UNIVERSITE PARIS.DIDEROT (Paris 7)
-
Ecole Doctorale de l’Institut de Physique du Globe de Paris
DOCTORAT
de
Géochimie
Jennyfer MIOT
Processus microbiens de biominéralisation
et de détoxification des métaux/métalloïdes. ~
Oxydation du fer par des bactéries anaérobies neutrophiles et résistance au fer
et à l’arsenic chez des eucaryotes unicellulaires de drainages miniers acides.
Soutenance le 8 décembre 2008
Composition du jury :
M. Géraldine Sarret Rapporteur
M. Jean-Claude Block Rapporteur
M. Marc Chaussidon Examinateur
M. Patrick Forterre Examinateur
M. François Guyot Directeur de thèse
M. Karim Benzerara Co-directeur de thèse
M. Guillaume Morin Co-directeur de thèse
2
3
Remerciements.
Les 3 années que j’ai passées à l’IMPMC ont été très enrichissantes tant sur le plan
scientifique qu’humain. Je tiens à vous en remercier les uns et les autres.
Mes remerciements vont en premier lieu aux trois personnes qui ont encadré ces trois années
de doctorat. Je suis consciente de la chance immense que j’ai eue de travailler sous la
direction de Karim, Guillaume et François. Vous avez su me transmettre le grand plaisir que
vous avez de faire de la recherche, via des discussions scientifiques passionnantes, des idées à
foison de manips, de projets. Outre votre excellence scientifique, j’ai aussi pu apprécier vos
qualités humaines. Merci d’avoir su être à l’écoute tout en me laissant une grande liberté
pendant ces trois années. Je veillerai à faire bon usage de l’immense privilège que j’ai eu de
travailler et d’apprendre à vos côtés.
Je remercie vivement Fériel, qui a participé de très près aux projets constituant cette thèse.
J’aurais aimé avoir plus de temps pour apprendre la biochimie à tes côtés. Je n’oublierai pas
les très bons moments en attendant Côme et Mattéo, et après leur arrivée aussi bien sûr !
Un immense merci à Céline, qui m’a épaulée avec Fériel pour tout le travail technique de fond
indispensable à la réalisation de cette thèse, en particulier l’entretien des cultures, mais aussi
tout ce qui permet au labo de bio de fonctionner au quotidien.
Je remercie Kirsty, avec qui j’ai eu la chance d’apprendre le cemovis. Je te souhaite de beaux
jours pluvieux et venteux comme tu les aimes !
Merci à Sylvain pour sa participation très active aux manips de STXM.
Merci à Georges pour son aide lors des manips d’EXAFS et ses conseils de microbiologiste
avisé.
Merci à Emmanuelle pour son aide pour les manips d’épifluorescence.
Merci à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la mise en place et au déroulement de
ces projets, y compris à ceux de passage.
Merci à Dik et Yuheng pour les bons moments partagés au 7.1.28. Je n’oublierai pas les
discussions passionnantes sur la Guyane ni les cours de chinois accélérés. Merci à tous les
autres, en particulier les thésards avec qui j’ai passé trop peu de temps…
Merci à Olivier et à Côme de me donner tous les jours le sourire.
4
5
Sommaire
Introduction…………………………………………………………………….9
Chapitre 1. Biominéralisation du fer par des bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles………………………………………………………31
1A. Biominéralisation du fer dissous par BoFeN1………………………………………...37 Problématique et objectifs de l’étude…………………………………………………37
Méthodologie…………………………………………………………………………37
Spectromicroscopie X (STXM) au seuil du Fe………………………………..37
Quantification des rapports Fe(II)/Fe(III) à l’aide des seuils L2,3 du fer en
XANES………………………………………………………………………...40
Estimation des dégâts d’irradiation…………………………………………..40
Principaux résultats et perspectives…………………………………………………...41
Encroûtement périplasmique………………………………………………….42
Globules membranaires……………………………………………………….42
Filaments d’exopolysaccharides minéralisés…………………………………42
Biominéralisation du calcium par BoFeN1……………………………….......43
« Iron biomineralization by anaerobic neutrophilic iron-oxidizing bacteria » (article #1)…...45
1B. Transformation de la vivianite par BoFeN1…………………………………………..83 Problématique et objectifs…………………………………………………………….83
Méthodologie…………………………………………………………………………83
Spectroscopie d’Absorption X (XAS)………………………………………….83
Principaux résultats et perspectives…………………………………………………...87
« Transformation of vivianite by anaerobic iron-oxidizing bacteria » (article #2)…………...89
1C. Biominéralisation extracellulaire du fer par une bactérie ferro-oxydante photo-
autotrophe…………………………………………………………………………………..117 Problématique et objectifs…………………………………………………………...117
Méthodologie………………………………………………………………………..118
Analyse des polymères organiques en STXM au seuil K du C………………118
Détermination des corrélations entre quantités de fer et de carbone organique
Principaux résultats et perspectives………………………………………………….119
Rôle des fibres lipo-polysaccharidiques dans le contrôle de la
biominéralisation du fer……………………………………………………………………..119
Existence d’un gradient redox le long des fibres minéralisées……………...120
Similarités des fibres observées avec les nanowires des bactéries ferri-
réductrices…………………………………………………………………………………...121
Bio-signatures potentielles…………………………………………………..121
Variabilité de la minéralogie des phases formées par SW2…………………123
« Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic iron-oxidizing bacteria » (article
#3)…………………………………………………………………………………………...125
1D. Les premiers stades de la biominéralisation du fer et la fossilisation de protéines..145 Problématique et objectifs…………………………………………………………...145
Méthodologie………………………………………………………………………..145
6
Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections (CEMOVIS)………………145
Principaux résultats et perspectives………………………………………………….153
Fossilisation de protéines……………………………………………………153
Etapes de la biominéralisation du fer dans le périplasme…………………..153
Spectromicroscopie X en conditions hydrates……………………………….154
« Looking at the first stages of bacteria fossilization : evidences for the preservation of
proteins and cellular ultra-fine structures in microfossils » (article #4)…………………….157
1E. Etude préliminaire de la viabilité des cellules BoFeN1 lors de la biominéralisation du
fer……………………………………………………………………………………………171 Problématique et objectifs…………………………………………………………...171
Méthodologie………………………………………………………………………..172
Suivi de la croissance bactérienne et de l’encroûtement……………………172
Estimation de la viabilité à l’échelle de la population – Cultures en milieu
solide………………………………………………………………………………………...172
Modélisation des courbes de croissance bactérienne……………………….173
Principaux résultats………………………………………………………………….173
Effet du fer sur la courbe de croissance bactérienne………………………..173
Relation avec l’évolution du nombre de bactéries encroûtées………………174
Viabilité et encroûtement…………………………………………………….176
Perspectives méthodologiques………………………………………………………178
Evaluation de la viabilité à l’échelle de la cellule – Méthodes utilisant la
fluorescence…………………………………………………………………………………178
Chapitre 2. Biominéralisation du fer et détoxification de l’arsenic par des eucaryotes unicellulaires du genre Euglena………………………………..181
2A. Bioaccumulations de fer par E. mutabilis issue de l’AMD de Carnoulès et par E. gracilis………………………………………………………………………………………187 Problématique et objectifs…………………………………………………………...187
Méthodologie………………………………………………………………………..187
Principaux résultats et perspectives………………………………………………….187
« Intracellular iron accumulation in Euglena mutabilis from the Carnoulès arsenic-rich acid
mine drainage (Gard, France) and in the model microorganism Euglena gracilis” (article
#5)…………………………………………………………………………………………...189
2B. Détoxification et toxicité de l’arsenic (As(III) et As(V)) chez E. gracilis…………...207 Problématique et objectifs…………………………………………………………...207
Toxicité de l’arsenic…………………………………………………………207
Mécanismes de résistance à l’arsenic chez les procaryotes et chez les
eucaryotes…………………………………………………………………………………...207
Objectifs de cette étude………………………………………………………208
Méthodologie………………………………………………………………………..209
Utilisation de la spectroscopie d’absorption X pour l’analyse d’éléments traces
Principaux résultats et perspectives………………………………………………….209
« XAS study of arsenic coordination in Euglena gracilis exposed to arsenite »
(article #6)…………………………………………………………………………………...213
« Detoxification and high toxicity of As(V) in Euglena gracilis” (article #7)……………...219
7
Conclusions & Perspectives…………………………………………………239
Bibliographie…………………………………………………………………251 Protocoles…………………………………………………………………….267 Lexique……………………………………………………………………….291
8
9
Introduction
10
11
La présence d’un système atmosphère-hydrosphère à la surface de la Terre participe à la
régulation du climat et fournit des niches écologiques, i.e. un ensemble de paramètres
permettant le développement et le maintien de la vie (Martin et al., 2006). Ce système a
évolué au cours des temps géologiques, imposant des contraintes variées aux organismes
vivants - en particulier en termes de sources d’électrons et d’énergie - et favorisant le
développement et l’évolution d’un certain nombre d’adaptations biologiques (adaptations
métaboliques et mécanismes de résistance). Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux
systèmes biogéochimiques actuels (voir paragraphe 5.) dans le but de mieux comprendre
leurs adaptations à des environnements extrêmes (anoxie, fort taux de minéralisation, acidité,
concentrations élevées en éléments toxiques), qui présentent certaines analogies avec ceux de
la Terre archéenne. L’intérêt de l’étude de tels systèmes est double : il est permet d’une part
de mieux caractériser les mécanismes adaptatifs de systèmes biologiques actuels et de mieux
cerner leur rôle dans le cadre d’études environnementales (en particulier de milieux pollués).
En outre, il s’inscrit dans le cadre des recherches actuelles sur les roches archéennes,
fournissant des clés pour mieux déterminer la nature des signatures bio-minérales
potentiellement fossilisées dans les roches anciennes.
1. Les conditions d’apparition des premiers métabolismes sur la Terre primitive
anoxique
Les principales étapes de l’évolution de la bio-géosphère précambrienne sont résumées en
Figure I-1. Les dates présumées d’apparition de la vie sur Terre sont très incertaines et
discutées et s’échelonnent entre -3.8 (inlcusions carbonées d’Isua, Schopf et al., 2002) et -3.4
Ga (structures filamenteuses carbonées de Buck Reef Chert, Tice & Lowe, 2004) pour
l’apparition des premières formes de vie « complexes ». La composition de l’atmosphère est
alors très différente de celle de l’atmosphère actuelle, une des différences majeures résidant
dans le fait qu’elle est dépourvue d’O2 (anoxique) (Kasting & Tazewell-Howard, 2006). En
effet, l’oxygène produit par réactions photochimiques dans la haute atmosphère est maintenu
à de très faibles niveaux (< 10-10
.PAL, Present Atmospheric Level) par réaction avec les
émissions volcaniques réductrices (Martin et al., 2006). En revanche, la pression partielle en
CO2 est probablement très élevée (2-6 bars) induisant un fort effet de serre (en combinaison
avec le méthane) et une température de surface avoisinant les 70°C vers -3.3 Ga (Kasting &
12
Figure I-1 : Quelques étapes de l’évolution de la biogéosphère précambrienne. De gauche à
droite : éons du Précambrien (ainsi que les ères du Protérozoïque); oxygénation progressive
de l’atmosphère à partir de -2.4 à -2.0 Ga (Farquhar et al., 2000) puis p(O2) actuelle atteinte
vers -600 Ma (Kerr, 2005) ; abondance des BIF ; évènements « Snowball » : glaciation
Pongola à -2.9 Ga, glaciation Makganyene à -2.3-2.2 Ga (Kopp et al., 2005), glaciation
sturtienne à -750 Ma et glaciation varangienne à -600 Ma ; Apparition des mitochondries
(d’après Hedges et al., 2004) et des plastes (d’après Hedges et al., 2004 et Douzery et al.,
2004) ; Quelques illustrations de la diversification de la biosphère, de bas en haut : (a) Plus
anciens microfossiles présumés, structures filamenteuses carbonées de Buck Reef Chert, vers
-3.4 Ga (Tice & Lowe, 2004), (b) 2-méthylhopanoïdes, plus anciens biomarqueurs de
cyanobactéries, à -2.7 Ga (Summons et al., 1999), (c) Plus anciennes traces fossiles
d’eucaryotes présumés, vers -2 Ga, fossile de Grypania spiralis (Han & Runnegar, 1992), (d)
Fossile d’acritarche (Tappania plana), vers -1.5 Ga (Javaux et al., 2001), (e) Faune
d’Ediacara signant la diversification des métazoaires vers -0.6 Ga (Kerr, 2005).
Premiers microfossiles présumés
Premiers biomarqueurs de cyanobactéries
Premiers eucaryotes présumés
Acritarches
Faune d’Ediacara
Anoxique
Oxygéné
pO2 actuelle
Evènements « Snowball »
Banded Iron Formations Mitochondries
Plastes
-3000
-2500
-2000
-1500
-1000
-543
Pro
téro
zo
ïqu
e
Pa
léo
-M
és
o-
Né
o-
Arc
hé
en
-3500
-4000
Te
mp
s,
en
Ma
Figure I-1
a
b
c
d
e
Premiers microfossiles présumés
Premiers biomarqueurs de cyanobactéries
Premiers eucaryotes présumés
Acritarches
Faune d’Ediacara
Anoxique
Oxygéné
pO2 actuelle
Evènements « Snowball »
Banded Iron Formations Mitochondries
Plastes
-3000
-2500
-2000
-1500
-1000
-543
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-3500
-4000
Te
mp
s,
en
Ma
Figure I-1
a
b
c
d
e
13
Tazewell Howard, 2006, Robert & Chaussidon, 2006). Par conséquent, les océans archéens (-
3.8 à -2.5 Ga) seraient anoxiques, riches en CO2 dissous (pour certains auteurs), donc acides
(en considérant un équilibre avec les carbonates, on estime un pH de l’ordre de 5.5, Pinti,
2005) et chauds. Les interactions entre cette eau chaude chargée en CO2 et les roches de la
proto-croûte océanique contrôlent fortement la composition chimique de l’océan primitif. En
particulier, la carbonatation de la croûte océanique (remplacement des silicates par des
carbonates) permet de piéger une grande proportion du CO2 dissous, faisant remonter le pH
jusqu’à environ 6 (Grotzinger & Kasting, 1993). Par ailleurs, ces réactions eau-roche
solubilisent un certain nombre d’éléments chimiques réduits entrant dans la composition de la
croûte océanique. Des équivalents modernes de l’océan primitif pourraient être assez bien
représentés par les systèmes hydrothermaux actuels à l’aplomb des rides médio-océaniques,
qui émettent des panaches riches en gaz (H2, H2S, CH4) et éléments dissous (Fe2+
, Mn2+
)
réduits (Konhauser et al., 2007). Si sur la Terre actuelle, le fer susceptible d’entrer dans le
cycle d’oxydation-réduction est principalement libéré par l’altération de la croûte continentale
(environ 20 fois plus que par les sources hydrothermales, Canfield, 1998, voir Figure I-2.a), il
est probable que les sources hydrothermales délivraient des quantités de fer (Fe2+
) plus
élevées qu’à l’actuel sur la Terre archéenne (Canfield et al., 2006, voir Figure I-2.b). Au cours
de ce cycle d’oxydation-réduction, le fer réduit (Fe2+
) émis au niveau des systèmes
hydrothermaux est oxydé en Fe3+
, très insoluble, qui précipite sous forme d’importants dépôts
d’oxydes de fer (Figures I-2.a et I-2.b). Les traces qu’il nous reste de ces dépôts au cours de
l’Archéen constituent les plus grands gisements de fer à la surface de la planète, connus sous
le nom de Banded Iron Formations (BIF ou dépôts de fer rubanés). Ces dépôts manifestent
une différence essentielle entre les géochimies de surface actuelle et archéenne (Figures I-2.a
et I-2.b) et fournissent une signature de l’environnement de la biosphère primitive.
14
Figure I-2.a : Cycle du fer moderne, d’après Lécuyer & Ricard (1999) : les flèches bleues
symbolisent le cycle du fer. Les flux correspondant aux volcanismes et à la subduction
représentent des flux de Fe(III) en mol.an-1
. Le fer issu du manteau, majoritairement réduit
(Fe(III)/Fe(II)=0.07) est progressivement oxydé jusqu’à la zone de subduction. L’oxydation
du fer de la croûte océanique (altération hydrothermale) est attribuée à 50% à des réactions
d’hydrolyse et à 50% à une oxydation biologique (Bach & Edwards, 2003), potentiellement
catalysée par des bactéries ferro-oxydantes (FeOB, voir e.g. Edwards et al., 2003). L’export
hydrothermal de fer sous forme particulaire ou dissoute dans l’océan est négligeable. Le perte
de Fe(III) dans le manteau au niveau des zones de subduction pourrait contribuer à 10-25% du
bilan total du fer mantellique et pourrait ainsi participer à la régulation de la production d’O2
photosynthétique à la surface de la Terre (Lécuyer & Ricard, 1999). Le fer d’origine
continentale est apporté à l’océan par l’érosion continentale (glaciers, rivières, apports de
poussières). Les flux correspondants représentent les flux de fer total « réactif », i.e. la plupart
des oxy(hyrdoxy)des de fer et les sulfures de fer (mais pas les silicates riches en fer, ni la
magnétite) (Raiswell, 2006). Ce fer d’origine continentale sédimente dans les océans, puis
entre en subduction. Le retour de fer du manteau vers le continent se fait via le volcanisme et
la tectonique (intégration de plateaux continentaux). L’encart bleu représente le principal
mode de précipitation du Fe(II) dissous dans les sédiments anoxiques de l’océan actuel, riche
en sulfates, faisant intervenir le couplage de la sulfato-réduction bactérienne (SRB) et de la
ferri-réduction bactérienne (DIR). L’encart gris représente le cycle biogéochimique du fer
dans les sols et sédiments (rivières ou lacs) à l’interface oxique-anoxique, faisant intervenir
des mécanismes abiotiques d’oxydation et de réduction du fer, ainsi que des mécanismes
catalysés par des bactéries ferri-réductrices (bio-réduction) et ferro-oxydantes (bio-oxydation)
et conduisant à la précipitation/dissolution de minéraux riches en Fe(II), Fe(III) ou Fe(II)-
Fe(III). Ces réactions de précipitation-dissolution contrôlent fortement la disponibilité des
éléments traces (tels que l’arsenic) susceptibles de s’adsorber à la surface des oxydes de fer ou
de co-précipiter avec les phases riches en fer.
Figure I-2.a
Fe3+ Fe2+
Fe(III)/Fe(II)=0.07Fe(III)/Fe(II)=0.22
HydrolyseFeOB
Croûte continentaleFe(III)=4-5.9.1020 kg
Volcanisme~5.1012 mol.an-1
Subduction~1,2.1013 mol.an-1
Apports terrigènes~5.1012 mol.an-1
Sédimentationpélagique
~5.1012 mol.an-1
Altération hydrothermale
~1,1.1013 mol.an-1
Basaltes~15 wt% Fe
Sédimentationprofonde
~3.1011 mol.an-1
Figure I-2
Oxique
Anoxique
Fe(II)
Fe(III)
(Bio
)ré
du
cti
on
Minéraux Fe(II)-(III)
Fe(OH)3
Fe(OH)3
(Bio
)ox
yd
atio
n
SO42-
H2SFe2+
FeS2
SRB
Fe(OH)3
DIR
Cycle moderne du fer
VolcanismeTectonique
~5.1011 mol.an-1
Exporthydrothermal
Figure I-2.a
Fe3+ Fe2+
Fe(III)/Fe(II)=0.07Fe(III)/Fe(II)=0.22
HydrolyseFeOB
Croûte continentaleFe(III)=4-5.9.1020 kg
Volcanisme~5.1012 mol.an-1
Subduction~1,2.1013 mol.an-1
Apports terrigènes~5.1012 mol.an-1
Sédimentationpélagique
~5.1012 mol.an-1
Altération hydrothermale
~1,1.1013 mol.an-1
Basaltes~15 wt% Fe
Sédimentationprofonde
~3.1011 mol.an-1
Figure I-2
Oxique
Anoxique
Fe(II)
Fe(III)
(Bio
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du
cti
on
Minéraux Fe(II)-(III)
Fe(OH)3
Fe(OH)3
(Bio
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Figure I-2
Oxique
Anoxique
Fe(II)
Fe(III)
(Bio
)ré
du
cti
on
Minéraux Fe(II)-(III)
Fe(OH)3
Fe(OH)3
(Bio
)ox
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atio
n
SO42-
H2SFe2+
FeS2
SRB
Fe(OH)3
DIR
Cycle moderne du fer
VolcanismeTectonique
~5.1011 mol.an-1
Exporthydrothermal
15
Figure I-2.b : Cycle du fer précambrien: Si la quantification des flux de fer à la surface de la
Terre précambrienne est très incertaine, il est couramment admis que le volcanisme était une
des principales sources de fer, sous forme de Fe(II) (Canfield, 1998) avec l’érosion
continentale. L’export hydrothermal de fer, probablement beaucoup plus important qu’à
l’actuel, conduisait à la dissolution de Fe(II) s’accumulant dans l’océan archéen à des
concentrations évaluées à 40-120 µmol.L-1
(Canfield et al., 2006), voire entre 1.8 et 3.6
mmol.L-1
à proximité directe des panaches hydrothermaux (Kump & Seyfrid, 2005,
Konhauser et al., 2007). L’encart A représente les mécanismes susceptibles de conduire au
dépôt de BIF dans l’océan archéen ou paléoprotérozoïque (d’après Konhauser et al., 2002 et
Konhauser et al., 2007), i.e. à des périodes où la pO2 atmosphérique était faible et la
concentration en sulfates dans l’océan également limitée. La précipitation d’oxydes de fer est
catalysée soit par de faibles teneurs en O2 dissous locales dans l’océan de surface, soit par
l’action des UV-A et UV-B (voir discussion dans le texte), soit par l’activité de bactéries
ferro-oxydantes phototrophes, pratiquant une photosynthèse anoxygénique (FeOB). Une
partie du Fe(III) précipité est de nouveau réduit par des bactéries ferri-réductrices (DIR),
conduisant à la formation de minéraux riches en Fe(II) (e.g. sidérite) ou à valence mixte (e.g.
magnétite). Ce dépôt des BIF se fait à une distance indéterminée de la source de Fe(II), en
alternance avec des bancs riches en silice. L’encart B présente des mécanismes susceptibles
d’expliquer la plus faible abondance des BIF à partir de 2.4-2.0 Ga. L’augmentation de la
teneur atmosphérique en O2 (Farquhar et al., 2000) conduit à une plus forte concentration en
O2 dissous dans l’océan, catalysant l’oxydation abiotique du Fe(II). De plus, la plus forte
teneur des eaux en sulfates a pu alimenter la sulfato-réduction (SRB) et soustraire du Fe(II)
dissous par précipitation sous forme de sulfures de fer (e.g. FeS2) (Johnson et al., 2008,
Canfield, 1998).
