (frustule) ............................. 8
Figure 4: zone centrale de la valve (3) extérieure (4) intérieure SEM (Smithsonian Marin
Station, 2015) .................................................................................................................................................... 9
Figure 5: zone apicale du frustule SEM (Smithsonian Marin Station, 2015) ........................... 9
Figure 6: Représentation de la re-distribution du frustule au cours de la croissance
d'Haslea ostrearia ......................................................................................................................................... 10
Figure 7: Haslea ostrearia déformé au microscope optique ........................................................ 10
Figure 8: Courbe de température moyenne annuelle en Baie de Bourgneuf (Climate data)
............................................................................................................................................................................. 12
Figure 9: représentation du cycle tychopélagique d'Haslea ostrearia dans une claire à
huîtres (D’après Robert, 1983) ............................................................................................................... 13
Figure 10: Relation écologique entre Haslea ostrearia et Crassostrea gigas en claire à
huître ................................................................................................................................................................. 14
Figure 11: Représentation de mécanisme de phase claire dans le phénomène de
photosynthèse. .............................................................................................................................................. 15
Figure 12: Représentation schématique du cycle de Calvin. ....................................................... 16
Figure 13: Schémas des cycles de l'activité oxygénase et carboxylase de l'enzyme
RuBisCO. ........................................................................................................................................................... 17
Figure 14: Représentation de la compostions pigmentaire des photosystèmes et la
circulation de l'énergie lumineuse chez une chlorophycée ......................................................... 19
Figure 15: Spectre d'absorption des pigments photosynthétiques (Devred et al., 2014) 20
Figure 16: 2D RMN (a) Spectre 1H–13C EMn d’Haslea ostrearia Correspond au spectre
1D 1H (Gastineau et al., 2014) ................................................................................................................. 21
Figure 17: Observation de marennine EMn à pH basique (gauche) et acide (droite)
(Jubeau, 2009) ............................................................................................................................................... 26
Figure 18: Absorbance de l'IMn (a) et EMn (b) en fonction du pH (Pouvreau et al.,2006)
............................................................................................................................................................................. 26
Figure 19: Courbes de croissance d’Haslea ostrearia sous lumière blanche (WL), bleu
(BL), vert (GL), jaune (YL), ou rouge (RL) à faible (20μmol photons m−2 s−1) et fort
intensité lumineuse (100μmol photons m−2 s−1) (Mouget et al., 2005) .................................. 28
Figure 20: Contenu en marennine de cellules d’Haslea ostrearia de différentes tailles
(longueur de cellule) produites sous lumière bleu (⧯) ou blanche (⧮) (Mouget et al.,
2005) ................................................................................................................................................................. 29
Figure 21: Cinétique de production de marennine et absorption de nitrate par des
cellules d'Haslea ostrearia immobilisées dans le gel d’agar (Lebeau et al., 2000) .............. 30
Figure 22: écoulement autour d’un cylindre, (Gauche : laminaire Rex< 5×105), (Droit :
turbulent Rex> 5×105) ................................................................................................................................ 33
Figure 23: Représentation de la circulation de la phase liquide en photobioréacteur
Airlift 1L ........................................................................................................................................................... 35
Figure 24: Simulation MFN du champ de vitesse de la phase liquide, coloré par intensité
de vitesse superficielle (m. s-1). (a) représente une Airlift 1L, (b) représente un Airlift
100L (Ndiaye et al., 2018) ......................................................................................................................... 37
Figure 25: schéma du pilote laboratoire Torique de production contrôlée de microalgues
(Artu, 2016) .................................................................................................................................................... 38
Figure 26: Représentation de la géométrie (Gauche) du PBR torique avec ses
dimensions, (Droite) de 2 types d'hélice utilisé pour l'agitation du PBR torique (Pruvost
et al., 2006) ..................................................................................................................................................... 39
Figure 27: Prédiction de la vitesse moyenne du fluide en PBR torique UO en fonction de
la vitesse de rotation des 2 types d'hélices (Fig. 25) utilisées en Torique (Pruvost et al.,
2006) ................................................................................................................................................................. 40
Figure 28: Prédiction des valeurs globales (VY), ε et εimp en fonction de la vitesse
moyenne du flux en PBR Torique (Pruvost et al., 2006) ............................................................... 40
Figure 29: (Gauche) plage de la baie Laguna Grande de nuit, Porto Rico et observation de
bioluminescence sur les vagues ; (droite) isolement du consortium bioluminescent en
laboratoire ....................................................................................................................................................... 46
Figure 30: Observation en microscopie optique de la dinoflagellé Pyrocystis lunula,
(Gauche) sans agitation sous lumière ; (Droite) après agitation sans lumière .................... 47
Figure 31: Observation en microscopie optique de la lignée cellulaire Sf9 de tissu
ovarien de Spodoptera frugiperda, (Gauche) culture adhérente en tissu ; (Droite) culture
libre agitée ....................................................................................................................................................... 47
Figure 32: Cinétique de croissance de culture après traitement en pompe péristaltique
(Q=25 L. h-1) selon le nombre de passage (étoile) témoin, + (croix) 10 passages, o
(rond) 100 passages, ◻ (carré) 250 passages (Rossignol, 1999).............................................. 51
Figure 33: Influence de la puissance et de la durée de sonication sur le cassage des
cellules d'Haslea ostrearia, V=300ml, □ (carrée) 550W, △ (triangle) 400W, ○ (rond)
300W (Rossignol 1999) ............................................................................................................................. 52
Figure 34: Influence du volume de suspension traité sur le cassage cellulaire d'Haslea
ostrearia, P=550W, ◼ (Carré) 90s, ◻ (blanc) 60s (Rossignol 1999) ....................................... 52
Figure 35: Observation de cellules d'Haslea ostrearia après traitement aux ultrasons par
microscopie électronique à balayage : t=40s, P=400W, V=200mL (document LBM -
ISOMer) ............................................................................................................................................................ 53
Figure 36: Influence de la pression du système de broyage haute pression sur le cassage
cellulaire et la libération de marennine dans le milieu (1 cycle), ♦ (losange) dommages
cellulaires, + (croix) diamètre moyen des particules, ● (rond) marennine libérer
(Rossignol 1999) .......................................................................................................................................... 53
Figure 37: Influence du nombre de cycle du système de broyage haute pression sur la
répartition de la taille des particules par granulométrie laser, (carré plein) culture
initiale ; (carré vide) 30 MPa, 1 cycle ; (étoile) 30 MPa, 5 cycles ; o (rond) 150 MPa, 1
cycle. (Rossignol 1999) .............................................................................................................................. 54
Figure 38: Observation d'Haslea ostrearia par microscopie électronique à balayage (a)
avant traitement, (b) après traitement (1 cycle 30 MPa) (Rossignol 1999) ......................... 54
Figure 39: Observation de cellules d'Haslea ostrearia au microscope électronique à
balayage avant (Gauche) et après passage dans une pompe à engrenage (Droite) (5L,
15min, 350 L. h-1) (document LBM - ISOMer) ................................................................................... 55
Figure 40: Comparaison des répartitions granulométriques d'une culture d'Haslea
ostrearia avant ⦁ (rond) et après 100 passages ◻ (carré) dans la pompe à engrenages
(300 L. h-1) (Rossignol 1999) ................................................................................................................... 55
Figure 41: Dégradation cellulaire en fonction du nombre de passages et du débit de
circulation ◼ (carré) 200 L. h-1, ▲ (triangle) 300 L h-1, ● (rond) 400 L. h-1 (Rossignol
1999) ................................................................................................................................................................. 56
Figure 42: Influence de l'accélération centrifuge sur la dégradation cellulaire et la
libération de marennine (Rossignol 1999) ........................................................................................ 57
Figure 43: Influence de la durée de centrifugation sur la dégradation cellulaire et la
libération de marennine (Rossignol, 1999) ....................................................................................... 57
Figure 44: Comparaison de la granulométrie des suspensions selon la méthode de
cassage cellulaire (Rossignol 1999) ...................................................................................................... 58
Figure 45: Infrastructures de production de spiruline de la compagnie Sosa Texcoco
1960 ................................................................................................................................................................... 60
Figure 46: Vue aérienne d'une culture de Dunaliella salina à Hutt lagoon, Australie
(infrastructure BASF) ................................................................................................................................. 61
Figure 47:Vue aérienne des raceways de Cyanotech Co Hawaii, USA ..................................... 61
Figure 48: PBR cascade à Trebon, république Tchèque (Malapascua et al., 2014) ............ 62
Figure 49: Système fermé de production d'Algatechnologie, Israël
(http://WWW.algatech.com) ................................................................................................................... 63
Figure 50: Culture d'Arthrospira platensis en photobioréacteur Airlift, GEPEA (Gauche).
Culture de Chlorella vulgaris en photobioréacteur Torique, Algosolis (droite) ................... 64
Figure 51: Profil d'atténuation lumineuse pour un PBR plan en régime photo-inhibé
(Prusvot et Cornet, 2012).......................................................................................................................... 66
Figure 52: Profil d'atténuation lumineuse pour un PBR plan en régime luminostat
(Prusvot et Cornet, 2012).......................................................................................................................... 67
Figure 53: Profil d'atténuation lumineuse pour un PBR plan en régime photolimité
(Pruvost et Cornet, 2012).......................................................................................................................... 67
Figure 54: Evolution de la productivité surfacique en biomasse de Chlorella vulgaris en
fonction de la température (PFD =130 μmolhv. m-2. s-1) (Souliès 2014) ................................. 70
Figure 55: effet de la température sur le taux de croissance de Phaeodactylum
tricornutum, Scenedesmus sp., Dinobryon divergens et Porphyridium cruentum (Ras et al.,
2013) ................................................................................................................................................................. 71
Figure 56: Représentation des fractions molaires de carbone dissous en fonction du pH à
25°C (Kaplan et al., 1986) .......................................................................................................................... 73
Figure 57: Photographie de la première culture d'Haslea ostrearia en photobioréacteur
de technologie Airlift au GEPEA (Jubeau, 2009) .............................................................................. 78
Figure 58: Installation expérimentale d'un photobioréacteur à membrane immergée
pour la culture d'Haslea ostrearia (Rossignol et al., 1999) .......................................................... 79
Figure 59: Photographie de cultures d'Haslea ostrearia en immobilisation cellulaire
passive : (Gauche) en erlenmeyer non agité 500 mL, (Droite) en bonbonne de verre
borosilicaté non agité 10 L ........................................................................................................................ 80
Figure 60: Culture d'Haslea ostrearia dans les PBR expérimentaux UQAR : (a)
photographie de deux des PBR, (b) courbe de la EMn mesuré dans le surnageant durant
35 jours de batch (Gastineau et al., 2014) .......................................................................................... 81
Figure 61: Méthodologie de la préparation de la culture d'Haslea ostrearia en tank de
500 L et en open pond expérimental de 10m3 (Turpin et al., 2001) ........................................ 81
Figure 62: Variation de la densité cellulaire et de la concentration en marennine dans le
surnageant au sein des culture en batch d'Haslea ostrearia (en tank 500 L et pond 10 m3)
(Turpin et al., 2001) .................................................................................................................................... 82
Figure 63: représentation du photobioréacteur à cellules immobilisées expérimental
(Lebeau et al., 2000) .................................................................................................................................... 83
Figure 64: représentation d'une inclusion cellulaire dans un polymère d'alginate de
calcium .............................................................................................................................................................. 84
Figure 65: photographie au microscope optique : (A) de billes d'alginate vide, (B) de
microcapsule d’alginate contenant Nitzschia closterium (Lebeau et al., 1998).................... 84
Figure 66: Représentation chronologique des innovations de productivité en marennine
extracellulaire selon les différentes technologies de systèmes de culture mis en place par
les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR .................................................................................. 87
Figure 67: Cellule de Nageotte Figure 68: Coupe latéral de la cellule de Nageotte ....... 93
Figure 69: Gravure de la cellule de Nageotte ..................................................................................... 94
Figure 70: Mesure des différentes formes de carbones par TOC-L CSH/CSN....................... 98
Figure 71: Enceinte de culture Sanyo MLR-350 .............................................................................101
Figure 72 : Flasque de culture de tissus cellulaire stérile non traitée (25 cm² de surface
de culture) .....................................................................................................................................................101
Figure 73: panneau de LEDs à variateur pour irradiance horizontale ..................................103
Figure 74: Schéma du PBR à cellules immobilisées ......................................................................104
Figure 75: Schémas du PBR Cristal (Moutel, 2016) ......................................................................105
Figure 76: Schémas du PBR Airlift (Souliès, 2014) .......................................................................106
Figure 77: Schémas du PBR Torique (Souliès, 2014) ...................................................................107
Figure 78: Schémas du PBR plan 6L (Souliès, 2014) ....................................................................108
Figure 79: Représentation de la technique de mesure expérimentale du MRPA sur le PBR
Plan-6L ............................................................................................................................................................109
Figure 80: Photos du plateau et du mobile du rhéomètre (1) et dimensions du système
plateau/mobile (2) .....................................................................................................................................114
Figure 81: Représentation chronologique actualisée des travaux successifs visant à
améliorer la production en marennine extracellulaire selon les différentes technologies
de systèmes de culture mises en place par les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR
...........................................................................................................................................................................234
Table of figures
Fig. 1: Culture chamber SANYO MLR-350 (left) and culture flask positions inside the
culture chamber (right). ..........................................................................................................................120
Fig. 2: Cell, Extracellular Marennine (EMn) and specific EMn productivity of Haslea
ostrearia in batch culture after 7 days in natural seawater-enriched (ES 1/3) based
medium with different sources of phosphorus and carbon. P EMn specific and Pv are,
respectively, the specific EMn productivity and the volumetric productivity. Data is
mean ±95% CI for n=3. .............................................................................................................................125
Fig. 3: Impact of organic phosphorus and copper on marennine and biomass
productivities according to carbon and phosphorus sources in ES1/3 based medium.
Data is mean ±95% CI for n=3. ..............................................................................................................126
Fig. 4: Cell, EMn and specific EMn volumic productivities of Haslea ostrearia for various
media (ES 1/3, artificial seawater (ASW) and ES 1/3 based medium with completely
inorganic C and P (NP)). P EMn specific and Pv are, respectively, the specific EMn
productivity and the volumetric productivity. Data is mean ±95% CI for n=3. .................129
Fig. 5: Simulation of precipitated molecules (%) in the 25N100P medium for 3 pH values
(Visual MINTEQ software) ......................................................................................................................131
Fig. 6: Biomass [X] (bars) and EMn (circles) volumetric productivities (Pv) according to
different macro and micro nutrient concentrations in artificial seawater. Data is mean
±95% CI for n=3 ..........................................................................................................................................133
Fig. 7: Comparison of Haslea ostrearia cell density culture in new NX-25N100P6Si
medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for n=3. .........135
Fig. 8: Comparison of EMn concentration from Haslea ostrearia culture in new NX-
25N100P6Si medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for
n=3 ...................................................................................................................................................................135
Fig. 9: Microscopic view of Haslea ostrearia. (A) is the contrast of two cells, cell (1) being
alive and cell (2) being dead. (B and C) shows living cells in a bloc of cellular residues,
with an assessment of cell viability by chlorophyll fluorescence under UV .......................157
Fig. 10: Representation of the torus shaped PBR geometry with its dimensions (left), and
2 types of impellers used for it stirring (right) (Pruvost et al., 2006) ...................................163
Fig. 11: Dynamic viscosity of the sample and shear stress applied over time at a constant
shear rate of 30,000 s-1 .............................................................................................................................164
Fig. 12: Evolution of cell viability at a constant shear rate (30,000 s-1) over time. Data is
mean ± 95% CI for n = 3 ...........................................................................................................................165
Fig. 13: Haslea ostrearia cell viability at a constant shear rate of a 30,000 s-1 with
different concentrations of Locust Bean Gum (LBG) to modify viscosities and shear
stress accordingly. Data is mean ± 95% CI for n = 3 .....................................................................166
Fig. 14: Haslea ostrearia cell viability cultivated in day/night culture. Cells were
subjected to a constant shear rate (30,000 s-1) for 1 h. Values are reported for every hour
during the day (14 h) and night (10 h) period of culture. Data is mean ± 95% CI for n = 3
...........................................................................................................................................................................168
Fig. 15: Haslea ostrearia culture with and without stirring in light/dark cycle and
constant 24 h illumination for 8-day batch. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ....................169
Fig. 16: Time evolutions of cell density and fluorimetry during semi-continuous culture
of Haslea ostrearia in a torus-shaped PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ......................172
Fig. 17: Cell and biomass surface productivity (PS) obtained for semi-continuous culture
of Haslea ostrearia in a torus PBR in continuous light with five different stirring duration
conditions (0; 8; 14; 20; 24 h). Data is mean ± 95% CI for n = 6 ..............................................173
Fig. 18: Total photosynthetic pigment production (%) and Extracellular marennine
(EMn) excretion (%) for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus PBR in
constant light and different stirring duration conditions. Data is mean ± 95% CI for n = 6
...........................................................................................................................................................................174
Fig. 19: Estimation of Mean Rate of Photon Absorption (A24H, suspended) for 0, 8, 14, 20 and
24 h stirring duration in torus PBR, according to biomass surface productivity (PS)
achieved (L = 4cm) (q0 = 300 μmol m-2 s-1). Data is mean ± 95% CI for n = 6 ...................175
Fig. 20: Representation of the immobilized cell photobioreactor 500mL, aS=33 m-1 ......192
Fig. 21: Representation of 1 L airlift photobioreactor, aS = 33 m-1 (Souliès, 2014) ..........193
Fig. 22: Representation of 6 L airlift photobioreactor, aS=25 m-1 (Souliès, 2014) ............194
Fig. 23: Representation of Crystal photobioreactor 250 mL, aS = 57 m-1 (Moutel, 2016)
...........................................................................................................................................................................195
Fig. 24: Passive and active continuous culture of Haslea ostrearia in immobilized cell
PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 and n = 2 for mean DIC. .................................................196
Fig. 25: Batch culture of Haslea ostrearia for 2% and 15% air/CO2 proportion for cell
density (A) and extracellular marennine concentration (EMn) (B), in Crystal PBR. Data
are mean ± IC 95% for n=3 .....................................................................................................................198
Fig. 26: Continuous culture of Haslea ostrearia at 15% CO2 in a Crystal PBR. Cell density,
extracellular marennine (EMn) and dissolved inorganic carbon (DIC) were measured.
Data is mean ± 95% CI for n = 3 ............................................................................................................199
Fig. 27: Semi-continuous culture of Haslea ostrearia in 1 L airlift PBR with carbon fed-
batch and 2% CO2. Dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and
dissolved inorganic carbon (DIC) were measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ......201
Fig. 28: Evolution of NO3-, PO42- and SiO32-concentration for semi-continuous culture of
Haslea ostrearia in a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ...................................202
Fig. 29: Semi-continuous Haslea ostrearia cell culture in 1 L airlift PBR with C, P, Si fed-
batch conditions. Dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn)
were measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ..........................................................................204
Fig. 30: Light tolerance curve of Haslea ostrearia, describing the evolution of surface
productivity (PS) depending on MRPA values for biomass and extracellular marennine
(EMn) results. Data is mean ± 95% CI for n = 5 ..............................................................................205
Fig. 31: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light
conversion efficiency (η) into biomass as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for
n = 5 .................................................................................................................................................................206
Fig. 32: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light
conversion efficiency (η) into EMn as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for n =
5 .........................................................................................................................................................................207
Fig. 33: pH effect on Haslea ostrearia total photosynthetic pigment concentration,
biomass and extracellular marennine (EMn] productivitys (PS) in semi-continuous
culture in 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 5 .........................................................208
Fig. 34: Temperature effect on Haslea ostrearia ostrearia total photosynthetic pigment
concentration, biomass and extracellular marennine (EMn] productivity (PS) in semi-
continuous culture in 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 5. ................................210
Fig. 35: Total photosynthetic pigment concentration of Haslea ostrearia under various
nutrient limitations and depletions. Data is mean ± 95% CI for n = 5 ...................................211
Fig. 36: Biomass and EMn productivity of Haslea ostrearia culture under various nutrient
limitations and depletions. Data is mean ± IC 95% for n = 5. ....................................................212
Fig. 37: Biomass and cell productivities (PS) of Haslea ostrearia culture under various
nutrient limitations and depletions. Data is mean ± 95% CI for n = 5. ..................................213
Fig. 38: Evolution of cell density and extracellular marennine concentration (EMn) for
semi-continuous culture of Haslea ostrearia in NX medium in 1 L airlift PBR (D = 0.09 d-1,
corresponding to 10 days of residence time). Data is mean ± 95% CI for n = 3. ...............215
Fig. 39: Evolution of cell density and extracellular marennine concentration (EMn) in a
semi-continuous (D=0.18 d-1 corresponding to 5 days of residence time) culture of
Haslea ostrearia in NX medium in a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n=3 .......216
Fig. 40: Evolution of dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and
specific EMn concentration of Haslea ostrearia for semi-continuous culture in NX media
with optimal culture conditions in a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ....218
Fig. 41: Evolution of dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn)
of Haslea ostrearia for a continuous culture in NX media with optimal culture conditions
in a 500 mL immobilized cell PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ......................................219
Liste des tableaux
Tableau 1: Activité antivirale de l’EMn et l’IMn purifiées (Gastineau et al., 2012) ............. 23
Tableau 2: Activité antiproliférative de la marennine IMn et EMn purifiées sur
différentes lignées de cellules cancéreuses (Gastineau et al., 2012a) ..................................... 24
Tableau 3: Constantes physiques caractéristiques de la marennine par analyse
spectrophotométrique (Pouvreau et al.,2006) ................................................................................. 27
Tableau 4: Comparaison de la biomasse et la concentration lipidique produite par
différentes microalgues ............................................................................................................................. 31
Tableau 5 : Etude bibliographique de la sensibilité d'organismes cellulaires face aux taux
de cisaillement ............................................................................................................................................... 42
Tableau 6 : Gamme de température supporté par 5 groupes taxonomiques de
microorganismes photosynthétique (Ras et al., 2013) .................................................................. 69
Tableau 7: Evolution de la solubilité du carbone en fonction de la température, PCO2=380
ppm (Le Gouic, 2013) ................................................................................................................................. 71
Tableau 8: liste des macroéléments nécessaires à la croissance microalgale (Grobbelaar
2003) ................................................................................................................................................................. 74
Tableau 9: liste des microéléments nécessaires à la croissance microalgale (Grobbelaar
2003) ................................................................................................................................................................. 75
Tableau 10: Biométrie du clone NCC 495 d'Haslea ostrearia et aspect au début et à la fin
de la thèse ........................................................................................................................................................ 91
Tableau 11: Biométrie du clone NCC 501 d'Haslea ostrearia et aspect à réception du
clone................................................................................................................................................................... 92
Tableau 12: Composition ionique en macro et microéléments de différents milieux de
culture .............................................................................................................................................................100
Tableau 13 : Caractéristiques des PBRs utilisés pour la culture d’Haslea ostrearia ........102
Tableau 14: Comparaison de l'intensité et la capacité à générer des contraintes
hydrodynamiques du PBR Colonne à bulle, Hector et Raceway clos. ....................................236
List of tables
Table 1: Elemental content comparison between the culture media tested .......................121
Table 2: Preliminary results of biomass and Extracellular Marennine (EMn)
productivities in different media. Data is mean ±95% CI for n=3. ..........................................123
Table 3: Salt solution composition for NX medium .......................................................................141
Table 4: Isolated solution for salt solutions realization ..............................................................142
Table 5: Enrichment solution composition for NX medium ......................................................142
Table 6: Iron solution composition for NX medium......................................................................143
Table 7: Metal A stock solution composition for NX medium ...................................................143
Table 8: Isolated solution for Metal A solution realization ........................................................144
Table 9: Metal B stock solution composition for NX medium ...................................................144
Table 10: Isolated solution for establishing Metal B solution ...................................................145
Table 11: Vitamins stock solution composition for NX medium ..............................................145
Table 12: Experimental conditions during the experiment with progressive shear stress
increase for a constant shear rate of 30,000 s-1 ..............................................................................166
Table 13: Nutrient consumption of Haslea ostrearia (rS, QS and YX determination for NO3-,
PO42- and SiO32-) in semi-continuous culture in an airlift PBR .................................................203
Table 14: Repartition and observation under light microscope of the Haslea ostrearia cell
population density after 24 h without manual stirring. Data is mean ± 95% CI for n = 3.
...........................................................................................................................................................................217
1
Introduction générale
Les microalgues et cyanobactéries, parfois appelées microphytes, désignent les
algues unicellulaires capables de produire du dioxygène et de la matière organique grâce
à la lumière. Ces organismes sont consommés depuis des milliers d’années par l’homme.
La première consommation fut décrite en Chine avec une cyanobactérie du genre Nostoc,
puis vînt la découverte de la Spiruline en 1325 ou encore Chlorella en 1890 (Spolaore et
al., 2005). Unicellulaires ou pluricellulaires indifférenciées, ces micro-organismes
photosynthétiques Eucaryotes ou Procaryotes peuvent posséder des flagelles ou non.
Très cosmopolites, on les trouve dans tous les milieux aquatiques exposés à la lumière.
Possédant souvent plusieurs types de reproduction, leur culture monoclonale est réalisée
dans des systèmes de culture appelés photobioréacteurs (PBR), à l’échelle du laboratoire
mais aussi à l’échelle industrielle pour l’intérêt qu’elles représentent vis-à-vis de leur
composition et leur capacité à synthétiser des molécules d’intérêt.
Depuis plus d'un siècle, botanistes et microbiologistes se sont intéressés à une
algue microscopique, une diatomée à protoplasme bleu responsable du phénomène de
verdissement des huîtres. C'est en 1669, que l’Anglais Sprat constate et étudie le
phénomène de verdissement des huîtres. Mais ce n’est seulement qu’en 1820, que Gaillon,
examinant au microscope la matière verte tapissant le sol des parcs à huîtres, constate
qu'elle est formée d'organismes allongés, mobiles, terminés en pointe aux zones apicales,
et chargés d’un pigment bleu-vert. Il leur donne le nom de Vibrio ostrearius qui sera classé
3 ans plus tard dans le genre Navicula par le Français Bory de Saint Vincent. Ainsi,
Navicula ostrearia, apparaît comme l’agent responsable de ce verdissement grâce à sa
sécrétion d’un pigment bleu-vert soluble dans l’eau, dont les premières études chimiques
et spectroscopiques sont effectuées en 1886 par Lankester, qu’il nommera « marennine ».
D’autre scientifiques se succèdent tels que Ranson (1927), Bachrach (1935) et Moreau
(1970) mais les fonctions physiologiques de cette molécule pour la cellule ne reposent, à
l’époque, que sur des hypothèses. C’est seulement en 1978, que Neuville et Daste
attribuent un caractère toxique à la marennine envers d’autres microorganismes. De
nombreuses études suivent et confirment alors les propriétés biologiques :
allélopathique, antioxydante, antibactérienne, antivirale, anti-tumorale et atténuateur de
2
lumière du pigment (Pouvreau et al., 2007 ; Gastineau et al., 2012). Navicula ostrearia sera
placée dans le genre Haslea par Simonsen, en 1974. Presque 10 ans après, Robert (1983),
étudie dans les claires à huîtres du bassin Vendéen, l’apparition de « blooms » saisonniers
de microalgues constitués entre autres d’Haslea ostrearia. Ces travaux sont suivis
notamment par ceux de Turpin (1999), qui étudie les paramètres physicochimiques et
biologiques responsables de la prolifération de cette microalgue lors de ces « blooms »
dans le bassin de Marennes-Oléron.
La présence d’Haslea ostrearia dans les claires à huîtres est responsable du
phénomène de verdissement des huîtres, d’une part lors de l’ingestion de la diatomée par
les huîtres, et d’autre part par la fixation de la marennine extracellulaire lors de la
filtration et de la sélection par les branchies de ces dernières (Gastineau et al., 2012). En
effet, la marennine dissoute dans l’eau des bassins, se fixe préférentiellement alors aux
cellules parenchymateuses branchiales de l’huître, entraînant une amélioration des
qualités organoleptiques de cette dernière (couleur, goût et masse). Cette technique
d’affinage a été valorisée à partir de 1989 à Marennes-Oléron par un label rouge « Fines
de claire verte » qui lui permet de gagner en notoriété et augmenter son prix de vente de
25 % (Robert, 1983 ; CNC, 2014). C’est à partir de 1989 (P. Jaouen, JM. Robert et X.
Gouabau), avec un développement particulier au milieu des années 90’ (via le soutien du
SMIDAP, Syndicat Mixte pour le développement de l’Aquaculture), que le GEPEA et MMS
ont amorcé leurs collaborations en « génie des bioprocédés » sur les thématiques culture
/ séparations / extractions. D’autres expériences, d’abord de R&D, puis entrepreneuriale
de verdissement d’huîtres (« Emeraudes de Vendée », par exemple) ont également été
conduites à Bouin à partir de 1992.
Malgré ces travaux, la culture en conditions intensives d’Haslea ostrearia reste un
défi. Les conditions d’agitation des photobioréacteurs conventionnels ne semblent pas
correspondre à la culture de cette cellule au comportement benthique (Jubeau, 2009). De
plus, des études de résistance cellulaire (Rossignol et al., 1999 ; Rossignol, 1999 ;
Vandanjon et al., 1999) définissent la cellule comme sensible face aux contraintes
physiques de cisaillements hydrodynamiques. Plusieurs systèmes de culture ont alors été
développés par les deux laboratoires GEPEA et MMS, impliqués dans ce travail de thèse,
pour optimiser la croissance et les productivités de cette diatomée. Un photobioréacteur
1L à cellules incluses en gel d’agar a été mis en place de manière à pouvoir agiter le milieu
3
de culture sans perturber la croissance de l’algue (Lebeau et al., 1999). Un autre
photobioréacteur 1L à membrane de filtration immergée a permis le prélèvement de la
marennine extracellulaire en continu sans perturber la croissance des cellules en
préservant la quantité de biomasse au cours de la culture (Rossignol, 1999). Une
technique de culture en bassin extérieur de 10m3 a été mise au point, dans l’optique de
reproduire le phénomène de verdissement en enrichissant de façon optimisée de l’eau de
mer naturelle avec de l’azote, du phosphore, et de la silice (Turpin et al., 2001). Un système
non agité de 100L de culture, a été utilisé par l’Université du Québec à Rimouski (UQAR)
pour la récolte et la concentration de marennine extracellulaire par filtration (Gastineau
et al., 2014). Toutes ces technologies ont permis la récolte d’informations pour la mise en
place de cultures sur plus grands volumes. Cependant, de nombreuses problématiques de
culture, telles que la reproductibilité des résultats de production, et la productivité
globale des systèmes, limitent le changement d’échelle de la production nécessaire au
passage à la phase industrielle. Le design d’un photobioréacteur spécifique pour la
croissance d’Haslea ostrearia, et d’une façon générale, l’optimisation des conditions de
culture, apparaissent ainsi comme nécessaires, à la fois pour valoriser cette souche de
façon plus systématique, mais aussi dans l’optique d’augmenter les productivités en
marennine extracellulaire. Cette production optimisée apporterait d’autres avantages, en
permettant par exemple une analyse plus approfondie de la structure chimique de la
molécule, mais aussi l’étude du potentiel prophylactique de la marennine grâce à une plus
grande quantité de matière première. Cela augmenterait le potentiel d’utilisation en
aquaculture, ainsi que de valorisation de ce pigment dans divers domaines industriels.
C’est dans ce contexte que s’inscrit ce travail de thèse, co-financé par la région des
Pays de la Loire dans le cadre de la contribution pour le projet de dynamique scientifique
collective AMI (Atlantic MIcroalgae). Le projet AMI implique principalement les équipes
de recherche du laboratoire de Génie des Procédés – Environnent et Agroalimentaire
GEPEA, des laboratoires Ifremer Physiologie et Biotechnologie des Algues (PBA) et
Phytotoxines, ainsi que le laboratoire Mer Molécules Santé (MMS). Il a pour objectifs
d’amplifier les collaborations et le rayonnement académique des équipes impliquées et
de contribuer au développement d’une nouvelle filière industrielle. Au sein de ce projet,
cette thèse a eu pour but de définir les conditions et systèmes de culture pour la
production optimisée de la microalgue Haslea ostrearia et de son métabolite d’intérêt
principal, la marennine. Cela a impliqué un travail systématique, sur la définition des
4
paramètres physico-chimiques et biologiques de culture, à la recherche de modes de
culture adaptés. Les résultats ont été comparés aux précédents travaux sur cette espèce
de manière à pouvoir comprendre et lever les problématiques de culture identifiées.
Le chapitre 1 présente l’Etat de l’art sur la production en photobioréacteur
conventionnel, avec un accent sur les conditions spécifiques pour Haslea ostrearia ainsi
que la récupération de la marennine extracellulaire. Les concepts de base de la culture
microalgale et la présentation de l’outil biologique utilisé sont développés dans ce
chapitre. Les études sur la sensibilité cellulaire d’Haslea ostrearia face à l’agitation est
aussi présentée. Une comparaison est effectuée avec des études pour d’autres
microorganismes unicellulaires libres et en tissu, pour une meilleure compréhension du
phénomène de mécano-sensitivité.
Le chapitre 2 présente la description des matériels et méthodes utilisés pour
répondre aux besoins expérimentaux de cette thèse. Les systèmes de cultures, les outils
biologiques ainsi que les méthodes d’expérimentation et de suivi de cultures y sont
décrites.
Le chapitre 3 est le premier chapitre de résultats et a fait l’objet d’une publication
internationale. La problématique physico-chimique des milieux de culture est étudiée et
la conception d’un nouveau milieu type « eau de mer artificielle » est présentée. La
validation de ce milieu artificiel ne sera effectuée qu’à la fin de cette thèse (chapitre final).
Les résultats présentés dans les chapitres suivants ont donc été effectués avec un milieu
d’eau de mer naturelle enrichie « revisité » et également décrit dans le chapitre 3.
Le chapitre 4 concerne l’étude de la sensibilité d’Haslea ostrearia à l’agitation et
plus précisément aux contraintes de cisaillements hydrodynamiques. Des contraintes de
cisaillement ont été appliquées à différentes intensités sur une culture de l’espèce étudiée
pour mesurer sa résistance dans le but d’adapter le système de culture aux particularités
morphologiques d’Haslea ostrearia.
Le chapitre 5 est le dernier chapitre de résultats et vise à optimiser la production
en culture d’Haslea ostrearia. Les résultats sont ainsi analysés en termes de productivité
en biomasse, pigments photosynthétiques et en marennine extracellulaire, face aux
variations des différents paramètres de culture étudiés (pH, T°C, nutriments et lumière).
Les performances de culture de cette espèce en culture agitée et en culture immobilisée
5
sont ainsi comparées. Au final, l’ensemble des données et résultats permet de proposer
des conditions et modes de culture à appliquer pour une production optimisée d’Haslea
ostrearia et de marennine extracellulaire.
6
Chapitre I :
Etude bibliographique
7
7 La diatomée Haslea ostrearia (Simonsen, 1974)
7.1 Taxonomie
Halsea ostrearia est une microalgue eucaryote de la Classe des Bacillariophycées,
aussi appelées diatomées. Le genre Haslea possède à l’heure actuelle 36 espèces décrites,
certaines produisant de la marennine (Gastineau et al., 2012). Ces diatomées
photosynthétiques possèdent un exosquelette siliceux nommé frustule. Ils forment un
maillon fondamental des cycles du carbone et de la silice en milieu aquatique (Kemp et al.,
2006) constituant majeur du phytoplancton (50 % de la production primaire océanique
globale) et responsable d’un quart de l’oxygène que nous respirons. Ces organismes
représentent environ 1 000 000 d’espèces dont 200 000 diatomées et 20 000 seulement
seraient décrites (Mann et Droop, 1996 ; Guiry, 2012).
Selon AlgaeBase, en 2018, 14 803 espèces de diatomée sont décrites. Elles sont très
utilisées en mytiliculture et en ostréiculture. L’élevage de bivalves intègre en effet
couramment des systèmes de cultures de microalgues pour l’amélioration des
rendements.
Figure 1: La phylogénie d'Haslea ostrearia au sein des Eucaryotes des grandes Classes d’algues
Les diatomées forment l'une des classes des algues jaunes et brunes (ou
Chromophytes), caractérisées par la présence de pigments associés à la chlorophylle (a et
c) tels que la fucoxanthine, qui donne aux chloroplastes une couleur brune ou jaune,
contrairement aux algues vertes et rouges du règne des archaeplastides (Fig. 1).
8
7.2 Cytologie
Le genre Haslea se définit d’abord par sa forme pennée. Haslea ostrearia quant à elle,
possède deux vacuoles apicales, lieu de stockage de la marennine (dite intracellulaire
IMn) mais on retrouve aussi l’IMn sous forme de globule dans le cytoplasme (Fig. 2)
autour des chloroplastes. Généralement au nombre de deux, ces chloroplastes en forme
de longues bandes sont disposés de manière pariétale (Nassiri et al.,1998).
Figure 2: Haslea ostrearia au microscope optique, légendé
La taille standard de cellules jeunes est estimée entre 60-120µm de long et 6-12µm
de large. Le sillon est droit, présent sur les deux valves et ses terminaisons sont peu
accentuées. Le frustule siliceux est composé d’une partie inférieure, l’hypothèque incluse
dans la partie supérieure, l’épithèque et reliées par la copulae qui se détache lors de la
division cellulaire (Fig. 3).
De nombreuses diatomées, présentent une fente, appelée raphé, interrompue par
un nodule central de silice. Ce raphé est à l’origine de la communication avec le milieu
extérieur et de l’excrétion de mucilage (composés polysaccharidiques). La formation de
gangues polymériques autour des diatomées va leur conférer des propriétés particulières
d’adhésion, en fonction de la composition de ces exopolysaccharides.
Les diatomées sont capables de moduler la composition de ces exopolymères
pendant la formation des biofilms benthiques selon les besoins structuraux ou
environnementaux. En outre, ces micro-algues peuvent également produire des lipides et
Figure 3: Représentation connective du frustule des diatomées (frustule)
9
acides gras, qui influencent l’hydrophobicité de leur surface. Après nettoyage du mucilage,
en microscopie électronique à balayage, le frustule apparaît comme étant constituée de
bandes longitudinales parallèles au sillon. La couche extérieure du frustule est constitué
de fissures longitudinales (Fig. 4.3) tandis que la couche intérieure est constituée d'une
structure en grille disposée en rangées longitudinales et transversales (fig. 4.4)
(Smithsonian Marin Station, 2015).
Figure 4: zone centrale de la valve (3) extérieure (4) intérieure SEM (Smithsonian Marin Station, 2015)
Figure 5: zone apicale du frustule SEM (Smithsonian Marin Station, 2015)
Le sommet de la valve possède un raphé terminal entouré de micro orifices (Fig. 5)
au niveau la zone de sécrétion de la marennine (dite extracellulaire EMn) (Nassiri et
al.,1998).
7.3 Reproduction
H. ostrearia est une microalgue qui possède deux types de reproduction : asexuée
et sexuée.
10
7.3.1 Reproduction asexuée
La reproduction végétative des diatomées s’effectue par fission binaire
(scissiparité), et deux nouveaux individus sont formés à partir d’une cellule mère. Le
frustule de la cellule mère se sépare en deux pour donner à l’une de ses deux cellules filles
son hypothèque et à l’autre son épithèque. Les deux thèques de la cellule mère forment
alors l’épithèque pour les cellules filles qui vont fabriquer leurs propres hypothèques.
L’hypothèque étant plus courte que l’épithèque, ce type de multiplication a pour
conséquence de réduire la taille de la cellule de générations en générations, à une vitesse
moyenne de 3,74± 0,33 µm/mois en conditions données (Davidovich et al., 2009) (Fig. 6).
Figure 6: Représentation de la re-distribution du frustule au cours de la croissance d'Haslea ostrearia
Chaque partie du frustule (épithèque et hypothèque) de la cellule mère se
transmettent aux cellules filles, l’état des valves de silice persistent théoriquement
« éternellement ». Dans le cas d’Haslea ostrearia l’apparition, assez rapide au cours de la
croissance, de frustules déformés dans les cultures au cours du temps est observé (Tomas,
1996) (Fig.7), et persistent au cours de la culture.
La baisse de taille de la cellule represente une problématique essentielle de la
culture d’H. ostrearia. Cette baisse engendrant une décroissance de performance en
productivité de la cellule expliqué Chapitre I 2.3, et ne pouvant cryopréserver la cellule,
plusieurs souche de génétiques variables sont donc utilisé dans cette thèse. Les résultats
Figure 7: Haslea ostrearia déformé au microscope optique
11
de performances obtenu sont donc théoriquement peu comparablent mais sont comparé
malgré tout due aux conditions de préservations actuelles.
7.3.2 Reproduction sexuée
La reproduction sexuée est importante pour la récupération de la taille originelle
des cellules. Elle est dite hétérothallique et met en jeu deux éléments (mâle et femelle)
morphologiquement semblables, mais physiologiquement différents pour former des
auxospores dans lesquelles les cellules se débarrassent de leurs thèques pour donner une
nouvelle cellule de taille maximale (60 – 140µm). L’auxosporulation s’effectue lorsque la
cellule atteint une taille critique aux alentours de 50-60±0,4µm de longeur (Mouget et al.,
2009). La lumière est un facteur clef de l’auxosporulation. Les faibles luminosités (<50
µmolhv. m-2. s-1) et les faibles photopériodes (6–10h) déclenchent la reproduction sexuée
lorsque la souche est aux alentours de 50% de sa longueur d’origine. La reproduction
sexuée, même isogamique fait intervenir deux cellules (gamétange). À ce moment-là,
aucune présence de mucus n’est observée, les plastes migrent vers le centre de la cellule
au-dessous de la valve, très tôt dans la prophase. Chaque gamétange produit deux
gamètes de taille égale qui fusionnent (cellules + et - de 2 cellules différentes) ; les deux
zygotes gravitent alors près de la ceinture entre les deux thèques de la cellule mère puis
l’auxospore s’étend entre les thèques pour redonner une cellule de grande taille.
7.4 L’écosystème en claire ostréicole
Haslea ostrearia est une souche euryhaline retrouvée dans de nombreux
écosystèmes tempérés et tropicaux (Gastineau, 2011). Les cultures monoclonales
d’Haslea ostrearia conservées à la NCC (Nantes Culture Collection), proviennent en
majorité d’échantillons prélevés en Baie de Bourgneuf. Dans cette ancienne région de
saliculture, l’activité ostréicole est implantée depuis 1956. La croissance d’Haslea dans ces
claires à huîtres apparaît par pic et atteint une densité maximale de 2 x 105 cellules. L-1 au
mois d’Août et jusqu’en Octobre/Novembre (Robert, 1983).
12
Figure 8: Courbe de température moyenne annuelle en Baie de Bourgneuf (Climate data)
Le mois le plus chaud de l'année est celui d’Août avec une température moyenne
de 19,6 °C (Fig. 8). Le laboratoire MMS estime la température de croissance optimale dans
une moyenne de 16°C avec la possibilité pour la souche de tolérer des températures de 8
à 26 °C au cours de l’année (Robert, 1983).
Haslea ostrearia est une microalgue considérée comme benthique qui possède un
cycle tychopélagique en milieu naturel. Cette souche tombe au fond de la claire et produit
en quasi-permanence (sauf durant la reproduction sexuée), un biofilm qui la protège des
agressions et forme un « tissu » de cellules (Rincé et al., 1999). De plus, elle produit de la
marennine au cours de sa croissance. Cependant, la sécrétion semble plus importante en
phase benthique (Fig. 9).
13
Figure 9: représentation du cycle tychopélagique d'Haslea ostrearia dans une claire à huîtres (D’après Robert, 1983)
Dans l’écosystème claire ostréicole (Fig. 9), les cellules d’Haslea commencent en
phase planctonique (1 et 2). Pendant environ un mois durant cette première phase la
production de marennine est faible. S’ensuit une phase benthique (3) pendant 2-3 mois
où elles forment en se multipliant activement un biofilm à l’interface eau-sédiment.
Débute ensuite une phase épipélagique en remontant à la surface sous forme de « crème
flottante » due à l’accumulation intracellulaire de globules lipidiques, et s’acheve par la
mort cellulaire (Robert, 1983).
14
Figure 10: Relation écologique entre Haslea ostrearia et Crassostrea gigas en claire à huître
En claire ostréicole Haslea ostrearia va servir de nourriture à l’huître est va
excréter la marennine qui sera responsable du phénomène de verdissement des huîtres
(Fig. 10). Ce pigment est filtré par l’huître et/ou d’autres bivalves et va se fixer à leurs
branchies qui vont prendre une teinte bleue verte au bout de quelques heures (Gastineau
et al., 2014). Ce pigment offre donc une coloration verte mais surtout de meilleures
qualités organoleptiques grâce à un affinage de 28 jours. La marennine filtrée et fixée
correspond aussi bien à la marennine sécrétée par les cellules (EMn) qu’à celle relâchée
lorsque l’huître consomme la biomasse d’Haslea (IMn). La croissance de l’huître entraîne
la production de fèces, pseudo fèces et mucus libérés dans le milieu qui fournissent les
nutriments pour la croissance des microalgues (Barillé et Cognie, 2000 ; 1998). Une fois
la marennine fixée aux branchies, la capacité de filtration du bivalve est diminuée si bien
que la relation écologique Haslea ostrearia/Crassostrea gigas, n’est pas encore totalement
qualifiée.
7.5 Photosynthèse
Commun au métabolisme d’Haslea ostrearia et à tout organisme végétal, La réaction
de photosynthèse selon l’équation 1 globale est la suivante :
Équation 1
Dans ce phénomène, l’énergie photonique (hv) est convertie par les cellules
végétales en énergie chimique (ATP, NADPH) utilisant le carbone inorganique et l’eau
15
pour la production de matière organique et de dioxygène. Cette conversion s’effectue
grâce à deux étapes essentielles de la photosynthèse. La phase lumineuse ou phase claire,
désigne la première phase de la photosynthèse, elle consiste à la conversion de l'énergie
lumineuse en énergie chimique sous forme d'ADP et le phosphate en ATP, (conversion de
l'énergie lumineuse en énergie chimique).
Figure 11: Représentation de mécanisme de phase claire dans le phénomène de photosynthèse.
Situés dans la membrane thylacoïde (Fig. 11), les complexes de protéines
membranaires contenant des pigments (donnant leurs couleurs aux thylakoïdes) sont
appelés photosystèmes I et II et permettent la réalisation de la réaction en phase claire.
La composition pigmentaire des thylakoïdes est alors essentielle pour les réactions
photosynthétiques. Situé sur les photosystèmes, le complexe de pigments accessoires
(Chlorophylle c et caroténoïdes pour les diatomées (De Reviers, 2002)) permet la
captation de différentes longueurs d’ondes de la lumière blanche, toutes apportées au
centre de réaction composé de chlorophylle a. Grâce à cette composition pigmentaire, le
complexe PSII absorbe l’énergie photonique et le transfert vers la plastoquinone sous
forme d’électrons après extraction de deux molécules d’eau (production de dioxygène)
(Fig. 11). S’en suit une réaction en chaîne d’oxydo-réduction au sein de la membrane
permettant au final, le stockage de cette énergie sous forme de composés chimiques utiles
(NADPH, ATP). Une fois la réaction déclenchée par le PSII, le PSI permet la synthèse de
16
NADPH grâce à un complexe d’enzymes ferriques et à la précédente hydrolyse effectuée
par le PSII. L’ATP est ensuite synthétisée grâce à l’ATP synthase qui utilise les protons et
les phosphates pour transformer l’ADP en ATP (Gest, 2002).
Les molécules de NADPH servent alors, de donneurs d'électrons utiles pour les
réactions ultérieures indépendantes de la lumière, effectués en phase sombre. Cette phase
à l’obscurité permet la synthèse de matières organiques avec utilisation de l’énergie
chimique précédemment synthétisée en phase claire. Cette phase sombre met en œuvre
plusieurs réactions chimiques cycliques en trois étapes appelées cycle de Calvin (Fig. 12).
Figure 12: Représentation schématique du cycle de Calvin.
Le Cycle de Calvin débute par la fixation du CO2 par une enzyme clef de la
photosynthèse, la ribulose 1,5 biphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO). Cette
enzyme permet la production de deux molécules de 3-phosphoglycérate grâce à la
consommation de deux molécules de NADPH; H+ et de trois molécules d'ATP, démarrant
la phase de fixation du carbone inorganique. Une molécule de 3-phosphoglycérate va alors
être réduite en 1,3-bisphosphoglycerate puis en Glycéraldehyde 3-phosphate (G3P) par
l’utilisation respective d’ATP et de NADPH+H+ en phase de réduction. Une phase de
17
régénération permet ensuite la synthèse de Ribulose 5-phosphate pour le renouvellement
de la RuBiscCO et la reprise du cycle (Karp et al., 2010).
Comme son nom l’indique, la RuBisCO possède deux activités catalytiques :
- L’activité carboxylase qui lui permet la formation de deux molécules d’acide
phosphoglycérique à partir du RuBP.
