TTHHÈÈSSEE
En vue de l'obtention du
DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Biologie moléculaire, cellulaire et du Développement
Présentée et soutenue par
Rami Makki
Le 11 Décembre 2008
Titre : Hématopoïèse et réponse immunitaire cellulaire chez Drosophila melanogaster
JURY
Professeur David Cribbs, Président Dr. Bruno Lemaitre, rapporteur Dr. Stéphane Noselli, rapporteur Dr. Isabelle Godin, rapporteur
Dr. Marie Meister, examinatrice Dr. Michèle Crozatier, directrice de thèse
Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologie
Unité de recherche : Centre de Biologie du Développement, CNRS UMR5547 Directeur de Thèse : Dr. Michèle Crozatier
TTHHÈÈSSEE
En vue de l'obtention du
DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Biologie moléculaire, cellulaire et du Développement
Présentée et soutenue par
Rami Makki
Le 11 Décembre 2008
Titre : Hématopoïèse et réponse immunitaire cellulaire chez Drosophila melanogaster
JURY
Professeur David Cribbs, Président Dr. Bruno Lemaitre, rapporteur Dr. Stéphane Noselli, rapporteur Dr. Isabelle Godin, rapporteur
Dr. Marie Meister, examinatrice Dr. Michèle Crozatier, directrice de thèse
Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologie
Unité de recherche : Centre de Biologie du Développement, CNRS UMR5547 Directeur de Thèse : Dr. Michèle Crozatier
Remerciements
Je tiens à remercier Alain Vincent pour m’avoir accueilli au CBD et dans son équipe, dans laquelle j’ai trouvé les meilleures conditions de travail qu’on puisse espérer. Mes plus sincères remerciements à Mr Bruno Lemaitre, Mr Stéphane Noselli, Mme Isabelle Godin et Mr David Cribbs pour le temps qu’ils ont pris pour juger mon travail. Il n’y a pas de mot assez fort pour exprimer l’ampleur de ma gratitude à ma directrice de thèse, Michèle Crozatier. Je te remercie pour tout ce que tu m’as appris, pour ta patience, ton soutient, pour ta gentillesse sans faille, et pour tes tiramisus. En espérant y regoûter bientôt. Merci à Marie Meister, dont la collaboration fut essentielle et enrichissante pour ce travail. Merci à Joanna Krzemień avec qui nous avons fait nos thèses côte à côte. De collègues nous sommes rapidement devenus amis et tu es de ces amis que l’on souhaiterait garder prêt de soi toujours. Merci pour ces longues discussions, pour ces bons moments, pour m’avoir fait découvrir Cracovie. Merci aux « musclés », Laurence et Jonathan. Laurence pour ce que tu m’as appris et ton amitié. A bientôt pour d’autres soirées jeu. Jon, et bien après une rencontre ratée à Paris, je suis heureux d’avoir eu une seconde chance car il y a des rencontres qu'on n'oublie pas. Un grand merci à Bruno pour son regard critique sur mon travail, Delphine, heureux d’avoir pu lymph glander avec toi, Virginie pour ton aide inestimable et pour m’avoir appris a travailler proprement. Merci aux nouveaux : Hadi et Justine, puissiez vous apprécier cette équipe autant que moi. Un merci particulier à ma « tutrice » Muriel. Pour m’avoir toujours fait voir le bon cote des choses, pour ton éternelle bonne humeur, pour tes sourires et tout le temps que tu m’as accordé. J’aimerai remercier les étudiants du CBD pour avoir créé cette atmosphère familiale dans laquelle j’ai travaille ces cinq années de DEA et de thèse. Merci Gaëlle et a notre prochaine danse. Merci Nico, je me suis senti comme chez moi grâce à toi. Merci Alex pour ces bons moments. Merci Mohamad, Isabelle, Helene, Dani, Aurélie, Aïcha, Flo, Maeva, Chantale… Merci à toi Julie, mieux que les antidépresseurs, plus agréable et sans effets secondaires, un café avec toi devrait être remboursé par la Sécu. Merci Cédric. Merci Mai, à bientôt j’espère en Australie. Emilie, pour une fois, les mots me manquent. Merci, merci mille fois. Merci à ma promo de DEA qui a fait que cette année fut une bonne année. Aux étudiants d’Alpha-T avec lesquels j’ai tant partage. Merci a Brice et Aurélie pour le temps passe à m’apprendre à me servir d’un microscope, du confocal au champ large. Grace à vous je vois le coté artistique de nos images. Merci Bruno alias Bigbrother. Promis la prochaine fois je vérifierai que l’ordi est branché. Merci aux Drôles de Dames du secrétariat toujours là pour moi Merci aux préparateurs du milieu a mouches. Merci à Daniel, pour tout. Merci aux organisateurs du festival Enormes et un grand merci aux Baleines pour tout ces souvenirs. Un grand merci pour tous les membres du CBD qui m’ont fait profiter de leur savoirs et savoirs faires et n’ont pas hésité à me donner de leur temps. Je remercie mes parents pour leur soutien. Merci frérot pour avoir toujours été la. Enfin, merci aux mouches et aux Drosophilistes qui depuis cent ans nous donnent les moyens de voir plus loin.
Résumé La Drosophile, comme tous les métazoaires, possède un système immunitaire inné, l’immunité adaptative étant spécifique aux vertébrés. Depuis environ une dizaine d’année la Drosophile est utilisée comme un excellent modèle pour aborder l’étude de la réponse immunitaire innée. Deux types de réponse immunitaire sont mis en jeux à la suite d’une infection. a) Une réponse humorale qui consiste en la sécrétion de peptides antimicrobiens dans l’hémolymphe. b) Une réponse cellulaire qui fait appel à des cellules spécialisées appelés hémocytes. Trois types d’hémocytes ont été caractérisés : les plasmatocytes qui sont responsables de la phagocytose, les cellules à cristaux responsables de la mélanisation et les lamellocytes responsables de l’encapsulation de parasites trop gros pour être phagocytés. Les hémocytes sont formés au cours d’un processus appelé hématopoïèse. Comme chez les vertébrés il existe deux vagues d’hématopoïèse chez la Drosophile, une vague embryonnaire et une vague larvaire. Les mécanismes moléculaires contrôlant l’hématopoïèse embryonnaire sont bien décrits dans la littérature, alors que ceux contrôlant l’hématopoïèse larvaire sont peu connus. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé aux mécanismes régulant l’hématopoïèse larvaire. L’hématopoïèse larvaire a lieu dans un organe spécialisé appelé la glande lymphatique composée de deux lobes antérieurs et d’une série de lobes postérieurs dont le nombre peut varier. Les lobes antérieurs sont composés de trois zones distinctes : la Zone Médullaire (ZM) qui contient les précurseurs hémocytaires appelés prohémocytes, la Zone Corticale (ZC) qui contient les hémocytes différenciés et un groupe de cellules situées postérieurement dans les lobes antérieurs appelé Posterior Signalling Centre (PSC) qui est un centre signalisateur qui ne participe pas au lignage hémocytaire. Les plasmatocytes et les cellules à cristaux sont formés dans la glande lymphatique qui éclate au début de la métamorphose et relâche les hémocytes dans l’hémolymphe. Les lamellocytes ne se différencient pas dans des larves saines mais uniquement en réponse à un challenge immun tel qu’une infection par un parasitoïde. Un parasitoïde naturel de la Drosophile est la guêpe, Leptopilina boulardi, qui pond ses œufs dans les larves de Drosophile. Suite à cette infection, toutes les cellules de la glande lymphatique vont se différencier prématurément et majoritairement en lamellocytes. La glande lymphatique éclate prématurément et relâche les lamellocytes dans l’hémolymphe. Les lamellocytes vont s’agglutiner autour de l’œuf de guêpe pour former une capsule et neutraliser son développement. Dans des mutants gain de fonction de certains composants des voies de signalisations JAT/STAT et Toll/NFκB on observe la formation de lamellocytes en absence d’infection par un parasitoïde. Ces résultats suggèrent que ces deux voies de signalisation sont impliquées dans l’hématopoïèse larvaire. Cependant les cascades moléculaires qui les mettent en jeu restent à ce jour non établies. Au cours de ma thèse je me suis plus particulièrement intéressé à l’étude du rôle de ses deux voies de signalisation dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire. Dans un premier temps, en collaboration avec Joanna Krzemień, nous avons montré que : i) la voie de signalisation JAK/STAT est activée et nécessaire dans la ZM pour maintenir l’état prohémocyte de ces cellules. ii) le PSC est nécessaire pour maintenir la voie de signalisation JAK/STAT activée dans la ZM. iii) suite à une infection par des guêpes la voie de signalisation JAK/STAT est inactivée dans les prohémocytes qui se différencient massivement en lamellocytes. Ces résultats indiquent que le PSC joue le rôle d’une « niche » pour les précurseurs hématopoïétiques dans la glande lymphatique. Une « niche » est un microenvironnement qui contrôle la prolifération et la différenciation des cellules souches.
5
Cette étude a permis d’établir que la glande lymphatique est un système modèle de choix pour définir in vivo, à la fois d’un point de vue cellulaire et moléculaire, ce qu’est une niche (Krzemień et al., 2007). Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à la régulation de la voie de signalisation JAK/STAT. Cette voie de signalisation est médiée par les récepteurs des cytokines de classe I. Chez la Drosophile, Domeless (Dome) est le seul récepteur connu de la voie de signalisation JAK/STAT et il est exprimé dans les prohémocytes de la ZM dans la glande lymphatique. La séquence du génome de la Drosophile a permis d’identifier un autre gène que nous appelons latran, qui code pour une protéine qui possède une forte homologie de séquence avec domeless. Cependant, latran code pour une protéine transmembranaire tronquée suggérant qu’il pourrait agir comme un récepteur ne pouvant pas signaler. L’analyse du rôle de latran m’a permis de montrer qu’il antagonise la voie de signalisation JAK/STAT uniquement après infection par une guêpe, en formant des hétéromères inactifs avec Dome. Le contrôle spécifique de la voie de signalisation JAK/STAT par Latran lors de la réponse immunitaire cellulaire chez la Drosophile pose la question de savoir si ce mode de régulation nécessitant des récepteurs courts inactifs pourrait également être utilisé chez les vertébrés. En effet, certains aspects de la réponse immunitaire, telle que l’inflammation, nécessitent un contrôle strict et rapide de la voie de signalisation JAK/STAT (Makki et al., manuscrit) Enfin, je me suis intéressé au rôle de toll4 qui code pour un des récepteurs Toll de la Drosophile. toll4 est spécifiquement exprimé dans le PSC suggérant qu’il pourrait jouer un rôle dans l’hématopoïèse larvaire. Pour tester cette hypothèse j’ai construit un mutant nul pour toll4 par recombinaison homologue. Le mutant toll4 ne présente aucun défaut ni morphologique, ni dans la réponse immunitaire. Ces résultats suggèrent que différents récepteurs Toll pourraient être impliqués de façon redondante dans l’hématopoïèse larvaire. Des analyses complémentaires visant à définir le rôle de la voie de signalisation Toll/NFκB dans l’immunité cellulaire chez la Drosophile sont donc nécessaires.
6
SOMMAIRE
INTRODUCTION............................................................................................. 11
Le système immunitaire de la Drosophile ................................................................ 13 La réponse humorale...................................................................................... 15 Les hémocytes de Drosophila melanogaster et la réponse immunitaire cellulaire........................................................................................................... 17 Les plasmatocytes............................................................................................. 17 Les cellules à cristaux....................................................................................... 19 Les lamellocytes ............................................................................................... 20
L’hématopoïèse chez la Drosophile........................................................................... 23 Description....................................................................................................... 23 L’hématopoïèse embryonnaire ...................................................................... 25 Description........................................................................................................ 25 Contrôles moléculaires ..................................................................................... 27 Hématopoïèse larvaire.................................................................................... 29 Ontogenèse de la glande lymphatique .............................................................. 29 Vous avez dit hémangioblaste ? ....................................................................... 33 Zones Médullaire et Corticale : les hémocytes de la glande lymphatique ....... 33 Cas particulier des lamellocytes et de la réponse au parasitisme ..................... 35 Collier ............................................................................................................... 37 Le PSC et le contrôle de l’hématopoïèse larvaire............................................. 37 Différenciation des lamellocytes et voies de signalisation. .............................. 39
La voie de signalisation JAK/STAT.......................................................................... 41 Description et régulation................................................................................ 41 La famille des récepteurs des cytokines de classe I ..................................... 45 Rôles de la voie de signalisation JAK/STAT ................................................ 48
Les TLRs et la voie de signalisation Toll/NFκB....................................................... 51 Description....................................................................................................... 51 Les TLRs chez la Drosophile ......................................................................... 53 Rôles dans le développement............................................................................ 53 Rôles dans la réponse immunitaire ................................................................... 55 Les TLRs chez les vertébrés........................................................................... 55 La voie de signalisation Toll/NFκB et la réponse immunitaire cellulaire chez la Drosophile ........................................................................................... 56
Matériels et Méthodes....................................................................................... 59 RESULTATS ..................................................................................................... 65
Première partie : Rôle du PSC dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire ........ 67 Introduction..................................................................................................... 67 Résultats........................................................................................................... 67 Le PSC est nécessaire pour maintenir un groupe de prohémocytes dans la glande lymphatique........................................................................................... 67 L’activation de la voie de signalisation JAK/STAT dans la Zone Médullaire est nécessaire pour maintenir les prohémocytes dans la glande lymphatique. ...... 68 Les prohémocytes se différencient prématurément en lamellocytes suite à une infection par un parasitoïde .............................................................................. 69 Discussion ........................................................................................................ 69
7
Article : Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the Posterior Signalling Centre............................................................................ 73
Deuxième partie : Rôle clef de latran dans le contrôle de la voie de signalisation JAK/STAT lors de la réponse immunitaire cellulaire............................................ 79
Introduction..................................................................................................... 79 Résultats........................................................................................................... 79 latran est spécifiquement exprimé dans les prohémocytes de la glande lymphatique. ..................................................................................................... 79 Les mutants latran sont immunodéficients....................................................... 80 Latran agit comme un dominant négatif de la voie de signalisation JAK/STAT.......................................................................................................................... 80 Latran forme des hétéromères avec Dome ....................................................... 81 L’infection par le parasitoïde Leptopilina boulardi modifie le rapport latran/domeless ................................................................................................. 81 latran est un interrupteur qui permet une réponse coordonnée de l’ensemble des prohémocytes.............................................................................................. 81 upd3 est nécessaire pour l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT dans la Zone Médullaire ................................................................................... 82 Modèle proposé pour le contrôle de l’hématopoïèse larvaire........................... 82 Résultats supplémentaires.............................................................................. 83 Latran ne bloque pas l’endocytose du complexe Dome/Upd ........................... 83 Fonction non cellulaire autonome de latran...................................................... 85 Discussion ........................................................................................................ 85 Manuscrit: A short receptor down-regulates JAK/STAT signalling to control the Drosophila cellular immune response. ...................................... 91
Troisième Partie : La voie de signalisation Toll/NFkB : Caractérisation du récepteur Toll4.......................................................................................................... 123
Introduction................................................................................................... 123 Résultats......................................................................................................... 123 Nouvelle annotation de la région génomique de toll4 .................................... 123 toll4 est spécifiquement exprimé dans le PSC................................................ 125 Les mutants toll4 sont viables et ne présentent pas de défaut hématopoïétique......................................................................................................................... 125 Les mutants toll4 sont capables de produire des lamellocytes après infection par un parasitoïde............................................................................................ 127 Discussion ...................................................................................................... 129
CONCLUSIONS GENERALES.................................................................... 131 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................... 137
8
Liste des abréviations
Antp : Antennapedia ARE : AU Rich Element AUBP : AU Binding Protein BCL6 : B-cell lymphoma 6 CBM : Cytokine Binding Motif Ci : Cubitus interruptus COE : Collier/Olfactory-1/EBF Col : Collier CRM :Cis Regulatory Module CSF : Colony Stimulating Factor CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques Dome : Domeless Dscam : Down syndrom cell adhesion molecule dsRNA : double strand Ribonucleic Acids EBF : Early B-cell Factor FOG : Friend Of GATA Gcm : Glial cells missing GNBP : Gram Negatif Binding Protein GPL : GP130 Like Receptor Hh : Hedgehog HLH : Helix Loop Helix Hop : Hopscotch HS : Heat Shock IL : Interleukin Imd : Immunedeficiency INF : Interferon INFRα :Interferon Receptor α IκB : Inhibitor of NFκB JAK : Janus Kinase KEN : Ken and Barbie LDHD : Latran Domeless Homologous Domain LRR : Leucine Rich Repeat N : Notch NFκB : Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells PCR : Polymerase Chain Reaction PDGF : Platelet Derived Growth Factor PGRP : Peptidoglycan Recognition Protein PI3K : Phosphatidyl inositol 3 kinase PIAS :Protein Inhibitors of Activated STAT PO : phenoloxydase proPO : prophenoloxydase PRP : Pattern Recognition Protein PSC : Posterior Signalling Centre PVR : PDGF and VEGF Receptor S2NP : S2 cells Norbert Perrimon
Ser : Serrate SOCS : Suppressors Of Cytokines Signalling Srp : Serpent STAT : Signal Transducer and Activator of Transcription TIR : Toll Interleukin-1 Receptor TLR : Toll Like Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor Upd : Unpaired VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VLP : Virus Like Protein ZC : Zone Corticale ZM : Zone Médullaire
INTRODUCTION
Le système immunitaire de la Drosophile
Le système immunitaire permet à un organisme de discriminer le « soi » du « non soi » (ou du
« soi altéré ») afin de se défendre contre des agressions telles que des infections virales,
bactériennes, par des champignons ou des parasites ou la présence de cellules cancéreuses. Il
existe deux types d’immunité : l’immunité innée et l’immunité acquise. L’immunité acquise
est spécifique des vertébrés.
L’immunité innée consiste en des barrières physiques telles que la peau et les muqueuses et
des mécanismes biologiques non spécifiques, comme la phagocytose, capables d’éliminer les
agents infectieux. L’immunité acquise est basée sur le remaniement génique dans les cellules
somatiques. C’est une immunité spécifique, secondaire, clonale, faisant appel à des cellules
spécialisées : les lymphocytes.
Les cascades moléculaires impliquées dans l’immunité innée étant phylogénétiquement
conservées, la Drosophile, qui est un organisme modèle grâce aux techniques de génétique et
de transgénèse est un modèle de choix pour l’étude de ces mécanismes.
La Drosophile possède des barrières physiques telles que les épithélia du tube digestif et des
trachées. Ces épithélia produisent localement des peptides antimicrobiens et des radicaux
libres, sécrètent des lysozymes créant un environnement hostile pour les agents infectieux
avec lesquels ils sont continuellement en contact.
Pour les pathogènes qui ont réussi à passer les défenses épithéliales deux types de réponses
immunitaires peuvent être mises en jeu : a) Une réponse humorale qui consiste en la sécrétion
de peptides antimicrobiens dans l’hémolymphe par le corps gras (un organe qui remplit
certaines fonctions équivalentes du foie des mammifères) et les hémocytes (cellules
« sanguines ») circulants. b) Une réponse cellulaire qui met en jeu trois processus : la
phagocytose, la mélanisation, et l’encapsulation (les deux derniers étant spécifiques des
Arthropodes). Cette réponse fait appel à des cellules spécialisées appelés hémocytes.
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Figure 1. La réponse humorale chez la DrosophileDeux voies de signalisation sont impliquées dans la synthèse de peptides antimicrobiens lors de la réponse humorale. La voie de signalisation Toll/NFκB activée par une infection par des bactérie Gram positives ou des champignons, et la voie Imd activée par une infection par des bactérie Gram négatives.Les bactéries à Gram positif et les champignons sont reconnus par des molécules de reconnaissances secrétées (PGRP-SA, PGRP-SD, GNBP1, 3) qui vont activer des Sérine Protéase qui vont cliver Spätzle. Spätzle clivé va se lier à Toll qui est à la surface des cellules du corps gras. Toll recrute la protéine intracellulaire MyD88 qui possède un domaine TIR, pouvant interagir avec celui de Toll, et un domaine de mort (Death Domain: DD). Deux autres protéine à domaine de mort sont recrutées: Tube et la kinase Pelle. Par un mécanisme encore inconnu Cactus est clivé ce qui libère les facteurs de transcription Dorsal et Dif qui vont activer la transcription de gènes codant pour des peptides antimicrobiens.Les bactéries à Gram négatif sont reconnues par des protéines solubles ou ancrées à la membrane des cellules du corps gras (PGRP-LC, PGRP-LE) qui vont recruter Imd. Imd interagit avec dFADDqui à son tour se lie avec la caspase Dredd qui s’associe avec Relish et le clivera une fois que Relish sera phosphotylé. Relish est le troisième facteur de transcription à domaine Rel de la Drosophile mais qui contrairement à Dorsal et Dif n’est pas séquestré par Cactus mais possède lui-même un domaine inhibiteur avec des motifs ankirines. Relish est phosphorylé par le complexe IKK. Comment IKK est activé et comment cette activation est liée à Imd restent des questions ouvertes. Cependant, il est proposé que IKK est activé par TAB2 et TAK1 qui est probablement activé par DIAP2. Une fois clivé Relish entre dans le noyau est active la transcription de gènes codant pour des peptides antimicrobiens. (d’après Lemaitre et Hoffmann, 2006)
Cellules de corps gras
Bactérie Gram positive Bactérie Gram négative
hémolymphe
levurechampignon
Noyau
?
Figure 1. La réponse humorale chez la DrosophileDeux voies de signalisation sont impliquées dans la synthèse de peptides antimicrobiens lors de la réponse humorale. La voie de signalisation Toll/NFκB activée par une infection par des bactérie Gram positives ou des champignons, et la voie Imd activée par une infection par des bactérie Gram négatives.Les bactéries à Gram positif et les champignons sont reconnus par des molécules de reconnaissances secrétées (PGRP-SA, PGRP-SD, GNBP1, 3) qui vont activer des Sérine Protéase qui vont cliver Spätzle. Spätzle clivé va se lier à Toll qui est à la surface des cellules du corps gras. Toll recrute la protéine intracellulaire MyD88 qui possède un domaine TIR, pouvant interagir avec celui de Toll, et un domaine de mort (Death Domain: DD). Deux autres protéine à domaine de mort sont recrutées: Tube et la kinase Pelle. Par un mécanisme encore inconnu Cactus est clivé ce qui libère les facteurs de transcription Dorsal et Dif qui vont activer la transcription de gènes codant pour des peptides antimicrobiens.Les bactéries à Gram négatif sont reconnues par des protéines solubles ou ancrées à la membrane des cellules du corps gras (PGRP-LC, PGRP-LE) qui vont recruter Imd. Imd interagit avec dFADDqui à son tour se lie avec la caspase Dredd qui s’associe avec Relish et le clivera une fois que Relish sera phosphotylé. Relish est le troisième facteur de transcription à domaine Rel de la Drosophile mais qui contrairement à Dorsal et Dif n’est pas séquestré par Cactus mais possède lui-même un domaine inhibiteur avec des motifs ankirines. Relish est phosphorylé par le complexe IKK. Comment IKK est activé et comment cette activation est liée à Imd restent des questions ouvertes. Cependant, il est proposé que IKK est activé par TAB2 et TAK1 qui est probablement activé par DIAP2. Une fois clivé Relish entre dans le noyau est active la transcription de gènes codant pour des peptides antimicrobiens. (d’après Lemaitre et Hoffmann, 2006)
Cellules de corps gras
Bactérie Gram positive Bactérie Gram négative
hémolymphe
levurechampignon
Noyau
?
Cellules de corps gras
Bactérie Gram positive Bactérie Gram négative
hémolymphe
levurechampignon
Noyau
?
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La réponse humorale
Suite à une infection, les cellules du corps gras et les hémocytes vont synthétiser et libérer
dans l’hémolymphe des peptides antimicrobiens dont sept familles ont été caractérisées chez
la Drosophile. Ces peptides peuvent êtres classés en trois groupes selon leur spectre d’action.
Les Défensines sont actives contre les bactéries à Gram positif, alors que les peptides
Diptéricine, Attacine, Cécropine et Drosocine sont principalement actifs contre les bactéries à
Gram négatif et la Drosomycine et la Metchnikowine sont des peptides antifongiques. Ces
peptides antimicrobiens agissent en synergie pour bloquer la croissance des pathogènes en
lysant leur membrane. Selon le microorganisme impliqué dans l’infection, les peptides
antimicrobiens seront différents et adaptés à l’infection. Ceci indique que la Drosophile
possède un système de reconnaissance des pathogènes qui peut faire la différence entre les
différents types de microorganismes. Les mécanismes de reconnaissance des pathogènes chez
la Drosophile reposent sur des protéines reconnaissant des motifs spécifiques des
microorganismes appelées les Pattern Recognition Proteins (PRP). Il existe deux familles de
PRP, les Peptidoglycan Recognition Proteins (PGRP) et les Gram Negative Binding Proteins
(GNBP). Ces PRP sont soit solubles dans l’hémolymphe soit ancrés à la membrane des
cellules du corps gras ou des hémocytes. Ils reconnaissent de manière spécifique certains
types de microorganismes (Gram positifs, négatifs ou champignon) et induisent en retour la
production des peptides antimicrobiens adaptés à l’infection. La réponse humorale est médiée
par deux voies de signalisation de type NFκB, les voies Toll et Imd (Figure 1). La voie de
signalisation Toll/NFκB est activée en réponse soit à une infection fongique soit par des
bactéries à Gram positif, alors que la voie Imd est activée par des bactéries à Gram négatif. La
voie de signalisation Toll est relayée par les facteurs de transcription à domaine Rel appelés
Dorsal et Dif, tandis que la voie de signalisation Imd est relayée par le facteur de
transcription, lui aussi à domaine Rel appelé Relish (pour revue voir(Lemaitre and Hoffmann,
2007)).
15
Figure 2. Les hémocytes de Drosophila melanogasterA. Les plasmatocytes. Cellules de 8 à 10µm de diamètre. Ce sont les phagocytes professionnels de la Drosophile. B. les cellules à cristaux, cellules de 10 à 12µm de diamètre avec des inclusions cristallines de prophénoloxydase. C. les lamellocytes font environ 15 sur 40µm. Ce type cellulaire n’est produit que dans des larves en réponse à un stress immun tel qu’une infection par un parasitoïde. Ils ont pour fonction de former des capsules autour de parasites trop gros pour être phagocytés tel que l’œuf d’une guêpe parasitoïde.Images en microscopie électronique à transmission Meister et Lagueux, 2003Images confocales de Joanna Krzemień avec les anticorps P1 (plasmatocytes), proPO (cellules àcristaux) et α-PS4 (lamellocytes).
A.
B.
C.
P1
proPO
α-PS4
Figure 2. Les hémocytes de Drosophila melanogasterA. Les plasmatocytes. Cellules de 8 à 10µm de diamètre. Ce sont les phagocytes professionnels de la Drosophile. B. les cellules à cristaux, cellules de 10 à 12µm de diamètre avec des inclusions cristallines de prophénoloxydase. C. les lamellocytes font environ 15 sur 40µm. Ce type cellulaire n’est produit que dans des larves en réponse à un stress immun tel qu’une infection par un parasitoïde. Ils ont pour fonction de former des capsules autour de parasites trop gros pour être phagocytés tel que l’œuf d’une guêpe parasitoïde.Images en microscopie électronique à transmission Meister et Lagueux, 2003Images confocales de Joanna Krzemień avec les anticorps P1 (plasmatocytes), proPO (cellules àcristaux) et α-PS4 (lamellocytes).
A.
B.
C.
A.
B.
C.
P1
proPO
α-PS4
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Les hémocytes de Drosophila melanogaster et la réponse immunitaire
cellulaire
Les hémocytes sont les « cellules sanguines » de la Drosophile. Trois types d’hémocytes ont
été décrits chez la Drosophile, en se basant sur leurs structures et leurs fonctions (Figure 2).
Ils sont impliqués dans la réponse immunitaire cellulaire et jouent également un rôle clef au
cours du développement. Il n’existe pas de cellules « sanguines » impliquées dans le transport
d’oxygène chez la Drosophile qui possède un système trachéal qui assure l’oxygénation de ses
tissus.
Les plasmatocytes
Les plasmatocytes sont le type hémocytaire majoritaire (95% de la population d’hémocytes
circulants)(Lanot, Zachary et al. 2001). Ce sont des cellules rondes de 8 à 10 µm de diamètre
(Figure 2). Les plasmatocytes sont les phagocytes professionnels de la Drosophile. Ce sont les
seules cellules responsables de la phagocytose des microorganismes et des corps apoptotiques
(Wood and Jacinto, 2007). Ils sont les seuls à exprimer des récepteurs tels que Eater impliqué
dans la phagocytose des microorganismes (Kocks et al., 2005), ou tels que Croquemort (qui
appartient à la famille des récepteurs CD36 des vertébrés) impliqué dans la reconnaissance
des corps apoptotiques (Franc et al., 1996). L’activité de phagocytose des corps apoptotiques
fait des plasmatocytes des acteurs importants du développement comme, par exemple pour le
remodelage de certains tissus comme le système nerveux central au cours de l’embryogenèse.
Les plasmatocytes sont également impliqués dans la synthèse de la matrice extracellulaire qui
recouvre toutes les surfaces cellulaires en contact avec l’hémolymphe (Fessler et al., 1994).
Ils sécrètent notamment plusieurs protéines structurales de la matrice extracellulaire comme la
Tiggrine (Fogerty et al., 1994), la Peroxydasine (Nelson et al., 1994), la Papiline (Kramerova
et al., 2003) et deux molécules de type Collagène IV, Viking et Cg25C (Freeman et al., 2003 ;
Paladi et Tepass, 2004). Cette activité de synthèse de matrice extracellulaire est également
essentielle au cours du développement car elle participe au remodelage de certains tissus.
Ainsi, la chaine nerveuse ventrale subit une phase de condensation, c'est-à-dire qu’elle
diminue de taille mais augmente sa densité cellulaire. Ce processus est dépendant du dépôt de
matrice extracellulaire par les plasmatocytes.
17
Figure. 3. Cycle de vie de Drosophila melanogaster et Leptopilina boulardi. Encapsulation d’un parasitoïde.A. Une femelle parasitoïde pond un œuf dans une larve (au deuxième stade larvaire) de Drosophile. La larve peut répondre à l’infection en produisant des lamellocytes qui vont neutraliser l’œuf de la guêpe et permettre l’éclosion d’une mouche adulte (flèches bleues). Si l’œuf de guêpe n’est pas neutralisé il va se développer au détriment de l’hôte et donner naissance à une guêpe adulte (flèches rouges).B. Oeuf de guêpe encapsulé dans une larve de Drosophile. La capsule est mélanisée d’où sa couleur noir (flèche blanche).C. Œuf de guêpe en cours d’encapsulation par des lamellocytes. Les lamellocytes forment une capsule constituée de plusieurs couches cellulaires (Carton et al. 2005).
B C
A
Figure. 3. Cycle de vie de Drosophila melanogaster et Leptopilina boulardi. Encapsulation d’un parasitoïde.A. Une femelle parasitoïde pond un œuf dans une larve (au deuxième stade larvaire) de Drosophile. La larve peut répondre à l’infection en produisant des lamellocytes qui vont neutraliser l’œuf de la guêpe et permettre l’éclosion d’une mouche adulte (flèches bleues). Si l’œuf de guêpe n’est pas neutralisé il va se développer au détriment de l’hôte et donner naissance à une guêpe adulte (flèches rouges).B. Oeuf de guêpe encapsulé dans une larve de Drosophile. La capsule est mélanisée d’où sa couleur noir (flèche blanche).C. Œuf de guêpe en cours d’encapsulation par des lamellocytes. Les lamellocytes forment une capsule constituée de plusieurs couches cellulaires (Carton et al. 2005).
B C
A
B C
AA
18
Les plasmatocytes sont également des senseurs de l’intégrité des tissus. En effet, ils peuvent
répondre à des signaux les attirant vers les épithéliums endommagés, soit par une blessure soit
par la présence de tumeurs, selon des mécanismes ressemblant à ceux impliqués dans
l’inflammation chez les vertébrés (Babcock et al., 2008)
De façon très intéressante, les plasmatocytes pourraient également contribuer à une protection
spécifique contre des pathogènes ressemblant à une « mémoire immune ». Des mouches
infectées par des doses sub-létales de Streptococcus pneumoniae ou Beauveria bassiana, sont
par la suite protégées contre toute autre infection secondaire même létale par le même
pathogène. Les plasmatocytes sont des acteurs de cette « mémoire immunitaire » (Pham et al.,
2007). Les mécanismes par lesquels cette « mémoire » est mise en place sont inconnus.
Down Syndrom cell adhesion (Dscam) est un récepteur à domaine immunoglobuline. Environ
18000 isoformes différentes de ce récepteur peuvent être obtenues par épissage alternatif.
Watson et collaborateurs ont montré que les plasmatocytes expriment la plupart des isoformes
de Dscam. De plus, la perte du gène dscam dans les plasmatocytes induit une réduction de
leur capacité à phagocyter (Watson et al., 2005). Dscam joue donc un rôle dans la
phagocytose et la diversité des ses isoformes pourrait apporter une grande diversité de
reconnaissance aux plasmatocytes.