Figure I-2.b
Cycle précambrien du fer
Fe2+
DIR
Oxique
Anoxique
UV-A, UV-C
Zo
ne
ph
otiq
ue
Fe2+
FeOB
Fe(OH)3
Fe(OH)3
Minéraux Fe(II) Fe(OH)3
O2
Erosion continentale
Volcanisme
[Fe(II)dissous]=0.04-4 mmol.L-1
Altérationhydrothermale
?
Faible pO2, Faible [SO42-]: périodes de dépôt des BIF Présence d’O2, Forte [SO4
2-]: 2.4-2.0 Ga
Oxique
Anoxique
Fe2+
Fe2+
FeS2
O2
Fe(OH)3
SO42-
H2S
FeS2A B
FeSi
Subduction
SRBTransport
Exporthydrothermal
Fe2+ Fe3+
Figure I-2.b
Cycle précambrien du fer
Fe2+
DIR
Oxique
Anoxique
UV-A, UV-C
Zo
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ph
otiq
ue
Fe2+
FeOB
Fe(OH)3
Fe(OH)3
Minéraux Fe(II) Fe(OH)3
O2
Erosion continentale
Volcanisme
[Fe(II)dissous]=0.04-4 mmol.L-1
Altérationhydrothermale
?
Faible pO2, Faible [SO42-]: périodes de dépôt des BIF Présence d’O2, Forte [SO4
2-]: 2.4-2.0 Ga
Oxique
Anoxique
Fe2+
Fe2+
FeS2
O2
Fe(OH)3
SO42-
H2S
FeS2A B
FeSi
Subduction
SRBTransport
Exporthydrothermal
Fe2+ Fe3+
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2. Les BIF, biomarqueurs de métabolismes anaérobies ?
Les BIF sont des formations sédimentaires, composées d’une alternance de lits
centimétriques à métriques riches en fer (~20-40 poids-%) et de bancs riches en silice (~40-60
poids-% SiO2). Les minéraux porteurs de fer incluent l’hématite (FeIII
2O3), la magnétite
(FeII(Fe
III)2O4) et la sidérite (Fe
IICO3). Ces formations datent de l’Archéen (3.5-2.5 Ga) et du
Paléoprotérozoïque (2.5-1.8 Ga) et incluent le Groupe de Hamersley (Australie occidentale) et
le super-groupe du Transvaal (Afrique du Sud), qui sont épais de plusieurs centaines de
mètres, couvrent plus de 105 km² de surface et contiennent plus de 10
13 tonnes de fer (Klein,
2005).
Il est couramment admis que la source de fer est d’origine hydrothermale (Jacobsen &
Pimentel-Klose, 1988, Bau & Möller, 1993, Frei & Polat, 2007), qui aurait pu libérer du
Fe(II) dissous à des concentrations de l’ordre de 1.8 à 3.6 mM localement (Konhauser et al.,
2007, Kump & Seyfried, 2005). Cependant, la distance entre la source de fer et le lieu de
dépôt est très incertaine. Le Fe3+
étant très insoluble à pH neutre (Cornell & Schwertmann,
2003), il est généralement suggéré que le fer était transporté sous sa forme réduite soluble,
Fe2+
. Le redox moyen des couches riches en fer constituant les BIF étant Fe2.4+
(Klein, 2005),
des réactions d’oxydation ont donc conduit à la précipitation du Fe(II) émis au niveau des
sources hydrothermales et transporté vers les zones de dépôt. Plusieurs hypothèses sont
proposées pour expliquer ces réactions d’oxydation massive (voir la revue par Konhauser,
2007 et Figure I-2.b):
(1) Le Fe(II) pourrait être photo-oxydé dans des eaux acides (Cairns-Smith, 1978) ou à
pH neutre (Braterman et al., 1983) par les forts flux de photons ultraviolets atteignant
la surface de la Terre en l’absence de couche d’ozone. Des expériences reproduisant
plus finement la chimie de l’hydrosphère précambrienne, notamment prenant en
compte la richesse en carbonates et silicates de la colonne d’eau, concluent cependant
que ces mécanismes auraient joué un rôle négligeable dans le dépôt des BIF
(Konhauser et al., 2007). Elles suggèrent au contraire l’implication de mécanismes
biologiques.
(2) L’O2 produit par les microorganismes pratiquant la photosynthèse oxygénique pourrait
entraîner la précipitation d’oxy(hydroxy)des de Fe(III) dans des « oasis oxygénés » se
développant au sein de « blooms » de cyanobactéries.
(3) Un autre type de photosynthèse aurait pu entraîner de façon directe l’oxydation du
Fe(II) en Fe(III) : il s’agit d’une photosynthèse anoxygénique (ne produisant pas
17
d’O2), utilisant le Fe(II) comme source d’électrons (à la place de l’H2O, par
comparaison avec la photosynthèse oxygénique). Plusieurs bactéries pourpres et vertes
ont été décrites qui présentent ce type de métabolisme (Widdel et al., 1993, Ehrenreich
& Widdel, 1994, Heising et al., 1999, Kappler & Newman, 2004), qui est considéré
comme une des formes les plus anciennes de photosynthèse (Xiong et al., 2000). Il a
été proposé que l’activité de tels microorganismes dans les océans précambriens
pourrait expliquer le dépôt de tout ou de la majeure partie des BIF (Konhauser et al.,
2002, Kappler et al., 2005).
Le Fe(III) précipité par l’une ou l’ensemble de ces réactions (abiotiques ou catalysées par
le vivant) est ensuite susceptible d’être réduit par des microorganismes utilisant le Fe(III)
comme accepteur final d’électrons, bouclant ainsi le cycle précambrien du fer (Figure I-2.b).
Il a été évalué qu’environ 70% du Fe(III) ainsi formé pourrait être recyclé dans la colonne
d’eau via l’activité de bactéries couplant la réduction du Fe(III) à l’oxydation du carbone
organique (Konhauser et al., 2005). Si une partie de la magnétite (oxyde de fer contenant 1
Fe2+
pour 2 Fe3+
) présente dans les BIF pourrait résulter d’une réduction abiotique
d’hydroxydes ferriques ou d’hématite par les kérogènes lors d’épisodes métamorphiques
(Ayers, 1972), la ferri-réduction bactérienne pourrait également expliquer en grande partie sa
présence dans les BIF.
3. L’apparition des premiers eucaryotes dans un environnement progressivement
oxydant
Plus aucun BIF n’est connu à la surface de la Terre après -1.8 Ga (mis à part les BIF
formés vers -750 et -600 Ma, dans les conditions très particulières imposées par les
glaciations sturtiennes et varangiennes (Evènements « Snowball »), voir Figure I-1),
suggérant la persistance d’un océan profond anoxique jusqu’à ces dates. En revanche, les
dépôts rouges riches en hématite (FeIII
2O3) se généralisent à partir de cette époque. Cette
séquence minéralogique suggère une augmentation progressive de la teneur atmosphérique en
O2. L’oxygénation progressive de l’atmosphère peut être finement tracée à l’aide des
compositions isotopiques du soufre enregistrées dans les roches. Il existe effectivement un
fractionnement indépendant de la masse pour de faibles teneurs en O2 (en raison de la
photolyse de SO2 induite par les UV en l’absence de couche d’O3), qui disparait en présence
de fortes teneurs en O2 (Farquhar et al., 2000). L’ensemble de ces données isotopiques et
18
minéralogiques ont permis de retracer l’évolution de la pression partielle en O2 atmosphérique
au cours des temps géologiques : elle augmente progressivement de -2.4 à -2.0 Ga et après
une seconde augmentation vers -0.6 Ga (Canfield & Teske, 1996, Catling & Claire, 2005),
atteint des valeurs proches de la pO2 actuelle entre -0.6 Ga et -540 Ma (Figure I-1).
L’augmentation initiale progressive de la teneur en O2 atmosphérique est attribuée à l’activité
des cyanobactéries (qui pratiquent la photosynthèse oxygénique) dont le produit métabolique
aurait commencé à s’accumuler dans l’atmosphère après que les composés réduits exposés à
la surface de la Terre (gaz volcaniques, croûte) ont été oxydés (Kerr, 2005).
C’est dans ce contexte d’oxygénation initiale des environnements de surface que sont
apparus les premiers eucaryotes (Figure I-1). Les premiers fossiles eucaryotes sont cependant
très controversés. Souvent considéré comme le plus ancien fossile eucaryote, le fossile de
Grypania spiralis daté à -2 Ga (Han & Runnegar, 1992) pourrait en fait correspondre à de
larges filaments de cyanobactéries (Cavalier-Smith, 2002). Par ailleurs, les plus anciens
fossiles d’acritarches sont datés à -1.5 Ga (Javaux et al., 2001). Enfin, en se basant sur
l’utilisation de données moléculaires, l’apparition des mitochondries est estimée à environ -2
Ga (Hedges et al., 2004) et celle des plastes entre -1.5 Ga (Hedges et al., 2004) et -1.1 Ga
(Douzery et al., 2004). Cependant, il est suggéré que l’état anoxique et la forte teneur en
sulfures (Anbar & Knoll, 2002) dans l’océan profond jusque vers -1 Ga auraient limité le
développement des eucaryotes photosynthétiques, même si les pré-requis (du point de vue de
l’écologie et du cytosquelette) pour leur diversification étaient établis depuis -1.5 Ga environ
(Javaux et al., 2001). La première radiation évolutive de métazoaires enregistrée dans le
registre fossile (la faune d’Ediacara, constituée d’organismes à corps mou, -575 à -542 Ma)
fait suite à un épisode « Snowball » (Terre totalement recouverte d’une couverture de glace).
La disparition de ces groupes fossiles à la base du Cambrien pourrait être liée un évènement
anoxique majeur (Kimura & Watanabe, 2001) ou à la généralisation de la prédation (Bengtson
& Zhao, 1992). La diversification qui a suivi, qualifiée d’explosion cambrienne (-543 Ma), a
conduit à la mise en place de tous les grands plans d’organisation de métazoaires connus :
tous les phyla actuels étaient déjà présents au Cambrien et aucun nouveau phylum n’a émergé
au cours des 500 Ma suivants (Lopez-Garcia et al., 2006). Les Diplomonades actuels -
anaérobies aérotolérants et ne possèdant pas de mitochondries - seraient les descendants des
plus anciens eucaryotes d’un point de vue phylogénétique (Hedges et al., 2004).
Une des différences majeures entre l’évolution des procaryotes et des eucaryotes est donc
constituée par les propriétés redox des milieux dans lesquels ils se sont diversifiés : les
procaryotes ont initialement évolué dans des environnements anoxiques, tandis que la
19
diversification des eucaryotes a opéré dans des environnements oxygénés (Raymond & Segrè,
2006), ce qui a laissé des traces observables très distinctes dans les protéomes (et
potentiellement les génomes) des organismes actuels (Dupont et al., 2006).
4. L’évolution de l’écologie de l’arsenic, reflet de l’oxygénation progressive de la
Terre ?
L’évolution des métabolismes utilisant l’arsenic et des mécanismes de résistance à ce
métalloïde toxique peut être considérée au regard de l’évolution géochimique de la surface de
la Terre, en particulier de l’oxygénation progressive de l’atmosphère. Le cycle de l’arsenic est
très fortement couplé au cycle du fer dans les environnements superficiels de la Terre actuelle.
En effet, les oxy-hydroxydes de fer ont la capacité d’adsorber ou de co-précipiter avec
l’arsenic, contrôlant ainsi sa mobilité dans l’environnement (Morin & Calas, 2006). Sur la
Terre actuelle, l’arsenic est libéré à de fortes concentrations dans différents systèmes, en
particulier dans certains cours d’eau résultant du drainage de déchets miniers (voir
paragraphe 5b.) ainsi qu’au niveau des systèmes hydrothermaux continentaux ou sous-
marins (e.g. Inskeep et al., 2004, Price et al., 2007). Ces environnements partagent de
nombreuses similitudes avec les environnements précambriens, dont ces fortes teneurs en
arsenic. En particulier, la forme réduite la plus commune de l’arsenic dans ces
environnements actuels – As(III) (ou arsenite) – devait prédominer sur la Terre archéenne
anoxique.
Divers métabolismes bactériens utilisent l’arsenic comme accepteur (réduction
dissimilatrice de l’As(V) ou arsenate) ou donneur d’électrons (oxydation de l’As(III) ou
arsenite) (Oremland & Stolz, 2003). L’oxydation de l’As(III) est liée à l’activité d’une
arsenite oxydase très conservée dans l’évolution (Aro, pour Arsenite oxidase) (Stolz et al.,
2006). La réduction bactérienne dissimilatrice de l’As(V) est quant à elle subordonnée à
l’activité d’une arsenate réductase (Arr, pour Arsenate reductase) (Stolz et al., 2006).
L’analyse phylogénétique très récente des séquences de ces enzymes chez différentes espèces
suggère qu’une sous-unité protéique de l’arsenite oxydase responsable de l’oxydation de
l’As(III) a émergé avant la divergence Archées/Bactéries, donc il y a plus de 3 Ga (Lebrun et
al., 2003). En revanche, Arr aurait évolué plus tardivement, non pas par modification d’Aro,
mais plutôt à partir de polysulfure réductases primitives (Duval et al., 2008). Cette évolution
peut être interprétée au regard de l’oxygénation progressive de l’atmosphère : tout d’abord, la
20
présence d’As(V) à de fortes teneurs dans l’environnement nécessite la présence d’O2, ce qui
expliquerait que les métabolismes de respiration de l’As(V) se sont surtout diversifiés après
que l’atmosphère a été oxygénée, donc plus tardivement que les métabolismes d’oxydation de
l’As(III) (Duval et al., 2008). De plus, étant donnés les plus faibles potentiels redox des
sulfures (E0’(S0/HS
-)=-275 mV) et des thiosulfates (E0’(S2O3
2-/HS
-)=-400 mV), comparés au
potentiel redox du couple AsV/As
III (E0’(As
V/As
III)=-139 mV), il est probable que les
composés soufrés étaient disponibles pour des degrés d’oxydation de l’environnement plus
faibles que les composés arséniés, i.e. plus tôt dans l’histoire de la Terre. Ceci pourrait
expliquer l’ancestralité des métabolismes de réduction des sulfures sur les mécanismes de
réduction des arsenates (Duval et al., 2008).
Contemporaine de cette dernière étude, une analyse de la diversité microbienne dans le
site hydrothermal de Mono Lake a révélé la présence d’une bactérie pratiquant une
photosynthèse anoxygénique, utilisant l’As(III) comme donneur d’électrons (Kulp et al.,
2008). Une souche bactérienne chimiolithoautotrophe oxydant l’As(III) avait été
antérieurement identifiée sur ce même site (Oremland et al., 2002). L’identification de ces
métabolismes corrobore les résultats de Duval et al. (2008), impliquant que les métabolismes
bactériens fondés sur l’oxydation de l’As(III) remontent très probablement à l’époque de la
Terre primitive anoxique. Cependant, l’absence de séquences similaires à Aro dans les deux
souches identifiées à Mono Lake catalysant pourtant l’oxydation de l’As(III) et la présence de
séquences présentant une forte similarité avec Arr (sans que ces souches soient capables de
réduire l’As(V)) ouvre de nouvelles pistes pour reconsidérer l’évolution précoce des systèmes
bactériens d’oxydation-réduction de l’arsenic.
D’autres bactéries sont capables de tirer de l’énergie de l’oxydation anaérobie de l’As(III)
couplée à la réduction des nitrates (Rhine et al., 2006). L’As(V) produit par l’ensemble de ces
métabolismes pourrait avoir soutenu une biomasse primitive hétérotrophe utilisant l’As(V)
comme accepteur terminal d’électrons.
Ces métabolismes peuvent donner lieu à des minéralisations spécifiques, qui peuvent être
recherchées dans le registre fossile. Si ces minéralisations, souvent riches en Fe et As, ont été
bien caractérisées chez des microorganismes procaryotes actuels exposés à de fortes
concentrations en fer et arsenic dans le milieu naturel (Inskeep et al., 2004, Morin et al., 2003,
Benzerara et al., 2008), les signatures minérales potentielles laissées par des eucaryotes
exposés à ces mêmes conditions n’ont été que très peu étudiées jusqu’à présent (Mann et al.,
1987, Brake et al., 2001).
21
Chez les eucaryotes, l’arsenic n’est pas utilisé comme métabolite. En revanche, comme
chez la plupart des procaryotes utilisant ou n’utilisant pas l’arsenic pour leur métabolisme, des
mécanismes de résistance à l’As(IIII) et à l’As(V) (voir Chapitre 2B pour un résumé de la
toxicité de ces deux éléments), ont été développés. Un résumé plus détaillé des connaissances
actuelles sur les mécanismes de résistance à l’arsenic chez les procaryotes et eucaryotes est
donné au Chapitre 2B. Le schéma de détoxification de l’arsenic est globalement le même chez
l’ensemble des procaryotes et eucaryotes étudiés jusqu’à ce jour. Cependant, les protéines
impliquées dans ces mécanismes résulteraient de chemins évolutifs distincts (Mukhopadhyay
& Rosen, 2002). Par ailleurs, les enzymes impliquées dans la détoxification de l’arsenic chez
les procaryotes ne semblent pas avoir de liens évolutifs avec les systèmes bioénergétiques
utilisant l’arsenic (Arr et Aro) (Silver & Phung, 2005). Si les mécanismes de résistance à
l’arsenic chez les eucaryotes ne dérivent pas de ceux connus chez les procaryotes, une
hypothèse à tester est leur potentielle parenté avec les mécanismes de résistance aux stress
oxydatifs développés chez les eucaryotes au cours de leur évolution sur une Terre oxygénée.
En effet, ces mécanismes de résistance aux stress oxydatifs ont pu être adaptés à la résistance
aux stress métalliques (Fahey et al., 1987), en particulier à l’arsenic.
5. Des modèles actuels des environnements et des métabolismes primitifs
Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux systèmes procaryotes oxydant le Fe(II) en
conditions anoxiques et un système eucaryote pratiquant la photosynthèse oxygénique, tous
trois exposés à des conditions, dont certaines peuvent s’apparenter à celles régnant sur la
Terre primitive. Plus que simuler les conditions de l’Archéen, le recours à des
microorganismes modèles cultivables en laboratoire, issus d’environnements actuels extrêmes
(anoxie, forte minéralisation, concentrations élevées en métaux ou métalloïdes) permet
d’étudier les mécanismes fondamentaux de détoxification et de biominéralisation. L’étude des
biominéralisations induites par ces microorganismes actuels ouvre également la possibilité de
disposer, dans le futur, de bases tangibles qui permettront de rechercher des signatures de
métabolismes comparables dans des échantillons anciens. De plus, les outils de géochimie
isotopique étant de plus en plus utilisés pour la recherche de ces métabolismes anciens, il sera
intéressant de disposer au laboratoire de modèles bien contraints, tels que ceux étudiés au
cours de cette thèse, afin de mieux comprendre –dans le futur- l’origine des fractionnements
isotopiques mesurés en fonction des conditions de milieu. Enfin, l’utilisation de ces modèles
22
issus d’environnements actuels présente un intérêt immédiat pour la compréhension de ces
milieux.