- L’activité oxygénase qui permet, à partir du RuBP, la formation d’une molécule
d’acide phospho-glycolique et d’une molécule d’acide phosphoglycérique (PGA).
Ce qui a pour conséquence de limiter/stopper la photosynthèse, ne permettant pas
la poursuite du cycle de Calvin.
Les conditions dans lesquelles l’enzyme va privilégier une activité plutôt qu’une autre
dépend de l’environnement dans lequel l’organisme photosynthétique se trouve.
L’activité carboxylase de l’enzyme est dominante en quantité équivalente d’oxygène et de
dioxyde de carbone, car l’affinité de son site actif pour le CO2 est plus importante que pour
l’O2. Cependant, une concentration plus élevée de dioxygène déclenche l’activité
oxygénase. La température faisant varier la solubilité du CO2 et de l’O2 dans l’eau est donc
un paramètre essentiel pour la croissance de la microalgue.
Figure 13: Schémas des cycles de l'activité oxygénase et carboxylase de l'enzyme RuBisCO.
L’activité d’oxygénase forcée de la RuBisCO fait intervenir le phénomène de
photorespiration (Fig. 13), une voie métabolique coûteuse pour la cellule, car elle réduit
le taux de production du 3-phosphoglycérate par rapport à l’activité carboxylase. De plus,
on peut aussi constater une perte nette en carbone et la libération de NH3, un composé à
18
détoxiquer par la cellule grâce à un processus, lui aussi, coûteux en énergie (Leegood,
2007).
Selon des chercheurs de Belgique, France, Italie et des Etats-Unis (Bailleul et al.,
2015), chez les diatomées, le mécanisme photosynthétique est le même que chez les
microalgues de manière générale, mais la capacité des diatomées à dominer la
communauté phytoplanctonique, leurs nombreuses caractéristiques physiologiques et
leur évolution pigmentaire, supposent une évolution différente des algues vertes et
rouges. Les diatomées possèdent une interaction/communication soutenue entre
chloroplastes et mitochondries, respectivement responsable de la photosynthèse et de la
respiration. La gestion de l’énergie chimique (ATP et NADPH) est différente pour la
fixation du carbone, car un échange soutenu de ces molécules permet de combler
rapidement le déficit du rapport ATP/NADPH lorsque celui-ci est inférieur au besoin de
la phase sombre de la photosynthèse où le CO2 est converti en sucre. Cette information ne
permet pas d’anticiper les comportements complexes des diatomées et d’Haslea ostrearia
dans notre cas, mais suppose que cette microalgue a un comportement et une relation à
la lumière différente des croissances de chlorophycées en photobioréacteur, considérées
comme modèles car cultivées communément à l’échelle laboratoire et industrielle.
Dans le cas des plantes supérieures, la régulation Redox via la thioredoxine du cycle
de Calvin est essentielle pour la régulation des dérivés réactifs de l'oxygène (DRO, en
anglais reactive oxygen species, ROS), espèces chimiques oxygénées (radicaux libres, ions
oxygénés (anion superoxyde O2−, de l'oxygène singulet O2), peroxydes d’hydrogène H2O2
etc …) capables d'oxyder les protéines, l'ADN et les membranes des cellules (attaque des
lipides constitutifs par peroxydation lipidique) (Holmgren, 1989). Les DRO peuvent être
d'origine exogène (produits par des rayonnements ionisants) ou bien endogène (sous-
produits du métabolisme normal de l'oxygène souvent importants dans la communication
entre les cellules). Les cellules subissant ce processus de dégradation se défendent à l’aide
souvent, de petites molécules antioxydantes telles que l'acide ascorbique (vitamine C), les
tocophérols (vitamines E), ou encore de molécules polyphénoliques plus grosses.
Cependant, chez les diatomées, la production de thioredoxine semble fortement
réduite par rapport à d’autres mécanismes de régulation. D’après les travaux de Sachse et
al. (2013), la transcription des enzymes intervenant dans le cycle de Calvin de
Phaeodactylum tricornutum cultivé en cycle jour/nuit et nuit complète a été quantifiée.
19
Les gènes codant pour la phosporibulokinase (PRK qui catalyse la phosphorisation du
ribulose 5-phosphate (RuP) en ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) pour la régénération de
la RuBISCO) et la glycéraldéhydedéshydrogénase (GAP-C1 qui catalyse la première étape
de la glycolyse, convertissant le D-glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) en 3-phospho-D-
glyceroyl phosphate, essentiel à la maintenance du niveau d’ATP et du métabolisme des
carbohydrates) sont fortement sollicités durant la phase lumineuse. Sachse évoque
l’hypothèse que la surproduction de PRK et GAP-C1 soit un des mécanismes évolutifs des
diatomées pour compenser le manque de thioredoxine et donc optimiser la croissance
cellulaire face aux agressions des DRO.
7.6 La composition pigmentaire
La présence de certains pigments accessoires ou surnuméraires confère aux algues
la capacité d’absorber différentes longueurs d’ondes, et ainsi des propriétés spécifiques
de survie dans différents environnements. Ces pigments forment des complexes
protéiques appelés antennes collectrices, capables de se charger en énergie lumineuse par
l’interception de photons de longueurs d’ondes dépendantes de la composition des
pigments accessoires (Fig. 13).
Figure 14: Représentation de la compostions pigmentaire des photosystèmes et la circulation de l'énergie lumineuse chez une chlorophycée
Les photons sont récoltés par les pigments (chlorophylle b, c, et caroténoïdes de
protection) qui permettent leurs transmissions aux centres réactionnels, composés de
chlorophylle a, (aussi appelé P680). L’apport d’énergie va exciter le P680 qui va ainsi
libérer l’électron à la plastoquinone, démarrant la réaction de photosynthèse.
20
Cette composition pigmentaire a pour rôle d’accroître la gamme d’absorption de la
lumière et est dépendante de l’espèce de l’organisme photosynthétique étudié, mais aussi
de l’intensité lumineuse à laquelle la cellule est soumise (Masojidek et al., 2013). Selon De
Reviers (2002) la majorité des diatomées ont une composition pigmentaire particulière
composée de chlorophylle a, c, et de fucoxanthine. Cela est confirmé par Carreto et al.,
(1976) et Kuczynska et al., (2015), qui précisent que les diatomées possèdent un groupe
de pigments caroténoïdes photoprotecteurs incluant le bêta-carotène, les xanthophylles
comme la diadinoxanthine, la diatoxanthine, la violaxanthine, l’anthéraxanthine et la
zéaxanthine.
Figure 15: Spectre d'absorption des pigments photosynthétiques (Devred et al., 2014)
La figure 15 présente le spectre d’absorption des différents pigments
photosynthétiques pouvant être retrouvés chez les organismes photosynthétiques. Ces
pigments principaux et accessoires sont dits photosynthétiques du fait de leur rôle dans
la réaction de photosynthèse. Cependant, dans le cas d’Haslea ostrearia, la sécrétion de la
marennine n’a pas été identifiée comme liée à la captation d’énergie lumineuse, et n’est
donc pas considérée comme un pigment photosynthétique (Schubert et al., 1995). Sa
production semble toutefois avoir une relation étroite avec la lumière et donc un lien avec
21
le métabolisme photosynthétique (Neville & Daste, 1978 ; Tremblin et al., 2000 ; Mouget
et al., 2005).
8 La marennine
8.1 La structure chimique
L’analyse élémentaire a été effectuée au CNRS par le laboratoire ICP-MS de Nantes,
par spectrométrie de masse ICP (Pouvreau et al., 2006). La marennine est donc composée
ainsi :
- IMn O = 48% (±0.50), C = 39.55% (±0.15), N=5.70% (±0.30), H=4.50% (±0.25),
Na=1.25% (±0.05), Ca = 1% (±0.05)
- EMn O = 53.5% (±0.50), C = 36% (±0.60), H = 3.80% (±0.15), N=1.70% (±0.25), Na =
3% (±0.05), Ca = 2% (±0.05)
Figure 16: 2D RMN (a) Spectre 1H–13C EMn d’Haslea ostrearia Correspond au spectre 1D 1H (Gastineau et al., 2014)
Cependant, Les études de spectrométrie de masse, spectroscopie Raman, RMN et
RMN 2D ne permettent pas de déduire la structure exacte. Les lignes noires (Fig. 15 a)
séparent les zones comportant des carbones reliés à un ou plusieurs atomes d’hydrogène
; le pyranose générique (Fig. 15 b); la région cyclique 1H–1H TOCSY de l’EMn avec 90 ms
22
de temps de mélange est représentée figure 15 c. Le signal fort 1H observé à 3,65 ppm
représente une impureté (Gastineau et al., 2014).
La différence de structure d’IMn/EMn est sensible chez Haslea ostrearia. L’EMn
semble contenir plus de protons anomériques en conformation alpha (4,9 – 5,7 ppm).
Cependant, les deux formes contiennent un cycle organique aromatique (3,4 – 5,4 ppm)
ainsi qu’un fort signal à 1,22 ppm révélant une région aliphatique (c.a.d, une longue chaîne
carbonée). Selon ces résultats, la marennine serait composée d’un cycle carboné
(Aromatique/benzénique) relié à une longue chaîne carbonée par un carbone
anomérique.
8.2 Les propriétés physico-biochimiques de la marennine
8.2.1 Les propriétés biochimiques
- Activité antibactérienne:
L’impact des deux types de marennine IMn et EMn a été testé par le laboratoire du
MMS sur trois espèces Polaribacter irgensii, Pseudoalteromonas elyakowii et Vibrio
aesturianus. Sélectionnés pour leur dangerosité, Pseudoalteromonas elyakowii et Vibrio
aesturianus ont été identifiés comme des souches de bactéries dangereuses pour la
croissance des huîtres, Polibacter étant une souche terrestre. Le potentiel antibactérien
de la marennine a été évalué par la méthode de diffusion de disque en gel d’agar. Il a été
constaté l’augmentation du cercle d’inhibition de croissance sur gélose avec
l’augmentation de la concentration de marennine utilisée. L’inhibition de la croissance des
bactéries est effective même avec une faible concentration de marennine de 1µg.ml-1.
Cependant, aucune zone d’inhibition n’a été observée pour la croissance de bactéries
terrestres (Gastineau et al., 2012).
- Activités antivirale et cytotoxique:
Cette étude a été effectuée sur la lignée de cellules Vero (Vero cell African green
monkey kidney cell), très utilisées dans la recherche de toxines bactériennes ainsi que
comme cellule hôte pour la culture de virus. Cette lignée cellulaire est aneuploïde ce qui
permet de nombreuses réplications cellulaires sans l’apparition de caractéristiques
sénescentes. L’application de IMn et EMn sur la lignée Vero montre des changements de
morphologie après 3 jours de traitement. Cependant, aucun effet cytotoxique n’a été
23
constaté avec la forme EMn. Concernant l’activité antivirale de la marennine, elle a été
comparée à celle du Zovirax (molécule référence contre le virus de l’herpès HSV-1 et sa
faible cytotoxicité, aussi commercialisée sous le nom d’Activir) (Table. 1).
Tableau 1: Activité antivirale de l’EMn et l’IMn purifiées (Gastineau et al., 2012)
Code CC501(µg/mL) EC502 (µg/mL)
Zovirax >200.0 0.2
IMn marennine 107.2 24.0
EMn marennine >200.0 27.0
Cependant, les deux formes EMn et IMn semblent posséder une activité anti
herpétique très efficace. Avec un EC50 de 24-27µg. ml-1, 2 fois plus important que celui du
Zovirax.
- Activité antiproliférative:
L’expérience a été effectuée sur plusieurs lignées de cellules tumorales humaines :
M113 (mélanome) ; SKOV3 et SHIN3 (cancer ovarien) ; SW116 (cancer du côlon) ; R3111
(cancer des reins) ; 1355 (cancer des poumons) ; et MCF7 (cancer du sein) provenant du
département INSERM U463 (Université de Nantes). La présence d’IMn et d’EMn permet
d’engendrer une différence de morphologie chez les cellules cancéreuses, les cellules
n’adhèrent plus sur les surfaces et prennent une forme globulaire sauf pour la lignée SHIN
3. Aucune dégénérescence ou toxicité n’a été observée sur les cultures, mais la marennine
semble inhiber la croissance de certaines lignées cellulaires (Table. 2) (Gastineau et al.,
2012).
1CC50 représente 50% de la concentration cytotoxique 50%, la concentration qui réduit l'absorbance des cellules pseudo-infectées à 50% de celle du témoin. 2EC50 représente 50% de la concentration antivirale, la concentration qui protège de 50% la cellule contre
l’infection virale HSV-1.
24
Tableau 2: Activité antiproliférative de la marennine IMn et EMn purifiées sur différentes lignées de cellules cancéreuses (Gastineau et al., 2012a)
Lignée cellulaire IC50
3 (µg. mL-1±SE)
EMn IMn
Cancer des
poumons
1355 1,10 ± 0,56 0,79 ± 0,35
Cancer des
poumons
NSCLC-N6 14,4 ± 9,8 nd4
Cancer du sein MCF-7 6,5 ± 3,5 22,2 ± 8,7
Cancer du rein R3III 25,9 ± 9,8 36,7 ± 1,1
Mélanome M113 >100 82,7 ± 33,0
Cancer des ovaires SKOV-3 >100 no5
Cancer des ovaires SHIN3 no no
Cancer du colon SW116 >100 >100
La lignée SHIN3 ne semble pas sensible aux différentes doses des deux formes de
marennine. SKOV-3, SW116 et M113 montre une inhibition à grande concentration de
marennine (100μg. mL-1, 31 ± 9%, 36 ± 4%, and 49 ± 3%, respectivement) pour EMn.
Seulement SW116 est sensible à l’IMn à haute concentration (100 µg. mL-1, 38 ± 7%). Les
deux formes de marennine montrent d’intéressants résultats sur l’inhibition des cellules
cancéreuses de poumons (1355 et NSCLC-N6). L’activité antiproliférative illustrée par
l’IC50 se situe entre 0.79 - 82.7 μg. mL-1 pour l’IMn et entre 1.10 - 25.9 μg. mL-1 pour l’EMn.
Les propriétés de la marennine sont actuellement étudiées pour une valorisation
potentielle dans différents domaines. La marennine pourrait être valorisée dans
l’industrie agroalimentaire, en tant que pigment bleu naturel comestible, ainsi que dans
le domaine de l’ostréiculture (CNC). La région de Marenne-Oléron est la principale région
de production française avec les huîtres labellisées « Fines de claire vertes », dont la
3Analyses statistiques des IC50 déterminées avec ± SE pour n = 6 (ANOVA, SNK; p < 0.05). IC50 représente la concentration minimum de marennine nécessaire pour provoquer 50% de l’inhibition de croissance cellulaire. 4nd = non déterminé 5no = pas d’inhibition détectée.
25
marennine donne aux huîtres cultivées dans cette région leur couleur bleu-vert unique.
Le phénomène de verdissement des huîtres est encore peu compris (Moreau, 1968 et
Gastineau et al., 2012b). C’est un phénomène affectant plusieurs tissus des mollusques
(manteau, branchies, épithélium intestinal), se produisant à différentes intensités et
fréquences au cours de l’année et dans de nombreuses régions, mais ne présente une
grande importance que dans le bassin de Marenne. La variation de l’efficacité du
phénomène de verdissement des huitres est importante d’une claire à une autre.
L’utilisation de la marennine pourrait être un moyen de limiter la mortalité des larves de
bivalves, due à son activité antibactérienne contre les pathogènes marins (Turcotte et al.,
2016 ; Latour et al., 2018). Depuis 2008, la filière ostréicole subit une surmortalité des
huîtres jeunes causées par le virus OsHV1. Cette crise est internationale et a entraîné une
forte baisse de la production d’huîtres en France, passant d’environ 126 000 tonnes en
2006 à 84 100 tonnes en 2010/2011 et 79 200 en 2014/2015 (CNC).
Les caractéristiques antibactériennes, anti-tumorales et anti-virales pourraient
être valorisées en industrie pharmaceutique, le marché des produits antiviraux devenant
plus en plus important depuis 2015 dû à l’augmentation de la population. En contrepartie,
l’expiration des brevets d’anciens antiviraux tels que Sustiva, Combivir, Tenofovir,
Telbivudine, Tamiflu et Relenza (pour 2017) va relancer la compétition des médicaments
génériques. En 2013, le marché des antiviraux était estimé à 22,1 milliards de dollars et
espère atteindre les 30,1 milliards de dollars pour 2017 (Franco, 2012). Le marché des
traitements anti-herpès est quant à lui, estimé à 4,9 milliards de dollars pour 2017. Une
portion de 0,7% de la population globale adulte, entre 15-49 ans est touchée par le virus
de l’herpès chaque année. En 2008, environ 600 millions d’adultes sont touchés par le
virus de l’herpès (Yasobiotech). Les dépenses mondiales en anticancéreux quant à eux,
atteignent $100 milliards (90 milliards d'euros), en 2014, en hausse de 10,3% par rapport
à l'année précédente, selon un rapport consacré à l'oncologie du cabinet IMS Health. Ce
montant représente 10,8% de l'ensemble des dépenses de médicaments à travers le
monde et inclue les traitements de support, comme les antinauséeux ou les traitements
de l'anémie. Le cabinet spécialisé prévoit qu'elles atteindront 117 à 147 milliards de
dollars en 2018, soit une croissance annuelle cumulée estimée entre 6% et 8%.
Les pigments bleus naturels étant rares, la marennine est un candidat pour la
production de cosmétiques d’origine naturelle. Le bleu indigo peut être produit à partir
26
de fleurs d’Indigofera tinctoria, commun en Asie et en Afrique et surtout connu en Europe
depuis le 15ème siècle pour la teinture des vêtements. Cependant, en termes de colorant
alimentaire d’origine naturelle, seule la phycocyanine, extraite de la spiruline, est
autorisée par les normes européennes (EFSA 2011).
8.2.2 Les propriétés physiques
La marennine est un pigment bleu-vert hydrosoluble possédant un déplacement
bathochrome réversible légèrement différent entre ses deux formes IMn et EMn.
Figure 17: Observation de marennine EMn à pH basique (gauche) et acide (droite) (Jubeau, 2009)
Ces deux formes changent de couleur en fonction du pH et de leur pKa. Les pH
basiques donnent une couleur vert sombre, alors qu’une partie des pH acides donnent une
couleur bleu ciel à la marennine (Fig. 17). La valeur du pKa de L’IMn et EMn détermine
leur limite de changement de couleur, respectivement 4,74 ± 0,05 et 4,02±0,02 (Fig. 18a
et b).
Figure 18: Absorbance de l'IMn (a) et EMn (b) en fonction du pH (Pouvreau et al.,2006)
27
L’analyse par spectrométrie nous renseigne sur le coefficient d’extinction molaire, le
point isobestique et le pKa de la marennine (Table. 3).
Tableau 3: Constantes physiques caractéristiques de la marennine par analyse spectrophotométrique (Pouvreau et al.,2006)
Les deux types de marennine sont complètement solubles dans l’eau pure avec une
concentration de saturation atteinte à 25g. L−1 à 25°C pour les deux formes ; Insolubles en
solvants organiques avec précipitation de 20 à 60°C. Après étude en spectrométrie de
masse le poids moléculaire de la marennine est estimé à 10,751±1 KDa pour IMn et 9,893
± 1 KDa pour EMn (Pouvreau et al., 2006).
8.3 Le métabolisme de production de marennine
La voie métabolique de production de marennine est encore inconnue. La question
même de l’origine et de la nécessité pour la microalgue du métabolite reste hypothétique,
confrontant la théorie du métabolite primaire à celui du métabolite secondaire.
Un métabolite primaire est directement impliqué dans la croissance, le
développement et la reproduction normale d'un organisme. Indispensable, il a en grande
majorité, une fonction physiologique intrinsèque, souvent partagée par d’autres
organismes taxonomiquement éloignés. A l’inverse, un métabolite secondaire n'est pas
directement impliqué dans ces processus physiologiques fondamentaux indispensables,
mais possède une fonction écologique ou relationnelle importante. De manière générale,
un métabolite secondaire se retrouve présent dans un ensemble taxonomiquement
restreint d'organismes (Plantes, Champignons, Bactéries etc...). Chez les plantes,
beaucoup de métabolites secondaires se retrouvent sous la forme de « polyphénols » ou
« composés phénoliques ». Souvent d'un poids moléculaire élevé, ce sont des molécules
aromatiques constituées d’un groupement phényle (C6) et d’un hydroxyle (-OH) dérivant
d’acides aminés aromatiques (e.g. tyrosine, phénylalanine) comme les flavonoïdes, les
tanins ou encore les lignines (Scriban, 2006).
28
Certaines études effectuées par le laboratoire MMS, soutiennent l’hypothèse d’une
production continue de marennine corrélée à celle de sa biomasse. L’intensité lumineuse
semble jouer un rôle important dans la production de biomasse et de la marennine qui
n’est pas seulement libérée lors d’une limitation en nutriment mais aussi au cours de la
phase exponentielle (Mouget et al., 2004). D’autres travaux montrent l’affinité d’Haslea à
la lumière bleue pour la production de biomasse et de marennine (Mouget et al., 2005)
(Fig.20). D’autre part, les cellules perdant de leur taille au cours du temps, produisent en
moyenne des quantités de marennine plus faibles (Mouget et al., 2005) (Fig.19).
Figure 19: Courbes de croissance d’Haslea ostrearia sous lumière blanche (WL), bleu (BL), vert (GL), jaune (YL), ou rouge (RL) à faible (20μmol photons m−2 s−1) et fort intensité lumineuse (100μmol photons m−2 s−1)
(Mouget et al., 2005)
29
Figure 20: Contenu en marennine de cellules d’Haslea ostrearia de différentes tailles (longueur de cellule) produites sous lumière bleu (⧯) ou blanche (⧮) (Mouget et al., 2005)
Concernant les figures 19 et 20, la concentration cellulaire est plus importante à
haute irradiance avec des courbes de croissance similaires entre elles, indépendamment
du spectre de lumière appliqué. Cependant, en phase exponentielle, la concentration
cellulaire la plus importante reste en lumière blanche. Alors qu’à faible irradiance, la
concentration cellulaire la plus importante est atteinte sous lumière bleue.
Indépendamment de la lumière, la figure 19 (différents clones d’Haslea sont utilisé A-G)
nous montre que les clones les plus longs (53 – 80µm) présentent les résultats de
concentration de marennine les plus importants.
Cependant, d’autres études menées à MMS et au GEPEA, soutiennent l’hypothèse
du métabolisme secondaire. Malgré un constat évident de la capacité d’Haslea ostrearia à
synthétiser de la marennine (même en très faible quantité) tout au long de sa croissance,
Neuville et Daste (1972), ont montré que la carence azotée avait un impact sur la
production d’EMn, confirmée par Rossignol, (1999) et Lebeau, (2000) (Fig. 21).
30
Figure 21: Cinétique de production de marennine et absorption de nitrate par des cellules d'Haslea ostrearia immobilisées dans le gel d’agar (Lebeau et al., 2000)
La figure 19, montre la production de marennine (⦁) et l’absorption de nitrate (o)
au court de la culture d’Haslea ostrearia dans le prototype de PBR à cellules immobilisées
de Lebeau (Présenté Chapitre I.5.4.2.2.1). La culture est en continu avec un taux de
renouvellement de milieux de culture de 0,025 J-1. Son travail ne présente pas d’autres
mesures de macroéléments nous permettant de confirmer avec certitude que seuls les
nitrates impactent la production de marennine. Cependant, ces résultats de corrélation
remettent en question l’hypothèse du métabolite primaire.
9 Valorisation de la biomasse
9.1 Les pigments
9.1.1 La marennine intracellulaire
La production de marennine intracellulaire pour valorisation est actuellement peu
envisagée, considérant les productivités plus importantes apportées par les technologies
de milking (Rossignol, 1999). La valorisation de l’IMn reste cependant une possibilité
après cassage cellulaire.
9.1.2 La fucoxanthine
La fucoxanthine est un pigment d’intérêt qui donne aux micro et macroalgues une
couleur brune. La composition en fucoxanthine d’Haslea ostrearia n’est pas connue mais
les diatomées, les dinophycées et les phéophycées possèdent en moyenne 20,4% (w/w)
du pigment. La fucoxanthine est un pigment de la famille des caroténoïdes
majoritairement répandu chez les macroalgues et les diatomées. Ce pigment, lié à la
31
chlorophylle a, c et aux apoprotéines forme le meilleur complexe photo absorbeur qui
transfère l’énergie lumineuse à la chlorophylle a pour la réaction photosynthétique. La
fucoxanthine possède des liaisons alléniques, un groupe carbonyle, un 5,6-monoepoxide
et un groupe acétyle qui définissent ses activités sur la physiologie humaine. Ce
caroténoïde montre une forte activité antioxydante, anti-inflammatoire, anti-obésité
(Abidov et al., 2010), antidiabétique (réduction du taux de glucose dans le sang),
anticancéreux et anti-hypertensive (Woo et al., 2010).
Le marché de la fucoxanthine est considéré comme un marché de niche en
croissance avec une valeur de la molécule estimé à 3000€/kg. Principalement pour la
consommation animale en aquaculture, elle est aujourd’hui en vente en gélule comme
complément alimentaire pour la nutrition humaine. La fucoxanthine peut être extraite à
partir de macroalgue comme Laminaria japonica, Eisenia bicyclis, et Undaria
pinnatifidacar, sur un marché très verrouillé par de nombreux brevets, car ces algues sont
déjà consommées en Asie du sud-est et en Europe. Cependant depuis 2005, certaines
entreprises comme Setalg, Algosud ou encore Nature-Algue commercialisent la
microalgue Odontella aurita en gélule pour la consommation humaine.
9.2 Les lipides
La composition lipidique d’Haslea représente un atout potentiel pour sa valorisation
économique. En phase épipélagique, Haslea semble produire des globules lipidiques
intracellulaires qui font remonter les cellules à la surface par densité. La composition
chimique des lipides produits est peu connue, mais le pourcentage produit en masse sèche
se rapproche des résultats obtenus sur des souches étudiées au GEPEA (Table. 5).
Tableau 4: Comparaison de la biomasse et la concentration lipidique produite par différentes microalgues
Biomasse (g/L) Lipides (% MS)
Chlorella sp.6 1 - 2 28 - 32
Chlamydomonas reinhardii7
1 – 2,5 19 - 21
Haslea sp.8 3,0 x 10-2 – 3,6 x 10-2 30,6 - 35,8
6 Taleb et al., 2015 ; Liang et al., 2009 7 Lemasson C. 2015 8 Griffiths et al., 2009
32
Les rendements lipidiques chez Haslea sp., sont élevés comparés à d’autres cellules
modèles du laboratoire. Cependant, les rendements de biomasses sont encore très peu
élevés et maîtrisés pour cette diatomée. D’autres études démontrent que Haslea ostrearia
contient principalement des mono- et digalactosyldiacylglycérol (MGDG and DGDG,
respectivement) membranaires sous forme C18/C16 and C18/C18 (Dodson et al., 2013).
Ces acides gras sont d'importants lipides membranaires, où ils remplacent les
phospholipides pour la préservation du phosphate, alors disponibles pour d'autres
processus biologiques essentiels (Peter et Benning 2002). Chez les plantes supérieures,
ses galactolipides (MGDG et DGDG) sont responsables de la régulation des oxydes
nitriques (composés considérés comme DRO) et ont donc été liés à des activités anti-
inflammatoire, diététique et antitumoral chez l’être humain (Gao et al., 2014).
10 Caractérisation de la fragilité cellulaire
L’agitation étant un paramètre de culture identifié comme important pour la
culture d’Haslea ostrearia (Robert, 1989 ; Rossignol et al., 1999 ; Vandanjon et al., 1999),
la conception et l’optimisation d’un système de culture nécessite la compréhension des
bases de la dynamique des fluides. Les phénomènes de cisaillement dûs à une déformation
d’un fluide sont donc détaillés dans cette partie.
10.1 Notions de cisaillement
10.1.1 La déformation d’un fluide : l’écoulement laminaire et turbulent
La déformation d’un fluide peut être observée par l’ajout de marqueurs (fumée
pour les gaz, colorant pour les liquides) permettant la caractérisation de l’écoulement
d’un fluide. Il est constaté que lorsque le marqueur diffuse très lentement au sein du
système, différentes couches (appelée lamelles) glissent les unes par rapport aux autres
sans se mélanger, formant un gradient de vitesse de vecteur parallèle à un instant t
l’écoulement est dit laminaire. Si tous les vecteurs vitesses sont à la fois parallèles et
égaux, l'écoulement laminaire est uniforme. A contrario, si le marqueur est « perturbé de
manière aléatoire et irrégulière dans toutes les directions » : l’écoulement est dit
turbulent. Les vecteurs de vitesse sont inégaux (différents en direction, sens, intensité).
Des tourbillons (vortex) se forment (Fig. 22).
33
Figure 22: écoulement autour d’un cylindre, (Gauche : laminaire Rex< 5×105), (Droit : turbulent Rex> 5×105)
Le passage d’un régime laminaire à un régime turbulent est régi par la vitesse de
déformation, des caractéristiques visqueuses du fluide ainsi que de la forme de
l’écoulement (espace fermé, canalisation, espace ouvert, etc.…). Ainsi, pour un écoulement
turbulent, les grandeurs caractérisant cet écoulement varient de manière aléatoire. La
notion même d’écoulement turbulent permanent ne peut être comprise qu’en moyenne.
A l’inverse, les fluctuations des gradeurs caractérisant un écoulement laminaire sont
négligeables, voire nulles pour les régimes laminaires parfaits.
La distinction entre les différents régimes s’effectue grâce au nombre de Reynolds :
Équation 2
𝑅𝑒 =𝑉𝐿
𝑣
V est la vitesse du (m.s-1), L la longueur spécifique du système (m) et 𝑣 la viscosité
cinématique. La transition d’un régime laminaire à un régime turbulent se fait
graduellement sur une plage critique de nombre de Reynolds, dont les valeurs peuvent
dépendre des systèmes étudiés. Les écoulements laminaires ont lieu à faible Reynolds
(Rex<2000 pour les cas les plus fréquents) tandis que les forts nombres de Reynolds
correspondront aux écoulements turbulents (Rex> 2000 pour les cas les plus fréquents)
(Bergman 2011).
10.1.2 Les fluides newtoniens et la viscosité
Lors de l’écoulement d’un fluide des forces tangentielles de frottement à cet
écoulement s’opposent au mouvement du fluide. Ces forces sont présentes sur les
extrémités non mobiles d’un système (les parois d’une canalisation par exemple) mais
sont aussi dues aux interactions entre les molécules du fluide, appelées forces de viscosité
intrinsèques aux fluides.
34
Plusieurs grandeurs physiques caractérisent la viscosité : la viscosité dynamique
(celle utilisée le plus généralement), la viscosité cinématique, la seconde viscosité et la
viscosité de volume. Nous ne nous intéresserons qu’aux deux premières (Nic et al., 2014) :
- La viscosité dynamique µ, est la grandeur de référence quand on parle de viscosité
sans autre précision. Elle se mesure en Pascal-seconde (Pa. s-1) et traduit le lien
entre la contrainte de cisaillement et le gradient transversal de la vitesse
d'écoulement dans le fluide « dynamique » :
Équation 3
µ =𝜏
γ
τ étant la contrainte de cisaillement (Pa), et γ le gradient de vitesse aussi appelé
taux de cisaillement (s-1).
- La viscosité cinématique ν, s’exprime en m2. s-1 et se déduit en divisant la viscosité
dynamique par la masse volumique ρ soit :
Équation 4
𝑣 =µ
ρ
Cependant, ces équations (3 et 4) ne sont valables que pour les fluides dits
newtoniens. Pour ses fluides, µ est une constante intrinsèque dépendant uniquement de
la température et de la pression. Dans le cas des fluides non newtoniens, la viscosité est
un paramètre dépendant de la température, de la pression mais aussi des forces en action
sur lui-même, faisant varier la rhéologie du fluide en fonction des contraintes. En d’autres
termes, le fluide newtonien continu de s’écouler indépendamment des forces extérieures
qui agissent sur lui (l’eau est un fluide newtonien parce qu’il conserve sa viscosité quelle
que soit la vitesse à laquelle il est agité).
10.2 Les contraintes de cisaillement en photobioréacteur
Le photobioréacteur représente le système le plus optimisé pour la culture de
microalgues, l’analyse des réactions biochimiques et la maîtrise des conditions axéniques.
Ce procédé optimisé implique plusieurs éléments tels que l’agitation, la recirculation,
l’aération, le pompage, tous dans le but de faciliter et d’optimiser le transfert de matière,
de chaleur autant que l’accès à la lumière au sein du photobioréacteur. Ces opérations
35
peuvent être appliquées à plusieurs intensités, entraînant pour le mélange des
contraintes de cisaillements pouvant être considérées comme excessives et causer une
mortalité cellulaire ou une baisse du taux de croissance (Wang & Lan, 2018).
10.2.1 Technologie Airlift
L’ajout de CO2 est essentiel à la culture des microalgues, en tant que source
inorganique de carbone pour la croissance. Il est nécessaire également d’aérer la culture
pour retirer l’excès de O2 dissous produit par cette même croissance (Ugwu et al., 2008).
Cette pression d’O2 peut devenir un problème pour la production de biomasse, faisant
rentrer la microalgue en photo-respiration (présenté Chapitre I.1.5) et ainsi diminuant la
productivité (Kazbar 2018 ; Pruvost et al., 2017 sur la technologie Algofilm ©). La
technologie Airlift (aussi appelé réacteur gaz/liquide) est une technologie d’agitation de
bioréacteur permettant le mélange, la régulation pH et l’injection de CO2, par la seule
injection de gaz.
Figure 23: Représentation de la circulation de la phase liquide en photobioréacteur Airlift 1L
Comme représenté sur la figure 23, l’injection de gaz située au bas du PBR, entraîne
une recirculation du milieu de culture autour des chicanes. Selon les travaux de Olmos et
al., (2003) et Ndiaye et al., (2018), effectués sur colonne à bulle et Airlift GEPEA, la
technologie Airlift permet l’application de trois types de régimes d’écoulement gazeux :
- Le régime homogène, apparaît lorsque de fines bulles (à faible distribution de
taille) progressent verticalement avec de faibles oscillations latérales sans
36
interaction entre elles. Cet écoulement intervient à faible vitesse superficielle de
gaz (Deckwer, 1991) et considère la rupture ou coalescence des bulles négligeable.
- Le régime de transition, apparaît lors de l’augmentation de la vitesse superficielle
augmentant les phénomènes de coalescences et rupture de bulles et ainsi la
distribution de taille des bulles.
- Le régime hétérogène quant à lui, intervient à haute vitesse superficielle de gaz,
lorsque l’écoulement devient instable et la distribution de taille de bulles très large.
Une distribution de gaz centré entraîne ce type de régime même à faible débit de
gaz.
Les performances des PBRs Airlift sont liées à ces types de régime et plus
particulièrement à la taille de bulles distribuées au sein du PBR, conditionnant le transfert
de matière par leurs aires interfaciales (Deckwer, 1991 ; Ruzicka et al., 2001). Selon
Deckwer (1991), l’importante agitation et l’augmentation du coefficient de transfert de
matière « kL » apporté par un régime hétérogène ne compense pas la diminution de l’aire
interfaciale. Il est donc conseillé de travailler en régime homogène pour optimiser le
coefficient de transfert de gaz-liquide « kLa ».
Les contraintes de cisaillements apportées par le débit de gaz en régime homogène
se retrouvent plus importantes au sein du trajet de gaz où le régime du fluide est
turbulent. L’étude en colonne à bulles de Contreras et al. (1998) permet d’approximer la
vitesse superficielle de gaz maximum du régime homogène, estimé à UG = 0.03 m. s-1 en
Airlift sur une culture de Phaedactylum tricornutum et obtient ses meilleurs rendements
de croissance cellulaire en régime transitoire à UG = 0.055 m. s-1.
Le GEPEA confirme ces résultats grâce à la mécanique des fluides numériques
(MFN) (Ansys-Fluent©14.5) Selon la Figure 24, la vitesse superficielle dans l’axe
d’injection du CO2 peut monter jusqu’à UGMAX=0,180 m. s-1, mais permet une moyenne de
UGMOY=0,05 m. s-1 au sein du PBR Airlift.
37
Figure 24: Simulation MFN du champ de vitesse de la phase liquide, coloré par intensité de vitesse superficielle (m. s-1). (a) représente une Airlift 1L, (b) représente un Airlift 100L (Ndiaye et al., 2018)
Du fait du passage des bulles, le taux de cisaillement apporté par cette vitesse
superficielle de gaz est relié par l’équation suivante (Chisti et Murray Moo-Young, 1989) :
Équation 5
�́� = 5000𝑈𝐺
Où UG la vitesse superficielle de gaz (m. s-1) et γ́ taux de cisaillement (s-1).
Le taux de cisaillement maximum moyen apporté par la turbulence de l’agitation
gazeuse est estimé entre 150 s-1 et 275 s-1 au sein du trajet gazeux dans une PBR Airlift.
Cependant, l’éclatement et l’apparition des bulles respectivement en haut et en bas du
PBR favorise l’apparition de micro vortex pouvant produire jusqu’à 14 000 s-1 de taux de
cisaillement moyen (Contreras et al., 1998 ; Michiel et al., 2010 ; Barbosa et al., 2003).
Malgré l’intérêt évident d’une utilisation de fines bulles pour le transfert de matière, la
multiplication de points d’entrée de gaz additionnée à de fines bulles peut être négative
pour la culture de cellules sensibles aux contraintes de cisaillement (Barbosa et al.,
2003 ; Sobczuk et al., 2006). La multiplication des points d’entrées augmente les
cisaillements dus à la génération des bulles, la production de micro vortex et la fréquence
d’explosion des fines bulles en haut du PBR.
38
10.2.2 Technologie Torique
La géométrie particulière de ce photobioréacteur de laboratoire a été mise au point
par le GEPEA dans le but d’étudier la réponse biologique des microalgues face aux
conditions environnementales appliquées et contrôlées. La géométrie du PBR est un
élément important car elle conditionne le comportement de l’algue au sein du PBR. Le
PBR torique est basé sur la forme « torique » permettant un mélange parfait (limitant les
zones mortes). Cette agitation permet un accès amélioré du micro-organisme à la lumière
en générant un mouvement dans le sens du gradient de lumière intra-PBR (présenté
Chapitre I.5.1.1). D’autre part, le procédé est entièrement automatisé pour le contrôle des
conditions environnementales appliquées (Fig. 25).
Figure 25: schéma du pilote laboratoire Torique de production contrôlée de microalgues (Artu, 2016)
L’injection de gaz en point bas du PBR permet une régulation du pH par ajout de
CO2 mais aussi l’agitation du milieu de culture dans le sens anti-trigonométrique (sens
horaire). Le mouvement principal est toutefois obtenu par l’agitation produite par la/les
hélice(s) marine(s) (Fig. 26 Droite). La forme torique (Fig. 26 Gauche) permet alors une
agitation efficace sans zones non agitées favorisant l’apparition de cellules stagnantes et
de biofilms (Pruvost et al., 2004).
39
Figure 26: Représentation de la géométrie (Gauche) du PBR torique avec ses dimensions, (Droite) de 2 types d'hélice utilisé pour l'agitation du PBR torique (Pruvost et al., 2006)
Tout comme la technologie Airlift, le champ de contraintes de cisaillement réparti
au sein du PBR est complexe et ne peut être réduit qu’à un chiffre moyen. Malgré une
bonne agitation sans zones mortes, les contraintes de cisaillement sont hétérogènes dans
l’ensemble du volume du PBR torique. L’agitation par hélice marine, engendre des
turbulences ainsi que des contraintes plus importantes que dans le reste du PBR, de même
que le point d’injection de gaz (malgré un faible débit d’injection maîtrisé par débitmètre
massique) génère des cisaillements ciblés plus importants. Cependant, la configuration de
la géométrie en boucle de ce PBR permet deux avantages. Tout d’abord la recirculation en
boucle entraîne toutes les cellules vers l’hélice qui ainsi subissent le même historique de
cisaillement au sein de la culture. D’autres part, une faible rotation de l’hélice (donc de
faibles contraintes de cisaillements) couplée à l’injection de gaz suffit à obtenir une bonne
efficacité de mélange (Pruvost et al., 2006).
40
Figure 27: Prédiction de la vitesse moyenne du fluide en PBR torique UO en fonction de la vitesse de rotation des 2 types d'hélices (Fig. 25) utilisées en Torique (Pruvost et al., 2006)
La corrélation entre la vitesse moyenne du fluide et la vitesse de rotation de l’hélice (Fig.
27) est comparée aux résultats de Khalid et Legrand (2001) effectués en boucle à section
circulaire. La vitesse moyenne obtenue par la rotation de l’hélice est un peu plus faible
que celle calculée par Khalid et Legrand, due à la section carrée de la géométrie du PBR
réduisant le débit induit de 10-20% des résultats. Comme présenté précédemment, de
fortes vitesses de rotations d’hélice ne sont pas nécessaires pour éviter la sédimentation
chez les microalgues pélagiques (par exemple, la culture de Chlamydomonas reinhardtii
en PBR Torique s’effectue à U0=0,05 m. s-1).
Figure 28: Prédiction des valeurs globales (VY), ε et εimp en fonction de la vitesse moyenne du flux en PBR Torique (Pruvost et al., 2006)
41
La Figure 28, montre l’évolution de la vitesse moyenne en direction de
l’atténuation de lumière au sein du PBR (VY), ainsi que le taux de cisaillement (ε imp et ε)
en fonction de la vitesse moyenne induite dans le PBR (UO) par la vitesse de rotation de
l’hélice. Le taux de cisaillement est séparé en deux pour différencier le cisaillement moyen
provoqué par l’hélice (ε imp) du cisaillement moyen en boucle (ε). Une évolution linéaire
des paramètres de cisaillement et de vitesse est observée. Les deux types d’hélice
permettent une redirection des microalgues dans le gradient d’atténuation de lumière,
qui se fait de plus en plus importante avec la vitesse moyenne engendrée par l’hélice. De
même, le taux de cisaillement augmente proportionnellement à la vitesse moyenne
induite par l’hélice, pouvant atteindre 90 s-1 en moyenne, 30 s-1 dans la boucle et 140 s-1
dans la zone de l’hélice (hélice 1) pour UO=0,4 m. s-1. Les résultats sont légèrement plus
faibles pour l’hélice 2 avec presque 70 s-1 moyen pour 30 s-1 en boucle et 110 s-1 dans la
zone de l’hélice.
10.3 L’impact des cisaillements sur les organismes microscopiques
unicellulaire libre et en tissus
10.3.1 La sensibilité des microalgues/cyanobactéries/tissus d’organismes
pluricellulaires
Malgré une génération de cisaillement au sein du PBR, l’agitation est essentielle
pour la culture de microorganisme non limitée et donc pour la production industrielle.
Cependant, dans la littérature, certains micro-organismes supportent moins bien
l’agitation. La tolérance des micro-organismes face à ces contraintes de cisaillements est
un phénomène complexe dépendant des facteurs physiologiques (benthique, pélagique,
croissance en colonie etc…) autant que des paramètres physiques (tailles, formes,
flagelles, filaments etc…) de chaque micro-organisme. De manière générale,
l’agitation/cisaillement affecte très peu les Chlorophycées mais elle affecte certaines
Cyanobactéries, Haptophytes, algues rouges, beaucoup de Diatomées et surtout les
Dinoflagellés qui sont considérés comme fragiles. Les tissus cellulaires (peau, organes
etc…) sont aussi étudiés dans la littérature pour leur comportement physiologique sous
contraintes. Après la récolte et la comparaison de ces informations (Table. 5), aucune
réelle corrélation n’a été observée entre la fragilité cellulaire, la forme, la taille ou même
la Classe des cellules étudiées face aux contraintes/taux de cisaillements.
42
Tableau 5 : Etude bibliographique de la sensibilité d'organismes cellulaires face aux taux de cisaillement
Type
d’organismes Classe Espèce
Aperçu
microscopique
Système de
culture
Cisaillement
limite
supporté
Références
Algue verte
Chlorodendrophyceae Tetraselmis
suecica
Rhéomètre 75 000 (s-1)
Michiels et al., 2015
Chlorophyceae Chlorella vulgaris
Cuve agitée 0,9 (Pa) Leupold et al., 2013
Chlorophyceae Senedesmus
obliquus
Cuve agitée 0,9 (Pa) Leupold et al., 2013
Chlorophyceae Chlamydomonas
reinhardtii
Cuve agitée 0,2 (Pa) Leupold et al., 2013
Les chiffres présentés proviennent de plusieurs études non liées entre elles et restent subjectifs. Ceci est du aux différences de temps et de techniques d’application des taux de cisaillement, régime d’écoulement des différentes études.
43
Algue rouge Porphyridiophyceae Porphyridium
cruentum
Cuve agitée 2 (Pa)
Cole K. M. & Sheath R. G.,
1990
Sobczuk et al., 2006
Cyanobactérie
Cyanophyceae Arthospira
platensis
Cuve agitée 2,2 (s-1) Mitsuhashi et al., 1995
Cyanophyceae Aphanizomenon
flos-aquae
Cuve agitée 0,45 (Pa)
Leupold et al., 2013
Bronnenmeier et Märkl,
1982
Synechocystis sp.
Barreau
aimanté 0,114 (Pa) Fadlallah et al., 1995
Diatomée Bacillariophyceae Phaeodactylum
tricornutum
Cuve agitée 7 000 (s-1) Contreras et al., 1998
44
Coscinodiscophyceae Skeletonema
costatum
Rhéomètre 5 000 (s-1) Michiels et al., 2015
Mediophyceae Chaetoceros
muelleri
Rhéomètre 930 (s-1) Michiels et al., 2010
Haptophytes Prymnesiophyceae Isochrysis
galbana
Rhéomètre 5 000 (s-1) Michiels et al., 2015
Dinoflagellé
Dinophyceae Protoceratium
reticulatum
Verrerie
agitée
0,12 (Pa)
0,16 (mPa)
Garcia et al., 2007
Camacho et al., 2007
Dinophyceae Lingulodinium
polyedrum
Rhéomètre 0,004 (Pa) Juhl et al., 2000
Dassow et Latz 2002
Dinophyceae Pyrocystis lunula
Microscope
à force
atomique
Light production
at
36 (µPa)
Tesson et Latz 2015
45
Système
immunitaire
vertébré
Mammalia Lymphocyte T
humain
10 – 20 (Pa) Chittur et al., 1988
Système
sanguin Mammalia
Erythrocyte
humain
Rhéomètre ≥ 2 000 (s-1) Mauer et al., 2016
Tissu
épithélial
ovarien
Insecta
Cellules Sf9
Spodoptera
frugiperda
Verrerie
agitée 0,084 (Pa) Connor et al., 2002
46
Après étude du tableau 5, il apparait que le cisaillement n’est pas qu’une fonction
de facteurs physiques mais aussi de facteurs biologiques, rendant la comparaison sur
cellules vivantes plus compliquée qu’une étude de résistance d’un solide inerte. D’autre
part, chaque analyse de fragilité a été effectuée dans différents systèmes menant à des
cisaillements d’intensité différentes, en type et en durée. Hormis l’importance physique
de l’agitation dans la production en bioréacteur, limiter la fragilité cellulaire à un seul
chiffre de contrainte/taux de cisaillement n’est pas suffisant pour comprendre la
complexité des phénomènes mis en jeu. Son impact sur la physiologie cellulaire, positif ou
négatif, est important à comprendre. Ce phénomène appelé la mécano-transduction ou
mécano-sensibilité regroupe les mécanismes physiologiques cellulaires engendrés par
des stimuli mécaniques, transformant ces signaux mécaniques en signaux électriques ou
chimiques (Griffin et al., 1992 ; Tavernarakis & Driscoll 1997). L’un de ces phénomènes le
plus impressionnant s’illustre sur la baie Laguna Grande à Porto Rico (Fig. 29) abritant un
consortium planctonique de dinoflagellés (Lingulodinium polyedrum, Pyrocystis lunula)
bioluminescentes sous stimuli mécaniques (Tesson et al., 2015 ; Dassow et Latz 2002).
Figure 29: (Gauche) plage de la baie Laguna Grande de nuit, Porto Rico et observation de bioluminescence sur les vagues ; (droite) isolement du consortium bioluminescent en laboratoire
Parmi ce consortium se démarque en concentration Pyrocystis lunula (Fig.30),
capable de synthétiser luciférine/luciférase, un complexe protéique bioluminescent dans
une stratégie de protection contre les prédateurs (Esaias & Curl 1972 ; Buskey & Swift
1985). Selon Tesson et Latz (2015), il suffit d’une contrainte de 36 µPa pour que cette
cellule irradie, une stimulation inférieure à 1.8 µPa ne déclenchant pas la synthèse
protéique bioluminescente. Ainsi, cela prouve l’importance des cisaillements et de leur
intensité dans la réponse des microorganismes.
47
Figure 30: Observation en microscopie optique de la dinoflagellé Pyrocystis lunula, (Gauche) sans agitation sous lumière ; (Droite) après agitation sans lumière
Un autre exemple de l’importance physiologique de la sensibilité aux contraintes
de cisaillement est la culture de tissus d’organismes pluricellulaires. La lignée Sf9 de
cellules ovariennes de Spodoptera frugiperda est une lignée de cellules se cultivant,
immobilisées en tissu mais aussi, libres en verrerie agitée (Fig. 31).