Les cellules à cristaux
Les cellules à cristaux sont des cellules de 10 à 12 µm de diamètre (Figure 2). Elles sont
présentes dans l’embryon et la larve de Drosophile, alors que les adultes en sont dépourvus.
Elles doivent leur nom aux cristaux de prophénoloxydase (proPO) qu’elles renferment en
grande quantité dans leur cytoplasme. Elles sont responsables du processus de mélanisation
qui est une réaction de défense spécifique des insectes. Les cellules à cristaux libèrent leur
contenu dans l’hémolymphe, la proPO est alors clivée en phénoloxydase (PO), sa forme
active, qui à son tour catalyse l’oxydation des phénols en quinones qui polymérisent en
mélanine formant un dépôt noir (Ashida M., 1997; Meister, 2004; Rizki et al., 1985). Les
réactions menant à la mélanisation libèrent des peroxydes et autres produits tels que des
radicaux libres toxiques pour les microorganismes participant ainsi à leur destruction. La
mélanisation est observée dans différents contextes immunitaires. Lors d’une infection par un
parasitoïde (voir le paragraphe sur les lamellocytes) une capsule se forme autour de l’œuf du
parasitoïde. Cette capsule est mélanisée. Les cellules à cristaux participent également au
19
processus de coagulation qui a lieu en plus de la formation de la barrière mélanique lors d’une
blessure (Bidla et al., 2005; Scherfer et al., 2004). Ce processus permet de limiter la perte
d’hémolymphe et de piéger les microorganismes.
Les lamellocytes
Les lamellocytes sont de grandes cellules plates et adhésives d’environ 15µm sur 40µm qui ne
sont produites qu’au stade larvaire (Figure 2). Cependant, ils ne sont pas présents dans des
larves saines et ne sont produits que suite à un stress immun particulier tel que la présence,
dans la larve, d’un corps étranger trop gros pour être phagocyté par les plasmatocytes (Lanot,
Zachary et al. 2001). Un des parasitoïdes naturels (voir définition plus loin) de la Drosophile
est la guêpe Leptopilina boulardi, qui pond ses œufs dans les larves. Suite à cette infection, le
parasitoïde est d’abord reconnu par les plasmatocytes circulants (Russo et al., 1996) puis,
quelques heures plus tard, une grande quantité de lamellocytes est observée en circulation
dans l’hémolymphe (Lanot et al., 2001; Sorrentino et al., 2002). Les lamellocytes vont former
plusieurs couches cellulaires recouvrant l’œuf du parasitoïde et conduire à la formation d’une
capsule. La capsule ainsi formée est mélanisée créant ainsi un environnement cytotoxique qui
va probablement conduire à la destruction du corps étranger (Figure 3 et (Nappi et al., 1995;
Nappi et al., 2000)).
Il existe environ une cinquantaine d’espèces de parasitoïdes naturels des Drosophiles, tous des
hyménoptères appartenant notamment aux genres Leptopilina, Asobara et Ganapsis.
Contrairement aux parasites les parasitoïdes tuent leurs hôtes. L’œuf qu’ils pondent va se
développer aux dépens de la larve hôte et c’est un parasitoïde adulte qui sort de la pupe à la
place de la mouche (Figure 3). Si la larve de Drosophile peut se défendre contre les
parasitoïdes grâce à la production de lamellocytes, les parasitoïdes ont développé différentes
stratégies pour contrecarrer les défenses de la Drosophile. Par exemple, certaines espèces de
parasitoïdes co-injectent avec leurs œufs des particules ressemblant à des particules virales
(VLP : Virus Like Particules) qui codent pour des protéines capables d’empêcher
l’encapsulation en altérant les capacités d’adhérence des lamellocytes. D’autre part, il existe
des espèces de Drosophile (tel que Drosophila pseudoobscura) qui sont incapables de
produire des lamellocytes après une infection. On ne sait pas, à ce jour, quelle est la cause de
cette immunodéficience ni si ces espèces ont d’autres moyens de défense.
20
Au cours de ma thèse je me suis particulièrement intéressé à la réponse immunitaire cellulaire
et au contrôle de la différenciation des hémocytes. Je vais donc plus particulièrement
développer l’étude de l’hématopoïèse, le processus conduisant à la formation des hémocytes.
Puis je m’attarderai sur deux voies de signalisation, les voies JAK/STAT et Toll/NFκB, qui
sont impliquées dans l’hématopoïèse et la réponse immunitaire.
21
L’hématopoïèse chez la Drosophile
Description
L’hématopoïèse chez la Drosophile est moins complexe que chez les vertébrés car il n’existe
que trois types d’hémocytes : les plasmatocytes, les cellules à cristaux et les lamellocytes,
décrits précédemment, qui sont généralement comparés au lignage myéloïde des vertébrés.
Chez la Drosophile l’hématopoïèse se déroule en deux phases, une phase embryonnaire et une
phase larvaire. L’hématopoïèse embryonnaire démarre dans le mésoderme antérieur et donne
naissance à des plasmatocytes et des cellules à cristaux qui vont coloniser l’embryon et se
retrouver, dans la larve, en circulation dans l’hémolymphe ou ancrés sur la face interne de
l’épiderme. Ces derniers forment les îlots sessiles. Les plasmatocytes produits dans l’embryon
sont retrouvés également en circulation dans l’hémolymphe de l’adulte après la
métamorphose (Holz et al., 2003). L’hématopoïèse larvaire a lieu dans un organe spécialisé,
appelé la glande lymphatique, qui est localisé dorsalement le long du tube cardiaque. La
glande lymphatique dans l’embryon et dans la larve, aux deux premiers stades larvaires,
contient des précurseurs hémocytaires appelés prohémocytes. Au troisième et dernier stade
larvaire les prohémocytes se différencient en plasmatocytes et cellules à cristaux. Au début de
la métamorphose, la glande lymphatique va éclater et libérer dans l’hémolymphe les
prohémocytes et les hémocytes différenciés. Les hémocytes produits dans la glande
lymphatique sont retrouvés par la suite dans l’hémolymphe de l’adulte. Aucun organe
hématopoïétique n’a été identifié chez la mouche adulte et les seuls hémocytes différenciés
identifiés à ce stade sont des plasmatocytes. On ne sait pas, à ce jour, comment se maintient
cette population d’hémocytes chez l’adulte.
23
prohemocytes
Stade 11
Stade 17
plasmatocytes cellules à cristaux
Stage 5
cellules à cristaux
Figure. 4. L’hématopoïèse embryonnaire de Drosophila melanogaster.A. Schéma d’un embryon au stade 5, en jaune le territoire du mésoderme. En rouge, la région située à70-80% de la longueur de l’embryon qui est à l’origine des hémocytes embryonnaires. (d’après Holz et al., 2003) B. Embryon au stade 5. Visualisation du territoire d’apparition des prohémocytes par hybridation in situ contre gcm. C,E. Les plasmatocytes sont marqués par la peroxydasin. C. embryons austade 11 les plasmatocytes commencent à migrer. E. au stade 17 les plasmatocytes sont dispersés dans tout l’embryon. D,F. Les cellules à cristaux sont marqués doxA3. D. embryons au stade 11 les cellules àcristaux se différencient dans la région antérieure. F. au stade 17 les cellules à cristaux restent localisées au niveau du proventricule. (B à F d’après le manuscrit de thèse de Laëtitia Bataillé)Dans toutes les images les pôles antérieur (A) et postérieur (P) sont à gauche et à droite respectivement. Le dos (D) est en haut et le ventre (V) en bas.
A
plasmatocytes
A
D
V
P
prohemocytes
Stade 11
Stade 17
plasmatocytes cellules à cristaux
Stage 5
cellules à cristaux
Figure. 4. L’hématopoïèse embryonnaire de Drosophila melanogaster.A. Schéma d’un embryon au stade 5, en jaune le territoire du mésoderme. En rouge, la région située à70-80% de la longueur de l’embryon qui est à l’origine des hémocytes embryonnaires. (d’après Holz et al., 2003) B. Embryon au stade 5. Visualisation du territoire d’apparition des prohémocytes par hybridation in situ contre gcm. C,E. Les plasmatocytes sont marqués par la peroxydasin. C. embryons austade 11 les plasmatocytes commencent à migrer. E. au stade 17 les plasmatocytes sont dispersés dans tout l’embryon. D,F. Les cellules à cristaux sont marqués doxA3. D. embryons au stade 11 les cellules àcristaux se différencient dans la région antérieure. F. au stade 17 les cellules à cristaux restent localisées au niveau du proventricule. (B à F d’après le manuscrit de thèse de Laëtitia Bataillé)Dans toutes les images les pôles antérieur (A) et postérieur (P) sont à gauche et à droite respectivement. Le dos (D) est en haut et le ventre (V) en bas.
A
plasmatocytes
A
D
V
PA
D
V
P
24
L’hématopoïèse embryonnaire
Description
La première vague d’hématopoïèse débute très tôt au cours du développement embryonnaire,
au stade blastoderme (stade 5), où les précurseurs hématopoïétiques sont spécifiés au sein du
mésoderme procéphalique (Figure 4A et (Holz et al., 2003)). Holz et collaborateurs ont
montré, par des expériences de transplantation de cellules isolées, que les hémocytes
embryonnaires sont spécifiés à partir du mésoderme dans un domaine restreint localisés entre
70 et 80% de la longueur de l’embryon (0% correspondant au pôle postérieur)(Figure 4A,B).
Au stade blastoderme, les cellules de ce domaine mésodermique sont, contrairement aux
autres cellules du mésoderme, déjà déterminées à devenir des hémocytes (Holz et al., 2003).
Lors de la gastrulation les prohémocytes vont à la fois s’invaginer, migrer et se différencier en
deux types d’hémocytes : plasmatocytes et cellules à cristaux. Au stade 11, alors que la
bandelette germinative est étendue, les prohémocytes migrent et colonisent principalement la
région postérieure du proencéphale et les segments gnathaux ainsi que le clypeolabrum. La
migration vers le pôle postérieur amène les prohémocytes dans l’extrémité caudal de la
bandelette germinative (segment abdominal 9). La rétraction de la bandelette germinative
entraîne les hémocytes vers le pôle postérieur. Durant les stades suivant (13 et 14) les
hémocytes migrent depuis les extrémités antérieure et postérieure le long de quatre voies
différentes (Fig 4 B, C et E) (Tepass et al., 1994)).
i. ventralement entre l’épiderme et la chaîne nerveuse.
ii. entre la face dorsale de la chaîne nerveuse et le mésoderme.
iii. le long de l’épiderme dorsal.
iv. le long du tube digestif.
A la fin du stade 14, tout l’embryon est colonisé par les hémocytes. Les plasmatocytes
représentent 95% de la population hémocytaire embryonnaire, soit environ 700 cellules et les
cellules à cristaux forment les 5% restant de la population hémocytaire, correspondant à
environ 30 cellules (Figure 4D,F et (Tepass et al., 1994)). Seuls les plasmatocytes vont
coloniser l’embryon alors que les cellules à cristaux migrent peu et forment deux groupes de
cellules localisés au niveau du proventricule (Figure 4 B,D,F et(Lebestky et al., 2000)).
25
A B
Figure 5. Contrôle moléculaire de l’hématopoïèse embryonnaire.A. srp est exprimé dans les prohémocytes et son expression est maintenue dans les hémocytes différenciés. gcm est nécessaire à la différenciation des plasmatocytes. lz est nécessaire à la différenciation de cellules à cristaux. Ush antagonise la différenciation des cellules à cristeaux. B. Dans des embryons au stade 5 tous les prohémocytes expriment gcm. Au stade 7 la premières rangée de cellules va réprimer l’expression de gcm et commence à exprimer lz. 60% de ces cellules vont maintenir l’expression de lz, via une boucle d’autorégulation, et se différencier en cellules à cristaux. Dans les 40% restant la présence résiduelle de Gcm inhibe l’expression de lz et induit la différenciation des cellules en plasmatocytes. D’après Bataillé et al., 2005.
prohémocytes
plasmatocytes
cellules à cristaux
srp
lz
gcm
ush
srp
srp
A B
Figure 5. Contrôle moléculaire de l’hématopoïèse embryonnaire.A. srp est exprimé dans les prohémocytes et son expression est maintenue dans les hémocytes différenciés. gcm est nécessaire à la différenciation des plasmatocytes. lz est nécessaire à la différenciation de cellules à cristaux. Ush antagonise la différenciation des cellules à cristeaux. B. Dans des embryons au stade 5 tous les prohémocytes expriment gcm. Au stade 7 la premières rangée de cellules va réprimer l’expression de gcm et commence à exprimer lz. 60% de ces cellules vont maintenir l’expression de lz, via une boucle d’autorégulation, et se différencier en cellules à cristaux. Dans les 40% restant la présence résiduelle de Gcm inhibe l’expression de lz et induit la différenciation des cellules en plasmatocytes. D’après Bataillé et al., 2005.
prohémocytes
plasmatocytes
cellules à cristaux
srp
lz
gcm
ush
srp
srp
26
Les hémocytes embryonnaires vont réaliser quatre cycles de mitose au cours de
l’embryogenèse. Au cours des stades larvaires, cinq cycles de division seront accomplis (Holz
et al., 2003) et vont conduire à la formation d’environ 3000 à 5000 hémocytes d’origine
embryonnaire qui sont principalement composés de plasmatocytes. Les hémocytes d’origine
embryonnaires sont également retrouvés chez l’adulte. La glande lymphatique ne contribue
pas à la production des hémocytes présents dans l’hémolymphe de la larve car elle ne devient
mature qu’à la fin du troisième stade larvaire et éclate au début de la métamorphose (Holz et
al., 2003; Lanot et al., 2001). La population d’hémocytes circulants dans l’hémolymphe ou
composants les îlots sessiles est donc entièrement composée d’hémocytes issus de
l’hématopoïèse embryonnaire.
Contrôles moléculaires
Le facteur de transcription Serpent (Srp), qui appartient à la famille des facteurs de type
GATA est nécessaire à la formation des hémocytes embryonnaires (Lebestky et al., 2000;
Rehorn et al., 1996). Srp est requis tout au long de l’hématopoïèse embryonnaire (Lebestky et
al., 2000) et il régule l’expression de différent gènes de lignage hémocytaire en coopération
avec différents cofacteurs (Figure 5A et (Waltzer et al., 2002; Waltzer et al., 2003).
Trois autres facteurs de transcription jouent un rôle clef dans la spécification de l’identité des
hémocytes (Figure5A). Glial Cell Missing (GCM) et GCM2 sont nécessaires à la spécification
des plasmatocytes (Alfonso and Jones, 2002; Bernardoni et al., 1997; Lebestky et al., 2000).
La différentiation des cellules à cristaux requiert l’expression du facteur de transcription
Lozenge (Lz), une protéine à domaine Runt qui est l’homologue des protéines RUNX des
mammifères (Lebestky et al., 2000; Waltzer et al., 2003), deBruijn et Speck 2004. Enfin, U-
shaped (Ush), qui est une protéine à doigt de zinc de la famille des protéines Friend Of GATA
(FOG) connus pour réguler l’activité des facteurs GATA chez les mammifères (pour revue
(Cantor and Orkin, 2005)), antagonise la formation des cellules à cristaux (Fossett et al.,
2001). Les facteurs de transcription appartenant à ces trois familles, GATA, FOG et Runx
sont également impliqués chez les vertébrés dans la spécification de différents lignages
myéloïdes (Evans and Banerjee, 2003). La succession des événements précoces amenant à la
détermination du lignage hémocytaire et au choix entre les destins cellules à cristaux et
plasmatocytes a été précisément décrite par Bataillé et collaborateurs (Bataille et al., 2005). Il
apparaît que gcm est initialement exprimé dans tous les prohémocytes, mais il est rapidement
réprimé dans la rangée de cellules la plus antérieure qui commencent alors à exprimer lz
27
(Figure 5B). La population de cellules exprimant lz est une population mixte. 60% d’entre
elles vont maintenir, grâce à une boucle d’autorégulation, l’expression de lz et vont se
différencier en cellules à cristaux. Dans les 40% des cellules restantes la présence résiduelle
de GCM va interférer avec l’expression de lz ce qui induit leur différenciation en
plasmatocytes. En absence de gcm/gcm2 la population de cellules exprimant lz augmente et
toutes les cellules lz+ se différencient en cellules à cristaux. Ces résultats indiquent que les
prohémocytes sont des progéniteurs bipotentiels et que la balance entre l’expression de lz et
gcm/gcm2 est un point clef dans le contrôle de la spécification des cellules à cristaux.
Le récepteur tyrosine kinase PVR (PDGF et VEGF Receptor), et ses trois ligands (PDGF et
VEGF related factor 1 PVF1, PVF2 et PVF3) jouent un rôle dans la survie de hémocytes
embryonnaires et dans leur migration (Bruckner et al., 2004; Stramer et al., 2005; Wood and
Jacinto, 2007). pvr est exprimé dans les plasmatocytes embryonnaires (Heino et al., 2001).
Dans les embryons mutants pour pvr le nombre d’hémocytes est significativement réduit et un
grand nombre d’hémocytes entrent en apoptose. Ce phénotype peut être sauvé en exprimant
spécifiquement dans les hémocytes p35, l’inhibiteur des caspases, indiquant que PVR est
requis pour la survie des plasmatocytes (Bruckner et al., 2004). Cependant, si les signaux
impliqués dans leur survie sont connus, les signaux gouvernants leur prolifération restent
encore inconnus.
PVR est également impliqué dans la migration des hémocytes embryonnaires. En effet, la
migration ventrale des hémocytes le long de l’épiderme et de la chaîne nerveuse est
dépendante de l’expression de pvr dans les hémocytes et de l’expression de pvf2 et pvf3 dans
des domaines temporellement et spatialement différents dans la chaîne nerveuse. PVF2 et
PVF3 fonctionnent comme des chémoatractants qui attirent les hémocytes le long du Système
Nerveux Central (SNC) (Cho et al., 2002; Wood and Jacinto, 2007).
Les hémocytes peuvent également migrer vers une blessure selon des mécanismes rappelant
ceux de l’inflammation chez les vertébrés. Les plasmatocytes changent alors de forme et
émettent des extensions cytoplasmiques résultant du remodelage du réseau d’actine. Rac
(appartenant à la famille des GTPases Rho) est requis pour la formation des extensions
cellulaires nécessaire à leur migration (Stramer et al., 2005 ; Paladi, 2004). Il a également été
montré que Rho, CDC42 et le Phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K) sont spécifiquement
requis pour la migration des plasmatocytes en réponse à une blessure, mais ils ne sont pas
requis pour leur migration au cours du développement embryonnaire (Stramer et al., 2005).
Ainsi, la migration des plasmatocytes soit vers une blessure soit le long des routes de
28
migration au cours de l’embryogenèse impliquent des mécanismes moléculaires clairement
distincts.
Hématopoïèse larvaire
Ontogenèse de la glande lymphatique
L’hématopoïèse larvaire a lieu dans un organe spécialisé appelé la glande lymphatique
localisée dorsalement le long de la partie antérieure du tube cardiaque (Figure 6B). La
formation de la glande lymphatique commence au cours de l’embryogenèse. Elle n’est pas
issue du mésoderme de tête comme les hémocytes embryonnaires, mais de quelques cellules
mésodermiques se trouvant, au stade blastoderme, entre 50 et 53% (0% étant le pôle
postérieur) de la longueur de l’embryon (Figure6A et (Holz et al., 2003)). Crozatier et
collaborateurs ont montré qu’au stade 11 les cellules précurseurs de la glande lymphatique,
correspondent à deux groupes de cellules mésodermiques localisés dorsalement au niveau des
deuxième et troisième segments thoraciques (Figure 6C (Crozatier et al., 2004). Ces deux
groupes de cellules expriment Collier (Col), un facteur transcription de la famille des facteurs
COE, orthologue de Early B-cell Factor de vertébrés (Dubois and Vincent, 2001). Col est le
marqueur le plus précoce connu à ce jour de la glande lymphatique. Par ailleurs, Mandal et
collaborateurs ont montré, en suivant l’expression du facteur de transcription Odd-skipped
(Odd), que les précurseurs de la glande lymphatique au stade 15 consistent en trois groupes de
cellules dans les trois segments thoraciques, dont un groupe supplémentaire présent dans le
premier segment thoracique qui n’est pas marqué par Collier (Mandal et al., 2004). Les trois
groupes de cellules vont ensuite fusionner et former deux lobes localisés de part et d’autre du
tube cardiaque qui sont appelés lobes primaires ou antérieurs (Figure 6 C-F). À la fin de
l’embryogenèse, la glande lymphatique est donc composée de deux lobes ayant chacun
environ vingt cellules. Toutes les cellules de la glande lymphatique expriment srp et
maintiennent son expression au cours du développement larvaire (Jung et al., 2005). Par
contre, l’expression de collier va s’éteindre dans la majorité des cellules de la glande
lymphatique et ne va être maintenue que dans quelques cellules (deux ou trois par lobe)
localisées le plus postérieurement, définissant ainsi une sous population de cellules qu’on
29
G H
Stade 11 Stade 12/13
Stade 14 Stade 16 Col
Figure 6. Ontogenèse de la glande lymphatiqueA. Schéma d’un embryon au stade 5, en jaune le territoire du mésoderme. En rouge, la région située à 50-55% de la longueur de l’embryon qui est à l’origine de la glande lymphatique (d’après Holz et al., 2003) B. Schéma d’un embryon à la fin de l’embryogenèse (stade 17). La glande lymphatique est localisée (cercle bleu) dorsalement de part et d’autre du tube cardiaque. (d’après Bate et Martinez Aris, 1993) C-H. Expression de col dans la glande lymphatique. C. L’expression de col est détectée, à partir du stade 11, dans deux groupes de cellules dans le mésoderme dorsal des seqments thoraciques T2 et T3 (flèches noires). D, E. Entre les stades 12 et 13, les deux groupes de cellules, exprimant col, se rapprochent et fusionnent pour former les deux lobes de la glande lymphatique. F-H. Aux stades 14 à 16, l’expression de col se restreint progressivement et ne marque plus que le PSC (têtes de flèche noires). (Crozatier et al.. 2004).
A B
C
F
D E
A
D
V
P
G H
Stade 11 Stade 12/13
Stade 14 Stade 16 Col
Figure 6. Ontogenèse de la glande lymphatiqueA. Schéma d’un embryon au stade 5, en jaune le territoire du mésoderme. En rouge, la région située à 50-55% de la longueur de l’embryon qui est à l’origine de la glande lymphatique (d’après Holz et al., 2003) B. Schéma d’un embryon à la fin de l’embryogenèse (stade 17). La glande lymphatique est localisée (cercle bleu) dorsalement de part et d’autre du tube cardiaque. (d’après Bate et Martinez Aris, 1993) C-H. Expression de col dans la glande lymphatique. C. L’expression de col est détectée, à partir du stade 11, dans deux groupes de cellules dans le mésoderme dorsal des seqments thoraciques T2 et T3 (flèches noires). D, E. Entre les stades 12 et 13, les deux groupes de cellules, exprimant col, se rapprochent et fusionnent pour former les deux lobes de la glande lymphatique. F-H. Aux stades 14 à 16, l’expression de col se restreint progressivement et ne marque plus que le PSC (têtes de flèche noires). (Crozatier et al.. 2004).
A B
C
F
D E
A
D
V
PA
D
V
P
30
appelle Posterior Signalling Centre (PSC) (Figure 6F et (Lebestky et al., 2003)). Au cours du
développement larvaire, les cellules de la glande lymphatique vont proliférer et au deuxième
stade larvaire les deux lobes contiennent environ 200 cellules chacun. A la fin du deuxième
stade larvaire des lobes secondaires ou postérieurs se forment et sont localisés plus
postérieurement le long du tube cardiaque. Au troisième stade larvaire, la glande lymphatique
est composée des deux lobes antérieurs ou primaires contenant chacun environ 2000 à 3000
cellules, et d’une série de paires de lobes postérieurs dont le nombre peut varier de trois à sept
(Figure 7A,B). Le PSC uniquement présent dans chaque lobe antérieur est constitué de trente
à quarante cellules (Figure 7D). La glande lymphatique est entourée par une couche de
matrice extracellulaire qui au troisième stade larvaire forme un réseau complexe à travers les
lobes antérieurs (Jung et al., 2005) Observées en Nomarsky, les cellules médullaires des lobes
antérieurs ont un aspect lisse et établissent de nombreux contacts cellulaires entre elles, tandis
que les cellules localisées à la périphérie de la glande lymphatique ont un aspect plus
granuleux et les contacts cellulaires sont plus rares. Ainsi, en se basant sur leur morphologie,
deux zones peuvent être distinguées dans les lobes antérieurs : une Zone Medullaire (ZM) et
une Zone Corticale (ZC) (Figure 7C et (Jung et al., 2005)). Ces deux zones diffèrent
également sur le plan de la prolifération. En effet, au troisième stade larvaire la prolifération
est active dans la ZC mais pas dans la ZM où on trouve peu de cellules en division (Jung et
al., 2005). Les lobes primaires sont donc composés de trois zones distinctes : la ZM, la ZC et
le PSC qui est en contact avec la ZM (Figure 7D). En revanche, les lobes secondaires sont
structurellement homogènes et la prolifération est toujours active dans l’ensemble des cellules
les composant.
La glande lymphatique persiste jusqu’à la fin du développement larvaire. Cinq heures après la
pupaison les lobes primaires commencent à relâcher des hémocytes dans l’hémolymphe.
Douze heures après le début de la métamorphose les lobes antérieurs ne contiennent presque
plus de cellules et les lobes postérieurs commencent à leur tour à éclater. Quinze heures après
la pupaison la glande lymphatique a libéré tous les hémocytes dans l’hémolymphe. Les
hémocytes de la glande lymphatique sont ensuite retrouvés en circulation dans l’hémolymphe
de l’adulte.
31
Figure 7. Morphologie de la glande lymphatique au troisième stade larvaire.A. Localisation de la glande lymphatique dans la larve. Vue dorsale d’une larve au troisième stade. Les lobes antérieurs sont nécrosés et apparaissent noirs (M. Crozatier, non publié) B. Glande lymphatique vue en microscopie électronique àbalayage. La flèche noire montre un lobe antérieur, les têtes de flèches blanches montrent des lobes postérieurs. D’après Meister and Lagueux 2003. C. Glande lymphatique vue en Nomarsky. Les lobes antérieurs et postérieurs sont indiqués. Les pointillés blanc délimitent la zone médullaire (ZM) qui a un aspect lisse. La zone corticale (ZC) a un aspect rugueux. D. Image confocale d’une glande lymphatique (image de Joanna Krzemień) où la ZM est marquée par dome-gal4/UASmCD8GFP (vert), la ZC contient des cellules à cristaux marquées par à un anticorps contre proPO (cellules àcristaux, rouge), le PSC est marqué par Col (bleu).
ZM
ZC
Lobes antérieurs Lobes postérieursLobes antérieursLobes postérieurs
ZM
CZ
PSC
A B
C D
Figure 7. Morphologie de la glande lymphatique au troisième stade larvaire.A. Localisation de la glande lymphatique dans la larve. Vue dorsale d’une larve au troisième stade. Les lobes antérieurs sont nécrosés et apparaissent noirs (M. Crozatier, non publié) B. Glande lymphatique vue en microscopie électronique àbalayage. La flèche noire montre un lobe antérieur, les têtes de flèches blanches montrent des lobes postérieurs. D’après Meister and Lagueux 2003. C. Glande lymphatique vue en Nomarsky. Les lobes antérieurs et postérieurs sont indiqués. Les pointillés blanc délimitent la zone médullaire (ZM) qui a un aspect lisse. La zone corticale (ZC) a un aspect rugueux. D. Image confocale d’une glande lymphatique (image de Joanna Krzemień) où la ZM est marquée par dome-gal4/UASmCD8GFP (vert), la ZC contient des cellules à cristaux marquées par à un anticorps contre proPO (cellules àcristaux, rouge), le PSC est marqué par Col (bleu).
ZM
ZC
Lobes antérieurs Lobes postérieursLobes antérieursLobes postérieurs
ZM
PSC
CZ
A B
C D
32
Vous avez dit hémangioblaste ?
Il a été proposé que, dans l’embryogenèse des vertébrés, les cellules sanguines et les cellules
endothéliales partagent un précurseur commun appellé hémangioblaste (Medvinsky and
Dzierzak, 1996), 1996 ; Kennedy et al., 1997 ; Huber et al., 2004). Toutefois, même s’il existe
des relations évidentes entre les progéniteurs des cellules sanguines et des cellules
endothéliales, l’existence de l’hémangioblaste reste très controversée (Jaffredo et al., 2005 ;
Bollerot et al., 2005 ; Ueno and Weissman, 2006). Chez la Drosophile, une analyse clonale
des étapes précoces de l’ontogenèse de la glande lymphatique indique que les cardioblastes
composant le tube cardiaque et les cellules de la glande lymphatique pourraient résulter de la
division d’un progéniteur commun que les auteurs ont proposé d’appeler hémangioblaste
(Mandal et al., 2004) Ces résultats relancent le débat sur l’existence et la conservation au
cours de l’évolution de l’hémangioblaste.
Zones Médullaire et Corticale : les hémocytes de la glande lymphatique
L’organisation structurale de la glande lymphatique, en trois zones distinctes, soulève la
question de la signification fonctionnelle des différentes zones pour les hémocytes et leur
différenciation. Les cellules de la ZM expriment domeless (dome) qui code pour le récepteur
de la voie de signalisation JAK/STAT chez la Drosophile, ce qui peut être visualisé grâce au
transgène pilote dome-Gal4 (pG125, Figure 7D (Bourbon et al., 2002; Jung et al., 2005)). Les
cellules de la ZM sont des hémocytes indifférenciés ou prohémocytes, qui ont un diamètre de
4 à 6 µm, un ratio nucléoplasmique élevé et n’expriment aucun des marqueurs de
différenciation des hémocytes. A l’inverse, les cellules de la ZC, correspondant aux
hémocytes différenciés, n’expriment pas dome mais des marqueurs de différenciation (Jung et
al., 2005). Jung et collaborateurs ont montré, par des expériences de lignage cellulaire, que les
cellules de la ZC sont issues de la ZM. En effet, au deuxième stade larvaire la glande
lymphatique est composée uniquement de précurseurs qui expriment dome. La ZC se forme
progressivement, à partir du début du troisième stade larvaire, et est composée d’hémocytes
différenciés (Figure 8 et (Jung et al., 2005)). Les mécanismes qui contrôlent la différenciation
des hémocytes et leur sortie de la ZM reste encore à élucider.
33
Figure 8. Représentation schématique de la morphologie de la glande lymphatique en contexte physiologique et après infection par un parasitoïde.L’ontogenèse de la glande lymphatique débute lors de l’embryogenèse. La glande lymphatique va croître au cours du développement larvaire puis éclater à la métamorphose en relâchant les hémocytes dans l’hémolymphe. Des marqueurs permettent de suivre les modifications morphologiques de la glande lymphatique au cours du développement. Le marqueur le plus précoce marquant la glande lymphatique est le facteur de transcription Collier (Col, bleu). Dans l’embryon Col est exprimés dans toutes la glande lymphatique puis son expression est restreinte au PSC au stade 16 (bleu). L’expression de dome (vert) débute au deuxième stade larvaire. Dans le PSC anpt et hh sont exprimés à partir du deuxième stade larvaire. Au troisième stade larvaire la ZC comprend des hémocytes différenciés (rouge). Puis à la métamorphose la glande lymphatique éclate. En cas d’infection par un parasitoïde des lamellocytes se différencient massivement. 24h après infection; la glande lymphatique est remplie de lamellocytes. 36h après infection elle éclate et libère les hémocytes dans l’hémolymphe.
Développement embryonnaire
Développement larvaire
22h 46h 70hstade L1 stade L2 stade L3
Métamorphose
Col ColAntp
Col, Hh, Antp Col, Hh, Antp
Dome Dome
P1
Pxn, ProPO, DoxA3, Lz
120h
0h
24h 36h
Infection par un parasitoïde
tube cardiaque
cellules péricardiaques
prohémocytes
hémocytes différenciés (plasmatocytes ou cellules à cristaux)
lamellocytes
PSC PSC PSC
ZMZM
ZC Lobes postérieurs
stade 16stade 14
Figure 8. Représentation schématique de la morphologie de la glande lymphatique en contexte physiologique et après infection par un parasitoïde.L’ontogenèse de la glande lymphatique débute lors de l’embryogenèse. La glande lymphatique va croître au cours du développement larvaire puis éclater à la métamorphose en relâchant les hémocytes dans l’hémolymphe. Des marqueurs permettent de suivre les modifications morphologiques de la glande lymphatique au cours du développement. Le marqueur le plus précoce marquant la glande lymphatique est le facteur de transcription Collier (Col, bleu). Dans l’embryon Col est exprimés dans toutes la glande lymphatique puis son expression est restreinte au PSC au stade 16 (bleu). L’expression de dome (vert) débute au deuxième stade larvaire. Dans le PSC anpt et hh sont exprimés à partir du deuxième stade larvaire. Au troisième stade larvaire la ZC comprend des hémocytes différenciés (rouge). Puis à la métamorphose la glande lymphatique éclate. En cas d’infection par un parasitoïde des lamellocytes se différencient massivement. 24h après infection; la glande lymphatique est remplie de lamellocytes. 36h après infection elle éclate et libère les hémocytes dans l’hémolymphe.