Nous avons fait le choix d’étudier deux systèmes modèles, permettant d’explorer des
questions scientifiques centrales à l’heure actuelle en biogéochimie:
(a) Des bactéries capables d’oxyder le Fe(II) sans utiliser O2 dans des conditions proches
de la neutralité acido-basique. Il s’agit d’un des modèles à tester pour la formation des BIF.
(b) Des eucaryotes vivant dans des milieux pollués présentant des analogies possibles
avec certains environnements anciens, en particulier très riches en Fe(II) et en arsenic.
5.a- La biominéralisation du fer par des bactéries ferro-oxydantes anaérobie.
Certains environnements actuels sont anoxiques, tels que l’océan profond (et en
particulier la croûte océanique profonde et les systèmes hydrothermaux), les sédiments
profonds de rivière ou la colonne d’eau profonde de certains lacs. Dans ces environnements,
la photosynthèse anoxygénique (dans les zones photiques) et la chimiolithoautotrophie sont la
face cachée de la productivité primaire observée à la surface de la Terre. Ces métabolismes
sont potentiellement quantitativement très importants sur la Terre actuelle. Par exemple, il a
été proposé sur la base de calculs thermodynamiques que l’énergie libérée par les interactions
eau-roches au niveau du plancher océanique pouvait alimenter une biomasse considérable
(Bach & Ewards, 2003). Plus particulièrement, les microorganismes catalysant l’oxydation du
fer ont joué un rôle primordial sur la Terre primitive (voir paragraphe 2.) et jouent encore un
rôle majeur sur la Terre actuelle. Outre leur contribution à la productivité primaire, ces
microorganismes participent au cycle du fer (Weber et al., 2006, Figures I-2.a et I-2.b), qui est
lui-même en interaction étroite avec les cycles de nombreux autres éléments métalliques,
potentiellement toxiques. L’arsenic, par exemple, a une forte affinité pour les oxydes de fer
avec lesquels il co-précipite ou à la surface desquels il peut s’adsorber (Morin & Calas, 2006).
L’état redox du fer contrôle donc en partie la mobilité de ces polluants.
Dans le cadre de cette thèse, nous avons cultivé deux souches bactériennes ferro-
oxydantes au laboratoire. Toutes deux sont des bactéries Gram-négatives, anaérobies et
neutrophiles :
• Rhodobacter sp., souche SW2 est une α-Proteobactérie isolée d’étangs de la
région de Hanovre (Ehrenreich & Widdel, 1994). Cette bactérie pourpre non
sulfureuse pratique une photosynthèse anoxygénique en conditions anoxiques,
23
utilisant le Fe(II) comme source d’électrons et la lumière comme source d’énergie,
selon la réaction suivante :
4 Fe2+
+ CO2 + 11 H2O (+hν) � <CH2O> + 4 Fe(OH)3 + 8 H+ (Eqn 1)
où <CH2O> est une formule générique pour la matière organique et où le Fe(III)
précipite sous forme d’hydroxyde ferrique Fe(OH)3. Une description plus
complète de la physiologie de cette bactérie est détaillée dans Hegler et al. (2008).
En raison de son métabolisme, cette souche constitue un bon analogue des
bactéries pratiquant la photosynthèse anoxygénique qui auraient pu participer à la
mise en place des BIF (Konhauser et al., 2002, Kappler et al., 2005).
• Proche de la β-Proteobactérie Acidovorax sp., la souche BoFeN1 a été isolée de
sédiments du lac de Constance (Kappler et al., 2005a). Elle est hétérotrophe vis-à-
vis du carbone et couple l’oxydation du Fe(II) à la réduction des nitrates, selon
l’équation suivante :
2Fe2+
+ 5H2O + NO3- � 2Fe(OH)3 + 4H
+ + NO2
- (Eqn. 2)
où le Fe(III) précipite sous forme d’hydroxyde ferrique Fe(OH)3. Il est probable
qu’un tel métabolisme soit moins ancien que la photosynthèse anoxygénique
décrite ci-dessus, la présence de nitrates impliquant la présence de dioxygène sur
Terre.
Ces deux souches catalysent donc l’oxydation du Fe(II) en Fe(III) en conditions anoxiques.
Le Fe(III), très insoluble à pH neutre (Cornell & Schwertmann, 2003), précipite
instantanément. Les biominéralisations résultant de l’activité de ces microorganismes
anaérobies ont été très peu étudiées jusqu’à présent. Pourtant, les oxydes de fer sont
ubiquistes dans le registre fossile et la question de leur potentielle biogénicité a été souvent
posée (e.g. Little et al., 2004, Ivarsson et al., 2008). Les biominéralisations riches en fer
produites par des bactéries ferro-oxydantes présentent une grande variété (Figure I-3). La
plupart des études ont relevé la similarité entre les filaments d’oxydes de fer observés dans les
roches anciennes ou actuelles et ceux produits par des bactéries ferro-oxydantes micro-
aérobies telles que Gallionella ou Leptothrix (Fortin & Langley, 2005, Figure I-3).
Cependant, les signatures potentielles de l’activité passée de bactéries ferro-oxydantes
anaérobies n’ont jamais été observées dans les roches anciennes, probablement en raison de la
rareté des études portant sur ces métabolismes. Les preuves du rôle crucial des bactéries ferro-
oxydantes anaérobies dans les cycles géochimiques passés (voir supra et Konhauser, 1998;
24
Kappler et al., 2005; Posth et al., 2008) et de leur implication potentielle dans la formation de
tubes dans des verres basaltiques sont ainsi très indirectes (e.g. Furnes et al., 2005; Benzerara
et al., 2007). Afin de tester ces hypothèses de biogénicité, une caractérisation fine des
biominéralisations formées par des bactéries ferro-oxydantes anaérobies est nécessaire. Un
des objectifs de cette thèse était donc de caractériser finement la minéralogie des phases
formées par ces deux souches bactériennes modèles, à l’aide d’outils essentiellement
microscopiques et spectroscopiques permettant de sonder la matière de l’échelle
micrométrique à l’échelle atomique (Chapitre 1). En particulier, les premiers stades de la
fossilisation des cellules (impliquant la formation de microfossiles) et la préservation de
matière organique (contenant des biomarqueurs potentiels) dans ces minéralisations a été
explorée (Chapitre 1D).
Par ailleurs, l’étude de ces systèmes a une portée plus fondamentale pour la
compréhension des mécanismes de biominéralisation et de détoxification. En effet, les
bactéries pratiquant l’oxydation du fer sont confrontées à la forte insolubilité du produit de
leur métabolisme, susceptible de créer une barrière limitant les échanges avec le milieu
extérieur en précipitant sur les structures cellulaires et menaçant donc potentiellement la
viabilité de ces microorganismes. La minéralisation massive de leur environnement pose donc
des questions fondamentales sur l’adaptation de ces souches à ces conditions extrêmes. Les
deux souches que nous avons utilisées au cours de cette thèse présentent des motifs de
biominéralisation distincts (Figure I-3), résultats possibles de degrés d’adaptation ou de
stratégies adaptatives différents, que nous avons parallèlement étudiés.
25
Figure I-3 : Quelques illustrations de la variété des biominéralisations du fer. Images de
microscopie électronique à balayage sur des cellules entières (A à C) et de microscopie
électronique en transmission sur des coupes de cellules incluses en résine époxy (D à J).
Bactéries ferro-oxydantes neutrophiles microaérophiles : (A) et (D) cellules de Galionella sp.,
produisant des chaînes d’oxydes de fer (B) et (E) cellules de Leptothrix sp.(c), dans des tubes
(t) d’oxydes de fer (cellules prélevées dans des eaux stagnantes en forêt de Brocéliande,
Collaboration X. Châtelier, CAREN, Rennes). Bactéries neutrophiles anaérobies : (C) et (F)
cellules d’Acidovorax sp., souche BoFeN1 (c), présentant une minéralisation riche en fer dans
le périplasme (p) et sous forme de globules (g) à la surface de la cellule (Cultures, voir Miot
et al., soumis #1, p. 43), (G) Cellules de Rhodobacter sp., souche SW2 (c), entourée de
minéraux riches en fer (m), à distance de la cellule (Cultures, voir Schaedler et al., soumis).
Bactéries ferro-oxydantes acidophiles : (H) Cellule d’Acidithiobacillus ferroxidans entourée
d’hydroxyde de fer-arsenic (Cultures, Collaboration Marion Egal, Corinne Casiot, Laboratoire
Hydrosciences de Montpellier), (I) et (J) bactéries ferro-oxydantes issues de l’AMD de
Carnoulès (voir Benzerara et al., 2008) présentant une fine couche minéralisée interne et une
gangue minérale externe plus épaisse (flèches) (I) ainsi que des vésicules minéralisées
émergeant des cellules (flèches) (J).
Figure I-3
100nm
500 nm 500 nm 1 µm
C
H I J
500 nm 200 nm100 nm
F GE
C t Cp
g
C
m
1 µm
D
1 µm
A
1 µm
B
Figure I-3
100nm
500 nm500 nm 500 nm500 nm 1 µm1 µm
C
H I J
500 nm 200 nm100 nm
F GE
C t Cp
g
C
m
1 µm
D
500 nm500 nm 200 nm200 nm100 nm100 nm
F GE
C t Cp
g
C
m
1 µm
D
1 µm
D
1 µm
A
1 µm
B
26
Ces études ont nécessité un certain nombre de développements méthodologiques,
présentés dans les chapitres précédant les articles composant cette thèse :
• La culture de bactéries en conditions anoxiques et la préservation du redox des
échantillons (Chapitre 1).
• La Spectromicroscopie X (STXM) aux seuils L2,3 du fer et la quantification des
rapports Fe(II)/Fe(III) à l’échelle sub-micrométrique (Chapitre 1A).
• La Spectroscopie d’Absorption X (XAS) au seuil K du fer pour la
détermination du redox et l’analyse de particules finement divisées (Chapitre
1B).
• La Spectromicroscopie X (STXM) au seuil du C et les méthodes de corrélation
Fe/C à l’échelle sub-micrométrique (Chapitre 1C).
• La Cryo-Microscopie Electronique de Sections Vitreuses (CEMOVIS) pour
l’observation en conditions natives des associations minéral-matière organique
(Chapitre 1D).
• Les techniques de microscopie en fluorescence et de culture en milieu solide
pour l’estimation de la viabilité bactérienne (Chapitre 1E).
5.b- La résistance aux métaux/métalloïdes chez un eucaryote photosynthétique :
Les drainages miniers acides (AMD ou Acid Mine Drainages) constituent un autre
type d’environnement actuel extrême présentant des similarités avec les environnements
passés de la Terre. Les AMD résultent de l’oxydation de déchets miniers riches en sulfures et
en particulier en pyrite (FeS2), sous l’action des eaux de pluie. L’oxydation de la pyrite est
spontanée en présence d’O2 ou de Fe3+
et elle acidifie les eaux en libérant des sulfates ou des
thiosulfates et du Fe2+
, selon la réaction suivante par exemple :
FeS2 + 6 Fe3+
+ 3 H2O � 7 Fe2+
+ S2O32-
+ 6 H+ (Eqn. 3)
Cette réaction d’oxydation peut être amplifiée par l’activité de microorganismes
chimiolithoautotrophes catalysant l’oxydation des sulfures, tels que Thiomonas sp. (Johnson
& Hallberg, 2005), Sulfobacillus sp. ou Acidithiobacillus caldus (Druschel et al., 2004). En
outre, la dissolution oxydative de la pyrite peut également être accélérée par l’activité de
microorganismes lithotrophes catalysant l’oxydation du Fe2+
par l’O2 dissous (réaction très
lente en conditions abiotiques, à pH acide), ce qui conduit à la régénération du Fe3+
dans ces
27
systèmes (e.g. Acidithiobacillus ferroxidans, Johnson & Hallberg, 2003, Duquesne et al.,
2003), selon la réaction (4) :
4 Fe2+
+ O2 + 4 H+ � 4 Fe
3+ + 2 H2O (Eqn. 4)
Certaines bactéries et archées peuvent également oxyder le thiosulfate - produit de
l’oxydation de la pyrite (Eqn. 3) - et produire de l’acide sulfurique selon l’équation suivante :
S2O32-
+ 2 O2 + H2O � 2 H+ + 2 SO4
2- (Eqn. 5)
Enfin, le Fe3+
peut être hydrolysé selon la réaction suivante:
Fe3+
+ 3 H2O � Fe(OH)3 + 3 H+ (Eqn. 6)
L’ensemble de ces réactions libère des quantités massives de fer (1.6-1700 mg.L-1
, Johnson &
Hallberg, 2003, Casiot et al., 2004) et de sulfates (150-4900 mg.L-1
, Johnson & Hallberg,
2003, Casiot et al., 2004). Par ailleurs, les réactions (3), (5) et (6) libèrent des protons,
conduisant à une forte acidification des eaux, le pH variant généralement entre 0.5 et 6.5 dans
ces systèmes (Johnson & Hallberg, 2003).
Les sulfures et autres minéraux présents dans les déchets miniers à l’origine de ces
AMD sont généralement enrichis en métaux traces, tels que Zn, Mn, Cu, As qui sont donc
libérés au cours des réactions d’altération. L’arsenic, en particulier, est généralement présent
en substitution du soufre dans les pyrites, ou sous forme d’arsenopyrite FeAsS ou de löllingite
FeAs2. L’oxydation de l’arsenopyrite, selon le même principe que la réaction d’oxydation de
la pyrite (Eqn. 3), libère du fer et des sulfates, mais aussi de grandes quantités d’acide
arsénieux, selon la réaction suivante :
FeAsS + 11/4 O2 + 3/2 H2O � Fe2+
+ SO42-
+ H3AsO3 (Eqn. 7)
L’arsenic, libéré sous forme d’As(III) (arsenite), est ensuite oxydé, selon la réaction (8),
généralement catalysée par des microorganismes chimiolithoautotrophes (e.g. Thiomonas sp.,
Bruneel et al., 2003, Duquesne et al., 2007) :
H3AsO3 + ½ O2 � H2AsO4- + H
+ (Eqn. 8)
Dans les conditions de pH acides régnant dans les AMD, l’arsenic dissous est présent sous
deux formes dominantes très toxiques : H3AsIII
O3 et H3AsVO4. Si l’As(III) domine dans les
AMD, les concentrations en As(V) peuvent être également très élevées. Les concentrations
totales en arsenic peuvent avoisiner les 200 mg.L-1
(Morin & Calas, 2006), dépassant jusqu’à
20 000 fois les normes imposées pour les eaux potables (10 µg.L-1
, Smedley & Kinniburgh,
2002).
Par comparaison avec des eaux non polluées, les AMD présentent une faible diversité
bactérienne, dominée par des espèces impliquées dans les cycles du Fe et du S (Bruneel et al.,
2006). De même, la diversité eucaryote est très limitée, dominée par des champignons (Baker
28
et al., 2004) et des algues (e.g. Euglena sp.). Le genre Euglena est l’un des seuls genres
eucaryotes adapté à ces conditions extrêmes, représenté par deux espèces ubiquistes dans les
AMD : E. mutabilis et E. gracilis (Kapfer et al., 1998, Casiot et al., 2004, Bruneel et al.,
2006). Ces deux espèces sont des eucaryotes unicellulaires acidophiles pratiquant la
photosynthèse oxygénique, ancrés proche de la racine des eucaryotes (Figure 1-4, Watanabe
& Gray, 2000, Hedges et al., 2004). Si les premières traces présumées d’Euglénoïdes dans le
registre fossile (Moyeria, Colbath & Grenfell, 1995) remontent au Silurien (-443 à -416 Ma),
les données moléculaires suggèrent une divergence avec les autres eucaryotes vers -1.9 Ga
(Hedges et al., 2004).
Si les métabolismes des procaryotes présents dans les AMD ne sont pas encore
parfaitement compris, beaucoup moins d’études encore se sont penchées sur les mécanismes
adaptatifs des eucaryotes rencontrés dans ces milieux extrêmes (Casiot et al., 2004). L’activité
des bactéries et archées, en particulier ferro-oxydantes ou arsenite-oxydantes, conduit
classiquement à la formation de biominéralisations riches en Fe et As pouvant participer à la
détoxification partielle des sites. Ces biominéralisations ont été bien caractérisées dans
certains AMD (Morin et al., 2003, Benzerara et al., 2008), ou dans des sites géothermaux de
chimie comparable (Inskeep et al., 2004). En revanche, les éventuelles biominéralisations
produites par des eucaryotes adaptés à ces conditions extrêmes n’avaient que très peu été
étudiées jusqu’à présent (Mann et al., 1987, Brake et al., 2001). De telles biominéralisations
d’origine eucaryote adaptés à des conditions acides, riches en Fe et As, s’apparentant
potentiellement à celles de certains environnements primitifs, pourraient guider la recherche
de fossiles eucaryotes dans des roches anciennes. De plus, les mécanismes de résistance de
ces eucaryotes aux conditions extrêmes des AMD, en particulier à l’arsenic, restaient jusqu’à
maintenant largement inexplorés. Un second volet de cette thèse a donc consisté en l’étude
des mécanismes de résistance d’E. mutabilis et E. gracilis à certaines des conditions extrêmes
des AMD. D’une part, E. mutabilis, collectée dans l’AMD de Carnoulès, a été étudiée dans le
cadre de la caractérisation de biominéralisations riches en fer produites par des eucaryotes
(Chapitre 2A). D’autre part, classiquement utilisée dans les études de phytotoxicité (Einicker-
Lamas et al., 2002, Mendoza-Cozatl et al., 2002, Aviles et al., 2003, Rochetta et al., 2006), E.
gracilis a été cultivée au laboratoire à pH acide en présence de fortes concentrations en Fe(II)
dissous et/ou arsenic, équivalentes aux concentrations rencontrées dans les AMD. Les
mécanismes de détoxification du fer et de l’arsenic ont ensuite été étudiés à l’aide d’outils
microscopiques, spectroscopiques et biochimiques (Chapitre 2). L’intérêt de l’utilisation de la
29
Spectroscopie d’Absorption des Rayons X (XAS) pour l’analyse des métaux traces et son
couplage aux méthodes biochimiques est explicité au Chapitre 2B.
30
31
Chapitre 1.
Biominéralisation du fer par des
bactéries ferro-oxydantes anaérobies
neutrophiles
32
33
Dans le cadre de l’étude de la biominéralisation du fer par des bactéries ferro-oxydantes
anaérobies, nous avons cherché à caractériser les produits minéraux de deux métabolismes
microbiens : la photosynthèse anoxygénique en conditions anoxiques (souche SW2) et la
dénitrification ferreuse (souche BoFeN1). Bien que ces souches, toutes deux ferro-oxydantes,
soient cultivées dans le même milieu de culture (mis à part les nitrates et l’acétate présents
uniquement dans le milieu de culture de la souche BoFeN1) et au même pH (~ 7), les motifs
de biominéralisation observés chez ces deux bactéries sont très différents (voir Figure I-3):
l’oxydation du fer conduit à un encroûtement des structures cellulaires de BoFeN1, tandis que
le fer précipite presqu’exclusivement à distance des cellules de SW2. Avec l’objectif de
mieux comprendre in fine l’origine de cette différence, notre approche a consisté à coupler la
caractérisation minéralogique des phases formées au cours des cultures, de l’échelle
microscopique à l’échelle atomique, à l’analyse de leurs interactions avec les bactéries ou les
molécules organiques en présence. L’étude de l’interface minéral-matière organique a ainsi
fourni des contraintes sur les mécanismes de la biominéralisation du fer en conditions
anoxiques, ainsi que des marqueurs fossiles qui pourraient être recherchés dans le registre
géologique. Cette étude a consisté dans un premier temps à suivre l’évolution temporelle de la
minéralogie et du degré d’oxydation du fer dans les biominéralisations formées par la souche
BoFeN1 en présence de fer dissous (Chapitre 1A). Une part importante du Fe(II) présent à la
surface de la Terre étant immobilisée dans des phases solides, les mécanismes de
transformation du fer solide (ici un phosphate de Fe(II), la vivianite) par la même souche ont
ensuite été étudiés (Chapitre 1B). Une comparaison avec les biominéralisations formées par la
souche phototrophe SW2 est présentée au Chapitre 1C. Enfin, le Chapitre 1D met en évidence
les premières étapes de fossilisation d’une bactérie ferro-oxydante (BoFeN1) et fournit une
visualisation directe de protéines et d’une structure cellulaire fine (le peptidoglycane)
préservées dans un microfossile.