Figure 31: Observation en microscopie optique de la lignée cellulaire Sf9 de tissu ovarien de Spodoptera frugiperda, (Gauche) culture adhérente en tissu ; (Droite) culture libre agitée
Les cellules supportent de très faibles contraintes de cisaillement (0,084 Pa) mais
la culture en cellule libre reste possible. L’agitation d’une de ces cultures en tissu
provoque immédiatement la mort cellulaire, même à très faible agitation. Ainsi, le
problème de la sensibilité de cette souche aux contraintes n’est pas tant le fait des
cisaillements que celui de sa physiologie (Akhnoukh et al., 1993 ; Connor et al., 2002).
La structure cellulaire joue un rôle dans la fragilité aux contraintes mécaniques.
Selon les travaux de Barbosa et al. (2004), le mutant de Chlamydomonas reinhardtii
CC1883 cell wall mutant 15, ne possède pas de paroi cellulaire rigide contrairement à son
équivalent souche sauvage. Soumis aux mêmes contraintes liées au bullage en colonne, le
mutant CC1883 montre un taux de mortalité cellulaire de 1,01 ± 0,29 h-1 pour la même
48
vitesse superficielle du gaz mesuré à 0,085 m. s-1. Ainsi la constitution même de la
membrane cellulaire et le type de parois peuvent fortement altérer la réponse de la cellule
face aux contraintes de cisaillements. La majorité des algues vertes possèdent des parois
riches en cellulose, les cyanobactéries possèdent du peptidoglycane permettant une
certaine rigidité alors que les diatomées possèdent le frustule de silice amorphe formant
une protection de verre rigide. Cependant, le frustule ne rend pas les diatomées forcément
plus résistantes comme démontre Sobczuk et al., (2006). De plus, contrairement aux
autres formes de parois cellulaires, le frustule nécessite une étape d’ouverture lors de la
division asexuée et sexuée de la cellule, rendant potentiellement cette cellule sensible lors
de la division. Ainsi, une paroi rigide ne peut assurer à elle seule une grande résistance
aux contraintes de cisaillement.
Quelques études (Leupold et al., 2013 ; Fadlallah et al., 2016) montrent que le
nombre de couches dans la paroi cellulaire peut potentiellement permettre à la cellule de
résister aux contraintes, comme Scenedesmus obliquus et Synechocystis sp. qui compte
parmi les microalgues multi lamellaires. Cependant, Arthrospira platensis compte aussi
parmi ces organismes multi lamellaires sans pour autant être capable de résister à plus
de 2,2 s-1 (Mitsuhashi et al., 1995 ; Leupold et al., 2013). L’épaisseur des membranes
cellulaires semble elle aussi, peu responsable de la résistance de la cellule puisque que
Chlamydomonas reinhardtti qui possède une paroi de 200 nm est moins résistante que
Chlorella vulgaris avec une paroi de 17-21 nm (Wang et Lan, 2018).
La taille de la cellule est un élément sur lequel il est presque possible de corréler la
sensibilité à la contrainte. En effet, même dans un régime laminaire non parfait, il peut
survenir des micros vortex liés à l’imperfection des parois du système, la présence de
particules ou encore la viscosité du milieu liée à la croissance du microorganisme. Plus les
cellules sont petites et plus elles ont peu de risque d’être impactées par ses micro
perturbations hydrodynamiques. Cependant, les cellules plus grosses ou plus larges telles
que les Dinoflagellés, Diatomées ou Haptophytes sont plus enclines à souffrir de ce
phénomène. Ces microalgues font en moyenne, partie des plus sensibles à l’agitation.
Concernant la diversité de physiologie de croissance des microorganismes, elle est très
importante (libre, filaments, colonies etc…) et ce paramètre semble être déterminant dans
la fragilité cellulaire. De hautes contraintes de cisaillement entraînent la séparation des
filaments tels que ceux d’Arthrospira platensis ou encore Aphanizomenon flos-aquae
49
(Bronnenmeier et Märkl, 1982 ; Leupold et al., 2013). Cependant, une fois de plus, certains
microorganismes tels que Skeletonema costatum poussent en chaînettes et se montrent
2000 fois plus résistants qu’Arthrospira platensis, 5 fois plus que Chaetoceros muelleri et
aussi résistants qu’une cellule isolée d’Isochrysis galbana. Ou encore, Tetraselmis suecica
possède la même forme et la même taille que Chaetoceros muelleri, pourtant ce dernier
est 80 fois moins résistant que Tetraselmis suecica (Michiels et al., 2010 ; Michiels et al.,
2015).
Certaines microalgues sont motiles et possèdent des flagelles. Ces algues sont
souvent présentées comme plus sensibles aux contraintes de cisaillement et la
destruction de ce flagelle entraîne, le plus souvent, la mort de la microalgue. La majorité
des algues vertes ne possèdent pas de flagelle, mais Chlamydomonas reinhardtii est une
exception qui se montre plus sensible aux cisaillements (0.2 Pa) que beaucoup d’algues
vertes. Cependant, Tetraselmis suecica possède aussi jusqu’à 4 flagelles et se montre
particulièrement résistant (75 000 s-1 soit presque 75 Pa dans une viscosité proche de
celle de l’eau) malgré une perte de mobilité (Jaouen, 1988). Les dinoflagellés, organismes
majoritairement flagellés sont aussi considérés comme les plus sensibles des microalgues.
Malgré quelques exceptions telles que Tetraselmis suecica, les flagellés sont des
organismes majoritairement plus sensibles à l’agitation que les non flagellés, ainsi la
présence de flagelles semble être un élément déterminant dans la sensibilité à l’agitation.
Le métabolisme et les cycles de croissances sont aussi des facteurs qui peuvent
jouer un rôle dans le phénomène de sensibilité cellulaire. Beaucoup de microalgues sont
plus sensibles aux cisaillements lors de leurs divisions cellulaires, expliqué par le fait que
les cellules possèdent une taille plus importante et ces parois/membranes plus fines
(pendant un court temps) lors de la division cellulaire, comme Tetraselmis suecica,
Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana et Skeletonema costatum présenté par le travail
de Michels et al., (2016). L’exemple du système de division cellulaire des diatomées
présenté plus haut illustre aussi l’impact que pourrait avoir le cycle de division sur la
sensibilité aux contraintes. Cependant, contrairement à la relation du cycle de division
avec les cisaillements, le constat de l’impact du métabolisme sur la sensibilité aux
cisaillements est aussi important que celui de la sensibilité des cisaillements sur le
métabolisme. L’agitation mécanique peut engendrer la détérioration cellulaire ou
l’interruption de croissance (cas de la majorité des cellules présentées tableau 6). De
même que le tissu cellulaire de lignée Sf9 peut altérer /adapter son métabolisme pour
50
supporter une faible agitation et permettre une croissance plus rapide des cellules libres
agitées (Connor et al., 2002). Pour finir, Les lymphocytes T et érythrocyte humains,
montrent une capacité d’adaptation très importante face à l’altération de l’intensité des
contraintes de cisaillements et la viscosité du fluide en canalisation (représentation d’un
conduit sanguin), faisant varier leurs formes pour supporter les variations (Chittur et al.,
1988 ; Mauer et al., 2016).
10.3.2 La caractérisation de la fragilité d’Haslea ostrearia
Comme la majorité des diatomées, Haslea possède une coque de silice amorphe
appelée frustule. Cette coque apporte une protection aux diatomées mais permet aussi le
maintien de la membrane cellulaire (Crawford et al., 2001). Longtemps considérées
comme fragiles, les premières hypothèses de cette fragilité se sont reposées sur sa
structure de verre ainsi que de sa forme pennée. Cependant, la caractérisation de la
fragilité d’une souche ne dépend pas seulement des paramètres physiques de la structure
mais aussi de sa physiologie. De plus, il existe une grande diversité de systèmes de culture
qui possèdent chacun selon leurs formes, une diversité de mélange hydrodynamique et
donc de cisaillement. L’association entre les résultats de fragilité cellulaire et l’agitation
du réacteur est complexe. Les travaux de Rossignol (1999) ont permis de cerner les
limites physiques d’Haslea ostrearia face à différents systèmes de transferts et de
destruction cellulaire.
10.3.2.1 Passage dans une pompe péristaltique
Les premiers tests de Rossignol (1999), ont été faits dans des systèmes de transfert
de type pompes péristaltiques reconnus pour générer le moins de cisaillements possibles
(Le Borgne 2011). La viabilité cellulaire d’Haslea ostrearia a été mesurée après le passage
dans une pompe péristaltique à 3 temps de passages différents (Fig. 32).
51
Figure 32: Cinétique de croissance de culture après traitement en pompe péristaltique (Q=25 L. h-1) selon le
nombre de passage (étoile) témoin, + (croix) 10 passages, o (rond) 100 passages, ◻ (carré) 250 passages (Rossignol, 1999)
Haslea ostrearia montre une faible sensibilité à ce type de pompe après
250 passages au moins. Cependant, la sensibilité est moindre que chez les autres types de
systèmes testés par Rossignol. Aucune différence de taux de croissance après la remise en
culture des échantillons traités par pompes péristaltiques n’a cependant été constatée
mais les productivités baissent légèrement. On constate aussi, que même si la sensibilité
à 250 passages est faible, le nombre de passages est lui, aussi relativement faible, comparé
à l’utilisation d’une pompe de recirculation dans un PBR en continu où ces différents
passages peuvent durer sur plus d’un mois.
10.3.2.2 Impact des ultrasons
Les travaux de Rossignol se sont aussi concentrés sur l’étude de la sensibilité
d’Haslea aux ultrasons de manière à comprendre sa fragilité et envisager différentes
techniques de bioraffinage. Différentes expériences ont été réalisées permettant de
comprendre l’impact de la sonication sur les cellules d’Haslea (Fig. 33).
52
Figure 33: Influence de la puissance et de la durée de sonication sur le cassage des cellules d'Haslea ostrearia, V=300ml, □ (carrée) 550W, △ (triangle) 400W, ○ (rond) 300W (Rossignol 1999)
Selon ces résultats, la sonication à un effet non immédiat mais létal sur Haslea, avec
100% de mortalité apparaissant presque 2 minutes après le début de traitement à plus
haute intensité (550W). Cependant l’impact du volume de l’échantillon et donc de la
propagation des ultrasons dans le milieu de culture n’est pas négligeable (Fig. 34).
Figure 34: Influence du volume de suspension traité sur le cassage cellulaire d'Haslea ostrearia, P=550W, ◼
(Carré) 90s, ◻ (blanc) 60s (Rossignol 1999)
Cette méthode de cassage cellulaire ne semble pas détruire immédiatement les
cellules mais il est observé, par microscopie électronique à balayage (Fig. 35) que les deux
moitiés du frustule sont déboîtées, les parois sont altérées et visiblement percées par
endroit modifiant la membrane et permettant la libération du contenu cellulaire.
Cependant, les apex ne semblent pas altérés.
53
Figure 35: Observation de cellules d'Haslea ostrearia après traitement aux ultrasons par microscopie électronique à balayage : t=40s, P=400W, V=200mL (document LBM - ISOMer)
La puissance de sonication permet une meilleure efficacité de cassage de cellules
alors que le volume de suspension agit de manière inversement proportionnelle sur
l’efficacité de cassage.
10.3.2.3 Désintégration haute pression
Tout comme pour les travaux de sonication, de manière à pouvoir récupérer la
marennine intracellulaire, le système de broyage à haute pression a été utilisé pour
évaluer la résistance d’Haslea ostrearia à différentes pressions de 30 à 270 MPa (1 cycle)
(Fig. 36).
Figure 36: Influence de la pression du système de broyage haute pression sur le cassage cellulaire et la libération de marennine dans le milieu (1 cycle), ♦ (losange) dommages cellulaires, + (croix) diamètre moyen
des particules, ● (rond) marennine libérer (Rossignol 1999)
30 MPa permettent le broyage d’une partie des cellules mais c’est à partir de
100 MPa (1 cycle) que la totalité des cellules est broyée et que l’on obtient une
récupération optimale de marennine intracellulaire. Le rapport direct du cassage
54
cellulaire et de la dimension cellulaire est inversement proportionnel, dépendant de la
pression et du nombre de cycles (Fig. 37).
Figure 37: Influence du nombre de cycle du système de broyage haute pression sur la répartition de la taille des particules par granulométrie laser, (carré plein) culture initiale ; (carré vide) 30 MPa, 1 cycle ; (étoile)
30 MPa, 5 cycles ; o (rond) 150 MPa, 1 cycle. (Rossignol 1999)
L’analyse microscopique, quant à elle, montre la destruction du frustule après
traitement (Fig. 38), à la plus faible pression du système, allant jusqu’à détruire les
différentes couches du frustule.
Figure 38: Observation d'Haslea ostrearia par microscopie électronique à balayage (a) avant traitement, (b) après traitement (1 cycle 30 MPa) (Rossignol 1999)
Les expériences ont montré qu’Haslea ostrearia ne résiste pas à 30 MPa, la plus
faible pression du broyeur haute pression, ce qui est due selon Rossignol (1999) à sa taille,
sa forme pennée ainsi qu’aux caractéristiques physiques de son frustule.
55
10.3.2.4 Pompe à engrenages
La dernière technique utilisée par Rossignol (1999), pour le bio raffinage d’Haslea
ostrearia est le système de pompe à engrenages connu pour son fort potentiel de
cisaillement (Le Borgne 2011). Après observation au microscope électronique à balayage
(Fig.39), l’impact négatif de la pompe à engrenage est constaté sur la viabilité cellulaire
d’Haslea. L’étude de répartition granulométrique (Fig. 40) confirme ces résultats.
Figure 39: Observation de cellules d'Haslea ostrearia au microscope électronique à balayage avant (Gauche) et après passage dans une pompe à engrenage (Droite) (5L, 15min, 350 L. h-1) (document LBM - ISOMer)
En comparant avant et après traitement (par microscopie), les cellules semblent
brisées majoritairement au niveau des pointes ce qui est confirmé par granulométrie avec
un décalage du pic représentant les cellules entières (A1) vers un diamètre plus faible (A2).
Figure 40: Comparaison des répartitions granulométriques d'une culture d'Haslea ostrearia avant ⦁ (rond) et
après 100 passages ◻ (carré) dans la pompe à engrenages (300 L. h-1) (Rossignol 1999)
De même, la surface du pic correspondant à des fragments de cellules augmente
(B1 et B2) La présence de cellules cassées aux extrémités entraîne une répartition
granulométrique étendue des cellules (entre 5 et 15 µm de diamètre moyen).
56
Comme les travaux précédents de Rossignol, l’impact du cisaillement des pompes
dépend du nombre de cycles et de l’intensité du débit (Fig. 41).
Figure 41: Dégradation cellulaire en fonction du nombre de passages et du débit de circulation ◼ (carré) 200 L. h-1, ▲ (triangle) 300 L h-1, ● (rond) 400 L. h-1 (Rossignol 1999)
Selon la figure 41, plus le nombre de passages est important et plus la dégradation
cellulaire augmente, de même à nombre de passages identiques, l’augmentation du débit
de circulation augmente le taux de dégradation cellulaire. Selon Rossignol, cette
augmentation provient de l’augmentation de l’intensité des contraintes de cisaillement dû
à l’augmentation du débit, du changement de régime d’écoulement au sein de la pompe et
de l’augmentation de la fréquence de passages.
10.3.2.5 Centrifugation
Le procédé de centrifugation étant un procédé très utilisé pour la manipulation
laboratoire et préindustrielle d’une souche. Rossignol a cherché l’accélération et la durée
de centrifugation maximale que la souche pouvait supporter de 500 à 50 000 g sur des
durées de 1 à 90 minutes (Fig. 42).
57
Figure 42: Influence de l'accélération centrifuge sur la dégradation cellulaire et la libération de marennine (Rossignol 1999)
Les résultats montrent l’impact non négligeable de l’accélération centrifuge sur
Haslea ostrearia. En effet, au-dessus de 20 000 g presque 50% des cellules sont détruites,
ce qui est confirmé par une augmentation de la marennine relâchée dans le surnageant
par les cellules mortes. L’accélération maximale (50 000 g) engendre plus de 80% de
mortalité cellulaire ce qui valide l’impact négatif de l’accélération sur la souche.
L’impact de la durée de centrifugation sur le cassage cellulaire a été investigué
pour deux accélérations (15 000 g et 30 000 g) (Fig. 43).
Figure 43: Influence de la durée de centrifugation sur la dégradation cellulaire et la libération de marennine (Rossignol, 1999)
À une accélération <20 000 g, aucune dégradation significative est observée,
cependant, à une accélération >20 000 g, l’impact de la durée de centrifugation sur la
58
dégradation cellulaire est avéré et passe de 50% après 1min à plus de 60% après 45 min.
Une centrifugation <20 000 g pendant 15min est donc conseillée pour la
récolte/séparation d’Haslea ostrearia.
10.3.2.6 Conclusion
Toutes les techniques étudiées par Rossignol sont très efficaces pour le cassage
cellulaire d’Haslea ostrearia et démontrent ainsi que cette souche est particulièrement
sensible face aux systèmes de récolte, transfert et séparation. A l’origine mises en œuvre
pour mesurer l’efficacité d’extraction de la marennine intracellulaire, ces études
démontrent une fragilité liée à différentes caractéristiques physiologiques. D’après les
précédentes études par microscopie et granulométrie, Rossignol présente la Figure 44,
qui permet de comparer la répartition des tailles de cellule après traitement ultrasons,
pompe à engrenage et broyeur haute pression.
Figure 44: Comparaison de la granulométrie des suspensions selon la méthode de cassage cellulaire (Rossignol 1999)
La pompe à engrenages et les ultrasons sont des méthodes aussi efficaces pour la
libération de marennine mais les particules broyées restent de dimensions plus élevées
59
(diamètres compris entre 1 et 3 µm après). Le broyage haute pression, quant à lui, réduit
la cellule à des fragments de très faible diamètre (<1 µm). Le système de pompe à
engrenages semble casser très rapidement les apex cellulaires, alors que les ultrasons
« déboîtent » les deux parties du frustule (épithèque et hypothèque) libérant ainsi la
marennine interne. La technique de centrifugation n’est pas présentée sur la figure 44.
Cependant, les résultats montrent qu’il est nécessaire de manipuler cette souche à
15 000g maximum pendant 15 min pour ne pas observer de mortalité cellulaire.
Rossignol conclut ainsi, que parmi les techniques utilisées pour l’extraction de la
marennine, la pompe à engrenage représente le meilleur compromis : quantité extraite et
simplicité de mise en œuvre. Cependant, cela conclut aussi que l’apport ou le transport
d’Haslea ostrearia ne peut se faire par pompe sans altérer les rendements au sein du
photobioréacteur. Seul le système de pompe péristaltique semble avoir un faible impact
sur les cellules jusqu’à environ 200 passages à Q=25 L. h-1, mais les cultures supposeront
des débits parfois plus grands avec des fréquences de passages plus élevées, selon les
systèmes mis en œuvre
11 La culture microalgale en photobioréacteur
La culture de microalgues est ancestrale, elle avait déjà lieu il y a 2000 ans, en Chine,
où Nostoc, une cyanobactérie était récoltée pour l’élaboration de farine (Spolaore et al.,
2006). Au Mexique, en 1325, les Aztèques récoltaient la Spiruline dans le lac Texcoco pour
former des galettes séchées qu’ils consommaient (Belay et al., 1996). La première
production commerciale de spiruline démarre au Mexique par la compagnie Sosa
Texcoco, possédant plusieurs centaines d’hectares d’évaporateurs solaires en spirales
(pour une précédente activité de production de carbonate de sodium et chlorure de
calcium). Après un développement inattendu d’Arthropsira platensis, l’entreprise décida
d’utiliser en 1940, 20 hectares de ses évaporateurs pour la culture de cette cyanobactérie
(Fig. 45).
60
Figure 45: Infrastructures de production de spiruline de la compagnie Sosa Texcoco 1960
Très vite, le constat du besoin en lumière limitant les microalgues, entraîne
l’élaboration de systèmes spécifiquement pensés pour la production de microalgues,
appelés photobioréacteurs (PBRs) pour les plus contrôlés. Ces procédés de cultures sont
catégorisés par taille, niveau de contrôle des paramètres de culture (pH, température,
lumière, etc…), mode d’agitation, source lumineuse (solaire ou artificielle) ou encore
géométrie (plan, tubulaire, etc…). Aucun PBR de culture universelle n’a été créé pour
l’instant. L’intégration de la lumière dans le procédé le rend plus complexe qu’une
technologie classique. Ainsi, les technologies PBR actuelles, industrielles et de laboratoire,
dépendent de la zone géographique, des ressources à la disposition (eau, surface,
électricité, soleil…), des connaissances sur la souche cultivée (fragilité, extrêmophile,
besoin en lumière…), et du marché visé par l’application du procédé (agro-alimentaire,
cosmétique, pharmaceutique, environnement) (Borowitzka 1999 ; Chen et al., 2011 ;
Gouveia 2011). Cela amène au final à différentes technologies, chacune ayant ses
avantages et inconvénients.
11.1 Les systèmes de culture ouverts
Ces types de système de culture, sont les premiers apparus, permettant un contrôle
des paramètres de cultures moins efficaces (lumière souvent solaire, température peu ou
pas contrôlée, contaminations microbiennes importantes) a contrario des systèmes de
culture fermés. Permettant des productivités souvent plus faibles que les systèmes
fermés, ils sont moins coûteux (économique et énergétique). Ils permettent cependant,
des productions importantes sur de grandes surfaces. Les premiers systèmes sont des
bassins artificiels, aussi appelés lagunes telles que Sosa Texcoco ou encore Hutt Lagoon
en Australie (Fig. 46).
61
Figure 46: Vue aérienne d'une culture de Dunaliella salina à Hutt lagoon, Australie (infrastructure BASF)
Cela consiste en une étendue d’eau d’une profondeur généralement comprise entre
20 et 40 centimètres sans agitation. Dans ce cas, les paramètres de cultures ne sont pas
maîtrisés et les productivités dépendantes des conditions environnementales
(Borowitzka 1989). Par la suite, des systèmes ouverts agités ont été développés pour
éviter la sédimentation, améliorer l’accès à la lumière, aux nutriments mais aussi éviter
les gradients de pH et le phénomène de stratification thermique pouvant altérer la
productivité (Pulz et Scheibenbogen 1998). Les plus célèbres sont circulaires agités par
un bras de même rayon que le bassin, mais la surface d’occupation au sol est non optimale
(Chaumont 1993). Ils ont été très vite remplacés par les bassins agités nommés
« raceways », pour leur forme de « champs de courses » (Fig. 47). Cette technologie
contient environ 20 à 40 centimètres de volume de culture (pour les systèmes industriels)
agitée le plus souvent par l’intermédiaire d’une roue à aubes.
Figure 47:Vue aérienne des raceways de Cyanotech Co Hawaii, USA
62
Une variante sur la base du plan incliné (Doucha et Lívanský 1995). L’inclinaison
de 1,7% permet le ruissellement de la culture qui est réinjectée par des pompes (Fig. 48).
Ce principe permet l’augmentation de la surface spécifique éclairée (aS) limitant ainsi le
volume d’eau utilisé pour une même surface, permettant l’utilisation moins intensive
d’eau ainsi que la réduction du coût de séparation de la biomasse.
Figure 48: PBR cascade à Trebon, république Tchèque (Malapascua et al., 2014)
A l’échelle industrielle, les systèmes ouverts sont encore les plus utilisés dus à leurs
faibles coûts de construction et d’entretien. Cependant, le manque de contrôle de certains
paramètres de culture et la pression constante de la compétition microbienne ne
permettent pas d’obtenir les meilleurs résultats de productivités. De plus, toutes les
souches de microalgues ne sont pas capables de supporter ces conditions. Actuellement,
les extrêmophiles Dunaliella salina et Arthrospira platensis sont principlement cultivées
en condition industrielle dans des systèmes ouverts, car supportant des conditions
limitant la pression microbienne (respectivement hypersalinité et milieu fortement
alcalin). Un autre désavantage du système ouvert est le contact avec l’air ambiant. L’air
étant pauvre en CO2 par rapport aux besoins, le carbone inorganique transféré à la culture
sera faible, apportant une limitation pour la culture d’algue.
Selon Tredici (2003) la productivité d’Arthorspira platensis en système ouvert est
estimée à 40 t.ha-1.an-1, confirmé par une étude effectuée en Espagne (Jiménez et al.,
2003). Cependant, le climat en zone tempérée réduirait les rendements de 50%, confirmé
par l’étude de Tredici et Materassi (1992), avec un rendement de 20 t.ha-1.an-1 obtenu sur
plusieurs années.
63
11.2 Les systèmes de culture fermés
Plus évolué, ce type de système de culture généralement appelé photobioréacteur
(PBR), n’est que peu utilisé à l’échelle industrielle. Malgré des productivités plus
importantes et un niveau de contrôle des paramètres de culture optimaux, le prix en
fonctionnement, de construction et de maintenance ne permet de produire que des
métabolites à très hautes valeurs ajoutées, comme pour l’exemple de la société Alga
Technologies, Ltd, basée en Israël, leader mondial de la production d’astaxanthine
d’origine naturelle, cultivant Haematococcus en PBR tubulaires (Fig. 49) fermés (Prokop
et al., 2015). On note toutefois ces dernières années que plusieurs unités de production
ont été réalisé sur cette base technologique. On peut citer ici les 10 unités A4F au Portugal,
Subitec en Allemagne, Microphyte en France.
Figure 49: Système fermé de production d'Algatechnologie, Israël (http://WWW.algatech.com)
Les PBR sont très utilisés à l’échelle laboratoire, les PBR fermés permettent la
culture de microorganismes photosynthétique en conditions axénique complète. De plus,
la faible surface d’échange avec l’air ambiant permet une désorption du carbone limitée
et limite les carences en carbone. Finalement, ces systèmes de culture ont une surface
spécifique éclairée élevés. Toutes ces conditions permettent l’étude précise des réactions
biochimiques s’effectuant au sein du PBR et du comportement de l’outil biologique. Deux
PBR du GEPEA sont présentés ci-dessous, le photobioréacteur Torique à agitation
mécanique (Fig. 50 (Droite)) et le photobioréacteur Airlift agité par flux d’air, (Fig. 50
(Gauche)).
64
Figure 50: Culture d'Arthrospira platensis en photobioréacteur Airlift, GEPEA (Gauche). Culture de Chlorella vulgaris en photobioréacteur Torique, Algosolis (droite)
Contrairement aux systèmes de culture ouverts, valorisant l’éclairage solaire, les
systèmes fermés ont aussi la possibilité d’être lancés sous éclairage artificiel, permettant,
là encore, l’optimisation de la productivité ainsi que la précision des études scientifiques.
Ces systèmes sont alors séparés en trois catégories :
- Les systèmes classiques à éclairage artificiel : Précédemment présentés, souvent
de faible contenance pour des productions intensifiées et l’étude en laboratoire.
Pouvant, cependant être aussi utilisés pour des productions industrielles, c’est le
cas lorsque la nécessité est d’avoir tout au long de l’année une quantité et une
qualité de biomasse constante.
- Les systèmes classiques à éclairage solaire : Présents à l’échelle pré-industielle
pour le passage de l’échelle laboratoire (système éclairé) à l’industrielle (pilote)
mais aussi à l’échelle industrielle comme Alga Technologies, produisant une
molécule à haute valeur ajoutée.
- Les systèmes de rupture : De nouveaux systèmes au stade de développement,
comme la technologie Algofilm du GEPEA (Pruvost et al., 2017).
Les photobioréacteurs peuvent aussi être classés par technique d’agitation,
technologie Airlift, agitation bras mécanique ou hélice, recirculation, etc… faisant varier
la géométrie des systèmes. La technologie photobioréacteur est encore en pleine
évolution. Dans le but de réduire les coûts de consommations (notamment en eau et
d’électricité (éclairage)) et d’augmenter les productivités en biomasse obtenues, de
nouveaux systèmes de culture sont actuellement en développement. Il n’existe pas de
65
photobioréacteur idéal adapté à la culture de toutes les algues et aux situations
particulières et chaque contrainte, y compris biologique, devra être prise en compte pour
le passage à une production industrielle.
11.3 Facteurs limitants de la croissance micro-algale
11.3.1 La lumière
11.3.1.1 Atténuation de la lumière en PBR et les régimes de production en PBR
La lumière représente le paramètre le plus important d’une production de
microalgues en condition autotrophe car elle conditionne la croissance par la
photosynthèse et donc la productivité (biomasse et/ou molécule d’intérêt) de notre
système. Considérant alors la lumière comme un « nutriment » pour la croissance des
algues, l’irradiance se propageant dans le PBR sera donc « consommée » par la population
de microorganismes photosynthétiques du PBR. Cependant, contrairement aux macros et
micronutriements ajoutés directement au sein du PBR via le milieu de culture, l’énergie
lumineuse est hétérogène dans le volume du PBR. Elle varie en fonction de la
concentration de la biomasse produite (les cellules plus nombreuses vont absorber plus
de photon) et éventuellement de la production de certaines molécules capables
d’absorber/réfracter la lumière. Connaître et contrôler la quantité de lumière au sein du
système de production est donc essentiel pour obtenir des productivités maximales de la
microalgue.
Comme souligné précédemment, l’atténuation de la lumière sera dépendante de la
lumière captée en surface du PBR appelée PFD (Photon Flux Density exprimée en µmolhv.
m-2. s-1), de la concentration en biomasse (Cx), souvent exprimée en g. L-1, des propriétés
radiatives du microorganisme photosynthétique dépendantes elles-mêmes, de la teneur
en pigment (exprimé en %) et de la forme de la cellule cultivée, ainsi que des propriétés
physiques de sa structure cellulaire (Souliès 2014). Trois régimes d’atténuation de la
lumière au sein du PBR ont pu être mis en évidence, donnant lieu à différentes
performances de production pour une même culture (Pruvost et Cornet, 2012).
Représentée par γ, la fraction volumique éclairée du PBR est définie par la lumière reçue
par les microalgues (ou irradiance, noté G) dans un volume donné. Ce paramètre γ, est
donc le ratio entre le volume éclairé et le volume total du PBR. L’intensité lumineuse
diminuant au sein du PBR pour les raisons précédemment citées, il existe alors, au sein du
66
PBR une zone éclairée permettant la croissance microalguale et une zone trop sombre
pour assurer une croissance positive. Ces deux zones sont délimitées par l’irradiance de
compensation notée Gc. Les trois régimes décrits sont :
- Le régime de culture photo-inhibée (Fig. 51) :
Figure 51: Profil d'atténuation lumineuse pour un PBR plan en régime photo-inhibé (Prusvot et Cornet, 2012)
Ce régime aussi appelé régime cinétique, signifie que tout le flux de photons n’est
pas absorbé par la culture, ainsi γ>1. Comme présenté sur la figure 51, toute la lumière
n’est pas absorbée par la biomasse, celle-ci était trop faible en concentration. Cela peut
amener également à une lumière reçue par cellule très importante, pouvant diminuer les
performances en croissance, voire photo-inhiber les cellules. Les microalgues vont alors
diminuer la production de chlorophylle et augmenter celle de caroténoïdes protecteurs
(effet de photo-inhibition). Cette instabilité pigmentaire entraîne, sur de très faibles
écarts de temps de résidence, une instabilité de productivité flagrante. Ce type de culture
n’est donc pas stable dans le temps pour des productions industrielles, avec la
conséquence d’une instabilité des conditions photosynthétiques, ce qui ne permet pas
d’obtenir les meilleurs rendements de productivité.
- Le régime de culture luminostat (Fig. 52) :
67
Figure 52: Profil d'atténuation lumineuse pour un PBR plan en régime luminostat (Prusvot et Cornet, 2012)
Ce régime signifie que l’intégralité de la lumière est absorbée par la culture, sans
apparition d’une zone sombre. Ainsi γ=1 comme présenté sur la figure 52. Cette situation
permet d’atteindre la productivité maximale ainsi qu’une stabilité pigmentaire durable en
limitant l’apparition du phénomène de respiration, pour des productions industrielles de
microalgues.
- Le régime de culture photolimitée (Fig. 53) :
Figure 53: Profil d'atténuation lumineuse pour un PBR plan en régime photolimité (Pruvost et Cornet, 2012)
Ce régime de culture signifie que l’intégralité de la lumière est absorbée par la
culture. Cependant dans ce cas, une zone d’ombre apparaît, favorisant le phénomène de
respiration au sein du PBR, amenant donc à une diminution des performances en culture.
68
Un temps de résidence long va augmenter la concentration en biomasse et augmenter le
volume de la zone sombre. Cela diminuera tout autant la productivité.
11.3.1.2 Caractérisation de l’absorption du flux lumineux par les microalgues
Souvent utilisée pour lier la croissance d’une culture de microalgues au paramètre
lumineux, l’irradiance G ne permet pas, seule, de comprendre le flux de lumière absorbé
par unité de biomasse microalgale. Comme présenté précédemment, l’absorption
lumineuse par les microalgues dépendent de leurs formes, tailles, structure et
composition pigmentaire. Ainsi, il est plus pertinent de considérer le flux absorbé plutôt
que le flux disponible pour la caractérisation du comportement d’une culture en PBR. La
vitesse d’absorption de photons ou RPA (Rate of Photons Absorption) exprimée en
µmolh𝑣. Kgx-1. s-1 et notée A est utilisée pour caractériser l’absorption du flux lumineux
(Cornet et al.,1998 ; Pruvost et al.,2008 ; Kandilian et al., 2014). Cette vitesse spécifique
d’absorption de photons par unité de biomasse est liée à l’irradiance G et au coefficient
massique d’absorption de la biomasse Ea (propriétés radiatives de la biomasse), celui-ci
pouvant être déterminé par spectrophotométrie à sphère d’intégration (Pilon et al., 2011)
ou par prédiction théorique (Pottie et al., 2005).
Les travaux du GEPEA (Pruvost et Cornet, 2012) permettent de considérer
l’atténuation de la lumière sur une seule dimension (épaisseur de la culture notée L) grâce
à l’utilisation de PBR plans et la captation de la lumière en surface de manière homogène.
L’atténuation lumineuse au sein d’une culture est alors représentée par le modèle dit à
deux flux (Cornet et al., 1995 ; Cornet et al., 1992) utilisant le modèle de Schuster (1905)
décrivant le comportement de la lumière dans une atmosphère brumeuse mais en prenant
en compte les propriétés radiatives des microalgues (effets d’absorption et de diffusion
de la lumière par les microalgues). Les travaux de Kandilian (2016) ont permis d’obtenir
les propriétés radiatives de Chlorella vulgaris. Une fois ces données connues, il est possible
de déduire soit le champ de vitesse d’absorption de photon, soit la moyenne sur la valeur
de culture (appelé MRA, pour Mean Rate of Photon Absorption). Cependant, dans le cas
où la forme, la composition pigmentaire, la taille et la structure sont différentes de
Chlorella, ou que ces informations sont difficiles d’accès, il est possible de mesurer la
valeur de MRPA par un bilan sur la phase photonique dans le volume de culture (Pruvost
et al., 2008) :
69
Équation 6
𝑨 =𝑺
𝑽 𝑪𝑿
(𝒒𝑶 − 𝒒𝑳) =𝒂𝑺
𝑪𝑿
(𝒒𝑶 − 𝒒𝑳)
Où q0 et qL représentent respectivement le flux de photon à l’entrée et à la sortie
du système en µmol m-2 s-1. CX représente la concentration de biomasse g. L-1. aS
représente la surface spécifique du PBR, soit le rapport entre la surface éclairée et le
volume du PBR (en m-1). Ce paramètre est lié au système de culture.
11.3.2 La température
La température est une condition essentielle à la culture en photobioréacteur car
elle impacte l’efficacité de l’activité enzymatique cellulaire et indirectement les réactions
photochimiques (Raven et Geider, 1988). Une température de culture non optimale
affecte la croissance de la microalgue et entraîne des productivités plus faibles mais
engendre aussi de possibles stress conjugués lors de l’étude des paramètres de culture,
modifiant la composition et/ou la réaction de la microalgue face aux conditions, comme
Raven et Geider le montrent sur les lipides.
La majorité des microalgues sont mésophiles, ainsi, elles possèdent une
température optimale de croissance comprise entre 15 et 40 °C (Richmond et Hu, 2008).
Les organismes psychrophiles (TOPT<15°C) et thermophiles (TOPT>50°C) sont capables de
croître en conditions extrêmes. Cependant, aucun microorganisme photosynthétique
possédant une température optimale supérieure à 75°C n’a été pour l’instant découvert
(Due à l’instabilité de la chlorophylle à cette température) (Varshney et al., 2015). Les
travaux de Ras et al., (2013) apportent des précisions sur les gammes de températures
supportées par différents groupes taxonomiques de microorganismes photosynthétiques
(Table. 6).
Tableau 6 : Gamme de température supporté par 5 groupes taxonomiques de microorganismes photosynthétique (Ras et al., 2013)
Groupes
Taxonomique Echelle de température (°C)
Bacillariophyceae 5-25
Dinophyceae 15-25
Prymnesiophyceae 16-25
Cyanophyceae 15-36
Chlorophyceae 20-36
70
Peu de microorganismes photosynthétiques connus et cultivés à l’échelle
industrielle, se cultivent à des températures supérieures à 30°C, à part Spirulina.
Lemasson (2011) compare plusieurs modèles de croissance de la microalgue Chlorella
vulgaris par rapport au paramètre température et démontre que la productivité d’une
culture continue pourrait être modélisée par des modèles utilisés pour la croissance des
plantes supérieures (modèle d’Alexandrov) ou celle des bactéries (modèles
d’Hinshelwood et de Ratkowsky) (Fig. 54).
Figure 54: Evolution de la productivité surfacique en biomasse de Chlorella vulgaris en fonction de la
température (PFD =130 μmolhv. m-2. s-1) (Souliès 2014)
D’autres travaux (Butterwick et al., 2005 ; Kudo et al., 2000 ; Xin et al., 2011 ;
Dermoun et Chaumont, 1992) mettent en lumière la diversité du comportement
microalgal face à la température (Fig. 55). Cependant, malgré cette diversité, les résultats
de la culture de Chlorella vulgaris correspond aux modèles d’Alexandrov, d’Hinshelwood
et de Ratkowsky qui centre la température optimale de croissance entre 20 – 25 °C.
71
Figure 55: effet de la température sur le taux de croissance de Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus sp., Dinobryon divergens et Porphyridium cruentum (Ras et al., 2013)
La température ne va pas altérer que les caractéristiques physiologiques de la
souche mais va avoir un impact non négligeable sur la chimie du milieu de culture, et ainsi
altérer les rendements de la culture. Les travaux de Le Gouic (2013) mettent en évidence
cet impact sur la solubilité du carbone, même dans les conditions de températures
supportées par les cellules (Table. 7).
Tableau 7: Evolution de la solubilité du carbone en fonction de la température, PCO2=380 ppm (Le Gouic, 2013)
Température Solubilité (Kg. m-3) 10 2,37 15 2,01 20 1,72 25 1,50
Ainsi, la culture en PBR thermostaté, conduit à de meilleures productivités (à
température optimale de croissance) et à des résultats reproductibles.
11.3.3 Le pH
De même que pour la température, une gamme de pH optimale de croissance de
chaque microalgue existe. Chlorella vulgaris est capable de croître dans des cultures à pH
compris entre 5 et 9. Cependant, les croissances optimales sont obtenues dans des
cultures à pH compris entre 7 et 8. Les cyanobactéries sont souvent capables de supporter
des gammes de pH plus élevées, et donc des conditions de cultures souvent moins
axéniques, comme dans le cas des cultures ouvertes à pH 10 de spiruline (Richmond
1986).
72
Tout comme pour le cas de la température, le contrôle du pH au cours d’une culture
en photobioréacteur est essentiel pour la reproductibilité des résultats et l’assurance
d’obtenir des productivités optimales (à pH optimale de croissance).
Il est possible de réguler le pH de différentes manières :
- Par l’ajout de NaOH ou HCl, à l’image des cultures de microorganismes en
bioréacteurs. Le phénomène de respiration engendrant la décroissance de pH au
cours de la culture (Phase sombre), il est nécessaire de rajouter du NaOH pour
contrôler le pH. Dans le cas d’une culture autotrophe, le phénomène de
photosynthèse engendre une croissance du pH au cours de la culture, l’ajout d’HCl
est nécessaire.
- Par l’ajout de CO2. L’augmentation du pH liée au phénomène de photosynthèse,
peut être régulée par l’ajout de CO2, dont l’acidité tamponne le pH de la culture.
Ainsi, cette technique permet la régulation du pH tout en assurant un apport en
carbone inorganique constant.
Cette montée en pH des cultures en photo-auhotrophie est liée à la consommation
du Carbone Inorganique Dissous (CID), absorbé sous forme de HCO3 dans les
chloroplastes et consommé sous forme de CO2 comme le montre l’équilibre chimique
suivant (Eq. 7) :
Équation 7
𝑯+ + 𝑯𝑪𝑶𝟑 → 𝑪𝑶𝟐 + 𝑯𝟐𝑶
La Rubisco fixe le CO2 produit dans le cycle de Calvin et consomme le proton (H+)
libéré lors du processus photosynthétique. La transformation du HCO3– en CO2 libère alors
un ion OH- au sein de la cellule, qui doit le neutraliser par l’absorption de H+
extracellulaire. La baisse de H+ dans le milieu entraîne donc la montée du pH (Chi et al.,
2011).
En système de culture ouvert, la concentration en carbone inorganique au sein de
la culture et en équilibre avec l’atmosphère contenant des concentrations proches de
380ppm en CO2 (Le Gouic, 2013). Ainsi l’ajout de CO2 en continus justifie pour assurer un
apport en carbone inorganique constant. L’injection de CO2 en PBR assure donc une
73
culture non limitée en carbone inorganique. Les études de Le Gouic, basées sur Chlorella
vulgaris, permettent d’affirmer des besoins de 10 mM en CID pour une culture non limitée
de 1g. L-1 (MS). Ce carbone est apporté en début de culture par du bicarbonate de sodium
et/ou alimenté au cours de la culture par injection de CO2.
Le CID est présent sous différentes formes dont l’équilibre et la physico-chimie est
régie par le pH de la culture (Fig. 56).
Figure 56: Représentation des fractions molaires de carbone dissous en fonction du pH à 25°C (Kaplan et al., 1986)
Seul le CID sous forme de CO2 est soumis au phénomène d’équilibre entre les
phases aqueuses et gazeuses, pouvant engendrer une désorption du CID de la culture.
Ainsi, comme représenté sur la figure 56, les pH élevés à partir de 8 favorisent une faible
désorption du CO2 du fait d’une faible concentration en CO2 dissous dans le milieu. Ce
phénomène est souvent mis à profit dans les cultures de Spiruline en système de culture
ouvert pH>9. Cependant, la proportion plus importante des autres formes de carbone à
pH élevé, peut aussi engendrer des réactions inattendues entre espèces chimiques au sein
du milieu de culture, comme la précipitation des sels minéraux (Olsen et al., 2006).
11.3.4 La composition du milieu de culture
La composition du milieu de culture est essentielle pour la culture non limitée des
microalgues. Les microorganismes autotrophes consomment des nutriments sous forme
de minéraux divisés en deux classes, les macronutriments et les micronutriments.
74
Les macronutriments constituent les éléments que la microalgue requiert (mais ne
consomme pas forcément) une forte concentration (supérieure à 10 mg. g-1 de masse
sèche) tels que le carbone, l’azote, l’hydrogène, le phosphate, le calcium, le magnésium, le
souffre, le potassium et la silice pour les diatomées (Kaplan et al., 1986 ; Grobbelaar
2003). Le carbone est l’élément majoritaire qui constitue la biomasse, il représente
environ la moitié de la masse sèche de la microalgue. L’hydrogène et l'oxygène sont
présents en grande quantité aussi, mais obtenus à partir de la photolyse de l’eau ou par
consommation de l’oxygène dissous. Ainsi, le deuxième élément le plus important à
fournir après le carbone est l’azote dont la proportion peut varier de 1 à 10% de la matière
sèche. Ce macronutriment est indispensable à la production de pigments (essentiel à la
photosynthèse) et aux protéines (multiplication cellulaire). Dans le cas des diatomées, la
proportion de l’azote est souvent de l’ordre de 1 %, mais la cellule consomme aussi en
concentration similaire, la silice pour constituer son frustule. L’azote est consommé sous
forme d’ions nitrates pour la majorité des cas, mais peut aussi être consommé sous forme
d’ammonium ou encore de nitrite (dépend des espèces). Certains microorganismes sont
capables de consommer des formes organiques (urée) ou encore sous forme gazeuse (N2)
(Kaplan et al., 1986).
Le troisième élément essentiel à la croissance cellulaire est le phosphore. Il
représente en moyenne moins de 1% de la masse sèche, mais reste majeur pour la
production d’énergie chimique (ATP). Il est assimilé sous forme inorganique (HPO2-,
H2PO4-) mais certaines algues consomment du phosphate sous forme organique (Na2-β-
Glycérophosphate) (Andersen 2005). Le tableau suivant présente ces nutriments et ce
qu’ils représentent en termes de pourcentage dans la matière sèche selon Grobbelaar
(2003) (Table. 8).
Tableau 8: liste des macroéléments nécessaires à la croissance microalgale (Grobbelaar 2003)
Macroéléments Composés % de la matière sèche
C CO2, HCO3-, CO32-, molécules
organiques 17,5-65
O O2, H2O, molécules organiques 20,5-33
H H2O, H2S, molécules organiques 2,9-10
N N2, NH4+, NO3-, NO2-, aminoacides, urée
etc. 1-14
75
Na Multiples sels inorganiques (NaCl,
Na2SO4…) 0,04-4,7
K Multiples sels inorganiques (KCl,
K2SO4…) 0,1-7,5
Ca Multiples sels inorganiques (CaCl2,
CaCO3…) 0-8
P H2PO4-, HPO4
2- 0,05-3,3
S Multiples sels inorganiques (MgSO4…) 0,15-1,6
Mg Multiples sels inorganiques (MgSO4,
MgCl) 0,05-7,5
Cl NaCl, KCl, CaCl2… -
Si Na3SiO3, 9H2O 0-23
Les micronutriments constituent les éléments que la microalgue requiert (mais ne
consomme pas forcément) à faible concentration (Inférieur à 10 mg. gx-1 de la masse
sèche) tel que le fer, le brome, le manganèse, le cuivre, le molybdène, le valium, le cobalt,
le nickel, le sélénium, l’aluminium, le lithium, le rubidium ainsi que les vitamines et autres
facteurs de croissance (Kaplan et al., 1986 ; Grobbelaar 2003). Bien que présents en
faibles quantités, ces éléments sont essentiels pour la croissance des microalgues.
Cependant, peu d’études déterminent des besoins précis en micronutriments et leur
dosage reste encore à l’heure actuelle très complexe en raison des faibles concentrations.
Le tableau suivant présente ces nutriments et ce qu’ils représentent en termes de
pourcentage de matière sèche selon Grobbelaar (2003) (Table. 9).
Tableau 9: liste des microéléments nécessaires à la croissance microalgale (Grobbelaar 2003)
Microélément Composés % de la matière sèche
Fe FeCl3, Fe(NH4)2SO4 0,02-3,4
Zn, Mn, Br, B, Mo, V, Sr,
Al, Rb, Li, Cu, Co, I, Se - <0,1
Ce manque de connaissances sur les besoins en microéléments des microalgues a
poussé les premiers chercheurs dans le domaine, à baser leurs milieux de culture sur la
composition de leurs environnements naturels respectifs. La composition des
76
échantillons de substrats naturels est analysée et certains milieux de culture sont même
élaborés à partir des substrats naturels stérilisés (eau de mer, eau minérale, terre,
sédiments, etc… (Andersen, 2005)). La culture de microalgue intensive en PBR nécessite
un milieu de culture concentré en macro et macronutriment pour s’assurer d’une culture
non limitée et des productivités importantes. De même, un milieu artificiel est nécessaire
pour s’assurer d’une reproductibilité des résultats de productivités. Dans le cas de la
culture d’Haslea ostrearia, le laboratoire MMS a déjà cherché à optimiser la composition
du milieu de culture pour l’élaboration d’un milieu d’eau de mer artificiel, appelé DAM
(Gagneux et al., 2007).
11.3.5 L’agitation
L’agitation n’est pas considérée, dans la majorité des cas, comme un paramètre
directement lié à la croissance de la cellule. Cependant, comme présenté chapitre I.4.3,
certains microorganismes répondent différemment au facteur agitation.
D’un point de vue biologique, certaines microalgues possèdent une physiologie
nécessitant une agitation plus faible voire aucune agitation. Cette agitation induit des
forces (contraintes) pouvant hypothétiquement altérer l’intégrité physique de la cellule
ou inhiber la croissance par un phénomène de mécano-sensitivité. Il est généralement
constaté que certaines microalgues (dont Haslea ostrearia) ne peuvent supporter une
agitation conventionnelle, sans altérer les productivités, faisant du paramètre agitation,
un paramètre limitant au sein du PBR.