Développement embryonnaire
Développement larvaire
22h 46h 70hstade L1 stade L2 stade L3
Métamorphose
Col ColAntp
Col, Hh, Antp Col, Hh, Antp
Dome Dome
P1
Pxn, ProPO, DoxA3, Lz
stade 16stade 14120h
ZMZM
ZC Lobes postérieurs
0h
24h 36h
Infection par un parasitoïde
tube cardiaque
cellules péricardiaques
prohémocytes
hémocytes différenciés (plasmatocytes ou cellules à cristaux)
lamellocytes
PSC PSC PSC
34
Les cellules du PSC, maintiennent l’expression de collier, n’expriment jamais dome ni aucun
des marqueurs de différenciation des hémocytes. Les cellules du PSC sont une population de
cellules à part qui ne participent à aucun des lignages hémocytaires. Le rôle du PSC dans
l’hématopoïèse larvaire restait encore à élucider.
Dans les lobes secondaires très peu de cellules se différencient avant la métamorphose. La
majorité des cellules sont des prohémocytes qui expriment dome-Gal4. Certaines cellules des
lobes postétieurs expriment collier mais n’ont pas de localisation particulière et sont
distribuées de manière sporadique à l’intérieur des lobes secondaires. Comme dans les lobes
primaires, les cellules exprimant collier et celles exprimant dome-Gal4 sont deux populations
mutuellement exclusives dans les lobes postérieurs.
Au moment où la glande lymphatique va éclater, au début de la métamorphose, elle possède
toujours une ZM, une ZC et le PSC. Ainsi, elle relâche dans l’hémolymphe des hémocytes
différenciés mais aussi des prohémocytes.
Cas particulier des lamellocytes et de la réponse au parasitisme
Comme décrit plus haut, lors d’une infection par un parasitoïde tel que la guêpe Leptopilina
boulardi, la larve de Drosophile peut se défendre en produisant des lamellocytes dans la
glande lymphatique. L’infection par le parasitoïde a lieu au cours du second stade larvaire
(Figure3A). Les lamellocytes se différencient dans les lobes antérieurs puis dans les lobes
postérieurs. La ZM, visualisée par l’expression de la GFP sous le contrôle du pilote dome-
Gal4, disparaît environ 24 heures après l’infection et les prohémocytes se différencient
majoritairement en lamellocytes (Krzemien et al., 2007). Entre 24 et 36 heures après
l’infection, c'est-à-dire au début du troisième stade larvaire, la glande lymphatique éclate pour
libérer ses hémocytes dans l’hémolymphe (Figure 8). Les lamellocytes relâchés dans
l’hémolymphe vont alors s’agglutiner autour de l’œuf de guêpe, former une capsule et
neutraliser son développement.
L’infection par un parasitoïde est donc un évènement capable de modifier le programme de
différenciation des hémocytes de la glande lymphatique mettant en évidence une grande
plasticité des hémocytes.
35
Fig. 9. Représentation schématique des protéines EBF de souris et Col de Drosophile. Col/DmCOE et EBF/MmCOE1 définissent une nouvelle famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN (DBD) uniquement présent dans cette famille de protéine, représentéen rouge. Le motif Hélice Boucle Hélice (Helix Loop Helix : HLH) et domaine Immunoglobuline-like/ Plexin/ Transcription factor (IPT) (jaune) sont impliqués dans la dimerisation. TAD pour le domaine transactivateur. Col et EBF présentent une forte homologie de séquence (d’après Daburon et al. 2008).
86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques
Fig. 9. Représentation schématique des protéines EBF de souris et Col de Drosophile. Col/DmCOE et EBF/MmCOE1 définissent une nouvelle famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN (DBD) uniquement présent dans cette famille de protéine, représentéen rouge. Le motif Hélice Boucle Hélice (Helix Loop Helix : HLH) et domaine Immunoglobuline-like/ Plexin/ Transcription factor (IPT) (jaune) sont impliqués dans la dimerisation. TAD pour le domaine transactivateur. Col et EBF présentent une forte homologie de séquence (d’après Daburon et al. 2008).
86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques86% 89% Pourcentage d’acide aminés identiques
36
Collier
collier (col) code pour un facteur de transcription appartenant à la famille COE (Collier/
Olfactory-1/ Early B cell Factor), et est l’orthologue Drosophile de Early B-cell Factor (EBF)
des vertébrés (Daburon et al., 2008; Dubois and Vincent, 2001). Col et EBF définissent une
nouvelle famille de facteurs de transcription caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN
uniquement présent dans cette famille de protéines, associé à un motif Hélice Boucle Hélice
(Helix Loop Helix : HLH) et un domaine Immunoglobuline-like/ Plexin/ Transcription factor
(IPT) impliqué dans la dimerisation. La comparaison des séquences Col et EBF montre que
ces trois domaines protéiques sont extrêmement bien conservés au cours de l’évolution
(Daburon et al., 2008; Dubois and Vincent, 2001). Col et EBF se lient à l’ADN sous forme
d’homodimères (Figure 9 et (Daburon et al., 2008)). Tandis qu’il existe un seul gène chez la
Drosophile, quatre membres de cette famille sont présent chez les vertébrés.
col est exprimé dans de nombreux tissus à la fois dans l’embryon et dans la larve. Il est
exprimé dans un segment de la tête de l’embryon de Drosophile où son rôle a été initialement
caractérisé (Crozatier et al., 1996). Il est également exprimé dans un muscle embryonnaire
somatique, le muscle DA3, dans trois neurones multidendritiques du système nerveux
périphérique et dans de nombreux neurones du système nerveux central. Différentes analyses
fonctionnelles de col ont été réalisées dans les différents tissus (Crozatier et al., 1996;
Crozatier et al., 1999; Crozatier and Vincent, 1999).
Au stade larvaire, col est également exprimé dans différents neurones du système nerveux
central, mais aussi dans le disque imaginal d’aile et dans le PSC de la glande lymphatique.
Son rôle dans les neurones larvaires n’a pas été analysé tandis que sa fonction dans la mise en
place de la partie centrale de l’aile en réponse à la signalisation Hedgehog (Hh) a été
caractérisée en détail. (Crozatier et al., 2002).
L’expression de col dans les cellules du PSC soulève la question de sa fonction dans
l’hématopoïèse et offre un point d’entrée pour étudier la fonction des cellules du PSC.
Le PSC et le contrôle de l’hématopoïèse larvaire
Lebestky et collaborateurs ont initialement décrit le PSC comme étant un groupe de cellules,
situées postérieurement dans les lobes antérieurs, qui expriment Serrate (Ser) un ligand de la
voie de signalisation Notch (N). Serrate est exprimé non seulement dans les cellules du PSC
37
Larves saines
PSCCol
plasmatocytes cellules à critaux
prohémocytes
PSCCol
lamellocytesL
S2
S1
prohémocytes
plasmatocytes en circulationœuf de guêpe
Infection par un parasitoïde
Figure10. Modèle pour le rôle du PSC dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire.Les cellules du PSC sont capables de percevoir un signal de danger, appelé S1, probablement émis par les plasmatocytes en circulation suite à une infection par un parasitoïdes. Le PSC stimulé par le signal S1 émet un second signal, dit S2, qui pousse les prohémocytes à se différencier en lamellocytes D’après Crozatier et al., 2004.
Larves saines
PSCCol
plasmatocytes cellules à critaux
prohémocytes
PSCCol
lamellocytesL
S2
S1
prohémocytes
plasmatocytes en circulationœuf de guêpe
Infection par un parasitoïde
Figure10. Modèle pour le rôle du PSC dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire.Les cellules du PSC sont capables de percevoir un signal de danger, appelé S1, probablement émis par les plasmatocytes en circulation suite à une infection par un parasitoïdes. Le PSC stimulé par le signal S1 émet un second signal, dit S2, qui pousse les prohémocytes à se différencier en lamellocytes D’après Crozatier et al., 2004.
38
mais aussi dans des cellules dispersées dans tout le reste du lobe antérieur (Lebestky et al.,
2003). La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l’évolution et est impliquée
dans la différenciation de nombreux types cellulaires ; elle agit via des interactions cellulaires
directes (pour revue Bolo et al., 2007 ; Carlson et al., 2007 ; Fiuza et al., 2007 ; Nichols et al.,
2007). Dans la glande lymphatique, la voie de signalisation Notch est nécessaire à la
différenciation des cellules à cristaux. En effet, dans un mutant thermosensible, Nts, à
température non permissive les cellules à cristaux ne se différencient pas dans la glande
lymphatique (Duvic et al., 2002). En se basant sur ces données et l’expression localisée de
Ser, Lebetsky et collaborateurs ont proposé que les cellules du PSC exprimant Ser induisent la
différenciation des cellules à cristaux et ont ainsi appelé ce groupe de cellules Posterior
Signalling Centre. En 2004, Crozatier et collaborateurs ont montré que collier est exprimé
dans le PSC. Dans un mutant col le PSC est absent indiquant que Collier est nécessaire à sa
formation. Cependant, dans un mutant col qui a perdu l’expression de Ser dans le PSC, les
cellules à cristaux sont capables de se différencier. Ces résultats indiquent qu’en fait ce sont
les cellules dispersées dans la glande lymphatique qui expriment ser qui sont nécessaires à la
différenciation des cellules à cristaux et non la PSC. Ces résultats reposent la question du rôle
du PSC.
Les mutants col présentent des défauts hématopoïétiques. En effet, ils sont incapables de
former des lamellocytes suite à une infection par un parasitoïde (Crozatier et al., 2004).
Cependant, les cellules du PSC ne participent pas au lignage des lamellocytes. Un modèle a
été proposé selon lequel, les cellules du PSC sont capables de percevoir un signal de danger,
appelé S1, probablement émis par les plasmatocytes en circulation suite à une infection par un
parasitoïdes. Le PSC stimulé par le signal S1 émet un second signal, dit S2, qui induit les
prohémocytes à se différencier en lamellocytes (Figure10 et (Crozatier et al., 2004)).
L’ensemble de ces résultats pose la question des voies de signalisation impliquées dans cette
réponse immunitaire.
Différenciation des lamellocytes et voies de signalisation.
L’infection par un parasite n’est pas la seule condition qui déclenche la formation de
lamellocytes. Dans la littérature, il a été rapporté que différents mutants produisent des
lamellocytes en absence d’infection par un parasitoïde. Hopscotch (Hop) est la seule Janus
Kinase (JAK) du génome de la Drosophile. Dans le mutant hopTum-L, correspondant à une
39
activation constitutive de la kinase, on observe une spectaculaire surprolifération des
hémocytes et une différenciation de lamellocytes en absence de parasitisme. A la température
restrictive on observe des lamellocytes dans la glande lymphatique dès le deuxième stade
larvaire. Dans l’hémolymphe les lamellocytes représentent jusqu’à 50% des hémocytes
circulant (Agaisse and Perrimon, 2004; Hanratty and Dearolf, 1993; Harrison et al., 1995).
Toll10B est un mutant gain de fonction d’un des récepteurs Toll de la Drosophile. Dans ce
mutant on observe aussi une formation anormale de lamellocytes en absence de
parasitisme(Qiu et al., 1998). Le même phénotype est également observé dans un mutant perte
de fonction pour cactus, l’orthologue de IκB des vertébrés.
Ces observations suggèrent que les voies de signalisation JAK/STAT et Toll/NFκB sont
potentiellement impliquées dans l’hématopoïèse larvaire.
40
La voie de signalisation JAK/STAT
Description et régulation
La voie de signalisation Janus Kinase (JAK)/ Signal Transducer and Activator of
Transcription (STAT) est une voie de signalisation très conservée au cours de l’évolution.
Elle fut d’abord identifiée chez les vertébrés pour la transduction de signal activée par les
cytokines.
Les composants majeurs de cette voie de signalisation sont les kinases JAK, dont quatre à ce
jour ont été identifiées chez les mammifères. La première identification d’une JAK remonte à
1989 (Wilks et al.1989) appelé alors « juste une autre kinase » (« Just Another Kinase »).
Rebaptisée Janus Kinase (JAK), comme le dieu romain, car elle possède un domaine kinase et
un domaine « kinase-like » presqu’identique qui régule le premier. Les facteurs de
transcription STAT, dont sept ont été identifiés à ce jour chez les mammifères, activent la
transcription des gènes cibles de la voie. Les récepteurs associés à la voie de signalisation
JAK/STAT sont les récepteurs des cytokines de classe I (ou hématopoIétines) et de classe II
(ou interferon). Ces récepteurs possèdent un domaine transmembranaire, leur partie
extracellulaire lie le ligand (cytokine) et leur partie intracellulaire sert à l’interaction avec
JAK et STAT. La fixation du ligand sur les récepteurs qui sont associés aux JAK, entraîne
l’activation de ces dernières qui vont se trans-phosphoryler et phosphoryler les récepteurs qui
les ont recrutés (Figure 11A). La phosphorylation des récepteurs crée un site de fixation pour
le domaine SH2 de STAT qui est présent dans le cytoplasme sous forme de monomères
inactifs. Une fois recruté par les complexes Récepteur/JAK, STAT est à son tour phosphorylé.
Il va ensuite former des dimères qui vont transloquer dans le noyau et se fixer sur une
séquence palindromique présente dans les promoteurs des gènes cibles de la voie.
Chez la Drosophile, la voie de signalisation JAK/STAT est moins complexe que chez les
vertébrés car une seule JAK, est codée dans le génome : Hopscotch (Hop) (Binari et
Perrimon, 1994), ainsi qu’un seul facteur de transcription appelé STAT92E ou Marelle (Hou
et al., 1996 ; Yan et al., 1996). Domeless (Dome) (Brown et al., 2001 ; Chen et al., 2002) est
le seul récepteur identifié et il appartient à la famille des récepteurs des cytokines de classe I
(Figure 11B).
41
DrosophileVertébrés
ZIMPPIAS1, 3, xα, xβ, yPIAS
SOCS36E, SOCS44A, SOCS16D
SOCS 1à7, CISSOCS
STAT92ESTAT1-4, 5A, 5B, 6STAT
HopJAK1-3, Tyk2JAK kinases
Domeless
Latran?
Récepteurs des cytokines de classe I et II
Récepteurs
Upd1, 2, 3CytokinesLigands
DrosophileVertébrés
ZIMPPIAS1, 3, xα, xβ, yPIAS
SOCS36E, SOCS44A, SOCS16D
SOCS 1à7, CISSOCS
STAT92ESTAT1-4, 5A, 5B, 6STAT
HopJAK1-3, Tyk2JAK kinases
Domeless
Latran?
Récepteurs des cytokines de classe I et II
Récepteurs
Upd1, 2, 3CytokinesLigands
Figure 11. La voie de signalisation JAK/STATA. Les récepteurs en gris sont associés aux kinases JAK; la fixation du ligand sur les récepteurs induit l’activation des JAK qui se trans-phosphorylent et phosphorylent les récepteurs créant un site d’ancrage pour STAT. STAT, qui est présent dans le cytoplasme, se fixe sur le récepteur où il est phosphorylé par les JAKs. STAT phosphorylé se dimèrise et va dans le noyau où il active l’expression de ces gènes cibles. Certain gènes cibles codent pour des inhibiteurs de la voie de signalisation JAK/STAT, tels que les SOCS, permettant d’établir une boucle de rétrocontrôle négaitf (d’après Arbouzova et Zeidler, 2006). B. Tableau indiquant les différents composants de la voie de signalisation JAK/STAT chez les vertébrés et la Drosophile.
STAT
STAT
STAT STAT
JAK JAK JAK JAKP
P P
P
STAT
STAT
PP
TTCNNNGAA
STAT
STAT
PP
gènes cibles
SOCS
SOCS
A B
Figure 11. La voie de signalisation JAK/STATA. Les récepteurs en gris sont associés aux kinases JAK; la fixation du ligand sur les récepteurs induit l’activation des JAK qui se trans-phosphorylent et phosphorylent les récepteurs créant un site d’ancrage pour STAT. STAT, qui est présent dans le cytoplasme, se fixe sur le récepteur où il est phosphorylé par les JAKs. STAT phosphorylé se dimèrise et va dans le noyau où il active l’expression de ces gènes cibles. Certain gènes cibles codent pour des inhibiteurs de la voie de signalisation JAK/STAT, tels que les SOCS, permettant d’établir une boucle de rétrocontrôle négaitf (d’après Arbouzova et Zeidler, 2006). B. Tableau indiquant les différents composants de la voie de signalisation JAK/STAT chez les vertébrés et la Drosophile.
STAT
STAT
STAT STAT
JAK JAK JAK JAKP
P P
P
STAT
STAT
PP
TTCNNNGAA
STAT
STAT
PP
gènes cibles
SOCS
SOCS
A B
STAT
STAT
STAT STAT
JAK JAK JAK JAKP
P P
P
STAT
STAT
PP
TTCNNNGAA
STAT
STAT
PP
gènes cibles
SOCS
SOCS
STAT
STAT
STAT STAT
JAK JAK JAK JAKP
P P
P
STAT
STAT
PP
STAT
STAT
PP
TTCNNNGAA
STAT
STAT
PP
STAT
STAT
PP
gènes cibles
SOCS
SOCS
A B
42
Unpaired 1, 2 et 3 (Upd) sont les ligands de Domeless. Malgré une lointaine ressemblance
avec les Leptines de mammifères, les Upds sont des protéines qui n’ont pas d’homologues
hors de la famille des Drosophilidés.
Les protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signalling) ont été initialement identifiées
chez les vertébrés. Les gènes socs sont des gènes cibles de la voie de signalisation
JAK/STAT codant pour des inhibiteurs de cette voie. Les SOCS permettent la mise en place
d’un rétrocontrôle négatif afin de limiter à la fois l’intensité et le temps d’activation de la
signalisation JAK/STAT. Les SOCS peuvent, soit inhiber l’activité catalytique des kinases
JAK, soit les entraîner vers la dégradation, soit entrer en compétition avec STAT pour la
liaison aux récepteurs. Tandis que chez les vertébrés huit gènes codent pour des SOCS (SOCS
1-7 et CIS) chez la Drosophile trois orthologues on été identifiés. SOCS36E et SOCS44A
sont des répresseurs de la voie de signalisation JAK/STAT. L’expression de SOCS36E est
dépendante de la voie de signalisation JAK/STAT contrairement à l’expression de SOCS44A.
SOCS16D n’a pas encore été caractérisé (Croker et al., 2008).
Les protéines PIAS (Protein Inhibitors of Activated STAT) sont également des inhibiteurs de
la voie de signalisation JAK/STAT. Elles se lient à STAT et l’entraînent vers la dégradation.
Chez la Drosophile une seule protéine PIAS a été identifiée, ZIMP, qui peut lier SOCS92E et
inhiber la voie.
Ken and Barbie (Ken) est l’orthologue de BCL6 (B-cell lymphoma 6) humain. Ken est
capable de reconnaître une séquence d’ADN qui recouvre partiellement la séquence reconnue
par STAT. Par des expériences ex vivo, il a été montré que Ken peut inhiber l’expression de
gènes rapporteurs de l’activité de la voie JAK/STAT seulement si la séquence reconnue par
Ken est présente. In vivo, Ken peut inhiber l’expression d’un sous ensemble des gènes cibles
potentiels activés par STAT (Arbouzova et al., 2006). L’étude approfondie de la fonction de
Ken est très prometteuse et devrait permettre de mieux comprendre au niveau moléculaire
comment une même voie de signalisation peut être impliquée dans un si grand nombre de
processus développementaux et réguler de manière différentielle tant de gènes cibles
différents.
Un autre aspect de la régulation de la voie de signalisation JAK/STAT est la localisation
subcellulaire des composants de la voie (Sotillos et al., 2008). En effet, il a été montré que
Dome et Hop sont localisés à la membrane apicale des cellules épithéliales, alors que
STAT92E est surtout présent dans des domaines apico-latéraux de la cellule. La proximité des
complexes Dome/Hop avec STAT92E dans des domaines membranaires spécifiques est un
pré-requis pour une signalisation efficace. La polarisation de la localisation membranaire
43
A B
Figure 12. Les récepteurs de cytokines de classe I.A. Représentation schématique des récepteurs de cytokines de classe I de Drosophile et de vertébrés. Le Cytokine Binding Motif (CBM) est en vert, les domaines fibronectineIII sont en rouge. TM indique le domaine transmembranaire. Le domaine intracellulaire contient les sites de fixation pour JAK (noir) et STAT (orange). Chez la Drosophile, Domeless est le seul récepteur connu. Toutefois un second gène, appelé latran, a été identifié comme présentant de l’homologie de séquence avec Dome. Latran et Dome partagent un domaine conservé qui leur est spécifique. Ce domaine est appelé LDHD pour Latran Domeless Homologous Domain (bleu). Le peptide signal est en jaune. B. Représentation schématique des cinq groupes de récepteurs de cytokines de classe I des vertébrés. Sont représentés les domaine immunoglobuline (Ig), les Cytokines Binding Motif (CBM), les domaines fibronectines III (FnIII), le domaine transmembraniare (TM). Les récepteurs du groupe 1 sont caractérisés uniquement par la présence du CBM. Les récepteurs du groupe 2 possèdent pour la plupart un domaine immunoglobuline en N-terminal, des domaines fibronectinesIII entre le CBM et le domaine transmembranaire et un long domaine intracellulaire. Les récepteurs du groupe 3 possèdent souvent aussi un domaine immunoglobuline en N-terminal mais pas de domaine fibronectine. De plus, ils sont soit solubles soit possèdent une région intracellulaire courte. Les récepteurs des groupes 2 et 3 forment la superfamille des récepteurs de type IL-6R . Les récepteurs du groupe 4 sont exclusivement caractérisés par la présence d’un CBM et un domaine intracellulaire long. Les récepteurs du groupe 5, sont caractérisés par un domaine CBM et un domaine intracellulaire court. Les récepteurs du groupe 4 et 5 s’associent pour former les récepteurs des familles IL-2R et IL-3R (d’après Boulay et al., 2003 et Liongue et Ward, 2007)
TM
Ig
CBM
FnIII
TM
A B
Figure 12. Les récepteurs de cytokines de classe I.A. Représentation schématique des récepteurs de cytokines de classe I de Drosophile et de vertébrés. Le Cytokine Binding Motif (CBM) est en vert, les domaines fibronectineIII sont en rouge. TM indique le domaine transmembranaire. Le domaine intracellulaire contient les sites de fixation pour JAK (noir) et STAT (orange). Chez la Drosophile, Domeless est le seul récepteur connu. Toutefois un second gène, appelé latran, a été identifié comme présentant de l’homologie de séquence avec Dome. Latran et Dome partagent un domaine conservé qui leur est spécifique. Ce domaine est appelé LDHD pour Latran Domeless Homologous Domain (bleu). Le peptide signal est en jaune. B. Représentation schématique des cinq groupes de récepteurs de cytokines de classe I des vertébrés. Sont représentés les domaine immunoglobuline (Ig), les Cytokines Binding Motif (CBM), les domaines fibronectines III (FnIII), le domaine transmembraniare (TM). Les récepteurs du groupe 1 sont caractérisés uniquement par la présence du CBM. Les récepteurs du groupe 2 possèdent pour la plupart un domaine immunoglobuline en N-terminal, des domaines fibronectinesIII entre le CBM et le domaine transmembranaire et un long domaine intracellulaire. Les récepteurs du groupe 3 possèdent souvent aussi un domaine immunoglobuline en N-terminal mais pas de domaine fibronectine. De plus, ils sont soit solubles soit possèdent une région intracellulaire courte. Les récepteurs des groupes 2 et 3 forment la superfamille des récepteurs de type IL-6R . Les récepteurs du groupe 4 sont exclusivement caractérisés par la présence d’un CBM et un domaine intracellulaire long. Les récepteurs du groupe 5, sont caractérisés par un domaine CBM et un domaine intracellulaire court. Les récepteurs du groupe 4 et 5 s’associent pour former les récepteurs des familles IL-2R et IL-3R (d’après Boulay et al., 2003 et Liongue et Ward, 2007)
TM
Ig
CBM
FnIII
TM
44
de ces éléments permet de limiter la réponse des cellules aux ligands secrétés par les cellules
avoisinantes.
La voie de signalisation JAK/STAT est également régulée par l’endocytose des récepteurs.
Chez les vertébrés l’endocytose du récepteur de l’interféron α (INFR α) lié à son ligand, est
nécessaire pour la signalisation (Marchetti et al., 2006). Chez la Drosophile la fixation d’Upd
sur Dome induit l’endocytose du complexe Ligand/Récepteur dans un endosome à manteau
clatherine qui est dirigé vers la dégradation dans les lysosomes. Le blocage de l’endocytose
induit l’inhibition de la signalisation. La fixation du ligand sur son récepteur n’est donc pas
suffisante pour la signalisation, il faut que le complexe ligand/récepteur soit internalisé pour
activer la voie de signalisation JAK/STAT. Ainsi seuls les complexes ligand/récepteur qui
sont envoyés vers la dégradation sont actifs jusqu’à leur dégradation effective, apportant ainsi
un niveau de régulation supplémentaire de la voie de signalisation JAK/STAT (Devergne et
al., 2007).
La famille des récepteurs des cytokines de classe I
Les cytokines sont des protéines secrétées qui incluent notamment les interleukines (IL), les
interférons (INF), les colony-stimulating factors (CSF) et les tumor necrosis factors (TNF).
Les récepteurs qui reconnaissent ces différent ligands sont nombreux et peuvent être classés
en cinq groupes : les récepteurs de la superfamille des immunoglobulines, les récepteurs des
TNF, les récepteurs des chémokines et enfin les deux types de récepteurs associés à la voie de
signalisation JAK/STAT, les récepteurs des cytokines de classe I et II.
Les cytokines de classe I représentent le plus grand groupe de cytokines et leurs récepteurs
sont des protéines à un domaine transmembranaire qui peuvent former des complexes homo
et/ou hétéromériques. Ces récepteurs ont des séquences relativement divergentes sauf dans
certains domaines qui caractérisent leur famille (Figure 12A). Le CBM (Cytokine Binding
Motif) situé dans la partie extracellulaire est nécessaire pour la liaison aux cytokines. Le CBM
est caractérisé par quatre cystéines formant des ponts disulfures intramoléculaires,et par un
motif conservé WSXWS. Le reste de la partie extracellulaire peut contenir des domaines
fibronectine III ainsi que des domaines immunoglobulines. Dans la partie intracellulaire, il y a
des motifs conservés correspondant aux sites de fixation des JAK et STAT.
45
Figure 13. Fonctionnement de récepteurs de cytokine de classe I.A. Les récepteurs de cytokine de classe I peuvent lier leur ligand de différentes façons. Ils peuvent former des homo ou hétéromères. Les récepteurs longs permettent la transduction du signal grâce à leurs sites de fixation pour JAK et STAT (orange), les récepteurs courts ont une plus forte affinité pour le ligand que les récepteurs longs et confère une spécificité via leur liaison aux cytokines.B. Différentes étapes conduisent à la formation d’un récepteur complexe. Exemple des récepteurs IL-6Rα et GP130. Le récepteur IL-6Rα se lie au ligand IL-6, puis il s’associe avec le récepteur long GP130. Un hexamère fonctionnel est alors formé. d’après Boulanger et al., 2003
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIIIC
BM
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
A
B
Membrane plasmique
intracellulaire
extracellulaire
Figure 13. Fonctionnement de récepteurs de cytokine de classe I.A. Les récepteurs de cytokine de classe I peuvent lier leur ligand de différentes façons. Ils peuvent former des homo ou hétéromères. Les récepteurs longs permettent la transduction du signal grâce à leurs sites de fixation pour JAK et STAT (orange), les récepteurs courts ont une plus forte affinité pour le ligand que les récepteurs longs et confère une spécificité via leur liaison aux cytokines.B. Différentes étapes conduisent à la formation d’un récepteur complexe. Exemple des récepteurs IL-6Rα et GP130. Le récepteur IL-6Rα se lie au ligand IL-6, puis il s’associe avec le récepteur long GP130. Un hexamère fonctionnel est alors formé. d’après Boulanger et al., 2003
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIIIC
BM
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
A
B
Membrane plasmique
Figure 13. Fonctionnement de récepteurs de cytokine de classe I.A. Les récepteurs de cytokine de classe I peuvent lier leur ligand de différentes façons. Ils peuvent former des homo ou hétéromères. Les récepteurs longs permettent la transduction du signal grâce à leurs sites de fixation pour JAK et STAT (orange), les récepteurs courts ont une plus forte affinité pour le ligand que les récepteurs longs et confère une spécificité via leur liaison aux cytokines.B. Différentes étapes conduisent à la formation d’un récepteur complexe. Exemple des récepteurs IL-6Rα et GP130. Le récepteur IL-6Rα se lie au ligand IL-6, puis il s’associe avec le récepteur long GP130. Un hexamère fonctionnel est alors formé. d’après Boulanger et al., 2003
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIIIC
BM
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
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M
CB
M
FnIII
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CB
M
FnIII
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CB
M
FnIII
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M
FnIII
FnIII
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M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
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CB
M
CB
M
FnIII
FnIII
FnIIIC
BM
FnIII
FnIII
FnIIIC
BM
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
FnIII
FnIII
FnIII
CB
M
A
B
Membrane plasmique
intracellulaire
extracellulaire
46
Il existe de nombreux récepteurs de cytokines de classe I (34 chez l’homme) répartis en cinq
groupes (Boulay et al., 2003) (Figure 12B). Parmi eux, les récepteurs du groupe 2 possèdent
pour la plupart un domaine immunoglobuline en N-terminal, des domaines fibronectines III
entre le CBM et le domaine transmembranaire et un long domaine intracellulaire avec les sites
de fixation pour JAK et STAT. Le représentant type du groupe 2 est le récepteur GP130. Les
récepteurs du groupe 3 possèdent souvent aussi un domaine immunoglobuline en N-terminal
mais pas de domaine fibronectine. De plus, ils sont soit solubles soit possèdent une région
intracellulaire courte dépourvue des sites de fixation pour JAK et STAT. Les récepteurs des
groupes 2 et 3 forment la superfamille des récepteurs de type IL6R (Taga et Kashimoto, 1997)
qui s’assemblent en complexes. Dans ces complexes, les récepteurs longs et les courts
s’associent pour lier le ligand et propager le signal. Généralement les récepteurs courts, qui
présentent plus d’affinité pour les cytokines que les longs, vont d’abord lier le ligand puis
s’associer au récepteur long qui permet la transduction du signal (Figure 13).
Le contrôle de la voie de signalisation JAK/STAT peut également se faire au niveau de la
réception du signal. Il existe des récepteurs qui sont des inhibiteurs de la signalisation par les
cytokines. Ce sont des récepteurs qui présentent une forte affinité pour les cytokines et qui
sont soit solubles soit avec un domaine intracellulaire court. Ils peuvent être codés par un
gène spécifique ou provenir de l’épissage alternatif d’un messager, ou du clivage d’un
récepteur signalant. Par exemple, il existe une forme soluble du récepteur GP130 qui inhibe la
voie de signalisation IL6 (Narazaki et al., 1993). Il existe également un récepteur court de
l’IL13, IL13Rα2 qui entre en compétition avec le récepteur IL13Rα1 pour la cytokine et
inhibe ainsi la voie de signalisation. (Rahaman et 2002 ; Zhang et al., 1997).
En 2003, Diveu et collaborateurs ont identifié un nouveau membre de la famille des
récepteurs des cytokines de classe I appelé GPL (Gp130 Like receptor) et présentant une forte
homologie de séquence avec GP130 (Diveu et al., 2003). Il existe une forme du récepteur
tronquée dans sa partie intracellulaire. Cette forme courte se comporte comme un dominant
négatif en inhibant le signal médié par la forme longue (Diveu et al., 2004).
Chez la Drosophile un seul récepteur de cytokine de classe I a été identifié : Dome. Son
domaine extracellulaire est composé d’un CBM, contenant un motif WSXWS tronqué, trois
domaines fibronectine III. Dans la partie intracellulaire, un site unique de fixation de STAT a
été identifié. Domeless ressemble à un récepteur de type GP130 et le récepteur avec lequel il
présente la plus forte homologie de séquence est GPL (Figure 12A). Il n’a jamais été isolé de
formes courtes ou solubles de Dome. Dome est présent sous forme de dimère à la membrane
47
et après fixation d’un Upd il active la voie de signalisation JAK/STAT (Arbouzova and
Zeidler, 2006).
Rôles de la voie de signalisation JAK/STAT
La voie de signalisation JAK/STAT est conservée au cours de l’évolution non seulement au
niveau de ses composant et régulateurs mais aussi fonctionnellement. En effet, chez les
vertébrés tout comme chez la Drosophile, la voie de signalisation JAK/STAT est impliquée
dans un grand nombre de processus biologiques. Chez la Drosophile elle est impliquée au
cours du développement, dans la détermination, la prolifération, la migration des cellules,
ainsi que dans la réponse immunitaire.
Ici je m’intéresserai plus particulièrement au rôle de la voie de signalisation JAK/STAT dans
l’immunité. Chez les vertébrés, la voie de signalisation JAK/STAT est impliquée à différents
niveaux dans le système immunitaire. Elle est impliquée dans l’hématopoïèse à différentes
étapes incluant la prolifération, la différenciation et la survie des cellules hématopoïétiques
(Ihle, 1995; Ihle and Kerr, 1995) et joue le rôle d’un chef d’orchestre lors de la réponse
immunitaire (pour revue Boehm et al., 1997; Hanlon et al., 2002; Trinchieri, 2003; Watford et
al., 2003 ; Schindler, 2002). Notamment, elle est essentielle dans le processus d’inflammation,
ainsi que dans l’activation de l’immunité adaptative.