Les deux souches modèles utilisées ont été cultivées en conditions strictement anoxiques,
dans des milieux de culture de composition chimique similaire. Le travail avec des souches
anaérobies strictes a nécessité le développement et l’utilisation de protocoles adaptés, en
particulier pour la préparation des milieux de culture, mais aussi pour la préparation
d’échantillons en vue de leur caractérisation minéralogique.
Culture de bactéries en conditions anoxiques strictes. Un protocole de préparation du
milieu de culture sous une atmosphère N2/CO2 (80/20, v/v) a été employé, adapté d’après
34
Widdel et al., 1993 (Figure 1-1, voir Protocoles p. 261). Le milieu de base, riche en phosphate
(4.4 mM), est tamponné par un tampon bicarbonate à pH ~ 7. Le fer est ajouté sous forme de
FeCl2 à 10 mM final dans le milieu de culture, avant inoculation des souches. Pour la culture
de la souche BoFeN1, des solutions de NaNO3 (source de nitrate) et d’acétate de sodium
(source de carbone organique) sont préalablement ajoutées à 10 mM et 5 mM final
respectivement. Les souches sont ensuite cultivées dans des flacons de 50 ou 100 mL, fermés
par un bouchon en butyl scellé, limitant les échanges avec l’atmosphère.
Figure 1-1. Schéma du protocole de préparation des milieux de culture pour les souches
BoFeN1 et SW2.
N2/CO2
(v/v: 90/10)
Milieu de base - agité et dégazé -
(NH4Cl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4).
- Tampon NaHCO3, vitamines,
éléments trace.
- pH ~ 7,0.
Milieu dispensé dans des
flacons de culture
Addition de NO3-, acétate, FeII
(FeCl2)
Inoculation des souches
30°C
Addition de
FeII (FeCl2)
hν
SW2 BoFeN1
N2/CO2
(v/v: 90/10)N2/CO2
(v/v: 90/10)
Milieu de base - agité et dégazé -
(NH4Cl, KH2PO4, CaCl2, MgSO4).
- Tampon NaHCO3, vitamines,
éléments trace.
- pH ~ 7,0.
Milieu dispensé dans des
flacons de culture
Addition de NO3-, acétate, FeII
(FeCl2)
Inoculation des souches
30°C
Addition de
FeII (FeCl2)
hν
SW2 BoFeN1
35
Figure 1-2. Quelques outils pour le conditionnement des échantillons en conditions
anoxiques. A : Chambre anaérobie utilisée pour la manipulation des échantillons en
conditions anoxiques (pO2 < 50ppm). B : Capillaire scellé inséré dans le goniomètre utilisé
pour la DRX. C : Fenêtres de nitrure de silicium scellées en conditions anoxiques sur un
porte-échantillon pour le STXM.
Analyses minéralogiques en conditions préservant le redox. Les premières analyses
(spectroscopie d’absorption des rayons X) que nous avons effectuées, ont révélé que les
échantillons analysés (phosphates de Fe(II) ou à valence mixte, très finement divisés) étaient
très sensibles à l’oxydation par le dioxygène de l’air. L’étude de la minéralogie des phases
formées et plus particulièrement de leur redox a donc nécessité le développement de
protocoles permettant de préserver le redox depuis la culture jusqu’à l’analyse. Une chambre
anaérobie (ou boîte à gants, Figure 1-2.) avec une atmosphère N2/H2 (5% maximum d’H2 dans
l’azote, l’H2 piégeant l’O2 sur des catalyseurs en Pt et assurant une pO2 constamment
inférieure à 50 ppm) a été employée pour la préparation de l’ensemble des échantillons. Une
centrifugeuse installée dans cette boîte à gants a permis de collecter les fractions solides des
échantillons à l’abri de l’O2. Le conditionnement des échantillons a ensuite été adapté à
chaque technique :
• Pour la microscopie électronique : les échantillons sont rincés et dilués dans une
solution anoxique (eau dégazée ou milieu de culture de base sans fer) avant dépôt sur
une grille MET.
A B C
36
• Pour la Diffraction des Rayons X (DRX), les échantillons sont séchés sous vide,
broyés et dispensés dans des capillaires scellés avec de la colle glue, le tout dans la
boîte à gants.
• Pour la spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS), les échantillons sont séchés
sous vide, broyés et dispensés dans un porte échantillon, le tout dans la boîte à gants.
• Pour la spectromicroscopie X (STXM), les échantillons rincés sont dilués dans une
solution anoxique (eau dégazée ou milieu de culture de base sans fer) avant dépôt sur
une membrane de nitrure de silicium. Une seconde membrane est délicatement
apposée à la première et l’ensemble est scellé à l’aide d’Epoxy.
Pour toutes ces préparations, les échantillons obtenus sont ensuite emballés dans un papier
aluminisé imperméable à l’O2, pour leur transport jusqu’au lieu d’analyse. Cette méthodologie
a été testée sur des échantillons de référence (e.g. vivianite). Malgré la très forte sensibilité à
l’oxydation par l’air de ces phosphates de Fe(II) finement divisés, cette méthode s’est révélée
être optimale pour la préservation du redox du fer dans nos échantillons. Aucune oxydation
détectable en spectroscopie d’absorption des rayons X (X-ray Absorption Near-Edge
Structure, XANES) n’a été observée pour les références les plus sensibles.
37
Chapitre 1.A.
Biominéralisation du fer dissous par BoFeN1
Problématique et objectifs de l’étude. Les mécanismes de biominéralisation du fer par les
bactéries ferro-oxydantes anaérobies restent largement inexplorés. D’une manière générale,
du fait de la forte insolubilité du Fe(III) à pH neutre, l’oxydation bactérienne du Fe(II) conduit
à la précipitation rapide de minéraux riches en Fe(III) à proximité ou au contact direct des
structures cellulaires. Des études récentes suggèrent que différentes souches, utilisant
différents métabolismes, présentent des motifs de biominéralisation différents : ainsi, si la
souche SW2 reste majoritairement libre de précipités après l’oxydation complète du Fe(II) en
Fe(III) (Kappler & Newman, 2004), la souche dénitrifiante BoFeN1 est rapidement encroûtée
par les minéraux riches en Fe(III) formés au cours de l’oxydation du Fe(II) (Kappler et al.,
2005a). Les mécanismes permettant d’expliquer ces différents phénotypes ne sont cependant
pas encore connus. Une caractérisation et une localisation précises des produits de ces
métabolismes associés aux structures cellulaires sont donc requises pour mieux comprendre
ces phénomènes.
Dans l’article qui suit, la souche BoFeN1 a été cultivée en présence de Fe(II) dissous.
Les phases minérales résultant de l’oxydation bactérienne du Fe(II) et leur association avec
les structures biologiques ont été caractérisées à l’aide d’outils microscopiques et
spectroscopiques. En outre, le degré d’oxydation du fer dans ces phases minérales a été suivi
au cours de la culture à l’échelle sub-micrométrique. Cette étude fournit des clés pour mieux
comprendre les mécanismes de biominéralisation du fer en conditions anoxiques et à pH
neutre et ouvre par ailleurs des pistes pour la recherche de signatures de ces métabolismes
dans le registre fossile.
Méthodologie.
Spectromicroscopie X (Scanning Transmission X-ray Microscopy, STXM) au seuil du Fe.
Pour suivre l’évolution du degré d’oxydation du fer à l’échelle submicrométrique dans ces
échantillons, une technique de spectromicroscopie X, utilisant le rayonnement synchrotron a
été employée. Le STXM (Scanning Transmission X-ray Microscopy) est avant tout une
microscopie en balayage permettant d’imager des échantillons avec une résolution spatiale de
l’ordre de 25-50 nm, intermédiaire entre les microscopies électroniques et optique. Il fournit
38
de plus une imagerie chimique de l’échantillon en utilisant la spectroscopie d’absorption des
rayons X (XANES, X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy ou NEXAFS, Near Edge X-
ray Absorption Fine Structure) mesurée à la même échelle spatiale et avec une résolution de
l’ordre de 0.1 eV. Il permet également de travailler dans des conditions plus
« environnementales » que d’autres techniques de microscopie ou de spectroscopie (par
exemple le MET), la chambre de l’échantillon étant à pression atmosphérique (généralement
sous He, donc anoxique) et non sous vide. Enfin, utilisant des rayons X de faible énergie (80
eV- 2100 eV), cette technique permet de caractériser, à l’échelle de 25 nm, à la fois des
éléments légers, tels que le carbone (seuil K, ~290 eV, difficilement accessible par les
techniques de spectroscopie X de haute énergie) et des éléments lourds comme le fer via leurs
seuils L (seuils L2,3, ~710 eV). Le spectre XANES obtenu sur un échantillon présente une
structure caractéristique de l’environnement électronique de l’atome central excité, qui permet
de déterminer la nature des groupements fonctionnels en présence (groupements
carboxyliques, cétones, amines, carbonates par exemple au seuil du C), la coordinance et/ou le
degré d’oxydation de l’élément (Fe(II) versus Fe(III) par exemple). Une description d’un
STXM et du principe d’acquisition des données (spectroscopie XANES et stacks) est donnée
en Figure 1A-1 (voir aussi Hitchcock, 2001 et Bluhm et al., 2006).
39
Figure 1A.1. Principe de fonctionnement d’un STXM. A : Schéma d’un STXM. La chambre
de l’échantillon est sous pression atmosphérique d’hélium (l’air est pompé et remplacé par de
l’hélium), donc en anoxie. Le faisceau de rayons X est issu du rayonnement synchrotron. Un
monochromateur permet de sélectionner l’énergie du faisceau incident, qui est focalisé par des
lentilles sur l’échantillon. B : Une analyse chimique ponctuelle peut être réalisée en
transmission, à l’aide d’un détecteur de rayons X (e.g. photodiode), en scannant en énergie
autour du seuil d’absorption de l’élément d’intérêt (spectroscopie XANES). C : L’échantillon
peut aussi être scanné, i.e. déplacé dans le plan orthogonal au faisceau incident, permettant
d’obtenir une image de l’échantillon. Enfin, une série d’images peut être obtenue en
transmission, en faisant varier l’énergie des rayons X incidents par petits incréments (jusqu’à
environ 0.1 eV). Ainsi, on peut obtenir un spectre XANES pour chaque pixel de l’image.
Cette matrice de données à 3 dimensions (x, y, énergie) est appelée stack.
Faisceau de RX
(synchrotron)
monochromatique
Echantillon
(scanné)Détecteur
de RX
280 285 290 295 300
XANES C K-edge
Energie (eV)
Bactérie
Energie500 nm
…280
290
300
Photon Energy500 nm
Order Sorting Aperture
(OSA)
Zone Plate
=lentille
Chambre sous pression atmosphérique, anoxique (He)
Spectroscopie XANES En 2D, i.e. stacks
A
B C
Faisceau de RX
(synchrotron)
monochromatique
Echantillon
(scanné)Détecteur
de RX
280 285 290 295 300
XANES C K-edge
Energie (eV)
Bactérie
Energie500 nm
…280
290
300
Photon Energy500 nm
Order Sorting Aperture
(OSA)
Zone Plate
=lentille
Chambre sous pression atmosphérique, anoxique (He)
Spectroscopie XANES En 2D, i.e. stacks
Faisceau de RX
(synchrotron)
monochromatique
Echantillon
(scanné)Détecteur
de RX
280 285 290 295 300
XANES C K-edge
Energie (eV)
Bactérie
280 285 290 295 300
XANES C K-edge
Energie (eV)
Bactérie
Energie500 nm
…280
290
300
Photon Energy500 nm
Energie500 nm
500 nm
…280
290
300
Photon Energy500 nm
Order Sorting Aperture
(OSA)
Zone Plate
=lentille
Chambre sous pression atmosphérique, anoxique (He)
Spectroscopie XANES En 2D, i.e. stacks
A
B C
40
Quantification des rapports Fe(II)/Fe(III) à l’aide des seuils L2,3 du fer en XANES. Dans le
cadre de l’étude des biominéralisations dans les cultures de bactéries ferro-oxydantes
anaérobies, nous avons développé une méthodologie donnant accès de façon semi-quantitative
aux rapports Fe(II)/Fe(III) à l’aide de données de STXM. Des stacks d’images ont été
enregistrés au seuils L2,3 du Fe, fournissant un spectre XANES en chaque pixel de la zone
d’intérêt. Les images enregistrées en transmission sont converties en densité optique, qui
s’exprime ainsi:
DO=-ln(I/I0)
où I représente l’intensité mesurée sur le pixel d’intérêt et I0 l’intensité en dehors de
l’échantillon (tenant compte de l’absorption résultant des deux membranes de nitrure de
silicium et plus généralement des contaminants éventuels présents tout le long du chemin
optique). Au seuil du fer, deux pics majeurs d’intensité relative variable sont observés à 707 et
710 eV environ. Ces deux pics sont généralement attribués au Fe(II) et au Fe(III)
respectivement. Cependant, l’approche consistant à faire une simple soustraction d’images à
ces deux énergies est très approximative et ne permet pas, par exemple, de quantifier les
rapports Fe(II)/Fe(III) dans des composés à valence mixte. Ici, des cartographies quantitatives
du Fe(II) et du Fe(III) ont été calculées en utilisant la routine « stack fit » du logiciel Axis
2000 (Hitchcock, 2001). L’algorithme calcule les spectres en chaque pixel avec une
combinaison linéaire de composés de référence (référence Fe(II) et référence Fe(III)) et d’une
constante, tenant compte de l’absorption de fond par les autres éléments que le fer (valeur de
l’OD sous le seuil).
Les spectres XANES extraits de régions d’intérêt (par exemple bactéries ou précipités
extracellulaires) sont également « fittés » pour estimer les proportions relatives de Fe(II) et de
Fe(III) dans les différentes zones de l’échantillon. Pour cela, l’aire sous les pics L2 et L3 des
spectres au seuil L2,3 du Fe est normalisée à 1. L’absorbance des composés contenant
majoritairement du Fe(II) est multipliée par un facteur correctif de 4/5, prenant en compte la
différence d’occupation des orbitales 3d entre les ions Fe2+
et Fe3+
(Thole et al., 1994). Les
spectres obtenus sont « fittés » avec des combinaisons linéaires des spectres normalisés de
références Fe(II) et Fe(III) en utilisant le code basé sur l’optimisation des gradients conjugués
(CGO) du logiciel Axis 2000.
Estimation des dégâts d’irradiation. En utilisant ces méthodes, les dégâts d’irradiation
(oxydation ou réduction potentielles du fer sous le faisceau de rayons X) en fonction du
41
temps d’exposition de l’échantillon aux rayons X ont été évalués sur des composés de
référence Fe(II) d’une part et sur des bactéries (matière organique) encroûtées par des phases
complètement oxydées (Fe(III)) d’autre part (Figure 1A-2.). On observe que les dégâts
d’irradiation sont très limités pour les temps d’analyse classiquement utilisés. La
quantification des rapports Fe(II)/Fe(III) est donc relativement exacte, à condition que chaque
étape du protocole soit scrupuleusement respectée (préparation et transport des échantillons en
conditions anoxiques, analyse sous atmosphère d’He, temps d’analyse limité par stack).
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150
Fe
(III)/
Fe t
ota
l
dt, ms
dt=0.8 ms
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
10 20 30 40 50 60 70
Fe
(III)/
Fe
to
tal
dt, ms
dt=0.8 ms
Figure 1A-2. Dégâts d’irradiation sur des références de phosphate de Fe(II) (a) et sur des
bactéries encroûtées par du Fe(III) (b). Evolution des rapports Fe(III)/Fe(total) en fonction du
temps de comptage par pixel et par pas d’énergie, estimés en fittant les spectres XANES au
seuil L2,3 du Fe enregistrés sur des références de phosphate de Fe(II) et de bactéries encroûtées
par du Fe(III) respectivement. Les courbes de tendance suivent une loi de Michaelis-Menton
de type y=ax/(b+x), avec a=0.3 et b=12 (r²=0.87) pour la vivianite et a=0.8 et b=-0.2 (r²=0.98)
pour les bactéries encroûtées. On observe donc une photo-oxydation sous le faisceau de
rayons X pour le phosphate de Fe(II) et une photo-réduction sous le faisceau X pour les
bactéries encroûtées. Par comparaison, le temps moyen d’analyse lors de nos mesures
habituelles des échantillons (par stack) est de 0.8 ms par pixel et par pas d’énergie. Les dégâts
d’irradiation sont donc limités.
Principaux résultats et perspectives. L’étude des biominéralisations produites par la souche
BoFeN1 cultivée en présence de Fe(II) en solution aqueuse a révélé la formation de
phosphates de fer, en interaction étroite avec la matière organique. Trois types de minéraux
coexistent, discriminés selon leur morphologie et leur localisation :
a b
42
(1) Encroûtement périplasmique. Une couche minéralisée de 40 nm d’épaisseur (qualifiée
d’encroûtement), est localisée entre la membrane plasmique et la membrane externe de la
bactérie, i.e. dans le périplasme. Ces minéralisations sont associées à des accumulations de
protéines dans le périplasme et de façon amplifiée et asymétrique au niveau des pôles de la
bactérie, probablement en relation avec le vieillissement des cellules. Ces résultats suggèrent
qu’une étape de l’oxydation du fer pourrait avoir lieu dans le périplasme, comme cela a été
proposé pour la bactéries phototrophe Rhodobacter sp., souche SW2 sur la base de données
de biologie moléculaire (Croal et al., 2007, Jiao & Newman, 2007). En outre, l’accumulation
spécifique de protéines dans le périplasme des bactéries encroûtées pourrait suggérer une
nucléation préférentielle des phosphates de fer sur des composés protéiques (Benzerara et al.,
2004b, voir aussi le Chapitre 1D). Ces composés protéiques pourraient être des agrégats
s’accumulant de façon asymétrique aux pôles au cours de leur vieillissement (Arié et al.,
2006).
(2) Globules membranaires. Des globules de 100±25 nm de diamètre sont localisés à la
surface des bactéries, accolés à la membrane externe.
(3) Filaments d’exopolysaccharides minéralisés. Ces filaments pourraient servir de matrice à
la précipitation du fer à distance des bactéries (Chan et al., 2004). L’oxydation progressive du
Fe(II) en Fe(III) mise en évidence dans ces phases extracellulaires soulève la question des
mécanismes d’export du Fe(III) ou d’oxydants par la bactérie. En effet, le Fe(III) très
insoluble précipite quasi-instantanément dans un milieu à pH neutre. Si l’oxydation du fer a
lieu principalement au niveau périplasmique, il faut envisager l’export soit du Fe(III)
directement, qui pourrait être facilité par un miro-environnement à pH acide autour de la
bactérie (Kappler & Newman, 2004), soit de Fe(III) complexé à des molécules organiques le
solubilisant. Des nanophases colloïdales mises en évidence dans ces milieux de culture
pourraient aussi jouer un rôle important dans le transfert de Fe(III). Enfin, une dernière
possibilité serait l’export d’oxydants (par exemple certains produits de la réduction des
nitrates), réalisant l’oxydation du Fe(II) au contact des fibres polysaccharidiques
extracellulaires. Des études complémentaires biochimiques seront nécessaires pour identifier
de telles molécules potentiellement impliquées dans l’oxydation et /ou l’export du Fe(II) par
BoFeN1.
Les motifs très particuliers de biominéralisation du fer observés chez BoFeN1 ainsi
que les hétérogénéités redox du fer mises en évidence au cours de ces cultures pourraient
fournir des pistes pour la recherche de traces d’oxydation bactérienne anaérobie du fer dans le
registre fossile.
43
Biominéralisation du calcium par BoFeN1. En complément des résultats précédents, nous
avons testé la capacité de la souche ferroxydante BoFeN1 à biominéraliser le calcium, dans le
but de déterminer si la précipitation périplasmique du fer est spécifique ou non de cet élément.
Pour cela, BoFeN1 est cultivée dans le même milieu de base que précédemment, sans fer mais
en présence de nitrates (10 mM), acétate (5 mM, qui sert alors de source de carbone et
d’électrons) et de calcium (10 mM, fourni sous forme de CaCl2). L’ajout de calcium dans le
milieu de culture entraîne la précipitation d’une phase blanche correspondant à de
l’hydroxylapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) d’après les simulations thermodynamiques (JChess).
Après filtration à 0.2 µm de ce précipité, la concentration en Ca2+
est de l’ordre de 3.4 mM
d’après les simulations thermodynamiques, donc du même ordre de grandeur que la
concentration en Fe(II) utilisée dans les cultures de BoFeN1 en présence de Fe(II) dissous (3-
4 mM). Après 2 semaines de culture dans ce milieu enrichi en calcium dissous, les cellules
ont été observées en microscopie électronique à transmission, en mode STEM (Scanning
Transmission Electron Microscopy). Comme on peut le voir en Figure 1A-3., le calcium n’est
pas accumulé dans le périplasme, mais dans des inclusions intracellulaires, où il est déposé
sous forme de phosphates de calcium. Ce motif de biominéralisation du calcium diffère de ce
qui a été décrit pour d’autres bactéries Gram-négatives, qui précipitent dans les mêmes
conditions des phosphates de calcium dans le périplasme (Van Dijk et al., 1998, Benzerara et
al., 2004b).