D’un point de vue physique, le paramètre agitation est considéré comme le plus
important depuis la mise en place des premiers réacteurs chimiques et bioréacteurs, au
même titre que la température et le pH (Hochfeld, 2005 ; Gabelle et al., 2012). L’agitation
permet l’optimisation de la cinétique de réaction chimique, favorisant l’homogénéité de
plusieurs paramètres tels que la thermique, la salinité, le pH et la concentration en
biomasse (pour les bioréacteurs et PBR). Ainsi, indirectement liés, le contrôle et le
maintien d’une bonne agitation permettent d’optimiser la productivité en biomasse en
bio-procédé.
Pour la culture de microalgues, les essais de Phillips et Myers en 1950, démontrent
qu’une culture agitée produit une biomasse plus dense. Ils expliquent cette différence par
la présence de gradients thermiques et de pH au sein du système de culture non agité
77
(Richmond et Hu, 2008). De plus, les travaux de Pruvost et Cornet (2012) présentent
l’homogénéité d’une culture comme un aspect essentiel pour de bonnes productivités
dues à un accès homogène des cellules à la lumière. Différents systèmes d’agitation sont
utilisés en PBR, des systèmes mécaniques et non-mécaniques, permettant la mise en
mouvement des microalgues. L’agitation non mécanique est l’agitation par bullage. Ce
type d’agitation à deux avantages : les contraintes de cisaillement générées sont
généralement faibles. De plus, il permet de favoriser le transfert de l’oxygène dissous de
la phase liquide vers la phase gazeuse, ce qui réduit le risque d’inhibition de la croissance
lié à une trop forte concentration en oxygène dans le milieu de culture (Kazbar, 2018).
L’agitation mécanique peut s’effectuer via une pompe de recirculation, une hélice
marine, une roue à aube ou encore par agitation manuelle en fonction de l’application et
de la géométrie du système de culture utilisé.
11.4 La culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur
Malgré la difficulté de cultiver Haslea ostrearia, le GEPEA et le MMS ont mis en place
différents types de systèmes de culture en cellules libres et en cellules immobilisées
(Rossignol 1999 ; Lebeau et al., 2000). Les hypothèses de l’incapacité d’Haslea ostrearia à
croître en système de cultures conventionnelles sont nombreuses. Les besoins en
nutriments de cette souche sont, depuis longtemps remis en question, ainsi que la gestion
des paramètres de cultures (Température, pH et irradiance). Cependant, l’agitation et plus
précisément les contraintes de cisaillement sont souvent citées.
11.4.1 Culture en cellules libres agitée
Peu de photobioréacteurs conventionnels en cultures agitées ont été utilisés pour
cultiver Haslea ostrearia, car la culture en erlenmeyer agité et en PBR montre déjà une
mort cellulaire (Jubeau, 2009). Très vite, l’agitation est apparue comme un paramètre
suspecté d’inhiber la croissance et/ou briser les cellules d’Haslea. Le GEPEA s’est penché
sur l’étude de la résistance d’Haslea en soumettant la cellule à des systèmes de
recirculation et de destruction cellulaire (Présenté chapitre I.4.3.2) et constate une
sensibilité réelle plus importante face à ces systèmes chez Haslea que chez d’autres
microalgues modèles cultivées au laboratoire (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas
reinhardtii etc…).
78
Jubeau (2009) a essayé de cultiver Haslea ostrearia au GEPEA dans le premier PBR
de technologie Airlift, malheureusement sans succès (Fig. 57).
Figure 57: Photographie de la première culture d'Haslea ostrearia en photobioréacteur de technologie Airlift au GEPEA (Jubeau, 2009)
L’agitation a donc toujours été une problématique essentielle à la culture d’Haslea
ostrearia poussant les scientifiques du GEPEA et de MMS à se tourner vers d’autres
technologies. Les travaux de Rossignol et al., 1999, permettent ainsi la culture d’Haslea en
cellules libres agitées grâce à la mise en place d’un photobioréacteur à membrane
immergée (Fig. 58).
79
Figure 58: Installation expérimentale d'un photobioréacteur à membrane immergée pour la culture d'Haslea ostrearia (Rossignol et al., 1999)
Le PBR à membrane immergée est constitué d’un cylindre de verre de 40 cm de
hauteur, 15 cm de diamètre d’un volume total de 7 L pour un volume réactionnel de 6 L.
Deux modules plans d’ultrafiltration de 2 x 45 cm2, en polyacrylonitrile, à un seuil de
coupure de 40 KDa (IRIS 3038 Orelis, Miribel-France), sont placés au fond du PBR. Le
principe de ce PBR consiste à filtrer le surnageant au court du temps grâce à la force
hydrostatique de l’eau, puis de renvoyer, une fois par jour, du milieu de culture frais en «
retrolavage » par la membrane sous un gradient hydrostatique de 6 kPa. Pour optimiser
le transfert de nutriments, le PBR est agité par barreau aimanté pendant 5 min après
l’addition du milieu frais. Les faibles coûts et les faibles cisaillements générés par une
circulation de substrats sans pompe, représentent tout l’intérêt de ce système de culture.
Les productivités en marennine de ce système atteignent 2,45 ± 0,25 mgEMn. L-1. J-1
(Rossignol et al., 1999) et son considéré comme un record pour l’époque.
11.4.2 Culture en cellule immobilisées
L’immobilisation cellulaire consiste à fixer une cellule à un support. Ce concept est
divisé en deux types : l’immobilisation passive et active.
80
11.4.2.1 L’immobilisation cellulaire passive
L’immobilisation passive consiste à fixer des cellules sur support en utilisant la
capacité naturelle de ces cellules à produire une matrice adhérente au support (Moreno-
Garrido, 2013). Haslea ostrearia semblant en être capable de par sa physiologie (Rincé et
al., 1999), le laboratoire MMS a développé cette technologie. Dans un premier temps, la
culture de cellules immobilisées passivement s’est effectuée en système de culture fermé
à éclairage artificiel tel que les erlenmeyers et les bonbonnes de verre borosilicatées non
agitées (Fig. 59).
Figure 59: Photographie de cultures d'Haslea ostrearia en immobilisation cellulaire passive : (Gauche) en erlenmeyer non agité 500 mL, (Droite) en bonbonne de verre borosilicaté non agité 10 L
Basées sur les travaux du laboratoire MMS, ces techniques de culture permettent
d’atteindre de 2 à 10 mg. L-1 de marennine extracellulaire en condition de batch
(Rossignol 1999 ; Jubeau 2009 ; Prasetiya et al., 2016). Le laboratoire canadien de l’UQAR
a lui aussi développé des systèmes de cultures fermés à éclairage artificiel expérimental.
Les PBR de 100 L (Fig. 60) permettent de monter à des concentrations en marennine
d’environ 6 mg. L-1 et des productivités en batch de 0,2 mgEMn. L-1. J-1 (Gastineau et al.,
2014 ; Turcotte et al., 2016).
81
Figure 60: Culture d'Haslea ostrearia dans les PBR expérimentaux UQAR : (a) photographie de deux des PBR, (b) courbe de la EMn mesuré dans le surnageant durant 35 jours de batch (Gastineau et al., 2014)
Le laboratoire MMS a de son côté mis en place un système de culture ouvert à
éclairage solaire de 10 m3, ouvrant la voie de la culture d’Haslea ostrearia en extérieur
pour des applications ostréicoles (Fig. 61).
Figure 61: Méthodologie de la préparation de la culture d'Haslea ostrearia en tank de 500 L et en open pond expérimental de 10m3 (Turpin et al., 2001)
Les conditions de culture de ce système sont moins contrôlées que pour le cas de
systèmes fermés. Les productivités obtenues sont présentées ci-dessous (Fig. 62).
82
Figure 62: Variation de la densité cellulaire et de la concentration en marennine dans le surnageant au sein des culture en batch d'Haslea ostrearia (en tank 500 L et pond 10 m3) (Turpin et al., 2001)
Ce système permet d’atteindre une concentration de 2 x 107 cellules. L-1 et une
concentration en marennine extracellulaire de 3,4 mg. L-1, soit une productivité
volumique moyenne de 0,34 mg. L-1. J-1.
11.4.2.2 L’immobilisation cellulaire active
L’immobilisation cellulaire active consiste à fixer des cellules sur support ou
bloquer les cellules dans une matrice, en utilisant une technologie d’immobilisation
biocompatible pour adhérer/ bloquer les cellules sur/dans le support (Moreno-Garrido,
2013). Parmi les méthodes d’immobilisation, beaucoup sont utilisées pour les
microorganismes non photosynthétiques tels que l’immobilisation dans/sur la mousse
synthétique, les billes/le gel de silice, des fibres de matériaux rugueux etc… La contrainte
de la propagation de la lumière, indispensable pour les microorganismes
photoautotrophes, limite les méthodes d’immobilisation active aux gels d’agar-agar,
d’alginate, carraghénane et autres gels transparents.
11.4.2.2.1 Inclusion cellulaire en matrice agar-agar
La technique d’inclusion cellulaire en gel d’agar-agar est très utilisée en
microbiologie pour le comptage et même la culture cellulaire (Lebeau et al., 1999 ;
Moreno-Garrido, 2013). Lebeau valorise ici cette technique pour bloquer les cellules au
centre du PBR dans un gel d’agar, au contact d’un tube percé où débouchaient des fibres
optiques permettant la diffusion de la lumière dans la fine couche d’Agar. Une membrane
poreuse constituée d’une grille en Inox maintenait la structure de gel sur le tube Inox (Fig.
63).
83
Figure 63: représentation du photobioréacteur à cellules immobilisées expérimental (Lebeau et al., 2000)
Le milieu de culture frais est injecté en continu (D=0,25 J-1) et circule dans le PBR
et le gel d’agar grâce à une pompe pour la récupération de la marennine extracellulaire.
Malgré l’ingéniosité du procédé, les résultats de productivité volumique restent faibles et
ne dépassent pas 0,5 mgEMn. L-1. J-1 (Rossignol 1999 ; Lebeau et al., 2000).
11.4.2.2.2 Inclusion cellulaire en billes d’alginates
Le principe de cette technique consiste à inclure des cellules à l’intérieur d’un
polymère d’alginate de calcium. Cette technique de culture cellulaire a été étudiée sur
d’autres microalgues avant Haslea, souvent dans le but de protéger les cellules de
l’agitation, d’optimiser la récupération d’exométabolites et/ou de biomasse (Moreira et
al., 2005), faciliter l’ingestion de biomasse en aquaculture (Espinosa et al., 2006), pour la
gestion en souchotèque (Lebeau et al., 1998) ou encore pour le traitement de l’eau (Wilde
et Benemann, 1993 ; Vilchez et al., 1997).
84
Figure 64: représentation d'une inclusion cellulaire dans un polymère d'alginate de calcium
Comme présenté en figure 64, les cellules (microalgues) mélangées dans la
solution d’alginate de sodium, se retrouvent incluses au sein des billes d’alginate lors de
la polymérisation (instantanée) de l’alginate avec des cations bivalents (Mg2+, Sr2+, ou
Ca2+…).
Quelques études ont été réalisées sur la croissance d’Haslea ostrearia et Nitzschia
closterium en billes d’alginate (Lebeau et al., 1998 ; Espinosa et al., 2006 ;) notamment
pour le stockage de ces souche (Fig. 65).
Figure 65: photographie au microscope optique : (A) de billes d'alginate vide, (B) de microcapsule d’alginate contenant Nitzschia closterium (Lebeau et al., 1998)
Les résultats de production de biomasse/marennine dans ses conditions, ne
montrent pas de productivités importantes (expérimentation pour le stockage) mais
surtout, la conservation du polymère d’alginate ne dépasse pas 15 jours avant de montrer
des signes de dégradation dans l’eau de mer. Cependant, la solution de production en
85
billes d’alginate, pour la protection des cellules contre les cisaillements reste
envisageable. Malgré une dissolution du gel en eau de mer due essentiellement à la
présence de cations, certaines techniques de chélation des cations « parasites » et/ou de
renforcement du gel sont possibles (Moreira et al., 2006 ; Castro-Ceseña & Del Pilar
Sánchez-Saavedra, 2014). D’autre part, il a été constaté que la division cellulaire
engendrait aussi une perturbation de la structure des billes (Lebeau et al., 1998).
86
Conclusion
Haslea ostrearia est une microalgue eucaryote de la classe des Bacillariophyceae
(diatomées), du genre Haslea. Cet organisme photosynthétique est capable de produire et
d’excréter de la marennine (Gastineau et al., 1983), un pigment bleu-vert. Découverte
avec le phénomène de verdissement des huîtres, la marennine est sécrétée par Haslea
ostrearia dans les claires à huîtres et est filtrée par les huîtres (et d’autres bivalves) pour
donner à leurs branchies une couleur verdâtre (2014 ; Barillé et Cognie, 2000 ; 1998 ;
Gastineau et al.,). La marennine a donc un intérêt organoleptique pour la production
d’huîtres mais ce pigment possède aussi des propriétés antibactérienne, antivirale,
antitumorale et allélopathique (Gastineau et al., 2012) à fort potentiel applicatif.
Contrairement aux microorganismes photosynthétiques modèles (Chlorella sp,
Spirulina sp, Chlamydomonas sp etc…) la culture d’H. ostrearia en photobioréacteur dans
des conditions conventionnelles est considérée comme très difficile. La réponse de cette
souche tychopélagique face à l’agitation reste incomprise. Différents essais ont été
cependant réalisés par le laboratoire MMS, du GEPEA ainsi que celui de l’UQAR, comme
présentés ci-dessous (Fig. 66).
Basé sur des constats de croissances observées en erlenmeyers à agitation
magnétique ainsi que dans des bioréacteurs en verre (données non publiées), une mort
cellulaire est très vite observée. De plus, Rossignol et al., (1999), démontre qu’Haslea
ostrearia souffre, plus que d’autres microalgues (modèles) face aux contraintes imposées
par la recirculation en pompe. Ainsi, Lebeau a créé un PBR à cellules immobilisées.
D’autres technologies de cultures immobilisées (actives et/ou passives) ont été
développées telles que la culture en bassin pour le verdissement des huîtres (Turpin et
al., 2001), la culture en billes d’alginate (Lebeau et al., 1998) et encore les PBRs
expérimentaux de l’UQAR au Canada (Gastineau et al., 2014). Le GEPEA se tourne vers des
technologies à cellules agitées (pas en continu) telles que la première culture en PBR
airlift (Jubeau, 2009), sans succès, ou encore le PBR à membrane immergée de Rossignol
(1999), permettant, jusqu’ici, les meilleurs rendements en productivité volumique de
EMn. Malgré ces avancées technologiques conséquentes, différentes problématiques de
cultures restent à résoudre, et ont fait l’objet de cette thèse, dont le but est de créer et/ou
optimiser un photobioréacteur spécifique pour la culture continue industrielle d’Haslea
ostrearia.
87
Figure 66: Représentation chronologique des innovations de productivité en marennine extracellulaire selon les différentes technologies de systèmes de culture mis en place par les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR
88
Ainsi, les différents systèmes de culture, présentés figure 66, n’ont pas utilisé les
mêmes milieux de culture ainsi que les paramètres de cultures. Ces différences
proviennent majoritairement des contraintes de chaque procédé, mais aussi d’un manque
de connaissances sur la réponse d’Haslea ostrearia face aux paramètres de culture.
Beaucoup de travaux ont été mis en place pour déterminer le meilleur milieu de culture
pour Haslea ostrearia (Turpin et al., 1999 ; Gagneux-Moreaux et al., 2007 ; Mouget et al.,
2009). Cependant, les seuls milieux retenus pour la production en continue (industrielle
ou non) sont des milieux à base d’eaux de mer naturelle (F/2, ES1/3 présenté chapitre
III), pouvant être limitant pour la production d’EMn et diminuant la reproductibilité des
résultats de productivité en biomasse et en marennine. D’autre part, le pH et la
température de culture utilisés dans tous les systèmes de cultures sont ingénieusement
basés sur les conditions de culture de l’écosystème d’Haslea ostrearia. Cependant, ces
deux paramètres, très importants pour une culture, peuvent être à l’origine d’une
limitation de la productivité et les informations récoltées sur la réponse d’Haslea ostrearia
à ces paramètres dans la littérature, ne permettent pas de nous assurer des conditions
optimales de production.
La sensibilité d’Haslea ostrearia à l’agitation reste aussi à éclaircir. Cependant,
quelques études ont déjà été publiées essentiellement par le laboratoire du GEPEA. Cette
cellule semble plus sensible que des modèles tels que Chlorella face à des traitements de
broyages, recirculation et séparation (Rossignol, 1999). Aucun type de pompe ne permet
de faire recirculer Haslea ostrearia en continu sans altérer l’intégrité cellulaire. Le
traitement de sonication semble provoquer l’altération du frustule mais surtout déboîte
les deux parties de celui-ci et déclenche la mort cellulaire à partir de 2 minutes de
traitement à 550 W. L’impact du traitement de centrifugation est aussi non négligeable
sur Haslea ostrearia avec 50% de mortalité cellulaire >20 000 g.
Cependant, les contraintes appliquées sur la cellule lors de ces traitements
s’éloignent fortement des contraintes potentielles apportées dans un photobioréacteur.
Selon le mode d’agitation et le type de photobioréacteur, les contraintes au sein du PBR
peuvent être fortement différentes, mais la déformation du fluide liée à l’agitation d’un
système de culture entraîne inévitablement des contraintes de cisaillement pouvant
impacter l’intégrité cellulaire (Olmos et al., 2003 ; Pruvost et al., 2006 ; Ndiaye et al., 2018
; Wang & Lan, 2018).
89
Ce phénomène de sensibilité cellulaire aux contraintes de cisaillement (ou autres
types de contraintes) est appelé mécano-sensitivité cellulaire (Griffin et al., 1992 ;
Tavernarakis & Driscoll 1997) et peut favoriser (ou non) la production d’un métabolite
chez certaines cellules tout comme déclencher la mort cellulaire, souvent à hauts
cisaillements. L’impact physique du cisaillement déclenché par l’agitation n’est donc le
plus souvent, pas directement responsable de la baisse de productivité. Un lien peut
apparaître avec la physiologie de la cellule. La question est donc ici, de comprendre si
Haslea ostrearia est réellement sensible aux contraintes de cisaillement, ou si elle possède
une physiologie différente des microalgues considérées comme modèles en production
lorsque les cisaillements sont appliqués.
Pour terminer, la production de marennine extracellulaire par Haslea ostrearia est
un phénomène beaucoup étudié, qui pourtant reste encore sujet à débat. Beaucoup
d’hypothèses divergentes sont soulevées dans les travaux existant (Moreau, 1970 ;
Neuville et Daste, 1978 ; Rossignol, 1999 ; Lebeau et al., 2000 ; Tremblin et al., 2000 ;
Robert et al., 2002 ; Mouget et al., 2005). Le mécanisme de synthèse et d’accumulation de
marennine reste globalement inconnu. D’autre part, les connaissances accumulées sur la
réponse d’Haslea ostrearia face à la lumière ne permettent pas d’établir une gamme de
tolérance précise. Les limites lumineuses qu’Haslea est capable de supporter sont encore
méconnues à l’échelle du PBR de laboratoire alors que ces informations sont essentielles
pour l’élaboration/optimisation d’un PBR à échelle industrielle.
90
Chapitre II:
Matériel et méthodes
91
1 Matériel biologique
1.1 Haslea ostrearia
La microalgue utilisée lors des études de production durant cette thèse est Haslea
ostrearia, (diatomée) prélevée à Bouin (France, Vendée) et isolée au laboratoire MMS (EA
2160) de l'Université de Nantes. Cette souche provient de la Nantes Culture Collection
(NCC), elle est référencée sous le numéro NCC 495. Les caractéristiques biométriques de
ce clone sont présentées dans le tableau 10. Ce clone a été sélectionné pour sa production
de marennine.
Tableau 10: Biométrie du clone NCC 495 d'Haslea ostrearia et aspect au début et à la fin de la thèse***
Date de
biométrie
02/03/2016 20/03/2018
Longueur (µm) 73,09±0,72 31,40±0,36
Largeur (µm) 8,80±0,37 6,04±0,15
Aspect
La déformation de la cellule observable le 20/03/2018 (Tableau 10) semble
inévitable et survient dès les premières semaines de la mise en culture en verrerie.
D’autre part, la cellule diminue en taille au cours des divisions successives sur plusieurs
générations, ce qui explique son différentiel de taille deux ans après la première culture
d’Haslea. Cette décroissance de taille est liée à la physiologie des diatomées et finit par
réduire les productivités (biomasse/marennine) d’Haslea. Ainsi, le clone NCC 501
(Tableau 11) a été fourni par le MMS pour terminer les résultats de thèse.
*** Les valeurs sont significatives ± IC 95% pour n=50.
92
Tableau 11: Biométrie du clone NCC 501 d'Haslea ostrearia et aspect à réception du clone†††
Date de biométrie 09/04/2018
Longueur (µm) 65,45±0,32
Largeur (µm) 6,89±0,15
Aspect
1.2 Nannochloropsis galitana
La souche Nannochloropsis gaditana est une Chlorophycée marine. Le clone 527,
provenant de la collection NCMA/CCMP est cultivé depuis 2015 (Taleb et al., 2015) au
GEPEA. Cette souche n’a été utilisée que pour la validation du photobioréacteur à cellules
immobilisées.
1.3 Chlorella vulgaris
La souche Chlorella vulgaris est une Chlorophycée d’eau douce. Le clone F&M-M33,
provenant du Fotosintetica & Microbiological Srl Culture Collection, est cultivé depuis
2015 (Taleb et al., 2015) au GEPEA. Cette souche n’a été utilisée que pour le test de
résistance de la technologie d’immobilisation cellulaire par encapsulation en bille
d’alginate face à l’agitation en airlift.
††† Les valeurs sont significatives ± IC 95% pour n=50.
93
2 Techniques de mesure
2.1 Suivi de la Densité numérique en cellules
2.1.1 Comptage cellulaire
La concentration en nombre de cellules est déterminée pour Haslea ostrearia au
microscope optique (objectif x40) par comptage sur hématimètre de type Nageotte pour
les cultures à faible biomasse. Les cultures en photobioréacteurs, nous permettent de
suivre la concentration de biomasse par la matière sèche car les concentrations en
biomasse sont plus importantes.
2.1.1.1 Comptage à la cellule de Nageotte
La cellule de Nageotte est une lame spéciale que l'on place sous un microscope
pour le comptage de diverses cellules animales et végétales (Fig. 67).
Figure 67: Cellule de Nageotte Figure 68: Coupe latéral de la cellule de Nageotte
Un quadrillage, dont on connait les dimensions, est précisément gravé au laser
(Fig. 68), et une lamelle délimite une hauteur elle aussi connue.
La gravure verticale de la cellule de Nageotte est composée de 40 colonnes, plus
une ligne seule au centre. Les lignes sont espacées de 0,25 mm. La gravure horizontale est
constituée de 2 lignes, espacées de 10 mm. Le volume de chaque colonne représente
1,25µl (Fig. 69).
94
Figure 69: Gravure de la cellule de Nageotte
Pour les éléments chevauchant les lignes, les cellules qui chevauchent les lignes à
gauche et en haut sont comptées. Ne sont comptés aucun élément chevauchant les lignes
à droite et en bas. On peut ensuite extrapoler la densité cellulaire de la culture, après
comptage, grâce au calcul suivant :
Équation 8
𝑁 =n
V
Soit n le nombre d’éléments comptés
N le nombre d’éléments par microlitre (µl)
V le volume de comptage.
Le volume V représente 5 µl pour 4 bandes de 1,25 µl comptées pour être
représentatif de la concentration de l’échantillon. Toutes les mesures ont été réalisées en
triplicats pour un minimum de 300 cellules.
2.1.1.2 Mesure de masse sèche
L’estimation de la matière sèche s’effectue sur filtre Whatman GF/F avec un
diamètre de pore de 0,7µm. Les filtres sont placés pendant 24h à l’étuve à 110°C pour
retirer l’humidité. Ils sont refroidis avant mesure dans un dessiccateur pendant 10
95
minutes, puis pesés sur une balance de précision. Ces filtres sont ensuite utilisés pour
filtrer la biomasse contenue dans un volume donné d’échantillon après étude sur la
souche Haslea ostrearia, le volume minimum pour obtenir un résultat significatif est 10
ml. Le même volume de formiate d’ammonium (NH4HCO2 à 28 g. L-1) est filtré dans le but
de retirer les sels du milieu de culture. Le filtre est ensuite séché 24h à l’étuve, refroidi 10
minutes dans le dessiccateur puis pesé. La différence entre la masse du filtre seul et celle
du filtre colmaté par les algues, divisée par le volume filtré permet d’obtenir la matière
sèche en (g. L-1). Toutes les mesures ont été réalisées en triplicats.
2.2 Suivi pigmentaire
2.2.1 Mesure de la chlorophylle a, c et des pigments caroténoïdes
Les diatomées ne possèdent que de la chlorophylle a et c. Concernant les
caroténoïdes, les diatomées possèdent d’autre formes comme la fucoxanthine, la
diadinoxanthine, le β-carotène et d’autres (Carreto et Catoggio, 1976).
Après comparaison des plusieurs techniques utilisées par le MMS et le GEPEA pour
l’extraction de pigment (Lorenzen, 1966 ; Speziale et al., 1984 ; Ritchie, 2006), la seule
technique permettant d’obtenir, pour Haslea ostrearia des résultats d’extraction des
pigments comparables avec d’autres souches, est la technique basée sur l’extraction à
l’acétone 90%, mise en place par Ritchie (2008). Puis, le contenu en pigments est
déterminé par une méthode spectrophotométrique (Ritchie, 2008). Ainsi, un volume noté
V0 de la culture, placé dans un contenant en verre, est centrifugé pendant 15 minutes à
6000 rpm. Le surnageant est ensuite éliminé et le culot est mis en suspension dans un
volume Vac d’acétone (90.8%) pendant une durée minimale de 30 minutes et maximale de
3 heures, à 3°C et à l’obscurité. Par la suite, les débris cellulaires sont précipités et séparés
par centrifugation pendant 10 minutes à 6000 rpm ; la couleur blanche du culot est un
moyen de vérification que l’extraction est complète. L’absorbance du surnageant
contenant les pigments dissous dans l’acétone est mesurée à différentes longueurs d’onde
(480, 630, 647 et 664 nm) au spectrophotomètre (JASCO V-630). Trois réplicats sont
préparés. Les valeurs moyennes de ces absorbances, sont finalement utilisées pour
calculer les concentrations en chlorophylle a, la chlorophylle c et les pigments
caroténoïdes via les équations de Ritchie, (2008) pour les chlorophylles et de Strickland
et Parsons, (1968) pour les caroténoïdes :
96
Équation 9
[Chl-a] (μg.ml-1) = (-0,3002A630 – 1,7538A647 + 11,9092A664)Vac/V0l Équation 10
[Chl-c] (μg.ml-1) = (23,6723A630 – 7,9057A647 – 1,5467A664)Vac/V0l Équation 11
[PPC] (μg.ml-1) = (4A480)Vac/V0l
Avec l la longueur du trajet optique de la cuve exprimée en cm.
Connaissant la densité numérique en cellules (cellules. mL-1 ou g. L-1) de la
culture, la teneur en pigments en gramme de pigment par quantité de cellule ou gramme
de biomasse sèche peut être calculée.
2.2.2 Mesure de la marennine
La marennine extracellulaire (EMn) est mesurée par spectrophotométrie
(Pouvreau et al., 2006). L’échantillon d’algue d'un volume de 1.5 ml est centrifugé par
MiniSpin® pendant 15 min à 13500 rpm, puis le surnageant est mesuré à 669nm contre
du milieu neuf à l’aide d’un spectrophotomètre JASCO V-630. Les mesures sont réalisées
en triplicat. Après mesure des spectres d’absorption de la marennine extracellulaire à
plusieurs pH, la longueur d’onde pour la mesure de EMn en routine a été fixée à 669 nm
pour un pH de 7,8, Les résultats se recoupent avec ceux de Robert et al., (2002).
La concentration en marennine extracellulaire est alors calculée par l’équation
suivante, en utilisant la loi de Beer-Lambert :
Équation 12
[𝐸𝑀𝑛] =𝐴669
εl
Avec A, l’absorbance de l’échantillon à 669nm, ɛ le coefficient d’extinction molaire,
(ɛ=12x104 mol-1. L. cm-1 pour la marennine extracellulaire) et l le trajet optique de la cuve
en cm égal à 1 pour notre cas (Pouvreau et al., 2006). Le résultat de la concentration
molaire est ensuite multiplié par la masse molaire de la EMn, MEMn=9893 g. mol-1, pour
obtenir le résultat en g. L-1.
97
2.3 Suivi de la composition des milieux de culture
2.3.1 Dosage des ions Nitrate et Phosphate dissous
La mesure des deux principaux macronutriments, N et P, se fait majoritairement
par chromatographie ionique – DIONEX (ICS 110 colonne cationique et ICS 900 colonne
anionique). L’échantillon est injecté dans une colonne cationique à résines échangeuses
d'ions, un flux d'éluant de H2SO4 permettant la migration des ions NH4+ présents. Les ions
sortant de la colonne sont détectés par conductimètre, cette mesure étant directement
reliée à leur concentration. L'identification de l'espèce ionique est assurée par la
comparaison des temps de rétention des différents pics observés avec ceux de standards
; la hauteur ou la surface des pics permet une détermination quantitative.
Les colonnes ne supportant pas plus de 550 mg. L-1 de Na+ et 3900 mg. L-1 de Cl-,
une dilution des échantillons était nécessaire et les premiers résultats de [PO42-] étaient
trop faibles pour être représentatifs. Ainsi l’utilisation des Kit Hach lange®, avec le
système photométrique LCK et les kit Phosphate LCK350 ont permis la récolte
approximative des premiers dosages en milieux de culture peu concentrés.
2.3.2 Dosage des ions silicates
Plusieurs méthodes de dosage de la silice dans l’eau existent, à savoir l’absorption
atomique, la méthode colorimétrique et la spectrométrie de masse au plasma. Seule la
technique colorimétrique au silico-molybdate est réalisable au laboratoire. Elle permet de
doser la silice réactive, soit uniquement la silice en mesure de réagir avec le molybdate.
Le complexe silico-molybdate émet une couleur jaune dans des conditions acides et est
instable dans ces conditions. Des interférences importantes peuvent survenir lors de
l’utilisation de contenant en verre, de tannins, d’une quantité trop importante de fer, de
la couleur de l’échantillon (la couleur bleue de la marennine hydrosoluble), de la turbidité,
des sulfites et surtout dans notre cas des phosphates. Le PO43- lui aussi, réagit avec le
molybdate. Ainsi pour éliminer ses interférences, de l’acide oxalique est ajouté pour
inhiber la réaction phosphate et du molybdate (Grasshoff et al., 2007).
2.3.3 Dosage du Carbone Organique Dissous
Cette mesure est réalisée par la méthode d’oxydation catalytique par combustion
à 680°C, effectuée par le Total Organic Carbon analyser (TOC-L CSH/CSN Shimadzu). Cette
méthode souvent utilisée comme indicateur de qualité de l’eau consiste à mesurer dans
98
un échantillon la concentration de dioxyde de carbone et de sels d’acide carbonique
(Carbonate, bicarbonate…etc) et du carbone total. L’extrapolation des résultats permet la
déduction de la concentration de Carbone organique total.
Figure 70: Mesure des différentes formes de carbones par TOC-L CSH/CSN
La combustion à 680°C de l’échantillon permet la libération de CO2 qui permet la
détection du carbone total (TC) par l’analyseur de gaz infrarouge (NDIR) après
refroidissement (Fig. 70.1). Le carbone inorganique (IC) est lui, oxydé par l’ajout d’acide
sulfurique permettant la libération de CO2 dans le processus de barbotage, puis mesurer
par NDIR (Fig. 70.2). La concentration de Carbone organique total (TOC) est calculée par
la soustraction de la concentration de carbone inorganique (IC) à la concentration de
carbone totale (TC) (Fig. 70.3). Ces analyses sont réalisées en triplicat.
2.4 Mesure du rendement photosynthétique FV/Fm
Chez les plantes supérieures, la mesure du rendement photosynthétique est un
moyen de quantification des effets de stress abiotiques (lumière, température, carences
etc…) sur la santé de la plante, et plus particulièrement son activité photosynthétique. Le
principe de cette mesure repose sur le suivi du transfert d’électrons du photosystème II
par la fluorescence de la chlorophylle face à une intensité lumineuse reçue. L’intensité de
cette fluorescence peut varier en fonction du bien-être ou de la détérioration du PSII liée
aux paramètres abiotiques appliqués. Les mesure de Fv/Fm sont réalisées à l’aide d’un
fluorimètre WaterPam (Walz, Allemagne) après ajout d’un échantillon de microalgues
dans la cuve d’analyse. La fluorescence de départ (Ft) est fixée à 250 (unité arbitraire)
pour toutes les mesures par dilution avec de l’eau de mer de salinité 28 ‰. L’échantillon
99
est alors plongé dans le noir pendant 15 minutes pour désaturer les antennes collectrices
de photons du PSII (pour la mesure de F0) avant l’émission d’un pulse de lumière
saturante et la mesure de la fluorescence maximale de la chlorophylle (Fm). Le rendement
photosynthétique FV/Fm est donné par l’équation suivante :
Équation 13
𝐹𝑣/𝐹𝑚 =𝐹𝑚 − 𝐹0
𝐹𝑚
F0 représente la fluorescence minimale de la chlorophylle pour un centre ouvert (PSII). A
l’état relaxé, c’est le rendement de la fluorescence à l’obscurité.
Fm représente la florescence maximale de la chlorophylle pour un centre fermé (PSII). A
l’état relaxé, cette fluorescence est obtenue en utilisant un pulse saturant de lumière.
FV représente la fluorescence variable, la fraction de l’énergie photonique absorbée
convertible en énergie chimique FV=Fm-F0.
La valeur théorique du FV/Fm maximale est de 0,83 chez les plantes supérieurs, 0,6
en moyenne chez les diatomées et Haslea ostrearia (Rech, 2004).
3 Matériel de culture
3.1 Les milieux de cultures
Plusieurs milieux de culture ont été utilisés, dans un premier temps, pour la
production d’Haslea ostrearia en verrerie puis ensuite retravaillées (Voir Chapitre III)
pour la culture en photobioréacteur. Tous les milieux sont à base d’eau de mer naturelle
enrichie. Le milieu F/2 (Guillard 1975) utilisé pour la culture de diatomées et Enriched
Seawater (ES) modifié ES1/3 par Robert, (1983) recommandé par le Laboratoire MMS est
utilisé uniquement pour la production d’inoculum. Le milieu F/2 a été abandonné au
profit du milieu ES1/3 modifié après étude des sources de phosphates (Voir Chapitre III)
pour de meilleurs rendements de production et une meilleure reproductibilité. Le milieu
Conway enrichi lui aussi à base d’eau mer naturelle a été optimisé pour la croissance de
microalgues salines au GEPEA, et il a été testé pour la production d’Haslea ostrearia en
photobioréacteur. Sans succès pour cette espèce, il a été utilisé pour la production de
100
Nannochloropsis gaditana en PBR immobilisé (voir Chapitre II 9.2.3.1). La composition de
ces milieux est présentée ci-dessous (Tableau 12).
Tableau 12: Composition ionique en macro et microéléments de différents milieux de culture
Ions
F/2
mol. L-1
ES 1/3
mol. L-1
Conway
mol. L-1
Eau de mer
naturelle‡‡‡
mol. L-1
B - 3,23 x 10-5 5,42 x 10-1 4,2 x 10-4
Br - - - 8,4 x 10-4
C 1,36 x 10-4 1,36 x 10-4 1,51 x 10-2 2,0 x 10-3
Ca - - - 1,0 x 10-2
Cl 3,69 x 10-5 4,79 x 10-1 1,85 x 10-2 5,5 x 10-1
Co 4,20 x 10-8 5,79 x 10-8 8,39 x 10-5 -
Cu 3,92 x 10-8 - 8,0 x 10-5 -
F - - - 6,8 x 10-5
Fe 1,17 x 10-5 6,34 x 10-6 4,80 x 10-3 -
K - - - 1,0 x 10-2
Mg - - - 5,3 x 10-2
Mn 9,10 x 10-7 2,33 x 10-6 1,82 x 10-3 -
Mo 5,43 x 10-8 - 5,09 x 10-5 -
N 8,82 x 10-4 3,00 x 10-4 3,52 -
Na 4,60 x 10-4 4,81 x 10-1 4,60 x 10-4 4,7 x 10-1
P 3,62 x 10-5 1,62 x 10-5 3,91 x 10-1 -
‡‡‡ Données analyse eau de mer (Razmig GEPEA) et données Oceanarium Le croisic, France
101
Si 2,00 x 10-4 1,00 x 10-4 2,00 x 10-4 -
S 1,72 x 10-7 1,51 x 10-2 7,99 x 10-5 2,8 x 10-2
Sr - - - 9,0 x 10-5
Zn 1,72 x 10-7 3,01 x 10-7 1,54 x 10-4 -
3.2 Systèmes de culture
3.2.1 Cultures en verrerie chimique
Les pré-cultures sont réalisées en erlenmeyer en verre borosilicaté dans une
enceinte à régulation thermique à cycle de circadien (Fig. 71). La culture d’Haslea est
effectuée à 16°C avec 250 µmol. m-2. s-1 de photons en cycle
jour/nuit 14/10. Le repiquage de la souche s’effectue tous
les 4 jours pour garder la souche en phase exponentielle.
Ce taux de renouvellement rapide permet l’obtention de
biomasse pour une relance fréquente des
photobioréacteurs. Tous les inoculums ont été effectués
sur milieu ES1/3 modifié avec une source de phosphate
inorganique (voir chapitre III.1.4)
3.2.2 Culture en flasques
Toutes les analyses préliminaires ont été effectuées, par manque de biomasse, en
flasques de culture de tissus cellulaires VWR (fig. 72) de 18 ml (volume horizontal). Ce
matériel de culture possède une importante surface spécifique éclairée de aS=180 m-2, et
présente une surface hydrophile permettant une meilleure culture cellulaire immobilisée
en tissus.
Figure 72 : Flasque de culture de tissus cellulaire stérile non traitée (25 cm² de surface de culture)
Figure 71: Enceinte de culture Sanyo MLR-350
102
3.2.3 Culture en photobioréacteur
Cinq types de photobioréacteurs ont été utilisés au cours de cette thèse, dont trois
types de technologie Airlift (PBR Cristal, Plan-6L et Airlift) un PBR torique et un PBR pour
la culture en cellules immobilisées. Le PBR Airlift a été utilisé pour la mise en culture de
la souche, la compréhension des besoins en macronutriments et l’application de forçages
physiologiques. Les PBR Cristal et Torique ont été mis en place dans l’optique d’obtenir
les paramètres optimaux de croissances en conditions photolimitées, mais surtout pour
l’étude des contraintes de cisaillement en PBR avec le PBR Torique. Un photobioréacteur
a été mis en place pour la culture des cellules immobilisées. Un photobioréacteur Plan-6L,
a été utilisé pour l’application des modèles de culture en conditions de pré-production et
mesures de MRPA. Les caractéristiques sont données en tableau 13.
Tableau 13 : Caractéristiques des PBRs utilisés pour la culture d’Haslea ostrearia
PBR Type
as
(m-1)
Vr
(L)
Matériaux Mode
d’agitation
Gestion
thermique
Taux de
cisaillements
(s-1)
Cristal Plan 57 0,25 PMMA,
Inox Airlift Non ≥150
Cellules
immobilisées Plan 33 0,4 PMMA Recirculation Non 0
Airlift Plan 33 1 PMMA,
Inox Airlift Oui 150
Torique Plan 25 1,3 PMMA,
Inox
Hélice
marine Oui 20
Plan-6L Plan 25 6 PMMA Airlift Non ≥275
Tous les PBR sont équipés de sonde pH/température METTLER TOLEDO®. Le pH
est contrôlé par l’ajout de CO2 dans un mélange air/CO2 (5%). La régulation pH s’effectue
à une valeur de consigne donnée, par l’ouverture automatisée de l’électrovanne CO2. La
103
majorité des PBRs (Airlift, Torique, Plan-6L) sont directement gérés via une interface
LabVIEW développée par l’équipe technique du GEPEA.
3.2.3.1 Le photobioréacteur à cellules immobilisées
La géométrie de ce photobioréacteur est pensée pour limiter tout impact des
contraintes de cisaillement dû à une agitation du fluide. Spécifiquement conçu pour les
cultures de cellules benthiques, ce PBR permet aux cellules de tomber au fond du réacteur
pour former un biofilm grâce aux mucopolysaccharides qu'elles produisent. La lumière
est dispensée de manière horizontale par le haut ou le bas du PBR (Fig. 74) grâce à un
panneau de LED (Fig. 73) contrôlé par variateur.
Figure 73: panneau de LEDs à variateur pour irradiance horizontale
Aucune autre agitation que la recirculation de milieu n’est appliquée dans ce PBR
permettant ainsi l’adhésion des cellules en conditions d’immobilisation passive.
104
Figure 74: Schéma du PBR à cellules immobilisées
Bien que ce PBR soit conditionné pour éviter les contraintes de cisaillement,
l’agitation reste indispensable pour l’homogénéisation des nutriments, l’apport de CO2 et
pour éviter la formation de gradient de pH en sortie de gaz et pouvant être dangereux
pour les cellules. D’autre part, les différentiels de pH provoquent dans certains cas des
précipités de nutriments importants pour la croissance cellulaire (SiO32-, PO43- et HCO3-
voir chapitre III.2.4).
Pour cela, un système de recirculation par pompe péristaltique a été mis en place
pour appliquer un faible courant horizontal au sein du PBR, sans engendrer la
perturbation du biofilm. Suite aux expérimentations, un débit de 7 mL. min-1 est appliqué
pour limiter son impact sur la cellule tout en validant la capacité de culture du PBR. Les
performances du PBR ont alors été validées sur une souche de Nannochloropsis gaditana
et comparées avec les performances d’un PBR Airlift. Les résultats de production de
Nannochloropsis (Taleb et al., 2015) se montrent équivalents à ceux obtenus, soit une
productivité surfacique de PS=10,9 g. m-2. j-1. Le PBR à cellules immobilisées est donc
considéré comme fiable pour la culture microalgale.
105
Ce photobioréacteur a aussi été utilisé pour la culture d’Haslea ostrearia en
immobilisation cellulaire dans un gel d’agar, de manière à limiter encore plus l’impact de
l’agitation sur les cellules, celle-ci étant isolées de l’écoulement.
3.2.3.2 Le photobioréacteur Cristal
Ce PBR a été créé au sein du laboratoire GEPEA pour la culture de souches de
microalgues à fort taux de sédimentation (Moutel, 2016). Ce PBR est inspiré des
décanteurs, sa forme resserrée vers la base avec une pente supérieure à 30 degrés, permet
de sédimenter les cellules vers son point d’injection de gaz, permettant la remise en
suspension des microalgues pour garder la culture homogène (Fig. 75).
Figure 75: Schémas du PBR Cristal (Moutel, 2016)
Le réacteur Cristal a été utilisé pour les premiers tests de croissance d’Haslea en
condition d’agitation continue. Le volume réactionnel (250 mL) de ce PBR ne permettant
pas un suivi de culture efficace et continu, les études de contraintes de cisaillement ont
continué avec le PBR Torique. Les contraintes de cisaillements au sein du réacteur Cristal
n’ont pas été mesurées mais estimées. Etant de même technologie que l’airlift, le taux
moyen de cisaillement en régime turbulent au sein de ce réacteur est estimé à 150 s-1
moyen (Ndiaye et al., 2018 ; Chisti and Murray Moo-Young, 1989) avec la présence de
coalescence et d’explosion de bulles localisées, pouvant engendrer jusqu’à 14 000 s-1
(Contreras et al., 1998).
106
3.2.3.3 Le photobioréacteur Airlift 1L
Le photobioréacteur Airlift 1L est le plus utilisé au laboratoire GEPEA, permettant
une agitation douce par l’injection de gaz à sa base en trois points possibles. L’injection
par ses points entraine le liquide vers le haut du réacteur qui redescend par gravité
derrière les séparateurs fixes situés à gauche et à droite du PBR. Cette technologie et
surtout cette géométrie de PBR, n’est pas la plus adaptée pour la croissance
majoritairement benthique d’Haslea, car l’agitation est trop douce et trop localisée pour
empêcher la forte sédimentation due à la physiologie de la souche. Cependant, la majorité
des résultats en croissance ont étaient obtenus dans ces PBRs pour s’assurer que la
souche ne subisse pas un impact trop important des contraintes de cisaillement.
Figure 76: Schémas du PBR Airlift (Souliès, 2014)
Le PBR Airlift 1L (Fig. 76) possède une plaque inox à l’arrière, permettant la
régulation (optionnelle) de la température. Le nombre d’entrées et sorties sont plus
importantes que celles du PBR Cristal, permettant notamment l’ajout de PO4 et SiO2 en
fed-batch (Voir Chapitre V) en plus du milieu de culture. Etant de technologie Airlift, le
taux moyen de cisaillement en régime turbulent au sein de ce réacteur est estimé à 150 s-
1 moyen, avec des maximums de taux de cisaillement estimés 14 000 s-1, et localisés au
niveau des entrées de gaz et de l’éclatement des bulles (Contreras et al., 1998).
107
3.2.3.4 Le photobioréacteur Torique
Le PBR Torique, développé lui aussi au GEPEA, fait partie des réacteurs de
laboratoire les plus intéressants du fait d’un excellent niveau de contrôle des paramètres
de culture et son excellente agitation. La présence d’une hélice marine agite le liquide dans
le sens de rotation horaire (anti-trigonométrique). De plus, l’injection d’air est effectuée
par le piquage du côté gauche du réacteur et va, en remontant le long de la paroi du PBR,
entrainer le liquide et optimiser l’agitation. La forme circulaire du réacteur permet alors
une agitation optimale en limitant les zones « mortes ».
Figure 77: Schémas du PBR Torique (Souliès, 2014)
Le PBR Torique (Fig. 77) possède, aussi une plaque en inox à l’arrière, permettant
la thermorégulation (optionnelle) ainsi qu’un orifice en PMMA à l’arrière, permettant la
mesure du flux incident de lumière absorbé par les algues. Le PBR torique possède une
forme et un système d’agitation d’hélice marine permettant une remise en suspension
permanente d’Haslea en agitation continue au sein d’un pavé circulaire. Pour une rotation
moyenne de 200rpm de l’hélice [permettant un mélange parfait du substrat (Pruvost et
al., 2006)], l’agitation du réacteur torique engendre des contraintes de cisaillement
maximum de 30 s-1 au niveau de l’hélice marine et 10 s-1 dans la zone sans hélice (boucle),
soit une moyenne de 20 s-1 maximum en régime turbulent (Pruvost et al., 2006). L’action
de l’hélice marine génère cependant des vortex ciblés près du mobile d’agitation (Fig. 77).
C’est pourquoi ce réacteur est considéré différemment que les technologies Airlift en
termes de cisaillement, car la circulation en boucle impose à toutes les cellules de passer
108
dans la zone de l’hélice. Ce PBR a donc été utilisé pour l’application de contraintes de
cisaillement sur du long-terme et la mesure de la sensibilité d’Haslea face à ces contraintes
(régimes laminaire et turbulent).
3.2.3.5 Le photobioréacteur Plan-6L
Ce photobioréacteur (Fig. 78) est de technologie Airlift et a été utilisé pour
anticiper les problèmes de sédimentation obtenus en PBR Airlift. L’agitation du réacteur
est assurée par un ensemble de piquages au fond du réacteur, qui permet l’injection de
gaz à travers un « tapis » et donc la répartition homogène du gaz en microbulles sur toute
la largeur du PBR. De plus, ce PBR est entièrement transparent et a permis l’étude du
MRPA avec des prises de mesures de lumière à travers le PBR.
Figure 78: Schémas du PBR plan 6L (Souliès, 2014)
La seule différence notable avec le PBR Airlift est le mode d’agitation qui est
dispensé ici, par une injection du gaz homogène dans le réacteur par le « tapis ». Etant de
technologie Airlift, le taux moyen de cisaillement en régime turbulent au sein de ce
réacteur n’est pas estimé à plus de 14 000 s-1 de manière localisée lors de l’éclatement des
bulles et leurs coalescence (Contreras et al., 1998). Le taux de cisaillement moyen devrait
être estimé à 275 s-1, cependant, la fréquence d’éclatement et de coalescence des bulles
est plus importante avec une répartition des axes d’injections le long du PBR. Ce constat
suppose que le taux de cisaillement moyen de ce PBR est supérieur à 275 s-1 (Barbosa et
109
al., 2003 ; Sobczuk et al., 2006). Ainsi, le débit de gaz a été réduit tous les soirs pour laisser
Haslea ostrearia se fixer et se reproduire dans les zones mortes. Cependant,
contrairement au PBR Airlift 1L, le gaz est réparti que toute la largeur du réacteur
permettant une meilleure agitation pour Haslea en période de jour. C’est grâce à ces
bonnes conditions d’homogénéisation que l’impact du MRPA moyen a pu être mesuré.