Chez la Drosophile la voie de signalisation JAK/STAT joue un rôle dans la réponse humorale.
Suite à une infection, les hémocytes circulants de l’hémolymphe expriment Upd3 qui va
activer la voie JAK/STAT dans le corps gras et induire l’expression de gènes effecteurs de
l’immunité ((Agaisse et al., 2003); revue dans (Agaisse and Perrimon, 2004)). Parmi ceux-ci
on trouve tepII qui code pour une protéine présentant des homologies avec les protéines du
complément des mammifères (Lagueux et al., 2000). On trouve également des gènes de la
famille turandot. Les gènes turandot (totA, B, C, F, M, X, Z) sont des gènes spécifiques de la
Drosophile et leur fonction est à ce jour inconnue. Par ailleurs, il a été montré que lorsqu’un
tissu est endommagé, suite à une blessure ou à la présence d’une tumeur, cela induit
l’expression de upd , upd2 et upd 3. La sécrétion des Upds par les tissus lésés induit
l’expression des Upds également dans les hémocytes et le corps gras ce qui entraîne une
augmentation de la prolifération des hémocytes (Pastor-Pareja et al., 2008).
Le rôle de la voie de signalisation JAK/STAT dans la réponse cellulaire reste à ce jour mal
connu. L’activation constitutive de la voie observée dans le mutant hopTum-l conduit à la
différenciation de lamellocytes en absence d’infection par un parasitoïde. Les mutants nuls
48
pour hop sont incapables de former des lamellocytes et d’encapsuler l’œuf du parasitoïde
après une infection (Lanot et al., 2001; Qiu et al., 1998). L’ensemble de ces données suggère
fortement un rôle de la voie de signalisation JAK/STAT dans la spécification des
lamellocytes. Comme présenté plus haut, les études récentes menées dans le laboratoire
indiquent que la voie de signalisation JAK/STAT est activée et nécessaire dans la glande
lymphatique pour maintenir une population de prohémocytes dans la zone médullaire (voir la
première partie des résultats ; (Krzemien et al., 2007)). Cependant, la régulation au niveau
moléculaire de la voie de signalisation JAK/STAT dans la glande lymphatique restait non
élucidée.
Le séquençage complet du génome de la Drosophile a permis d’identifier CG14225 qui code
pour une protéine transmembranaire qui présente une forte homologie de séquence avec
domeless (Brown et al., 2001; Hou et al., 2002)(Figure 12A). Au cours de ma thèse j’ai étudié
le rôle du gène CG14225, que nous avons appelé latran, et montré qu’il est exprimé dans la
ZM. J’ai, par la suite pu établir qu’il est impliqué dans la régulation de la voie de signalisation
JAK/STAT lors de la réponse immunitaire cellulaire au parasitisme. Ce travail est présenté
dans la deuxième partie des résultats.
49
Figure14. Voie de signalisation Toll/NFκB.Représentation schématique des cascades de signalisation impliquées dans la formation de l’axe dorso-ventral, dans l’immunitéchez la Drosophile et les vertébrés. Chez les vertébrés et chez la Drosophile l’activation du récepteur TLR suite à la fixation de son ligand induit le recrutement sur le domaine intracytoplasmique TIR du récepteur des protéines adaptatrices possédant également un domaine TIR, et des « domaines de mort » (Myd88, Tube) menant à l’activation de la kinase Pelle (IRAK chez les vertébrés). L’activation de la voie de signalisation conduit à la dégradation de Cactus (homologue de IκB des vertébrés) libérant ainsi le facteur de transcription à domaine Rel appartenant à la famille des facteurs NFκB qui sont Dorsal et Dif (Dorsal relatedImmune Factor) chez la Drosophile.Toutefois les ligands et les gènes cibles peuvent différer selon la fonction où l’espèce. A. Rôle de la voie de signalisation
Toll/NFκB dans la mise en place de l’axe dorso-ventral de l’embryon de Drosophile. Une cascade protéolytique déclenchée par Pipe et Nudel, dans la future face ventrale de l’embryon, va menée au clivage de Spätzle leligand de Toll. Ceci entraîne la libération de Dorsal qui va entrer dans le noyau et activer l’expression de gènes cibles permettant la mise en place de l’axe dorso-ventral de l’embryon. B. Rôle de la voie de signalisation Toll/NFκB dans la réponse humorale chez la Drosophile. Les bactéries àGram positif et les champignons sont reconnus par des molécules de reconnaissances secrétées (PGRP-SA, PGRP-SD, GNBP1, 3) qui vont activer des Sérine Protéase qui vont cliver Spätzle. Spätzle clivé va se lier à Toll qui est à la surface des cellules du corps gras. L’activation de la voie de signalisation va induire l’expression de gènes codant pour des peptides antimicrobiens. C. Rôle de la voie de signalisation Toll/NFκB dans l’immunité des vertébrés. Les TLRs sont capables de se lier à des motifs spécifiques des microorganismes tels que des lipopolysaccharides (LPS), des peptidoglycanes, ou des acides nucléiques comme les ADN et ARN bactériens ou viraux etc…Les gènes cibles activés codent soit pour des protéines antimicrobiennes soit pour des
cytokines et chemokines pro-inflammatoires qui vont permettre de recruter des neutrophiles et d’activer les macrophages.
complexe IKKIκB
NFκB
MyD88TIR TIR
DD
IRAK
TRAF6
DD
TLR
Cactus
Dorsal/DIF
TIRTIR
DD
DD
DD
Toll
DMyD88
Tube
Pelle
?
Noyau
Spätzle
LPS, ADN et ARN bactérien, flagelline…
Famille rel
Pro-Spätzle
PGRP-SD, PGRP-SA, GNBP1
persephone
WindbeutelSlalom
Pipe
Gastrulation defective
Snake
Easter
Nudelbactéries Gram positif
champignons
sérine protéase
A. Mise en place de l’axe dorso-ventral de
l’embryon de Drosophile
B. Réponse humoraleDrosophile
C. Immunité des vertébrés
Figure14. Voie de signalisation Toll/NFκB.Représentation schématique des cascades de signalisation impliquées dans la formation de l’axe dorso-ventral, dans l’immunitéchez la Drosophile et les vertébrés. Chez les vertébrés et chez la Drosophile l’activation du récepteur TLR suite à la fixation de son ligand induit le recrutement sur le domaine intracytoplasmique TIR du récepteur des protéines adaptatrices possédant également un domaine TIR, et des « domaines de mort » (Myd88, Tube) menant à l’activation de la kinase Pelle (IRAK chez les vertébrés). L’activation de la voie de signalisation conduit à la dégradation de Cactus (homologue de IκB des vertébrés) libérant ainsi le facteur de transcription à domaine Rel appartenant à la famille des facteurs NFκB qui sont Dorsal et Dif (Dorsal relatedImmune Factor) chez la Drosophile.Toutefois les ligands et les gènes cibles peuvent différer selon la fonction où l’espèce. A. Rôle de la voie de signalisation
Toll/NFκB dans la mise en place de l’axe dorso-ventral de l’embryon de Drosophile. Une cascade protéolytique déclenchée par Pipe et Nudel, dans la future face ventrale de l’embryon, va menée au clivage de Spätzle leligand de Toll. Ceci entraîne la libération de Dorsal qui va entrer dans le noyau et activer l’expression de gènes cibles permettant la mise en place de l’axe dorso-ventral de l’embryon. B. Rôle de la voie de signalisation Toll/NFκB dans la réponse humorale chez la Drosophile. Les bactéries àGram positif et les champignons sont reconnus par des molécules de reconnaissances secrétées (PGRP-SA, PGRP-SD, GNBP1, 3) qui vont activer des Sérine Protéase qui vont cliver Spätzle. Spätzle clivé va se lier à Toll qui est à la surface des cellules du corps gras. L’activation de la voie de signalisation va induire l’expression de gènes codant pour des peptides antimicrobiens. C. Rôle de la voie de signalisation Toll/NFκB dans l’immunité des vertébrés. Les TLRs sont capables de se lier à des motifs spécifiques des microorganismes tels que des lipopolysaccharides (LPS), des peptidoglycanes, ou des acides nucléiques comme les ADN et ARN bactériens ou viraux etc…Les gènes cibles activés codent soit pour des protéines antimicrobiennes soit pour des
cytokines et chemokines pro-inflammatoires qui vont permettre de recruter des neutrophiles et d’activer les macrophages.
complexe IKKcomplexe IKKIκB
NFκB
IκB
NFκB
MyD88TIR TIR
DD
IRAK
TRAF6
DD
TLR
TIRTIR TIR
DD
TIRTIR
DDDD
IRAK
TRAF6
DDDDDD
TLR
Cactus
Dorsal/DIF
Cactus
Dorsal/DIF
TIRTIR
DD
DD
DD
Toll
DMyD88
Tube
Pelle
TIRTIRTIRTIR
DD
TIRTIR
DDDD
DDDDDD
DDDDDD
Toll
DMyD88
Tube
Pelle
?
Noyau
Spätzle
LPS, ADN et ARN bactérien, flagelline…
Famille rel
Pro-Spätzle
PGRP-SD, PGRP-SA, GNBP1
persephone
WindbeutelSlalom
Pipe
Gastrulation defective
Snake
Easter
Nudelbactéries Gram positif
champignons
sérine protéase
A. Mise en place de l’axe dorso-ventral de
l’embryon de Drosophile
B. Réponse humoraleDrosophile
C. Immunité des vertébrés
50
Les TLRs et la voie de signalisation Toll/NFκB
Description
Les TLRs (Toll Like Receptors) sont des récepteurs à un domaine transmembranaire. C’est
une famille de protéines apparue très tôt chez les métazoaires avant la séparation des cnidaires
et des bilatériens (pour revue (Leulier and Lemaitre, 2008)). Leur domaine intracellulaire
contient un domaine appelé domaine TIR (Toll/ Interleukine1 Receptor domain) et leur partie
extracellulaire est composée de domaines LRR (Leucine Rich Repeat) (Figure 15).
Les motifs LRR sont en règle générale composés de 22 à 29 acides aminés formant un feuillet
β et une hélice α reliés par une boucle. C’est un type de domaine ancestral retrouvé chez les
plantes, les champignons, les animaux et qui est impliqué dans des interactions protéine-
protéine ainsi que dans des interactions avec les lipides et les acides nucléiques.
Dans l’ectodomaine des TLRs, associé aux motifs LRR, on trouve un cluster de cystéines
dans la partie C-terminale du motif LRR le plus proche du domaine transmembranaire.
Certains TLRs possèdent des clusters supplémentaires de cystéines en N et C terminal des
motifs LRR (Figure 15).
Les domaines TIR sont d’anciens motifs retrouvés chez les plantes et la plupart des
métazoaires. Il existe de nombreux types de protéines possédant un domaine TIR, les TLRs
n’en représentent qu’un sous ensemble. La région intracellulaire des TLRs est associée à une
cascade de signalisation menant à la translocation dans le noyau d’un facteur de transcription
NFκB (Belvin and Anderson, 1996; Medzhitov et al., 1997). Chez la Drosophile comme chez
les vertébrés, l’activation du récepteur TLR suite à la fixation de son ligand induit le
recrutement sur le domaine intracytoplasmique TIR du récepteur de protéines adaptatrices
possédant également un domaine TIR, et des « domaines de mort » (Myd88, Tube) menant à
l’activation de la kinase Pelle (IRAK chez les vertébrés). Ceci mène à la dégradation de
Cactus (homologue de IκB des vertébrés) libérant ainsi le facteur de transcription à domaine
Rel appartenant à la famille des facteurs NFκB qui sont Dorsal et Dif (Dorsal related Immune
Factor) chez la Drosophile (Figure 14).
51
Figure15. Structure des TLRLe domaine extracellulaire est composé de motifs LRR (pour Leucine Rich Repeat, en jaune). Le domaine TIR (pour Toll Interleukin 1 Receptor) est en violet. La membane plasmique est indiquée par MB. Les groupes de cystéines sont représenté en vert(NF, groupe en Nterminal des LRR) et en rouge (CF, groupe en C-terminal des LRR). Il existe deux types de récepteurs: les récepteurs avec plusieurs groupes de cystéines et les récepteurs avec un seul motif cystéine. D’après Leulier et Lemaitre, 2008
Figure16. Expression des TLRs de Drosophile.A. Dans l’embryon, détection de l’expression par hybridtion in situ (Ferrandon et al., 2004)B. Dans la larve, détection par RT-PCR (Kambris et al., 2002)
A
B
TLR avec plusieurs
groupes de cystéines
TLR avec un seul
groupe de cystéines
Figure15. Structure des TLRLe domaine extracellulaire est composé de motifs LRR (pour Leucine Rich Repeat, en jaune). Le domaine TIR (pour Toll Interleukin 1 Receptor) est en violet. La membane plasmique est indiquée par MB. Les groupes de cystéines sont représenté en vert(NF, groupe en Nterminal des LRR) et en rouge (CF, groupe en C-terminal des LRR). Il existe deux types de récepteurs: les récepteurs avec plusieurs groupes de cystéines et les récepteurs avec un seul motif cystéine. D’après Leulier et Lemaitre, 2008
Figure16. Expression des TLRs de Drosophile.A. Dans l’embryon, détection de l’expression par hybridtion in situ (Ferrandon et al., 2004)B. Dans la larve, détection par RT-PCR (Kambris et al., 2002)
A
B
Figure16. Expression des TLRs de Drosophile.A. Dans l’embryon, détection de l’expression par hybridtion in situ (Ferrandon et al., 2004)B. Dans la larve, détection par RT-PCR (Kambris et al., 2002)
A
B
TLR avec plusieurs
groupes de cystéines
TLR avec un seul
groupe de cystéines
52
Les TLRs chez la Drosophile
Rôles dans le développement
Le séquençage du génome a permis d’identifier neufs gènes codant pour des TLRs chez la
Drosophile (Toll1 à 9). Le profil d’expression des TLRs au cours du développement
embryonnaire de la Drosophile est dynamique sauf pour Toll3 qui n’est pas exprimé dans
l’embryon et Toll4 dont l’expression est restreinte à la glande lymphatique (Kambris et al.,
2002) Figure16). Ils sont exprimés dans de nombreux tissus laissant supposer des rôles dans
différents processus développementaux (Figure16 A B). Le premier TLR à avoir été identifié
et caractérisé est le récepteur Toll de la Drosophile. Il fut initialement identifié pour son rôle
dans la formation de l’axe dorso-ventral de l’embryon (Anderson et al., 1985). Une cascade
protéolytique est déclenchée dans l’espace périvitellin par les cellules folliculaires entourant
l’embryon et ce uniquement au niveau de la future face ventrale de l’embryon. Cette cascade
entraîne le clivage de Spätzle, une protéine présente dans l’espace périvitellin, qui une fois
clivée va se fixer sur le récepteur Toll présent sur la membrane vitelline de l’embryon. Spätzle
est ainsi le ligand du récepteur Toll chez la Drosophile. La fixation de Spätzle sur Toll active
l’initiation de la cascade de signalisation induisant la dégradation de Cactus et la libération du
facteur de transcription Dorsal. Dorsal va rentrer dans le noyau et activer l’expression de
gènes cibles uniquement dans la partie ventrale de l’embryon, et va établir l’axe dorso-ventral
(Figure14).
Toll est également impliqué dans le développement musculaire de l’embryon. Notamment il
est requis pour la fixation des muscles somatiques à l’épiderme (Halfon and Keshishian,
1998) et leur innervation (Rose et al., 1997). Toll est également requis pour la migration et
l’alignement des cardioblastes lors de la formation du tube cardiaque dans l’embryon (Wang
et al., 2005).
Toll2 est impliqué dans l’invagination des glandes salivaires en coopération avec des Rho
GTPases. La fonction de Toll2 dans les glandes salivaires n’implique pas la voie NFκB
(Kolesnikov and Beckendorf, 2007). Toll2 est également impliqué dans la migration des
cellules folliculaires dans l’ovaire (Kleve et al., 2006).
Toll8, quant à lui, est exprimé dans des neurones embryonnaires dans lesquels il induit la
formation de motifs glycosylés spécifique des neurones.
53
Figure17. Spécificité des TLRs chez les vertébrés.Les TLRs de vertébrés son capables de reconnaître directement des motifs structuraux de pathogènes, comme par exemple des lipopolysaccharides (LPS), des peptidoglycanes, ou des acides nucléiques comme les ADN et ARN bactériens ou viraux. Les différents TLR sont « spécifiques » de certains types de motifs. Ces récepteurs peuvent former des homodimères ou des hétéromères capables de reconnaître différents ligands. Ainsi, par exemple, un hétéromère TLR1/TLR2 va reconnaître des triacyl lipopeptides (bactéries), l’hétéromère TLR2/TLR6 peut reconnaître des motifs fongiques, et le dimère TLR2 reconnaît le peptidoglycane à la surface des bactéries. D’après West et al., 2006
Figure17. Spécificité des TLRs chez les vertébrés.Les TLRs de vertébrés son capables de reconnaître directement des motifs structuraux de pathogènes, comme par exemple des lipopolysaccharides (LPS), des peptidoglycanes, ou des acides nucléiques comme les ADN et ARN bactériens ou viraux. Les différents TLR sont « spécifiques » de certains types de motifs. Ces récepteurs peuvent former des homodimères ou des hétéromères capables de reconnaître différents ligands. Ainsi, par exemple, un hétéromère TLR1/TLR2 va reconnaître des triacyl lipopeptides (bactéries), l’hétéromère TLR2/TLR6 peut reconnaître des motifs fongiques, et le dimère TLR2 reconnaît le peptidoglycane à la surface des bactéries. D’après West et al., 2006
54
Rôles dans la réponse immunitaire
Toll joue un rôle clef dans la réponse immunitaire humorale, suite à une infection par un
champignon ou une bactérie à Gram positif. Les agents infectieux sont reconnus par des
protéines spécifiques appelées PGRPs ou les GNBPs présentes dans l’hémolymphe ou à la
surface des hémocytes circulants. Cette reconnaissance déclenche une cascade protéolytique
qui implique des acteurs différents de ceux impliqués lors de la formation de l’axe dorso-
ventral de l’embryon, et va induire le clivage de proSpätzle qui est présent en circulation dans
l’hémolymphe. Spätzle maturé se lie alors à Toll présent à la surface des cellules du corps
gras et active la voie de signalisation Toll/NFκB conduisant à la synthèse des peptides
antimicrobiens. Contrairement à la mise en place de l’axe dorso-ventral dans l’embryon c’est
Dif et non Dorsal le facteur de transcription impliqué lors de la réponse humorale (Figure 14).
La plupart des fonctions décrites pour les TLRs de la Drosophile sont nécessaires au cours du
développement, sauf pour Toll qui a également une fonction immunitaire. Cependant
quelques travaux montrent que d’autre TLRs pourraient également être impliqués dans
l’immunité, tel que Toll9 dont la surexpression induit la production de peptides
antimicrobiens au niveau de l’épiderme (Luo et al., 2001; Ooi et al., 2002; Tauszig et al.,
2000).
Les TLRs chez les vertébrés
Douze et dix récepteurs TLRs ont été identifiés chez la souris et l’homme respectivement. Ils
ne possèdent qu’un seul cluster de cystéines. Chez les vertébrés les TLRs sont exclusivement
impliqués dans la réponse immunitaire. Comme chez la Drosophile la liaison du ligand aux
TLRs active la voie de signalisation Toll/NFκB qui conduit à la dégradation d’IκB et à la
libération de NFκB. NFκB qui va migrer dans le noyau et activer la transcription de différents
gènes cibles (Figure 14et (Kawai and Akira, 2007a; O'Neill and Bowie, 2007)). Si les
composants de la voie de signalisation Toll/NFκB sont bien conservés entre la Drosophile et
les vertébrés, les ligands et les gènes cibles sont différents. En effet, les TLRs de vertébrés
vont reconnaître directement des motifs structuraux de pathogènes alors que chez la
Drosophile le seul ligand connu de Toll est la protéine Spätzle (Figure14). Les TLRs sont
capables de se lier à des motifs spécifiques des microorganismes tels que des
lipopolysaccharides (LPS), des peptidoglycanes, ou des acides nucléiques comme les ADN et
ARN bactériens ou viraux etc… (Figure 17et ). Les gènes cibles activés codent soit pour des
55
protéines antimicrobiennes soit pour des cytokines et chemokines pro-inflammatoires qui vont
permettre de recruter des neutrophiles et d’activer les macrophages (Iwasaki and Medzhitov,
2004; Kawai and Akira, 2007b; Pasare and Medzhitov, 2004; Takeda and Akira, 2005).
Dans les cellules présentatrices d’antigènes telles que les cellules dendritiques l’activation de
la voie de signalisation Toll/NFκB induit l’expression de molécules co-activatrices
accompagnant le Complexe Majeur d’Histocompatibilité, ainsi que la sécrétion de cytokines
permettant d’induire la maturation de lymphocytes T ou B et de moduler leur activité.
Ainsi, chez les vertébrés les TLRs jouent le rôle de sentinelles qui sont capables de détecter
une infection et d’orchestrer une réponse appropriée impliquant l’inflammation, la sécrétion
d’effecteurs antimicrobiens et l’activation du système immunitaire adaptatif.
D’une manière générale, les TLRs sont impliqués dans l’immunité et dans le développement,
pas uniquement via l’activation de cascades de signalisation, mais également en agissant
directement au niveau des interactions cellulaires. Leurs rôles dans l’immunité sont conservés
chez des insectes aux vertébrés ; alors que des fonctions au cours du développement n’ont été
décrites que chez les insectes. Les données phylogénétiques n’ont pas permis de mettre en
évidence des relations d’orthologie entre les TLRs d’insectes et de vertébrés indiquant qu’ils
ont évolué de manière indépendante. La fonction ancestrale des TLRs reste inconnue et il est
proposé que la fonction immunitaire de TLRs dans différents phylums, est le résultat d’une
cooptation indépendante dans différents lignages. La conservation de la voie de signalisation
Toll/NFκB suggère un lien ancestral entre les TLRs et NFκB. Toutefois, il a été montré chez
la Drosophile, tout comme chez C. elegans dont je n’ai pas parlé ici, que les TLRs pouvaient
exercer des fonctions au cours du développement qui sont indépendante de NFκB.
La voie de signalisation Toll/NFκB et la réponse immunitaire cellulaire chez la Drosophile
Aucun rôle des TLRs dans l’hématopoïèse n’a été décrit chez la Drosophile à ce jour.
Toutefois, comme je l’ai décrit plus haut, l’activation constitutive de la voie de signalisation
Toll/NFκB dans le mutant Toll10B conduit à la formation de lamellocytes sans infection par un
parasitoïde. Le mutant cactus produit également massivement des lamellocytes en absence
d’infection (Qiu et al., 1998). Ces données suggèrent fortement que la voie de signalisation
Toll/NFκB pourrait être impliquée dans la réponse immunitaire cellulaire. Son rôle exact dans
56
ce processus reste à ce jour non établi. L’analyse du profil d’expression des différent Tolls au
cours du développement embryonnaire réalisé par Kambris et collaborateurs a révélé une
expression très localisée de toll4 dans la glande lymphatique. Une analyse plus précise de son
domaine d’expression m’a permis de déterminer que l’expression de toll4 est restreinte aux
cellules du PSC. En me basant sur cette observation et le fait que la voie Toll/NFκB est
impliquée dans la production de lamellocytes il était très intéressant d’étudier en détail le rôle
de toll4 dans l’hématopoïèse larvaire. Cette étude est rapportée dans la troisième partie des
résultats.
57
Matériels et Méthodes
Seuls les matériels et méthodes non décrits dans les deux articles sont présentés ici.
Hybridation in situ pour les TLR
Les sondes utilisées dans les hybridations in situ correspondent à des ARN anti-sens marqués
à la digoxygénine (DIG), et générés par transcription in vitro.
Les sondes pour toll3, toll4 et toll5 ont été générées à partir des clones pJL159, pJL65,
pJL206, respectivement, donnés par Jean-Luc Imler. Ces clones ont été linéarisés par NotI,
HindIII et XhoI respectivement. La transcription a été réalisée à l’aide de la T7 ARN
polymérase pour toll3 et toll 5, et avec la SP6 ARN polymérase pour toll4. Les séquences
correspondant à toll6 et toll9 ont été sous clonées dans le vecteur KS. Les clones ont été
linéarisés par Not1 et EcoR1 respectivement. La T3 ARN polymérase a été utilisée pour la
transcritption de toll6 et la T7 ARN polymérase a servi pour la transcription de toll9. Pour
toll, toll2, toll7 et toll8 des fragments de 1,2kb ont été amplifiés par PCR à partir d’ADN
génomique, puis clonés dans le pGEM-T easy de Promega.
Les amorces utilisées sont :
Toll1 5’CTTCCGAGCTGGCATTGCTTG 3’; 5’TTATCCTCCAGACGCAGATCC 3’
Toll2 5’TGTTGCTTCTTGTGGCTGATGC 3’; 5’TTGTTTAGCGTGAGTTTCGTCAG 3’
Toll7 5’CTTTAACGCCACAGGTGCTGC 3’; 5’ACGGCTGTCGGATTTGGTTGC 3’
Toll8 5’ACCTGCAGCTGTGAATTCATTG 3’; 5’TGGTTCGGTGGCAATGGTAGG 3’
Génération d’un mutant nul pour toll4
La délétion du locus du gène toll4 a été réalisée par la méthode « Ends Out » de
recombinaison homologue (Gong and Golic, 2003). Les séquences de 4 kb situées de part et
d’autre de toll4 (région 5’ et région 3’ voir Figure 18) ont été clonées de part et d’autre d’un
gène white dans le pW25 qui est un pCaspeR modifié comme décrit dans Gong et Golic,
2004. Des lignées transgéniques ont été obtenues avec cette construction et ont été utilisées
pour réaliser le KO. Trois allèles mutants pour toll4 ont été obtenus pour lesquels nous avons
confirmé par PCR que toll4 a bien été remplacé par le gène white (voir Figure 18) De plus,
des hybridations in situ avec la sonde toll4 ont été réalisées sur ces trois allèles et indiquent
que l’expression de toll4 est abolie.
61
Région 2L, 29F7-30A2 :
4kb region 5’ 4kb region 3’
CG31708 CG12439 toll4 CG31609 Or30a
CG31708 CG12439 white CG31609 Or30a
Figure 18. K.O. de toll4A. Les amorces utilisées pour amplifier les régions génomiques de part et d’autre de toll4 sont indiquée par des petites flèches rouges et bleues. Les fragments génomiques de 4kb amplifiés par PCR et clonées dans le pW25 sont indiquées en rouge pour la région 5’et en bleu pour la région 3’.B. Suite à un événement de recombinaison homologue le gène toll4 et remplacé par le gène white. Les amorces (petites flèches en jaune) utilisées pour vérifier par amplification PCR la délétion de toll 4sontindiquées.
WT
KO toll4
5kb
A
B
Région 2L, 29F7-30A2 :
4kb region 5’ 4kb region 3’
CG31708 CG12439 toll4 CG31609 Or30a
CG31708 CG12439 white CG31609 Or30a
Figure 18. K.O. de toll4A. Les amorces utilisées pour amplifier les régions génomiques de part et d’autre de toll4 sont indiquée par des petites flèches rouges et bleues. Les fragments génomiques de 4kb amplifiés par PCR et clonées dans le pW25 sont indiquées en rouge pour la région 5’et en bleu pour la région 3’.B. Suite à un événement de recombinaison homologue le gène toll4 et remplacé par le gène white. Les amorces (petites flèches en jaune) utilisées pour vérifier par amplification PCR la délétion de toll 4sontindiquées.
WT
KO toll4
5kb
A
B
Immunocoloration sur cellules S2 en culture
Les transfections et la mesure de l’activité luciférase ont été réalisés sur des cellules S2NP
(Baeg et al., 2005). Les cellules ont été transfectées avec 20 pg d’un vecteur exprimant upd,
5ng du vecteur portant le gène raporteur 10XSTAT luciférase, 5ng d’un vecteur exprimant la
Renilla sous le contrôle d’un promoteur actine et 0,2 ng d’un vecteur exprimant Dome-V5.
Des doses croissantes du vecteur exprimant HA-Latran ont été transfectées. Le kit Effecten de
Qiagen a été utilisé pour les transfection. 96 heures après transfection les cellules ont été
séparées en deux lots. Le premier lot a servi à mesurer l’activité luciférase tandis que le
deuxième lot a été utilisé pour faire des immunocolorations. Le kit DualGlo de Promega a été
utilisé pour les mesures d’activité luciférase. Pour chaque condition, les résultats sont
indiqués en unités relatives de luciférase qui sont le ratio entre les valeurs luciférases et les
valeurs Renilla. Les immunocolorations ont été réalisées comme décrit dans Carreno et al.,
2008. Les anticorps utilisés sont l’anticorps anti-HA (sc-805) de Santa Cruz Biotechnology
(au 1/100) et l’anticorps anti-V5 (R960-25) d’Invitrogen (au 1/200).
Génération de clones somatiques.
L’allèle mutant de latran (lat18A) a été recombiné avec le site FRT19A présent sur le
chromosome X. Par croisements, le transgène dome-MESO présent sur le chromosome II a
été introduit. Pour dome, les deux allèles mutants PL100 et 120.30 recombinés avec le site
62
FRT19A donnés par Stéphane Noselli ont été utilisés. La souche hs-GFP, FRT19A ; C765,
hs-FLP/TM6B a été utilisée. Les pontes ont été réalisées sur la journée à 18°C. Puis 24 ou 48
heures après la ponte un choc thermique de 30mn à 37°C est réalisé. Puis, 48heures après un
nouveau choc thermique de 30mn à 37°C est réalisé afin d’iduire l’expression de la GFP. Les
larves sont ensuite immédiatement disséquées. Les immunocolorations ont été réalisées
comme décrit dans Krzemień et al., 2007.
63
RESULTATS
Première partie : Rôle du PSC dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire Article : Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the Posterior Signalling Centre
Introduction
Comme décrit dans l’introduction, la glande lymphatique larvaire est composée de trois
zones : la Zone Médullaire (ZM) contenant les précurseurs hématopoïétiques qui expriment
domeless, la Zone Corticale (ZC) contenant les hémocytes différenciés et le PSC (Jung et al.,
2005). Le facteur de transcription Collier est exprimé et nécessaire pour la formation des
cellules du PSC et pour la différenciation des lamellocytes en réponse à une infection par un
parasitoïde (Crozatier et al., 2004). De plus, dans un mutant col un plus grand nombre de
cellules à cristaux se différencie dans la glande lymphatique, suggèrant un rôle plus général
du PSC dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire dans des conditions normales.
Dans la publication de Krzemień et collaborateurs, grâce à l’analyse du mutant col, le rôle du
PSC dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire a été établi.
Résultats
Le PSC est nécessaire pour maintenir un groupe de prohémocytes dans la glande lymphatique.
Dans un mutant col, au troisième stade larvaire, la ZM disparaît de manière concomitante à la
différenciation prématurée des hémocytes en cellules à cristaux et plasmatocytes. Au
deuxième stade larvaire la ZM se forme normalement dans un mutant col. Ces résultats
indiquent que la ZM se forme de façon indépendante du PSC, mais que le PSC joue un rôle
dans le maintien de la ZM au troisième stade larvaire.
Serrate, un des ligands de la voie de signalisation Notch, est exprimé dans le PSC (Lebestky
et al., 2003). Cependant, la fonction de Serrate dans le PSC restait non établie. L’expression
d’un dominant négatif de Serrate (SerTM, (Sun and Artavanis-Tsakonas, 1996) dans le PSC
entraîne une forte diminution de la transcription de col dans le PSC indiquant que la voie de
67
signalisation Notch, activée via Ser, est nécessaire pour maintenir l’expression localisée de
col dans le PSC.
Au cours de l’embryogenèse, col est initialement exprimé dans toutes les cellules de la glande
lymphatique puis, en fin d’embryogenèse, son expression est restreinte aux cellules du PSC
(Crozatier et al., 2004). L’expression ectopique de col dans la ZM empêche la différenciation
des hémocytes et maintien toutes les cellules de la glande lymphatique à l’état de
prohémocytes. La restriction de l’expression de col dans le PSC est nécessaire afin d’avoir un
contrôle correcte de l’hématopoïèse dans la glande lymphatique.
En conclusion, le contrôle de l’homéostasie des hémocytes dans la glande lymphatique
requiert la communication entre deux types cellulaires : les cellules du PSC qui
s’individualisent à la fin de l’embryogenèse et maintiennent l’expression de col tout au long
du développement larvaire et un ensemble de prohémocyte qui ne l’expriment pas. Le rôle
clef du PSC, dans le contrôle de la balance entre le maintien d’un pool de prohémocytes et
leur différenciation rappelle le rôle décrit pour la « niche » des cellules souches
hématopoïétiques (CSH) chez les vertébrés. Une « niche » est un microenvironnement qui
contrôle la prolifération et la différenciation des CSH (pour revue (Cumano and Godin, 2007;
Kiel and Morrison, 2008).
L’activation de la voie de signalisation JAK/STAT dans la Zone Médullaire est nécessaire pour maintenir les prohémocytes dans la glande lymphatique.