La solubilité des phosphates de calcium ainsi que des phosphates de fer formés par
BoFeN1 dans les cultures en présence de calcium ou de Fe(II) dissous n’est pas connue.
Cependant, en utilisant les constantes de solubilité reportées dans la littérature, on note que
l’hydroxylapatite (phosphate de calcium, KS=10-110.6
, Narasaraju et al., 1978) est encore plus
insoluble que la vivianite (phosphate de Fe(II), KS= 10-36
, Nriagu et al., 1972) et que les
phosphates de Fe(III) tels que Fe2(HPO4)3 (KS=8.6x10-41
, Pierri & Dalas, 1998). Ces résultats
suggèrent donc que la précipitation de phosphates de fer périplasmiques n’est pas contrôlée
par la concentration en phosphate, mais plus probablement par l’oxydation du fer elle-même.
Une modélisation géochimique de la précipitation des phosphates de fer dans le périplasme,
s’appuyant entre autres sur les données acquises au cours de cette thèse et impliquant une
meilleure connaissance des valeurs de pH et des concentrations des différents éléments
chimiques dans le périplasme, permettrait dans le futur de mieux contraindre les mécanismes
de biominéralisation chez BoFeN1.
44
Figure 1A-3. Minéralisation de phosphates de calcium par BoFeN1. A et B: images STEM
de bactéries présentant des dépôts intracellulaires denses aux électrons (blancs). C :
composition chimique de ces dépôts intracellulaires analysés en EDX. Le calcium est donc
accumulé sous forme de phosphates de calcium dans le cytoplasme.
500 nm 500 nm
1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
P Kαααα
K Kαααα
Ca Kαααα
Co
un
ts,
a.u
.
Energy, keV
A B
C
500 nm 500 nm500 nm 500 nm
1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
P Kαααα
K Kαααα
Ca Kαααα
Co
un
ts,
a.u
.
Energy, keV
A B
C
45
Iron biomineralization by anaerobic neutrophilic iron-oxidizing bacteria
Jennyfer Miot (1), Karim Benzerara (1), Guillaume Morin (1), Andreas Kappler (2), Sylvain
Bernard (3), Martin Obst (4), Céline Férard (1), Fériel Skouri-Panet (1), Jean-Michel Guigner
(1), Nicole Posth (2), Matthieu Galvez (1), Gordon E. Brown Jr (5, 6), François Guyot (1).
(1) Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,
Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.
140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.
(2) Geomicrobiology Center for Applied Geoscience (ZAG), University of Tuebingen,
Sigwartstrasse 10, 72076 Tuebingen, Germany.
(3) Laboratoire de Géologie, Ecole normale supérieure, CNRS, 24 rue Lhomond, 75005
Paris, France.
(4) BIMR McMaster University Hamilton & Canadian Light Source, 101 Perimeter Road,
Saskatoon, SK, Canada, S7N OX4.
(5) Surface & Aqueous Geochemistry Group, Department of Geological & Environmental
Sciences, Stanford University, Stanford, CA 94305-2115, USA
(6) Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, SLAC, Menlo Park, CA 94025, USA
*Corresponding author:
[email protected] ; Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785
Geochimica et Cosmochimica Acta
In press
46
ABSTRACT
Minerals formed by bio-oxidation of ferrous iron (Fe(II)) at neutral pH, their
association with bacterial ultrastructures as well as their impact on the metabolism of iron-
oxidizing bacteria remain poorly understood. Here, we investigated iron biomineralization by
the anaerobic nitrate-dependent iron-oxidizing bacterium Acidovorax sp. strain BoFeN1 in the
presence of dissolved Fe(II) using electron microscopy and Scanning Transmission X-ray
Microscopy (STXM). All detected minerals consisted mainly of amorphous iron phosphates,
but based on their morphology and localization, three types of precipitates could be
discriminated: (1) mineralized filaments at distance from the cells, (2) globules of 100±25 nm
in diameter, at the cell surface and (3) a 40 nm-thick mineralized layer within the periplasm.
All of those phases were shown to be intimately associated with organic molecules.
Periplasmic encrustation was accompanied by an accumulation of protein moieties. In the
same way, exopolysaccharides were associated with the extracellular mineralized filaments.
The evolution of cell encrustation was followed by TEM over the time course of a culture:
cell encrustation proceeded progressively, with rapid precipitation in the periplasm (in a few
tens of minutes), followed by the formation of surface-bound globules. Moreover, we
frequently observed an asymmetric mineral thickening at the cell poles. In parallel, the
evolution of iron oxidation was quantified by STXM: iron both contained in the bacteria and
in the extracellular precipitates reached complete oxidation within 6 days. While a progressive
oxidation of Fe in the bacteria and in the medium could be observed, spatial redox (oxido-
reduction state) heterogeneities were detected at the cell poles and in the extracellular
precipitates after 1 day. All these findings provide new information to further the
understanding of molecular processes involved in iron biomineralization by anaerobic iron-
oxidizing bacteria and offer potential signatures of those metabolisms that can be looked for
in the geological record.
47
1. INTRODUCTION
Iron-oxidizing bacteria and archeae may have a significant impact on the Earth’s
surface geochemistry, by taking part in the redox cycling of iron under both oxic and anoxic
conditions (e.g. Ghiorse, 1984; Konhauser, 1998; Fortin and Langley, 2005; Kappler and
Straub, 2005; Weber et al., 2006). Various micro-organisms can retrieve energy from the
aerobic oxidation of Fe(II) in oxic environments at acidic (Lazaroff et al., 1985; Clarke, 1997;
Kozubal et al., 2008) or neutral pH (Hallberg and Ferris, 2004). Over the last 15 years, the
discovery of bacteria capable of using Fe(II) as an electron donor under anoxic conditions and
at neutral pH has boosted interest in the study of these metabolisms. Among them, two are
potentially widespread in neutral-pH anoxic habitats (for instance in river sediments, lakes or
deep-sea environments) : (1) anoxygenic photosynthesis using Fe(II) as an electron donor
(Widdel et al., 1993; Ehrenreich and Widdel, 1994, Heising and Schink, 1998) and (2) iron
oxidation coupled to nitrate reduction (Hafenbradl et al., 1996; Straub et al., 1996; Benz et al.,
1998, Straub and Buchholz-Cleven, 1998, Kappler et al., 2005a).
Fe(II) oxidation driven by iron-oxidizing nitrate-reducing bacteria leads to the
formation of Fe(III) compounds. The chemistry and mineralogy of these Fe(III) compounds
depend on environmental conditions. Equation 1 summarizes this reaction with formation of
Fe(III) hydroxides:
2Fe2+
+ 5H2O + NO3- = 2Fe(OH)3 + 4H
+ + NO2
- (Eqn. 1)
Due to their low solubility at neutral pH (Cornell and Schwertmann, 2003), the Fe(III) by-
products of this reaction, represented here by iron hydroxides, precipitate rapidly in the direct
vicinity of the cells. However, the accurate localization of iron biominerals with respect to the
cellular ultrastructures remains unclear. Recent studies tend to indicate that different strains
(utilizing different metabolisms) exhibit different biomineralization patterns. For instance, the
nitrate-reducing iron-oxidizing β-proteobacterial strain BoFeN1 (Kappler et al., 2005a)
becomes encrusted with Fe(III) minerals as iron oxidation proceeds, whereas the
photosynthetic iron-oxidizing purple bacterium Rhodobacter ferroxidans strain SW2
(Ehrenreich and Widdel, 1994) does not encrust, even after complete oxidation of Fe(II)
(Kappler and Newman, 2004). It has been suggested that this is related to a differential
adaptation to iron oxidation, yet the mechanisms accounting for these two distinct phenotypes
are still poorly understood. A precise characterization and localization of iron-containing
48
minerals associated with the cells is thus needed to better constrain these mechanisms. This in
turn might offer useful signatures for the search of the by-products of such metabolisms in the
geological record (e.g. Konhauser, 1998, Little et al., 2004).
In this study, we chose to focus on the iron-oxidizing nitrate-dependent strain
BoFeN1, phylogenetically close to the β-Proteobacterium Acidovorax sp. We used several
microscopic and spectroscopic techniques, in particular Transmission Electron Microscopy
(TEM), X-ray Absorption Spectroscopy (XANES: X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy
and EXAFS: Extended X-ray Absorption Fine Structure) and Scanning Transmission X-ray
Microscopy (STXM) to characterize the cell-mineral associations in batch cultures of
BoFeN1. The evolution of iron redox state and the association of organics with iron minerals
are documented at the sub-micrometer scale over the time course of a culture.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Bacterial strain and growth conditions
The nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1, isolated from Lake Constance
littoral sediments (Kappler et al., 2005a), was cultivated in freshwater mineral medium
prepared after Ehrenreich & Widdel (1994). Phosphate was provided as KH2PO4 at an initial
concentration of 4.3 mM. The bacteria were cultured in this medium complemented with 5
mM acetate (provided as sodium acetate) and 10 mM nitrate (provided as sodium nitrate) in
the presence or absence of Fe(II) (provided as FeCl2). Although BoFeN1 clearly oxidizes
metabolically Fe(II), it should be noted that it has not been demonstrated yet that BoFeN1
cells can use Fe as an energy source (Kappler et al., 2005a). The addition of Fe(II) at a total
concentration of 10 mM led to the precipitation of a whitish phase (consisting of Fe(II)-
phosphate, mostly vivianite Fe3(PO4)2), which was subsequently removed by filtration
through 0.22 µm Millipore filters, in an anoxic glovebox (p(O2) < 50 ppm). After filtration,
the medium contained 5.4 mM dissolved Fe(II) and 1.3 mM phosphate. For each culture, 25
mL of medium were transferred into a 58 mL serum bottle that was flushed with N2/CO2
(80% / 20%), closed with a butyl rubber stopper and crimped. BoFeN1 was inoculated (10%)
from an acetate-nitrate-grown culture (culture without iron). Cultures were incubated at 30°C.
49
For TEM and STXM analyses, samples of the same culture were taken in an O2-free glove-
box at several subsequent time steps.
2.2. Analytical methods
Growth was followed by measuring the total soluble protein content using the
Bradford assay. One mL of culture was mixed with a solution of oxalic acid (pH 3, 0.2M) in
order to dissolve iron-bearing minerals and with 6.1 M trichloroacetic acid to precipitate
proteins. After centrifugation (11000 g, 30 min) and removal of the supernatant, proteins were
dissolved in 0.1 M NaOH at 60°C for 6 min. The absorbance of the samples was measured at
595 nm after reaction with the Bradford reagent (BioRad, microassay). Experiments were
conducted in duplicate.
In order to analyze dissolved iron, 200 µL of a culture suspension were sampled with a
syringe and filtered through 0.22 µm Millipore filter in an anoxic glovebox. The dissolved
Fe(II) content of the filtrate was determined by the ferrozine assay (Viollier et al., 2000) after
dilution in 1 M HCl.
2.3. Synthesis of model compounds
To determine the Fe redox state of the samples by STXM at the Fe L2,3-edges, we used
pure Fe(II)- and Fe(III)-phosphates as reference compounds. Both have been synthesized
under anoxic conditions. Fe(II)-phosphate was obtained by addition of 10 mM Fe(II) (as
FeCl2), 5 mM acetate and 10 mM nitrate in the growth medium, which led to the precipitation
of a whitish Fe(II)-phosphate phase. Fe(III)-phosphate was obtained by the addition of 10 mM
Fe(III) (as FeCl3), 5 mM acetate and 10 mM nitrate in the growth medium. Both precipitates
were rinsed twice with degassed distilled water and dried under vacuum inside an anoxic
glove-box. As shown by XRD, this Fe(II)-phosphate phase consisted of vivianite, whereas the
Fe(III)-phosphate was amorphous (Fig. 2). Based on TEM, XRD and XAS analyses, these
model compounds likely represented the closest analogues of the phases formed in the
BoFeN1 cultures. Therefore, we used experimental Fe L2,3-edge spectra of these model
compounds to analyze iron oxidation state of BoFeN1 in STXM experiments, instead of
goethite, hematite, or siderite. XAS data of the BoFeN1 samples were least-square fitted using
linear combinations of these two model compounds and of a 2-line ferrihydrite (Fh2L)
synthesized following the procedure by Schwertmann and Cornell (1991).
50
2.4. Mineral characterization by X-ray diffraction
The bulk mineralogical composition was determined by X-ray diffraction (XRD)
measurement performed on the solid phase collected from a 13-day old culture compared to
Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds. Samples were prepared under anoxic
conditions in an anoxic glove-box. The culture was centrifuged (5000 g, 10 min). The solid
phase was rinsed twice using degassed distilled water and vacuum-dried. The powder was
grinded in an agate mortar and dispensed in a borosilicate capillary, that was sealed with glue
before analysis in the diffractometer. This preparation guaranteed strictly anoxic conditions
for XRD analyses. XRD measurements were performed with CoKa radiation on a
Panalytical® X’Pert Pro MPD diffractometer mounted in Debye-Scherrer configuration using
an elliptical mirror to obtain a high flux parallel incident beam and an X'Celerator®
detector to
collect the diffracted beam. Data were recorded in the continuous-scan mode within the 5 -
80° 2θ range with a step of 0.03°, and a counting time of 12 to 24 h per sample.
2.5. XAS analyses
2.5.1. XAS data collection
In order to limit Fe(II) oxidation under the X-ray beam and to enhance EXAFS signal
on our nano-sized and poorly ordered mineral phases, all data were recorded at 10-15 K using
a modified Oxford®
liquid He cryostat. Samples were transferred from the glove-box into a
liquid nitrogen bath and then into the cryostat, where they were placed under He atmosphere.
This procedure preserved anoxic conditions during sample transfer and analysis. EXAFS data
on all samples except the Fe(II)-phosphate and Fh2L, were recorded at the Fe K-edge, using a
Si(220) double-crystal monochromator on beamline 10-2 at the Stanford Synchrotron
Radiation Laboratory (SSRL). Monochromator was detuned 50% in order to reject harmonics.
Data on the final product of Fe(II) bio-oxidation by BoFeN1 were collected in fluorescence
detection mode using a 13-element Ge-array detector and a 3 ∆µ Mn filter to attenuate elastic
scattering. For EXAFS data collection, energy resolution was around 1 eV, with a beam size
of 2 x 3 mm2 achieved by vertical and horizontal focusing, with a Pt coated elliptic mirror. For
XANES data collection, resolution was improved using vertical slits of 0.25 mm height from
~1.5 to ~0.5 eV. Data on the Fe(III) phosphate model compounds were recorded in
transmission mode with an unfocused beam collimated by 2 × 3.5 mm2 slits , which explain
XANES data for this sample are not as well resolved as for other samples studied. Four
EXAFS scans were accumulated for each sample in order to obtain a reliable signal-to-noise
51
ratio up to k = 11 Å-1
. No measurable change in iron oxidation state was observed during
beam exposure under these experimental conditions. XAS data of the Fe(II)-phosphate model
compound were recorded in transmission at 10K on the SAMBA beamline at the SOLEIL
(Source Optimisée de Lumière d'Énergie Intermédiaire du LURE) synchrotron using a
dynamical sagittal-focusing Si(111) monochromator. EXAFS data on the Fh2L were recorded
at 10 K on the D44 beamline at the Laboratoire pour l’Utilisation du Rayonnement
Electromagnétique (LURE) using a Si(111) double crystals monochromator. XANES data on
this sample were recorded in transmission mode at 10 K on the BM29 ESRF (European
Synchrotron Radiation Facility) beamline using a Si(111) double crystals monochromator. For
all experiments, energy was calibrated by using a double-transmission setup; the first
inflection point of the Fe metal foil K-edge was set at 7111.1 eV (Wilke et al. 2001).
2.5.2. XAS data analysis
X-ray absorption spectra were averaged using the SixPack software (Webb, 2004). EXAFS
data were extracted using the XAFS program (Winterer, 1997) following the procedure
detailed previously by Morin et al., 2008. Radial distribution functions around the Fe
absorber were obtained by calculating the Fourier transform (FT) of the k3χ(k) EXAFS
functions using a Kaiser-Bessel window within the 2.7 – 11 Å-1
k-range with a Bessel weight
of 2.5. Least-squares fitting of the unfiltered EXAFS functions was performed with the plane-
wave formalism, using a Levenberg-Marquard minimization algorithm. Ab initio phase shifts
and total amplitude functions employed in this fitting procedure were calculated with the
curved-wave formalism using the ab-initio FEFF 8 code (Ankudinov et al., 1998) and the
atomic positions from the crystal structure of goethite (Forsyth et al., 1968) and vivianite
(Fejdi et al., 1980). The fit quality was estimated within the 2.7 – 11 Å-1
k-range, using a
reduced χ2 of the following form:
χ2 = Nind / ( Nind - p ) Σ ( k
4 χ(k)exp – k4 χ(k)calc)
2 (Eqn. 2)
with Nind (the number of independent parameters) = (2∆k∆R)/π, p the number of free fit
parameters. The fitting procedure was performed on k4-weighted χ(k) functions in order to
emphasize the signal at high k values, which improves the accuracy of the fitted distances for
light backscattering atoms. Data are however displayed as k3-weighted χ(k) functions. The
χ(k) function of the BoFeN1 sample was also fit within the 3 – 10.5 Å-1
k-range by linear
least-squares fitting (LSF), using linear combinations of k3χ(k) spectra of the Fh2L and
Fe(III)-phosphate model compounds.
52
2.6. Microscopic analyses
Two types of samples were prepared for TEM analyses. First, ultrathin sections were
prepared by ultramicrotomy. Cells were fixed for 2 hours in 1% glutaraldehyde at 4°C,
centrifuged (5000 g), rinsed three times in 0.1 N sodium cacodylate buffer (pH 7.2) for 18h at
4 °C. They were then post-fixed for 90 min in 1% OsO4 in the same buffer, rinsed three times
in distilled water, dehydrated in graded ethanol and propylene oxide-1,2 and progressively
embedded in epoxy resin (Epoxy, Fluka Chemika). Ultrathin sections (70 nm-thick) were cut
with a LEICA ultramicrotome (EM-UC6). After deposition on copper grids, they were stained
with uranyl acetate (2% w/v) and lead citrate (2 g.L-1
). The whole preparation was conducted
in air, since fixation with glutaraldehyde requires O2. As a consequence, TEM observations
could not allow the determination of the redox state of iron, which was determined by STXM
analyses (see infra).
For Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM), High-Resolution TEM
(HRTEM), tomography observations and Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (XEDS)
measurements, whole cells were deposited on a carbon-coated 200-mesh copper grid after two
rinses in degassed distilled water and dried in an anoxic glove-box. STEM and HRTEM
observations, as well as XEDS analyses were performed with a JEOL2100 Microscope
operating at 200kV. STEM observations were performed in darkfield (DF) mode. XEDS
maps were acquired in STEM DF mode, with a focused electron beam (1 nm). Selected area
electron diffraction (SAED) patterns were obtained on areas of interest. Tomography was
performed using a JEOL2100 TEM, equipped with a LaB6 source, operating at 200 kV.
Samples were tilted between -60 and +50°, and images were acquired with Digital-
Micrograph at 1° steps.
2.7. Scanning Transmission X-ray Microscopy
2.7.1. Sample preparation
Preliminary STXM experiments showed that the samples are highly sensitive to
oxidation by O2. We thus developed a specific protocol to keep the samples under an anoxic
atmosphere from preparation to transfer into the microscope. Tests on the reference highly
O2-sensitive Fe(II)-phosphate showed that this protocol was efficient in preserving the sample
from any oxidation detectable by XANES. The entire preparation was performed in an anoxic
glove-box. 1 mL of a suspension of BoFeN1 culture (or of reference compounds) was
sampled at different stages of each culture (3 h to 6 days). Each sample was rinsed twice in
53
degassed distilled water. 0.3 µL of each sample was then deposited on a silicon nitride
membrane (Norcada Inc., Canada) fixed on an aluminium sample holder and allowed to dry at
ambient temperature. A second silicon nitride membrane was then deposited in contact with
the first one and sealed with araldite. Sample holders were stored in sealed aluminised paper
(Protpack, UK) before transfer to the synchrotron. The sealed pockets were opened under a
nitrogen flow just before placing the sample inside the microscope, in which air had been
replaced by nitrogen. After sample transfer, nitrogen was replaced by helium at 1 atm.