Figure 79: Représentation de la technique de mesure expérimentale du MRPA sur le PBR Plan-6L
Contrairement aux autres PBRs utilisé pour la culture d’Haslea ostrearia, le Plan-
6L est entièrement en PMMA ce qui permet la récolte des mesures de MRPA plus précises
(équation 6, chapitre I.5.3.1.2) (Fig.79) grâce à l’utilisation du capteur LI-COR plan en
faces avant et arrière du PBR.
3.3 Modes de culture
La production de microalgues peut être mise en place selon trois modes de culture :
la production en Batch (ou discontinue), semi-continue et continue. Selon les contraintes
associées au raffinage et/ou à la physiologie de la souche, certains modes de culture
seront préférés à d’autres. La productivité de biomasse et de Marennine (dans notre cas)
sera calculée différemment selon le mode de culture utilisé.
3.3.1 Culture en batch
Ce mode de culture représente celui utilisé pour la majorité des productions
d’inoculum, mais il est aussi pratiqué en photobioréacteur. Dans ce cas, le PBR est inoculé
110
à faible concentration d’algues et une forte concentration d’éléments nutritifs. Aucun
volume n’est soustrait ou additionné au PBR et la culture est souvent récoltée lorsque la
productivité faiblit. Le pH et la température sont contrôlés, cependant, la concentration
en nutriment varie au cours de la culture, faisant varier les conditions nutritives dans
lesquelles la microalgue évolue. La productivité volumique est alors calculée ainsi :
Équation 14
𝑃𝑣 =C𝑓 − 𝐶𝑖
𝑇𝑓 − 𝑇𝑖
Avec Cf, la concentration finale, Ci la concentration initiale, Tf le temps à la fin du batch et
Ti le temps au début.
3.3.2 Culture en mode semi-continu
La culture en mode semi-continu est souvent utilisée lors d’un besoin de biomasse
immédiat, par exemple pour le traitement d’un minimum de biomasse fraîche. La récolte
est donc effectuée de façon séquentielle d’un volume calculé pour un taux de dilution
donné. Le volume prélevé est alors immédiatement remplacé par du milieu de culture
frais pour maintenir le volume réactionnel et le taux de dilution fixé. Travailler en semi-
continu nous permet donc surtout de contrôler la récolte du PBR. La productivité
volumique est alors calculée en moyennant les différentes séquences de récoltes
assimilées à une culture en batch sur une certaine période de culture (équation 14). Plus
le volume prélevé (taux de dilution) est important et plus le temps de croissance l’est
aussi, ainsi plus la fréquence de prélèvement est faible et le volume prélevé fort, plus la
culture est assimilée à des batch successifs. De la même manière, plus la fréquence de
prélèvement est forte et le volume prélevé faible, plus la culture se rapproche d’une
culture en continu (équation 15).
3.3.3 Culture en continu
La culture en continu est réalisée par l’ajout en continu de milieu frais et une
récolte de biomasse souvent par surverse. Le volume est donc maintenu, cette récolte en
continu nous permet d’avoir les productivités les plus importantes calculées selon
l’équation suivante :
Équation 15
𝑃𝑣 = D. 𝐶𝑥
111
Avec D le taux de dilution (J-1) :
Équation 16
𝐷 =Q
V𝑟
Avec Q le débit (mL. J-1), Vr le volume réactionnel (ml) et Cx la concentration en biomasse
obtenue (g. L-1).
Dans notre cas très particulier, la caractéristique benthique d’Haslea ostrearia ne
nous permet pas de la cultiver en PBR Airlift sans éviter une forte sédimentation. La mise
en continu de culture d’algues benthiques est impossible dans cette géométrie de
réacteur, car l’ajout en continu de milieu concentrerait les microalgues au lieu de les
diluer. Dans le cas du continu et du semi-continu, il est possible d’appliquer des taux de
dilution directement sur le surnageant sans diluer les microalgues par membrane
(Rossignol, 1999) ou simplement par surverse pour garder/concentrer la biomasse
catalytique.
3.4 Application du flux d’énergie lumineux
Pour la culture de microalgues, la grandeur la plus utilisée en laboratoire est la
densité de flux de photons (Photons Flux Density, PFD) avec pour unité µmolhv. m-2. s-1.
La gestion continue ou dynamique du PFD est effectuée par consignes souvent
automatisées (LabVIEW) de voltages différents aux panneaux de LED. Pour l’agitation de
l’hélice marine du PBR Torique, la gestion est également automatisée.
Le flux lumineux incident présente le paramètre clé pour la modélisation des PBRs,
car il conditionne les performances de l’appareil en termes de cinétique et d’énergétique
(Pruvost et al., 2012). Il doit être connu avec précision pour calculer les profils de l’énergie
radiante à l’intérieur du réacteur. La méthode de mesure physique par capteurs
radiométrique est utilisée sur le cas du PBR à cellules immobilisées, avec un capteur
sphérique (US-SQS/LI (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Allemagne) de 3 mm. Immersible, il
permet d’effectuer des mesures au sein même de la culture. Ce capteur mesure un débit
de fluence photonique (μmol. m-2. s-1), c’est-à-dire la lumière provenant de toutes les
directions de l’espace. En combinaison avec un calculateur (DataLogger) de type LI-COR
1400 (Li-COR, Lincoln USA), ce capteur permet d’obtenir la mesure pour des radiations
112
photo-synthétiquement actives (entre 400 et 700 nm) présentent une erreur relative de
±5% (donnée LI-COR).
Pour la détermination du flux lumineux incident par le capteur sphérique, la
connectique inférieure (prélèvement de biomasse) est retirée pour introduction
perpendiculaire du capteur au fond du PBR. Le dessous du PBR est recouvert d’une
surface noire non-réfléchissante afin de mesurer le flux incident seul (pas de réflexion sur
le fond du PBR). Trois points sont mesurés au sein du réacteur, les valeurs obtenues sont
ensuite moyennées.
Pour le reste des photobioréacteurs, le capteur plan LI-COR 190 SA a été utilisé,
mesurant le flux incident sur une surface plane (angle solide 2π). Ce capteur permet
d’obtenir alors une densité de flux hémisphérique photonique (μmol. m-2. s-1). ). En
combinaison avec un calculateur (DataLogger) de type LI-COR 1400 (Li-COR, Lincoln
USA), ce capteur permet d’obtenir la mesure pour des radiations photosynthétiquement
actives (entre 400 et 700 nm) présentent une erreur relative de ±5% (donnée LI-COR).
Pour la détermination du flux lumineux incident par le capteur plan, on place le PBR dans
sa position de fonctionnement à une distance D du panneau de LEDs. Après démontage
du réacteur, on effectue différentes mesures de flux. Cette mesure est réalisée pour les
différentes positions (le long de la surface éclairée du PBR), les mesures obtenues sont
ensuite moyennées pour calculer une valeur moyenne du flux incident en surface optique
du réacteur.
3.5 Méthode d’immobilisation cellulaire par inclusion en gel d’agar
La méthode d’inclusion cellulaire en gel d’agar est une méthode courante en
microbiologie. Elle est utilisée par Lebeau et al., (2000) pour protéger Haslea ostrearia de
l’agitation en PBR. Le gel d’agar est constitué de 100 ml d’eau distillé (de manière à former
un gel de 1cm d’épaisseur maximum) et d’agar agar à 15% autoclavé à 121°C durant
20min. le flacon stérile est placé dans un bain thermostaté à 40°C maximum pendant une
heure. Les cellules d’Haslea ostrearia sont prélevées en phase exponentielle et
centrifugées durant 10 min à 6000rpm, avant d’être suspendues dans 1mL de solution
saline a 28 g. L-1 de NaCl. Cette solution est rapidement mélangée à la solution d’agar-agar
sous hotte à flux laminaire avant d’être immédiatement coulée dans le PBR à cellules
immobilisées au préalable stérilisé à l’acide peracétique. 30 min est nécessaire sous hotte
113
à flux laminaire pour que le gel solidifie puis les PBR est refermé et placé dans son espace
de culture où le milieu de culture est injecté en conditions stériles.
3.6 Méthode d’immobilisation cellulaire par inclusion en billes d’alginate
Pour l’inclusion cellulaire dans des billes d’alginate 5 mL de solution de culture de
Chlorella vulgaris ont été ajoutés en condition aseptique à une solution d’alginate de
sodium 2%. Après homogénéisation, la solution est extrudée goutte à goutte dans un
tuyau à diamètre constant terminé par une aiguille et poussé par une pompe à débit
constant. La solution d’alginate et d’algue est extrudé dans une solution de chlorure de
calcium à 14,7 g. L-1, sous agitation par barreau aimanté. Les billes sont alors rincées dans
du milieu de culture stérile avant d’être inoculées en PBR.
3.7 Techniques de stérilisation des PBRs
Tous les photobioréacteurs sont stérilisés grâce à l’ajout d’acide peracétique (5‰
dans de l’eau distillé) pendant 30 min. Puis le PBR est rincé (avec son volume) à l’eau
distillée stérile. Enfin, le réacteur doit être encore rincé (dû à l’intolérance aiguë d’Haslea
ostrearia à l’acide peracétique) en continu durant une nuit avec de l’eau distillée stérile et
une agitation gaz pour lessiver et stripper l’acide peracétique. Les connectiques sont
retirées et nettoyées à l’hypochlorite de sodium (Javel) 10% ou autoclavées pour celles
qui peuvent l’être.
3.8 Application des contraintes de cisaillement en Rhéomètre
Le rhéomètre (Physica MCR 500) a été utilisé pour l’application de contraintes dans
le but de mesurer l’impact des cisaillements sur Haslea. Normalement utilisé pour
mesurer la viscosité d’un échantillon, le rhéomètre est capable, sur de faibles volumes
d’échantillon, d’appliquer un taux de cisaillement à une culture de microalgue pour en
mesurer l’effet (constant ou variable). Pour les besoins d’une mesure de viscosité, les
cisaillements ne doivent pas produire de perturbations hydrodynamiques et se doivent
d’être homogènes dans tout l’échantillon. Ce sont ses caractéristiques qui nous
permettent d’appliquer, sur Haslea, des contraintes de cisaillement laminaires
homogènes dans l’échantillon. Le système de mesure avec cylindres coaxiaux de type
Couette (Fig. 80) a été utilisé (plateau TEZ150P et un mobile CC28.7) pour permettre
d’appliquer des plus hauts taux de cisaillement de l’appareil, soit 30 000 s-1.
114
Figure 80: Photos du plateau et du mobile du rhéomètre (1) et dimensions du système plateau/mobile (2)
Dans ces conditions d’utilisation du rhéomètre, le nombre de Taylor est calculé
pour s’assurer de la stabilité hydrodynamique au sein de la cellule de Couette. Un nombre
de Taylor supérieur à 41,3 permet de déceler la présence de micro-turbulence (vortex) au
sein du flux (Mezger 2011). Il est défini ainsi :
Équation 17
𝑇𝑎 =4ω2R4
ν2
Avec ω La vitesse angulaire (m. s-1), R la taille de l’entrefer (m) qui correspond à la
différence du rayon intérieur du cylindre R2 avec celui du mobile R1 (Fig. 80) et ν, la
viscosité cinématique (m2. min-1) de l’eau de mer:
Équation 18
𝑣 =μ
ρ
La masse volumétrique de l’eau de mer est de ρ = 1025 Kg. m-3 et sa viscosité dynamique
µ=1,07 x 10-3 Pa. s-1, ce qui nous donne une viscosité cinématique de ν = 1,04 x 10-6 m2. s-
1.
115
Chapter III:
Design of an artificial culture
medium to optimize Haslea
ostrearia biomass and marennine
production
R. Nghiem Xuan1,3, I. Safitri4, J. L. Mouget1, 2, J. Pruvost 3, V. Turpin1, P. Jaouen3
1 Université de Nantes, MMS, EA 2160, Faculté des Sciences et des Techniques, 2 Rue de la
Houssinière, BP, 92208, 44322 Nantes Cedex, France.
2 MMS (Mer Molécules Santé), Le Mans Université, Ave O. Messiaen, 72085 Le Mans, France.
3 GEPEA, Université de Nantes, CNRS, UMR6144, Bd de l'Université, CRTT - BP 406, 44602 Saint-
Nazaire Cedex, France.
4 Marine Science Department, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas
Tanjungpura, 78124 Pontianak, Indonesia.
Ce chapitre est rédigé sous forme de publication pour soumission dans un journal
scientifique.
116
1 Abstract:
The diatom Haslea ostrearia was first studied by Gaillon in the year 1820 because
of the greening phenomenon of oysters in western France. This microalga has the capacity
to produce and excrete a blue pigment, called marennine, that has antioxidant, anti-
bacterial and anti-viral properties, with possible industrial applications related to
aquaculture and cosmetics. However, it is difficult to produce biomass in large
concentrations in photobioreactors (i.e, usually 1kg m-3 dry weight or higher) due to
stirring sensitivity, and also because diatoms have special requirements, such as a supply
of silica. This work presents a design for a new, completely artificial, seawater medium
named NX (i.e, Nghiem Xuan) for optimizing cultivation of the diatom H. ostrearia in
photobioreactors. NX takes account of the carbon and phosphorus sources in either
organic or inorganic form, and the composition of the main elements (C, H, O, N, P, S, Si).
Optimization of the calcium, magnesium and iron concentrations was found to be
essential in order to achieve the highest productivities. The resulting NX medium was
validated in an airlift photobioreactor. This led to productivities of 4.9 x 108 cell L-1 (ca.
500 mg L-1 of biomass) and 15.7 mg L-1 of marennine, higher than has previously been
reported in the literature.
Keywords: Haslea ostrearia, Marennine, Culture medium, microalgae, Photobioreactor.
117
2 Introduction
Microalgae are increasingly becoming the subject of investigation for several
industrial purposes. They have the potential to produce molecules for pharmacology,
cosmetology, food, bio-based chemicals and biofuels (Spolaore et al., 2006). Over 15,000
valuable chemically-determined compounds, such as antioxidants, carotenoids, fatty
acids, polymers, peptides, enzymes, toxins and sterols (Cardozo et al., 2006), are produced
by all the microalgae that have been identified to date, but only a few species are currently
produced on an industrial scale: Haematococcus (Chlorophyceae), for example, which is
produced for astaxanthin (Panis et al., 2016), and Chlorella (Chlorophyceae) and
Arthrospira platensis (Cyanophyceae), which are produced worldwide for food and
nutraceutical purposes (Iwamoto, 2007, Spolaore et al., 2006; Belay et al., 1996).
Regarding diatoms, which represent the largest group of microalgae (Stoermer and Smol,
1999), applications mainly concern aquaculture (Merz and Main, 2014). Except for some
species like Phaeodactylum tricornutum, which are already produced on a large scale
(Veloso et al., 1991), one of the biggest challenges is the difficulty in setting up a controlled
and optimized large-scale production.
Issues linked to scaling up the cultivation of a given strain usually relate to the lack of
information regarding growth and metabolite production conditions, specific nutrient
needs and responses to light, but also the need to establish adequate tools and methods
for controlled and optimized scaling-up of production. This is generally supported by
bioprocess engineering approaches, such as the design of culture systems, i.e,
photobioreactor engineering (Pruvost et al., 2016), but in some cases, a specific growth
medium has to be specially designed to fulfill conditions of intensified production, which
results in larger biomass concentrations (usually 1kg m-3 dry-weight or higher). The
composition of the medium used in flask culture must be adapted and chemical
dissolution stability can be impaired due to the need for larger nutrient concentrations.
H. ostrearia is a marine diatom that has long been known (Gaillon, 1820) and mainly
studied at laboratory scale. This diatom has the capacity to produce and excrete a blue
pigment named marennine that has industrial potential (Gastineau et al., 2012). There are
two forms of marennine, which differ in their spectral characteristics: the intracellular
marennine (IMn) synthesized in the cell, and the extracellular marennine (EMn) excreted
in the culture medium (Pouvreau et al, 2006). In a culture, the relative abundance of the
118
two forms was found to depend on the medium composition variability, and on abiotic
and biotic factors (Moreau, 1968; Robert, 1983; Robert, et al., 2002).
The Mer-Molécules-Santé (MMS) laboratory has a long experience in culturing H.
ostrearia at laboratory scale, and in recent decades hundreds of strains have been
maintained for years in culture at Le Mans University and in the Nantes Culture Collection
(NCC), using enriched natural seawater media, such as Guillard F/2 (Andersen, 2005), or
Provasoli-based medium ES1/3 modified by Robert (1983). Haslea strains have also been
grown in artificial seawater (ASW), e.g, the diatom artificial medium (DAM) specifically
designed for H. ostrearia culture (Gagneux-Moreau et al., 2007), (not used due to its
composition complexity and cost), or the ASW proposed by Berges et al. (2001), modified
according to Mouget et al. (2009), which results in production as good as with natural
seawater.
Culturing H. ostrearia using conventional photobioreactors (PBRs) is a challenge, so
specific PBRs have been implemented, such as immersed membrane PBRs and agar
immobilization PBRs (Rossignol et al., 1999; Lebeau et al., 2000). In both cases, the yield
of excreted marennine (EMn) per cell remains low (around 25 mg 109 cell-1 d-1 for
immersed membrane PBRs and 5 mg 109 cell-1 d-1 for agar immobilization PBRs). Despite
some outdoor semi-pilot attempts (Turpin et al., 1999), the scaling-up of production is
still an objective for industrial applications.
Our work aims to develop an optimized medium for both biomass and EMn
production in PBRs. A biomass concentration of 1g L-1 in dry weight is targeted, based on
the use of ES1/3, which has been identified as the best medium for EMn production
(Robert, 1983). The newly-designed artificial seawater culture medium NX (i.e. Nghiem
Xuan) was finally tested in a continuous airlift PBR, and revealed the highest EMn yield
for a conventional PBR in the published literature.
3 Material and methods
3.1 Organism and culture maintenance
A strain of the diatom H. ostrearia (NCC 495) was obtained from the Nantes culture
collection of the MMS laboratory and cultivated in natural seawater from Le Croisic
(Loire-Atlantique, France), enriched with Guillard F/2 medium. The salinity was fixed at
119
28 PSU. Cultures of H. ostrearia were maintained in 250 mL Erlenmeyer flasks containing
100 mL medium with 10% dilution after 4 - 5 days of culture. Light was supplied by white
fluorescent tubes (F36W/840 T8) across the day/night cycle 14 h/10 h at 300 µmol m-2
s-1 inside the culture chamber (SANYO MLR-350) at 16°C.
3.2 The culture media tested
Table 1 shows the composition of all the culture media that were compared for this
study. All these media were made from natural seawater provided by the Croisic
Ocearium (Loire Atlantique), except the ASW medium (Mouget et al., 2009), which is an
artificial seawater. Seawater was filtered at 0.7 µm then 0.45 µm before being used as a
medium. The medium was then sterilized in an autoclave at 121°C for 20 min. The average
elemental composition of this water was estimated from a previous measurement of
different seawater composition (data not shown).
The modified Provasoli ES1/3 medium is a natural, enriched seawater not supplied
with copper, unlike Guillard F/2 medium, which is specifically for diatom culture
(Andersen, 2005). The Conway natural seawater medium is a medium that is commonly
used for marine microalgae culture (Taleb et al., 2015).
Because of the precipitation of sodium bicarbonate with phosphate and silica
sources during autoclave sterilization, these elements were added after the sterilization
step by filtration at 0.2 µm under a laminar flow hood.
3.3 Macro and micro nutrients concentration tests
The concentration of nutrients were tested in flat culture flasks of 50ml volume
(flasks for cell culture tissue, VWR collection, France). The flat surface allows better
illumination and light propagation conditions than in conventional Erlenmeyer flasks (i.e,
curved surface). They can, therefore, be considered as a useful alternative for rapid but
reliable screening of culture conditions, such as the impact of various nutrient
concentrations on cell productivity.
Nutrients were divided into two categories, namely macronutrients (C, Ca, Cl, K,
Mg, N, Na, P, S, Si), which represent the main elements involved in cells, macromolecules
synthesis, and micronutrients, which are usually added at small concentration in the
medium (B, Br, Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Sr, Zn). It is worth noting that the respective
120
impact of each nutrients is difficult to distinguish, as each addition can involve a counter-
ion and may modify the equilibrium of the medium, producing micro-precipitation, which
may prevent the cells from accessing the nutrient (Andersen, 2005; Miazek et al., 2015).
To avoid chemical contamination with endogenous macro and micronutrient
concentrations from the inoculum, the biomass was centrifuged at 10,500 g (Hettich
Mikro 22R C1110, Marshal scientific, United states) for 10 minutes and the supernatant
was removed. The cells were then rinsed with a sterile solution of 28 g L-1 NaCl at pH 7.8,
prepared beforehand, and re-suspended in it to reach a mean cell density of 3.6 x 105 cell
mL-1. This concentrated culture enabled starting tests in flasks at 104 cell mL-1 with 500
µL inoculum, to prevent dilution of the medium composition. Tests were carried out under
the same conditions as the inoculum culture (SANYO MLR-350 culture chamber,
Richmond Scientific, UK). However, due to the large variation of irradiance distribution
inside the culture chamber, flasks were placed horizontally in column stacks as shown in
Fig. 1 to obtain similar light intensity on each flask.
The cell density was measured using a Nageotte counting chamber (Marienfeld,
AQRA, India) and extracellular marennine was measured by spectrophotometry, as
described by Pouvreau et al. (2006).
Fig. 1: Culture chamber SANYO MLR-350 (left) and culture flask positions inside the culture chamber (right).
3.4 General approach to investigate mixotrophic and autotrophic growth
The role of organic and inorganic carbon and phosphorus sources was investigated
in particular. This consisted of cultivating H. ostrearia cells with different combinations of
sodium acetate (C2H3NaO2 for organic carbon form), sodium bicarbonate (NaHCO3 for
121
inorganic carbon form), Na2-β-glycerophosphate (for organic phosphorus form) and
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4 for inorganic form) in the same molar
concentrations as in the modified ES1/3 culture medium. The aim of this experiment (Fig.
2) was to check the capacity of H. ostrearia for growth under autotrophic or mixotrophic
conditions and to determine which phosphorus and carbon forms are preferred for
producing biomass and/or EMn.
Special attention was then given to investigating the effect of copper (Cu) on growth.
Copper is an important micronutrient for the growth of microorganisms, such as
microalgae, fungi and bacteria (Cid et al., 1995). It can be lethal, however, in high
concentrations. In addition, heterotrophic metabolism is highly sensitive to Cu
concentrations because it can damage the respiratory chain (in Escherichia coli),
according to Domek et al. (1984; 1987). The Cu is used by enzymes to drive diverse
structures and biochemical reactions. The intracellular Cu used in the respiratory chain
and the process of moving from Cu+ to Cu2+ allows the production of free hydroxyl
radicals. Theses reactive species are responsible for the degradation of proteins, nucleic
acids, lipids, etc, and the death of the microorganism at high copper concentrations (Festa
and Thiele, 2011). The same phenomenon is observed for microalgae, with an impact on
respiration and photosynthesis (Levy et al., 2008). However, in the case of microalgae, the
respiration process is known to be more sensitive than photosynthesis to copper (Wells
et al., 1998).
The presence or absence of Cu in the tested medium can, thus, reveal which
metabolism the cell is forced to use, depending on the medium composition
(photosynthesis or respiration process). As shown in Table 1, F/2 and ASW, the media
possess the same amount of added Cu.
Table 1: Elemental content comparison between the culture media tested
Culture media composition (mol L-1)
Ions
F/2
(Natural
seawater)
ES1/3
(Natural
seawater)
ASW
(Artificial
seawater)
Conway
(Natural
seawater)
25N100P
(Natural
seawater)
B 4.2 x 10-4 4.5 x 10-4 3.7 x 10-4 5.4 x10-1 4.5 x 10-4
Br 8.4 x 10-4 8.4 x 10-4 7.3 x 10-4 8.4 x 10-4 8.4 x 10-4
122
C 1.4 x 10-4 1.4 x 10-4 2.1 x 10-3 1.5 x 10-2 5.8 x 10-2
Ca 1.0 x 10-2 1.0 x 10-2 9.4 x 10-3 1.0 x 10-2 1.0 x 10-2
Cl 5.5 x 10-1 1.0 4.7 x 10-1 5.6 x 10-1 1.0
Co 4.2 x 10-8 5.8 x 10-8 5.8 x 10-8 8.4 x 10-5 5.8 x 10-8
Cu 3.9 x 10-8 - 3.9 x 10-8 8.0 x 10-8 -
F 6.8 x 10-5 6.8 x 10-5 6.7 x 10-5 6.8 x 10-5 6.8 x 10-5
Fe 1.2 x 10-5 6.3 x 10-6 6.6 x 10-6 4.8 x 10-3 6.3 x 10-6
K 1.0 x 10-2 1.0 x 10-2 8.8 x 10-3 1.0 x 10-2 1.0 x 10-2
Mg 5.3 x 10-2 5.3 x 10-2 4.1 x 10-2 5.3 x 10-2 5.3 x 10-2
Mn 9.1 x 10-7 2.3 x 10-6 2.4 x 10-6 1.8 x 10-3 2.3 x 10-6
Mo 5.4 x 10-8 - 6.6 x 10-9 5.1 x 10-5 -
N 8.8 x 10-4 3.0 x 10-4 5.5 x 10-4 3.5 1.1 x 10-2
Na 4.7 x 10-1 4.8 x 10-1 4.2 x 10-1 4.7 x 10-1 4.8 x 10-1
Ni - - 6.3 x 10-9 - -
P 3.6 x 10-5 1.6 x 10-5 2.2 x 10-5 3.9 x 10-1 1.2 x 10-3
S 2.8 x 10-2 4.3 x 10-2 2.5 x 10-2 2.8 x 10-2 4.3 x 10-2
Se - - 1.0 x 10-9 - -
Si 2.0 x 10-4 1.0 x 10-4 1.1 x 10-4 2.0 x 10-4 1.2 x 10-3
Sr 9.0 x 10-5 9.0 x 10-5 8.2 x 10-5 9.0 x 10-5 9.0 x 10-5
Zn 1.7 x 10-7 3.0 x 10-7 2.5 x 10-7 1.5 x 10-4 3.0 x 10-7
3.5 Material for the new medium assessment and productivity validation
Validation of the growth medium on H. ostrearia growth and marennine
productivity was carried out in a lab-scale airlift photobioreactor. This flat-panel PBR has
been used for microalgae strain characterization, as described in Pruvost et al, (2009),
Kandilian et al. (2014), Taleb et al. (2015). The volume was 1 L and the depth 0.03 m
(aLight= 33.3 m-1). Mixing was done by gas injection at the bottom of the PBR. Temperature
was regulated by cool air blowing into the stainless-steel back, and the pH was controlled
by CO2 injection, supplied by an automated regulating valve.
3.6 Statistics
The statistics were compiled using XLSTAT 2019 software (Addinsoft). Normality of
the distribution law for the different samples was identified by the Shapiro-Wilk test to
123
select the tests (T-test). Statistics was measured with triplicate data for all the
experiments presented in this paper.
4 Results
4.1 Determination of key nutrients responsible for Haslea ostrearia
growth
A series of preliminary experiments was conducted to compare H. ostrearia growth
and EMn production in the different culture media to estimate which nutrient
concentrations have the greatest impact. The strain was cultivated in batch conditions in
the Sanyo culture chamber, under culture chamber conditions. The results of biomass and
EMn productivity depending on culture medium are presented in Table 2.
Table 2: Preliminary results of biomass and Extracellular Marennine (EMn) productivities in
different media. Data is mean ±95% CI for n=3.
Medium F/2 ES1/3 ASW Conway
PV Biomass
(106cell L-1 d-1) 19.30 ±11.02 4.38 ±0.22 11.00 ±1.74 0
PSpecific EMn
(mg 106cell-1 d-1) 0.26 ±0.12 0.46 ±0.10 0.27 ±0.02 0
The Conway medium was too concentrated and precipitated during the culture
growth. This resulted in cell death. The three other media resulted in biomass and EMn
production. However, the ASW and F/2 media were found to be more suitable for biomass
production than the ES1/3 medium. It should be noted that ES1/3 medium was
previously identified as the best medium for EMn production, mainly due to its
stimulating effect on cells for EMn production rather than growth (Robert, 1983). This
tends to be confirmed by our results, as higher specific EMn productivity was achieved for
this medium.
Macronutrient elementary concentrations (nitrogen, phosphorus, carbon, sulfate
and silicon) are given in Table 1 for all the growth media. No significant differences were
observed except for a lower nitrogen concentration in the ES1/3 medium. In addition, no
124
copper was added to ES1/3, as it was with the F/2, ASW and Conway media, however,
differences due to the presence of copper in different seawater supplies cannot be
disregarded. Nitrogen concentrations remained proportional to phosphorus
concentration in the three media, and a higher concentration of silica was also found in
ES1/3 than in the other media. The main difference between the media was the supply of
phosphorus, which was organic (Na2-β-glycerophosphate) for the ES1/3 medium.
4.2 Effect of organic and inorganic sources of carbon and phosphorus on
Haslea growth
The various carbon and phosphorus sources (organic or inorganic, noted as org and
inorg respectively), as well as the addition of Cu, were tested in flat flasks (Fig. 2). The
composition of the conventional ES1/3 medium (C-inorg P-org) was shown to strongly
limit cell productivity with only 4.6 x 106 cell L-1 d-1. Biomass productivity was also
strongly inhibited when organic P sources were combined with the addition of Cu, with
2.2 x 105 and 3.3 x 105 cell L-1 d-1 for C-inorg P-org Cu and C-org P-org Cu respectively.
However, when both P and C sources were in organic form, cell productivity was
significantly higher with 17 x 106 cell L-1 d-1. Similar high productivity of was also
observed when using only inorganic sources, with 18 x 106 cell L-1 d-1 for both C-inorg P-
inorg Cu and C-inorg P-inorg.
125
Fig. 2: Cell, Extracellular Marennine (EMn) and specific EMn productivity of Haslea ostrearia in batch culture after 7 days in natural seawater-enriched (ES 1/3) based medium with different sources of phosphorus and
carbon. P EMn specific and Pv are, respectively, the specific EMn productivity and the volumetric productivity. Data is mean ±95% CI for n=3.
Concerning the specific EMn productivity results, carbon and phosphorus sources
also seemed to have a consistent impact. The first apparent observation emphasizes that
all the culture media composed of organic phosphorus seemed to stimulate specific EMn
production. In contrast, the culture media made with inorganic sources of phosphorus
definitely resulted in low levels of specific EMn production. For growth media where
photosynthesis was hypothesized to occur (C-inorg P-org Cu and C-org P-org Cu), low
biomass with no significant differences (T.Test p=0.424) and high specific EMn
productivity was obtained, with respectively 1.37 and 5.38 mg 106 cell-1 d-1. However, the
medium (C-inorg P-org Cu) induced lower EMn productivity than (C-org P-org Cu), with
respectively 0.30 and 1.78 mg L1 d-1. Comparing similar medium compositions with and
without copper, the presence of copper was found to stimulate EMn synthesis in the
presence of organic carbon, whereas the opposite was found with inorganic carbon, with
EMn production significantly lower (T.Test p=0.008).
These results lead to the assumption that H. ostrearia has difficulty consuming
inorganic carbon (photosynthesis) in the presence of an organic source of phosphorus,
0
1
2
3
4
5
6
0
5
10
15
20
25
PV
EMn
(m
g L-1
d-1
)P
EM
n s
pec
ific
(m
g 1
06ce
ll-1
d-1
)
PV
cell
(10
6ce
ll L-1
d-1
)
PV cell PV EMn P EMn specific
126
and may, therefore, favor the organic source of carbon for growth, but this hypothesis
cannot be demonstrated without further studies.
Fig. 3: Impact of organic phosphorus and copper on marennine and biomass productivities according to carbon and phosphorus sources in ES1/3 based medium. Data is mean ±95% CI for n=3.
Figure 3 presents a detailed analysis of the influence of copper and P organic
sources. For a better clarity, each result was normalized against its control. P-org C-inorg
and P-org C-org experiments results have been normalized against the same treatment
with inorganic phosphorus (P-inorg C-inorg and P-inorg C-org). Concerning the Cu
experimental results, these have been normalized against the same treatment without
Copper addition (C-inorg P-org, C-inorg P-inorg, C-org Porg, C-org P-inorg). This
emphasized the significant impact that organic phosphorus has on biomass productivity.
Cell productivity lost 74.6% vs the control with an inorganic carbon source, compared to
cell productivity with an inorganic phosphorus medium, whereas, in the presence of
organic carbon, the culture had 17.1% higher productivity with organic phosphorus than
with inorganic. As a result, it can be concluded that H. ostrearia presents significantly
better growth in either a completely organic or inorganic medium (in terms of carbon and
phosphorus), and presents significant difficulties with growth on organic phosphorus
with inorganic carbon. Additionally, the organic phosphorus allows H. ostrearia to achieve
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
C-inorg C-org C-inorg P-org C-inorg P-inorg
C-org P-org C-org P-inorg
Imp
act
of
org
anic
PO
42
-an
d C
u2
+ o
n b
iom
ass
and
m
are
nn
ine
pro
du
ctiv
itie
s (%
)
Porg Cu
127
a gain of 94.0% and 122.9% in EMn productivity when combined with an inorganic and
an organic source of carbon, respectively.
Regarding EMn production, two typical media can be considered. C-inorg P-org
medium offers a final EMn concentration of 18.0 ± 0.2 mg L-1 compared to 11.1 ± 3.3 mg
L-1 for the C-inorg P-inorg medium. For the former, a small quantity of biomass was
produced whilst producing a large quantity of EMn, whereas for the latter, a large amount
of biomass was produced but with a small EMn specific productivity.
Concerning the impact of Cu on biomass and EMn productivity, Figure 3 confirms
the previous hypothesis on completely inorganic medium. Copper does not significantly
impact biomass productivity when an inorganic P source is used (C-inorg P-inorg and C-
org P-inorg) in contrast with an organic P source (C-inorg P-org and C-org P-org).
Regarding marennine production, the correlation of the presence of copper with
the resulting productivity is unclear. Copper was found to only stimulate EMn
productivity for a completely inorganic medium (carbon and phosphorus) with 20.4%
more EMn. However, the ES1/3 medium induced a loss of 87.2% EMn productivity when
copper was added, whereas (C-org P-org Cu) medium showed a constant specific EMn
production (Fig. 2 and 3).
Because organic sources were not found to be mandatory for H. oslearia growth, a
fully mineral medium was retained as a basis for the remaining part of this study. At large
scale, a medium such as this will indeed limit bacterial contamination.
4.3 Determination of inorganic C and P source concentration in natural
seawater culture medium
A stoichiometry analysis based on biomass elemental composition (C, H O, N, P, S,
Si) has been carried out with the aim of defining a medium that allows a biomass
concentration of 1 g L-1 to be achieved without macronutrient limitation [33,34]. Failing
to obtain significant biomass for analysis, the elemental composition of H. ostrearia has
been estimated based on the elemental composition of Chlorella vulgaris, which was
grown separately for the purpose (data not shown). Contrary to the Chlorophyceae, H.
ostrearia is a member of the Bacillariophyceae and needs silicon for frustule synthesis.
According to Turpin et al. [35], the macronutrient mass ratio C:N:P:Si, for H. ostrearia
128
growth is 106:16:1:16. The cell, therefore, needs the same mass of silica as nitrogen. Based
on this result, and the molecular weight of Si (28 g mol-1) and N (14 g mol-1), the following
molar elemental composition formula of H. ostrearia is proposed:
C3.805H4.110O1.359N0.688P0.081S0.024Si0.344
The biomass molecular weight (Mbiomass=24.72 g mol-1) and this formula allow us
to theoretically determine the C, N, P, S, Si concentration needed to produce 1g L-1 of
biomass (for example, for 1 g of biomass, H. ostrearia needs 7 mmol of nitrogen). Based
on this analysis, phosphorus and carbon concentrations in the ES1/3 medium were found
to be underestimated compared to the nitrogen and silica available in the medium. The
composition of the medium was, therefore, adjusted to propose a composition more
equilibrated in N and P. By applying a 1.5 coefficient to ensure 1 g L-1 biomass was
achieved without limitation, this led to 25-fold and 100-fold increases in N and P,
respectively (noted 25N100P) (Table 1).
In the first instance, micronutrient concentrations were considered to be in excess
in the medium, and their original concentrations as defined in the ES 1/3 medium were,
therefore, kept, but in completely inorganic source. However, the silica concentration
(Table 1) was found to be impossible to achieve without the precipitation phenomenon.
According to Fournier and Rowe (1977), amorphous silica solubility is restricted to 100 –
150 mg L-1 (1.7 – 2.7 M) at 25°C, which could decrease to 1-7 mg L-1 (1.7 x 10-5 to 1.2 x 10-
4 M) with the presence of calcium, aluminium and iron cations. However, it may increase
with dissolved inorganic matter. Because of this very low solubility, it was decided to
supply silica separately to the photobioreactor experiments.
A new set of experiments in flat flasks was designed to validate the new media
proposed (Fig. 4), namely NP medium (which corresponds to a fully mineral medium but
with the same N and P molar concentration as the previous ES1/3 medium shown in Table
1, but obtained from natural seawater with various enrichments in N and P up to
25N100P). Note that the period of growth for this experiment did not exceed 8 days.
129
Fig. 4: Cell, EMn and specific EMn volumic productivities of Haslea ostrearia for various media (ES 1/3, artificial seawater (ASW) and ES 1/3 based medium with completely inorganic C and P (NP)). P EMn specific
and Pv are, respectively, the specific EMn productivity and the volumetric productivity. Data is mean ±95% CI for n=3.
According to Figure 4, the NP medium was found to be much more efficient than
ES1/3 in terms of both biomass and EMn. Although the ES1/3 medium allowed the best
EMn specific productivity (Fig. 2 and 3), 6N24P allowed higher EMn concentration with
1.32 mg L-1 compared to 0.17 mg L-1 for ES1/3. The ASW medium allowed cell growth
higher than the ES1/3 medium but was still inferior to NP, with respectively 0.9 x 107cell
L-1 d-1 and 1.8 x 107cell L-1 d-1.
The progressive increase in concentration of N and P resulted in an increase of
biomass up to the 6N24P enrichment. This medium composition showed the best biomass
and EMn production, of respectively 3.0 x 107 cell L-1 d-1 and 1.3 mg L-1 d-1. With higher
enrichment (9N36P and more), therefore, a significant decrease in EMn and biomass
productivity was observed, and the 18N72P medium ultimately led to cell death. These
results could be explained by the silica and carbon concentration, which was the same for
all media but not increased proportionally. The rationale was that Si concentration limited
the strain growth at 3.0 x 107 cell L-1 d-1 (see below). A significant precipitation was
observed from the 12N48P concentrations. Note that 3.0 x 107 cell L-1 d-1 also represents
the maximum value of biomass production that is currently reported in the literature
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
ES1/3 NP 6N24P 9N36P 12N48P 18N72P 25N100P ASW
PV
(mgE
Mn
L-1
d-1
)P
EM
n s
pec
ific
(m
g 1
06ce
ll-1
d-1
)
PV
(10
7ce
ll L-1
d-1
)
Medium
Pv Biomasse Pv EMn Pspecifique EMn
130
(Rossignol et al., 1999). Medium stability could, thus, explain the actual low H. ostrearia
biomass production, as precipitates are not biologically available for cell growth.
The 6N24P medium, which led to the best productivity, was used as a basis for
further investigation of H. ostrearia macronutrient needs in PBR (see final section).
4.4 Component interaction and medium precipitation
Nguyen et al. (2013, 2014) explained the precipitation/flocculation phenomenon
of a seawater-based medium by the interaction between high concentrations of Ca2+, PO43-
and Mg2+ ions. By using Visual MINTEQ V3 software (KTH, Sweden), which enables
prediction of dissolution equilibrium, the percentage of chemical species of
macronutrients (N, P, Si, C) was investigated for the 25N100P medium at different pH
levels and at a fixed temperature (22°C) (Fig. 5).
Dissolution equilibrium predictions confirmed the interaction of the Ca2+, PO43-
and Mg2+ ions. The seawater endogenous ions, Ca2+ and Mg2+, were found to react with the
macronutrient enrichment ions in the culture medium. In addition, the extent of
precipitation increased with pH value. The magnesium precipitated with around 0.8% of
carbon and 20% of phosphorus, as well as with the calcium with 0.4% of carbon and 3.4%
of phosphorus at pH 7.8. Phosphorus precipitation with calcium and magnesium was
emphasized, with an important loss of 23.35% of the phosphate even at pH 7.8. Note that
no significant precipitation was predicted with the nitrogen source.
131
Fig. 5: Simulation of precipitated molecules (%) in the 25N100P medium for 3 pH values (Visual MINTEQ software)
Unfortunately, silica interaction could not be predicted with Visual MINTEQ, as the
software was set up for freshwater analysis. However, silica interaction in seawater is a
common matter for diatom culture and has been studied by Vollast et al. (1968). Their
results confirm the precipitation of hydrated magnesium silica, called synthetic sepiolite,
by the addition of metasilicate in seawater (eq. 1):
Equation 1
2𝑀𝑔2+ + 3𝑆𝑖𝑂2𝑎𝑞 + (𝑛 + 2)𝐻2 𝑂 ↔ 𝑀𝑔2𝑆𝑖3𝑂8(𝐻2𝑂)𝑛 + 4𝐻+
This equilibrated equation finds the solubility of amorphous silica to be 115 ppm,
as confirmed by Morey et al. (1995) with the possibility of precipitation of other nutrients
dependent on variations in temperature and pH.
The analysis shows that the precipitation phenomenon in natural seawater could
represent a significant limitation for H. ostrearia cultivation due to the high content of
both Ca2+ and Mg2+, as it limits medium enrichment and, therefore, the achievable biomass
132
concentration and productivity. Reducing calcium and magnesium, as a possible solution
to prevent precipitation, was investigated by designing an artificial medium.
4.5 Study of the impact of micronutrients on biomass and marennine
production in artificial seawater medium
Based on the previous study (Fig. 4), it was assumed that a medium composition of
nitrogen and phosphorus higher than 6N24P (inorganic) could be limited by silica
concentration. The 6N24P (inorganic) composition was, therefore, chosen for
micronutrient addition tests to prevent Si limitation during growth in artificial seawater.
The design for the experiment, which consisted of a large set of 180 flat flasks (Fig. 6),
provided useful information on the importance of each micronutrient for the optimization
of both biomass and EMn production in artificial medium conditions.
133
Fig. 6: Biomass [X] (bars) and EMn (circles) volumetric productivities (Pv) according to different macro and micro nutrient concentrations in artificial seawater. Data is mean ±95% CI for n=3
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
4.5
x 1
0-5
4.5
x 1
0-4
4.5
x 1
0-3
4.5
x 1
0-2
8.4
x 1
0-5
8.4
x 1
0-4
8.4
x 1
0-3
8.4
x 1
0-2
1.0
x 1
0-5
1.0
x 1
0-4
1.0
x 1
0-3
1.0
x 1
0-2
5.8
x 1
0-9
5.8
x 1
0-8
5.8
x 1
0-7
5.8
x 1
0-6
3.9
x 1
0-9
3.9
x 1
0-8
3.9
x 1
0-7
3.9
x 1
0-6
6.8
x 1
0-6
6.8
x 1
0-5
6.8
x 1
0-4
6.8
x 1
0-3
1.2
x 1
0-6
1.2
x 1
0-5
1.2
x 1
0-4
8.1
x 1
0-3
9.0
x 1
0-3
1.6
x 1
0-2
9.2
x 1
0-2
5.3
x 1
0-3
5.3
x 1
0-2
5.3
x 1
0-1
2.3
x 1
0-7
2.3
x 1
0-6
2.3
x 1
0-5
2.3
x 1
0-4
6.6
x 1
0-9
5.4
x 1
0-8
5.4
x 1
0-7
5.4
x 1
0-6
3.4
x 1
0-1
0
3.4
x 1
0-9
3.4
x 1
0-8
3.4
x 1
0-7
2.5
x 1
0-3
2.5
x 1
0-2
2.5
x 1
0-1
6.5
x 1
0-1
0
6.5
x 1
0-9
6.5
x 1
0-8
6.5
x 1
0-7
9.0
x 1
0-5
9.0
x 1
0-4
9.0
x 1
0-3
3.0
x 1
0-8
3.0
x 1
0-7
3.0
x 1
0-6
3.0
x 1
0-5
B Br Ca Co Cu F Fe K Mg Mn Mo Ni S Se Sr Zn
PV
EMn
(m
g L-1
d-1
)
PV
bio
mas
s [X
] (1
06 c
ell
L-1d
-1)
Nutrients concentration (mol L-1)
B [X] PV Br [X] PV Ca [X] PV Co [X] PV Cu [X] PV F [X] PV Fe [X] PV K [X] PV Mg [X] PV Mn [X] PV Mo [X] PV
Ni [X] PV S [X] PV Se [X] PV Sr [X] PV Zn [X] PV B [EMn] PV Br [EMn] PV Ca [EMn] PV Co [EMn] PV Cu [EMn] PV F [EMn] PV
Fe [EMn] PV K [EMn] PV Mg [EMn] PV Mn [EMn] PV Mo [EMn] PV Ni [EMn] PV S [EMn] PV Se [EMn] PV Sr [EMn] PV Zn [EMn] PV
134
The first objective was to decrease the magnesium and calcium concentration to
reduce the occurrence of precipitation/flocculation, which was found to lead to culture
death. The best productivity was obtained at a cell density of 35.0±2.2 x 106 cell L-1 d-1,
with a calcium concentration of ca. 1.0 x 10-3 M, which is 9.4 times less than in the ASW
medium. The best productivity for magnesium was found at 6.4±0.4 x 106cell L-1 d-1 for a
magnesium concentration of 5.3 x 10-2 M, which is the same concentration as the ASW
medium composition.
The second objective was to increase micronutrient concentration to ensure a high
productivity with increasing concentrations of nitrogen, phosphorus and silica, thus,
preventing growth limitation. The only micronutrient that led to the highest biomass
productivity of 25.8±4.0 x 106cell L-1 d-1 was iron, with a concentration of 1.2 x 10-4 M.
This concentration represents 10 times that in the ASW medium, and biomass
productivity increased 5-fold. Zinc also seemed to increase biomass and EMn production
when increased 100-fold, compared to ASW. In addition, 10 times less boron than in ASW
increased biomass productivity, reaching 6.9±0.9 x 106cell L-1 d-1. Finally, a 10-fold
increase in nickel nutrient (3.4 x 10-8 M) led to higher EMn and biomass productivity, with
0.61±0.04 mg L-1 d-1 and 7.3±0.4 x 106cell L-1 d-1, respectively. H. ostrearia seemed to
tolerate the ASW range of concentrations for the other nutrients: bromine, cobalt, copper,
fluorine, magnesium (as previously presented), manganese, molybdenum, potassium,
sulfur, selenium and strontium (T.Test with p>0.05). We can note that conclusions were
similar for both biomass and EMn, except for the molybdenum test, which seemed to show
an inverse correlation. This was not investigated further in the present work.
These results enabled the design of the new artificial seawater NX medium based
on the highest productivities previously obtained (Fig. 6).
4.6 Validation of the artificial seawater NX medium in a photobioreactor
Following verification that there was no visual precipitation, three recipes for
culture medium were tested in a 1 L Airlift photobioreactor. The same conditions of light
(300 µmol m-2 s-1), temperature (22°C), pH (7.8) and cell inoculation concentration were
applied. However, to definitely prevent silica and carbonate precipitation in the artificial
medium, the concentration of carbon and silicon added was equilibrated with the
nitrogen and phosphorus concentration following the same approach based on
stoichiometric growth, leading to 25N100P6Si media with a 10 mM of dissolved carbon
135
concentration maintained constant for the entire culture duration with CO2 addition via
the gas phase. Figure 7 presents the results in terms of cell density and EMn concentration
for batch cultures of 22 days.
Fig. 7: Comparison of Haslea ostrearia cell density culture in new NX-25N100P6Si medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for n=3.
Fig. 8: Comparison of EMn concentration from Haslea ostrearia culture in new NX-25N100P6Si medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for n=3
The three batches represented in Figures 7 and 8 reveal the efficiency of the new
artificial seawater culture medium NX. In terms of biomass, the ES1/3 medium limited
0,0E+00
1,0E+08
2,0E+08
3,0E+08
4,0E+08
5,0E+08
6,0E+08
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Cel
l den
sity
(ce
ll L-1
)
Time (days)
Cell density
Artificiel NX-25N100P6Si Cell Naturel 25N100P6Si Cell Naturel ES1/3 Cell
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Time (days)
EMn
Artificiel NX-25N100P6Si EMn Naturel 25N100P6Si EMn Naturel ES1/3 EMn
136
cell concentrations at 7.9 x 107 cell L-1, whereas in the NX medium cultures reached 4.9 x
108 cell L-1 (a 6.2-fold increase). The culture in natural seawater 25N100P6Si quickly
decreased after 4 days, containing a whitish mineral precipitation. In terms of
extracellular marennine, ES1/3 medium reached 8.6 mg L-1, while NX allowed the culture
to reach 15.7 mg L-1. Both NX-25N100P6SFi and natural seawater 25N100P6Si media
received 1.4 g L-1 of sodium bicarbonate, 1.2 x 10-3 M of silica and 1.2 x 10-3 M of
phosphorus at the beginning of the culture. As a result, better stability was observed for
the artificial seawater NX than for natural seawater, with negligible precipitation
phenomena under the same conditions.