Un des marqueurs utilisé pour visualiser la ZM est le transgène dome-Gal4 suggérant que le
récepteur Dome est exprimé dans ces cellules. Dome étant le récepteur de la voie de
signalisation JAK/STAT, nous avons voulu savoir si cette voie de signalisation était activée
dans la ZM. Un des rapporteurs de l’activité de la voie de signalisation JAK/STAT est dome-
MESO (Hombria et al., 2005). L’analyse de l’expression de ce rapporteur nous a permis de
montrer que la voie de signalisation JAK/STAT est activée dans les prohémocytes de la ZM.
De plus, l’analyse d’un mutant hypomorphe pour STAT92E, le facteur de transcription
médiant l’activité de la voie de signalisation, a permis de montrer que l’activation de la voie
de signalisation JAK/STAT dans les cellules de la ZM est nécessaire pour maintenir ces
cellules à l’état de prohémocytes.
68
Les prohémocytes se différencient prématurément en lamellocytes suite à une infection par un parasitoïde
Afin de mieux caractériser les changements induits dans la glande lymphatique après
infection par un parasitoïde, nous avons suivi l’expression de marqueurs de prohémocytes
(dome-Gal4/UAS-GFP) et de lamellocytes (iintégrine αPS4). Vingt quatre heures après une
infection par un parasitoïde, le marquage de la ZM disparaît tandis qu’on observe une
différenciation massive de lamellocytes dans la glande lymphatique. La production de
lamellocytes se fait aux dépens du pool de prohémocytes. Ces résultats indiquent que
l’infection par un parasitoïde induit une différenciation prématurée des prohémocytes en
lamellocytes. La reprogrammation des prohémocytes suite au parasitisme, qui contourne
l’homéostasie normale des hémocytes révèle un haut niveau de plasticité des prohémocytes de
la glande lymphatique.
L’ensemble de ces données nous a conduit à modifier le modèle préalablement proposé en
2004 pour la fonction du PSC (Crozatier et al., 2004) (Figure10). Le nouveau modèle (Figure
3 de l’article) propose que le PSC a une fonction non cellulaire autonome et maintient
l’activité de la voie de signalisation JAK/STAT dans la ZM de la glande lymphatique au
troisième stade larvaire. L’activité du PSC, qui dépend de Col, est nécessaire dans des larves
saines pour empêcher une différenciation prématurée des prohémocytes multipotents en
plasmatocytes et cellules à cristaux. L’expression de ser dans le PSC est nécessaire pour
maintenir l’expression de col dans le PSC. Suite à une infection par un parasitoïde un signal,
probablement émis par les plasmatocytes circulants qui ont détecté l’œuf du parasitoïde, est
reçu par les prohémocytes, soit directement soit via le PSC. Ceci induit une différenciation
massive des prohémocytes en lamellocytes. Dans ce modèle nous proposons que le PSC agit
comme un microenvironnement ou « niche » sur les prohémocytes.
Discussion
Le nouveau modèle que nous proposons pour le contrôle de l’hématopoïèse larvaire implique
des communications cellulaires entre les cellules du PSC et les prohémocytes de la ZM.
Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués restent encore inconnus.
Différents modes de communications entre le PSC et la ZM peuvent être proposés. Ces
communications peuvent être transmises par : i) des contacts cellulaires directs, ii) par des
69
molécules diffusibles, iii) nous pouvons également imaginer que certaines cellules servent de
relais entre le PSC et la ZM. Ces cellules seraient directement en contact avec le PSC,
émettraient des signaux vers les autres prohémocytes de la ZM. Aucune de ces trois
possibilités ne peut être exclue à l’heure actuelle.
Contacts cellulaires directs
Des communications directes entre les cellules du PSC et les cellules de la ZM peuvent être
envisagées. En effet, les cellules du PSC projettent de longues extensions cytoplasmiques
appelées filopodes. Ces filopodes, visualisés par l’expression d’une GFP ancrée à la
membrane, ne s’étendent que sur deux ou trois diamètres cellulaires. Cependant il est possible
qu’ils soient plus longs mais non détectables par ces types de marquages. Ces filopodes
pourraient être le support physique de contacts cellulaires directs entre le PSC et une sous
population des prohémocytes de la ZM. Des filopodes ont précédemment été décrits comme
permettant la signalisation Notch à distance et la formation des précurseurs des organes
sensoriels chez la Drosophile (De Joussineau et al., 2003). Le fait que le PSC exprime serrate
laisse ouverte la possibilité que les filopodes puissent médier la signalisation Notch à longue
distance dans la glande lymphatique. Différents essais réalisés par Joanna Krzemień au
laboratoire afin d’empêcher la formation de ces filopodes sont malheureusement restés
infructueux et ne permettent donc pas d’établir s’ils jouent ou non un rôle dans la
communication entre le PSC et les prohémocytes de la ZM.
Molécules diffusibles
Du fait que le PSC est requis pour maintenir l’activation de la voie de signalisation
JAK/STAT dans la ZM, le signal le plus probable émis par ces cellules pourrait être un des
Upd. Lors de l’étude du rôle de Latran (voir ci-après) j’ai montré qu’upd3 est exprimé dans la
ZM et le PSC et que seule l’expression dans la ZM est requise pour maintenir l’activation de
la voie JAK/STAT. L’expression d’un ARN double brin permettant de faire de l’interférence
à l’ARN contre upd3 dans le PSC n’entraîne aucun défaut hématopoïétique indiquant
qu’Upd3 n’est pas le signal émis par le PSC. Les mutants pour upd2 sont viables et ne
présentent pas de défauts hématopoïétiques. Enfin, upd n’est pas exprimé dans la glande
lymphatique. Ainsi, l’ensemble de ces données semble exclure que les Upd soient les signaux
majeurs émis par le PSC et requis pour le maintien des prohémocytes dans la ZM.
En même temps que nous établissions le rôle du PSC dans le contrôle de l’homéostasie des
hémocytes dans la glande lymphatique, Mandal et collaborateurs abordaient également le rôle
70
du PSC en étudiant des mutants pour le gène homéotique Antennapedia (Antp) dans lesquels
l’expression de col dans le PSC est abolie. Ils ont de plus montré que les cellules du PSC
expriment spécifiquement hedgehog (hh), tandis que les cellules de la ZM expriment d’autres
composants de la voie de signalisation Hh tels que le récepteur Patched (Ptc) et le facteur de
transcription Cubitus interruptus (Ci). Comme observé dans un mutant col, une différenciation
massive de cellules à cristaux est observée dans un mutant thermosensible pour hh (hhts) et
lorsqu’une forme dominante négative de Ci est exprimée dans la ZM (Mandal et al., 2007).
Hh est un morphogène. La diffusion de Hh à partir d’une source localisée forme un gradient
de concentration qui conduit à l’activation de différents gènes cibles en fonction de leur
distance par rapport à la source (Kornberg and Guha, 2007). Les auteurs ont proposés que Hh
sécrété par les cellules du PSC pourrait agir à distance dans la glande lymphatique pour
maintenir les prohémocytes dans la ZM.
Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère que le PSC contrôle de façon non cellulaire
autonome l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT dans la ZM via la sécrétion de
Hh. L’hypothèse la plus simple pourrait être que la voie de signalisation Hh contrôle
l’expression dans la ZM de différents composants de la voie de signalisation JAK/STAT.
Cette hypothèse est en train d’être testée dans notre laboratoire.
Cellules relais entre le PSC et la ZM
Ni notre équipe, ni celle de Mandal et collaborateurs n’indiquent que de telles cellules
pourraient être présentes dans la glande lymphatique. De plus pour le moment nous ne
disposons pas de marqueurs qui suggéreraient l’existence de différents types cellulaires à
l’intérieur de la ZM.La recherche de nouveaux gènes exprimés dans la glande lymphatique,
réalisée par Delphine Pennetier dans notre laboratoire, devrait pouvoir apporter des
informations nouvelles.
Enfin, le rôle clef du PSC dans le contrôle de la balance entre la maintenance des
prohémocytes et leur différenciation rappelle le rôle de la « niche » des cellules souches
hématopoïétiques chez les vertébrés. Ce concept de « niche » a été proposé il y a environ 30
ans en se basant principalement sur les études réalisées chez les vertébrés et les cellules
souches hématopoïétiques (CSH) présentes dans la moelle osseuse. Cependant les bases
moléculaires et cellulaires de la « niche » des CSH restent encore à établir et semblent très
complexes (pour revue (Kiel and Morrison, 2008)). La glande lymphatique représente un
système modèle de choix pour étudier in vivo les mécanismes mis en jeu dans une « niche ».
Cependant, une des difficulté pour établir des parallèles entre la fonction du PSC de la
71
Drosophile et la « niche » des CSH chez les vertébrés est qu’il est impossible chez la
Drosophile de tester le caractère « cellule souche ». En effet, les cellules souches sont définies
comme des cellules multipotentes capables de s’autorenouveler. Chez les vertébrés, pour
tester le caractère « souches » des cellules, on teste leur capacité à reconstituer in vivo tout le
lignage auquel elles appartiennent dans un organisme où ce lignage a été détruit. Ce test n’est
techniquement pas réalisable chez la Drosophile.
La recherche de cellules souches dans la glande lymphatique, réalisée par Joanna Krzemień
au laboratoire, a été principalement basée sur la recherche de l’expression dans la glande
lymphatique de marqueurs connus, dans d’autres tissus, pour être caractéristiques des cellules
souches. Cette étude est restée infructueuse mais n’exclut pas que de telles cellules puissent
être présentes dans la glande lymphatique.
L’identification de nouveaux gènes exprimés dans la glande lymphatique est une priorité de
notre équipe et devrait permettre de mieux définir les mécanismes moléculaires mis en jeu
dans le contrôle de l’hématopoïèse larvaire.
72
Article : Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the Posterior Signalling Centre
Joanna Krzemień, Laurence Dubois, Rami Makki, Marie Meister, Alain Vincent and Michèle
Crozatier
73
LETTERS
Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvaeby the posterior signalling centreJoanna Krzemien1,2, Laurence Dubois1, Rami Makki1, Marie Meister3{, Alain Vincent1 & Michele Crozatier1
Drosophila haemocytes (blood cells) originate from a specializedhaematopoietic organ—the lymph gland. Larval haematopoieticprogenitors (prohaemocytes) give rise to three types of circulatinghaemocytes: plasmatocytes, crystal cells and lamellocytes. Lamello-cytes, which are devoted to encapsulation of large foreign bodies,only differentiate in response to specific immune threats, such asparasitization by wasps. Here we show that a small cluster of sig-nalling cells, termed the PSC (posterior signalling centre)1, controlsthe balance between multipotent prohaemocytes and differenti-ating haemocytes, and is necessary for the massive differenti-ation of lamellocytes that follows parasitization. Communicationbetween the PSC and haematopoietic progenitors strictly dependson the PSC-restricted expression of Collier, the Drosophila ortho-logue of mammalian early B-cell factor. PSC cells act, in a non-cell-autonomous manner, to maintain JAK/STAT signalling activityin prohaemocytes, preventing their premature differentiation.Serrate-mediated Notch signalling from the PSC is required tomaintain normal levels of col transcription. The key role of thePSC in controlling blood cell homeostasis is reminiscent of inter-actions between haematopoietic progenitors and their micro-environment in vertebrates2–4, thus further highlighting the interestof Drosophila as a model system for studying the evolution ofhaematopoiesis and cellular innate immunity.
Similar to vertebrates, haematopoiesis in Drosophila occurs in twophases during development5. A first population of haemocyte pre-cursors is specified during embryogenesis and gives rise to an invari-ant number of plasmatocytes and crystal cells6. A second populationof haemocytes is specified during larval stages from a specializedhaematopoietic organ, the lymph gland, which ruptures at meta-morphosis and releases its prohaemocytes and haemocytes into thehaemolymph7,8. Prohaemocytes in the lymph gland can give rise tothe three types of circulating haemocytes: (1) plasmatocytes, whichare involved in phagocytosis and share properties with the mam-malian monocyte/macrophage lineage; (2) crystal cells, which arenecessary for melanization; and (3) lamellocytes, which are devotedto encapsulation of large foreign bodies9,10. The lymph gland is com-posed of four to six paired lobes located along the aorta, with theanterior-most (primary) lobe forming first (Supplementary Fig. 2)and the posterior lobes forming later, during larval development. Theprimary lobes are organized in two distinct zones: a medullary zone,containing haematopoietic progenitors that can be identified by theexpression of domeless (dome, which encodes the receptor for theJanus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signalling pathway), and a cortical zone, containing differ-entiating cells that have left the medullary zone11. In addition, ithas been suggested that a small group of cells expressing the Notchligand Serrate (Ser) and the transcription factor Collier (Col) acts as a‘posterior signalling centre’1,12. Col is required for PSC cell identity
and production of lamellocytes triggered by wasp parasitism12. Anincreased number of differentiating crystal cells are found in colmutant lymph gland, raising the possibility that the PSC has a generalrole in controlling haemocyte homeostasis.
Indeed, whereas in mid-third instar wild-type larvae the medullaryzone, as evidenced by dome-gal4/upstream activation sequence (UAS)-mCD8–GFP expression, occupies a large volume of the primary lobes(Fig. 1a), very few, if any, GFP-positive cells are detected in col mutantlymph gland (Fig. 1b). Expression of tep4, another gene specificallyexpressed in the medullary zone13, is also lost in col mutant larvae(Fig. 1c, d), confirming a premature loss of the medullary zone. Thisdisappearance correlates with increased differentiation both of crystalcells and plasmatocytes detected by prophenoloxidase and P1 express-ion, respectively (Fig. 1e, f). No difference in size or morphology of themedullary zone is observed, however, between wild type and col mutantlarvae of second and early third instar larvae (Supplementary Fig. 3),indicating that the medullary zone forms independently of the PSC.The PSC activity is, therefore, necessary to maintain a pool of haemato-poietic progenitors throughout larval development.
Whether progenitors, released from the lymph gland into the haemo-lymph at metamorphosis, are long-term progenitors maintainingactive haematopoiesis in adult flies remains unknown owing to thelack of appropriate markers. The same phenotype as col2 results fromselective killing of PSC cells using targeted expression of the pro-apoptotic gene reaper (rpr) (Pcol85-Gal4/UAS-rpr; SupplementaryFig. 1), thus strengthening the conclusion that communicationbetween the PSC and medullary zone cells controls larval haemato-poiesis. Although Notch activity within the lymph gland is requiredfor the differentiation of crystal cells, the role of Ser in the PSC—whereits expression depends on Col activity—remains uncharacterized1,12.To test whether Ser is involved, through Notch signalling, in thecommunication between the PSC and prohaemocytes, we targetedthe expression of a dominant-negative form of Ser, SerTM (ref. 14),to the PSC. This resulted in a decreased level of tep4 in the medullaryzone, and increased differentiation of crystal cells (doxA3-positivecells), but not plasmatocytes (P1-positive cells) (data not shown),indicating that the downregulation of Ser signalling only partly repro-duces the col mutant phenotype. Interfering with Notch signalling,either through SerTM expression in the PSC or in Notchts mutants,resulted in nearly complete loss of col transcription in the PSC of thirdinstar larvae, suggesting that maintaining high levels of col transcrip-tion in the PSC requires Notch signalling mediated by Ser (Fig. 1g, h).This observation is reminiscent of the regulatory loop involving Delta/Notch and proneural genes, which operates during lateral inhibition.Decreased col transcription is not due to a reduced number of PSCcells, which can be followed by GFP labelling (Fig. 1i). The number ofPSC cells was normal as was their morphology, which is characterizedby the extension of numerous long, thin processes (Fig. 1l) stained by
1Centre de Biologie du Developpement, UMR 5547 and IFR 109, CNRS and Universite Paul Sabatier, Toulouse III, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse cedex 09, France. 2JagiellonianUniversity, The Institute of Zoology, 6 Ingardena Street, 30-060 Cracow, Poland. 3UPR 9022 du CNRS, IBMC, 15 rue Rene Descartes, 67084 Strasbourg, France. {Present address:Museum of Zoology, 29 boulevard de la Victoire, 67000 Strasbourg, France.
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an actin–GFP fusion protein (data not shown), indicating that they arefilopodia. These filopodia are first observed in early third instar larvae,progressively grow in size and branching complexity throughout thethird instar and could be detected to extend over 2 to 3 cell diameters(Supplementary Fig. 2). This raises the intriguing possibility that directcellular contacts between the PSC and a subset of medullary zone cells,via filopodia, could mediate Notch signalling15 and be important forthe control of PSC function.
Col is initially expressed in all embryonic lymph gland precursorcells before becoming restricted to the PSC at the end of embryo-genesis12. To address whether this restriction is necessary for normalhaematopoiesis, we ectopically expressed col in medullary zone cells(domeless-gal4/UAS-GFP/UAS-col). Staining for markers of plasmato-cytes and crystal cells revealed the nearly complete absence of haemo-cyte differentiation in the third instar lymph gland. Correlatively, mostlymph gland cells still stained for mCD8–GFP and tep4, indicatingthat col expression in medullary zone cells prevents prohaemocytesfrom differentiating (Fig. 1j, k). In summary, experiments involvingboth loss of function and ectopic expression of col lead to the conclusionthat the control of haemocyte homeostasis requires communicationbetween two types of cells: PSC cells that segregate in late embryosand maintain high levels of col expression throughout larval develop-ment; and a pool of haematopoietic precursors that do not express col.Thus, the main role of the PSC is to block expression of genes that
trigger the differentiation of prohaemocytes, a situation reminiscentof a stem cell niche4,16
JAK/STAT activity has been shown to promote dome expression innumerous tissues17,18. To assay whether dome-gal4 expression in themedullary zone reflected active JAK/STAT signalling, we made use ofan in vivo monitor for JAK/STAT activation, the dome-MESO lacZtransgene (dome-MESO)17. Overlap between the cells expressing highlevels of dome-GFP and those expressing dome-MESO indicated thatthe JAK/STAT signalling pathway is activated in medullary zone cells(Fig. 2a). Similar to dome-GFP, expression of dome-MESO is inde-pendent of col in second instar larvae but lost in third instar larvae,confirming that col is required for maintaining the JAK/STAT path-way active (Supplementary Fig. 3 and data not shown). To askwhether this signalling was required to maintain prohaemocytes inthe medullary zone, we analysed lymph glands from stat92E mutantlarvae (STAT92E is the sole Drosophila STAT transcription factor)and found a nearly complete loss of tep4 expression and increasedhaemocyte differentiation in the primary lobes (Fig. 2b–d).
These results indicate that JAK/STAT-pathway activity is requiredfor the maintenance of the medullary zone and the control ofhaemocyte production in third instar larvae. The premature loss ofmedullary zone, together with increased differentiation of haemo-cytes that are observed either in the absence of a functional PSC or onloss of JAK/STAT activity, support the conclusion that PSC cells actin a non-cell-autonomous manner to maintain JAK/STAT activity inthe medullary zone cells, thereby conferring on them a prohaemocytecharacter (Fig. 3e). We noted, however, that unlike in col mutantlarvae, low levels of tep4 expression could still be observed in statmutant lymph glands, which correlates with morphological evidencefor a residual, reduced medullary zone. Furthermore, loss of tep4expression and premature haemocyte differentiation in stat92Emutants was only observed in the primary lobes, whereas secondarylobes maintained wild-type features. In contrast, in col mutants, pre-mature differentiation of crystal cells can be observed both in primaryand in secondary lobes with the primary lobes remaining spherical,which is reminiscent of the morphology of lymph gland from secondinstar larvae. Altogether, these data suggest that the PSC performsfunctions in lymph gland development other than merely maintain-ing JAK/STAT signalling in the medullary zone. Three putative cyto-kine-like molecules are associated with regulating the activity of the
b
doxA3doxA3tep4
WT
a dome>GFP; dome-MESO
GFP +Anti-LacZAnti-LacZ
cstat92E–GFP
dstat92E–
Figure 2 | JAK/STAT signalling pathway is required to maintain a pool ofprohaemocytes in the lymph gland. a, Expression of GFP (dome.GFP) andnuclear LacZ (dome-MESO) overlaps in the medullary zone of lymph glandsof third instar larvae, indicating that the JAK/STAT signalling pathway isactive. Residual LacZ staining in cells that have left the medullary zonereflects the high stability of the b-galactosidase protein. b–d, In stat mutants(b, c), tep4 transcription is almost completely lost from the primary lobe,correlating with increased differentiation of crystal cells. Note that in thesemutants, tep4 remains expressed in posterior lobes (arrow in b). Scale bar,40 mm.
l
PSC
a
g
col col
col>Ser TM > GFPh i
* *
col>SerTM
dome>GFP
d col– col–
tep4
k dome>col
tep4
b dome>GFP;col–
GFP + proPO + TOPRO-3
GFP + proPO + TOPRO-3
GFP + proPO + TOPRO-3
j
c WT
WT
tep4
f
e WT
Anti-P1
Anti-P1
GFP + TOPRO-3
MZ
col>GFPdome>GFP>col
Figure 1 | The PSC is required to maintain a pool of haematopoieticprogenitors. a–f, The medullary zone (marked by dome-Gal4/UAS-mCD8–GFP (dome.GFP) in a and b, and tep4 in c and d) is lost in colmutant lymph glands, whereas the number of crystal cells (proPO; a, b) andplasmatocytes (P1; e, f) increases. g, h, col transcription is decreased in thePSC (arrow) on downregulation of Notch signalling (h), whereastranscription in pericardial cells (asterisk) is unmodified; the morphology ofthe PSC is also normal (i) as visualized by the expression of mCD8–GFP andSerTM targeted to the PSC cells (col.SerTM.GFP). j, k, Forced Colexpression in the medullary zone prevents progenitors from differentiating.l, Expression of mCD8–GFP targeted to the PSC cells (col.GFP) revealsnumerous cytoplasmic extensions (arrows). Nuclei (TOPRO-3), blue;anterior, left; scale bar, 40 mm (a–k), 20 mm (l).
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326Nature ©2007 Publishing Group
JAK/STAT pathway, Unpaired (Upd) 1 to 3. Overexpression of eitherupd1 or upd2 in the PSC (using the Pcol85-Gal4 driver) or of an activeform of the JAK kinase (hopTum-l) in the medullary zone (using adome-gal4 driver) provokes larval lethality at the L1/L2 stage, pre-cluding analysis at the L3 stage (data not shown). Which Upd(s) actsin the medullary zone under the control of the PSC remains an openquestion.
Egg-laying by parasitoid wasps in Drosophila larvae triggers theproduction of lamellocytes. Using antibodies raised against thelamellocyte-specific integrin a-chain, a-PS4 (refs 12, 13), we con-firmed the absence of lamellocytes in unchallenged larvae. In con-trast, massive differentiation of lamellocytes was already observed24 h after wasp egg-laying (Fig. 3c, d). Strikingly, this was paralleledby the premature loss of the medullary zone (Fig. 3a, b), indicatingthat the production of lamellocytes takes place at the expense of thepool of prohaemocytes, which, during normal development, are stillpresent in the lymph gland when it bursts at metamorphosis. Thisreprogramming, bypassing the normal haemocyte homeostasis,reveals an unexpected level of plasticity of Drosophila prohaemocytes,which, to our knowledge, are the only Drosophila cells with a ‘cryptic’fate revealed under only specific conditions. Because lamellocytedifferentiation could not be observed when prohaemocytes differen-tiated prematurely, for instance, in the absence of the PSC (see Fig. 1)
or in hopscotch mutants (hop, the Drosophila JAK) after wasp infesta-tion (data not shown), it indicates that the maintenance of a pool ofmultipotent progenitors in the lymph gland is a prerequisite forDrosophila to be able to mount a dedicated cellular response againstparasites (Fig. 3f). Conversely, the premature loss of haemocyte pre-cursors that results from wasp infestation could have a cost in termseither of adult fitness and/or reproductive ability19,20.
The key role of the PSC in maintaining a pool of uncommittedhaematopoietic progenitors throughout Drosophila larval develop-ment that is required to generate the necessary supply of lamello-cytes in response to parasitization is very reminiscent of the micro-environmental niches that supply factors to maintain stem cellpotential in vertebrates2,3 and in the Drosophila germ line21. A signalproduced by the PSC is required to maintain JAK/STAT activity andhaemocyte progenitors in medullary zone cells (Fig. 3e). This is alsoreminiscent of the key role of JAK/STAT signalling in the stem cellniches of Drosophila male and female gonads21,22. Expression of Ser inthe PSC, and the role of Notch signalling in the control of germlinestem cell proliferation in nematodes and haematopoietic stem cellfunction in vertebrates, suggest some further parallels23–25. Yet, evi-dence for the existence of bona fide haematopoietic stem cells in theDrosophila lymph gland is still lacking. Further characterization ofPSC functions and related signalling components in the control ofDrosophila larval haematopoiesis should provide important newinsights into the interactions between the haematopoietic progeni-tors and their micro-environment, and the evolution of cellularaspects of innate immunity.
METHODSGenetics and Drosophila strains. A lethal P-lacZ insertion (Pcol85-lacZ) located
immediately upstream of the col transcription start site (position 2624 base pairs
from 11 of transcription) from which LacZ expression mimics that of col was
generously provided by W. Son. To convert it into a driver line, we used the
technique of gene replacement26 and substituted the Gal4 for the lacZ coding
region, thereby generating a Gal4 line, Pcol85-Gal4. In Pcol85-Gal4/UAS-lacZ
strains LacZ expression is first detected in the lymph gland at embryonic stage 16
and is restricted to PSC cells from that stage until pupariation (Supplementary
Fig. 1). The OregonR strain was used as wild type; Pdome-Gal4 was described in
ref. 27. Wasp infestation was as in ref. 12. To kill the PSC cells, Pcol85-Gal4 was
used to target the expression of rpr in the PSC; embryos were maintained at 16 uCto avoid embryonic lethality and larval development was at 29 uC. We used a null
allele of stat, stat397. Larval development of Pcol85-Gal4/UAS-SerTM was per-
formed at 25 uC. Embryonic and larval development of Notchts2 mutant occurred
at 29 uC.
Antibodies. Immunostaining and in situ hybridization were performed as in ref.
28. To produce polyclonal antibodies against a-PS4 we used a synthetic peptide
of 13 amino acids (Leu-Lys-Leu-Ala-Asp-Thr-Asn-Leu-Iso-Pro-Tyr-Tyr-Ser)
coupled to ovalbumin (Imject Maleimide activated Ovalbumin, Pierce) to
immunize rabbits. A dilution of 1/200 was used for immunostaining on lymph
glands. The following antibodies, dilutions and reagents were used: anti-mouse
and anti-rabbit anti-lacZ (Promega, 1/1,000, and Capell, 1/5,000, respectively);
rabbit poly-clonal anti-prophenoloxydase (1/200) and mouse mono-clonal anti-
P1 (1/30) (gifts from H.M. Mueller and I. Ando, respectively), rabbit anti-Col28,
and rabbit poly-clonal anti-GFP (Torrey Pines Biolabs, 1/1000). Alexa-Fluor-
546-conjugated goat anti-mouse (Molecular Probes, 1/250), Alexa-Fluor-647-
conjugated goat anti-mouse (Molecular Probes, 1/250) biotinylated anti-mouse
and anti-rabbit (Vector, 1/800), phalloidin (Interchim) and TOPRO3 (Mole-
cular Probes).
Received 24 August 2006; accepted 5 February 2007.
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Waspegg
a b
c d
Lamellocytes
Prohaemocytes
PlasmatocytesCrystal cells
PSC
S1S2
f
dome>GFP dome>GFP
Crystal cells
MZ
CZ
JAK /STAT
e
PSC
Notch
GFP + phalloidin + TOPRO-3 GFP + phalloidin + TOPRO-3
α-PS4 + TOPRO-3 α-PS4 + TOPRO-3
No infestation Wasp infestation
Plasmatocytes
Prohaemocytes
Figure 3 | Premature differentiation of prohaemocytes into lamellocyteson wasp infestation. a, b, The medullary zone is lost after wasp infestationand this is paralleled by lamellocyte differentiation (a-PS4) (c, d). Cellcontours are revealed by phalloidin staining (red in panels a and b). Scalebar, 20 mm. e, f, Model for larval haematopoiesis. e, During normaldevelopment the PSC acts non-cell-autonomously to maintain JAK/STATsignalling activity in the medullary zone (grey), thereby preventingpremature haemocyte differentiation. Notch signalling maintains colexpression in the PSC. f, On parasitization, a signal, probably emitted byplasmatocytes (black circles), is perceived either directly (S2) or via the PSC(S1RS2 relay), or through both ways. Col activity in the PSC is required forpro-haemocytes to adopt a lamellocyte fate. Arrows, activation; verticalbars, repression.
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327Nature ©2007 Publishing Group
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Supplementary Information is linked to the online version of the paper atwww.nature.com/nature.
Acknowledgements We thank J. Castelli-Gair Hombria, O. Devergne, M. Milan,S. Noselli, M. Zeidler and the Bloomington Stock Center for fly stocks, I. Ando andH. M. Muller for antibodies, and M. Haenlin, J. Smith, L. Waltzer for critical readingof the manuscript and discussion. We are grateful to platforme Toulouse RIOimaging and B. Ronsin for assistance with confocal microscopy. This work wassupported by CNRS, a European Marie Curie PhD Training programme grant andMinistere de la Recherche et de la technologie (ACI Biologie Cellulaire, Moleculaireet Structurale) et Ministere des affaires etrangeres (Programme Egide).
Author Contributions J.K., M.M., A.V. and M.C. conceived the experiments, whichwere essentially performed by J.K. and M.C. L.D. and M.M. provided crucialreagents. R.M. assisted with experiments involving wasp infestation. A.V. and M.C.wrote the manuscript.
Author Information Reprints and permissions information is available atwww.nature.com/reprints. The authors declare no competing financial interests.Correspondence and requests for materials should be addressed to M.C.([email protected]).
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328Nature ©2007 Publishing Group
Deuxième partie : Rôle clef de latran dans le contrôle de la voie de signalisation JAK/STAT lors de la réponse immunitaire cellulaire
Manuscrit : A short receptor down-regulates JAK/STAT signalling to control the Drosophila cellular immune response.
Introduction
Nos travaux précédents ont montré que le maintien de l’activité de la voie de signalisation
JAK/STAT, dans la ZM de la glande lymphatique, est nécessaire pour préserver des
prohémocytes dans la glande lymphatique. Nous avons également montré, que suite à une
infection par un parasitoïde, la voie de signalisation JAK/STAT est inactivée afin de
permettre aux prohémocytes de se différencier massivement en lamellocytes. Les mécanismes
moléculaires impliqués dans le contrôle de la voie de signalisation JAK/STAT dans la glande
lymphatique restent non établis.
Le séquençage du génome de Drosophila melanogaster a permis d’identifier CG14225, qui
code pour une protéine présentant une forte homologie de séquence avec Dome et que nous
avons appelée Latran (Brown et al., 2001; Hou et al., 2002). latran code pour une protéine
tronquée dans la partie intracellulaire si on la compare à Dome suggérant qu’elle pourrait agir
comme un récepteur inactif. Cependant, ni son profil d’expression ni sa fonction n’avaient été
analysés. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à l’étude du rôle de latran.
Résultats
latran est spécifiquement exprimé dans les prohémocytes de la glande lymphatique.
Latran présente une forte homologie de séquence avec Dome suggérant qu’il pourrait être
impliqué dans le contrôle de la voie de signalisation JAK/STAT. Attendu que Latran possède
un domaine intracellulaire court, dépourvu des sites de fixation pour JAK et STAT, il pourrait
agir comme un récepteur inactif. (Figure 1 de l’article). L’analyse de son profil d’expression
au cours du développement indique qu’il a une expression très restreinte par rapport à celle de
dome. dome est exprimé de façon très dynamique à la fois dans l’embryon, la larve et l’adulte
tandis que latran est uniquement exprimé au stade larvaire dans les cellules de la ZM de la
79
glande lymphatique et dans les cellules pericardiales (Figure1 de l’article). L’expression de
latran, restreinte aux prohémocytes de la glande lymphatique qui expriment également dome,
et où la voie de signalisation JAK/STAT est activée, présentait un profil très intéressant qui
soulevait la question de son rôle dans ces cellules.
Les mutants latran sont immunodéficients
Afin d’analyser la fonction de latran dans la ZM, un mutant nul a été construit par
recombinaison homologue en utilisant la méthode « Ends Out » (Gong and Golic, 2003). Les
mutants latran sont viables, fertiles et ne présentent aucun défaut morphologique ce qui est en
accord avec son profil d’expression. Les glandes lymphatiques de larves mutantes pour latran
ne présentent aucun défaut hématopoïétique en condition normale (Figure S4 de l’article).
Ceci indique que latran n’est pas nécessaire pour l’ontogenèse de la glande lymphatique. Par
contre, suite à une infection par la guêpe Leptopilina boulardi, les mutants latran sont
incapables de produire en masse des lamellocytes et vont succomber à l’infection. Une
analyse détaillée de l’activité de la voie de signalisation JAK/STAT dans des mutants latran
après parasitisme indique qu’ils sont incapables d’inactiver la voie de signalisation
JAK/STAT et donc de permettre aux prohémocytes de se différencier massivement en
lamellocytes. Ces résultats indiquent que latran est nécessaire pour inactiver la voie de
signalisation JAK/STAT dans la glande lymphatique suite à une infection par un parasitoïde
(Figure 2 de l’article).