2.7.2. STXM experiments
Some of the STXM observations at the Fe L2,3-edges were performed at the Swiss
Light Source (SLS, Villigen) at the PolluX beamline. Some of the observations at the Fe L2,3-
edges and all the observations at the C K-edge were performed at the spectromicroscopy
beamline 10ID-1 at the Canadian Light Source (CLS, Saskatoon). Additional information on
the PolluX beamline can be found in Bernard et al. (2007). The beamline 10ID-1 at the CLS
was described in detail by Kaznatcheev (2007). Both beamlines have an energy resolving
power E/∆E > 3000. The energy scales for this study were calibrated using the well-resolved
3p Rydberg peak of gaseous CO2 for the C K-edge and the major peak of hematite at 708.7
eV for the Fe L3-edge.
2.7.3. Data processing
Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edges. They were
performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the
energy range of interest. Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e.
changes of the Fe redox state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-
edge with increasing dwell times up to several tens of ms (Fig.EA-1). However, no significant
changes were observed for typical dwell times used during analyses of the samples (i.e.
around 0.8 ms per energy- and image-point). The aXis2000 software-package (Hitchcock,
2001) was used for processing image stacks and XANES spectra. Images were recorded on
transmission scale and converted into optical density (OD) according to Equation (3).
OD = -ln(I/I0) (Eqn. 3)
wherein I represents the measured intensity at the point of interest and I0 represents the
intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.
Qualitative speciation maps were obtained by subtracting OD images obtained at an energy
below the absorption edge from OD-images taken at the energies of specific absorption peaks.
54
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150
Fe
(III)/
Fe t
ota
l
dt, ms
dt=0.8 ms
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
10 20 30 40 50 60 70
Fe
(III)/
Fe
to
tal
dt, ms
dt=0.8 ms
Figure EA-1. Beam radiation damage during STXM analyses of vivianite (a) and Fe(III)-
encrusted bacteria (b). Evolution of the Fe(III)/Fe(total) ratios as a function of dwell time,
estimated by fitting the XANES spectra at Fe L2,3-edges. Data were fitted by a Michaelis-
Menton law (y=ax/(b+x)), with a=0.3 and b=12 (r²=0.87) for vivianite and a=0.8 and b=-0.2
(r²=0.98) for Fe(III)-encrusted bacteria. The Fe(II)-phosphate is photo-oxidized, whereas the
Fe(III)-encrusted bacteria are photo-reduced. By comparison, spectra of the BoFeN1 samples
and model compounds were recorded with a dwell time of 0.8 to 1.5 ms per point and energy.
The beam radiation damage is thus very limited under our conditions of data collection.
Quantitative Fe-speciation maps were calculated from the image stacks by singular
value decomposition using the stack-fit routine in aXis2000. The algorithm fits the spectra of
each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference spectra
(Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds) plus a constant, accounting for the
absorption background. Composite maps were obtained by overlaying on the same image the
Fe(II) (blue) and the Fe(III) (red) maps using a common intensity scale for both colour
channels.
XANES spectra were extracted from the stacks on regions of interest. For C K-edge
spectra, the edge jump was normalized to 1. For Fe L2,3-edges spectra, we normalized the area
below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the absorbance of the compounds containing
mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5 correction factor to take into account the
difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+
and Fe3+
ions, neglecting the variation of
radial integrals (Thole et al., 1994). We fit the normalized spectra with linear combinations of
the normalized reference spectra of the Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds,
applying the CGO (Conjugate Gradient Optimization method) curve fit routine in Axis2000.
Fit results allowed estimating the Fe(III)/Fe(total) content of regions of interest. Standard
deviations (SD) were calculated from the deviation between the fit and the data and were
b a
55
systematically less than 1%. Additionally, we performed duplicates (two independent cultures
and analyses) for the 1-day and 3-day old samples, that indicated a good reproducibility of the
Fe(III)/Fe(total) ratio estimations, with a standard deviation lower than 10%.
3. RESULTS
3.1. Bacterial growth and Fe oxidation by-products formed in BoFeN1 cultures
Bulk measurements on the cultures showed that starting from 4-6 mM of dissolved Fe(II),
iron was completely oxidized within 3 days, which coincided with the start of the stationary
phase of growth (Fig. 1). In contrast, no significant Fe(II) oxidation was observed in non-
inoculated samples over the duration of the experiment.
0
10
20
30
40
50
60
70
0
1
2
3
4
5
6
0 50 100 150
To
tal
pro
tein
co
nc
en
tra
tio
n,
µµ µµg
.mL
-1 Dis
so
lve
d F
e(II) c
on
ce
ntra
tion
, mM
Time, hours
Figure 1. Growth curve of BoFeN1 and Fe(II) consumption in the presence of acetate (5
mM), nitrate (10 mM) and ferrous iron over a period of 6 days. (■): Total protein
concentration, (○): Dissolved Fe(II) concentration.
56
20 40 60 80 100
Rela
tiv
e in
ten
sit
y
Degrees 2θ (θ (θ (θ (CoKαααα)
V
V
VVV
V
VV
V
BoFeN1
Fe(III)-phosphate
Fe(II)-phosphate
Figure 2. X-Ray diffractograms of precipitates collected from BoFeN1 cultures after 13 days
and of reference Fe(II)- and Fe(III)-phosphate.
In the cultures, the oxidation of Fe(II) could be observed macroscopically by the
appearance of an orange precipitate. The solid phase, collected after 13 days of culture, was
XRD-amorphous (Fig. 2) and was therefore further characterized by XAS (Table 1, Fig. 3 and
EA-2). The position of the pre-edge of the BoFeN1 sample at 7113.7 eV indicated that iron
was mostly present as Fe(III) in the end-product of iron bio-oxidation by BoFeN1 after 13
days of culture (Fig. 3, Wilke et al., 2001), which is consistent with the shift of 2 eV in the
absorption maximum of the XANES spectrum compared to the Fe(II)-phosphate model
compound. Additionally, the shape of the pre-edge peak is consistent with a dominant
octahedral coordination of Fe(III) in this mineral. Best fits of the EXAFS data of this sample
and of the model compounds ferrihydrite, Fe(II)-, and Fe(III)-phosphates are listed in Table 1
and plotted in Fig. 3. The first- and second-neighbour shells in EXAFS data of the 13-day old
BoFeN1 culture consisted of oxygen, phosphate and iron ligands at 1.97±0.05 Å, 3.19±0.05 Å
and 3.52±0.05 Å respectively. These distances are consistent with those measured on the
reference amorphous Fe(III)-phosphate (Table 1), i.e. FeO6 octahedra sharing corners with
PO4 tetrahedra (Rose et al. 1996, Rose et al., 1997). The structure of this phase could thus be
close to the structure of iron arsenate proposed by Paktunc et al. (2008). The absence of Fe-Fe
57
pairs at a distance of 3.0-3.2 Å, corresponding to edge-sharing FeO6 octahedra that are the
structural basis of all iron oxyhydroxides, rules out the possibility this phase would be an iron
oxyhydroxide with adsorbed phosphate. In contrast, our EXAFS results clearly indicate that
the final Fe-oxidation product in BoFeN1 cultures consists of a mixed Fe-PO4
(oxy)hydroxide. Additionally, a linear decomposition of the k3χ(k) function of the BoFeN1
sample with the k3χ(k) functions of Fh2L and of the amorphous Fe(III)-phosphate model
compound (Fig. EA-2) was performed. Although previous results clearly indicate that the iron
minerals are not composed of ferrihydrite, this decomposition allowed the local order of the
iron minerals formed in BoFeN1 cultures to be investigated. These results indicate that the
local structure of the minerals formed in BoFeN1 cultures is more ordered than the local
structure of the reference amorphous Fe(III)-phosphate, but remains very close to. Indeed, a
component having a local structure similar to Fh2L is more expressed in the BoFeN1 sample
than in the reference Fe(III)-phosphate. All these results are consistent with the production of
amorphous Fe(III)-phosphates in BoFeN1 cultures. This phase exhibits similarities in its
EXAFS signal with the natural oxidation product of vivianite, i.e. santabarbaraite (Pratesi et
al. 2003) but determining the exact nature of this mineral would need further investigations.
58
3 4 5 6 7 8 9 10
5
k3χ
(χ
(χ
(χ
(k)) ))
k, Å-1
Fe(III)-phopshate
2L-Fh
BoFeN1
0 1 2 3 4 5 6
FT
Ma
gn
itu
de
R(Å)
2
Figure EA-2. Linear decomposition of 13-day old BoFeN1 culture with reference 2-line
ferrihydrite and amorphous Fe(III)-phosphate. a: unfiltered k3χ(k) data compared with the
spectra of the model compounds 2-line ferrihydrite (Fh2L) and Fe(III)-phosphate. b:
corresponding Fourier Transform. Solid line shows the data and dashed line the best fit. The
fit gives 21% 2L-Fh and 76% Fe(III)-phosphate respectively, with an Rfactor equal to ∑(fit-
exp)2/∑exp
2) = 5.6 10
-2.
Sample N (± 0.3)
Bond R (Å) (± 0.05)
σσσσ (Å)
(± 0.02)
E0 (eV) (± 3)
χχχχ2
2-line ferrihydrite 4.2 Fe-O 1.96 0.11 1 9.68 1.4 Fe-Fe 3.03 0.10 2.6 Fe-Fe 3.44 0.10
Fe(II)-phosphate 4.0 Fe-O 2.09 0.09 4 37.1 1.8 Fe-P 3.29
0.9 Fe-Fe 3.00
2.6 Fe-Fe 4.71
Fe(III)-phosphate 3.5 Fe-O 1.98 0.07 3 19.9 2.5 Fe-P 3.23 0.11
BoFeN1 4.5 Fe-O 1.97 0.10 1 10.7 1.3 Fe-P 3.19 0.05 0.3 Fe-Fe 3.52 0.05
TABLE 1. Fitting results for Fe K-edge EXAFS data of 13-day old BoFeN1 cultures and of
the 2-line ferrihydrite, Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds. Coordination number
(N), interatomic distance (R), Debye-Waller parameter (σ) and energy offset (E0). Fit quality
was estimated by a reduced χ2 parameter (see text).
a b
59
7108 7110 7112 7114 7116
No
rma
lize
d a
bs
orb
an
ce
, a
.u.
Energy, eV
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
BoFeN1
2L-Fh
7113.7 eV
7111.8 eV
7100 7120 7140 7160 7180 7200
No
rma
lize
d a
bs
orb
an
ce
Energy, eV
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
7132 eV
7127.5 eV
BoFeN1
2L-Fh
3 4 5 6 7 8 9 10 11
k3χ
(χ
(χ
(χ
(k)) ))
k, Å-1
5
2L-Fh
BoFeN1
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
0 1 2 3 4 5
2L-FhF
T M
ag
nit
ud
e
R(Å)
5
BoFeN1
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
Figure 3. X-ray Absorption Spectroscopy measurements on the bulk cultures of BoFeN1
after 13 days. a: XANES spectra at the Fe Kα−edge of 13-day old BoFeN1 cultures and of
2L-ferrihydrite (Fh2L), Fe(III)- and Fe(II)-phosphate model compounds. b: unfiltered k3χ(k)
data compared with the spectra of the model compounds 2-line ferrihydrite (Fh2L), Fe(II)-
and Fe(III)-phosphate. c: corresponding Fourier Transforms. Solid lines show the data and
dashed lines the best fits of the k3χ(k) data (see Table 1).
a
c d
b
60
3.2. Microscopic characterization of the precipitates formed in BoFeN1 cultures
The minerals formed in BoFeN1 cultures were further characterized by a set of
microscopic methods. As illustrated in Fig. 4, three different types of precipitates could be
discriminated, based on their morphology and localization with respect to the cells. (1)
mineralized filaments formed by assemblies of 95±30 nm in diameter spherules were
observed outside the cells, and usually in the vicinity of the cells. (2) 100±25 nm in diameter
globules covered the cell surface (Fig. 4a and 4c). The extracellular localization of these
globules, in contact with the cell outer membrane was confirmed by tomography performed
on mineralized bacteria (Fig. 4d and Movie EA3). (3) An electron dense layer outlining the
cell surface was observed both by STEM in Dark Field mode (Fig. 4a) and by TEM (Fig. 4d).
As shown by tomography on whole cells, this layer remained visible whatever the tilt angle
(from -60° to +50°, Fig. 4d and Movie EA3). TEM observations of stained thin sections
unambiguously indicated that this mineral layer was located within the periplasm, in between
the cytoplasmic and the outer membranes (Fig. 5a and 5b). This is consistent with the
observation of a rather constant thickness (40 nm) of this electron dense layer observed by
STEM in darkfield mode on samples of whole bacteria (Fig. 5c and 5d). In the following, we
refer to the formation of this mineral layer in the periplasm as “cell encrustation”. This
mineralization almost systematically displayed an asymmetric pattern at the cell poles: one
pole was heavily mineralized with thicknesses up to 350 nm, whereas the dense layer on the
opposite pole did not exceed 40 nm in thickness (Fig. 5c). Consistently with XRD and XAS
analyses, all three types of precipitates were amorphous by electron diffraction (Fig. 5b and
5c) and composed of Fe, P and O (Fig. 6).
Detection and mapping of organic molecules were performed using STXM at the C K-
edge (Fig. 7). Different biochemical compounds can be discriminated at this edge based on
their XANES spectra, in particular the energy position of their maximum absorption peaks
(e.g. Benzerara et al., 2004a). Fig. 7b, 7c and 7d show the maps of proteins (-(C=O)-(NH)-,
288.2-280 eV), polysaccharides (289.2-280 eV) and iron (708-700 eV) respectively on the
same area. The periplasmic iron-rich layer contained high amounts of organic carbon.
XANES spectra obtained on the periplasm of many cells were similar to whole bacteria
XANES spectra (Fig. 7e) and contained mostly amide functional groups characteristic of
proteins. In addition, different organic molecules were observed in association with
extracellular iron minerals (Fig. 7c and 7d). C K-edge XANES spectra recorded on these
phases exhibited major peaks at 288.6 and 289.9eV and were similar to XANES spectra of
reference polysaccharides (Fig. 7e).
61
Figure 4. TEM and STEM observation of Fe-precipitates in BoFeN1 cultures. a: STEM
image (Dark Field) showing three cells and Fe-containing precipitates (bright areas). Three
types of precipitates can be observed (white arrows): mineralized filaments (F), globules at
the cell surface (G) and periplasmic encrustation (P) are pointed by white arrows. b: Electron
diffraction pattern obtained on a globule at the cell surface and showing diffuse rings
indicating that the globules are amorphous. c: High-resolution image of a single particle on a
filament, showing that it is amorphous. d: TEM tilt series (-60°, 0° and +50°, movie available
as Supporting Information EA-4) of an encrusted cell and mineralized filaments.
a b
5nm
c P
G
F
-60°°°° 0°°°° +50°°°° d
g
g
f
p
62
Figure 5. TEM study of periplasmic encrustation within BoFeN1 cells after 6 days of
culture. a: TEM bright-field image of a transversal section of a BoFeN1 cell stained with U-
acetate and Pb-citrate b: TEM bright-field image of a detail of the BoFeN1 cell wall shown in
a. White arrows point the outer and inner membranes enclosing the precipitates. c: STEM
image (darkfield) of an encrusted cell. Bright areas are enriched in iron. White arrows point
the asymmetric mineral thickening at the poles, with the right pole being thicker than the left
pole. d: Intensity profile taken along the A-B line indicated from panel c, evidencing the 40-
nm thick encrustation within the periplasm. Such measurements can be processed all around
the cells and show the relatively constant thickness (except at one of the poles) of this
encrustation consistent with the width of the periplasm.
50nm 100nm
a b
c
1µm
0
50
100
150
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Inte
nsit
y,
a.u
.
Distance, µm
40nm 40nm
d
A
B
A B
63
Figure 6. Chemical composition of minerals formed in BoFeN1 culture after 6 days of
culture. a: STEM image (darkfield) showing numerous cells of BoFeN1, most of which
containing periplasmic iron-rich precipitates. b, c and d: XEDS maps of Fe, P and O
respectively. e: XEDS spectra measured on extracellular mineralized filaments and on
bacteria.
Fe K 2 µm
b
2 µm
a
P K 2 µm
c
O K 2 µm
d
0 1 2 3 4 5 6 7
Co
un
ts
Energy, keV
200Fe Kαααα
Fe Kββββ
K KββββK Kαααα
Cl Kαααα
P Kαααα
Na Kαααα
Fe Lαααα
O Kαααα
C Kαααα
e
Bacteria Precipitates
64
Figure 7. Spectromicroscopy study of organics associated with BoFeN1 biominerals. a:
STXM image of BoFeN1 bacteria and precipitates at 288.2 eV. b: map of proteins obtained
by subtracting the image at 280 eV converted into optical density units (OD) from the OD-
image taken at 288.2 eV (maximum absorption of proteins). Bacteria cells can be easily
detected on this map and show for some of them (e.g. left hand side) a higher protein
concentration at the periphery and especially at the poles. c: Map of carbon absorbing at 289.2
eV (maximum absorption of polysaccharides) showing the presence of exopolysaccharides in
the vicinity of the cells. d: Fe map obtained from the subtraction of the OD-image taken at
700 eV from the OD-image taken at 708.7 eV, showing a higher content of iron within the
periplasm of the cells and the presence of extracellular iron-rich precipitates. e: C K-edge
NEXAFS spectra of the BoFeN1 bacteria, organics associated with the extracellular
precipitates and of the reference compounds albumin (protein) and alginate (polysaccharide).
2µm 2µm
2µm 2µm
a b
c d
280 285 290 295 300
Op
tic
al
de
ns
ity,
a.u
.
Photon energy, eV
288.2eV
288.6eV289.9eV
Albumin
BoFeN1
Filaments
Alginate
e
65
Figure 8. Temporal evolution of BoFeN1 encrustation. STEM images (darkfield) acquired
30 min. to 6 days after inoculation showing the progressive encrustation of the periplasm,
followed by the appearance of globules at the cell surface.
3.3. Spatial and temporal variations of cell encrustation among a bacterial
population
Aliquots of BoFeN1 cultures were sampled for STEM analysis 30 min, 3 h, 6h, 1 day, 3
days and 6 days after inoculation in order to follow the evolution of cell encrustation (Fig. 8).
In the first stage (30 min), a thin and discontinuous precipitation of Fe-phosphate started in
the periplasm. In addition, colloidal Fe-rich particles could be observed at the surface of the
cells. After 3 h, the periplasm was already completely encrusted. Globules located at the cell
surface were widespread in 6h-old cultures and restricted to cells showing encrustation of the
periplasm. After 3 days, a clear asymmetric mineral thickening was observed at the cell pole.
Finally, globules at the cell surface were more numerous and thicker in 6-day old cultures.
Superimposed to this general scheme, heterogeneities in the intensity of cell biomineralization
were noticed among the bacterial populations. As shown in Fig. 9, cells devoid of any
precipitate were observed in the cultures at each individual stage. These bacteria were
observed by STEM (Fig. 9a) and were also clearly identified by STXM, appearing on C maps
but not on Fe maps (Fig. 9b and 9c).
30min. 3h 6h
1 day 3 days 6 days
66
Figure 9. Heterogeneity of encrustation among the bacterial population. a: STEM image a
BoFeN1 cells 6 days after inoculation, showing the coexistence of encrusted and non-
encrusted bacteria (white arrows). b: Map of proteins in a 1-day old culture obtained from the
subtraction of the OD-image taken at 280eV from the OD-image taken at 288.2eV. White
arrows point out non-encrusted cells. c: Iron OD-map of the same area as b obtained from the
subtraction of the OD-image taken at 700eV from the OD-image taken at 708.7eV. Non-
encrusted cells are not visible on this map.
Figure 10. Mapping of Fe(II) and Fe(III) in a 1-day old culture of BoFeN1. Stacks were
fitted by a linear combination of a reference Fe(II)-phosphate, a reference Fe(III)-phosphate
and a constant. a and b: Fe(II) and Fe(III) maps obtained by fitting the stack with a reference
Fe(II)-phosphate and a reference Fe(III)-phosphate respectively. These maps show two
705 710 715 720 725
Op
tic
al
de
nsit
y, a
.u.
Photon energy, eV
707eV
708.7eV
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
Precipitates
Oxidized spots in precipitates
Bacteria
e
2µm 2µm 1µm
a b c
1µm
0
0.4
Constant
Fe(II) 1µm
0
4.4
Fe(III) 1µm
3.0
0
Fe(II) Fe(III)
1µm
a b
c d
67
encrusted cells and extracellular precipitates. c: Constant map (i.e. contribution of a constant
absorbance spectrum at each pixel) accounting for the absorption of all elements below the
absorption edge energy of Fe. d: Composite map obtained by overlaying the Fe(II)- and the
Fe(III)-maps of the same area (in blue and red respectively), showing the presence of highly
oxidized spots among the mixed-valence extracellular precipitates. e: NEXAFS spectra at the
Fe L2,3-edge extracted from different areas of the stack compared with the spectra of Fe(II)-
phosphate and Fe(III)-phosphate model compounds. Spectra (solid lines) were fit with
combinations of the two model compounds to estimate the proportions of Fe(II) and Fe(III)
(dashed lines). Numerical fit results are displayed in Table 2.