5 Discussion
Our results demonstrate that H. ostrearia needs either a completely organic or
completely inorganic medium to achieve the highest biomass and EMn concentrations.
Using an organic medium could be an opportunity to cultivate H. ostrearia and to decrease
the risk of culture medium precipitation, for example. According to Andersen (2005), Na2-
β-glycerophosphate from Provasoli ES medium (Provasoli, 1968) could be used as a
substrate by bacteria because of their heterotrophic nature. H. ostrearia has formerly
been suspected of being a mixotrophic strain, able to use different (organic and inorganic)
forms of nutrients (Rech, 2004). However, no proof has been brought to affirm the
mixotrophic nor the heterotrophic growth of the strain for EMn production purpose,
although an organic carbon source could also be used by H. ostrearia, being found in its
natural growing environment (Zhan et al., 2017). The results from this study indicate that
the culture of H. ostrearia in a medium made with organic phosphorus and inorganic
carbon may hypothetically influence H. ostrearia growth (Fig. 2) but also EMn production
per cell (Fig. 2). Both media containing organic phosphorus and carbon sources, as well
as inorganic phosphorus and carbon sources, lead to important yield of EMn and biomass.
This could indicate a mixotrophic metabolism, which is known to provide a better yield of
energy production than autotrophic metabolism (Li et al., 2014; Bouarab et al., 2002),
increasing then the biomass yield and the synthesis of complex compounds, such as
marennine. Note that in addition to modifying the overall physiology of H. ostrearia, using
an organic medium could increase the production costs.
137
If it is assumed that Cu could inhibit respiration and favor photosynthesis process,
the hypothesis from the results (Fig. 2 and 3) is that H. ostrearia could display
heterotrophy or mixotrophy in the presence of organic phosphorus. EMn overproduction
could, therefore, be the result of mixotrophy/heterotrophy metabolism or of a stress
resulting from the organic source of phosphorus in the medium. The impact of copper on
marennine production has already been observed by Minier et al. (1998), who showed
that copper toxicity varies according to the physiological stage of the microalgae,
especially in relation to EMn synthesis. Marennine production could, therefore, play an
important role in copper bio-availability in oyster ponds. It remains difficult to argue
whether H. ostrearia is able to consume organic matter or not, although the presence of
organic carbon seems to positively stimulate its growth. However, this study confirms the
relevant impact of the phosphorus source on this species. H. ostrearia is able to produce
significant biomass with completely organic or completely inorganic sources of carbon
and phosphorus. However, under these conditions, H. ostrearia seems to favor the
production of biomass rather than marennine.
With a mineral medium, the stoichiometric approach based on the elementary
composition of biomass (CHONPSSi method) allowed the macronutrient composition to
be equilibrated, which sustained high H. ostrearia growth. Although the ES1/3 medium
showed higher specific EMn productivity (0.51±0.04 mg 107cell-1 d-1) than with the
inorganic medium (0.07±0.01 mg 107cell-1 d-1) that was studied, the equilibrated medium
6N24P was found to produce more biomass and EMn (3.04±0.04 x 107 cell L-1 d-1 and
1.31±0.07 mg L-1 d1, respectively). However, in the case of this inorganic medium, a severe
precipitation phenomenon was observed, which revealed significant limitation for scaling
up H. ostrearia cultivation and confirmed possible interaction of the endogenous Ca2+ and
Mg2+ ions from seawater with added PO42-, HCO3- and SiO32- from the enrichment solution.
In order to increase the concentration of different nutrient sources in the medium
while preventing precipitation, a new artificial medium adapted to H. ostrearia was
designed. Following a detailed study of the nutrient impact on both biomass and EMn
productivity, calcium concentration was found to be decreased 10-fold (1.0 x 10-3 M),
leading to higher productivities (35.0±2.2 x 106 cell L-1 d-1 and 2.2±0.2 mgEMn L-1 d-1).
However, a higher decrease in calcium concentration led to lower productivities
(12.0±1.6 x 106 cell L-1 d-1 and 1.3±0.2 mgEMn L-1 d-1). As a major cation in cell culture with
138
magnesium and sodium, calcium is a required nutrient for eukaryotic cells (Merchant and
Helmann, 2014). Decreasing the calcium concentration does not necessarily mean that
less calcium is needed for growth, but it was found to definitely decrease the precipitation
phenomenon. However, H. ostrearia seems to need magnesium in the same concentration
as in ASW (5.3 x 10-2 M), since decreasing the magnesium concentration led to lower
productivity than for ASW Mg concentration (Fig. 6).
Surprisingly, by increasing the iron concentration 10-fold compared to the ASW
medium (1.2 x 10-4 M), a 5-fold increase in biomass productivity was observed (25.8±4.0
x 106 cell L-1 d-1 and 0.8±0.1 mgEMn L-1 d-1). This could be explained by the importance of
iron in the iron-sulfur cluster and enzymes structure, present in ferredoxin and
cytochromes, which are responsible for photosynthesis (Merchant and Helmann, 2014).
However, it should be noted that this iron concentration was the highest tested in this
study, since precipitation appeared over 1.2 x 10-4 M. Thus, H. ostrearia might tolerate a
higher iron concentration.
Zinc testing also showed better productivities when 100 times more zinc was
added than in the ASW medium. Zinc plays a vital role in maintaining the integrity of
ribosomes, as a cofactor for enzyme and protein folding (Praske and Plocke, 1971;
Merchant and Helmann, 2014), and seems to be a major requirement for H. ostrearia.
Nickel also yields better productivities when increased by a factor of 10. However,
nickel ion is used as a cofactor by different enzymes, mainly as a substitute for other
metals in phytoplankton (Merchant and Helmann, 2014). These results could also be
explained by a lack of other nutrients (Fe, Zn, Mg).
It was also shown that the other micronutrients were present in sufficient
concentrations in the ASW medium, and these concentrations were the same in the NX
medium. However, compared to other nutrients, increasing molybdenum concentrations
showed better EMn production and lower biomass production than in low concentrations.
No hypothesis could be confirmed, but according to Merchant and Helmann (2014), Mo is
responsible for the activity of nitrogenase and some other enzymes as a cofactor, and low
concentrations may be stressful for marennine production.
After the new artificial medium NX recipe was designed, its efficiency was tested
in batch mode using photobioreactors. NX medium achieved concentrations of 4.9 x 108
139
cell L-1 (±1.1 x 104) and 15.7±0.1 mg L-1 EMn using a conventional agitated
photobioreactor, compared to 8.0 x 107 cell L-1 (±8.8 x 103) and 8.62±0.04 mg L-1 EMn for
the ES1/3 medium. Biomass production was, therefore, increased 5.7-fold and marennine
yield was almost twice as high. This emphasizes the interest of the NX medium for
growing H. ostrearia. However, it was observed that H. ostrearia started to overproduce
EMn when the biomass reached a maximum concentration of 4.9 x 108 cell L-1 (around day
9). This phenomenon could be attributed to cell lysis due to nutrient
deficiency/limitation, and merits further investigation. As a benthic diatom, H. ostrearia
has a particular physiology that could be influenced when maintained in suspension in a
PBR, as in this study. Marennine, which presents a significant bioactivity (Gastineau et al.,
2012), could also inhibit the growth of H. ostrearia cells.
It should be noted that the NX medium did not allow 1 g L-1 of biomass (equivalent
to ca. 8.0 x 108 cells L-1) to be achieved. Since this limit was obtained through
stoichiometric analysis by setting macronutrient requirements, it could be explained by a
possible limitation of certain micronutrients. But considering the previously-described
design strategy, this would be surprising as they were provided in excess. A particular
physiological response could be the explanation: overproduction of EMn only seems to
appear from day 9 (Fig. 7), which also corresponds with higher cell concentration. EMn
concentration, therefore, only increases when biomass starts to decrease. EMn
overproduction or accumulation could be due to cell death, or conversely cell death could
be due to EMn overproduction, as EMn is also suspected as presenting an inhibitory effect
for growth (Rossignol, 1999; Pouvreau et al., 2007; Gastineau et al., 2014). This
phenomenon could possibly have occurred here, given the large EMn concentration that
was achieved, but investigation of the possible inhibitory effect of EMn on H. ostrearia
growth was not within the scope of this study and remains to be further investigated.
6 Conclusion
An artificial growth medium was designed for the cultivation of H. ostrearia in
PBRs. It enables the growth of H. ostrearia to be stimulated with equilibrated nutrient
composition, while preventing the formation of precipitate under normal growth
conditions. This allows the largest reported productivity values, to our knowledge, to be
achieved for the production of both biomass and marennine.
140
Additionally, the NX medium combined with the airlift PBR was found to be
effective for growing H. ostrearia cells in suspension. This would be a great advantage in
comparison with immobilized-cell PBRs, which could also be used for growing these
benthic species, but would certainly increase the precipitation phenomenon due to low
mass transfer without a stirring system. This condition leads to a pH and temperature
gradient within the PBR, which is closely linked to the calcium and magnesium
precipitation phenomenon (Pulz and Scheibenbogen 1998; Hochfeld, 2005; Gabelle et al.,
2012).
The stability of the NX culture medium remains to be optimized, as precipitation
occurred at high pH and temperature levels (data not shown). For exploitation under
industrial conditions, pH or temperature regulation should be efficient and the medium
composition could be simplified by reducing or omitting costly elements. The same
procedure (i.e, testing the effect of each micronutrient on growth) as described in this
study could be applied for the purpose.
In this study, H. ostrearia was able to grow on both carbon and phosphorus organic
sources. This could be further investigated, as mixotrophic culture remains a possible
solution for optimizing biomass and EMn production, but may also reduce the
precipitation phenomenon. Finally, working without natural seawater will facilitate
research by preventing precipitates and, therefore, controlling the nutrient intake by cells.
Seawater would be preferable on a very large scale (for economic reasons), but would
limit biomass and marennine production due to the endogenous calcium and magnesium
concentration, unless adequate medium renewal or an enrichment strategy, such as fed-
batch, were applied.
141
7 Supplemental information
Artificial seawater culture medium (NX) for PBR culture
NX culture medium based on artificial seawater is described below (Tables 3 to
11). The first step in its synthesis is production of the salt solution. For all salts given in
Table 3 except NaHCO3, NaH2PO4, Na2SiO3, each salt must be dissolved individually (in any
order) until it is completely dissolved. NaHCO3, NaH2PO4 and Na2SiO3 may precipitate
greatly, mainly at high temperature and pH levels, so these salts must be added after the
sterilization step (shown as * in Table 3). Additionally, these three molecules trigger
variations in pH, which can be lethal for algae, so they are added directly to the PBR one
by one to ensure pH-regulated conditions. The vitamin solution was also added after
sterilization to prevent denaturation by temperature (Gadient et al., 1992; Reddy and
Love, 1999). All the salts were mixed in a 1 L graduated flask with 400 mL of distilled
water completed at 1 L after dissolution/dilution. Note that some elements in Table 4
were dissolved in separated solutions. The Si solution was also isolated from the other
nutrients because of its high alkalinity.
Table 3: Salt solution composition for NX medium
Salt Solution (1 L)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
NaCl 21.21 g 3.63 x 10-1
Na2SO4 3.55 g 2.50 x 10-2
KCl 0.60 g 8.04 x 10-3
NaHCO3* 1.4 g 1.62 x 10-2
Br solution 10 mL 8.40 x 10-4
B solution 1 mL 4.50 x 10-5
F solution 1 mL 6.80 x 10-5
MgCl2,6H2O 10.77 g 5.30 x 10-2
CaCl2, 2H2O 0.15 g 1.00 x 10-3
Sr solution 10 mL 8.18 x 10-5
142
Si solution* 2.94 mL 1.17 x 10-3
NaNO3 0.85 g 9.95 x 10-3
P solution* 2.08 mL 1.27 x 10-3
Vitamin stock solution*
20 µL
Enrichment solution 7 mL
Table 4: Isolated solution for salt solutions realization
B solution (100 mL)
Quantity used
Concentration in Final medium (M)
H3BO3 0.28 g 4.50 x 10-5
Br solution (100 mL)
KBr 1.00 g 8.40 x 10-4
F solution (100 mL)
NaF 0.29 g 6.80 x 10-5
Sr solution (100 mL) SrCl2·6H2O
0.22 g 8.18 x 10-5
P solution (100 mL)
NaH2PO4 8.43 g 1.27 x 10-3
Si solution (100 mL)
Na2SiO3·5H2O 2.12 g 1.17 x 10-3
The enrichment solution (Table 5) is composed of metal nutrients and an isolated
iron solution. Tris base buffer could be added to this solution to facilitate pH regulation
during PBR culture. However, since the pH is regulated by CO2 injection in the PBR, the
buffer was not used during PBR culture.
Table 5: Enrichment solution composition for NX medium
Enrichment solution (1 L)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
Tris base 5 g 2.89 x 10-4
143
Iron solution 379.61 mL
Metal A stock solution 250 mL
Iron ion is highly reactive inside a neutral and alkaline aqueous medium and
precipitates immediately. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is a chelating agent
able to stabilize iron ion in the culture media (Paolieri, 2017). Na2EDTA was, therefore,
dissolved in the solution first, for this purpose. When it was completely dissolved, the rest
of the iron forms were dissolved one by one. Both iron forms are based on F/2 and ASW
iron forms with new concentrations based on the results in Fig. 5 (table 6). Note that a
higher stability of iron and metals than the one in this recipe is possible with anhydrous
EDTA.
Table 6: Iron solution composition for NX medium.
Iron solution (500 mL)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
Na2EDTA·2H2O 6.97 g 1.37 x 10-4
FeCl3·6H2O 5.07 g 9.96 x 10-5
FeNH4-Citrate 1.03 g 2.04 x 10-5
The metal A stock solution (Tables 7 and 8) is composed of all the metal ions
(except iron) necessary for H. ostrearia culture (based on ASW and F/2 medium). This
solution is also stabilized with Na2EDTA chelating agent to avoid possible metal
precipitation between metal A ions and also between metal A ions and iron ion, when iron
solution and metal A solutions are mixed within the enrichment solution (Andersen,
2005).
Table 7: Metal A stock solution composition for NX medium
Metal A stock solution (500 mL)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
Na2EDTA·2H2O 16.08 g 1.51 x 10-4
144
Zn solution 100 mL 3.00 x 10-5
Co solution 10 mL 5.66 x 10-8
Metal C stock solution 100 mL
Se solution 58 µL 1.00 x 10-9
Mn solution 10 mL 2.42 x 10-6
Table 8: Isolated solution for Metal A solution realization
Zn solution (100 mL)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
ZnSO4·7H2O 2.46 g 3.00 x 10-5
Co solution (100m mL)
CoCl2·6H2O 0.04 g 5.66 x 10-8
Mn solution (100 mL)
MnSO4·H2O 1.17 g 2.42 x 10-6
Se solution (50 mL)
Na2SeO3 0.04 g 1.00 x 10-9
The metal B stock solution (Table 9) is composed of the lowest micronutrient
concentration of the NX medium, which implies multiple dilutions. This solution kept at
3°C was stable and started to precipitate only after 3 weeks. However, the metal ions do
not precipitate when dissolved separately (Table 10). Na2EDTA was not added to the
metal B solution in order to limit the addition of sodium to the NX medium, but it is still
possible to stabilize it with anhydrous EDTA (Andersen, 2005).
Table 9: Metal B stock solution composition for NX medium
Metal B stock solution (1 L)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
CuSO4·5H2O 10 mL 3.90 x 10-8
Na2MoO4·2H2O 10 mL 6.57 x 10-9
145
NiSO4·7H2O 10 mL 3.40 x 10-8
Table 10: Isolated solution for establishing Metal B solution
Cu solution (100 mL)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
CuSO4·5H2O 0.28 g 3.90 x 10-8
Mo solution (100m mL)
Na2MoO4·2H2O 0.05 g 6.57 x 10-9
Ni solution (100m mL)
NiSO4·7H2O 0.27 g 3.40 x 10-8
Finally, the composition of the vitamin stock solution is based on the vitamin
composition of F/2 and ASW (Table 11). After dissolution, the vitamin solution is filtered
at 0.2 µm inside a sterile 2 L bottle and kept at 3°C, covered with aluminum foil to avoid
light degradation of the vitamins. This solution is added under sterile conditions in the
sterile bottle of medium, after sterilization.
Table 11: Vitamins stock solution composition for NX medium
Vitamins stock solution (2 L)
Quantity used Concentration in Final
medium (M)
Thiamine HCl (C12H17N4OS+) 1.00 g 2.97 x 10-7
Biotine (C10H16N2O3S) 0.01 g 4.09 x 10-9
B12 Cyanocobalamine (C63H88CoN14O14P)
0.02 g 1.47 x 10-9
146
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151
Chapter IV:
Investigation of Haslea ostrearia
cellular fragility and consequences
of stirring strategy in conventional
photobioreactor culture
R. Nghiem Xuan1,3, J. L. Mouget1, 2, J. Pruvost 3, V. Turpin1, P. Jaouen3
1 Université de Nantes, MMS, EA 2160, Faculté des Sciences et des Techniques, 2 Rue de la
Houssinière, BP, 92208, 44322 Nantes Cedex, France.
2 MMS (Mer Molécules Santé), Le Mans Université, Ave O. Messiaen, 72085 Le Mans, France.
3 GEPEA, Université de Nantes, CNRS, UMR6144, Bd de l'Université, CRTT - BP 406, 44602 Saint-
Nazaire Cedex, France.
Ce chapitre est rédigé sous forme de publication pour soumission dans un journal
scientifique.
152
1 Abstract:
Discovered by Gaillon with the greening oyster phenomenon in 1820, Haslea
ostrearia is a benthic diatom that produces and excretes a blue pigment called Marennine.
This molecule was studied for several years and represents great industrial potential, as
described by Gastineau et al. (2014). Nevertheless, culture of the diatom on an industrial
scale is still challenging. Like many others diatoms, one of the main difficulties is cell
sensitivity to hydrodynamic shear stress, for which cell immobilization technology is
usually applied.
The cellular fragility of H. ostrearia to hydrodynamic shear stress is investigated in
this study. It has been demonstrated that strain is not sensitive to shear rate or shear
stress in laminar flow, even at high shear rate (30,000 s-1) and shear stress (3,180 Pa).
However, cultivation in a torus PBR with turbulent flow conditions showed a serious
negative impact on biomass productivity, with 0.3 ± 0.2 g m-2 d-1 compared to 1.0 ± 0.2 g
m-2 d-1 for an unstirred PBR. As an alternative strategy, it was proposed to apply a limited
mixing period per day, and 8 h of stirring was found to give the best biomass productivity
results with 1.8 ± 0.2 gx m-2 d-1. This demonstrates the need to mix the culture for at least
a few hours per day to avoid too much sedimentation of the benthic strain, which causes
a decrease in productivity.
Finally, a detailed analysis of the results has shown that biomass productivity is
related to the resulting rate of photon absorption received by pelagic (i.e. suspended) cells
over a 24 h period, which was influenced by both mixing and the length of lit periods. For
moderate mixing conditions leading to an acceptable shear rate in turbulent flow, this
parameter was found to be useful in optimizing the mixed H. ostrearia culture.
Keywords: Haslea ostrearia, industrial production, hydrodynamics, shear stress, cell
fragility, light, photobioreactor culture.
153
2 Introduction
Mixing is known to be a relevant operating parameter for any microalgae culture
system (Hochfeld, 2005; Richmond and Hu, 2008; Gabelle et al., 2012). It allows
optimization of the culture conditions in terms of homogeneity, growth nutrient
concentration, pH and temperature, while also allowing cell suspension for good light
access conditions in bulk. It remains, however, a parameter difficult to optimize when
cultivating strains that are sensitive to hydrodynamic shear-stress (Contreras et al., 1998;
Garcia Camacho et al., 2007; Michiels et al., 2015; Wang and Lan, 2018).
Several technologies are available for the culture of microalgae (Spolaore et al.,
2006; Pruvost et al., 2006; Pruvost et al., 2011; Pruvost et al., 2012). As closed systems,
photobioreactors are known to offer better control of culture conditions, enabling
systematic optimization to obtain maximum growth performance in a given strain. This
approach has been previously demonstrated for commonly cultivated genders like
Chlorella, Nannochloropsis and Arthrospira. These strains were grown in various
photobioreactor technologies with different types of mixing, i.e. airlift principle or
mechanical mixing (Pruvost et al., 2006; Ndiaye et al., 2018). They can therefore be
considered as resistant to the range of hydrodynamic shear stress usually encountered in
conventional photobioreactors. This resistance greatly simplifies their cultivation, which
also opens up the possibility of production at industrial scale.
However, some microalgae such as dinoflagellates and diatoms are also known to
be more sensitive to shear stress (Sobczuk et al., 2006; Wang and Lan, 2018). This is the
case with the diatom Haslea ostrearia, which is considered to be a fragile microalga
(Robert, 1989; Rouillard, 1996). The culture of H. ostrearia in conventional
photobioreactors has been reported as challenging, no doubt due to its marked sensitivity
to shear stress (Robert, 1989). Rossignol et al. (1999) attest that this strain is sensitive to
recirculation in pumps, which also reduces the range of photobioreactors (PBRs) that can
be used.
As a diatom, H. ostrearia possesses a solid silica protective structure called frustule,
which is supposed to present low resistance to shear stress. This frustule is composed of
two parts, which separate during cell division (Nassiri et al., 1998), leading to additional
fragility in the cell.
154
As an alternative to a conventional PBR based on cell-suspended culture,
technologies based on immobilized cells, which protect cells from hydrodynamic shear
stress, can offer benefits for fragile species. For example, immerged membrane PBRs
(Vandanjon, 1997; Rossignol et al., 1999; Rossignol, 1999), cell immobilization in agar gel
(Lebeau et al., 2000; Rossignol et al., 2000), and unstirred open pond PBRs (Turpin et al.,
2001; Turcotte et al., 2016). For H. ostrearia, the main molecule of interest of which -
marennine - is exudate, the immobilized-cell culture principle can be associated with
separation processes such as a membrane to continuously recover the extracellular
marennine (EMn).
When grown in an immerged membrane PBR technology, a biomass productivity
of 2.45 ± 0.25 mg L-1 d-1 was obtained for H. ostrearia (Rossignol et al., 1999). This is the
best productivity reported in literature. Despite extensive engineering work, a lower
productivity is reported for open pond culture and agar immobilized cell PBRs with 0.34
± 0.04 mg L-1 d-1 and 0.50 ± 0.20 mg L-1 d-1 respectively (Lebeau et al., 2000; Turpin et al.,
2001). For conventional suspended-cell systems, airlift technology has been tested but no
growth observed (Jubeau, 2009).
Mixing impacts several culture parameters, such as mass and thermal transfers,
and also light access to flowing cells. Regarding the effect on fragile cells, this is often
described as the mechanical impact of hydrodynamic shear stress, or shear rate, on the
physical integrity of cells (Fadlallah et al., 1995; Mitsuhashi et al., 1995; Olmos et al., 2003;
Garcia Camacho et al., 2007; Tesson and Latz 2015; Mauer et al., 2016). Using an adequate
quantity to relate hydrodynamic stress to microorganism fragility remains controversial,
shear stress itself being a complex physical phenomenon that varies widely between
culture systems. From a hydrodynamics point of view, the mechanical effect resulting
from hydrodynamics is represented by both shear stress (denoted τ) and shear rate
(denoted γ̇). In fluids, the former represents the stress (Pa) produced by the force applied,
parallel or tangential to the surface studied, while the latter is the velocity gradient (s-1)
produced by the progressive shear deformation of the fluid. To the author’s knowledge,
no proof has been provided to confirm that one quantity is more related to cell fragility.
As a result, both are used in literature (Fadlallah et al., 1995; Mitsuhashi et al., 1995;
Olmos et al., 2003; Garcia Camacho et al., 2007; Tesson and Latz 2015; Mauer et al., 2016).
155
In addition, the mechanical effect on cells also depends on the shape of the cell and
its mechanical structure. A great diversity of microalgae is known to exist, from the
Chlorella gender, which presents spherical resistant cells, to complex diatom shapes with
silica cell walls. It is also reported that the mechanical resistance of a given strain depends
on its physiological state, which is highly variable (Wang and Lan, 2018). Concerning H.
ostrearia, its special fusiform shape, as well as its cell division process with frustule
separation, could explain the cell’s fragility.
This study is aimed at a better understanding of the response of H. ostrearia cells
to mixing, and their sensitivity. This will be conducted as a two-step approach. The effects
of hydrodynamic shear stress will first be investigated in homogeneous laminar flow (i.e.
rheometer experiments) and in turbulent flow (i.e. a mechanically stirred
photobioreactor). The combination of light access and mixing will then be analyzed by
cultivating H. ostrearia under various light and mixing conditions.
3 Materials and Methods
3.1 Inoculum and cultures for preliminary experiments in rheometer and
flasks
The diatom H. ostrearia NCC 495 and NCC 501 was obtained from MMS laboratory
and cultivated in natural seawater from Croisic (Loire-Atlantique, France), enriched with
Guillard F/2 medium.
NCC 495 was used to analyze the cell response in perfect laminar flow (rheometer
experiment). NCC 501 was used 2 years after the NCC 495 experiment, when we
succeeded in growing H. ostrearia in conventional photobioreactor conditions. The NCC
495 strain was lost in the meantime due to senescence.
Cultures of H. ostrearia were maintained in 250 mL Erlenmeyer flasks containing
100 mL medium with 10% dilution, after 4 - 5 days of culture in Provasoli ES1/3 medium
(Robert, 1983) which was remodified for exclusive use of complete inorganic sources
(Nghiem-Xuan, 2019). This medium is a natural seawater-based medium and water is
filtered at 0.7 µm then 0.45 µm before being used as a medium.
156
The light supplied was white fluorescent light (F36W/840 T8, Sylvania, China)
with a 14/10 photoperiod (denoted L/D) at 300 µmol m-2 s-1 in a culture chamber (SANYO
MLR-350 culture chamber, Richmond Scientific, UK) at 16°C. Fresh natural seawater was
provided by the Croisic Ocearium (Loire Atlantique, France).
In the case of experiments in the rheometer, all samples were taken from the same
Erlenmeyer flasks where cells were grown for 5 days until they reached the exponential
phase. The preliminary results of the mixing effect on H. ostrearia were obtained in stirred
Erlenmeyer flasks. Stirring was carried out using a magnetic stirrer in 500 ml Erlenmeyer
flasks in the same medium and same culture conditions as the inoculum culture (SANYO
MLR-350 culture chamber, Richmond Scientific, UK).
3.2 Measurement of cell viability
Cell viability was measured with a Nageotte counting chamber (Marienfeld, AQRA,
India) and a light microscope (AXIO Scope A1, Zeizz, Germany). The living cells were
counted before and after each physical treatment to calculate cell viability (%). Note that
staining to distinguish living and dead cells was found to be unnecessary due to the
specific shape of dying/dead H. ostrearia cells, as shown in Figure 9. All measurements
were made around 1 x 105 cells mL-1 in the early stage of the stationary step (maximal
concentration usually observed in an Erlenmeyer flask).
157
Fig. 9: Microscopic view of Haslea ostrearia. (A) is the contrast of two cells, cell (1) being alive and cell (2) being dead. (B and C) shows living cells in a bloc of cellular residues, with an assessment of cell viability by
chlorophyll fluorescence under UV
3.3 Photosynthetic efficiency and pigments measurement
Photosynthetic efficiency as described by the PSII quantic efficiency (i.e. Fv/Fm
fluorescence ratio) was measured by Chlorophyll fluorescence to estimate the impact of
shear stress/mixing on the photosynthetic capacity of the cell. This was obtained with a
chlorophyll fluorimeter (Water-Pam, Heinz Walz, Germany). The maximal value of Fv/Fm
fluorescence ratio is reported as reaching 0.6 for diatoms (Rech, 2004).
To measure pigments, Chlorophylls a and c and total carotenoids were measured
after extraction in 90% acetone (Strickland and Parsons, 1968; Ritchie, 2008).
Chlorophylls a and c were measured using Ritchie’s methodology (2008), and carotenoids
by the Strickland and Parsons (1968) methodology. Extracted pigment solution was
measured (480, 630, 647 and 664 nm) by spectrophotometer (V-630 UV-VIS, JASCO,
Germany). Note that these measurements were only made for torus-PBR experiments.
The extracellular marennine (EMn) was measured using a spectrophotometer (V-630 UV-
VIS, JASCO, Germany) in the supernatant after centrifugation of the sample. A wavelength
of 669 nm was selected and the EMn mass concentration measured using the Beer-
158
Lambert equation (ɛ = 12 x 104 mol L-1 cm-1 and MEMn = 9893 g mol-1) in accordance with
Pouvreau et al. (2006).
3.4 Determination of Mean Rate of Photon Absorption (MRPA)
The mean rate of photon absorption noted that “MRPA” refers to the photons
absorbed by cells per unit of time and biomass, and is expressed as µmolh𝑣 gX -1 s-1 (Cornet
et al., 1998; Pruvost et al., 2008; Kandilian et al., 2014). This physical quantity is related
to the light condition and the radiative properties of the cells, which were measured for
the experiment using a spectrophotometer with integrative sphere (Pilon et al., 2011;
Kandilian et al., 2016). MRPA can also be deduced from a balance on the photonic phase
on the culture system (Pruvost et al., 2008):
Equation 2
𝐴𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡 =𝑆
𝑉 𝐶𝑋
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿) =𝑎𝑆
𝐶𝑋
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿)
where Alight is the MRPA received during a light period (µmolh𝑣 gX -1 s-1), q0 and qL refer
respectively to input and output photon flux density on the culture system (µmolh𝑣 m-2 s-
1), CX is the biomass concentration (g L-1), and aS the specific illuminated surface of the
culture system (m-1), which is the ratio between the illuminated surface S (m2) and the
culture volume V (m3).
Determination of the MRPA value was used to characterize the light absorbed by
suspended cells over a 24 h cycle. For this purpose, MRPA was first calculated during the
illuminated period (denoted Alight) and then related to the total culture cycle:
Equation 3
𝐴24ℎ, suspended = 𝑅𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡𝐴𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡
where RLight refers to the ratio of the light cycle (14/24 in our case) to compare results to
the continuous light case (denoted “Alight”).
The MRPA was then referred to the pelagic population (i.e. suspended cells). As a
consequence, the biomass concentration of pelagic cells Cpelagic was used as a reference
concentration in Eq. 2 with:
159
Equation 4
𝐴𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡 =𝑎𝑆
𝐶𝑝𝑒𝑙𝑎𝑔𝑖𝑐
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿)
Because the biomass in suspension was a function of the stirring conditions, Cpelagic
was estimated as a function of the concentration of pelagic cells achieved in stirred
(Cstirred) and unstirred (Cunstirred) conditions. Cpelagic was obtained as a weighted function of
both concentrations to take into account the different stirring periods therefore applied:
Equation 5
𝐶𝑝𝑒𝑙𝑎𝑔𝑖𝑐 = 𝑅𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑𝐶𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 + 𝑅𝑢𝑛𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑𝐶𝑢𝑛𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑
where Rstirred and Runstirred refer respectively to the ratio of stirred and unstirred time
during the culture.
Finally, this leads to the MRPA for suspended cells over a 24 h cycle:
Equation 6
𝑨𝟐𝟒𝒉, suspended =𝒂𝑺 ((𝒒𝟎 − 𝒒𝑳)𝑹𝑳𝒊𝒈𝒉𝒕)
(𝑪𝑺𝒕𝒊𝒓𝒓𝒆𝒅𝑹𝑺𝒕𝒊𝒓𝒓𝒆𝒅) + (𝑪𝒖𝒏𝒔𝒕𝒊𝒓𝒓𝒆𝒅𝑹𝑼𝒏𝒔𝒕𝒊𝒓𝒓𝒆𝒅)
CStirred and CUnstirred represent the pelagic biomass concentrations in the PBR which
were measured during stirred and unstirred periods respectively. These were estimated
from the measurement of cell density and total biomass concentration CX:
Equation 7
𝐶𝑆𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 = 𝐶𝑥𝑃𝑆𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑
where PStirred is the pelagic population in stirred conditions, obtained from the ratio of
suspended cell density to total cell density:
Equation 8
𝑃𝑆𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 =𝐶𝑒𝑙𝑙𝑆𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑑𝑒𝑑 𝑖𝑛 𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛𝑠
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙
Similarly, CUnstirred was obtained:
160
Equation 9
𝐶𝑈𝑛𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 = 𝐶𝑥𝑃𝑈𝑛𝑠𝑡𝑖𝑟𝑒𝑑
Equation 10
𝑃𝑈𝑛𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 =𝐶𝑒𝑙𝑙𝑆𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑑𝑒𝑑 𝑖𝑛 𝑢𝑛𝑠𝑡𝑖𝑟𝑟𝑒𝑑 𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛𝑠
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙
with PUnstirred the pelagic population in unstirred conditions and referring to the ratio of
suspended cell density to total cell density.
The stirred and unstirred time, represented respectively by Rstirred and Runstirred,
refers to the ratio of stirred and unstirred time (h) to the maximum light time represented
by TLight (daytime period of 14 h). Note that for the day/night cycle, 100% of the stirring
time is reached for 14, 20 and 24 h of stirring because the light period is 14 h (i.e. less than
the stirring time).
3.5 Characterization of shear stress influence on H. ostrearia
3.5.1 Investigation in rheometer
The effect of hydrodynamic shear stress on cell viability was first studied using a
Couette rheometer (PHYSICA MCR 500, Anton-Paar, UK), to apply a constant and
homogeneous shear stress field in perfect laminar flow on the diatom cells.
Shear cylinders of cone and plate types were used. The inner and outer cylinder
radii R1 and R2 were 14.36 mm and 14.46 mm respectively, with an inter-cylinder gap of
0.1 mm and a total volume of 25 mL. The inner cylinder rotates while the outer cylinder
remains stationary.
By modifying the viscosity of the medium, the impacts of both shear stress and
shear rate on the cell viability were investigated. For a Newtonian fluid (as is the case
here), both quantities were related to the dynamic viscosity of the medium:
Equation 11
𝜏 = μγ ̇
where τ is the shear stress (Pa), μ the dynamic viscosity of the fluid (Pa s-1) and γ̇ the shear
rate (s-1).
161
The maximum shear rate value achievable with shear cylinders was 35,000 s-1 as
obtained at a rotational speed of 1990 rpm. The exposure time to the different levels of
shear stress was limited to 1 h to avoid possible bias due to evaporation, and the
temperature was regulated at 20°C.
The experiments were conducted in triplicate on samples obtained on day/night
culture, for each hour of the daytime (14 h) and night periods (10 h). Cell counting was
carried out on the sample before treatment (i.e. control). Different values of shear rate
were tested (1,000; 5,000; 10,000; 20,000 and 30,000 s-1) but only results with a high
shear rate (30,000 s-1) were found to be relevant and are therefore presented here.
Flow laminar stability in the Couette flow was checked by calculating the Taylor
number to check that no Taylor vortices occurred. These vortices are found for Taylor
numbers higher than 41.3 (Michiels et al., 2010; Contreras et al.,1998), which is defined
as:
Equation 12
𝑇𝑎 =4ω2R4
ν2
where ω is the angular velocity (m min-1), R is the inter-cylinder gap (m) and ν = µ/ρ is
the kinematic viscosity (m2 min-1).
At 30,000 s-1, the angular velocity ω was 181.2 m min-1 and the cinematic viscosity
ν of our seawater-based substrate was 1.04 x 10-6 m2 min-1. This led to Ta = 12.13, below
the Taylor regime.
To distinguish shear rate and shear stress effects, the viscosity of the medium was
increased by adding Locust Bean Gum (LBG) (from Ceratonia siliqua seeds, Sigma Aldrich,
USA). Three different viscosity values were tested (8.54 x 10-3 Pa s-1, 2.84 x 10-2 Pa s-1 and
1.06 x 10-1 Pa s-1, corresponding respectively to 0.3, 0.5 and 1% of LBG). Note that for higher
values, a non-Newtonian shear thinning behavior tends to appear (Michiel et al., 2010; El
Batal et al., 2012).
3.5.2 Effect of shear stress in stirred flasks
In complementary experiments in constant and homogeneous shear stress fields,
the effect of mixing as obtained in stirred flasks was studied. The cells were cultivated
162
under the same conditions as the inoculum culture, with constant 24 h light and light
cycles of 14 h/10 h. Some Erlenmeyer flasks were stirred by a magnetic stirrer while
others remained unstirred. For the mixed flasks, shear rate intensity was estimated as
constant at 50 s-1 as fixed by the magnetic stirrer rotation speed. This shear rate value was
estimated according to Halasz et al. (2008). This corresponded to a Reynolds number Re
of around 5,000, corresponding to a turbulent regime (Re >4,000) inside the flasks (Rott,
1990).
3.5.3 Investigation in torus-shaped PBR
A torus-shaped PBR stirred by a marine impeller was used to investigate the long-
term effect of mixing and shear stress on H. ostrearia culture (Fig. 10, impeller no.2 was
used here). As with most mixed bioreactors, the effect of shear stress on living cells is
difficult to characterize. The shear stress field is difficult to determine accurately because
of a marked heterogeneity in the culture volume. This heterogeneity makes the shear
stress effect on living cells dependent on the cells’ history (and therefore trajectory) in
the culture vessel. The torus-shaped PBR has some advantages here. It can be divided into
two zones: the impeller zone and the circular loop zone (Fig. 10 left). This configuration
avoids a dead mixed volume (Khalid and Legrand, 2001). Because of its loop
configuration, the device also allows all the flowing cells under consideration to be
subjected to a similar history up to hydrodynamic shear stress. Although the shear stress
field is heterogeneous in the overall culture volume, all cells periodically flow in the region
of the impeller (approx. every 10 s), where the maximum shear rate occurs. Shear rate
can also be varied by simply modifying the rotation speed of the impeller, and even a low
impeller rotation speed (200 rpm) leads to good mixing conditions that avoids
sedimentation of H. ostrearia cells.
The impeller rotation speed was fixed at 200 rpm for all the experiments.
Following Pruvost et al. (2006) who numerically investigated the hydrodynamics of the
torus-shaped PBR, this leads to a mean bulk velocity of Uo = 0.05 m s-1 which was found
sufficient to avoid cell sedimentation, corresponding to an average shear rate value of 30
s-1 in the impeller zone and 10 s-1 in the loop zone, with an average value of 20 s-1 for the
total volume. Note that unlike the rheometer experiment where laminar conditions were
guaranteed, a turbulent regime was obtained in the torus PBR. These average shear rate
163
values can therefore only be considered as a first indication, as turbulent flows will
generate shear stress time and spatial variation.
Regarding culture conditions, the torus-shaped PBR enables full control of pH,
temperature, light and also mixing, in terms of stirring periods and intensity (i.e. impeller
rotation speed). Air is injected into the PBR to avoid the accumulation of dissolved oxygen,
which contributes to culture mixing. The flow rate was fixed at constant throughout the
experiments. CO2 was used for pH regulation, mixed in the air circuit by a control valve to
maintain a low variation in the total gas flow rate (100 mL min-1). Cells were grown in
non-limited culture medium 12N48P natural seawater (ES/3 complete inorganic
modified medium) to guarantee that any modification of the biomass productivity when
measured was only due to the effect of mixing.
Fig. 10: Representation of the torus shaped PBR geometry with its dimensions (left), and 2 types of impellers used for it stirring (right) (Pruvost et al., 2006)
3.6 Statistics
The statistics were compiled using XLSTAT 2019 software (Addinsoft). The normality
of the distribution law for the different samples was identified by the Shapiro-Wilk test to
select the tests (T-test). Statistics were measured with triplicate data for the experiments
in Figures 12 to 16 and with sextuplicate data for the in experiments Figures 17 to 19.
164
4 Results
4.1 Effect of short-term application of homogeneous and constant shear
stress
4.1.1 Investigation of experiment duration in rheometer treatment
As a first assessment of the experimental characterization in the rheometer, the
culture (i.e. seawater medium and microalgae cells) was first exposed at 20°C to a
constant shear rate of 30,000 s-1 (the highest intensity provided by the rheometer) for
300 min. The high viscosity of the medium was found to decrease after 260 min due to the
small volume and noted evaporation, although the temperature was regulated at 20°C. Up
until 260 min the proportionality of shear stress to sample viscosity for Newtonian fluid
was assessed as expected (Eq. 11) but with a variation in shear stress of 22% over the
total period, indicating a progressive decrease in apparent viscosity of the medium. For
the first 60 min the shear stress variation represented only 0.4%, which was considered
acceptable for our experiment (Fig. 11).
Fig. 11: Dynamic viscosity of the sample and shear stress applied over time at a constant shear rate of 30,000 s-1
In terms of the effect that shear stress has on cell viability, no significant
relationship was observed, even after five hours of treatment at the highest shear stress
of the rheometer (Fig. 12). The progressive decrease in viscosity (before 230 min) cannot
therefore be related to a cell disruption process. This was assumed to be attributable to
the thixotropic behavior of the culture (medium, algae and released exometabolites),
which is usually encountered in the liquid phase with solid inclusions (Reiner and Scott
0,0E+00
2,0E-04
4,0E-04
6,0E-04
8,0E-04
1,0E-03
1,2E-03
1,4E-03
1,6E-03
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290
Dyn
amic
vis
cosi
ty µ
(P
a s-1
)
She
ar s
tre
ss τ
(Pa)
Treatment time in shear cylinder (min)
Shear Stress [Pa] Viscosity
165
Blair, 1967). Note that, while decreasing the apparent viscosity and therefore shear stress
value for a constant stress rate, this helps to limit the shear stress impact on cells.
Based on these results, a single hour of treatment was selected as the reference for
experiments. It was also considered unnecessary to analyze treatment at a lower shear
stress or shear rate.
Fig. 12: Evolution of cell viability at a constant shear rate (30,000 s-1) over time. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Results are presented in Fig. 12. No apparent cells destruction was observed even
at the highest shear rate value reached by the rheometer.
4.1.2 Effect of viscosity on cell viability by rheometer treatment
The literature reports different quantities when investigating the effect of
hydrodynamics on cell viability. Shear stress (τ) is usually used (Connor et al., 2002;
Michiel et al., 2010; Leupold et al., 2013), but shear rate was also proposed (Barbosa et
al., 2004; Contreras et al., 1998), while some studies report the effects of operating
parameters of the processes used (Rossignol et al., 1999; Jaouen et al., 1998; Vandanjon
et al., 1999).
In our study, the shear rate is considered the reference and viscosity was
progressively increased to modify shear stress accordingly, as described in Table 12.
60
70
80
90
100
110
120
0 60 120 180 240 300 360
Ce
ll vi
abili
ty (
%)
Time (min)
166
Fig. 13: Haslea ostrearia cell viability at a constant shear rate of a 30,000 s-1 with different concentrations of Locust Bean Gum (LBG) to modify viscosities and shear stress accordingly. Data is mean ± 95% CI for n = 3
In all cases, no significant impact of viscosity on H. ostrearia cell viability was
observed, as shown in Fig. 13 (cell viability > 95%). At a constant shear rate, the shear
stress applied can increase up to 3180 Pa for 1% LBG mixture, but even at this value no
cell disruption was observed. Note that the Taylor number remained below the critical
value, indicating that no Taylor vortices occurred during the experiments.
Table 12: Experimental conditions during the experiment with progressive shear stress increase for a constant shear rate of 30,000 s-1
Control 0.3% LBG 0.5% LBG 1% LBG
Shear stress τ (Pa)
32.1 256.2 852 3180
Taylor number Ta
12.13 6.41 0.8 0.04
Dynamic viscosity µ (Pa
s-1) 1.07 x 10-3 8.54 x 10-3
2.84 x 10-2
Shear thinning 1.06 x 10-1
Shear thinning
We can note that these results contrast with those of Michiel et al., (2010). These
authors imposed a much lower shear rate (from 0 to 1000 s-1) and observed 66% cell
death in the rheometer experiment for the diatom Chaetoceros muelleri at 1.3 Pa. This may
be attributed to a difference in fragility of the species.
80
85
90
95
100
105
110
Control 0.3% LBG 0.5% LBG 1% LBG
Ce
ll vi
abili
ty (
%)
Sample of microalgae
167
4.1.3 Investigation in day/night cycles
Like many microalgae cultured in solar conditions, Halsea ostrearia cells seem to
synchronize with day/night cycles, triggering cell division during the dark phase (Mitsue
León-Saiki et al., 2018; De Winter et al., 2017). To study whether shear rate could have
more impact during the cell division stage, cell fragility was measured with a rheometer
on a flask culture subjected to light (14 h) and dark (10 h) periods. Because of the culture
growth and therefore cell concentration increase, cell viability was determined using the
cell concentration measured after treatment (2.41 ± 0.46 x 107 cell L-1) (Fig. 14).
The highest shear rate was first applied in the rheometer (30,000 s-1). Results are
given in Figure 14. H. ostrearia cells were found to be unaffected by the shear rate during
the 14 h of the light period (confidence interval and T-test does not allow variations to be
concluded between control and treated samples P > 0.05). We can note that the cell
viability of control samples is usually inferior to that of treated samples. This could be
attributable to cell homogenization by rheometer treatment compared to the control
(even with manual stirring before sample), by re-suspending some of the immobilized
cells in their own biofilm.
Same observation can be done for the night period. No significant shear stress
impact was observed. In addition, an increase in cell density, definitely linked to cell
division, is present throughout the night period. Note that this confirms that H. ostrearia
synchronizes with the light cycle.
168
Fig. 14: Haslea ostrearia cell viability cultivated in day/night culture. Cells were subjected to a constant shear rate (30,000 s-1) for 1 h. Values are reported for every hour during the day (14 h) and night (10 h) period of culture. Data is mean ± 95% CI for n = 3
169
4.2 Effect of long-term application of hydrodynamics shear stress in
turbulent flow
4.2.1 Investigation of stirring and dark/night illumination effects on H. ostrearia
in flask culture
Before analyzing H. ostrearia growth in a mixed PBR, the cell was cultured
beforehand in flasks. Cell growth with and without a magnetic stirrer was measured for
two illumination conditions: a 14 h/10 h photoperiod and constant illumination. Agitation
conditions produced by the magnetic stirrer (mean rotation 100 rpm) led to an estimated
shear rate of 50 s-1 in turbulent flow conditions (Halasz et al., 2008). Results are reported
in Fig. 15 in terms of cell productivity.
Fig. 15: Haslea ostrearia culture with and without stirring in light/dark cycle and constant 24 h illumination for 8-day batch. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Surprisingly, the unstirred constant 24 h light and the unstirred 24 h in the light
cycle revealed the lowest cell productivity whatever the stirring conditions (between 1.2
and 2.0 x 106 cells L-1 d-1), the best results being achieved with the unstirred culture with
day/light cycles (7.5 x 106 cells L-1 d-1). Comparing stirred cultures, the culture in the
day/night cycle led to a 5.7-fold increase under the same light conditions (6.8 x 106 cells
L-1 d-1) as the 24 h lit culture (1.2 x 106 cells L-1 d-1).
Note that even though the day/night stirred culture production was slightly lower
than the unstirred one under same illumination conditions, the T-test confirmed no
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
unstirred Stirred light Stirred 24h unstirred
Light cycle L/D Light 24h
Ce
ll p
rod
uct
ivit
y (1
06ce
ll L-1
d-1
)
Light and stirring conditions
170
significant difference between the two results (P > 0.05). However, for constant 24 h
illumination, a significant impact on constant stirring can be concluded. It can therefore
be concluded that day/night periods are required for increased Haslea ostrearia growth.
Constant stirring has a lower effect, although it seems to negatively affect cell productivity
under turbulent flow conditions with magnetic stirring at around 50 s-1.
4.2.2 Investigation of mixing effect in torus shaped photobioreactor
A possible effect of stirring and shear rate on H. ostrearia cells can be highlighted
from previous results in flasks, achieved in turbulent flow and mainly when a night period
was added. These conditions are therefore very different from those applied in rheometer
experiments (homogeneous shear rate condition in laminar flow).
A full set of experiments was then conducted in a torus-shaped PBR to investigate
the possible long-term effect. The PBR was operated in semi-continuous conditions, and
cell density and photosynthetic efficiency were monitored every hour for 48 h (Fig. 16).
Only the two last days of the semi-continuous culture are reported here (after 7 days of
biomass productivity stabilization). The PBR was operated at a dilution rate of D = 0.1 d-1
with and without stirring by the marine impeller. Note that during the 48 h period of
measurement, the dilution rate was stopped for easier analysis of the cell response
(possibly hidden by culture harvesting). Yellow and blue areas represent light and dark
periods respectively throughout the culture. In addition, for the first 24 h of the culture
the PBR was unstirred and the impeller activated only after the first 24 h for the
remainder of the 48 h. Results are given in Figure 16.