Latran agit comme un dominant négatif de la voie de signalisation JAK/STAT
Dans des expériences de surexpression de latran in vivo ou en culture de cellules, nous avons
pu montrer que Latran agit comme un dominant négatif de la voie de signalisation
JAK/STAT. Les analyses réalisées en culture de cellules indiquent que le rapport entre Latran
et Dome est crucial afin de permettre à Latran d’inactiver la voie de signalisation JAK/STAT
(Figure 3 de l’article). Basée sur ces résultats, l’hypothèse la plus simple est que Latran et
Dome pourraient former des hétéromères inactifs qui inhibent la voie de
signalisationJAK/STAT.
80
Latran forme des hétéromères avec Dome
Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons adapté la technique de « βlue-βlau in vivo
complementation » développée et utilisée précédemment par Brown et Castelli-Gair Hombría
afin de mettre en évidence la formation de dimères de Dome in vivo (Brown et al., 2003).
Cette technique nous a permis de montrer in vivo que Latran est capable de former des
homodimères et des hétéromères avec Dome (Figure 4 de l’article).
L’infection par le parasitoïde Leptopilina boulardi modifie le rapport latran/domeless
Afin de comprendre pourquoi latran est uniquement requis après infection par un parasitoïde
bien qu’il soit transcrit dans la ZM dans des conditions normales, nous avons regardé par RT-
PCR semi-quantitative le niveau d’accumulation des ARNs messagers de dome et latran dans
des glandes lymphatiques disséquées avec ou sans infection par un parasitoïde (Figure5 de
l’article). Quatre heures après infection par la guêpe le niveau d’accumulation des transcrits
pour dome diminue fortement alors que celui de latran n’est pas affecté. Ces données
suggèrent que, suite à une infection par le parasitoïde, le ratio Latran/Dome est augmenté
favorisant la formation d’hétéromères Dome/Latran inactifs.
latran est un interrupteur qui permet une réponse coordonnée de l’ensemble des prohémocytes
Par ailleurs, nous savons que dans un mutant col tous les prohémocytes de la ZM se
différencient massivement. Or, dans un double mutant lat;col tous les prohémocytes ne se
différencient pas ; il n’y a plus de ZM organisée mais des prohémocytes dispersés persistent
dans la glande lymphatique. (Figure 2g de l’article). Ces observations révèlent qu’il y a une
activité basale de la voie JAK/STAT dans les mutants col, qui est inhibée grâce à latran. Dans
un double mutant lat ;col après infection par un parasitoïde des lamellocytes et des
prohémocytes sont présents (Figure 2h de l’article). L’ensemble de ces résultats indique que
latran sert d’interrupteur permettant d’éteindre complètement la voie de signalisation
JAK/STAT de manière coordonnée dans toutes les cellules de la ZM.
81
upd3 est nécessaire pour l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT dans la Zone Médullaire
upd3 est exprimé à la fois dans la ZM et dans le PSC. En utilisant une approche d’interférence
à l’ARN, nous avons montré que seule l’expression d’upd3 dans les cellules de la ZM est
requise pour permettre l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT dans ces cellules.
Ces résultats indiquent qu’Upd3 est le ligand de Dome dans la ZM et qu’il active la voie
JAK/STAT de manière paracrine ou autocrine. De plus, nous avons montré par RT-PCR
semi-quantitative que l’accumulation du transcrit upd3 est diminuée quatre heures après une
infection par un parasitoïde (Figure 6 de l’article).
Modèle proposé pour le contrôle de l’hématopoïèse larvaire
L’ensemble de ces résultats nous a permis de compléter le modèle proposé par Krzemień et
collaborateurs en 2007 pour le contrôle de l’hématopoïèse larvaire (Figure 7 de l’article). En
contexte normal, le PSC émet un signal Sx qui maintient la voie de signalisation JAK/STAT
active dans les cellules de la ZM et permet ainsi de maintenir l’état prohémocyte de ces
cellules. Suite à une infection par un parasitoïde un signal de danger est émis, probablement
par les plasmatocytes circulants qui ont détecté l’œuf du parasitoïde. Ce signal conduit à une
répression de l’expression de dome et upd3 dans la ZM, entraînant une augmentation du ratio
Latran/Dome et donc la formation d’hétéromères Latran/Dome inactifs. La voie de
signalisation JAK/STAT est alors inactivée et les prohémocytes se différencient massivement
en lamellocytes. Des lamellocytes peuvent se différencier dans les glandes lymphatiques
mutantes pour latran, indiquant que latran n’est pas impliqué dans le programme de
différentiation des lamellocytes, mais est requis pour inactiver la voie de signalisation
JAK/STAT dans la ZM et permettre au prohémocytes de se différencier. Nous proposons
qu’un autre signal, résultant de l’infection, instruit les prohémocytes ayant inactivé la voie de
signalisation JAK/STAT à se différencier en lamellocytes.
Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la voie de
signalisation JAK/STAT via la formation de complexes de récepteurs inactifs. Nous pensons
que ce type de régulation n’est probablement pas restreint à la Drosophile mais pourrait
également être utilisé chez les vertébrés, notamment lors de réponses immunitaires qui
nécessitent un contrôle strict et rapide de la voie de signalisation JAK/STAT tel que par
exemple la réponse inflammatoire.
82
Résultats supplémentaires
Latran ne bloque pas l’endocytose du complexe Dome/Upd
Nous avons montré que Latran forme des hétéromères avec Dome pour antagoniser
l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT. La question est maintenant de comprendre
comment il interfère avec cette voie de signalisation. Devergne et collaborateurs ont montré
que l’endocytose du complexe Dome/Upd est nécessaire pour la transduction du signal. Est-ce
que Latran bloque l’endocytose du complexe Dome/Upd ? Pour répondre à cette question
nous avons suivi la localisation subcellulaire de Dome et Latran dans des cellules S2NP en
culture en fonction du niveau d’activation de la voie de signalisation JAK/STAT. Pour cela
nous avons utilisé les mêmes conditions que celles des expériences présentées en Figure 3c de
l’article. Nous avons transfecté des cellules S2NP avec un rapporteur permettant de mesurer
l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT (Baeg et al., 2005) et avec des vecteurs
codant pour Upd et pour Dome étiquetés avec le peptide V5. Les cellules ont été transfectées
avec des doses croissantes (0ng ; 0,05ng et 1ng) d’un vecteur codant pour une protéine Latran
étiquetée avec le peptide HA (voir Figure 19). Par des immunocolorations en utilisant des
anticorps dirigés contre V5 et HA, la localisation subcellulaire des deux protéines a été
réalisée. Dans des cellules contrôles non transfectées avec latran, dans lesquelles la voie de
signalisation JAK/STAT est active nous pouvons voir que Dome est présent dans des
vésicules dans le cytoplasme comme précédemment décrit par Devergne et collaborateurs
(Figure 19A et (Devergne et al., 2007)). Dans des cellules transfectées avec 0,05ng de latran,
la voie de signalisation JAK/STAT est toujours activée à environ 80% (voir Figure D). Dans
ces cellules Latran et Dome sont dans des vésicules présentes dans le cytoplasme mais Lat et
Dome ne colocalisent presque jamais (Figure 19B). Dans des cellules transfectées avec 1ng de
latran la voie de signalisation JAK/STAT est totalement inhibée. Dans ce cas, Latran et
Dome colocalisent dans des vésicules cytoplasmiques (Figure 19C). Ces résultats montrent
que Latran ne piège pas Dome à la membrane empêchant son endocytose. Au contraire Latran
et Dome sont endocytés ensemble.
83
0
20
40
60
80
100
120
Cont pA
c vide
dome 0,
2 / u
pd 1
dome 0,
2 / L
at 0,0
5 / u
pd1
dome 0,
2 / L
at1 / u
pd1
un
ité
rela
tive
lu
cifé
rase
A B C
Figure 19. Latran ne bloque pas l’endocytose du complexe Dome/UpdA. Cellules transfectées avec 0,2ng d’un vecteur exprimant Dome-V5 (rouge) (condition A de la figure 19D). Dome est localisé dans des vésicules cytoplasmiques. Les noyaux sont marqués au Dapi (vert). B. Cellules transfectées avec 0,2ng d’un vecteur exprimant de Dome-V5 (rouge) et 0,05ng d’un vecteur exprimant HA-Latran (vert) (condition B de la figure 19D). Les flèches montrent la localisation de Dome (rouge) et de Latran (vert) dans des vésicules cytoplasmiques différentes. C. Cellules transfectées avec 0,2ng d’un vecteur exprimant de Dome-V5 (rouge) et 1ng d’un vecteur exprimant HA-Latran (vert) (condition C de la figure 19D). La flèche montre la colocalisation (jaune) de Dome (rouge) et de Latran (vert) dans des vésicules cytoplasmiques. D.Histogramme indiquant le niveau d’activité de la voie de signalisation JAK/STAT mesurée grâce à un rapporteur luciférase, dans les différentes conditions testées (A, B, C).
D
A
B
C
Dome-V5 Dome-V5 Dome-V5HA-Latran, HA-Latran,
0
20
40
60
80
100
120
Cont pA
c vide
dome 0,
2 / u
pd 1
dome 0,
2 / L
at 0,0
5 / u
pd1
dome 0,
2 / L
at1 / u
pd1
un
ité
rela
tive
lu
cifé
rase
A B C
Figure 19. Latran ne bloque pas l’endocytose du complexe Dome/UpdA. Cellules transfectées avec 0,2ng d’un vecteur exprimant Dome-V5 (rouge) (condition A de la figure 19D). Dome est localisé dans des vésicules cytoplasmiques. Les noyaux sont marqués au Dapi (vert). B. Cellules transfectées avec 0,2ng d’un vecteur exprimant de Dome-V5 (rouge) et 0,05ng d’un vecteur exprimant HA-Latran (vert) (condition B de la figure 19D). Les flèches montrent la localisation de Dome (rouge) et de Latran (vert) dans des vésicules cytoplasmiques différentes. C. Cellules transfectées avec 0,2ng d’un vecteur exprimant de Dome-V5 (rouge) et 1ng d’un vecteur exprimant HA-Latran (vert) (condition C de la figure 19D). La flèche montre la colocalisation (jaune) de Dome (rouge) et de Latran (vert) dans des vésicules cytoplasmiques. D.Histogramme indiquant le niveau d’activité de la voie de signalisation JAK/STAT mesurée grâce à un rapporteur luciférase, dans les différentes conditions testées (A, B, C).
D
A
B
C
HA-Latran, HA-Latran,Dome-V5 Dome-V5 Dome-V5
84
Fonction non cellulaire autonome de latran ?
Nous proposons dans notre modèle que Latran agit comme un interrupteur permettant aux
prohémocytes de répondre rapidement et de manière homogène à une infection en inactivant
la voie JAK/STAT. Afin de déterminer si latran a une fonction cellulaire autonome nous
avons étudié le devenir d’un groupe de cellules mutantes pour latran dans un contexte
sauvage. Pour cela, nous avons fait des clones mitotiques mutants pour latran dans la glande
lymphatique en utilisant le système Flipase/FRT. Dans des glandes lymphatiques de larves
saines les cellules mutantes pour latran se comportent de la même manière que les cellules
sauvages et expriment le rapporteur de la voie JAK/STAT dome-MESO (Figure 20A, B, C)
Ces résultats confirment que latran n’est pas requis pour l’hématopoïèse larvaire dans des
larves saines. Dans des glandes lymphatiques de larves infectées par un parasitoïde les
cellules mutantes pour latran se comportent de la même manière que les cellules sauvages et
n’expriment plus le rapporteur de la voie JAK/STAT dome-MESO (Figure 20D, E, F).Ce
résultat indique que latran agit de façon non cellulaire autonome, les cellules sauvages
voisines étant capables de compenser la perte de fonction de latran dans les clones de cellules
mutantes.
Afin de compléter cette étude j’ai également produit des clones mitotiques mutants pour dome
dans la glande lymphatique. Dans des larves saines, les cellules mutantes pour dome se
comportent comme des cellules sauvages et expriment le rapporteur de la voie JAK/STAT
dome-MESO (Figure 20G, H, I). Ce résultat très inattendu indique que dome pourrait agir de
façon non cellulaire autonome dans la glande lymphatique.
Discussion
La forte conservation de séquence entre Dome et Latran chez Drosophila melanogaster, et le
fait qu’ils sont séparés uniquement de 150 pb sur le chromosome X, suggèrent fortement
qu’ils résultent de la duplication d’un gène ancêtre. L’analyse des génomes de différentes
espèces de Drosophile, du moustique Anopheles gambiae, et de Bombyx mori indique que la
duplication n’est présente que dans le groupe Drosophila indiquant que la duplication a eu
lieu après la séparation de ce phylum et des autres diptères. Chez Drosophila melanogaster,
nous avons montré qu’au cours du développement dome et latran ont des profils d’expression
85
dome-MESO dome-MESO
Figure 20. Latran agit de manière non cellulaire autonome.A-I. l’expression de dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie de signalisation JAK/STAT, est en rouge. La GFP (vert) marque les cellules sauvages, les clones de cellules mutantes pour latran (A-F) et dome (G-I) n’expriment pas la GFP.A-C. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO. D-F. Glande lymphatique de larves vingt quatre heures après infection par un parasitoïde. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et éteignent l’expression de dome-MESO. G-I. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour dome se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO.
A B C
D E
IH
F
G
GFP GFP +
dome
latranlatran
latran
latran
latran
domedome
latran
Figure 20. Latran agit de manière non cellulaire autonome.A-I. l’expression de dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie de signalisation JAK/STAT, est en rouge. La GFP (vert) marque les cellules sauvages, les clones de cellules mutantes pour latran (A-F) et dome (G-I) n’expriment pas la GFP.A-C. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO. D-F. Glande lymphatique de larves vingt quatre heures après infection par un parasitoïde. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et éteignent l’expression de dome-MESO. G-I. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour dome se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO.
A B C
D E
IH
F
G
Figure 20. Latran agit de manière non cellulaire autonome.A-I. l’expression de dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie de signalisation JAK/STAT, est en rouge. La GFP (vert) marque les cellules sauvages, les clones de cellules mutantes pour latran (A-F) et dome (G-I) n’expriment pas la GFP.A-C. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO. D-F. Glande lymphatique de larves vingt quatre heures après infection par un parasitoïde. Les clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme les cellules sauvages et éteignent l’expression de dome-MESO. G-I. Glande lymphatique de larves saines. Les clones de cellules mutantes pour dome se comportent comme les cellules sauvages et maintiennent l’expression de dome-MESO.
A B C
D E
IH
F
G
GFP GFP +
dome
latranlatran
latran
latran
latran
domedome
latran
dome-MESO dome-MESO
86
différents suggérant que leurs expressions sont contrôlées par différentes séquences
régulatrices ou CRM (Cis Regulatory Modules). De plus, après une infection par des guêpes
l’expression de dome est diminuée tandis que celle de latran n’est pas modifiée indiquant que
leurs expressions sont contrôlées, au moins partiellement, par des CRMs différents. Dans de
nombreux tissus dome est lui-même un gène cible de la voie de signalisation JAK/STAT.
Dans la glande lymphatique, dome-MESO, le rapporteur de l’activité de la voie, correspond à
un fragment génomique de dome incluant l’intron 1 cloné en amont de la-galactosidase
(Hombria et al., 2005). Ainsi, le maintien de l’expression de dome dans la MZ est
probablement sous le contrôle de la voie JAK/STAT. Comment l’expression de dome est
diminuée suite à un parasitisme reste non établi. La diminution de l’expression de dome
pourrait être soit la conséquence de l’inactivation de la voie JAK/STAT en réponse à
l’infection soit la cause de l’inactivation de cette voie. Les données actuelles ne permettent
pas de trancher entre ces deux possibilités. En ce qui concerne latran, son expression au
contraire de celle de dome, est indépendante à la fois de la voie JAK/STAT et de l’infection
par les guêpes. Une analyse détaillée des CRMs contrôlant la transcription de dome et latran
devrait être envisagée. Pour cela, la comparaison des séquences des différents génomes de
Drosophiles devrait permettre de mettre en évidence des séquences non codantes conservées
entre les différentes espèces. Ces séquences pourraient correspondre à des régions régulatrices
fonctionnelles. L’identification des différents CRMs responsables de l’expression spécifique
dome et latran pourrait permettre de mieux comprendre comment sont régulés ces deux gènes
en condition normale et suite à un parasitisme.
Par des expériences d’expression ectopique, nous avons montré que Latran peut antagoniser la
fonction de Dome non seulement dans la glande lymphatique mais également dans d’autres
tissus où la voie de signalisation JAK/STAT est activée. La restriction de l’expression de
latran à la ZM suggère qu’il n’est impliqué que dans la réponse immunitaire cellulaire. Il est
intéressant de noter que certaines espèces de Drosophiles, telle que D. subobscura sont
incapables de former des lamellocytes suite à une infection par un parasitoïde (Eslin and
Doury, 2006). Les processus moléculaires responsables de cette immunodéficience restent
non connus. L’hypothèse la plus simple est que dans cette espèce la voie de signalisation
JAK/STAT n’est pas inhibée suite à un parasitisme et par conséquent les prohémocytes sont
incapables de se différencier en lamellocytes. latran pourrait être le chaînon manquant dans
ce processus. Cependant, D. subobscura possède des orthologues de dome et latran dans son
génome. L’acquisition de nouvelles fonctions au cours de l’évolution résulte de modifications
spatiales et temporelles de l’expression génique (pour revue (Simpson, 2007)). En effet, de
87
nombreuses études récentes ont corrélé des différences morphologiques entre différentes
espèces de Drosophile à des changements dans des séquences cis-régulatrices (Jeong et al.,
2008; McGregor et al., 2007; Williams et al., 2008). Ainsi, la première étape pour déterminer
si latran est impliqué dans l’immunodéficience de D.subobscura serait d’établir son profil
d’expression dans cette espèce.
Nos résultats indiquent que suite à une infection par un parasitoïde le rapport des transcrits
latran/dome est augmenté. Malheureusement, nous n’avons pas les moyens de vérifier le
niveau relatif des protéines Dome et Latran in vivo. En effet, ni les anticorps dirigés contre
Dome que nous a donnés Stéphane Noselli (Devergne et al., 2007) ni les anticorps que nous
avons générés dans notre laboratoire (voir Matériel et Méthodes) ne permettent de détecter les
protéines in vivo dans la glande lymphatique. Il est probable que, soit le niveau d’expression
des deux protéines est trop faible, soit elles sont instables ce qui expliquerait notre incapacité
à les détecter. En culture de cellules, grâce à l’utilisation de protéines Dome et Latran
étiquetées, nous avons pu suivre leur localisation subcellulaire. Dans des conditions où la voie
de signalisation JAK/STAT est inhibée par Latran, Latran et Dome co-localisent dans des
vésicules cytoplasmiques. Devergne et collaborateurs ont montré que l’endocytose du
complexe Dome/Upd est nécessaire pour la transduction du signal (Devergne et al., 2007).
Nos résultats indiquent que Latran n’empêche pas l’endocytose du complexe Dome/Upd et
qu’il est endocyté avec Dome. L’étape suivante sera de déterminer comment Latran
antagonise la voie de signalisation JAK/STAT. Une façon d’apporter une réponse à ce point
est de définir les rôles respectifs des domaines extra et intra cellulaires des récepteurs Dome et
Latran. La construction de protéines chimères entre Dome et Latran, par exemple avec la
partie extracellulaire de Latran associée à la partie intracellulaire de Dome et inversement
(comme cela a été réalisé précédemment lors de l’étude des récepteurs des vertébrés par
Baumann et collaborateurs en 1994) peut être envisagée. La fonction de ces protéines
chimères pourrait être testée en culture de cellule et in vivo. Il serait intéressant de déterminer
si par exemple, Latran peut signaler avec le domaine intracellulaire de Dome et si Dome peut
antagoniser la voie de signalisation JAK/STAT avec le domaine intracellulaire de Latran.
La diminution drastique et rapide de l’accumulation des ARNs messagers de dome et upd3,
quatre heures après infection par un parasitoïde, suggère une inhibition de leur transcription
qui pourrait être également associée à un contrôle post-transcriptionnel de la stabilité des
ARNs messagers de dome et upd3. Les AUBPs (AU Binding Proteins) sont capables, en se
fixant sur des séquences ARE (AU Rich Elements) présentes dans les régions 3’ non traduites
des ARN messagers, de stabiliser ou de déstabiliser ces ARN messagers (Liu, 2008; Nguyen-
88
Chi and Morello, 2008). Grâce à l’aide de Nathalie Vanzo nous avons pu identifier des
séquences ARE dans la région 3’ non traduite d’upd3. Ainsi, upd3 pourrait être soumis à une
régulation post-transcriptionelle par des AUBPs. Par ailleurs, il existe aujourd’hui des
banques de données permettant de prédire si une séquence peut être la cible de micro ARNs.
Toujours avec l’aide de Nathalie Vanzo, nous avons pu voir que la région 3’ non traduite de
dome contient des sites complémentaires pour trois micro ARNs. Il serait donc intéressant de
vérifier si dome est la cible de micro ARNs. Une première étape pourrait être de vérifier, par
Northern blot sur des ARNs extraits à partir de glandes lymphatiques, si les micro ARN
prédits sont présents.
L’analyse des clones mitotiques pour latran et dome dans la glande lymphatique, suggère que
Latran et Dome agissent de manière non cellulaire autonome. Malheureusement, ces résultats
sont discutables en ce qui concerne dome. En effet, les seuls mutants disponibles pour ce gène
correspondent à des insertions d’éléments transposables P dans la région régulatrice du gène
(Bourbon et al., 2002). Le fait que des cellules mutantes pour dome se comportent comme des
cellules sauvages est un résultat très étonnant sachant que jusqu’à présent toutes les données
de la littérature indiquent que Dome agit de façon cellulaire autonome. Les deux allèles
mutants de dome utilisés dans notre étude, sont des mutants d’expression et non des mutants
nuls protéiques. Ainsi l’hypothèse la plus plausible est que ces deux allèles ne sont pas
mutants dans la glande lymphatique. Une analyse par hybridation in situ devrait permettre de
vérifier si les clones de cellules mutantes pour dome l’expriment ou non. En ce qui concerne
latran, nous avons été très surpris de voir que, suite à une infection par un parasitoïde, les
clones de cellules mutantes pour latran se comportent comme des cellules sauvages et vont
éteindre la voie de signalisation JAK/STAT. Deux possibilités pourraient expliquer la
fonction non cellulaire autonome de latran : i) soit il existe une forme soluble du récepteur
Latran après infection, ii) soit le ligand Upd3 est une cible de la voie de signalisation
JAK/STAT et est le composant limitant pour l’activation de la voie.
i) Existence d’une forme soluble de Latran. Chez les vertébrés il existe des formes solubles
des récepteurs des cytokines de classe I résultant soit d’épissages alternatifs soit de coupures
protéolytiques des formes pleines taille. Les formes solubles agissent comme des antagonistes
de la voie JAK/STAT en titrant les cytokines. Basé sur ces données il est possible que des
formes solubles de Latran puissent également exister chez la drosophile. Nous avons donc
décidé de tester si Latran pouvait exister sous forme soluble. Des expériences ont été réalisées
en culture de cellules après transfection avec un vecteur permettant l’expression de latran. Ni
l’analyse du surnageant par Western blot, ni le transfert de ce surnageant sur des cellules
89
exprimant des rapporteurs de la voie de signalisation JAK/STAT, n’a permis de mettre en
évidence l’existence d’une forme soluble de Latran. La surexpression de latran dans toutes les
cellules de la glande lymphatique (avec le pilote srp-Gal4) permet de sauver les mutants
latran. Par contre, la surexpression de latran dans les cellules du PSC (grâce au pilote pcol85-
Gal4) ne sauve pas les mutants latran indiquant que latran doit être exprimé dans les cellules
de la ZM pour sauver le phenotype L’ensemble de ces résultats suggèrent qu’il n’existe pas
de forme soluble pour Latran.
ii) Upd3 est le facteur limitant pour l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT.
Après infection il y a une forte diminution de l’expression de dome et upd3 dans la glande
lymphatique. Upd3 est une molécule diffusible et peut donc agir sur les cellules voisines.
Nous proposons que le faible niveau de Upd3 produit après parasitisme n’est pas suffisant
pour maintenir la voie de signalisation JAK/STAT activée dans les clones de cellules voisines
mutantes pour latran.
Cette étude a mis en évidence qu’un contrôle strict de la voie de signalisation JAK/STAT est
nécessaire, suite à une infection par un parasitoïde, afin de permettre à l’hôte de survivre.
Cependant, de nombreuses questions restent en suspens. En absence de parasitisme, quel est
le signal emis par le PSC requis pour maintenir la voie JAK/STAT activée dans la ZM ?
Comment les voies de signalisation Hh et JAK/STAT sont elles interconnectées ? Comment
une infection par un parasitoïde induit-elle une diminution spécifique de l’accumulation des
transcrits de dome et upd3 ? Quels sont les signaux émis lors d’une infection qui poussent les
prohémocytes à se différencier en lamellocytes ? Comment les signaux émis par le PSC et
requis pour le maintien de l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT en condition
normale, sont antagonisés suite à une infection par un parasitoïde.
Des études, en cours au laboratoire, visent à identifier de nouveaux gènes exprimés dans la
glande lymphatique. Par une approche basée sur l’analyse de transcriptomes, Delphine
Pennetier recherche de nouveaux gènes exprimés dans la ZM, la ZC et le PSC. Elle s’intéresse
également à l’identification de gènes dont l’expression est modifiée suite à une infection par
un parasitoïde. De plus, Justine Oyallon développe une approche basée sur
l’immunoprécipitation de la chromatine pour isoler les gènes cibles directs de Col dans le
PSC. L’ensemble de ces études devrait nous permettre, à terme, de répondre aux questions
posées et ainsi de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans le contrôle
de l’hématopoïèse larvaire.
90
Manuscrit: A short receptor down-regulates JAK/STAT signalling to control the Drosophila cellular immune response.
Rami Makki1$, Marie Meister2,#$, Delphine Pennetier1, Jean-Michel Ubeda2,##, Anne
Braun2,¤, Virginie Daburon1, Joanna Krzemień1, Rui Zhou3, Alain Vincent1** and
Michèle Crozatier1**
1Centre de Biologie du Développement, UMR 5547 and IFR 109, CNRS and
Université Paul Sabatier, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse cedex 09, France 2 Institut de Biologie Moléculaire et cellulaire, UPR 9022 CNRS, Strasbourg, France 3 Howard Hughes Medical Institute, Harvard Medical School, 77 Avenue Louis
Pasteur, Boston, MA 02115, USA.
# present address : Museum of Zoology, 29 boulevard de la Victoire, 67000
Strasbourg, France.
## present address : Centre de Recherche en Infectiologie, CHUQ, Pavillon CHUL,
2705 Boul. Laurier, Ste.-Foy, Québec, Canada G1V 4G2.
¤ present address : Charles River Laboratories, 334 South Street, Shrewsbury, MA
01545, USA
$ Both authors contributed equally
** Correspondence and requests for materials should be addressed to A.V.
([email protected]) or M.C ([email protected]), Fax: 33 5 61 55 65 07.
Key words: Drosophila, JAK/STAT, hematopoiesis, lymph gland, lamellocytes
91
Summary
The Posterior Signalling Center of the Drosophila larval hematopoietic tissue, the
lymph gland, acts as a niche and maintains JAK/STAT signalling in a pool of
multipotent pro-hemocytes, thereby preventing their premature differentiation. We
show here that CG14225/latran, which encodes a short cytokine receptor, is required
for efficiently switching off JAK/STAT signalling in pro-hemocytes and allowing
massive differentiation of lamellocytes following wasp parasitization. Cell culture and
in vivo assays indicate that latran antagonises the function of Domeless, the
Drosophila type I cytokine-related receptor in a dose-dependent manner, via the
formation of inactive heterodimers. The specific role of Drosophila latran in controlling
a dedicated cellular immune response via the repression of JAK/STAT signalling
raises the question of whether short, non signalling receptors could also control
specific aspects of vertebrate immunity.
92
Introduction
The innate immune response – synthesis of antimicrobial peptides and
mobilisation of dedicated immune cells - confers a broad protection against
pathogens to all multicellular organisms. Among metazoans, only vertebrates have
developed adaptive immunity while different strategies have been developed in non
vertebrate animals (Kimbrell and Beutler, 2001). Over the last few years Drosophila
has become a model for studying the role of hematopoietic (blood) cells and the
evolution of cellular immunity (reviews by (Crozatier and Meister, 2007; Lemaitre and
Hoffmann, 2007)). Similar to vertebrates, Drosophila hematopoiesis occurs in two
waves during development (Evans and Banerjee, 2003). A first population of
embryonic hemocytes is specified and released in the hemolymph, which is
composed of two cell types : plasmatocytes involved in phagocytosis and crystal cells
required for melanisation (Bataille et al., 2005). A second wave of plasmatocyte and
crystal cell production occurs at the end of larval development. Larval hematopoiesis
can, however, give rise to a third cell type, the lamellocytes which are large cells
devoted to the encapsulation of foreign bodies too large to be phagocytised and
which only form in response to specific immune challenges such as parasitization by
wasps, a common threat for many higher order insects (Crozatier and Meister, 2007;
Lanot et al., 2001; Lemaitre and Hoffmann, 2007; Rizki and Rizki, 1984). Larval
hematopoiesis takes place in a specialised organ, the lymph gland, which forms
during embryogenesis and grows during larval development. In third instar larvae, the
lymph gland is composed of several lobes with the anterior-most lobes organised into
a medullary zone containing the hematopoietic progenitors, a cortical zone containing
differentiating hemocytes and a so-called Posterior Signalling Centre (PSC) (Jung et
al., 2005). These three zones can be molecularly identified by the expression of
different markers. In the cortical zone, crystal cells and plasmatocytes express
prophenoloxydase (proPo such as DoxA3) and P1, respectively. Hematopoietic
progenitors can be distinguished by their expression of domeless (dome), which
encodes the Drosophila receptor of the JAK/STAT pathway and tep4. PSC cells
express the transcription factor Collier/Knot (Col), the Drosophila EBF ortholog
(Dubois and Vincent, 2001) and the morphogen Hedgehog (Hh) (Crozatier et al.,
2004; Jung et al., 2005; Lebestky et al., 2003; Mandal, 2007). Recent analyses
established that the PSC plays a key function in controlling the balance between
multipotent pro-hemocytes present in the medullary zone and differentiating
93
hemocytes (Krzemien, 2007; Mandal, 2007). PSC cells act, in a non cell autonomous
manner, to maintain JAK/STAT signalling activity in pro-hemocytes, preserving the
multipotent character necessary for these cells to adopt a lamellocyte fate in
response to parasitisation. This key role of the PSC revealed that in Drosophila,
larval hemocyte homeostasis is dependent upon interactions between hematopoietic
progenitors and their micro-environment, a role reminiscent of the hematopoietic
niche in vertebrates (Crozatier, 2007; Krzemien, 2007; Mandal, 2007).
Janus tyrosine Kinases (JAKs) and Signal Transducers and Activators of
Transcription (STATs) mediate intra-cellular signalling in response to secreted type I
cytokines (Darnell, 1997). In mammals, large families of cytokines and single-pass
transmembrane receptors, named type I cytokine receptors which signal as either
homodimers or heteromers, have been identified (for review (Heinrich et al., 2003;
Kristensen et al., 2005; O'Shea et al., 2002; Taga and Kishimoto, 1997)). JAK
kinases are anchored to the intracellular part of signalling receptors. Binding of the
cytokine induces conformational changes in the latter that bring two JAKs in close
proximity. This allows JAK trans-phosphorylation and phosphorylation of the receptor,
thereby creating a docking site for STAT transcription factors. STATs become in turn
phosphorylated, leading to their dimerisation and translocation into the nucleus
where they function as transcriptional regulators. The JAK/STAT signalling pathway
regulates numerous aspects of development and tissue differentiation. Altered
JAK/STAT activity has been associated with several human diseases including
leukaemia, myocardial hypertrophy and asthma while knock-out studies in mice point
to a central role of JAK/STAT signalling in hematopoeisis and regulation of immune
functions (O'Shea and Murray, 2008; Shuai and Liu, 2003). In contrast to mammals,
only one receptor, Domeless (Dome) (Brown et al., 2001; Chen et al., 2002) one JAK
(Hopscotch, Hop)(Binari and Perrimon, 1994) and one STAT (Stat 92E or Marelle
(Hou et al., 1996; Yan et al., 1996) have been characterised in Drosophila while
three cytokines, Unpaired (Upd), Upd2 and Upd3 have been shown to act upstream
of JAK-STAT signalling (Agaisse et al., 2003; Brown et al., 2001; Chen et al., 2002;
Ghiglione et al., 2002; Gilbert et al., 2005; Harrison et al., 1998; Hombria et al.,
2005). Sequencing of the Drosophila genome revealed the existence of a gene,
encoding a protein showing sequence similarity with Dome ((Hombria and Brown,
2002; Hou et al., 2002), Fig. 1). However, neither the characteristics of this gene
94
(CG14225, renamed here latran (lat)), nor its connection to JAK/STAT signalling has
been established.