3.4. Evolution of iron redox state at the submicrometer scale in BoFeN1 cultures
The spatial distribution of iron redox states in BoFeN1 cultures was analyzed by STXM at
the Fe L2,3-edges (Fig. 10). Fe(II) and Fe(III) maps (Fig. 10a and 10b) were obtained by fitting
Fe L2,3-edges stacks with linear combinations of Fe L2,3-edges spectra of the Fe(II)- and
Fe(III)-phosphate model compounds and a constant (Fig. 10c). A colour composite of the
Fe(II) and Fe(III) maps (Fig. 10d) allowed the localization of oxidized versus reduced areas in
the samples. The two references (Fe phosphates) were also used for linear decomposition of
the XANES spectra extracted from the stacks on bacteria and extracellular precipitates (Fig.
10e). Best fits provided a quantitative estimation of Fe(II)/Fetotal and Fe(III)/Fetotal ratios
(Table 2) in the bacteria and in the extracellular precipitates. The optical density was
systematically checked to ensure that it was low enough to avoid oversaturation of the
absorption signal that could artefactually modify the Fe-redox ratio.
In 1-day old cultures, iron exhibited a mixed valence in bacteria as well as in extracellular
precipitates, with average Fe(III)/Fetotal ratios of 50±0.6% and 44±0.6% Fe(III) respectively
(Fig. 10 and Table2). Combining these results with the total Fe concentration (Fe(II) and
Fe(III) in a dissolved or particulate form, 5.4 mM) and the dissolved Fe(II) concentration
measured by spectrophotometry in the culture medium after 1 day of culture (3.6 mM), we
can estimate particulate Fe(II) and Fe(III) average concentrations in the medium of 0.95 mM
and 0.85 mM respectively. However, spatial heterogeneities of the Fe redox state were
detected within the extracellular precipitates (Fig. 10d): in particular, highly oxidized spots
(75±0.6%Fe(III)) were observed among the extracellular precipitates.
Following the same method, the temporal evolution of iron redox state was investigated
on samples collected 3 h to 6 days after inoculation. Fe(II)-Fe(III) composite maps (Fig. 11a
to 11e) showed a progressive evolution from a predominantly Fe(II) composition on the cells
and the extracellular precipitates (3-6 h) towards a completely oxidized, Fe(III) state in 6-day
68
old samples. Accordingly, best fits of the XANES spectra of the bacteria (Fig. 11f and Table
2) evidenced a transition from a mixed valence Fe(II)-Fe(III) mineral (42±0.5% Fe(III))
towards an almost pure Fe(III) mineral (91.7±0.7% Fe(III)). The same trend was observed on
the extracellular precipitates (Fig. 11g and Table 2). These results parallel bulk measurements
of dissolved Fe(II) in the cultures (Fig. 1).
TABLE 2. Fe(III)/Fe(total) quantification obtained from the fit of Fe L2,3-edge NEXAFS
spectra extracted from stacks on bacteria and precipitates at different stages of the culture.
Fe(III)/Fe(total) values result from at least two spectra fits. Standard deviations (SD) were
calculated as the SD of the fit to the data. Values reported in this Table are means of the
standard deviations obtained for each fit.
Area Time, h Mean Fe(III)/Fe(total) Standard deviation Bacteria 3 0.42 0.005
6 0.450 0.004 24 0.50 0.006 72 0.65 0.008 144 0.917 0.007
Precipitates 3 0.37 0.006
6 0.349 0.004
24 0.44 0.006
72 0.66 0.007
69
Figure 11. Evolution of iron redox state 3 h to 6 days after inoculation. a to e: Fe redox
mapping (after the same procedure as presented in Figure 8) after 3 h, 6 h, 24 h, 72 h and 144
h of culture. We observed the progressive oxidation of iron associated with bacteria and
extracellular precipitates. f and g: NEXAFS spectra at the Fe L2,3-edge obtained on bacteria
and extracellular precipitates respectively, collected on 3h-old to 6-days old cultures. Solid
lines show the data and dashed lines the fits. The numerical results of the fits are displayed in
b
c d e
a
3h 6h
1 day 3 days
2µm 2µm
1µm 2µm 2µm
Fe(II) Fe(III)
705 710 715 720 725
Op
tica
l d
en
sit
y, a
.u.
Photon energy, eV
3h
6h
1 day
3 days
6 days
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
707eV
708.7eV
Bacteria
705 710 715 720 725
Op
tic
al
de
ns
ity
, a
.u.
Photon energy, eV
3h
6h
1 day
3 days
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
707eV
708.7eV
Precipitates
f g
70
Table 2. These results indicate the progressive oxidation of iron both at the contact of the
bacteria and in the extracellular precipitates.
4. DISCUSSION
4.1. Periplasmic and polar precipitation of iron phosphates
In the present study, we observed the precipitation of amorphous iron phosphates within
the periplasm of the anaerobic iron-oxidizing nitrate-reducing strain BoFeN1 (Fig. 4). In
contrast, in the anaerobic iron-oxidizing phototrophic purple bacteria strain SW2, the
periplasm is never encrusted and precipitation of iron mainly occurs outside the cells (Kappler
and Newman, 2004). The reason why these two strains, that both oxidize ferrous iron at
neutral pH, exhibit different biomineralization patterns remains unclear. Precipitation of
calcium and chromium phosphates within the periplasm has been reported in several other
Gram-negative bacteria exposed to elevated concentrations calcium (Benzerara et al., 2004b)
or chromate (Goulhen et al., 2006) respectively. This suggests that periplasmic mineralization
of phosphates is a widespread mechanism, not restricted to iron-oxidizing bacteria. Moreover,
the two latter studies proposed two separate processes to account for the preferential
precipitation of phosphate in the periplasm: (1) the achievement of supersaturation with the
phosphate phase within the periplasm and (2) the preferential nucleation of phosphate
minerals on periplasmic, possibly proteic, compounds. Regarding the achievement of
supersaturation, it should be noted that the culture medium was initially saturated with a
Fe(II)-phosphate phase (see medium preparation in Material and Method section). It is
generally assumed that the chemical composition within the periplasm is close to that of the
culture medium, given the high permeability of the outer membrane, due to the abundance of
porins (Nikaido, 2003; Wilks and Slonczewski, 2007). Slight variations of chemical activities
within the periplasm may locally increase supersaturation with a Fe-phosphate phase and
account for its precipitation at this location. For example, these variations may be triggered by
the recycling of phosphates involving the activity of phosphatases (e.g. Hirschler et al., 1990;
Blake et al., 1998), by local variations of pH and/or by the metabolic oxidation of iron. The
solubility of the amorphous Fe-phosphates detected in the present study is however unknown
and thermodynamic analyses will have to be conducted in the future to address that point.
Regarding a preferential nucleation of mineral phases within the periplasm, observations of a
71
preferential crystallographic growth of apatite parallel to the cell surface and proteomics
studies have suggested that formation of Ca-phosphate in the periplasm may result from
nucleation on specific membrane-associated proteins (e.g. Benzerara et al., 2004b, Van Dijk
et al., 1998). In BoFeN1 cultures, we observed an accumulation of proteins in the periplasm
of iron-encrusted cells (Fig. 7). These periplasmic proteins could serve as nucleation sites for
precipitation of iron phosphate, but further investigations are needed to support this
hypothesis.
Proteins allocated to the periplasm are synthesized in the cytoplasm and translocated to
the periplasmic compartment, where they are ultimately folded and assembled (Miot and
Betton, 2004). It has been shown that various environmental stresses can enhance the
accumulation of misfolded proteins in the periplasm of E. coli, leading to the formation of
periplasmic inclusion bodies composed of protein aggregates (e.g. Arié et al., 2006).
Moreover, recent studies evidenced an asymmetric formation and accumulation of inclusion
bodies at the poles of E. coli, under non-stressing conditions (Lindner et al., 2008). This
asymmetric pattern was shown to be a direct consequence of aging: upon cell division, protein
aggregates segregate and accumulate in older poles relative to new poles. In the present study,
we observed both a periplasmic accumulation of proteins in iron-encrusted cells and an
asymmetric pattern of cell mineralization at the poles. These results are both suggestive of
protein aggregation and the possible relation with a preferential cell encrustation would be
interesting to study further. Alternatively, the preferential location of iron precipitates at the
cell poles might be reminiscent of iron oxide granules previously reported to accumulate at
the poles of the iron-reducing bacterium Schewanella putrefaciens (Glasauer et al., 2007).
These authors proposed that this polar location could result from a facilitated iron uptake at
the poles.
4.2. Evolution of iron redox state in the periplasm
Proteins involved in the transfer of electrons during iron oxidation by anaerobic nitrate-
dependent iron-oxidizing bacteria are not known nor localized yet. However, recent studies of
the anaerobic iron-oxidizing phototrophs Rhodopseudomonas palustris strain TIE-1 and
Rhodobacter ferroxidans strain SW2 suggested that a soluble decahaeme c-type cytochrome,
potentially playing a crucial role in iron oxidation, could reside in the periplasm (Croal et al.,
2007, Jiao and Newman, 2007). Similarly, in the acidophilic iron oxidizing bacterium
Acidithiobacillus ferroxidans, the electron transfer system coupled to iron oxidation is
expected to function in the periplasmic space (Bruscella et al., 2005) and in particular, the
72
cytochrome c oxidase has been described as a membrane-bound protein (Yamanaka and
Fukomori, 1995). In the present study, significant amounts of Fe(III) within BoFeN1
periplasm were observed from the beginning of the culture, increasing over time. These
results strongly suggest that at least one of the steps of iron oxidation takes place in the
periplasm of this strain as well.
Given the high permeability of the outer membrane of Gram-negative bacteria, it is
likely that the higher the Fe(II) concentration in the culture medium, the higher the Fe(II)
concentration in the periplasm. Hypothesizing that Fe(II) oxidation occurs within the
periplasm of BoFeN1, the redox state of periplasmic iron phosphates is directly influenced by
the balance between soluble Fe(II) concentrations in the culture medium and Fe(III) formed
by metabolic oxidation. The following scenario can thus be proposed: at time zero, there is a
high concentration of Fe(II) in solution, and part of this iron is taken up and oxidized by the
bacteria, leading to the precipitation of a mixed-valence iron phase in the periplasm. Over the
course of culture growth, the concentration of dissolved Fe(II) in solution decreases and thus
the average iron redox state of the periplasmic precipitate increases. This scenario could
partly explain how the redox state of the periplasmic precipitate roughly follows the iron
redox state of the bulk solution. Moreover, in a scenario where Fe oxidation stops as soon as
precipitation occurs within the periplasm, one could expect to find a mixture of cells with
periplasmic precipitates exhibiting various iron redox states ranging from a mixed-valence
compound towards a pure Fe(III) compound in the latest stages of growth. In contrast,
although the number of analyses was inherently limited by the microscopy approach, the iron
redox state of the periplasmic precipitates was constant from one cell to another at a given
growth stage. Two hypotheses could account for these results: (1) a constant re-equilibration
of the redox state of the precipitates after their formation, or (2) an increasing fraction of
biomineralizing cells at a given stage compared to former stages (potentially caused by a
combination of growth and precipitation kinetics or by cell lysis). These hypotheses will have
to be assessed in future studies. Overall, the homogeneity of the iron redox state and the
colocalization of Fe and P evidenced by EDXS (Fig. 6) both suggest the existence of a single
Fe-phosphate phase at a given stage of the culture. Some authors have proposed the existence
of an autocatalytic process consisting in the oxidation of Fe(II) in solution by Fe(III)-
containing solids. Fakih et al. (2008) have observed a decreased autocatalytic effect of the
oxidation of Fe(II) associated with bacteria in cultures of Bacillus subtilis. While this process
may occur in BoFeN1 cultures, it should be noted that it would slow down the rate of Fe(II)
oxidation within the periplasm of BoFeN1 cells. However, the main trend we observe is the
73
reverse, i.e. faster oxidation of Fe(II) on the cells, which likely results at first order from the
metabolic oxidation of Fe(II) by the bacteria.
4.3. Extracellular precipitation of iron phosphates
4.3.1. Role of organics in extracellular precipitation of iron phosphates
Extracellular mineralized filaments consisting of iron phosphates were shown to be
associated with exopolysaccharides (Fig. 7) in the BoFeN1 cultures. These precipitates
displayed a morphology (Fig. 4) and an organic content similar to the polysaccharide-
associated iron oxyhydroxide filaments described by Chan et al. (2004) in a neutral-pH
environment. These authors suggested that extrusion of polysaccharides localized iron
precipitation in proximity to the cell membranes, thus harnessing the proton gradient for
energy generation. In addition, this study showed that polysaccharide strands triggered the
nucleation of high aspect ratio pseudo-single crystals of akaganeite. In contrast, iron
phosphates formed by BoFeN1 are amorphous. However, our results suggest that EPS may
facilitate iron phosphate nucleation or aggregation of iron phosphate colloids outside the cells,
concomitantly with periplasmic encrustation.
4.3.2. Origin of extracellular Fe(III)
STXM analyses of the extracellular precipitates formed in BoFeN1 cultures highlighted a
local heterogeneity of iron redox state, with highly oxidized spots disseminated within a
mixed-valence iron phosphate matrix (Fig. 10). Furthermore, iron was almost completely
oxidized in the extracellular precipitates after three days of culture (Fig. 11 and Table 2).
These extracellular iron biominerals are reminiscent of those described in neutrophilic iron-
oxidizing phototroph cultures of R. palustris strain SW2 for instance (Kappler and Newman,
2004). Those authors have questioned the mechanisms involved in the transfer of Fe(III) from
the cells to the extracellular medium. Indeed, the presence of Fe(III) away from the bacteria is
somewhat surprising given the low solubility of Fe(III) at neutral pH (Cornell and
Schwertmann, 2003). The same question is relevant to BoFeN1, as we showed in the present
study that BoFeN1, in addition to mineral precipitation within the periplasm and on external
cell wall, has the ability to form extracellular Fe(III) mineral phases not bound to the cells.
Abiotic oxidation of Fe(II) by nitrite can first be considered. However, such processes have
been shown to contribute to a significant iron oxidation rate only in the presence of cell-bound
Fe(II) and not in the presence of aqueous Fe(II) (Coby and Picardal, 2005). Moreover, as
demonstrated by Kappler et al. (2005a), the kinetics of iron oxidation observed in BoFeN1
74
cultures does not support an abiotic oxidation of iron by nitrites. Therefore, abiotic oxidation
of Fe(II) at distance from the cells via this mechanism is unlikely. Although significant
amounts of proteins were not detected in association with extracellular precipitates, lysis of
cells encrusted by Fe(III)-minerals could account in part for the presence of Fe(III)-rich spots
among the extracellular mixed-valence precipitates. Previous studies on R. ferrooxidans sp.
strain SW2 (Croal et al., 2004; Kappler and Newman, 2004; Croal et al., 2007) have
suggested some other mechanisms: (1) A production of Fe(III)-chelators exporting Fe(III)
away from the cells (this hypothesis may also partly explain the Fe isotope fractionation
produced by iron-oxidizing phototrophs (Croal et al., 2004)) (2) A local drop of pH around
the cells (Kappler and Newman, 2004), which may favor Fe(III) export.
4.4. Potential bio-signatures in the fossil record
Mineralized filaments composed of iron oxides have been widely described in ancient rocks
and their biogenicity questioned (e.g. Little et al., 2004, Ivarsson et al., 2008). Most of these
studies have noted the morphological similarity of these filaments with structures resulting
from iron oxidation by microaerobic bacteria such as Gallionella stalks and Leptothrix
sheaths (Fortin and Langley, 2005). However, potential signatures of the past activity of
anaerobic iron-oxidizing bacteria have never been observed in ancient rocks, probably as a
consequence of the scarcity of studies dealing with these metabolisms. Nevertheless,
anaerobic iron-oxidizing bacteria may have played a crucial role in driving ancient
geochemical cycles (Konhauser, 1998; Kappler et al., 2005b; Posth et al., 2008). Moreover,
the potential involvement of iron-oxidizing bacteria in the formation of tubes in basaltic glass
has been discussed (e.g. Furnes et al., 2005; Benzerara et al., 2007). In order to fully assess
the biogenic origin of iron minerals found in ancient rocks and their possible relationship with
the activity of past anaerobic iron-oxidizing bacteria, accurate and specific criteria are needed.
In the present study, minerals produced in BoFeN1 cultures were shown to consist of Fe-
phosphates. It is likely that using a different culture medium composition (for instance
carbonate instead of phosphate) would have led to a different mineralogy. The mineralogy of
the phases formed in the present BoFeN1 cultures is thus likely not innate to bacterial
anaerobic Fe oxidation at neutral pH. This issue should be addressed in future experiments in
which the chemistry of culture medium could be modified. Nevertheless, iron biominerals
produced in BoFeN1 cultures were shown to exhibit very specific patters that are probably
independent of the chemistry of the culture medium and more likely related to processes
triggered by this bacterial metabolism: a 40 nm-thick layer of iron minerals associated with
75
high concentrations of protein moieties within the periplasm (Fig. 4), asymmetric
mineralization at bacteria poles (Fig. 4), and mineralized filaments composed of iron minerals
associated with polysaccharides (Fig. 4 and Fig. 7). These features are potential indicators of
these metabolisms that could be preserved and sought for in modern environments and in
ancient rocks. The preservation of such features during diagenesis and metamorphism, in
particular the preservation of local accumulations of proteins and polysaccharides associated
with the mineral precipitates will have to be assessed in future experiments. Looking for such
organic-mineral associations using spectromicroscopic methods (e.g. Bernard et al., 2007;
Lepot et al., 2008) would provide additional evidence of bacterial iron oxidation in the fossil
record.
5. CONCLUSIONS
The periplasm was revealed as a key location for iron oxidation in BoFeN1. Asymmetric
polar mineral thickening and accumulation of proteins within the periplasm of iron-encrusted
cells are suggestive of protein aggregation possibly promoting iron phosphate nucleation.
Exopolysaccharides were produced and released by the bacteria and potentially participate in
localizing the precipitation of extracellular iron phosphates at distance from the cells. The
progressive oxidation of these extracellular phases supports the hypothesis of a mechanism of
Fe(III) export. These results indicate that this encrusting strain (BoFeN1) shares similarities
with non-encrusting neutrophilic iron-oxidizing bacteria, such as SW2 (Kappler and Newman,
2004), suggesting that cell encrustation is not exclusive of Fe(III) export.
76
Acknowledgments:
We gratefully acknowledge the support of an ANR “Jeunes Chercheurs” Grant (JM &KB).
The STXM measurements have been performed at the Swiss Light Source, Paul Scherrer
Institut, Villigen, Switzerland and the Canadian Light Source, Saskatoon, Canada. The CLS is
supported by NSERC, CIHR, NRC and the University of Saskatchewan. We thank Joerg
Raabe and George Tzvetkov for their expert support of the SLS STXM and Konstantine
Kaznatcheev, Chithra Karunakaran and Drew Bertwistle for their expert support of the CLS
STXM. We also thank Olivier Beyssac (ENS Paris) for his help in data collection at SLS.
Portions of this research were carried out at the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, a
national user facility operated by Stanford University on behalf of the U.S. Department of
Energy, Office of Basic Energy Sciences. The authors are indebted to the SSRL staff,
especially John R. Bargar, Joe Rogers and Samuel Webb, for their technical assistance during
the XAFS experiments. We also thank Georges Ona N’guema and Farid Juillot (IMPMC) for
their help in XAS data collection at the SSRL. We acknowledge the European Synchrotron
Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities and we would like to thank
Olivier Mathon for his assistance in using beamline BM29. We acknowledge the SOLEIL
Synchrotron for provision of synchrotron radiation facilities and we would like to thank
Stephanie Belin, Emiliano Fonda and Valerie Briois for their assistance in using the SAMBA
beamline. We would like to acknowledge Florian Hegler for his help cultivating the nitrate-
depending Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1. The contribution from AK and NP was funded by
an Emmy-Noether fellowship and additional funding from the German Research Foundation
(DFG) to AK. This study was supported by a grant from Agence Nationale de la Recherche
(KB and JM). This is IPGP contribution No. xxx.
77
REFERENCES
Ankudinov A.L., Ravel B., Rehr J.J. and Conradson S.D. (1998) Real-space multiple-
scattering calculation and interpretation of X-ray-absorption near-edge structure. Physical
Rev. B (Condensed Matter), 58, 7565-7576.
Arié J.P., Miot M., Sassoon N. and Betton J.M. (2006) Formation of active inclusion bodies
in the periplasm of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 62(2), 427-437.
Benz M., Brune A. and Schink B. (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at
neutral pH by chemohetereotrophic nitrate-reducing bacteria. Arch. Microbiol., 169, 159-165.