Changes in culture conditions were found to affect cell productivity. In addition,
the response could not be described as usual, with successive increases and decreases in
cell density. A small increase from 1.7 x 108 cells L-1 to 2.5 x 108 cells L-1 appeared from 6
h to 8 h respectively on average, then cell density remained stable until 24 h when it
increased greatly from 25 h to 28 h, corresponding to the beginning of the stirring,
reaching 4.0 x 108 cells L-1. However, cell density decreased immediately to 1.7 x 108 cells
L-1 from 28 h to 31 h. Note that contrary to the experiments conducted in flasks, the
synchronized division stage was not observed at night.
Regarding PSII efficiency (Fv/Fm), values were found to range between 0.62 and
0.69, which is considered the optimal photosynthetic capacity for diatoms (Rech, 2004).
171
A decrease of 5% was observed at 26 h of the culture, which could be due to the impact of
mixing. However, this wide variation can also be observed throughout the culture, even
in unstirred conditions. In all cases, variations did not exceed 10%. It can therefore be
concluded that mixing itself has no significant impact on the photosynthetic capacity of H.
ostrearia cells. Only cell division seems to be affected by stirring.
172
Fig. 16: Time evolutions of cell density and fluorimetry during semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus-shaped PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3
173
In a second experiment, H. ostrearia was cultivated in semi-continuous mode at D
= 0.1d-1 in constant light, but with different stirring durations. The goal was to better
identify cell response to stirring to establish a mixing strategy for H. ostrearia culture in
photobioreactors. Results are given in Fig. 17 & 18.
Fig. 17: Cell and biomass surface productivity (PS) obtained for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus PBR in continuous light with five different stirring duration conditions (0; 8; 14; 20; 24 h). Data is
mean ± 95% CI for n = 6
Figure 17 shows that 8, 14 and 20 h of stirring led to the largest biomass
productivities; larger than unstirred culture (i.e. 0 h in Fig. 17). 1.8 ± 0.2 g m-2 d-1 can be
achieved with 8 hours stirring, compared to unstirred culture which reaches 1.0 ± 0.2 g
m-2 d-1. However, 24 h stirring was shown to greatly reduce biomass productivity at 0.3 ±
0.2 g m-2 d-1. The same results profile can be observed for cell productivity, achieving up
to 22.9 ± 0.5 x 108cells m-2 d-1. However, constant stirring for 24 h led to only 4.3 ± 0.3 x
105 cells m-2 d-1 (equivalent to a cell density of 1.1 x 105cell L-1 which is lower than the
inoculation concentration of 1.5 x 105 cells L-1). So, even if a low biomass is still measured
for constant 24 h stirring, it tends to indicate that culture loss will result if the same
conditions are applied over time. Indeed, the 0.3 ± 0.2 g m-2 d-1 measured here can be
assumed to be mainly composed of cellular exometabolites and empty silica frustules as
observed by light microscopy. The T-test revealed no significant differences between the
14 h and 20 h experiments on biomass productivity (P > 0.05) or between 8 h and 14 h on
cell productivity (P > 0.05).
0
5
10
15
20
25
30
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 8 14 20 24
Cel
l PS
(10
8ce
ll m
-2d
-1)
Bio
mas
s P
S(g
m-2
d-1
)
Stirring time (Hours)
Biomass Cell
174
Fig. 18: Total photosynthetic pigment production (%) and Extracellular marennine (EMn) excretion (%) for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus PBR in constant light and different stirring duration
conditions. Data is mean ± 95% CI for n = 6
In terms of pigment production, the content of extracellular marennine (% W/W)
as shown in Figure 18 remains almost unaffected when 0, 8, 14 and 20 h of stirring is
applied, with a content of 0.61 ± 0.04, 0.57 ± 0.18, 0.24 ± 0.44 and 0.34 ± 0.09% of biomass
produced, respectively. This absence of significant difference between the 0 h (no
stirring), 8 h, 14 h and 20 h experiments on EMn productivity is confirmed by a confidence
interval. Surprisingly, the constant 24 h stirring led to significant results, with 6.81 ±
1.92%. This can be attributed here to the intracellular marennine which may have been
released after cell disruption, possibly due to shear stress.
In terms of total pigment concentration (% w/w), similar results as for biomass
productivity were observed. Stirring time allowed an increase of total pigment
concentration of 2.2 ± 0.3 % of biomass for 8 h of stirring, against 1.3 ± 0.2 % for unstirred
conditions. However, the increase in stirring time quickly becomes unfavorable for
pigment production, decreasing to 0.8 ± 0.1 % of biomass for a 24 h mixing period.
Our results tend to emphasize that Halsea ostrearia growth rate is favored by
applying mixing, but also that cells possibly disrupt over a 24 h period of stirring (at least
under the hydrodynamic conditions applied here). Where this relates to results achieved
in day/night periods, the cell disruption may be explained by the sensitivity of H. ostrearia
cells at the division stage, which could occur in a 24 h period. However, the wide variation
in pigment content also requires explanation. Mixing may indeed have an impact on total
-1012345678910
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 8 14 20 24
EMn
(%
w/w
)
Tota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
Stirring time (Hours)
Total pigment EMn
175
pigment production by modifying the photosynthetic conditions in bulk culture. It was
actually shown that mixing does not affect the photosynthetic capacity of the cell, so
suspended cells are capable of photosynthetic conversion. Photosynthetic pigments are
known to be closely related to received light, with an overall decrease in pigment with
increasing light overexposure to limit the energy overload.
The results presented in Figures 17 and 18 alone, therefore, do not prove that 8 h
of stirring is the optimal value for H. ostrearia culture. Because of the large sedimentation
rate of H. ostrearia cells, stirring could indeed induce a change in access to light, which
could also benefit growth. To better analyze this, the rate of photon absorption, as
represented by the MRPA, was estimated for each stirring time (Equation 3). Results are
given in Figure 19.
Fig. 19: Estimation of Mean Rate of Photon Absorption (A24H, suspended) for 0, 8, 14, 20 and 24 h stirring duration in torus PBR, according to biomass surface productivity (PS) achieved (L = 4cm) (q0 = 300 μmol m-2 s-1). Data
is mean ± 95% CI for n = 6
Although this result must be considered as a first estimation due to the difficulty
in re-suspending H. ostrearia cells correctly in in the culture volume (measurement of cell
concentration is used in Eq. 8), this curve can be compared with the data obtained for
Chlorella vulgaris and Nannochloropsis gaditana, which possess optimal MRPA ranges 11
- 15 μmol g-1 s-1 and 13 – 15 μmol g-1 s-1 respectively (Artu, 2016). Our analysis reveals
that only 8, 14 and 20 h stirring periods achieve the range of optimal MRPA values for the
two previously-mentioned microalgae species, with respectively 10.8, 15.5 and 14.0 μmol
g-1 s-1 (Fig. 19). On the other hand, 0 h (unstirred culture) and 24 h stirring periods,
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
PS
Bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
A24h,suspended (µmolhv gx-1 s-1)
0h 8h 14h 20h 24h
176
corresponding to the lowest biomass productivity (respectively 1.0 ± 0.1 and 0.4 ± 0.2 g
m-2 d-1), are found to be well above these values, with respectively 44.4 and 42.6 μmol g-1
s-1. Large values of MRPA are also known to result in a decrease in pigment content due
to overexposure to light. This is in agreement with the pigment analysis presented in
Figure 18. In addition to the possible effect of shear-stress on cells and their division, this
analysis therefore tends to suggest a strong relation between mixing period, light
exposure, pigment acclimation, MRPA value and, eventually, the resulting photosynthetic
growth.
5 Discussion
As a diatom strain and because of its shape and structure (frustule) H. ostrearia is
usually considered to be physically sensitive to shear stresses, hypothetically caused by
culture mixing (Nassiri et al., 1998, Wang and Lan, 2018). The frustule is also related to
cell division, which implies the frustule has to be opened, hypothetically making the cell
more sensitive to hydrodynamic stress.
Our results demonstrated, however, that H. ostrearia cells are more resistant to
shear stress than could be expected according to the literature, as shown, for example, by
our experiments in the rheometer, which allows a shear-rate of up to 30,000 s-1 to be
achieved (Fig. 12 & 14). In addition, contrary to what has been demonstrated elsewhere
(Michiel et al., 2010), increasing the culture viscosity and consequently the shear stress
did not result in any significant variation in cell viability (Fig. 13) in our case. The
experiment in the rheometer also failed to highlight any increase in cell fragility during
cell division. Although we were only able to conduct experiments under large shear-stress
values for 1 hour due to the conditions of the experiment, H. ostrearia can be considered
resistant to high shear-rate values in a laminar well-structured flow (i.e. without vortices),
as obtained with our experiments in the rheometer. Note that this could represent an
opportunity to design a specific PBR enabling this type of hydrodynamics.
In most culture systems, mixing generates vortices and in most cases turbulent
flow. The specific penne shape of the cell can induce a specific response here. Mauer et al.
(2016) attest that red blood cells present anisotropic behavior because of their oblong
shape, which allows mechanical forces to be limited due to the shear rate on the cells, by
orientating parallel to the fluid velocity gradient (i.e. shear rate). Such behavior could
177
explain our results with H. ostrearia in the rheometer. Because of their shape, cells can
orientate in the Couette flow which is thereby generated, leading to a limitation of the
impact that shear rate has on the cell.
However, parallel laminar flow is rarely found inside conventional mixed
photobioreactors. This makes the effect of shear stress difficult to understand due to the
possible large variations in time and space of shear stress fields. Shear stress fields are
therefore the result of the sparge valve, bubble disruption at the liquid/gas interface in a
tubular PBR, the recirculation pumps, etc. (Leupold et al., 2013 ; Connor et al., 2002 ;
Contreras et al.,1998 ; Jaouen et al., 1998 ; Wang and Lan, 2018). All these conditions could
lead to very different hydrodynamics. In other words, experiments in rheometer and
Couette flow are certainly far from being able to represent actual hydrodynamics in a PBR,
and cell fragility cannot be related to shear rate value.
The effects of mixing were further investigated by applying more realistic
conditions, namely turbulent mixing and day/night periods, because of the possible
relation between shear stress effect and cell division. Preliminary results in an
Erlenmeyer flask (Fig. 15) showed a significant negative impact when the culture was
continuously illuminated, especially when combined with constant stirring. This suggests
cell death due to cell disruption. However, additional experiments in semi-continuous
culture (i.e. long-term effect) refuted this hypothesis by emphasizing the positive impact
that certain stirring periods (8, 14, 20 h) have on biomass productivity. It also suggests
the hypothesis of cell division sensitivity by showing a possible larger cell disruption
during the cell division stage (fig. 16). Nevertheless, it was also shown that the effect of
stirring duration could not be separated from a modification of the cells’ light access. H.
ostrearia cells exhibit a fast sedimentation rate. By applying mixing, cells were re-
suspended, which led to better light access and therefore a resulting photosynthetic
growth for moderate values of mixing duration. In fact, pigment content was found to be
closely related to light absorption conditions (as represented by the MRPA), indicating a
photo-acclimation process, and lower productivity was observed at constant illumination,
which could be attributed to light overexposure. All of our results therefore tend to
illustrate the possibility that the sensitivity of H. ostrearia to mixing in a PBR culture could
result from the combination of shear rate (or shear stress), especially during cell division,
and also modification of the cells’ exposure to light because of their sedimentation ability.
178
Finally, the sensitivity of H. ostrearia to mixing is closely related to the physiology of the
cell (cell division and benthic behavior, but also light needs through modification to cell
light exposure), and not only to its physical resistance (shape and silicate structure).
6 Conclusions
H. ostrearia is usually described as a species that is highly sensitive to hydrodynamic
shear stress due to its tychopelagic behavior and rigid cell structure, composed mainly of
silica. Our study, however, attested to its ability to resist both high shear rate and shear
stress. Compared to similar studies available in literature on other diatoms, a higher
mechanical resistance than for Phaeodactylum tricornutum or Chaetoceros muelleri
(Sobczuk et al., 2005; Michiel et al., 2010), could be suggested, at least in laminar flow, as
tested here by using a rheometer.
H. ostrearia was found to be sensitive to long-term application of mixing in turbulent flow,
which could be attributed to the anisotropic behavior of such mixing conditions, resulting
in more complex hydrodynamics and preventing cell orientation along the flow. However,
comparing immobilized with mixed culture, stirring was shown to have a positive effect
on biomass productivity. The duration of the mixing was found to be relevant, a duration
of around 20 h and over resulting in a negative effect. This could be attributed to a more
marked fragility at the cell division stage
It was also suggested that the positive effect of a moderate mixing duration could
be attributed to an enhancement of cell access to light, resulting in better photosynthetic
growth conditions. Biomass productivity was found to be directly related to the rate of
photon absorption (i.e. MRPA), which was influenced by mixing re-suspended cells in
bulk.
This observation opens up the possibility of culture optimization, but it requires
further investigation as large values of MRPA produce a negative effect on biomass
productivity. This study should focus in particular on better characterization of the light
response of the pelagic cells of H. ostrearia. This physiological behavior has mainly been
studied in the ecological state and under benthic conditions (Robert, 1983; Rincé et al.,
1999). Further studies would be of interest in the pelagic conditions involved in a mixed
PBR.
179
Our study attests that H. ostrearia can be cultured under controlled stirring
conditions, thus avoiding limitations due to the cell immobilization process.
180
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185
Chapter V:
Haslea ostrearia culture in
photobioreactor: growth
parameters gathering and
marennine production optimization
R. Nghiem Xuan1,3, J. L. Mouget1, 2, J. Pruvost 3, V. Turpin1, P. Jaouen3
1 Université de Nantes, MMS, EA 2160, Faculté des Sciences et des Techniques, 2 Rue de la
Houssinière, BP, 92208, 44322 Nantes Cedex, France.
2 MMS (Mer Molécules Santé), Le Mans Université, Ave O. Messiaen, 72085 Le Mans, France.
3 GEPEA, Université de Nantes, CNRS, UMR6144, Bd de l'Université, CRTT - BP 406, 44602 Saint-
Nazaire Cedex, France.
Ce chapitre est rédigé sous forme de publication pour soumission dans un journal
scientifique.
186
1 Abstract:
The marine diatom Haslea ostrearia which has the capacity to excrete a blue
pigment called marennine, described as having industrial potential according to
Gastineau et al., (2012), remains a challenging organism to culture in a photobioreactor
(PBR). Robert (1989) and Rouillard (1996) assumed that benthic behavior and apparent
sensitivity to hydrodynamic shear stress could be responsible for this. Immobilized-cell
protocols proved successful but have rather low extracellular marennine (EMn), i.e. 0.63
± 0.05 mg L-1 d-1 and 0.43 ± 0.05 mg L-1 d-1 for passive immobilized cell and agar gel
immobilization respectively. This could be attributed to a limitation in mass or light
transfer in the biofilm and consequent decreasing kinetics of biosynthesis (i.e. growth and
EMn production).
This study investigates culture in a conventional mixed PBR, which has previously
been proven to overcome culture limitations such as mass transfer, and to provide a high
level of control over light access to cells, enabling the application of systematic
optimization of photosynthesis-related kinetics.
Increasing the dissolved inorganic carbon concentration up to values of around 5-
10 mM was found to increase both growth kinetics and EMn production. For example,
EMn production reached 1.0 mg L-1 and 7.3 mg L-1 for DIC concentrations of 3.75 mM and
4.61 mM (corresponding to gas enrichment of 2% CO2 and 15% CO2 respectively). Growth
medium enrichment with silica (Si) to avoid growth limitation by nutrients was also found
to be challenging due to chemical precipitation. A fed-batch strategy on Si-P supply was
implemented, leading to an increase in biomass productivity (51.8 ± 2.3 mgX L-1 d-1).
Although EMn was produced continuously, the nutrient-limited conditions led to higher
productivity with 9.2 ± 1.7 mgEMn m-2 d-1, 37.9 ± 0.7 mgEMn m-2 d-1 and 54.5 ± 1.8 mgEMn m-
2 d-1 for phosphorus, silicon and nitrogen deprivation respectively.
In addition to the usual culture parameters of optimal pH and temperature (pHOPT
= 7.8 and TOPT = 22°C), the effect of light availability was also investigated, as represented
by the Mean Rate of Photon Absorption (MRPA). A direct relation was shown for both
biomass and EMn production kinetics. However, maximal biomass and EMn
productivities were found at different MRPA values, respectively 1.7 ± 0.1 gx m-2 d-1 at 12.3
µmolh gx-1 s-1 and 11.0 ± 0.5 mgEMn m-2 d-1 at 8.4 µmolh gx-1 s-1.
187
Finally, a continuous EMn production was obtained in optimal conditions, leading
to a productivity of 4.5 ± 0.16 mgEMn L-1 d-1, enabling validation of the conventional mixed
PBR for H. ostrearia culture and continuous EMn production.
.
188
2 Introduction
Microalgae are investigated for industrial purposes due to their potential for
producing molecules for pharmacology, cosmetology, food and biofuel, and for their use
in water treatment and CO2 valorization (Spolaore et al., 2006; Cardozo et al., 2007).
Nowadays however there are few industrialized microalgae, representing only a minor
part of algae biodiversity. There are estimated to be about 200,000 – 800,000 species of
which only 50,000 have been described (Starckx et al., 2012). This could be partly due to
difficulties in scaling-up the culture to industrial levels. A significant lack of knowledge is
usually the main reason, (Spolaore et al., 2006) but in the case of diatoms and
dinoflagellates, high sensitivity to hydrodynamic shear stress and stirring conditions is
often referenced (Wang and Lan, 2018). Additionally, specific culture medium and culture
conditions may be required, as has previously been shown for several species cultivated
on a large scale. This is the case with Haematococcus pluvialis for astaxanthin production,
obtained under intense light, high salinity, and low availability of nutrients (Shah et al.,
2016; Panis et al., 2016), and for Dunaliella salina production of β-carotene, obtained
under intense light and high salinity (Ben-Amotz et al., 1983; Oren, 2005).
Haslea ostrearia is a diatom that has been studied since 1820 (Gaillon, 1820) at
laboratory scale. It has the capacity to produce and excrete a blue pigment called
marennine, which has industrial potential (Gastineau et al., 2012). This microalgae strain
is well known to be shear-stress sensitive and its culture in PBR conditions is therefore
challenging. Culture in a specific photobioreactor (PBR), such as agar immobilization PBR
and immersed membrane PBR (Rossignol et al., 1999; Lebeau, 2000).was implemented.
The approach was successful due to the benthic behavior of H. ostrearia. Cell
immobilization also enabled the prevention of hydrodynamic shear stress on cells
(Robert, 1989; Rouillard, 1996). But although immobilized-cell protocols proved
successful, the extracellular marennine production obtained was fairly low, i.e. 0.63 ± 0.05
mgEMn L-1 d-1 and 0.43 ± 0.05 mgEMn L-1 d-1 for passive immobilized cell and agar gel
immobilization respectively. This can be attributed to limitations in mass or light transfer
in the biofilm, thereby decreasing the kinetics of biosynthesis (i.e. growth and EMn
production).
Medium composition and cell fragility have been investigated in a previous work. A
new NX medium was proposed and it was demonstrated that H. ostrearia cells could
189
tolerate mixing conditions when an appropriate stirring strategy was applied. This opens
up the perspective of a systematic optimization of culture conditions. As already
demonstrated in several publications (Pruvost et al., 2009; Takache et al., 2012),
suspended-cell culture enables the prevention of growth limitation by nutrient access
(including dissolved organic carbon) while optimizing photosynthetic growth by
controlling light availability in bulk.
The aim of this work is to investigate and optimize the parameters (pH, temperature
and light) for H. ostrearia culture in a mixed PBR. Comparison will be made with
immobilized cell culture. The influence on Extracellular Marennine (EMn) productivity
will also be considered. Currently, the
EMn production pathway remains unclear. Robert (1983) attested that EMn is
continuously produced as a primary metabolite, whereas Neuville and Daste (1972),
Rossignol (1999) and Lebeau, (1999) indicated an increased production under nitrogen
deprivation. Both strategies will be investigated here.
3 Materials and Methods
3.1 Culture media for production in PBR
The ES 1/3 medium (Robert 1983), modified with inorganic sources of phosphorus
and carbon was used for the following part of the study:
- Immobilized H. ostrearia cell culture
- Nutrient consumption in PBR culture
- Establishing the optimal growth parameters for biomass and EMn production
The final optimization was carried out using NX artificial seawater medium
(Nghiem-Xuan, 2019). Note that this medium was not used for all the experiments
because previous experiments were carried out before it was available.
3.2 Cells density and biomass concentration measurement
Cell density measurement was carried out by counting the cells using a Nageotte
counting chamber (Marienfeld, AQRA, India) and observed by light microscopy (AXIO
Scope A1, Zeizz, Germany). Dry weight measurement was carried out by filtering a 10 mL
sample on 0.7 µm Whatman GF/F. The same volume of ammonium format (NH4HCO2 at
190
28 g L-1) was added in order to remove the salt weight. The filters were then desiccated
over 24 h at 110°C.
3.3 Determination of pigment concentration
The measurement of pigments, chlorophylls a, c and total carotenoids, were
carried out with the acetone 90% extraction protocol. Chlorophylls a, c were measured
by the Ritchie (2008) protocol, and carotenoids by the Strickland and Parsons (1968)
protocol. The extracted pigment solution was measured (480, 630, 647 and 664 nm) by
spectrophotometer (V-630 UV-VIS, JASCO, Germany). The extracellular marennine (EMn)
was measured by a spectrophotometer (V-630 UV-VIS, JASCO, Germany) in the
supernatant after centrifugation of the sample. A wavelength of 669 nm was selected and
the EMn mass concentration measured using the Beer-Lambert equation (ɛ = 12 x 104 mol
L-1 cm-1 and MEMn = 9893 Da) according to Pouvreau et al. (2006).
3.4 Nutrients concentration measurement
Nitrogen and phosphorus were mainly measured by ionic chromatography
(DIONEX ICS 110 cationic column and ICS 900 anionic column, Thermo-scientific, France).
Silicon nutrient was measured by silicon-molybdate colorimetric methods (Grasshoff et
al., 2007 Revised). A high concentration of extracellular marennine interferes with this
colorimetric reaction and produces an overestimation. Dissolved Inorganic Carbon (DIC)
was measured by catalytic oxidation methods by combustion at 680°C, using a Total
Organic Carbon analyzer (TOC-L CSH/CSN, Shimadzu, UK).
3.5 Determination of the Mean Rate of Photons Absorption (MRPA)
The Mean Rate of Photon Absorption, also denoted “A”, refers to the light absorbed
by cells per unit of time and microalgal biomass. It is expressed in µmolh𝑣 kgx-1 s-1 (Cornet
et al., 1998; Pruvost et al., 2008; Kandilian et al., 2014). The MRPA is related to the
radiative properties of the biomass (Pilon et al., 2011; Kandilian et al., 2016). In our case,
MRPA was measured by photonic balance directly in the experiment culture, as
represented by Equation 13 (Pruvost et al., 2008):
Equation 13
𝐴 =𝑆
𝑉 𝐶𝑋
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿) =𝑎𝑆
𝐶𝑋
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿)
191
where q0 and qL refer respectively to the input and output PFD of the culture in µmolh m-
2 s-1. CX refers to dry biomass concentration in g m-3, and aS refers to the specific surface
of the PBR, which is the ratio between the illuminated surface and the volume of the PBR
in m-1.
3.6 Statistics analysis
The statistics were compiled using XLSTAT 2019 software (Addinsoft). Normality of
the distribution law for the different samples was identified by the Shapiro-Wilk test to
select the tests (T-test). Statistics were measured in triplicate for the experiments in
Figures 24 to 29 and 38 to 41. Statistics were measured in quintuplicate for the
experiments in Figures 30 to 37.
3.7 Haslea ostrearia culture
3.7.1 Inoculum
The diatom Haslea ostrearia NCC 501 was obtained from MMS laboratory and
cultivated in natural seawater from the Croisic (Loire-Atlantique, France), enriched with
Guillard F/2 medium. Cultures of H. ostrearia were maintained in 250 mL Erlenmeyer
flasks containing 100 mL medium with 10% dilution, after 4 - 5 days culture in Provasoli
ES1/3 (inorganic) modified medium (Robert, 1983) and remodified in total inorganic
sources. Light was supplied by white fluorescent light for the day/night cycle 14/10 at
300 µmol m-2 s-1 inside the culture chamber (SANYO MLR-350 culture chamber,
Richmond Scientific, UK) at 16°C. Fresh natural seawater was provided by Le Croisic
Ocearium (Loire Atlantique, France) and filtered at 0.7 µm then 0.45 µm before being used
for the medium.
3.7.2 Immobilized cell PBR
A PBR of 500 mL was designed to culture H. ostrearia in immobilized cell
conditions. It was designed to limit the shear stress impact of stirring by applying a low
liquid recirculation of the medium through the culture (Fig. 20). Recirculation of the
medium was carried out using a peristaltic pump and controlled to obtain a low horizontal
flowrate of 7 mL min-1. This value was set semi-empirically to avoid influencing the
formation of a biofilm of H. ostrearia (data not shown).
192
Fig. 20: Representation of the immobilized cell photobioreactor 500mL, aS=33 m-1
Gas was injected through the external wall of the PBR near to the pH probe to
better control pH regulation. pH was regulated by CO2 injection with an automatized
valve. The PFD was provided by setting a horizontal LED panel above the PBR. This
prevents any increase in temperature in the culture. The PBR was of Polymethyl
methacrylate (PMMA) material, with a depth of 0.03m (aS = 33 m-1).
This culture system was found to be well-adapted for investigating benthic cell
culture, which was obtained by allowing the cells to produce a cell “tissue” naturally at the
bottom of the PBR or by creating cell inclusions in agar gel. Agar gel and cell inclusion of
H. ostrearia was carried out using the Lebeau et al. (1999) protocol.
3.7.3 Airlift PBR 1L and 6L
1 L airlift PBR technology was used to cultivate H. ostrearia in conventional mixed
conditions. This type was proved to lead to sufficiently low shear stress for H. ostrearia
culture, as demonstrated in a previous work (Fig. 21) (data not shown). Gas was injected
at the center bottom of the PBR, which proved efficient for both mixing and gas-liquid
mass transfer (Kazbar, 2018; Ndiaye et al. 2018).
193
Fig. 21: Representation of 1 L airlift photobioreactor, aS = 33 m-1 (Souliès, 2014)
This technology is more adapted to planktonic (i.e. suspended) cells. It was found
that a single localized gas injection was insufficient to prevent cell sedimentation
completely, which occurs in the “dead zone” around the gas injection. Regarding shear
stress, high values were mainly located along the gas path. A value of around 150 s-1 in
this PBR was estimated, with a maximum of 275 s-1 through the injection axis (Ndiaye et
al., 2018; Chisti and Moo-Young, 1989). However, the bubble disruption and coalescence
that are present oat the top and bottom of the PBR respectively are also known to promote
the emergence of micro-vortices capable of producing up to 14,000 s-1 of mean shear rate
(Contreras et al., 1998; Barbosa et al., 2004; Michels et al., 2010).
In addition to the 1 L airlift PBR, a 6 L airlift PBR was used to study the effect of
light on H. ostrearia culture. This PBR was made of PMMA, which enables determination
of the MRPA by measuring PFD q0 and qL on both sides of the PBR (Equation 13). Note
that whereas the 1 L airlift PBR had only one gas injection, the 6 L airlift PBR is based on
multiple injections by injecting gas through a rubber mat placed on the bottom of the PBR
(Fig. 22).
194
Fig. 22: Representation of 6 L airlift photobioreactor, aS=25 m-1 (Souliès, 2014)
This perforated rubber mat allowed a continuous injection of gas along the bottom
of the PBR in the form of microbubbles, and consequently homogeneous aeration and
stirring of the PBR. The drawback is that the higher values of shear rate obtained in bubble
wakes are obtained across almost the entire culture volume, with a higher frequency of
bubble disruption/coalescence of microbubbles than in the 1 L PBR (Barbosa et al.,
2004; Sobczuk et al., 2006). Whereas the 1 L airlift PBR does not allow perfect biomass
homogeneity, the 6 L airlift PBR provides better cell suspension, which is a mandatory
condition for accurate measurement of MRPA in pelagic condition. Note that due to the
absence of a dead zone in this PBR, the gas flow rate was reduced every night to avoid the
stirring impacting the cell culture during cell division, as shown in a previous work (data
not shown).
3.7.4 Airlift Crystal PBR
The Crystal PBR is designed for the culture of microalgae species presenting a high
sedimentation rate (Moutel, 2016). Inspired by a settling tank, the shape of this PBR
allows cells to settle down to the gas injection, leading to cell re-suspension (Fig. 23). This
PBR has a culture volume of 250 mL, is 20 mm thick and has an illuminated surface of
14426.99 mm2. It was used for the first culture test of H. ostrearia in mixed conditions.
195
All the airlift PBRs (1 L, 6 L, Crystal) were controlled at a temperature at 22°C. This
was achieved by regulating the room temperature and with fans at the back of the Crystal
PBR only. Light was supplied by LED panels on the day/night cycle 14 h/10 h.
Fig. 23: Representation of Crystal photobioreactor 250 mL, aS = 57 m-1 (Moutel, 2016)
4 Results
4.1 Immobilized-cell culture
H. ostrearia was cultivated in passive cell immobilization to protect the cell from
the effects of shear stress. The immobilized-cell PBR culture was carried out in continuous
mode at dilution rate D = 0.1 d-1, 22°C throughout the culture, with pH regulation fixed at
7.8, a PFD of 200 µmol m-2 s-1 in the day/night cycle 14/10 and cultivated in ES1/3
(inorganic) modified medium. As a passive cell immobilization culture, the biomass was
not mixed, which did not require daily measuring of biomass concentration, and only two
points of cell density were carried out. EMn and dissolved inorganic concentrations in the
culture medium were measured. The results were compared with the agar cell inclusion
culture, which was conducted in the same PBR under the same conditions (Fig. 24). An H.
ostrearia cell in agar gel was included to achieve similar cell density to the passive-cell
196
immobilized culture inoculation. Note that cell immobilization in alginate beads was also
carried out but no positive results were obtained (data not shown).
Fig. 24: Passive and active continuous culture of Haslea ostrearia in immobilized cell PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 and n = 2 for mean DIC.
Time evolutions of cell density, EMn and dissolved organic concentrations are
given in Fig.24. For biomass concentration, only values at to (4.13 x 107 cell L-1 for passive;
4.18 x 107 cell L-1 for active culture) and tend (cell death) were carried out.
Regarding immobilization, cell death was observed at day 9 whatever the passive
or active culture. Immobilized cell culture being demonstrated elsewhere, this could be
attributed to our growing conditions (see below). Our experiments, however, were found
to be sufficient for estimating marennine production. Both culture techniques revealed
maximum production at day 4, with 3.7 ± 0.2 mgEMn L-1 and 4.5 ± 0.2 mgEMn L-1 for active
immobilized and passive immobilized cultures respectively. In either case, EMn
production over time was found to be unstable and led to a progressive decrease in EMn
concentration, doubtless due to cell death.
Regarding culture loss, multiple attempts were carried out and similar results
obtained. This could not be attributed to shear stress, and the culture medium was
validated elsewhere (see below). One explanation could be the DIC concentration, as
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0,0E+00
5,0E+06
1,0E+07
1,5E+07
2,0E+07
2,5E+07
3,0E+07
3,5E+07
4,0E+07
4,5E+07
5,0E+07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Mea
n D
IC (
mM
)
Ce
ll d
ensi
ty (
cell
L-1)
Time (days)
Cell active Cell passive EMn active EMn passive Mean DIC
197
shown in Fig. 24. Values given here are an average of the concentrations obtained in
passive and active cell immobilization tests, as similar values were achieved. A
progressive decrease was obtained, which could lead to the appearance of carbon
limitation. It is known that immobilization reduces mass transfer in the cell’s biofilm.
Since a decrease in DIC contributes to the decrease of this mass transfer, it could lead to
limitation of the cells’ access to the carbon source in the film, leading to cell death. Because
the immobilization approach was only applied to obtain some preliminary values in EMn
production for future comparisons to other culture techniques, this was not investigated
further. The effect of carbon supply was investigated in suspended cell conditions (see
section below).
4.2 Haslea ostrearia culture in Crystal PBR
4.2.1 Investigation of CO2 tolerance of Haslea ostrearia in batch culture
CO2 intolerance in H. ostrearia was hypothetized by Robert (1983). In a natural
environment, H. ostrearia usually grows on the bottom of a biofilm, and consequently has
natural protection against the gas phase. Two air enrichments of CO2 (2 and 15%) were
tested in suspended cell culture. A Crystal PBR was used because of its efficiency with cells
presenting a high sedimentation rate. Batch cultures with the same conditions as for
immobilized cell culture were conducted (22°C, pH regulation fixed at 7.8) with an
incident PFD of 115 µmolh m-2 s-1 in day/night cycle 14/10. The incident PFD was
modified to take into account the larger specific illuminated surface of the Crystal PBR (i.e.
lower depth of culture). Results are given in Figure 25.
198
Fig. 25: Batch culture of Haslea ostrearia for 2% and 15% air/CO2 proportion for cell density (A) and extracellular marennine concentration (EMn) (B), in Crystal PBR. Data are mean ± IC 95% for n=3
A marked effect of the CO2 supply was observed. Cell densities reached 2.5 x 108
cell L-1 at day 8 and 1.4 x 108 cell L-1 at day 6 for 15% CO2 and 2% CO2 respectively (T-test
p < 0.001). The main impact was on EMn production, which reached 7.3 mg L-1 against 1.0
mg L-1 with 15% CO2 and 2% CO2 at day 10 respectively (T.-test p < 0.001). We noted a
decrease in EMn concentration for the 2% CO2. This could be attributable to EMn
degradation or consumption by bacteria. Finally, H. ostrearia was found to tolerate CO2-
enriched gas injection when combined with pH regulation. Increasing the proportion of
CO2 (and consequently the carbon transferred to the gas phase, as shown in next section)
revealed an increase in both cell density and EMn concentration. The relevance of carbon
limitation on H. ostrearia culture was therefore confirmed.
199
4.2.2 Assessment of Halsea ostrearia growth in continuous mixed culture
To assess the possibility of cultivating H. ostrearia in stirred conditions, a
continuous culture was conducted under mixed conditions in a Crystal PBR. The CO2
supply in the gas phase was set at 15% and the same conditions as in previous batch
culture were applied. The dilution rate was set at D = 0.1 d-1. Results are given in Figure
26.
Fig. 26: Continuous culture of Haslea ostrearia at 15% CO2 in a Crystal PBR. Cell density, extracellular marennine (EMn) and dissolved inorganic carbon (DIC) were measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3
A maximum cell density of 1.5 ± 0.1 x 108 cell L-1 was reached at day 5 before
decreasing to 1.1 ± 0.1 x 108 cell L-1 at day 9. Regarding EMn production, the stirred
continuous culture led to a productivity of 6.9 ± 0.1 mgEMn L-1 at day 9 and 8.2 ± 0.2 mgEMn
L-1 at day 22. These values can be compared to immobilized-cell continuous culture which
reached a maximum of 4.5 ± 0.2 mgEMn L-1. The interest of cultivating H. ostrearia in mixed
conditions was here confirmed.
We can note also that both cell density and EMn concentration, as well as inorganic
carbon concentration, stabilized at day 8 for 4 days, before a decrease in cell density and
inorganic carbon. EMn concentration then started to increase (day 15), demonstrating
EMn synthesis or intracellular marennine (IMn) release in the medium. Despite the 15%
CO2 injection, dissolved inorganic carbon was also found to decrease continuously, as
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,0E+00
2,0E+07
4,0E+07
6,0E+07
8,0E+07
1,0E+08
1,2E+08
1,4E+08
1,6E+08
1,8E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
DIC
(m
M)
Ce
ll d
ensi
ty (
cell
L-1)
Time (Days)
Cell density EMn DIC
200
observed previously in the immobilized cell PBR culture. This indicated the need for a
further increase in carbon supply to avoid possible growth limitation.
4.3 Investigation of nutrient consumption in PBR culture
4.3.1 Carbon consumption
The DIC concentration was raised by adding sodium bicarbonate at the beginning
of the culture. Le Gouic (2013) estimated that Chlorella vulgaris needs up to 10 mM of DIC
to avoid carbon limitation, which could be given either by a phase of gas injection enriched
with CO2, or by dissolution of a chemical carbon source in the medium. 10 mM
corresponds to a sodium bicarbonate concentration of 1.2 g L-1. This concentration was
found to lead to nutrient precipitation in the seawater-based medium due to the
interaction of silicon, phosphate and carbonate with Ca2+ and Mg2+ endogenous entities in
seawater (Morey et al., 1995; Nguyen, 2013).
H. ostrearia was therefore cultivated in semi-continuous mode in the 1 L airlift
PBR, with a fed-batch strategy conducted on a sodium bicarbonate source. For this
purpose, a solution of sodium bicarbonate (5 mM maximum) was injected punctually
every day. Because of the parallel CO2 injection, this enabled us to raise the final DIC to
around 10 mM while avoiding the precipitation phenomenon. This was added to the
ES1/3 medium (6N24P inorganic medium), which was optimized for H. ostrearia growth
in PBR, as presented previously (Nghiem-Xuan, 2019). The semi-continuous mode was
selected to cultivate H. ostrearia because of its benthic characteristic, which leads to an
inhomogeneous culture. Harvesting was then applied for a limited period of time per day.
Other parameters were similar: temperature was fixed at 22°C throughout the culture, pH
regulation was fixed at 7.8 and PFD at 200 µmol m-2 s-1 (measured to obtain the same
MRPA value according to the different aS of the PBRs, see Eq.1) in day/night cycle 14/10
and dilution rate at D = 0.1 d-1 (Fig. 27).
201
Fig. 27: Semi-continuous culture of Haslea ostrearia in 1 L airlift PBR with carbon fed-batch and 2% CO2. Dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and dissolved inorganic carbon (DIC) were
measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Unlike with previous experiments, a constant production of biomass and EMn was
obtained throughout the semi-continuous culture. Dry biomass concentration reached
320 mgX L-1, corresponding to 2.6 x 108 cell L-1 and an EMn concentration of up to 8.2
mgEMn L-1. DIC concentration was found to stabilize progressively at the targeted 10 mM
concentration. The carbon-fed batch strategy was therefore found to be suitable to obtain
202
a stable and constant productivity of 31.7 ± 0.3 mgX L-1 d-1 of biomass and 0.8 ± 0.1 mgEMn
L-1 d-1
4.3.2 Silicon, nitrogen and phosphorus consumption
Silicon and phosphorus consumption were investigated during the semi-
continuous culture presented in Figure 27. The main macronutrients over time evolutions
are given in Figure 28.
All nutrients were found to decrease, as expected. Nitrate decreased to 57% of its
initial concentration (1.73 mM) but without deprivation, with a final concentration of
around 1 mM. Phosphate and silicon dioxide concentrations showed a marked decrease
and could therefore be suspected of limiting cell growth (around 0.7% of the initial
concentration after 4 days). A slight increase of PO42- and SiO32- concentration by day 7
was also noted. This could be attributable to cell release or possible dissolution of small
quantities of agglomerated compounds. In the case of the SiO2 colorimetric measure
method, the high production of EMn by day 7 (Fig. 27) is suspected of interacting with the
method and possibly overestimation of SiO2 concentration.
Fig. 28: Evolution of NO3-, PO42- and SiO32-concentration for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Time evolutions of main nutrients enable to determine substrate consumption
rates (rS), specific substrate consumption rates (QS) and the yield factor (YX) for NO3-, PO42-
and SiO32- (Table 13).
0
50
100
150
200
250
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PO
42
-an
d S
iO3
2-co
nce
ntr
atio
n (
µM
)
NO
3-C
on
cen
trat
ion
(µ
M)
Time (Days)
N P Si
203
Table 13: Nutrient consumption of Haslea ostrearia (rS, QS and YX determination for NO3-, PO42- and SiO32-) in semi-continuous culture in an airlift PBR
NO3 PO4 SiO2
rS (µmol L-1 d-1) 3.0 x 10-1 1.0 x 10-1 9.2 x 10-2
QS (µmol gX-1 d-
1) 1.3 4.3 x 10-1 3.9 x 10-1
YX (µmol gX-1) 9.4 x 10-3 3.2 x 10-3 2.9 x 10-3
PO42- and SiO32- consumption rates were found to be respectively 1.0 x 10-1 and 9.2
x 10-2 µmol L-1 d-1; 3 times less than the NO3- consumption rate (nitrogen is the main
nutrient source of photosynthetic organisms). The specific substrate consumption rate
enables us to determine the need for these nutrients. The values obtained here emphasize
the need to increase SiO32- and PO42- concentration in the ES 1/3 medium to avoid any
limitation. However, SiO32- and PO42- are highly precipitating molecules with Ca2+ and
Mg2+ ions, such as sodium bicarbonate (Morey, Fournier & Rowe, 1995; Nguyen, 2013). It
was therefore decided to extend the fed-batch strategy on HCO3- to PO42-, SiO32-. The
nutrient feeding rate was based on the specific substrate consumption rate (Table 13) to
ensure no limitation of the nutrient and that no precipitation phenomenon would occur.
According to Figure 8, for a productivity of PV = 28.33 mgX L-1 d-1, H. ostrearia would need,
for example, a fed-batch of 1.1 x 10-2 µmol L-1 d-1 of SiO32- nutrient and 1.2 x 10-2 µmol L-1
d-1 for PO42-. This fed-batch strategy was implemented in a semi-continuous culture on ES
1/3 medium (6N24P inorganic). No further increase in either biomass or EMn
productivity was observed (data not shown). Thus, a further increase in N and P
concentrations was applied, and H. ostrearia was cultivated on 12N48P (Fig. 29). The
temperature was fixed at 22°C throughout the culture, pH regulation was fixed at 7.8, the
PFD at 330 µmol m-2 s-1 in day/night cycle 14/10 and the dilution rate at D = 0.1 d-1.
Results are given in Fig. 29.
204
Fig. 29: Semi-continuous Haslea ostrearia cell culture in 1 L airlift PBR with C, P, Si fed-batch conditions. Dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn) were measured. Data is mean ± 95% CI for n =
3
The fed-batch strategy applied to P-C-Si elements was found to prevent any
precipitation phenomenon in semi-continuous mode culture. This allowed the provision
of macronutrients such as N, P, Si and C in higher concentrations, leading to a 12N48P
medium.
A constant biomass and EMn production were obtained, stable over a period of
more than 20 days. However, whereas biomass productivity reached 51.8 ± 2.3 mgX L-1 d-
1, EMn productivity only reached 0.2 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1. Medium enrichment in Si and P
could therefore have a negative impact on EMn synthesis, reducing EMn productivity from
0.8 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1 (Fig. 27 B) to 0.2 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1. On the other hand, it significantly
increased biomass concentration, up to 522 mgX L-1 (equal to 4.22 x 108 cell L-1). This value
can be considered high compared to H. ostrearia standards. Additionally, stable
production such as this can be considered an important methodologic achievement. This
opens up the possibility of further optimization of H. ostrearia culture in suspended cells.
The section below presents the investigation of light tolerance in a 6 L airlift PBR.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 5 10 15 20 25 30
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
DW
(g
L-1)
Time (Days)
DW EMn
205
4.4 The ingathering of optimal growth parameters for biomass and EMn
productions
4.4.1 Light tolerance and cell response
This study was carried out in the 6 L airlift PBR, in order to measure input and
output PFD for MRPA measurement (Eq. 13). The temperature of the culture was fixed at
22°C, pH regulation at 7.8 and dilution rate at D = 0.1 d-1. The test was carried out with 6
different PFDs ranging from 140 to 400 µmol m-2 s-1 (140, 165, 210, 300, 350, 400 µmol
m-2 s-1), with a day/night cycle 14 h/10 h. Each culture was monitored for 3 times the
residence time to obtain a constant productivity (Fig. 30).
Fig. 30: Light tolerance curve of Haslea ostrearia, describing the evolution of surface productivity (PS) depending on MRPA values for biomass and extracellular marennine (EMn) results. Data is mean ± 95% CI for
n = 5
The results given in Figure 30 reveal that both EMn and biomass were found to be
closely related to MRPA values. This indicates a light tolerance of the cell response in both
growth (as it should be) and also EMn production. An optimal MRPA value was achieved
for both, indicating a light tolerance of biological responses. Concerning biomass
productivity, the highest values were achieved in the range 10.7-12.3 µmolhv gx-1 s-1,
leading respectively to 1.6 ± 0.1 and 1.7 ± 0.1 gx m-2 d-1. However, the highest EMn
productivity was 11.0 ± 0.5 mgEMn m-2 d-1 which was obtained at 8.4 µmolhv gx-1 s-1, with a
different optimal value, therefore, than for biomass growth. With both biomass and EMn,
MRPAs higher and lower than 12.3 µmolhv gx-1 s-1 resulted in lower productivity. We can
also note that the range of optimal MRPA values, as well as the profile of the curves
0
2
4
6
8
10
12
14
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
PS
Bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
MRPA (µmol g-1 s-1)
Biomass EMn
206
achieved, are close to the photosynthetic growth response of Chlorella vulgaris and
Nannochloropsis gaditana (Artu, 2016).
The results can be combined to determine light conversion efficiency, which
represents the amount of biomass produced per µmolh absorbed (gx molh-1):
Equation 14
ηX/hν
=𝑆𝑋
(𝑞0 − 𝑞𝐿)
where SX represent the surface productivity in g m-2 d-1.
Fig. 31: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light conversion efficiency (η) into biomass as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for n = 5
Figure 31 presents the results of light conversion efficiency and total pigment
content. Both evolutions as a function of the MRPA are found to be similar here. Light
conversion efficiency was found to decrease for values lower than 6 and higher than 14
µmolh gx-1 s-1, with maximal values around 0.10 ± 0.01 gx molh-1 in the range 8 and 12
µmolh gx-1 s-1.
The highest pigmentation result (2.9 ± 0.1% w/w) was found at 12.3 µmolh gx-1 s-
1, a value similar to the optimal MRPA condition for biomass productivity. We can note,
however, that the reverse was observed for Chlorella vulgaris, where a progressive
decrease in pigment content was obtained with increasing MRPA value, as a result of the
well-known pigment acclimation process (i.e. decrease of pigment content with increased
light absorption). This could be attributed to the effect of marennine. The EMn content,
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
η(g
mo
l-1)
Pig
me
nt
(% w
/w)
MRPA (µmolhv gx-1 s-1)
Total pigment EMn η biomass
207
which is also presented Figure 31, decreases continuously with the rise in MRPA.
However, the EMn content curves appear to cross the total pigment curve at 8 µmolh gx-1
s-1, representing a maximal light conversion efficiency of biomass for H. ostrearia.
To better understand EMn excretion as a function of light, the light conversion
efficiency of EMn was investigated. Results are given in Fig. 32.
Fig. 32: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light conversion efficiency (η) into EMn as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for n = 5
As well as total photosynthetic pigment content correlated to light conversion into
biomass efficiency, Figure 32 also shows a similar evolution for the EMn produced (%
w/w) and light conversion into EMn efficiency. The rise in MRPA leads to a decrease in
EMn (%) from 1.89 ± 0.08 % to 0.17 ± 0.05%. The decrease in light conversion into EMn
efficiency occurs at 8 µmolh gx-1 s-1, which also leads to an increase in light conversion
into biomass efficiency (Fig. 31). Figures 31 and 32 show that 8 µmolh gx-1 s-1 triggers
lower EMn production in favor of biomass.
4.4.2 pH
The goal of this experiment was to observe and measure the impact of pH
conditions on H. ostrearia culture in order to select the optimal pH (pHOPT) conditions for
EMn production. The culture was carried out in a 1 L airlift PBR in semi-continuous mode
using a P, Si, C fed-batch strategy. The temperature of the culture was fixed at 22°C
throughout, pH regulation was fixed at 6; 7.8; 8.3; 9 and the dilution rate at D = 0.1 d-1.
The PFD was fixed at 300 µmol m-2 s-1 (to obtain AOPT around 12 µmolh gx-1 s-1) in the
0,00E+00
2,00E-04
4,00E-04
6,00E-04
8,00E-04
1,00E-03
1,20E-03
1,40E-03
1,60E-03
1,80E-03
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
η(g
mo
l-1)
Pig
me
nt
(% w
/w)
MRPA (µmolhv gx-1 s-1)
EMn Total pigment
208
day/night cycle 14/10. All cultures were monitored for 3 times the residence time to
achieve constant biomass productivity. Results are given in Fig.33 (the presence of the *
symbol indicates the presence of visual precipitation throughout the culture).
Fig. 33: pH effect on Haslea ostrearia total photosynthetic pigment concentration, biomass and extracellular marennine (EMn] productivitys (PS) in semi-continuous culture in 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n
= 5
Figure 33 shows optimum surface biomass productivity (1.63 ± 0.06 gx m-2 d-1) and
total pigment concentration (2.42 ± 0.08 %) at pH 8.3. However, for the same pH EMn
productivity was low, reaching only 5.27 ± 0.24 mgEMn m-2 d-1. pH 6 also showed low EMn
productivity, biomass and pigment concentration respectively at 6.71 ± 0.37 mgEMn m-2 d-
1, 0.63 ± 0.06 gx m-2 d-1 and 0.48 ± 0.05 %. However, pH 7.8 led to interesting EMn results
with 14.10 ± 0.65 mgEMn m-2 d-1; the best results for this study.