We show here that lat acts as a negative regulator of the JAK/STAT pathway in
hematopoiesis. lat is specifically required for complete turning off of JAK/STAT
signalling in progenitors cells following wasp parasitization, thereby allowing these
progenitors to differentiate into a specific cell type able to fight the invader. Cell
culture and in vivo assays indicate that lat may antagonise Dome function, in a dose-
dependent manner, via the formation of inactive heteromers. While there are many
receptors and cytokines in vertebrates, a negative regulation of JAK/STAT signalling
by a non signalling receptor chain has, so far, only been reported in cultured cells, for
a short version of GPL, which is a class I cytokine receptor. The specific role of
Drosophila lat in controlling a dedicated cellular immune response via the repression
of JAK/STAT signalling, raises the question of whether titration of JAK/STAT
signalling by non signalling receptors could also operate in vertebrates, and
prefigures a new field of investigations on the pathway.
Results
CG14225/latran encodes a JAK/STAT receptor-like protein
Class 1 cytokines are secreted proteins that regulate development, differentiation and
activation of immune cells and cells of the inflammatory system in vertebrates
(O'Shea and Murray, 2008). They bind to receptors composed of various single-pass
transmembrane protein chains that form homo and heteromeric complexes and
utilize intracellular signalling mediators of the JAK and STAT families. Dome is the
only class I cytokine receptor that has been identified and characterised in
Drosophila (Baeg et al., 2005; Brown et al., 2001; Chen et al., 2002; Muller et al.,
2005). It is distantly related to the archetypal glycoprotein 130 (GP130) vertebrate
receptor ((Boulay et al., 2003; Taga and Kishimoto, 1997), Fig. 1). Existence of a
Drosophila gene, CG14225/lat, encoding a single-passtransmembrane protein
structurally related to Dome and GP130 was noticed, however, several years ago
(Brown et al., 2001; Hou et al., 2002). The dome and lat genes are located
immediately adjacent to each other on the X chromosome and transcribed in the
same orientation, suggesting that they originate from an ancient gene duplication.
95
Figure 1. Latran: homology with JAK/STAT receptors and expression in the
lymph gland.
a) Schematic representation of the D.melanogaster domeless/latran (dome/lat) genomic region. The open reading frames and untranslated 5’ and 3’ regions are indicated by black and grey boxes, respectively. Positions of the PG125/dome-Gal4 P-element insertion (Bourbon et al., 2002) and the lat genomic fragment that was deleted to generate a null allele are indicated by an arrowhead and a red bar, respectively. b) Schematic representation of the Lat, Dome and human GP130 proteins. The green box corresponds to the Cytokine Binding Motif (CBM) and the blue box to a second conserved region between Lat and Dome, the Latran Domeless Homologous Domain (LDHD); the percentage of sequence identity is given. Fibronectin III motifs are indicated in red, the signal peptide in yellow. TM indicates the transmembrane domain. The intra-cytoplasmic regions are in grey, with the position of the STAT binding site shown in orange. c-d) Overlapping expression of lat (red fluorescent ISH, c) and dome>GFP (d) in lymph glands of third instar larvae. Position of the PSC (Col antibody bright green staining) is indicated by arrows in (d). Nuclei are highlighted in blue (TOPRO-3); anterior is to the left.
96
The key role of JAK/STAT signalling in regulating hemocyte homeostasis during
larval development led us to ask whether lat was involved in this regulation. Since
only the structure predicted by genome annotation was available (Flybase:
http://flybase.bio.indiana.edu/), we first experimentally defined the 5’ end of lat
transcripts by RACE-PCR, using total mRNA isolated from larval lymph glands. It
allowed us to position the lat transcription start and methionine initiation codon and
established that only 153 bp separates the 3’ end of dome transcripts from the lat
transcription start site (Figure 1 and S1). The Dome and predicted Lat proteins show
significant similarity in their extra-cellular domains which include, from N to C-
terminal, a signal peptide, a Cytokine Binding Motif (CBM) related to that of
vertebrate receptors and an approximately 200 amino acid domain that is not found
in vertebrate receptors. We designate this new domain, whose function remains
unknown, as LDHD for Latran-Domeless Homology Domain (Fig 1b and S2). The
CBM and LDHD show 43% and 41% identity between Dome and Lat, respectively.
Similar to GPL, the class I vertebrate receptor most closely related to Dome (Diveu et
al., 2003), Dome contains 3 tandemly arranged fibronectin type III motifs. These
motifs are not found in Lat. The intracellular region of Lat is also much shorter and
shows no significant homology to that of Dome, ((Hombria and Brown, 2002). Finally,
no consensus motif for STAT binding sites is found suggesting that Lat encodes a
non-signalling form of cytokine receptor. A search for lat-related genes in Drosophila
species whose genome sequence has recently become available indicates that,
similar to D. melanogaster, lat and dome are clustered in tandem in these species,
with an intergenic region varying from 150 bp (D.melanogaster) to 2.5kbp (D.virilis).
An evolutionary dendogram indicates a higher degree of sequence conservation
between orthologs than paralogs, suggesting an ancient duplication and that lat
sequences diverge at a much higher rate than that of dome (Fig S3).
lat is specifically expressed in hematopoietic progenitors in the Drosophila
lymph gland.
In order to determine where lat is expressed we used in situ hybridisation on embryos
and third instar larvae. Unlike dome, which shows expression in embryonic tissue, no
lat expression could be detected throughout the Drosophila embryos, a result
confirmed by RT-PCR performed on total embryonic mRNA (data not shown). This
97
indicates that the control of lat transcription is distinct from that of dome.In larvae, lat
transcription was detected both in pericardial cells and the lymph gland. In order to
determine which cells of the lymph gland express lat, we performed fluorescent in
situ hybridisation onto lymph glands expressing a membrane targeted GFP either in
the medullary zone (dome-gal4/UAS-mcd8GFP(dome>GFP)) or the PSC,
(pcol85/UAS-mcd8GFP (pcol>GFP)). Overlap between dome>GFP, which
reproduces dome endogenous expression in the lymph gland (not shown), and lat
staining indicates that lat is expressed in the medullary zone but not in the PSC (Fig
1c,d). The co-expression of dome and lat in medullary zone cells, where JAK/STAT
signalling activity is critically required to maintain a pool of hematopoietic progenitors
(Krzemien, 2007) raised the question of whether lat is playing a specific role in this
process and prompted us to undertake a genetic analysis of lat function.
lat mutants are fully viable but unable to mount a cellular immune response
against wasp parisitization.
To determine if lat plays a role in larval hematopoiesis, we generated a lat null allele
by homologous recombination (Gong and Golic, 2003). Several independent
recombination events were obtained, all verified by PCR and southern blotting, and
homozygous mutant lines established. Homozygous and trans-heterozygous
combinations of these mutant lines produced viable and fertile adults with no obvious
morphological defect, indicating that lat is not essential for either viability or germ line
development. We then looked in detail at the morphology and structure of the lymph
gland in lat mutant larvae, using specific markers for either the medullary zone (tep4),
the PSC (col) or differentiated hemocytes, crystal cells (doxA3) and plasmatocytes
(P1). No obvious difference could be observed between wt and lat mutant larvae with
either marker, suggesting that lat is not required for the ontogeny of the lymph gland
and differentiation of plasmatocytes and crystal cells that takes place in normal
developmental conditions (Fig S4). The third type of Drosophila hemocytes, the
lamellocytes, massively differentiate at the expense of the pool of hematopoietic
progenitors upon wasp parasitization. Lamellocytes start to differentiate in the lymph
gland before being released in the hemolymph. In wt larvae, the number of circulating
lamellocytes reaches its maximum 48h after wasp egg-laying (Lanot et al., 2001). In
sharp contrast to wt, they are virtually no circulating lamellocytes found in the
hemolymph of parasitized lat mutant larvae (Fig 2a,b) at either 48 or 72 hours after
98
wasp egg-laying, showing that lat function is required for the massive differentiation
of lamellocytes that is triggered by this immune challenge.
We have previously established that lamellocyte production in response to
wasp parasitization involves a premature down regulation of JAK/STAT signalling in
the medullary zone, thereby licensing hematopoietic progenitors to differentiate
(Krzemien, 2007). JAK/STAT signalling activity in the lymph gland can be monitored
by the expression of a reporter transgene, dome-MESO-lacZ (dome-MESO,
(Hombria et al., 2005; Krzemien, 2007)). In normal developmental conditions, LacZ
expression is observed in the medullary zone of lat mutant as in wt larvae, indicating
that the JAK/STAT pathway is active and lat is not required for this signalling activity
(Fig 2 and S4). We then examined LacZ expression in lat mutant lymph glands after
parasitization. In wt, dome-MESO expression is nearly undetectable 30 hours post-
infestation (Fig 2c,d) and lymph glands disperse prematurely (Lanot et al., 2001). In
sharp contrast, dome-MESO remains expressed in lat mutant lymph glands and the
lymph glands do not prematurely disperse. Very rare differentiating lamellocytes are
observed in the cortical zone (Fig 2c-f). This correlates well with the absence of
circulating lamellocytes in the hemolymph and shows that lat is required for the down
regulation of JAK/STAT activity in hematopoietic progenitors that occurs in response
to parasitisation. Since a few lamellocytes still differentiate in absence of lat activity
(Fig 2f), we also conclude that lat expression is not required for the lamellocyte
differentiating program per se but rather for allowing hematopoietic progenitors to
concertedly differentiate in response to wasp parasitization. In order to confirm this
lymph gland specific role, we performed rescue experiments by expressing lat
(pUAS-lat) under the control of a srp-Gal4 driver active in the lymph gland. This
completely rescued the ability of lat mutant larvae to mount a cellular immune
response and produce lamellocytes following wasp parasitisation (data not shown).
Taken together, the lat expression profile and mutant phenotype led us to conclude
that lat plays a critical role in regulating JAK/STAT signalling in hematopoietic
progenitors following an immune challenge.
99
Figure 2. lat mutant lymph glands do not properly respond to wasp
parasitization
a,b) 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining of circulating hemocytes from wt (a) and lat mutant larvae (b). 48h after parasitization by L. boulardi, lamellocytes are present in large numbers in the hemolymph of wt larvae (a, insert) in addition to plasmatocytes (white dots), but are completely lacking in lat mutants (b). c-f) Pro-hemocytes, marked by dome-MESO expression (LacZ immunostaining, green) (c) are not maintained in wt lymph glands following wasp parasitization and this is paralleled by massive lamellocyte differentiation (-PS4 immunostaining, red) (d). In lat mutant larvae, dome-MESO remains expressed after parasitization (e, f) and some lamellocytes differentiate. Nuclei (TOPRO-3) are in blue. g) Intermingling of pro-hemocytes (green) and differentiating cells, here crystal cells expressing proPO (red) is observed in lat;col double mutant lymph glands; some lamellocytes differentiate following wasp egg-laying (red arrow). The persistence of a pool of pro-hemocytes in col;lat mutant lymph gland confirms that lat normally acts as a differentiation switch.
100
Lat and PSC activity in the lymph gland: robustness of hemocyte homeostasis.
While JAK/STAT signalling in the lymph gland is independent of the PSC in second
instar larvae, the PSC is critically required to maintain a balance between a pool of
JAK/STAT positive progenitors and JAK/STAT negative differentiating hemocytes in
third instar larvae (Krzemien, 2007). Expression of lat in the medullary zone raised
the question of relative contributions of positive and negative regulations by the PSC
and lat respectively, in maintaining this balance. To address this question, we
examined prohemocytes (expressing dome-MESO) and cell differentiation in lymph
glands double mutant for lat and col (Fig 2g). In the single col mutant which lacks the
PSC, all pro-hemocytes differentiate (Krzemien, 2007) whereas we observed the loss
of an organised medullary zone in the lat;col double mutant, with variable numbers of
dome-MESO expressing cells intermingled with differentiated cells (Fig 2g). The
persistence of prohemocytes in the double mutant, contrasts with the single col
mutant phenotype and underlines the crucial role of lat in the complete switch from
progenitor to differentiated state that is observed in col mutant larvae. Moreover,
intermingling of prohemocytes and differentiated cells was still observed in lat;col
double mutants following wasp parasitisation (Fig 2h) with in this case some
differentiating cells being lamellocytes. These data further underline the key role for
lat in ensuring a concerted differentiation of all prohemocytes in response to a
specific immune challenge.
lat is a negative regulator of JAK/STAT signalling.
The requirement for lat for down-regulation of JAK/STAT signalling in the lymph
gland following wasp parasitisation, in addition to its structural similarity to Dome,
suggested that it potentially encodes a novel negative regulator of this pathway. To
test this hypothesis, we overexpressed lat in the medullary zone using the dome-gal4
driver and followed JAK/STAT activity using dome-MESO. lat overexpression leads
to a complete loss of lacZ expression in the medullary zone (Fig 3a-b) indicating that
it is able to block JAK/STAT signalling. To further investigate the possible mechanism
by which lat could block JAK/STAT signalling, we turned to an ex vivo reporter assay
developed in cultured Drosophila Schneider (S2-NP) cells (Baeg et al., 2005). These
cells display a basal level of endogenous JAK/STAT activity, as shown by the
expression of a transfected reporter gene containing ten STAT binding sites placed
upstream of the firefly Luciferase gene (10X Stat92E-Luciferase reporter). A much
101
Figure 3. Lat acts as a dominant-negative JAK/STAT receptor.
a,b) dome-Gal4 driven expression of lat in the medullary zone switches off JAK/STAT signalling as monitored by dome-MESO expression (LacZ, green). proPO staining (red) indicates differentiating crystal cells. c) Drosophila S2-NP cells were transfected with 10XSTAT92E-luciferase, Act-Renilla and Act-upd together with various relative amounts of Act-dome and Act-lat. Luciferase assays were performed 4 days later, and the reporter activity was normalised as the ratio of firefly luciferase/Renilla. The results were from three independent experiments.
102
stronger activity is observed, when co-transfecting a DNA construct expressing either
Drosophila cytokine, Upd, Upd2 or Upd3 (Hombria et al., 2005; Muller et al., 2005).
To assess for lat function, we therefore transfected S2-NP cells with 10XSTAT-
luciferase together with Actin promoter-driven Renilla luciferase and Upd expression
vectors (Act-Renilla and Act-Upd). We also co-transfected Actin promoter-driven
Dome (Act-dome) and/or Lat (Act-lat) expression vectors in different relative
concentrations. Adding Act-dome modestly increased the level of JAK/STAT
signalling.In contrast, addition of similar amounts of Act-lat severely decreased
signalling (> 4 fold), confirming that lat acts as a negative regulator of the pathway
(Fig 3c). Intermediate levels of JAK/STAT inhibition were observed when pAc-dome
and pAc-lat were co-transfected in different relative amounts indicating that the ratio
between Lat and Dome is critical (Figure 3c). Altogether, these data confirm that lat is
a negative regulator of JAK/STAT signalling and further suggest that the ratio
between dome and lat is a key factor in controlling JAK/STAT activity in the
Drosophila hematopoietic tissue.
Lat and Dome can form heterodimers in vivo
It was previously shown that Dome acts as homodimers to activate the
JAK/STAT pathway ((Arbouzova and Zeidler, 2006; Hombria and Brown, 2002).
Since long and short forms of vertebrate class 1 cytokine receptors can form homo-
or heterodimers and multimers ((Heinrich et al., 2003) and see discussion), it raised
the possibility that Lat could down-regulate JAK/STAT signalling through the
formation of inactive heterodimers with Dome. We thus designed experiments to test
whether Lat and Dome are able to form heterodimers in vivo, using the blue-blau
gal complementation technique developed to detect protein interactions in vivo
(Mohler and Blau, 1996; Rossi et al., 1997) and successfully applied to show that
Dome forms homodimers (Brown et al., 2003). Briefly, this technique uses two -gal
mutant forms ( and ) that are separately inactive but can complement each
other if brought into proximity by fusing them to proteins that physically interact.
Formation of such dimers of fusion proteins can be visualised by staining for -
galactosidase activity. We first used embryos for the complementation assays, using
the ubiquitous da-gal4 driver to co-express different combinations of Lat, Lat
Dome and Dome fusion proteins (Fig. 4). Strong X-gal staining was detected in
103
Figure 4. Lat forms heterodimers with Dome in the lymph gland.
a-c) Formation of either Dome or Lat homo-dimers or Lat/Dome hetero-dimers in da-Gal4xUAS-Dome/UAS-Dome (a), da-Gal4; UAS-Lat/UAS-Lat (b) or (c) da-Gal4; UAS-Lat/UAS-Dome embryos, as visualised by X-Gal staining (blue). In stage 13 embryos, strong staining is observed in the salivary glands (black arrow) and the hindgut (black arrowhead). (d) Formation of Dome/Lat hetero-dimers in the medullary zone of the lymph gland.
104
the salivary glands and hind gut (Fig 4a) when Dome and Dome were co-
expressed, as previously reported (Brown et al., 2003). A similar staining pattern was
observed upon co-expression of Lat/Lat Lat/Dome or Lat/Dome
(Fig 4b-c and not shown), while no staining could be detected when only one of the
fusion proteins was expressed. These results indicate that Lat is able to form
homodimers and heterodimers with Dome in vivo. We then performed -gal
complementation assay in the lymph gland using the dome-Gal4 driver. While no X-
Gal staining could be observed when either Dome or Latalone was expressed,
we observed X-gal staining in the medullary zone following co-expression of
Dome and Lat (Fig. 4d) or Lat and Dome (not shown). However, we were
unable to determine if Dome or Lat can form homodimers in the lymph gland since
dome-Gal4 driven expression of two copies of Dome or Lat leads to early lethality. In
the course of these experiments, we also observed that dome-gal4-driven expression
of either Lat, Lat or Lat resulted in a “outstretched wing” phenotype in adult
flies. The “outstretched wing” phenotype was previously described for upd mutant
flies, hence the name outstretched (os/upd) given to upd mutants (Harrison et al.,
1998; Weischaus, 1984). The similarity between the upd mutant phenotype and the
phenotype induced by dome-Gal4 driven ectopic expression of lat indicates that lat is
able to down-regulate JAK/STAT signalling in tissues other than the lymph gland,
when ectopically expressed. Taken together, our data support the conclusion that Lat
can form heterodimers with Dome in vivo in the same tissue where Dome can form
homodimers.
Wasp infestation lowers the Dome/Lat ratio.
Our ex vivo and in vivo data pointed to the Dome/Lat ratio as a key component in the
regulation of JAK/STAT signalling in response to cytokines. To determine whether
this ratio is modified upon wasp parasitisation, in conditions where strong down-
regulation of JAK/STAT signalling is observed in the medullary zone, we compared
the relative levels of accumulation of lat and dome in lymph glands. Semi-quantitative
RT-PCR were performed on total RNA extracted from dissected lymph glands taken
from control larvae and larvae 6 hours after wasp egg-laying. We opted for a short 6
hours delay in order to mainly detect primary changes in the accumulation of
transcripts that occur in response to parasitism (Wertheim et al., 2005).
105
Figure 5: dome and upd3 are down regulated four hours after wasp infestation.
Quantitative analysis of transcripts accumulation relative to the Ribosomal Protein 49 (RP49) indicates a significant decrease of dome and upd3, but not of lat transcripts following wasp egg laying. Three independent experiments were performed
106
Whereas we did not detect a significant change in the accumulation of lat transcripts,
we consistently observed an important decrease of dome RNA level (not shown),
resulting in a drop in the dome/lat ratio. In order to better define when dome
accumulation is affected after infestation we reproduced these analysis on lymph
glands dissected two and four hours after wasp infestation. No changes in lat and
dome were observed two hours after infestation whereas four hours after infestation
a strong decrease in dome but not lat was observed (Fig 5). We propose that it is the
shift in dome relative to lat expression which operates as a switch to license pro-
hemocytes to differentiate upon wasp infestation. This postulate, which is consistent
with measurements of JAK/STAT activity in cultured cells transfected with various
amounts of lat and dome expression vectors (Fig 3c), further predicts that Lat acts as
a dominant-negative receptor protein in conditions where the Lat/Dome ratio favours
the formation of Lat/Dome inactive hetero-dimers.
upd3 is expressed and required for JAK/STAT signalling activity in the
medullary zone.
Three different ligands, Upd, Upd2 and Upd 3 are able to activate JAK/STAT
signalling in Drosophila (Gilbert et al., 2005; Harrison et al., 1998). Cell culture
assays showed that lat can antagonise JAK/STAT signalling whatever the cytokines
(Upd, Upd2 and Upd3) used to activate the pathway suggesting that lat function is
independent of the acting cytokine (data not shown). The upd2 mutant shows no
hematopoietic phenotype (data not shown). Mutants for upd and upd3 are either
embryonic lethal or not available, respectively precluding functional test. To establish
which Upd could be active in the lymph gland we first performed in situ hybridisation
and RT-PCR experiments. upd3 but not upd transcripts were detected in lymph
glands (Fig 5, 6 and not shown), leading us to study upd3 in detail. Unlike upd and
upd2, only genome annotation data were available for upd3 hence we verified the 5’
end of upd3 by RACE-PCR, starting from total RNA isolated from larval lymph glands
(Fig S5). In order to identify which lymph gland cells express upd3, we performed
fluorescent in situ hybridisation in Dome>GFP and pcol>GFP lymph glands where
GFP labels the medullary zone and PSC cells, respectively. Overlap between the
107
Figure 6. upd3 is expressed and required to maintain JAK/STAT signalling in
pro-hemocytes.
a) upd3 expression (white, left panel) overlaps that of dome>GFP (green, right panel) in lymph glands of third instar larvae indicating that it is expressed in prohemocytes. b) upd3 (red) is also expressed in the PSC (pcol>GFP, green). c) dome-Gal4 driven expression of upd3 dsRNA leads to the loss of dome-MESO expression (LacZ, green). proPO staining (red) indicates differentiating crystal cells . Nuclei (TOPRO-3) are in blue.
108
cells expressing upd3 and both medullary zone (dome>GFP) and PSC (pcol>GFP)
cells indicated that upd3 is expressed in both domains (Figure 6a-b, (Jung et al.,
2005)). Previous studies performed in vivo and in cultured cells had established that
upd3dsRNA can efficiently suppress upd3 activity (Agaisse et al., 2003). To
determine whether upd3 is required for JAK/STAT signalling in the medullary zone,
we looked at dome-MESO expression when upd3dsRNA expression was targeted to
the medullary zone (UAS-upd3dsRNA/dome-Gal4). Semi-quantitative RT-PCR
performed on RNA extracted from dissected lymph glands showed a strong decrease
in the amount of upd3 mRNA, confirming that upd3dsRNA is functional in the lymph
gland (not shown). dome-MESO expression was not detected in these conditions,
indicating that upd3 expression is required in the medullary zone to maintain high
level of JAK/STAT signalling (Fig 6c-d). When upd3dsRNA expression was targeted
to the PSC (pcol-Gal4), dome-MESO expression was unperturbed (not shown). To
determine whether upd3 levels are modified upon wasp parasitisation, in conditions
where the JAK/STAT signalling is decreased, we performed semi-quantitative RT-
PCR on total RNA extracted from dissected lymph glands taken from control larvae
and larvae four hours after wasp egg-laying. We observed a significant decrease of
upd3 transcripts (Fig 5) that correlates well with the strong down-regulation of
JAK/STAT signalling. Altogether, expression and functional data lead us to conclude
that upd3 expression in medullary zone cells contributes to maintenance of high
levels of JAK/STAT signalling in these cells.
Discussion Studies on the role of interferon in the control of immune responses led to the
discovery of the JAK/STAT signalling pathway which is evolutionarily conserved.
While the human genome encodes multiple isoforms of all major JAK/STAT pathway
components, including multiple receptor subunits, only one functional receptor,
Dome, had so far been characterised in Drosophila. Interestingly, sequence similarity
between dome and the neighbouring gene CG14225/lat was noted several years
ago, suggesting an ancient gene duplication event and raising the question of the
role of lat. By generating a lat knock out, we show here that it is specifically and
critically required for the control of lamellocyte differentiation, the Drosophila
dedicated response to wasp parasitisation. Lat acts by forming heterodimers with
Dome, thereby antagonising Dome function in a dose-dependent manner. Lat
109
Figure 7: Model for lat function in Drosophila larval hematopoiesis.
a, During normal development (left graph), PSC cells (yellow) act, in a non cell autonomous manner (arrow X ), to maintain JAK/STAT signalling activity (green shades) and preserve a pool of multipotent prohemocytes in the medullary zone (adapted from Krzemien et al., 2007). Signal X overrides lat function (grey shades). In response to parasitization (right graph), signal X is court-circuited. As a result, JAK-STAT signalling is switched off, licensing prohemocytes to differentiate into lamellocytes (red arrow). Lat activity is strictly required for this switching off. In the absence of lat (center panel), residual JAK-STAT activity preserves a pool of pro-hemocytes. Some differentiating cells become lamellocytes, however, indicating that lat is not required for this fate. Arrows indicate activation, vertical bars repression. b. Lat forms inactive heterodimers with Dome. Schematic representation of the Dome homodimer signalling receptor (left, adapted from(Arbouzova and Zeidler, 2006)) and two possible forms of Dome/Lat inactive heterodimers (right). JAK/STAT signalling in the lymph gland depends upon the Lat/Dome ratio.
110
structure, expression and function highlight a novel mechanism of tissue-specific
regulation of the JAK/STAT pathway that controls the immune response.
Switching off JAK/STAT signalling and orienting pro-hemocytes towards a
lamellocyte fate: two facets of the Drosophila immune response to wasp
parasitization
In order to mount an efficient cellular response to wasp parasitism, the hematopoietic
organ of Drosophila larvae must rapidly produce large amounts of lamellocytes that
encapsulate the parasite. The production of lamellocytes in the lymph gland is a
tightly regulated process. Previous analyses have established that maintenance of
JAK/STAT signalling in the hematopoietic progenitor zone (medullary zone), under
the control of the PSC, is required to preserve the pro-hemocyte character of these
cells throughout larval development. In non-immune conditions, hemocyte
differentiation correlates with the loss of dome expression in pro-hemocytes. Upon
wasp infestation however, JAK/STAT signalling is switched off prematurely in the
entire medullary zone leading to a concerted differentiation of pro-hemocytes into
lamellocytes (Krzemien, 2007). The mechanisms responsible for this switching off
remained unknown. In col mutant lymph glands which are devoid of PSC cells, no
lamellocytes can differentiate after wasp infestation as the pool of prohemocytes is
not maintained throughout the larval life. However, pro-hemocytes persist in lat;col
double mutant lymph glands, suggesting that a basal level of JAK/STAT signalling
subsists in this mutant context, leading to a stochastic differentiation of
prohemocytes. The comparison of col, lat and col;lat mutant phenotypes thus
strengthens the conclusion that lat functions as a switch in conditions of low
JAK/STAT signalling, which can occur either upon wasp parasitisation or upon
removal of the PSC such as in col mutant larvae (Krzemien, 2007). In normal
developmental conditions, PSC activity overrides lat function in the medullary zone.
Upon wasp infestation, this activity is short-circuited and lat plays a decisive role in
completely silencing the JAK/STAT pathway in all prohemocytes. Hemocyte
homeostasis in the lymph gland thus relies on both extrinsic signals from the niche
(the PSC) and intrinsic JAK/STAT activity in progenitor cells (Fig.7). Interestingly, in
both lat or lat;col double mutants, some lamellocytes differentiate following wasp
parasitisation. This indicates that lat function is not required for the lamellocyte fate
111
per se and that switching off JAK/STAT signalling and orienting prohemocytes
towards a lamellocyte fate are two distinct responses to wasp parasitisation (Fig.7).
Separate regulations of lat and dome expressions upon wasp infestation
underlie lat function.
Cell culture assays showed that lat can antagonise dome function irrespective of
which cytokines activate the JAK/STAT pathway. In situ hybridisation and lymph
gland targeted dsRNA experiments show that upd3 is expressed and required in the
medullary zone. Upd3 might be involved in a positive autoregulatory loop maintaining
JAK/STAT activity in pro-hemocytes in an autocrine and/or paracrine manner, as
previously reported for Upd (Gergen and Wieschaus, 1986; Harrison et al., 1998;
Sefton et al., 2000). That dome itself and upd3 are both components and targets of
JAK/STAT signalling in the medullary zone is supported by the rapid decrease of
both dome and upd3 mRNA levels upon wasp parasitisation in conditions where
JAK/STAT signalling is turned off (Fig 5). Previous analysis established a positive
dome autoregulation in the embryonic mesoderm which is driven by intronic
regulatory sequences used to generate the dome-MESO reporter gene (Hombria et
al., 2005). How dome is down-regulated in the lymph gland after wasp infestation
however remains unknown. At least, two none-mutually exclusive possibilities exist:
infestation either antagonises the positive signal(s) issued from the PSC which is
(are) required for maintaining JAK/STAT activity in the medullary zone or has a direct
effect on pro-hemocytes. Whatever the mechanism involved to down-regulate dome
expression, it results in a drastic increase in the Lat/Dome ratio, allowing Lat to
antagonise Dome function (Fig. 7). An interesting point to note is that even if lat and
dome lie very close on the chromosome, they are not co-regulated in response to
parasitisation. A similar tandem organisation is found in other Drosophila species,
providing access to inter-specific sequences comparison of lat and dome non-coding
regions which might allow the identification of potentially active cis-regulatory
modules. Studies performed in vertebrates have shown the importance of post-
transcriptional regulation of mRNA levels, including the process of ARE-mediated
decay (AMD) and mRNA release from granules stored in the cytoplasm which
provide a rapid “on/off” control (for review (Anderson, 2008)). Thus, post-
112
transcriptional control of dome and upd3 mRNAs could also operate following wasp
parasitization, something which remains to be investigated.
dome and lat, a pair of duplicated genes with antagonistic functions
Dome, the Drosophila JAK/STAT receptor is most similar to the archetypical human
GP130 signalling receptor and related GPL receptor, which form heteromeric
complexes with short, non signalling receptors such as IL-6R or OSM-R to mediate
interleukin 6 and 31 signalling, respectively (Diveu et al., 2004; Diveu et al., 2003;
Ernst and Jenkins, 2004). Annotation of the Drosophila genome predicted that lat
encodes a short-type receptor that might act either as IL-6R and confer signalling
specificity to Dome or as a dominant-negative receptor as previously described in cell
culture for a short isoform of GPL (Fig. S6, (Diveu et al., 2004)). Two independent,
systematic genome-wide RNA interference screens for JAK/STAT signalling
components recently conducted in Drosophila cultured cells which identified large
sets of putative positive and negative regulators failed to detect lat likely because its
expression level was too low to be functional. (Baeg et al., 2005; Muller et al., 2005).
We show here that in cell-culture assays lat antagonises dome activity in a dose-
dependent manner suggesting that Lat acts as a dominant-negative receptor. In vivo
protein complementation assays further confirmed the ability of Lat and Dome to form
heteromers in the lymph gland. While our analysis shows that lat is specifically
required in the larval hematopoietic organ for massive lamellocyte production in
response to an immune challenge, phenotypes induced by ectopic lat expression
establish that it is able to antagonise dome function in other tissues. Altogether,
these data suggest that a tight control of lat expression has been selected during
evolution to fulfil specific immune functions.
A conserved role for dominant-negative short receptors in the JAK/STAT
pathway?
The JAK/STAT pathway is highly conserved between Drosophila and mammals and
plays critical roles in development, immunity and inflammation (O'Shea and Murray,
2008). Annotation of arthropod and vertebrate genomes indicates that the type I
cytokine receptor family has considerably expanded in vertebrates (Boulay et al.,
2003). This expansion results both from an increased number of receptor genes and
from expression of various protein isoforms. Earlier structural studies, performed in
113
vertebrates, already distinguished between long and short chain type I cytokine
receptors as corresponding to signal transducing (signalling) receptors such as
GP130 and non-signalling -receptors such as IL-6R (Taga and Kishimoto, 1997).
Functional receptors consist of various chains that associate in higher order
homomeric or heteromeric complexes. The complexes formed between GP130 and
different cytokines have been particularly well studied. A recent structural study has
shown that GP130 forms a hexameric signalling complex structure with the IL6-R
receptor bound to IL6; binding of IL-6R/IL-6 induces a conformational change in
GP130 that induces JAK trans-phosphorylation (Skiniotis et al., 2005). At the
opposite, however, the expression in cell cultures of a short isoform of the GP130-
related receptor GPL was shown to exert a dose-dependent inhibitory effect on IL-31
signaling through GPL although, the molecular mechanism of this antagonism
remains unknown (Diveu et al., 2004; Diveu et al., 2003). Our in vivo studies indicate
that Lat acts as a dominant-negative receptor rather than a co-receptor, extending
the few observations made so far only in mammalian cultured cells (Perrot-Applanat
et al., 1997; Ross et al., 1997). Our observations made in Drosophila suggest that
regulated expression of short receptor isoforms could be a much more widespread
mechanism to regulate development and/or activation of the immune system than
anticipated. All cytokine signalling pathways are subject to extensive positive and
negative feedback regulations, which are crucial to generate appropriate
physiological responses (Shuai and Liu, 2003). The dominant negative effect exerted
by Lat, which is both tissue-specific and revealed only under specific immune
conditions, establishes a new regulatory mechanism to antagonise JAK/STAT
signalling in Drosophila. Whether and when this mechanism is employed in
controlling immunity in vertebrates certainly deserves further investigation.
Materials and Methods
Drosophila strains.
The following strains were used : pcol85-Gal4;UASmcd8GFP (pcol>GFP, (Krzemien,
2007); PG125-dome-Gal4 (dome-Gal4, (Bourbon et al., 2002) and srp-Gal4
(Crozatier et al., 2004). da-Gal4 was obtained from the Bloomington Drosophila
Stock Center. We thank James Hombria-Castelli-Gair for providing the dome-MESO,
UAS-dome, UAS-DomeΔα and UAS-DomeΔω lines (Brown et al., 2003) , Hervé
Agaisse for UAS-upd3dsRNA (Agaisse et al., 2003) and François Karch for
114
P[70FLP][70I-SceI)/TM3 and P[ry+ ; FLP)10 (chromosome II). The Oregon R strain
was used as wt.
Generation of a lat nul mutant by site-directed mutagenesis.
The procedure was adapted from Gong and Golic’s Ends out Knock Out method
(Gong and Golic, 2003). Two different inserts on the II chromosome were selected for
the targeting protocol. Final evidence for lat deletion was obtained by Genomic
southern blots and PCR analysis on genomic DNA using primers localised in lat
(primers 1 and 14, Figure S1)
Constructions.
The identification of lat and upd3 transcript 5’ ends was performed by 5’ RACE PCR
(« Marathon cDNA amplification kit », Clontech, and BD SmartTM RACE Kit, BD
Biosciences, respectively) using either polyA+ RNA from hopTum-l larvae or total RNA
from dissected OregonR lymph glands. Several fragments corresponding to lat
cDNA were cloned in Invitrogene pCRBluntII-TOPO. Full length lat cDNA was
reconstituted in the pUAS-T vector for injection to generate UAS-Lat transgenic lines.
UAS-LatΔα and UAS-LatΔω were constructed using the complete lat cDNA fused to
the -galactosidase and fragments isolated from the pUAS-Dome-LacZΔα and
pUAS-Dome-LacZΔω clones, respectively (Brown et al., 2003). The fusion constructs
were sub-cloned into the pUAS-attB vector to generate transgenic flies using the
ZH49B and ZH86F attP integration platforms (Bischof, 2007).
RNA probes
lat primers 7 and 9 (Figure S1) were used to amplify a genomic fragment of 526bp
that was cloned in the Invitrogen pCRBluntII-TOPO vector. upd3 probes of 836 bp
and 2057 bp were designed for in situ hybridisation, (primers 1 and 2, and 5 and 6,
Figure S5) using pGEM-T easy as a cloning vector.
In situ and antibody staining.
Dissections, in situ hybridisation and immunostaining procedures were as described
(Dubois et al., 2007; Krzemien, 2007) The following antibodies were used: rabbit anti-
GFP (Torrey) 1/500; mouse anti--galactosidase (Promega) 1/800 ; rabbit anti proPO
1/200 ; mouse anti-Col (clone 35, (Krzemien, 2007) 1/50 ; rabbit anti-PS4
(Krzemien, 2007) 1/200. Mounting in Vectashield medium (Vector Laboratories,
Burlingame, California, United States) preceded observation and photographs by
LeicaSP2 confocal microscopy (Leica, Wetzlar, Germany).
115
X-Gal Staining.
To detect β-galactosidase activity, third-instar larvae were fixed and subjected to a
standard X-Gal staining protocol at room temperature.(Brown et al., 2003).
RNA amplification and semi-quantitative RT-PCR.
Dissected lymph glands were collected in trizol and total RNA was extracted using
trizol reagent (Invitrogen) according to the manufacturer’s instruction. Superscipt
Reverse Transcriptase II (Invitrogen) and oligo dT primers were used for reverse
transcription and Taq polymerase (Q-Biogen) for PCR. Primers used: 1 and 4 and 7
and 9 for dome and lat, respectivey (FigS1); 3 and 4 for upd3 (Fig S5) and
5’GCACCAGGAACTTCTTGAATCCGC3’and5’CTTCAAGGGACAGTATCTGATGCC
5’, for RP49. Data are representative of experiments that were repeated three times.
Cell culture experiments
Act-lat and Act-dome tagged with V5 and HA and Act-upd3 were used for
transfection into S2-NP cells as described (Baeg et al., 2005). Luciferase assays
were made in triplicate from independent transfections.
Acknowledgements: We thank James Hombria-Castelli-Gair, Rob Maeda and
François Karch Hugues Gascan Sébastien Carreno, Konrad Basler for plasmids and
fly strains and the Bloomington Stock Center for fly stocks, I. Ando H.M. Müller for P1
and proPO antibodies, Henri-Marc Bourbon, Vanessa Gobert and Nathalie Vanzo for
discussions and Muriel Boube, Justine Oyallon, Serge Plaza and Lucas Waltzer for
critical reading of the manuscript. We thank Norbert Perrimon for hospitality and help
with the cell culture assays. We are grateful to B. Ronsin and A. Leru for assistance
with confocal microscopy (Plateforme Imagerie Cellulaire RIO Toulouse). This work
was supported by CNRS, Ministère de la Recherche (ACI and ANR programs) and
ARC. RM and JK benefited from fellowships from FRM and ARC, respectively.
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121
ATG STOPTM
TIR
CG31708 CG12439 toll4 CG31609 Or30a
Région génomique 2L, 29F7-30A2 :
ATATAATTACAAGACTAATTTGTTATTGGTCACAGCGGATTTATGAATTTTTTCTTTTGCTTGTTAAGAGCAAATC TTCCAGTCAATTCAGTTCAGTTTAAAGATTGACCCAGACTACATCGTACC
CATTAACTGTTCCAACGGATTGGGCAATATTAGAGAGGACTACTGTGAAATATATTTGGATGAACTTGGCGAAAACGGAACATGCTCAATAGCTAATAATGAAGTAACCACTGA
ATGTATGTCGAGTAAAATAATATTTCTGTTTTTTCT
TTTTTTTATTCAACACCCTACAGA
5kb
Figure 21. organisation génomique du locus toll4.Les exons sont indiqués (Ex1, 2, 3, 4). TM: séquence codant pour le domaine transmembranaire. TIR: région codant pour le domaine TIR. Le nouvel ATG et indiqué en rouge.
X ATG
Ex1 Ex2 Ex3 Ex4
ATG STOPTM
TIR
CG31708 CG12439 toll4 CG31609 Or30a
Région génomique 2L, 29F7-30A2 :
ATATAATTACAAGACTAATTTGTTATTGGTCACAGCGGATTTATGAATTTTTTCTTTTGCTTGTTAAGAGCAAATC TTCCAGTCAATTCAGTTCAGTTTAAAGATTGACCCAGACTACATCGTACC
CATTAACTGTTCCAACGGATTGGGCAATATTAGAGAGGACTACTGTGAAATATATTTGGATGAACTTGGCGAAAACGGAACATGCTCAATAGCTAATAATGAAGTAACCACTGA
ATGTATGTCGAGTAAAATAATATTTCTGTTTTTTCT
TTTTTTTATTCAACACCCTACAGA
5kb
X ATGATG
Ex1 Ex2 Ex3 Ex4
Figure 21. organisation génomique du locus toll4.Les exons sont indiqués (Ex1, 2, 3, 4). TM: séquence codant pour le domaine transmembranaire. TIR: région codant pour le domaine TIR. Le nouvel ATG et indiqué en rouge.
122
Troisième Partie : La voie de signalisation Toll/NFκB :
Caractérisation du récepteur Toll4
Introduction
La voie de signalisation Toll/NFκB joue un rôle clef dans la réponse humorale chez la
Drosophile (Figure1). A ce jour aucun rôle n’a été décrit pour cette voie de signalisation dans
la réponse immunitaire cellulaire. Cependant, l’activation constitutive de la voie Toll/NFκB,
observée dans des mutants Toll10B et perte de fonction du gène cactus, induit la formation de
lamellocytes en absence d’infection par un parasitoïde. Ces données suggèrent un rôle de cette
voie de signalisation dans l’hématopoïèse larvaire. Suite au séquençage du génome de
Drosophila melanogaster neuf récepteurs de la famille Toll ont été identifiés. Kambris et
collaborateurs ont établi le profil d’expression des neuf tolls au cours de l’embryogenèse
(Kambris et al., 2002). Seul toll4 est exprimé dans la glande lymphatique embryonnaire. Une
observation plus détaillée de l’expression de toll4 dans l’embryon indique que seul un sous
ensemble des cellules de la glande lymphatique l’exprime qui semble correspondre aux
cellules du PSC (Figure 23). En me basant sur cette observation, et les phénotypes mutants
pour les mutants Toll10B et cactus, j’ai entrepris de caractériser le rôle de toll4 dans la réponse
immunitaire cellulaire.
Résultats
Nouvelle annotation de la région génomique de toll4
Le gène toll4 annoté dans Flybase est composé de quatre exons (Ex1-4 voir figure 21). Le
dernier exon contient notamment les séquences codantes pour le domaine transmembranaire
et le domaine TIR. Le gène toll4 s’étend sur 5334 pb et code pour une protéine de 1125 acides
aminés. Des expériences de 5’RACE PCR réalisées par Marie Meister, à partir d’ARNs
extraits de glandes lymphatiques dissequées, ont permis de montrer que l’annotation de toll4
était incorrecte. En effet, la séquence 5’ obtenue par nos expériences ne correspond pas à celle
prédite et positionne l’ATG juste en amont de l’exon 3 (Figure 21).
123
toll1 toll2
toll5
toll6 toll9
toll3
Figure22. Hybridations in situ des TLR de Drosophile sur des glandes lymphatiques de larves au troisième stade larvaire.A, B. toll et toll2 sont exprimés de façon ubiquitaireC-F. Aucune expression n’est détectée pour toll3, toll5, toll6 et toll9
A
E
DC
B
F
toll1 toll2
toll5
toll6 toll9
toll3
Figure22. Hybridations in situ des TLR de Drosophile sur des glandes lymphatiques de larves au troisième stade larvaire.A, B. toll et toll2 sont exprimés de façon ubiquitaireC-F. Aucune expression n’est détectée pour toll3, toll5, toll6 et toll9
toll1 toll2
toll5
toll6 toll9
toll3
toll1 toll2
toll5
toll6 toll9
toll3
Figure22. Hybridations in situ des TLR de Drosophile sur des glandes lymphatiques de larves au troisième stade larvaire.A, B. toll et toll2 sont exprimés de façon ubiquitaireC-F. Aucune expression n’est détectée pour toll3, toll5, toll6 et toll9
A
E
DC
B
F
124
La comparaison des séquences génomiques de toll4 chez différentes espèces de Drosophiles
(D.yakuba, D.ananasae, D.pseudoobscura) indique que seul l’ATG identifié dans nos
expériences de 5’RACE PCR est conservé dans ces différentes espèces tandis que les
séquences situées plus en 5’ sont divergentes. Cette nouvelle annotation indique que toll4
s’étend sur 3254pb et code pour une protéine de 1006 acides aminés.
toll4 est spécifiquement exprimé dans le PSC
Afin de déterminer le profil d’expression des différents tolls dans la glande lymphatique, des
hybridations in situ ont été réalisées (Figure 22). Toll et toll2 ont une expression ubiquitaire
dans la glande lymphatique tandis que toll3, 5, 6 et 9 n’y sont pas exprimés. Le profil
d’expression de toll7 et 8 n’a pas été réalisé. Pour toll4, nous avons observé une expression
localisée et restreinte aux cellules les plus postérieures des lobes antérieurs de la glande
lymphatique suggérant une expression restreinte au PSC. Afin de vérifier cette proposition
nous avons regardé l’expression de toll4 dans un mutant col qui est dépourvu de PSC. Dans
un mutant nul pour col (col1) l’expression de toll4 n’est plus détectée indiquant que
l’expression de toll4 est restreinte au PSC et est dépendante de col (Figure 23). Une analyse
plus détaillée de l’expression de toll4 au cours de l’embryogenèse indique qu’il commence à
être exprimé au stade 16 dans les futures cellules du PSC comme on peut le voir en comparant
avec l’expression de Col (Figure 23). toll4 est également exprimé dans l’amnioséreuse dans
l’embryon. Une expression très faible est détectée dans le corps gras (non montré) et les
gonades de la larve (Figure 23). L’expression restreinte de toll4 dans le PSC soulève la
question de sa fonction dans l’hématopoïèse larvaire.
Les mutants toll4 sont viables et ne présentent pas de défaut hématopoïétique.
Le gène toll4 se trouve sur le chromosome 2L de la Drosophile en position 30A1. Il n’existe
pas de mutant pour toll4, ni d’éléments transposables insérés à proximité du gène rendant
difficile la génération d’un mutant toll4. Deux déficiences étaient décrites comme recouvrant
toll4 : Df(2L)TE30Cb-1 (Wustmann et al., 1989) et Df(2L)Exel6021 (Ryder, 2004). La
Df(2L)TE30Cb-1 est létale au stade embryonnaire excluant la possibilité d’obtenir des larves
L3 mutantes. La Df(2L)Exel6021 est viable mais n’a pas été correctement cartographiée.
125
toll4 toll4
Figure 23. Profil d’expression de toll4.A-D et F-G. Hybridation in situ contre toll4. E. Immunocoloration avec un anticorps dirigé contre Col. A. toll4est exprimé dans le PSC de la glande lymphatique au troisième stade larvaire. Cette expression est abolie dans un mutant col (B). C. Dans l’embryon au stade 16 toll4 est détecté dans la glande lymphatique (flèche rouge). D. Grossissement de l’image en C. E. Dans l’embryon au stade 16 l’expression de Col est progressivement restreinte aux cellules du PSC (flèche rouge). F. Dans un embryon au stade 14 toll4 est exprimé dans l’amnioséreuse (flèche blanche). G. toll4 est exprimé dans les gonades de larve mâle au troisième stade larvaire.
toll4 toll4 Col
toll4 toll4
A B
DC E
F G
WT col1
toll4 toll4
Figure 23. Profil d’expression de toll4.A-D et F-G. Hybridation in situ contre toll4. E. Immunocoloration avec un anticorps dirigé contre Col. A. toll4est exprimé dans le PSC de la glande lymphatique au troisième stade larvaire. Cette expression est abolie dans un mutant col (B). C. Dans l’embryon au stade 16 toll4 est détecté dans la glande lymphatique (flèche rouge). D. Grossissement de l’image en C. E. Dans l’embryon au stade 16 l’expression de Col est progressivement restreinte aux cellules du PSC (flèche rouge). F. Dans un embryon au stade 14 toll4 est exprimé dans l’amnioséreuse (flèche blanche). G. toll4 est exprimé dans les gonades de larve mâle au troisième stade larvaire.
toll4 toll4 Col
toll4 toll4
A B
DC E
F G
WT col1
126
En effet, j’ai pu amplifier toll4 par PCR à partir d’ADN génomique extrait de mouches
Df(2L)Exel6021 adultes, indiquant que cette déficience n’enlève pas toll4.
J’ai alors entrepris de générer un mutant nul pour toll4 par recombinaison homologue en
utilisant la méthode « Ends Out » (Gong and Golic, 2003) (voir matériel et méthodes). Trois
allèles indépendants, qui délètent le cadre de lecture complet de toll4, ont été isolés. Par PCR,
à partir d’ADN génomique et par hybridation in situ j’ai vérifié que les trois allèles obtenus
correspondent bien à une délétion complète de toll4. Les combinaisons homozygotes ou
hétérozygotes de ces trois allèles mutants pour toll4 sont viables, fertiles et ne présentent pas
de défaut morphologique. Ces données indiquent que toll4 n’est essentiel ni pour la viabilité
des mouches, ni pour le développement de la lignée germinale. Sachant que les trois allèles se
comportent de la même façon j’ai poursuivi l’étude uniquement avec l’allèle toll4301821. Je me
suis intéressé à la morphologie et à l’organisation des glandes lymphatiques du mutant toll4
en utilisant différents marqueurs pour la ZM (tep4), le PSC (Col) et les hémocytes
différenciés (doxA3 pour les cellules à cristaux). Aucun défaut majeur n’a pu être mis en
évidence dans le mutant toll4 (Figure 24). Ces résultats indiquent que toll4 n’est pas requis
pour l’ontogenèse ni du PSC ni de la glande lymphatique. Il n’est pas requis non plus pour la
différenciation des hémocytes dans la glande lymphatique de larves saines.
Les mutants toll4 sont capables de produire des lamellocytes après infection par un parasitoïde
L’infection par un parasitoïde induit la différenciation des lamellocytes dans la glande
lymphatique. Les lamellocytes sont visualisés dans la glande lymphatique, vingt quatre heures
après infection grâce au marqueur α-PS4 (Crozatier et al., 2004). Dans un mutant toll4,
comme dans un sauvage, on observe des lamellocytes dans la glande lymphatique vingt quatre
heures après infection (Figure 24). De plus, quarante huit heures après parasitisme on peut
voir dans un mutant toll4, comme dans un sauvage, une grande quantité de lamellocytes en
circulation dans l’hémolymphe. Des capsules mélanisées correspondant à des œufs de guêpes
encapsulés (non montré) sont également observables. Ces résultats indiquent donc que le
mutant toll4 est capable de produire des lamellocytes après infection par une guêpe et est
capable de neutraliser le développement de l’œuf de guêpe. Ainsi, aucune différence notable
n’a pu être mise en évidence entre le mutant toll4 et un sauvage. En conclusion cette étude n’a
pas permis de mettre en évidence un rôle de toll4 ni au cours du développement, ni dans
l’hématopoïèse larvaire et ni dans la réponse immunitaire cellulaire.
127
Figure 24. Le mutant toll4 ne présente pas de phénotype hématopoïétique.A, C, E. glandes lymphatiques mutantes pour toll4. B, D, F. glandes lymphatiques sauvages. G et H. glandes lymphatiques mutante pour toll4 (G) et sauvage (H) 24 h après infection par un parasitoïde. A,B. tep4 marque la zone médullaire; C,D. doxA3 marque les cellules à cristaux dans la zone corticale; E,F. Col est exprimé dans le PSC (flèche blanche). G,H. αPS4 marque les lamellocytes.
toll4301821 WT
ZM(tep4)
PSC(Col)
ZC(doxA3)
A B
C D
E F
Lamellocytes(αPS4)
G H
24h après infection par des guêpestoll4301821 WT
Figure 24. Le mutant toll4 ne présente pas de phénotype hématopoïétique.A, C, E. glandes lymphatiques mutantes pour toll4. B, D, F. glandes lymphatiques sauvages. G et H. glandes lymphatiques mutante pour toll4 (G) et sauvage (H) 24 h après infection par un parasitoïde. A,B. tep4 marque la zone médullaire; C,D. doxA3 marque les cellules à cristaux dans la zone corticale; E,F. Col est exprimé dans le PSC (flèche blanche). G,H. αPS4 marque les lamellocytes.
toll4301821 WT
ZM(tep4)
PSC(Col)
ZC(doxA3)
A B
C D
E F
Lamellocytes(αPS4)
G H
24h après infection par des guêpestoll4301821 WT
128
Discussion
Le PSC joue un rôle clef dans l’hématopoïèse larvaire (Crozatier et al., 2004; Krzemien et al.,
2007). Le gène toll4 est spécifiquement exprimé dans les cellules du PSC dès la fin de
l’embryogenèse et cette expression est maintenue dans ces cellules tout au long du
développement larvaire suggérant que toll4 pourrait jouer un rôle dans l’hématopoïèse
larvaire. Nous avons généré un mutant nul pour toll4 par recombinaison homologue et montré
que, contre toute attente, il ne présente aucun de défaut ni dans l’ontogenèse de la glande
lymphatique ni au cours de l’hématopoïèse en condition normale ou lors de la réponse
immunitaire au parasitisme. Même si aucun des neuf autres toll n’est spécifiquement exprimé
dans le PSC nous avons observé que Toll et toll2 sont exprimés de façon ubiquitaire dans la
glande lymphatique, suggérant qu’ils pourraient compenser la perte de fonction de toll4. Des
analyses préliminaires indiquent que les mutants toll et toll2 sont capables de différentier des
lamellocytes en réponse à un parasitisme indiquant que la perte d’un seul toll n’a pas de
conséquence sur la réponse à l’infection par des guêpes (M. Crozatier, non publié) Afin de
tester l’hypothèse d’une redondance fonctionnelle entre les différents toll, des mutants double
et triples pourraient être construits et analysés. De plus, il existe des lignées permettant
d’exprimer des ARNs double brin (dsRNA) permettant de produire des pertes de fonction par
interférence à l’ARN pour les neufs gènes toll. L’expression de ces dsRNAs soit dans le PSC,
soit dans toutes les cellules de la glande lymphatique pourrait être réalisée en utilisant
différents pilotes tels que pcol85-Gal4 (dans le PSC) et srp-Gal4 (toute les cellules de la
glande lymphatique). L’intérêt d’utiliser l’interférence à l’ARN pour inactiver un gène est
double car il permet d’une part d’inactiver le gène d’intérêt de façon tissu-spécifique et
d’autre part de pouvoir inhiber l’expression de plusieurs gènes à la fois en exprimant
différents ARNs double brin en même temps. Des études récentes ont de plus montré que la
co-expression des dsRNAs avec dicer2 permet une inactivation bien plus efficace du gène
d’intérêt et conduisent in fine à l’obtention de phénotype équivalent à celui obtenu pour un
allèle nul du gène.
L’expression de toll4 restreinte au PSC reste cependant très intrigante. Comment expliquer
que l’expression d’un gène soit maintenue et restreinte à un groupe de cellules et qu’il n’est
pas de fonction dans ces cellules ? Il demeure évidemment possible que toll4 a bien une
fonction dans les cellules du PSC mais que les outils dont nous disposons à ce jour ne nous
ont pas permis de la mettre en évidence. Il serait également intéressant de déterminer si toll4
129
est impliqué dans la réponse humorale car j’ai observé qu’il est faiblement exprimé dans le
corps gras.
L’étude du contrôle transcriptionnel de toll4 est très intéressante principalement pour deux
raisons. D’une part, l’identification des séquences régulatrices permettant son expression
spécifique au PSC pourrait servir à construire un nouveau pilote (toll4-Gal4) permettant une
expression restreinte uniquement aux cellules du PSC. Le seul pilote de ce type disponible
actuellement est Pcol85-Gal4 qui résulte d’une insertion d’un élément P dans col (Krzemien
et al., 2007). Ce pilote présente deux inconvénients : d’une part il est mutant pour col et
d’autre part il reproduit tout le profil d’expression de col au cours du développement. Il n’est
donc pas spécifique du PSC. De plus, l’analyse in silico de la séquence génomique
nouvellement annotée de toll4 a permis d’identifier un site potentiel de fixation pour Col. Ce
site est localisé 200 pb en amont de l’ATG de toll4. Cette observation suggère que toll4
pourrait être un gène cible direct de col. A ce jour, malgré de nombreuses études réalisées
pour étudier le rôle de col dans de nombreux processus développementaux chez la drosophile,
un seul gène cible direct de col a été identifié et c’est col lui-même (Dubois et al., 2007). col
est exprimé dans, et est nécessaire à la formation du muscle somatique DA3 de l’embryon.
L’expression de col est maintenue dans ce muscle grâce à une boucle d’autorégulation. En
conclusion, la dissection fonctionnelle du promoteur de toll4 devrait être entreprise et
permettrait à la fois d’isoler un nouveau pilote et de déterminer si toll4 est une cible directe de
Col.
En conclusion, le rôle de la voie de signalisation Toll/NFκB dans la réponse immunitaire
cellulaire reste non élucidé. L’établissement du profil d’expression combiné à l’analyse
fonctionnelle d’autres composants de la voie tels que les facteurs de transcription Dorsal et
Dif serait nécessaire.
130
CONCLUSIONS GENERALES
Les travaux réalisés au cours de ma thèse ont permis d’élargir le champ de nos connaissances
sur l’hématopoïèse larvaire et la réponse immunitaire cellulaire chez Drosophila
melanogaster. Ces travaux soulèvent également de nombreuses questions.
Nous avons montré qu’au début de la métamorphose, lorsque la glande lymphatique éclate
elle relâche des prohémocytes dans l’hémolymphe. Que deviennent ces prohémocytes ?
Existe-t-il des « niches » secondaires que ces prohémocytes pourraient coloniser et où ils
contribueraient à la formation des hémocytes de l’adulte ? Les données de la littérature
indiquent qu’il n’existe, a priori, pas de site d’hématopoïèse chez l’adulte (Lanot et al., 2001).
Le suivi du devenir de ces prohémocytes dans la pupe et l’adulte devrait permettre d’éclairsir
ce point.
L’étude détaillée du contrôle de la voie de signalisation JAK/STAT dans l’hématopoïèse
larvaire à travers la caractérisation du rôle de latran, met en évidence un nouveau mode de
régulation de cette voie de signalisation. Des analyses complémentaires sont nécessaires afin
de définir comment au niveau moléculaire latran antagonise la voie de signalisation
JAK/STAT. En effet, l’hypothèse la plus simple est que Latran empêche la liaison de JAK et
STAT sur le récepteur Dome. Enfin, la formation d’hétéromères inactifs entre des formes
longues et courtes des récepteurs de cytokines de classe I pourrait également réguler la voie
de signalisation JAK/STAT chez les vertébrés. Deux études, réalisées en culture de cellules
indiquent que des récepteurs courts ancrés à la membrane peuvent inactiver la voie de
signalisation JAK/STAT (Diveu et al., 2004; Rahaman et al., 2002). Dans ces deux cas, les
mécanismes de cette régulation au niveau moléculaire ne sont pas établis. Ces récepteurs
courts peuvent soit agir en piégeant les cytokines soit, comme chez la Drosophile, en
s’associant à des récepteurs longs pour former des hétéromères inactifs. Des études
complémentaires réalisées en culture de cellules et in vivo sont nécessaires pour établir ce
point.
La mise en évidence du rôle de la voie de signalisation JAK/STAT dans le maintien d’une
population de prohémocytes dans la glande lymphatique semble a priori contradictoire avec
les données de la littérature qui indiquent que dans un mutant hopTum-l l’activation constitutive
de la voie de signalisation JAK/STAT a pour conséquence une différenciation massive de
lamellocytes en absence d’infection par un parasitoïde (Qiu et al., 1998). Comment réconcilier
ces résultats ? Nous savons que dans certains mutants où l’intégrité des tissus est altérée,
ceux-ci peuvent être enveloppés par des lamellocytes et mélanisés pour former des capsules
mélanotiques. Dans les mutants hopTum-l, la voie de signalisation JAK/STAT est
constitutivement activée dans tous les tissus. Ainsi l’activation constitutive de la voie de
133
signalisation JAK/STAT pourrait être dommageable pour certains tissus et/ou simuler un
dommage qui aurait pour conséquence indirecte la formation de lamellocytes.
Des études très récentes réalisées chez la Drosophile ont mis en évidence le rôle de la voie de
signalisation JAK/STAT dans le contrôle de la stabilité de la chromatine (Brown and Zeidler,
2008; Li, 2008). Ces données indiquent que la voie de signalisation JAK/STAT agit sur le
statut épigénétique des cellules en modulant globalement la stabilité de l’hétérochromatine.
La formation de l’hétérochromatine et le remodelage de chromatine sont des aspects
importants de la régulation génique. Ainsi, ces donnés suggèrent que les phénotypes observés
dans les mutants hopTum-l pourraient résulter d’un remodelage de la chromatine conduisant à
une dérégulation de l’expression génique et non d’une dérégulation spécifique du programme
de différenciation des hémocytes. Il serait intéressant de vérifier cette hypothèse et de trouver
dans quel tissu un tel remodelage de la chromatine peut avoir pour conséquence finale la
différenciation de lamellocytes.
Au cours de mon étude, j’ai également observé que les trois gènes upd, upd2 et upd3 sont
exprimés dans les lamellocytes de la glande lymphatique (résultats non montrés). La question
est maintenant de déterminer quel pourrait être le rôle des Upds exprimés dans les
lamellocytes. La voie de signalisation JAK/STAT est elle nécessaire à une étape ultérieure
pour la différenciation ou la fonction des lamellocytes ? Des approches de perte de fonction
basées sur l’expression ciblée dans différents types cellulaires de la glande lymphatique
d’ARN double brin contre STAT et Hop devraient permettre d’apporter des réponses à ces
questions.
Enfin, nous avons montré que les cellules du PSC jouent un rôle comparable à celui d’une
« niche » en maintenant une population de précurseurs hématopoïétiques dans la glande
lymphatique. Bien que le concept de niche ait été proposé il y a de nombreuses années chez
les vertébrés, les mécanismes d’interaction entre les cellules souches hématopoïétiques (CSH)
et leurs niches restent à ce jour très éparses et parfois contradictoires (Cumano and Godin,
2007; Kiel and Morrison, 2008; Wilson and Trumpp, 2006). Bien que nous ne sachions pas
encore s’il existe des CSH dans la glande lymphatique de la Drosophile, cet organe reste un
système modèle de choix pour analyser à la fois d’un point de vue moléculaire et cellulaire les
interactions mises en jeu entre la « niche » (PSC) et les progéniteurs présents dans la ZM.
Bien sûr, il faudra rester prudent quant aux conclusions qui pourront être tirées de la
comparaison du rôle du PSC chez la Drosophile et de la « niche » hématopoïétique de la
moelle osseuse chez les vertébrés. Cependant la mise en évidence, chez la souris, de
l’expression de EBF2 (un orthologue de Col) dans les ostéoblastes (Kieslinger et al., 2005),
134
qui forment la « niche » endostéale, est très prometteuse et suggère que les fonctions de Col et
EBF2 pourraient être conservées, au moins en partie, au cours de l’évolution. Une analyse
comparée des rôles de Col dans le PSC et d’EBF2 dans les ostéoblastes devrait être très
informative.
135
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Summary
Drosophila possesses an innate immune system and the immune response is manifested in two main
ways: the humoral and the cellular response. Hémocytes, the Drosophila “blood cells” are responsible
of the cellular immune response. Haemocytes are formed during haematopoiesis that occurs in two
separate phases: an embryonic and a larval one. The molecular mechanisms that control the
embryonic haematopoiesis are well described in the literature, while the control of larval
haematopoiesis remains largely unknown.
During my Ph.D. I studied the molecular control of larval haematopoiesis. (1) I participated in the
identification of a group of cells that plays the role of a haematopoietic “niche” controlling haemocytes
differentiation. (2) I then studied the role of the JAK/STAT signalling pathway during larval
haematopoiesis and I characterised a new type I cytokine receptor of Drosophila, called Latran. I
showed that Latran is necessary for the cellular immune response to parasitisation and that it acts as a
dominant negative to shut down the JAK/STAT signalling pathway. I have therefore identified a new
type of regulation of this signalling pathway in vivo. (3) Eventually I initiated the study of the role of
the Toll/NFκB signalling pathway in larval haematopoiesis by making and characterising a mutant of
toll4, a gene coding for one of the Drosophila Toll receptors. But this mutant do not show any
haematopoiesis defects. Further studies are consequently needed to describe the role of the Toll/NFκB
pathway in larval haematopoiesis.
Key words
Drosophila Haematopoiesis Innate immunity, Cellular immune response, JAK/STAT, Toll/NFκB,
lymph gland, Parasitism
Rami MAKKI
Hématopoïèse et réponse immunitaire cellulaire chez
Drosophila melanogaster
Sous la direction de Michèle Crozatier
Soutenue à Toulouse, le 11 décembre 2008
Résumé
La Drosophile possède un système immunitaire inné qui met en jeu deux types de réponse, une
réponse humorale et une réponse cellulaire. Cette dernière fait appel aux cellules « sanguines » de la
Drosophile appelées hémocytes. Les hémocytes sont formés au cours d’une vague embryonnaire et
une vague larvaire d’hématopoïèse. Les mécanismes moléculaires contrôlant l’hématopoïèse
embryonnaire sont bien décrits dans la littérature, alors que ceux contrôlant l’hématopoïèse larvaire
sont peu connus.
Au cours de ma thèse, je me suis intéressé aux mécanismes régulant l’hématopoïèse larvaire. (1) J’ai
notamment participé à la caractérisation d’un sous ensemble de cellules jouant le rôle d’une « niche »
hématopoïétique contrôlant la différenciation des hémocytes au cours de l’hématopoïèse larvaire
(Krzemień et al., 2007). (2) Je me suis également intéressé au rôle de la voie de signalisation JAK/STAT
au cours de l’hématopoïèse larvaire. J’ai en particulier montré que Latran, une protéine présentant de
l’homologie de séquence avec la famille des récepteurs aux cytokines de type I est nécessaire pour la
réponse cellulaire au parasitisme et qu’elle agit comme un dominant négatif pouvant inhiber la voie
de signalisation JAK/STAT. J’ai ainsi mis en évidence un nouveau mode de régulation de cette voie de
signalisation. (3)Enfin, j’ai également initié des travaux visant à étudier le rôle de la voie de
signalisation Toll/NFκB dans l’hématopoïèse larvaire. J’ai construit un mutant nul pour toll4, qui code
pour un des récepteurs Toll, qui ne présente aucun défaut hématopoïétique laissant le rôle de la voie
de signalisation Toll/NFκB dans l’hématopoïèse non élucidé.
Mots‐clefs
Drosophile, hématopoïèse, immunité innée, réponse immunitaire cellulaire, JAK/STAT, Toll/NFκB,
glande lymphatique, parasitisme
Discipline
Biologie Moléculaire, Cellulaire et du Développement
Centre de Biologie du Développement
Université Paul Sabatier, Toulouse III – CNRS UMR 5547
Bât 4RIII‐ 118, rte de Narbonne ‐ 31062 Toulouse cedex 09 – France