Pigment content was found to follow the same evolution as for biomass
productivity, which tends to attest to the direct relation of pH to H. ostrearia
photosynthetic growth. However, the results should be considered in hindsight because
of the consequences of pH variation. pH value is known to greatly impact the medium
chemistry of H. ostrearia, which could induce a limiting of nutrient conditions or
chemistry interaction with EMn. This hypothesis is supported by the increasing
precipitation with increasing pH value. pH 9 was found to lead to a high level of
precipitation, which raises the chemistry instability of the medium (Nghiem-Xuan, 2019).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
6 7.8 8.3* 9*
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
Tota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
pH
Total pigment PS Biomass PS EMn
209
Despite this precipitation, pigment concentration was found to be higher at pH 8.3 with
2.42 ± 0.08% than for pH 7.8. Finally, this raises the possibility of a pHOPT close to 8.3 while
avoiding any high level of precipitation.
Although the best biomass and pigment productivity result was achieved at pH 8.3,
the best EMn productivity was achieved at pH 7.8, which also exhibits no visual
precipitation. Because the culture of H. ostrearia was found to be more convenient at pH
7.8 due to the precipitation phenomenon being amplified in higher pH conditions, the pH
value of 7.8 was selected as pHOPT for the rest of the studies.
4.4.3 Temperature
The goal of this experiment was to observe and measure the impact of temperature
conditions on H. ostrearia culture in order to select the optimal temperature (TOPT)
condition for EMn production. The culture was carried out in a 1 L airlift PBR in semi-
continuous mode with P, Si, C fed-batch. During the culture, the temperature was
regulated at 16; 22; 25; 30°C throughout, pH regulation was fixed at 7.8 and the dilution
rate at D = 0.1 d-1. The PFD was fixed at 300 µmol m-2 s-1 (to obtain AOPT=12 µmolhv gx-1 s-
1) in the day/night cycle 14/10. All cultures were monitored for 3 times the residence time
to obtain a constant productivity. The results are given in Figure 34. The presence of the
* symbol indicates the presence of visual precipitation throughout the culture.
210
Fig. 34: Temperature effect on Haslea ostrearia ostrearia total photosynthetic pigment concentration, biomass and extracellular marennine (EMn] productivity (PS) in semi-continuous culture in 1 L airlift PBR.
Data is mean ± 95% CI for n = 5.
Temperature was found to impact the H. ostrearia culture, but mainly by triggering
the precipitation phenomenon which could negatively impact cell culture, as presented
above for the pH study. Precipitation was found to occur at temperatures higher than
22°C. Considering only a non-precipitate culture initially, the highest biomass results
were achieved at 22°C with 1.63 ± 0.06 gx m-2 d-1. There was therefore no significant
impact (T-test p = 0.748 for n = 5) of temperature on EMn productivity between 16 and
22°C. In terms of pigment concentration, there was no significant impact (T-test p = 0.563
for n = 5) at 16°C with 1.80 ± 0.29% compared to 22°C culture with 2.08 ± 0.15%, but a
higher pigment concentration is reached at 25°C with 2.62 ± 0.20%.
As with the pH study, the precipitation phenomenon definitely impacts biomass
and EMn. It can be noted, however, that pigment concentration is higher at 25°C even
though precipitation occurs. These results raise the possibility of a TOPT = 25°C, however,
precipitation also impacts biomass productivity greatly, decreasing it from 1.63 ± 0.06 gx
m-2 d-1 to 0.73 ± 0.19 gx m-2 d-1 in the 25°C and 30°C experiment. EMn productivity also
decreased with the increase in temperature. There could be various explanations for this:
the molecule could be degraded at a higher temperature, less could be produced by the
cell or it could interact with the precipitation phenomenon. Finally, because of the
precipitation phenomenon, 22°C was considered as TOPT for the rest of the study.
0
1
2
3
4
5
6
7
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
16 22 25* 30*
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
Tota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
Temperature (°C)
Total pigment PS biomasse PS Emn
211
4.4.4 Physiologic stress for EMn overproduction
Based on previous results, the optimal values for MRPA, temperature and pH were
gathered (AOPT, TOPT and pHOPT) for H. ostrearia culture. Different conditions were then
tested to induce stressing conditions for EMn overproduction. Figure 29 shows
continuous production of EMn in a semi-continuous culture without nutrient limitation.
This was retained as a reference. Even in unrestricted conditions, the productivity of EMn
was found to be low at 0.2 mgEMn L-1 d-1, corresponding to 6.06 mgEMn m-2 d-1.
The following experiment consists of measuring EMn, biomass, cell and pigment
productivity in order to understand if nutrient depletion or limitation leads to
overproduction of EMn. This study was carried out in a 1 L airlift PBR and under the same
culture conditions as previously, but with TOPT = 22°C, pHOPT = 7.8 and AOPT = 12.3 µmolhv
gx-1 s-1. Depletion conditions were carried out to cultivate H. ostrearia without nitrogen,
phosphorus, silica or carbon nutrients. Nutrient concentration for limitation conditions
was fixed with regard to the 20-times diluted culture of Rossignol (1999). These
concentrations represent 2.39 x 10-4 M for nitrogen, 3.05 x 10-5 M for phosphorus and 5.49
x 10-5 M for silica. All cultures were monitored for 3 times the residence time to confirm
constant productivity (Fig. 35; 36; 37).
Fig. 35: Total photosynthetic pigment concentration of Haslea ostrearia under various nutrient limitations and depletions. Data is mean ± 95% CI for n = 5
The impact of nutrient limitation and depletion on pigment concentration can be
observed in Figure 35. None of the depleted or limited culture offers any increase in
pigment concentration, with values below 2.5 ± 0.2%. H. ostrearia pigment synthesis is
highly reduced by nitrogen depletion and limitation, at 0.7 ± 0.3% and 1.2 ± 0.4%
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
P Si N C P Si N
Depletion Nodepletion
LimitationTota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
212
respectively. Both results can be explained by the high nitrogen requirement for protein
synthesis. The reduction of pigment content shows the cell’s capacity to adapt to balance
its composition in order to survive, and certainly impacts the cell’s photosynthetic
efficiency.
Fig. 36: Biomass and EMn productivity of Haslea ostrearia culture under various nutrient limitations and depletions. Data is mean ± IC 95% for n = 5.
The results are therefore analyzed in terms of EMn and biomass productivity
(Figure 36). Depletion and limitation were found to reduce biomass productivity by
almost 2.7 times compared to the unrestricted culture. In terms of EMn productivity,
depletion conditions only led to lower productivity than the unrestricted culture, at 5.3 ±
0.2 mgEMn m-2 d-1. However, P, Si and N limitation conditions led to higher productivity,
9.2 ± 1.7 mgEMn m-2 d-1, 37.9 ± 0.7 mgEMn m-2 d-1 and 54.5 ± 1.8 mgEMn m-2 d-1 respectively.
Silicon limitation therefore stimulates EMn release, while nitrogen limitation shows the
best results for EMn productivity, with 54.5 ± 1.8 mgEMn m-2 d-1. Note that there is no
significant difference (T-test p = 0.376 for n = 5) between phosphorus and silicon
limitation biomass productivity, which is not observed with 0.57 ± 0.05 and 0.62 ± 0.08
mgEMn m-2 d-1 respectively. EMn productivity is significantly higher (T-test p=0.002 for
n=5) for silicon limitation, with 37.9 ± 0.7 mgEMn m-2 d-1 than for phosphorus limitation,
reaching only 9.2 ± 1.7 mgEMn m-2 d-1. The opposite situation can be observed with EMn
productivity under replete culture, reaching 5.3 ± 0.2 mgEMn m-2 d-1, and the carbon-
depleted culture, reaching 5.8 ± 0.6 mgEMn m-2 d-1, whereas biomass productivity for
replete culture is 3.5 times higher. Finally, all these results show that nutrient limitation
0
10
20
30
40
50
60
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
P Si N C P Si N
Depletion Nodepletion
Limitation
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
Biomass EMn
213
(especially in Si and N) leads to a more marked release of EMn, resulting in greater EMn
productivity.
Since nutrient depletion is known to greatly affect cell physiology and morphoply,
Figure 18 presents both cell and biomass productivity for various nutrient depletion and
limitation conditions. Similar trends for both quantities were observed under both
nitrogen depletion and limitation, with respectively 4.3 ± 0.2 x 105 and 5.5 ± 0.2 x 105cell
m-2 d-1, which were found to be related to biomass productivity. However, in phosphorus
depletion and limitation conditions, cell productivity reached respectively 18.4 ± 0.5 x 105
and 9.4 ± 0.1 x 105cell m-2 d-1, whereas biomass productivity was found to be constant (T-
test p = 0.274 for n = 5) with 0.6 ± 0.1 gx m-2 d-1 for P depletion and 0.6 ± 0.1 gx m-2 d-1 for
P limitation.
Fig. 37: Biomass and cell productivities (PS) of Haslea ostrearia culture under various nutrient limitations and depletions. Data is mean ± 95% CI for n = 5.
As was observed between EMn and biomass productivity, nutrient depletion and
limitation led to a low correlation (r = 0.4178) between cell and biomass productivity.
This decorrelation is mainly observed in nutrient depletion for phosphorus and silicon.
The observation of different cell productivities with low biomass productivities attests to
a metabolism reorientation of H. ostrearia in depletion culture conditions. High cell
density in phosphorus-depleted conditions but with 3.5 times lower mass than no-
depleted culture shows that cell variation composition may be linked to metabolism
adaptation (Rodolfi et al., 2009; Goiris et al., 2015; Bajwa et al., 2018).
02468101214161820
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
P Si N C P Si N
Depletion Nodepletion
LimitationP
SC
ell
(10
5ce
ll m
-2d
-1)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
Biomass Cells
214
As a conclusion to these studies, no clear correlation can be assessed between
biomass and cell EMn productivity. However, it can be concluded that unrestricted culture
favors biomass production, with 1.6 ± 0.1 gx m-2 d-1, and nitrogen limitation favors EMn
release, with 54.5 ± 1.8 mgEMn m-2 d-1.
4.5 Towards an optimized production protocol
4.5.1 EMn concentration impact on process productivity
Previous studies have exhibited differing optimal conditions (pHOPT, TOPT, AOPT)
between growth and EMn production. This raises the hypothesis of EMn having a negative
impact on biomass productivity, and consequently on EMn productivity. Two tests were
therefore carried out to identify the impact of EMn on productivity.
H. ostrearia was cultivated in semi-continuous mode to remove 90% of culture
medium at each culture medium renewal, taking advantage of the benthic cell
characteristics. For this purpose, stirring was stopped a few hours before culture renewal
to allow the cells to sediment at the bottom of the PBR, and culture was renewed by
pumping culture medium from the top of the culture volume before replacing it with fresh
medium.
Two residence times were used: 10 days and 5 days, corresponding to around D =
0.09 d-1 and D = 0.18 d-1 respectively. The experiments were done with an optimized
formulation of NX medium to avoid Si, P and C fed-batch strategy. The cultures were
carried out in a 1 L airlift PBR. The temperature of the culture was fixed at 22°C, pH
regulation at 7.8 and incident PFD at 300 µmol m-2 s-1 (to obtain AOPT = 12 µmolh gx-1 s-1)
in the day/night cycle 14/10. For the first part of the study, H. ostrearia was cultivated
under nitrogen limitation (NX-5N100P6Si) conditions in order to enhance marennine
production, according to results achieved in the previous section. Results are given in Fig.
38 and 39.
215
Fig. 38: Evolution of cell density and extracellular marennine concentration (EMn) for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in NX medium in 1 L airlift PBR (D = 0.09 d-1, corresponding to 10 days of residence
time). Data is mean ± 95% CI for n = 3.
After 10 days, cell density reached 4 ± 0.1 x 108cell L-1, which also corresponds to
maximum EMn concentration (11 mgEMn L-1). Culture medium was then renewed at 90%.
As expected, this resulted in a marked decrease in EMn concentration due to the dilution
(around 2 mgEMn L-1). Similar observation can be made on day 20, when the second
medium renewal was applied. After 10 days of EMn accumulation in the culture medium,
the concentration was decreased by culture renewal. However, this also induced a
continuous decrease in cell density over time. Even though the cell should have been
immobilized at the bottom of the PBR during the sample step, some of the cells were
definitely sampled during medium renewal. Cell density decreased to finally reach 0.4 ±
0.1 x 108cell L-1 by day 31. In addition, EMn concentration was found to remain below 11.6
± 0.1 mgEMn L-1 and decrease greatly over time, reaching 5.7 ± 0.3 mgEMn L-1 at day 31.
The same observation was made for the 5 days’ residence time experiment (Fig.
39). EMn concentration increased between each culture renewal, reaching 4.3 ± 0.1 mgEMn
L-1 and 5 ± 0.1 mgEMn L-1 at day 10 and day 15 respectively, but then decreased over the
culture to reach 1.3 ± 0.3 mgEMn L-1 by day 31. In terms of cell density, each medium
renewal reduced it and the cells barely managed any growth. Cell density reached 3.3 ±
0.1 x 108cell L-1 by day 5 and finally decreased to 1.7 ± 0.1 x 107cell L-1.
0
2
4
6
8
10
12
14
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
2,0E+08
2,5E+08
3,0E+08
3,5E+08
4,0E+08
4,5E+08
5,0E+08
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Cel
l den
sity
(ce
ll L-1
)
Times (Days)
Cell density EMn
216
Fig. 39: Evolution of cell density and extracellular marennine concentration (EMn) in a semi-continuous (D=0.18 d-1 corresponding to 5 days of residence time) culture of Haslea ostrearia in NX medium in a 1 L airlift
PBR. Data is mean ± 95% CI for n=3
Comparing the two experiments, the 10 days’ residence time experiment and 5
days’ residence time experiment led to an average EMn productivity of 1.0 mgEMn L-1 d-1
and 0.7 mgEMn L-1 d-1 respectively. Both these productivities are lower than the results
obtained by Rossignol (1999). In addition, no stable production was obtained for any of
these tests. The dilution step led to progressive cell density decrease, although EMn
concentration was regularly decreased. There was no strong evidence of any relationship
between EMn concentration and biomass productivity. However, a progressive evolution
of H. ostrearia cell population was observed, which was found to be distributed in the
benthic and pelagic phases even after 24 hours without manual stirring (Table 14).
0
1
2
3
4
5
6
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
2,0E+08
2,5E+08
3,0E+08
3,5E+08
4,0E+08
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Cel
l den
sity
(ce
ll L-1
)
Time (Days)
Cell density EMn
217
Table 14: Repartition and observation under light microscope of the Haslea ostrearia cell population density after 24 h without manual stirring. Data is mean ± 95% CI for n = 3.
Pelagic phase Benthic phase
Cell population
density (%)
42.7 ± 0.4 57.3 ± 0.4
Visual
appearance
The results of Table 14 could explain the decrease in cell density at each medium
renewal, as mainly pelagic cells were harvested. The visual appearance of the cells also
raises the hypothesis of a higher IMn production by the benthic cell population than the
pelagic one. As described by Robert (1983) and Rossignol (1999), this cell behavior is
observed in the natural H. ostrearia environment, which confirms the possibility that
pelagic cell population could be constituted mainly of young cells, and the benthic cell
population constituted of older ones. This hypothesis could explain why removing pelagic
cells leads to a progressive decrease in cell density, as young cells were mostly harvested
at each medium renewal.
4.5.2 Implementation of EMn continuous production process
In a final assessment of our optimization procedure, the knowledge and data
gathered from our experiments was combined to carry out continuous EMn production in
a conventional process.
H. ostrearia was cultivated in NX-25N100P6Si medium (unrestricted growth
medium) until day 8, to optimize the biomass produced and increase marennine
production or/and release. NX-5N100P6Si medium (N limited growth medium) was then
injected at D = 0.25 d-1 in order to overproduce EMn under nitrogen stress culture
conditions. During the culture, TOPT was fixed at 22°C and pHOPT regulation at 7.8. The PFD
was fixed at 300 µmol m-2 s-1 (biomass AOPT=12 µmolhv gx-1 s-1) in the day/night cycle
218
14/10 throughout the culture. Note that the PFD fixed at 200 µmol m-2 s-1 (EMn AOPT=8
µmolhv gx-1 s-1) was initially thought to be overproducing marennine, but with the
concentration of marennine in the PBR expected to be significant, light attenuation should
also be increased. The PFD was therefore slightly increased. Results are given in Fig. 40.
Fig. 40: Evolution of dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and specific EMn concentration of Haslea ostrearia for semi-continuous culture in NX media with optimal culture conditions in
a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3
The 8-day batch culture with NX-25N100P6Si allowed a maximum biomass
concentration of 0.63±0.02 g L-1 to be reached. Biomass then instantly decreased by day
8 with the addition of nitrogen-limited medium (NX-5N100P6Si), leading to an increase
in EMn production with a maximum EMn concentration of 19.64 ± 0.19 mg L-1 on day 15.
The specific EMn concentration also increased by day 8 as expected, from 0.88 ± 0.05 mg
108cell-1 to 7.81 ± 0.08 mg 108cell-1 by day 15, and attested to the capacity of H. ostrearia
to overproduce EMn in nitrogen-limited complete inorganic medium. To confirm the
efficiency of the airlift stirred culture, H. ostrearia was cultivated in the same conditions
but in the immobilized cell PBR. Results are given in Fig. 41.
0
5
10
15
20
25
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Spec
ific
EM
n (
mg
10
8ce
ll-1
)
DW
(g
L-1)
Times (Days)
DW EMn EMn spe
219
Fig. 41: Evolution of dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn) of Haslea ostrearia for a continuous culture in NX media with optimal culture conditions in a 500 mL immobilized cell PBR. Data
is mean ± 95% CI for n = 3
Similar biomass and EMn evolutions as discussed above (Fig. 24) were obtained.
However, the EMn concentration reached 10.6 ± 0.2 mg L-1, whereas previous
immobilized cell culture remained at around 4.5 ± 0.2 mg L-1. This emphasizes the interest
of our systematic optimization of culture conditions. In terms of biomass, time monitoring
was not allowed by cell immobilization. Only to (0.07 ± 0.02 g L-1) and tend (0.15 ± 0.05 g L-
1) were carried out.
Compared to stirred culture, the interest of producing H. ostrearia in suspended
(pelagic) cells is confirmed here. An EMn productivity of 4.5 ± 0.2 mg L-1 d-1 was obtained,
although the influence of EMn concentration on cell growth or physiology was not
elucidated.
5 Discussion
This study was the result of numerous experiments aimed at elucidating the main
parameters governing H. ostrearia culture in PBR. All immobilization studies resulted in
low productivity (0.63 ± 0.05 mgEMn L-1 d-1 for passive immobilized cell and 0.43 ± 0.05
mgEMn L-1 d-1 for agar gel immobilization). Alginate entrapment bead was not found to be
resistant to stirring and medium chemistry. Carbon nutrient limitation was found to be a
highly relevant limiting parameter. Even though pH is regulated by CO2 injection, the
geometry of the PBR led to a low mass transfer of CO2 in the biofilm.
0
2
4
6
8
10
12
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
DW
(g
L-1)
Time (Days)Cell Emn
220
A systematic optimization was then conducted in cell-suspended mode. Dissolved
inorganic carbon (DIC) was added by CO2 injection (Fig. 25), eventually combined with
the addition of sodium bicarbonate (Fig. 27). H. ostrearia revealed a high DIC requirement
in the PBR culture, mainly for EMn production, reaching 7.3 mg L-1 with 15% CO2 against
1.0 mg L-1 with 2% CO2. The high requirement of H. ostrearia for carbon supply could be
attributed to the high carbon content (36 ± 0.6%) of EMn (Pouvreau et al., 2006). With
the addition of sodium bicarbonate, it was found necessary to keep DIC constant at 10
mM, to reach 31.7 ± 0.3 mg L-1 d-1 of biomass and 0.8 ± 0.1 mg L-1 d-1 of EMn in semi-
continuous culture mode. However, culture medium precipitation appeared at high DIC,
phosphorus and silicon concentration, which impaired biomass and EMn productivity.
The substrate consumption rate H. (rS) and specific substrate consumption rates
(QS) of NO3-, PO43- and SiO32- (Table 1) were determined. This enabled us to set a fed-batch
strategy for the P, Si, C elements, avoiding precipitation and therefore increasing biomass
productivity to 51.8 ± 2.3 mgx L-1 d-1. In terms of EMn productivity, this leads to the lowest
productivity obtained, with 0.2 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1 (Figure 29). As described by Robert
(1983), H. ostrearia excretes marennine continuously, but surprisingly in nutrient
unrestricted conditions this leads to metabolism orientation to reduce EMn production.
As described in previous studies (Neuville & Daste, 1972; Rossignol, 1999; Lebeau et al.,
2000), marennine overproduction can be induced by nitrogen limitation. This was
confirmed by our study (Figure 37). Phosphorus, silicon and nitrogen limitation
conditions lead to higher productivities than the control test, respectively 9.2 ± 1.7 mgEMn
m-2 d-1, 37.9 ± 0.7 mgEMn m-2 d-1 and 54.5 ± 1.8 mgEMn m-2 d-1. Nitrogen is definitely the best
nutrient limitation to overproduce EMn.
Optimal conditions of temperature, pH and light were investigated. pHOPT = 7.8 and
TOPT = 22°C were assessed. These values were not different from the ideal settings
previously established (Robert, 1983; Turpin et al., 1999), but it was found quite difficult
to determine the optimal ones due to the medium chemistry leading to precipitation of
the medium, which started at pH 8 and 25°C (Nguyen, 2013).
Concerning light, it was determined here to be a function of the MRPA (denoted A),
which enables PFD, biomass concentration and PBR geometry to be gathered in a single
representative physical quantity. Different optimal values AOPT were identified for both
biomass and EMn production, with respectively 1.7 ± 0.1 gx m-2 d-1 at 12.3 µmolh gx-1 s-1
221
and 11.0 ± 0.5 mgEMn m-2 d-1 at 8.4 µmolh gx-1 s-1. Biomass production was found to be
positively impacted by high PFD until an MRPA of around 12 µmolh gx-1 s-1 was reached.
We also noted that these values were close to the values for other species known for their
high light tolerance (Chlorella vulgaris and Nannochloropsis gaditana, with 15 μmolhv gx-1
s-1 ≥ AOPT ≤ 20 μmolhv gx-1 s-1 and AOPT = 13 μmolhv gx-1 s-1 respectively) (Artu, 2016).
The conversion efficiency of light into biomass (Figure 31) showed an efficiency of
around 0.10 ± 0.01 gx molh-1 for MRPA values in the range 8-12 µmol h gx-1 s-1, but a low
correlation (r = 0.4564) between MRPA and total pigment concentration evolution was
observed. The lower the MRPA value, the higher the pigment concentration should be,
according to the photoadaptation phenomenon (Pruvost & Cornet, 2012; Artu, 2016). The
reverse behavior was observed here for H. ostrearia, with an increase in photosynthetic
pigment content from 8 to 12 µmolh gx-1 s-1, which was also found to correspond to the
maximum conversion efficiency of light into biomass. This also corresponded to a
simultaneous decrease in EMn concentration (%) with a switch from EMn production to
biomass, which could be estimated at around 8 µmolh gx-1 s-1 (Figure 32). All these results
tend to indicate a possible particular evolution of H. ostrearia pigments towards light (i.e.
different from Chlorophyceae), which could be linked to H. ostrearia metabolism.
In terms of EMn production, a productivity of 11.0 ± 0.5 mgEMn m-2 d-1 produced at
8.4 µmolh gx-1 s-1 was obtained. Light, as represented by the MRPA, was revealed to be an
important parameter for marennine production. But contrary to Mouget et al. (2004;
2005), according to whom the higher the PFD, the higher the EMn produced, our study
showed an optimal MRPA for EMn production at around 8 µmolh gx-1 s-1, which was found
to be lower than the optimal MRPA for biomass production. Given that the origin of
marennine synthesis is still unknown, only a partial hypothesis can be elaborated here. In
our experiments, EMn production was found to be inversely related to biomass
productivity and photosynthetic pigment concentration (figures 30 and 33). Even if EMn
could (directly or indirectly) come from photosynthetic pigment synthesis or be related
to photosynthetic growth metabolism, it certainly follows its own pathway and role in
terms of cell physiology. These pathways could be energetically in conflict. Therefore, the
cell should promote either biomass or marennine. This hypothesis tends to be verified by
our experiment with nitrogen limitation conditions, which revealed the enhancement of
EMn synthesis.
222
EMn is known to be a highly bioactive molecule (Gastineau et al., 2012). Therefore,
when concentration is increased in culture it could have a negative impact on H. ostrearia
growth. If marennine has a negative impact on biomass productivity (and thus the EMn
synthesis itself) during the production process, this molecule should be removed from the
medium during culture. Additionally, the shadowing characteristic of EMn also raises the
possibility of limiting light propagation in the PBR, thus also reducing photosynthetic
growth. We therefore tested an adapted protocol based on medium renewal (+EMn) after
a period of unstirred conditions to allow cells to sediment at the bottom of the PBR.
Unfortunately, the tychopelagic characteristic of the cell prevented it from removing 90%
of EMn without decreasing too much cell density. The hypothesis of controlling the
tychopelagic behavior by culture condition is raised to better control the production
process.
In a final experiment, we finally demonstrated that whatever the impact of
marennine, the culture of H. ostrearia in a stirred conventional PBR managed to produce
continuous EMn at 4.5 ± 0.16 mgEMn L-1 d-1, against 0.7 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1 for immobilized
cell culture (Figure 41). The conventional stirred PBR is therefore confirmed for H.
ostrearia culture and continuous EMn production.
6 Conclusions
Cell immobilization has been presented as a solution for H. ostrearia culture for a
long time (Robert, 1983, 1989; Rouillard, 1996; Rincé et al., 1999; Rossignol, 1999;
Lebeau et al., 2000; Turpin et al., 2001). However, it is rather difficult to scale up and
induces possible limitations related to mass or even light transfer in biofilms (Hochfeld,
2005; Gabelle et al., 2012; Souliès, 2014; Kandilian et al., 2017; Ndiaye et al., 2018). In the
case of H. ostrearia, the composition of the culture medium ES1/3 (Robert, 1983), which
is used as a reference, was also found to be prone to chemical precipitation. This
phenomenon limits biomass and EMn productivity.
It was found essential to design a new specific growth medium for H. ostrearia
culture in a PBR in order to understand, investigate and optimize H. ostrearia culture. It
was also found difficult to fully optimize pH and temperature because of their relationship
with the precipitation phenomenon. Further improvement of the culture medium and
223
conditions (being related) is still possible. The use of P, Si and C fed-batch was found to be
a useful strategy and could be used for this purpose.
Among the various parameters, light as represented by the MRPA was found to be
highly relevant. It impacts biomass productivity and also EMn synthesis, pigment and
overall conversion efficiency. However, the particular response to low MRPA value
remains to be further investigated, as its behavior towards pigment evolution was found
to be very different here than with other well-known organisms such as Chlorella vulgaris.
Hypothetically, this bias in cell response could come from the EMn synthesis and be
confirmed by the study of IMn production to light conditions.
The marennine synthesis pathway was not elucidated in our study (as this was not
the main aim of this paper), but it was confirmed that continuous EMn production and
excretion occur in a PBR culture, even without nutrient limitation. Overproduction was
obtained by applying silicate or nitrogen limitation. As a consequence, nutrient
concentration variation and its consequences for culture cell physiology remains to be
investigated.
To conclude, once all optimum parameters are collected and applied, the culture of
H. ostrearia cells in a stirred airlift PBR is possible. An EMn productivity of 4.5 ± 0.2 mgEMn
L-1 d-1 was achieved. The new NX medium was found to be stable at pH 7.8 and the P, Si, C
fed-batch could be avoided. We succeeded in scaling up H. ostrearia culture to a 6 L PBR.
A further study will investigate the continuous recovery of EMn by using, for
example, membrane technology. This will enable investigation of the interest in keeping
pelagic cells in the culture volume to further increase EMn productivity in a mixed PBR.
224
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229
Conclusions et perspectives
Le travail présenté dans ce manuscrit de thèse a permis de découvrir une partie
des problématiques de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur, et ainsi
apprendre à maîtriser et orienter la production de cette microalgue à fort potentiel, mais
dont la culture optimisée reste un enjeu en vue de son exploitation contrôlée.
Une première problématique identifiée durant cette thèse a été la variabilité des
résultats en milieu d’eau de mer enrichie (Turpin et al., 1999 ; Gagneux-Moreaux et al.,
2007 ; Mouget et al., 2009). La composition et la concentration des éléments nutritifs de
ces milieux sur base naturelle entraine un phénomène de précipitation limitant la
croissance d’H. ostrearia en PBR. Les milieux minéraux d’eau de mer artificiels (NX-
5N10P6Si et NX-25N100P6Si) élaboré par une approche stœchiométrique de la
composition élémentaire de la biomasse, ont permis la diminution du phénomène de
précipitation, augmentant respectivement, les productivités en EMn et en biomasse. Les
interactions chimiques entre les ions Ca2+, Mg2+, PO43-, HCO3- et SiO32- provenant de la
solution d’enrichissement, ont été confirmées par simulation des équilibres physico-
chimiques. D’autre part, l’étude de l’impact de chaque nutriment sur les productivités en
biomasse et en EMn démontre que 10 fois moins de Calcium dans le milieu entraîne une
augmentation de productivité d’un facteur 5,5 en cellules, et 2 en EMn. La concentration
en Magnésium n’a pu être ni baissée ni augmentée sans provoquer des pertes de
productivité. L’augmentation des concentrations de Fer et de Zinc ainsi que la baisse de
Bore et de Nickel, ont permis d’obtenir de meilleures productivités en biomasse et en
marennine extracellulaire ainsi qu’un contrôle des conditions nutritionnelles en PBR.
Cette nouvelle composition de milieu nous permet d’envisager l’augmentation de
macronutriments (N, P, Si) dans le but d’augmenter le seuil de productivité que ce milieu
permet d’atteindre en PBR. De plus, il est possible d’utiliser cette approche pour
l’élaboration d’autres milieux de culture. Cependant, à pH>8, une précipitation est encore
présente, et s’avère létale pour les microalgues à pH>9. Une étude physico-chimique du
230
milieu de culture est donc encore nécessaire pour éviter le phénomène de précipitation
avant d’envisager l’augmentation des concentrations de macronutriments.
Le milieu NX est un milieu minéral, mais les études sur l’impact des sources de
Carbone et de Phosphate ont montré qu’il est possible d’obtenir de bons résultats de
productivité en EMn et en biomasse avec des sources organiques de nutriments. La
mixotrophie d’H. ostrearia n’a pas été démontrée dans cette thèse, mais les diatomées
possèdent une gestion de l’énergie chimique (ATP et NADPH) différente de celle des
chlorophycées pour la fixation du Carbone. Un échange rapide entres ces molécules existe
entre le chloroplaste et la mitochondrie, permettant de combler rapidement le déficit du
rapport ATP/NADPH de la photosynthèse grâce à l’énergie produite par respiration
(Bailleul et al., 2015). Le fait qu’H. ostrearia possède potentiellement cette capacité,
soulève l’hypothèse d’une alternative mixotrophe au milieu inorganique NX. Quoi qu’il en
soit, bien que l’utilisation de l’eau de mer naturelle puisse être préférable à une
production à grand volume, le milieu artificiel NX de composition connue et contrôlée,
apporte une reproductibilité dans l’étude de la culture de cette algue et de la production
de la marennine à l’échelle du laboratoire. A l’avenir, la méthodologie d’enrichissement
combinée à une prédiction des limites de dissolution et de précipitations pourra être
étendu au cas de milieux à base d’eau de mer naturelle. Ainsi, même si celle-ci contient
des concentrations élevées en Ca2+ par exemple, il sera possible d’appliquer une stratégie
fed-batch d’enrichissement progressif afin d’apporter les nutriments nécessaires à la
croissance, tout en gardant un milieu de croissance chimiquement stable.
Bien que l’impact du milieu de culture ait été montré dans la limitation de la
croissance d’H. ostrearia en PBR, l’impact des conditions d’agitation soulève encore des
problématiques de culture. Malgré les travaux du GEPEA (Rossignol et al., 1999 ;
Vandanjon et al., 1999) et ceux de cette thèse. L’étude du phénomène de mécano-
sensitivité se heurte à la mesure de réponse biologique d’H. ostrearia, la différence des
conditions appliquées entre les expériences à hydrodynamique maîtrisée et les réelles
conditions turbulentes en PBR. La sensibilité d’H. ostrearia n’a donc pu être rapportée à
une grandeur type liée aux contraintes de cisaillement, car l’origine même de sa sensibilité
ne semble pas être entièrement physique mais est également due à sa physiologie.
La sensibilité générale des diatomées face à l’agitation est connue et présentée
dans la littérature (Wang et Lan, 2018). Dans le cas d’H.ostrearia, l’hypothèse de la
231
sensibilité due à son système de division cellulaire est la plus plausible à notre niveau de
compréhension de cette microalgue. La baisse de productivité en biomasse observée
durant la culture en PBR torique, indique une difficulté d’H. ostrearia à supporter le
régime turbulent, même à faible cisaillement (20 s-1) et en agitation continue. Pourtant, la
même intensité de 8h d’agitation par jour provoque une augmentation de productivité de
biomasse d’un facteur 1,8 par rapport à une culture non agitée. Il a pu être montré que
l’agitation permet aussi d’augmenter l’accessibilité des cellules à la lumière, une
corrélation directe ayant en effet à pu être montrée avec la remise en suspension des
cellules par l’agitation. Ainsi, du fait de la sédimentation rapide des cellules menant
naturellement à protéger les cellules de la lumière, une durée trop longue d’agitation peut
amener les cellules en suspension à recevoir un excès lumineux sur une journée. D’autre
part, si on suppose que la synchronisation de la population cellulaire ne se déroule qu’en
période de nuit, une agitation de 8h alternée n’engendre des contraintes de cisaillement
que seulement durant la période de jour. Ainsi, ce gain de productivité pourrait autant
venir de la sensibilité d’Haslea ostrearia en phase de division cellulaire, que d’une
meilleure exposition à la lumière. La baisse de concentration en pigment
photosynthétique tend à corroborer l’hypothèse d’une réponse à la lumière. Cependant,
ce point mériterait d’être approfondi, notamment en étudiant plus en détail la relation
entre croissance et lumière absorbée (MRPA), elle-même modifiée par la stratégie de mise
en suspension des cellules.
Compte-tenu des résultats obtenus, une stratégie de 8h d’agitation par jour en PBR
torique a été mis en place, avec pour but d’améliorer l’accès à la lumière des cellules tout
en évitant les stress hydrodynamiques pendant la nuit et/ou la surexposition lumineuse.
Même si cela s’est avéré concluant, une optimisation de cette stratégie reste possible par
une étude du comportement d’H. ostrearia en mode tychopélagique de croissance
(cellules en suspension), pour contrôler au mieux l’impact de la lumière sur le
comportement cellulaire et d’isoler ce comportement de celui provoqué par l’agitation.
Concernant la stratégie d’agitation en PBR Airlift, le comportement tychopélagique d’H.
ostrearia peut en effet s’avérer clé, car cette stratégie permet à une partie de la population
cellulaire de se fixer au fond du PBR (comportement benthique) et de limiter l’impact de
l’agitation turbulente générée par le gaz, alors qu’une remise en suspension des cellules
favorise la réception de lumière pour les cellules au comportement tychopélagique.
Visuellement, les cellules se sont révélées différentes, laissant présager une physiologie
232
différente également. Une étude plus précise de la physiologie tychopélagique/benthique
d’H. ostrearia permettrait une meilleure compréhension et un meilleur contrôle de la
stratégie d’agitation (vis-à-vis de la croissance et de la marennine).
Considérant les cisaillements provoqués par un régime laminaire, la résistance sur
courte durée d’H. ostrearia a été confirmée et à de très hauts taux de cisaillement non
présents en PBR (jusqu’à 30 000 s-1). La forme pennée de la microalgue est l’hypothèse la
plus plausible pour expliquer nos résultats, lui donnant des propriétés anisotropes lui
permettant de diminuer l’impact des cisaillements sur elle-même selon son orientation
dans le fluide (Mauer et al., 2016). Cependant, comparée à la résistance d’autres
diatomées en régime laminaire, H. ostrearia est capable de supporter une intensité de
cisaillement d’un facteur 4,5 plus important que Phaeodactylum tricornutum et
Chaetoceros muelleri (Sobczuk et al., 2005 ; Michiel et al., 2010). Le régime laminaire est
très rare en PBRs conventionnels (Olmos et al., 2003 ; Pruvost et al., 2006 ; Ndiaye et al.,
2018 ; Wang et Lan, 2018). Envisager la conception d’un système de culture
spécifiquement dédié pour H. ostrearia en conditions de régime laminaire uniforme,
permettrait l’application d’agitation et l’optimisation du transfert de matière (élimination
du gradient T°C et pH) sans altérer l’intégrité cellulaire. A noter que des réacteurs à flux
laminaire (LFR) reposant sur le contrôle d’un régime laminaire au sein du PBR sont
communément utilisé en génie des procédés et pourraient servir d’inspiration.
Concernant la réponse d’H. ostrearia à la lumière, nos études ont permis de
confirmer des hypothèses précédemment mentionnées dans la littérature mais en
soulèvent aussi d’autres. H. ostrearia possède un besoin en énergie lumineuse (AOPT=12
µmolhv. gx-1. s-1) similaire à ceux de Chlorella vulgaris et Nannochloropsis gaditana (Artu,
2016). Cependant, nous avons observé une variation pigmentaire importante dans une
gamme de MRPA de 8,4 à 12,3 µmolhv. gx-1. s-1, correspondant respectivement aux AOPT
EMn et AOPT biomasse. L’hypothèse d’une utilisation de la marennine (hypothétiquement
intracellulaire) dans la photosynthèse chez H. ostrearia est donc plausible. Comprendre
les conditions de production d’un exo-métabolite tel que la marennine est une
problématique importante pour la conception optimisée d’un procédé de culture et
d’extraction de ce composé.
En débat dans la communauté scientifique (Robert, 1983 ; Neuville et Daste, 1972 ;
Rossignol, 1999 ; Lebeau et al., 1999), l’origine de la marennine reste d’une façon générale
233
à élucider. Les résultats de cette thèse ont permis d’identifier quelques stress
physiologiques induisant la surproduction de l’EMn. Les résultats démontrent que les
carences en nutriments provoquent chez H. ostrearia une forte diminution voire un arrêt
de l’excrétion de l’EMn, alors que les limitations en Silice et en Azote permettent la
stimulation de l’excrétion. Les faibles résultats de productivité (en cellule et en EMn)
obtenus en PBR à cellules immobilisées (actives et passives) ont conduit à remettre en
question ce mode de culture. Au final, H. ostrearia a donc été cultivée en PBR agité airlift
dans un milieu NX pour optimiser la production de biomasse, puis cultivée dans un milieu
NX (limité N) en continu pour stimuler l’excrétion d’EMn. Cette technique de culture
permet d’obtenir des productivités de 4.5±0.16 mg L-1 d-1 en EMn ce qui correspond à 1,8
fois les productivités publiées par Rossignol (1999) en PBR à membrane immergée
(Figure 81).
La comparaison aux PBR à membrane immergée permet d’envisager une autre
piste d’optimisation. En effet, dans notre étude et contrairement aux travaux de Rossignol
(1999), la récolte d’EMn a été effectuée par surverse en semi-continu, ce qui entraîne une
partie des cellules (principalement tychopélagiques). Il est intéressant de constater qu’H.
ostrearia excrète de l’EMn en continu même en conditions non limitées par les nutriments.
Cela nous permet d’envisager d’optimiser les productivités en EMn du procédé (en
adaptant par exemple les concentrations du milieu de culture pour limiter la cellule en
Azote) en maintenant les cellules dans le PBR grâce aux membranes immergées. On peut
aussi ajouter qu’une concentration importante d’une molécule active tel que l’EMn dans
le milieu soulève l’hypothèse d’un impact négatif de la molécule sur le comportement d’H.
ostrearia (Robert et Turpin, 1993 ; Rossignol, 1999). Les travaux deRossignol (1999) sur
la filtration en continu d’EMn par membrane immergé permettrait donc de palier à ce
potentiel impact négatif de la marennine sur la productivité. Nous avons ainsi estimé qu’il
était encore possible d’augmenter d’un facteur 3 nos productivités volumiques en EMn
dans les conditions de culture optimales identifiées dans cette thèse (PVestimé = 13,5 mgEMn
L-1 j-1).
234
Figure 81: Représentation chronologique actualisée des travaux successifs visant à améliorer la production en marennine extracellulaire selon les différentes technologies de systèmes de culture mises en place par les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR
235
Pour conclure de façon générale sur la culture d’H. ostrearia, les cultures effectuées
en PBRs à cellules immobilisées ont permis jusqu’ici de cultiver H. ostrearia (Rincé et al.,
1999 ; Rossignol, 1999 ; Lebeau et al., 2000 ; Turpin et al., 2001), mais la montée en échelle
de ce type de culture reste une problématique, un tel système apporte aussi des
problématiques propres de transfert de matière au sein du biofilm, avec possible
apparition de gradients localisés de pH, de température, de nutriments (Hochfeld, 2005 ;
Gabelle et al., 2012 ; Souliès, 2014 ; Ndiaye et al., 2018). L’utilisation de systèmes de
culture agités conventionnels (tel que airlift) pour la culture d’H. ostrearia s’est avérée
une alternative possible. Cependant cette algue est sensible aux pompes ainsi qu’à
l’agitation en régime turbulent, notamment avec un couplage qui apparait entre cycles
d’éclairement et périodes d’agitation. Un système d’agitation alterné ou spécifique
(régime laminaire) doit être appliqué. Les études présentées dans cette thèse nous
permettent de montrer qu’une agitation locale d’intensité conventionnelle (20 – 15 000 s-
1) en période de jour est favorable à la culture de cette microalgue. Une homogénéisation
du PBR engendre un meilleur transfert de matière, favorablement combiné ici avec
l’utilisation d’un milieu NX stable au niveau physico-chimique. La mise en suspension des
cellules permettra d’optimiser les conditions d’accès à la lumière, et donc une
optimisation globale de la croissance photosynthétique. La solution de récolte de EMn par
membrane de filtration est aussi une piste très intéressante, car cela permet de limiter
l’impact potentiel de l’EMn sur la croissance d’H. ostrearia, tout en évitant le lessivage de
la culture provoqué par un comportement tychopélagique de cette microalgue.
D’un point de vue applicatif, aux vues de nos résultats, on peut conclure que la
montée en échelle de la culture d’H. ostrearia est donc possible. Nous avons ainsi identifié
quelques PBR sélectionnés selon leurs types d’agitation permettant d’imposer des
périodes d’agitation, et leur capacité à générer des taux de cisaillement supportable pour
H. ostrearia (Tableau 14). Cela pourrait être dans un PBR « colonnes à bulles », un PBR
airlift de type Hector, ou un Raceway clos (voir le Tableau ci-dessous). Cependant, chacun
demandera une étude dédiée pour notamment adapter les stratégies d’agitation. Les
données collectées dans nos travaux pourront alors être utiles pour définir les durées
d’agitation (notamment obtenir une valeur de MRPA optimale sur une journée, en jouant
sur la capacité naturelle de la souche à sédimenter, et ainsi se protéger des excès de
lumière). Cela permet d’envisager des solutions de contrôle des conditions de culture d’H.
ostrearia (milieu, stratégie d’agitation et de sous-titrage de la marennine extracellulaire),
236
et d’envisager une monté en échelle rationnelle de la culture pour sa valorisation
industrielle.
Tableau 14: Comparaison de l'intensité et la capacité à générer des contraintes hydrodynamiques du PBR Colonne à bulle, Hector et Raceway clos.
PBR Type VR (L)
γestimé
(s-1)
Agitation Régulation
pH
Régulation
T°C
Colonne à
bulles Cylindre 130 150 - 275 Airlift
CO2 oui Hector Plan 150 150 - 275 Airlift
Raceway
clos Plan 700-1500 <275
Roue à
aubes
237
Nomenclature
Hydrodynamique et cisaillement
γ Taux de cisaillement s-1
μ Viscosité dynamique Pa. s-1
ν
Viscosité cinématique m2. s-1
Q Débit L. h-1
Re Nombre de Reynolds -
τ Contrainte de cisaillement Pa
Ta Nombre de Taylor -
Ug Vitesse superficielle du gaz m. s-1
Transfert de lumière au sein d’un photobioréacteur
A ou Alight Vitesse spécifique
moyenne d’absorption de
photons (MRPA)
μmolhv. gx-1. s-1
A24h, suspended Vitesse spécifique
moyenne d’absorption de
photons (MRPA) estimé en
fonction de la condition
d’agitation
μmolhv. gx-1. s-1
as Surface spécifique éclairée m-1
CX Concentration en biomasse
sèche
g. L-1
γ Fraction volumique
éclairée du PBR
-
Ea Coefficient massique
d’absorption
m². kg-1
FV/Fm Fraction de l’énergie
photonique absorbée
convertible en énergie
-
238
chimique (mesure de
stress chez la plante)
G Irradiance locale μmolhv. m-2. s-1
L Profondeur de culture m
η L’efficacité de conversion
de la lumière
gx. molhv-1
q0 Flux incident en surface μmolhv. m-2. s-1
qL Flux lumineux en sorti de
PBR
µmolhv. m-2. s-1
V Volume du réacteur L
Production en photobioréacteur
PV Productivité volumique Cell. L-1. d-1 or g. L-1. d-1
PS Productivité surfacique Cell. m-2. d-1 or g. m-2. d-1
N Concentration cellulaire Cell. L-1
D Taux de dilution en culture
semi-continue ou continue
j-1
rS Vitesse de consommation
de substrat
µmol. L-1. d-1
QS Vitesse spécifique de
consommation de substrat
µmol. gx-1. d-1
Yx Rendement de conversion
du substrat en biomasse
µmol. gx-1
P EMn specific Productivité spécifique de
marennine extracellulaire
mg. cell-1. d-1
DW or MS Matière sèche g. L-1
239
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Titre : Optimisation de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur
Mots clés : Milieu de culture, fragilité cellulaire, conditions de culture, photobioréacteur, marennine extracellulaire, Haslea ostrearia, diatomée.
Résumé : Haslea ostrearia est une diatomée capable d’excréter un pigment bleu-vert appelé marennine d’intérêt industriel en aquaculture, cosmétique et pharmaceutique. Sa culture en laboratoire et à grande échelle est actuellement un défi, cette espèce à comportement benthique étant considérée comme sensible à l’agitation des systèmes de cultures conventionnels. Cette thèse décrit l’identification, l’étude et
l’optimisation des paramètres limitants de la culture en photobioréacteur. Un milieu de culture d’eau de mer artificielle a été conçu pour garantir une production stable et non limitée par les nutriments. La fragilité d’Haslea ostrearia au cisaillement hydrodynamique a été caractérisée en appliquant différentes intensités de taux de cisaillement.
Les paramètres optimaux de culture et les conditions d’excrétion de marennine extracellulaire ont été finalement identifiés en photobioréacteur. Au final, les résultats obtenus ont permis de proposer des protocoles et systèmes optimisés de culture, adaptés aux spécificités et besoins d’Haslea ostrearia. Les résultats de cette thèse permettent d’envisager la culture semi-continue de cette microalgue, avec des productivités supérieures à celles rencontrées jusqu’alors dans la littérature. La méthodologie permet également d’apporter les bases pour une optimisation future de la culture d’Haslea ostrearia contrôlée à plus grande échelle, ainsi que sa production de marennine extracellulaire associée.
Title : Optimization of Haslea ostrearia culture in photobioreactor
Keywords : Culture medium, Cell fragility, growth conditions, photobioreactor, extracellular marennine, Haslea ostrearia, diatom.
Abstract : Haslea ostrearia is a marine diatom able to produce and excrete a blue-green pigment called marennine, exhibiting potential industrial valorization in aquaculture, cosmetic and pharmaceutics. Its laboratory and large-scale culture are challenging because this benthic strain is considered as sensitive to mixing conditions in conventional culture system. This thesis describes the identification, the
study and the optimization of limiting parameters of the cell culture in a photobioreactor. A new artificial seawater medium has been designed in order to guarantee a stable and no-nutrients limited production. The Haslea ostrearia fragility to hydrodynamics shear stress has been characterized by applying different intensities of shear rate.
The optimal culture parameters and excretion conditions of extracellular marennine have been finally identified in a photobioreactor. In the end, the results obtained made it possible to propose protocols and optimized culture systems, adapted to Haslea ostrearia specificities and needs. The results of this thesis make it possible to consider the semi-continuous culture of this microalgae, with higher productivities than those described so far in the literature. The methodology also provides the basis for future optimization of the Haslea ostrearia controlled culture on a larger scale, as well as its asociated extracelular marennine production.