Benzerara K., Yoon T.-H., Tyliszczak T., Constantz B., Spormann A.M., and Brown, G.E. Jr.
(2004a) Scanning Transmission X-ray Microscopy Study of Microbial Calcification.
Geobiology, 2, 249-259.
Benzerara K., Menguy N., Guyot F., Skouri F., de Luca G., Barakat M. and Heulin T. (2004b)
Biologically controlled precipitation of calcium phosphate by Ramlibacter tataouinensis.
Earth Plan. Sc. Lett., 228, 439-449.
Benzerara K., Menguy N., Banerjee N.R., Tyliszczak T., Guyot F. and Brown, Jr. G.E. (2007)
Alteration of submarine basaltic glass from the Ontong Java Plateau: a STXM and TEM
study. Earth Planet. Sci. Lett. 260, 187-200.
Bernard S., Benzerara K., Beyssac O., Menguy N., Guyot F., Brown G.E. and Goffé B.
(2007) Exceptionnal preservation of fossil plant spores in high-pressure metamorphic rocks.
Earth Plan. Sc. Lett., 262, 257-272.
Blake R.E., O’Neil J.R. and Garcia G.A. (1998) Effects of microbial activity on the delta O-
18 of dissolved inorganic phosphate and textural features of synthetic apatites. Am. Min., 83,
1516-1531.
Bruscella P., Cassagnaud L., Ratouchniak J., Brasseur G., Lojou E., Amils R. and Bonnefoy
V. (2005) The HiPIP from the acidophilic Acidithiobacillus ferroxidans is correctly processed
and translocated in Escherichia coli, in spite of the periplasm pH difference between these
two micro-organisms. Microbiology SGM, 151, 1421-1431.
Chan C.S., De Stasio G., Welch S.A., Girasole M., Frazer B.H., Nesterova M.V., Fakra S. and
Banfield J.F. (2004) Microbial polysaccharides template assembly of nanocrystal fibers.
Science, 303, 1656-1658.
Clarke W.A., Konhauser K.O., Thomas J.C. and Bottrell S.H. (1997) Ferrix hydroxide and
ferric hydroxysulfate precipitation by bacteria in an acid mine drainage lagoon. FEMS
Microbiol. Rev., 20, 351-361.
78
Coby A.J. and Picardal F.W. (2005) Inhibition of NO3- and NO2
- reduction by microbial
Fe(III) reduction: evidence of a reaction between NO2- and cell surface-bound Fe
2+. Appl.
Environ. Microbiol., 71, 5267-5274.
Cornell R.M. and Schwertmann U. (2003) The iron oxides: structure, properties, reactions,
occurrences and uses. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, Weinheim, Germany.
Croal L.R., Johnson C.M., Beard B.L. and Newman D.K. (2004) Iron isotope fractionation by
Fe(II)-oxidizing photoautotrophic bacteria. Geochim. Cosmochim. Acta, 68, 1227-1242.
Croal L.R., Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The fox operon from Rhodobacter strain SW2
promotes phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodobacter capsulatus SB1003. J. Bacteriol.,
189, 1774-1782.
Ehrenreich A. and Widdel F. (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron by purple bacteria, a
new-type of phototrophic metabolism. Appl. Envrion. Microbiol., 60, 4517-4526.
Fejdi P., Poullen J.F. and Gasperin M. (1980) Refinement of the structure of vivianite,
Fe3(PO4)2.8H2O. Bulletin de Minéralogie, 103, 135-138.
Forsyth J.B., Hedley I.G. and Johnson C.E. (1968) Magnetic structure and hyperfine field of
goethite (alpha-FeOOH). Journal of Physics Part C (Solid State Physics), 1, 179-&.
Fortin D. and Langley S. (2005) Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals.
Earth Sc. Rev., 72, 1-19.
Furnes H., Banerjee N.R., Muehlenbachs K., Kontinen A. (2005) Preservation of
biosignatures in metaglassy volcanic rocks from the Jormua ophiolite complex, Finland.
Precambrian Res. 136, 125-137.
Ghiorse W.C. (1984) Biology of iron-depositing and manganese-depositing bacteria. Ann.
Rev. Microbiol., 38, 515-550.
Glasauer S., Langley S., Boyanov M., Lai B., Kemner K. and Beveridge T.J. (2007) Mixed-
valence cytoplasmic iron granules are linked to anaerobic respiration. Appl. Environ.
Microbiol., 73, 993-996.
Goulhen F., Gloter A., Guyot F. and Bruschi M. (2006) Cr(VI) detoxification by
Desulfovibrio vulgaris strain Hildenborough: microbe-metal interactions studies. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 71, 892-897.
Hafenbradl D., Keller M., Dirmeier R., Rachel R., Rossnagel P., Burggraf S., Huber H. and
Stetter K.O. (1996) Ferroglobus placidus gen nov, sp nov, a novel hyperthermophilic archeum
that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions. Arch. Microbiol., 166, 308-314.
Hallberg R. and Ferris F.G. (2004) Biomineralization by Galionella. Geomicrobiol. J., 21,
325-330.
79
Heising S. and Schink B. (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium
vannielii strain. Microbiology, 144, 2263-2269.
Hirschler A., Lucas J. and Hubert J.C. (1990) Apatite genesis, a biologically induced or
biologically controlled mineral formation process. Geomicrobiol. J., 8, 47-56.
Hitchcock AP (2001) Soft X-ray spectromicroscopy of polymers and biopolymer interfaces,
Journal of Synchrotron Radiation. 8, 66-71.
Ivarsson M., Lindblom S., Broman C., Holm N.G. (2008) Fossilized microorganisms
associated with zeolite-carbonate interfaces in sub-seafloor hydrothermal environments.
Geobiology, 6, 155-170.
Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The pio operon is essential for phototrophic Fe(II)
oxidation in Rhodopseudomonas palustris TIE-1. J. Bacteriol., 189, 1765-1773.
Kappler A. and Newman D.K. (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing
phototrophic bacteria. Geochim. Cosmochim. Acta, 68, 1217-1226.
Kappler A. and Straub K.L. (2005) Geomicrobiological cycling of iron. Mol. Geomicrobiol.
Review in Mineralogy and Geochemistry, 59, 85-108.
Kappler A., Schink B. and Newman D.K. (2005a) Fe(III) mineral formation and cell
encrustation by the nitrate-dependent Fe(II)-oxidizer strain BoFeN1. Geobiology, 3, 235-245.
Kappler A., Pasquero C., Konhauser K.O. and Newman D.K. (2005b). Deposition of Banded
Iron Formations by photoautotrophic Fe(II)-oxidizing bacteria. Geology, 33, 865-868.
Kaznatcheev K.V. (2007) Soft X-ray spectromicroscopy beamline at the CLS:
Commissioning results. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A:
Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment, 582, 96-99.
Konhauser K.O. (1998) Diversity of bacterial iron mineralization. Earth Sc. Rev., 43, 91-121.
Kozubal M., Macur R.E., Korf S., Taylor W.P., Ackerman G.G., Nagy A. and Inskeep W.P.
(2008) Isolation and distribution of a novel iron-oxidizing crenarchaeon from acidic
geothermal springs in Yellowstone National Park. Appl. Environ. Microbiol., 74, 942-949.
Lazaroff N., Melanson L. Lewis E., Santoro N. and Pueschel C. (1985) Scanning electron-
microscopy and infrared-spectroscopy of iron sediments formed by Thiobacillus ferroxidans.
Geomicrobiol. J., 4, 231-268.
Lepot K., Benzerara K., Brown Jr. G.E., Philippot P. (2008) Nanoscale evidence for microbial
mineralization of Archean stromatolites. Nature Geoscience 1, 118-121.
80
Lindner A.B., Madden R., Demarez A., Stewart E.J. and Taddei F. (2008) Asymmetric
segregation of protein aggregates is associated with cellular aging and rejuvenation. PNAS,
105, 3076-3081.
Little C.T.S., Glynn S.E.J. and Mills R.A. (2004) Four-hundred-and-ninety-million-year
record of bacteriogenic iron oxide precipitation at sea-floor hydrothermal vents.
Geomicrobiol. J., 21, 415-429.
Michel FM, Ehm L, Antao SM., Lee PL., Chupas PJ., Liu G., Strongin DR., Schoonen MAA.,
Phillips BL., Parise JB. (2007) The structure of ferrihydrite, a nanocrystalline material.
Science, 316, 1726-1729.
Miot M. and Betton J.M. (2004) Protein quality control in the bacterial periplasm. Microbial
Cell Factories, 3.
Morin, G., Ona-Nguema, G., Wang, Y., Menguy, N., Juillot, F., Proux, O., Guyot, F., Calas,
G., Brown Jr., G. E. (2008) Extended x-ray absorption fine structure analysis of arsenite and
arsenate adsorption on maghemite. Environ. Sci. Technol., 42, 2361-2366.
Nikaido H. (2003) Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67, 593-.
Paktunc D, Dutrizac J, Gertsman V (2008) Synthesis and phase transformations involving
scorodite, ferric arsenate and arsenical ferrihydrite: Implications for arsenic mobility.
Geochimica et Cosmochimica Acta. 72, 2649-2672.
Posth N.R., Konhauser K.O. and Kappler A. (2008) Microbiological Processes in BIF
Deposition. Journal of Sedimentology, in press.
Pratesi G., Cipriani C., Giuli G., Birch W.D. (2003) Santabarbaraite: a new amorphous
phosphate mineral. Eur. J. Mineral. 15, 185-192.
Rose J., Manceau A., Bottero J.Y., Masion A., Garcia F. (1996) Nucleation and growth
mechanism of Fe oxyhydroxide in the presence of PO4 ions. 1. Fe K-edge EXAFS study.
Laangmuir, 12, 6701-6707.
Rose J., Flank AM., Masion A., Bottero JY., Elmerich P. (1997) Nucleation and growth
mechanisms of Fe oxyhydroxide in the presence of PO4 ions. 2. P K-edge EXAFS study.
Langmuir, 13, 1827-1834.
Schwertmann U. and Cornell R.M. (1991) Iron oxides in the laboratory: preparation and
characterization. VCH Publishers, Germany.
Straub K.L., Benz M., Schink B. and Widdel F. (1996) Anaerobic, nitrate-dependent
microbial oxidation of ferrous iron. Appl. Environ. Microbiol., 62, 1458-1460.
81
Straub K.L. and Buchholz-Cleven B.E.E. (1998) Enumeration and detection of anaerobic
ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments. Appl.
Environ. Microbiol., 64, 4846-4856.
Thole B.T., Van der Laan G., Fabrizio M. (1994) Magnetic ground state properties and
spectral distributions. I. X-ray absorption spectra. Phys. Rev. B., 50, 11466-11473.
Van Dijk S., Dean D.D., Liu Y., Zhao Y. Chirgwin J.M., Schwartz Z. and Boyan B.D. (1998)
Purification, amino acid sequence and cDNA sequence of a novel calcium-precipitating
proteolipid involved in calcification of Corynebacterium matruchotii. Calcified Tissue
International, 62, 350-358.
Viollier E., Inglett P.W., Hunter K., Roychoudhury A.N. and Van Cappellen P. (2000) The
ferrozine method revisited: Fe(II)/Fe(III) determination in natural waters. Appl. Geochem., 15,
785-790.
Webb S. (2004) SIXPACK: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.
Physica Scripta, T115, 1011-1014.
Weber K.A., Achenbach L.A. and Coates J.D. (2006) Microorganisms pumping iron :
anaerobic microbial iron oxidation and reduction. Nature, 4, 752-764.
Widdel F., Schnell S., Heising S., Ehrenreich A., Assmus B. and Schink B. (1993) Ferrous
iron oxidation by anoxygenic phototrophic bacteria. Nature, 362, 834-836.
Wilke M., Farges F., Petit P.E., Brown Jr G.E. and Martin F. (2001) Oxidation state and
coordination of Fe in minerals: An Fe K-XANES spectroscopic study. Am. Min. 86, 714-730.
Wilks J.C. and Slonczewski J.L. (2007) pH of the cytoplasm and periplasm of Escherichia
coli: rapid measurement by green fluorescent protein fluorimetry. J. Bacteriol., 189, 5601-
5607.
Winterer, M. (1997) XAFS – A data analysis program for material science. J. Phys. IV, 7,
243-244.
Yamanaka T. and Fukomori Y. (1995) Molecular aspects of the electron transfer system
which participates in the oxidation of ferrous iron by Thiobacillus ferroxidans. FEMS
Microbiol. Rev., 17, 401-413.
82
83
Chapitre 1.B.
Transformation de la vivianite par BoFeN1
Problématique et objectifs. Une des questions centrales de la géomicrobiologie est de
déterminer par quels mécanismes les micro-organismes peuvent extraire les éléments
chimiques essentiels à leur métabolisme à partir d’une source solide : contact direct, induction
de dissolution avec génération de systèmes transporteurs, etc... Cette question se pose de
manière évidente pour comprendre le comportement de la souche dénitrifiante BoFeN1 et
plus généralement des bactéries ferro-oxydantes à pH neutre ou quasi neutre car le Fe(II) est
majoritairement immobilisé dans des phases solides à la surface de la Terre (sous forme de
carbonates, de phosphates ou encore de silicates). Après avoir étudié au Chapitre 1.A. les
processus de biominéralisation du fer par la souche dénitrifiante BoFeN1 cultivée en présence
de Fe(II) en solution, nous nous sommes donc intéressés aux transformations minéralogiques
d’une phase solide insoluble, riche en Fe(II), la vivianite Fe(II)3(PO4)2.8H2O en présence de
ce microorganisme. La vivianite est l’un des porteurs de fer les plus importants dans les
environnements continentaux anoxiques (zones profondes anoxiques des lacs, sédiments de
rivières) et constitue le principal puits de phosphore dans les lacs (Nriagu & Dell, 1974,
Manning et al., 1991, Viollier et al., 1997, Sapota et al., 2006). Son choix a été suggéré par sa
synthèse in situ dans nos milieux de culture. Ce phosphate de Fe(II) est de plus très peu
soluble (Ks=10-36
, Nriagu et al., 1972) et est donc supposé être très stable en conditions
anoxiques : il était couramment admis que cette phase ne pouvait pas être transformée par des
bactéries ferro-oxydantes anaérobies. Dans l’article qui suit, nous avons étudié les
transformations minéralogiques de la vivianite, en équilibre avec une solution saturée en
Fe(II), en particulier en suivant l’évolution du degré d’oxydation du fer au cours de la culture.
Méthodologie.
Spectroscopie d’absorption X (XAS). Les phases riches en fer que nous avons caractérisées
au cours de cette thèse sont des particules de très petites tailles, avec une taille caractéristique
de l’ordre de quelques nanomètres de diamètre. En outre, les produits de l’oxydation
microbienne du fer dans les conditions de culture que nous avons appliquées, sont très
souvent amorphes. Afin de déterminer la minéralogie de ces particules finement divisées et
souvent amorphes, nous avons eu recours à la spectroscopie d’absorption des rayons X
(XAS), utilisant un rayonnement synchrotron de haute énergie. Les spectres obtenus peuvent
84
être divisés en deux parties : la partie XANES (X-ray Absorption Near-Edge Structure)
s’étend depuis la partie avant le seuil d’absorption jusqu’à 50 eV après le seuil, tandis que la
partie EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) des spectres s’étend au-delà de 50
eV après le seuil d’absorption.
Dans le cas des éléments de transition, le spectre XANES au seuil K permet
généralement d'accéder avec une bonne précision à l'état d'oxydation, au travers de la position
du seuil ou du maximum d'absorption (As, Se) ou par l'analyse des transitions du préseuil (V,
Cr, Mn, Fe) (Galoisy et al. 2001, Petit et al., 2001, Wilke et al. 2001, Berry et al. 2003). Il est
important de rappeler que, pour utiliser ces méthodes, il est très souvent nécessaire de
disposer d'un jeu de spectres expérimentaux de composés de références bien caractérisés sur
le plan chimique et structural, et représentant le mieux possible la diversité des formes
chimiques de l'élément analysé dans l'échantillon. En effet, les spectres XANES dépendent
non seulement du degré d'oxydation mais également de la structure et de la chimie locale, à
courte (coordinance, liaison chimique, nature du ligand) et à moyenne distance (structure
moléculaire ou cristalline).
Lorsque les rayons X interagissent avec un atome, ils éjectent un ou plusieurs
électrons de cœur (ou photoélectrons) si l’énergie du faisceau incident est supérieure au seuil
d’absorption de cet atome. Il est prédit que l’éjection provoque une onde sphérique, qui
interagit à son tour avec les atomes voisins, conduisant à la propagation d’ondes
rétrodiffusées. Les interférences constructives et destructives entre ces ondes émises par les
atomes absorbeurs et rétrodiffuseurs donnent lieu à des oscillations du coefficient
d’absorption. Ces oscillations fournissent la structure fine de la partie EXAFS des spectres
d’absorption des rayons X.
Une relation théorique peut être utilisée pour modéliser le signal EXAFS χ(k):
( ) ( )∑ −
−= )(2sin.2exp.
)(
2exp.
)()(
22
2
2
0kkRk
k
R
kR
SkANk asasas
as
as
ss ϕσλ
χ (Eqn. 1)
Où : 2
0 )(2
h
EEmk e −
=
est le vecteur d’onde, avec me la masse d’un electron,
Eo l’énergie du seuil
h la constante de Planck.
Les paramètres de l’Eqn. 1 décrivent la structure interne de l’échantillon (Ns, Ras, σas)
ou sont reliés à l’état électronique des atomes présents (As, So2, ϕas, λ).
85
• NS et Ras sont respectivement le nombre d’atomes rétrodiffuseurs et la distance
absorbeur-diffuseur. En première approximation, NS est lié à l’amplitude du signal
EXAFS et Ras à la fréquence des oscillations. De plus, comme l’amplitude décroît en
1/R², l’EXAFS fournit seulement des informations pour les atomes les plus proches de
l’absorbeur, généralement jusqu’à une distance de 5 Å et au maximum 10 Å dans les
matériaux cristallisés très bien ordonnés.
• ϕas et As fournissent les informations nécessaires pour identifier les différents atomes.
ϕas représente le déplacement de phase dû aux variations de potentiel subies par l’onde
sphérique (passage par les potentiels des atomes absorbeurs et rétrodiffuseurs). As
correspond à la dépendance en énergie de l’amplitude de la rétrodiffusion du
photoélectron. Cependant, ces deux facteurs ne sont pas fortement contraints par
l’identité des atomes présents. On peut par exemple facilement distinguer O de S, mais
pas O de N, ni C de F par exemple.
• Le terme So2 explique les processus de perte inélastique. Le premier terme exponentiel
est un facteur d’atténuation, lié au libre parcours moyen du photoélectron (λ(k)). Le
second terme exponentiel est le facteur de Debye-Waller. C’est également un terme
d’atténuation qui permet d’expliquer les interférences destructives entre les ondes
rétrodiffusées des différents atomes voisins. Théoriquement, le facteur de Debye-
Waller est en fait limité au terme σas et explique les effets d’agitation thermique.
La contribution de toutes les paires d’atomes absorbeur-rétrodiffuseur crée les oscillations
observées. Ces termes sont donc sommés pour l’ensemble des atomes. De façon pratique, les
différents atomes sont regroupés en couches, correspondants aux atomes absorbeurs
identiques placés à des distances de l’atome central approximativement similaires.
Afin de préserver le degré d’oxydation du fer, outre les précautions prises lors de la
préparation et du transport des échantillons (voir supra), toutes les analyses XAS ont été
effectuées à basse température (10 K) (e.g. Wang et al., 2008). Au cours de ce travail, les
données XANES et EXAFS au seuil K du fer ont été enregistrées sur divers synchrotrons
(SSRL, ESRF, SOLEIL), en général en transmission, sauf pour certains échantillons dont
nous disposions en très faibles quantités qui ont été enregistrés en fluorescence. Les détails
concernant les lignes de lumière et les conditions d’expériences sont reportés dans les articles
correspondants. Les spectres EXAFS ont été extraits et normalisés selon les procédures
classiques en utilisant le programme de Winterer (1997). Les données EXAFS non filtrées ont
86
été interprétées en utilisant le formule en ondes planes de l’EXAFS (Eqn. 1) à l’aide de
fonctions de phase et d’amplitude calculées selon une formulation en ondes courbes (FEFF8,
Ankudinov et al., 1998).
Dans le cadre de notre étude, la spectroscopie XANES a été employée pour déterminer
le redox global moyen des échantillons, l’analyse semi-quantitative du redox à l’échelle locale
étant réalisée en STXM. De plus, l’EXAFS nous a permis de déterminer la nature des phases
amorphes présentes dans nos échantillons, nous permettant ensuite d’utiliser des références
appropriées pour la décomposition des spectres XANES obtenus en STXM.
Figure 1B-1. Spectroscopie d’Absorption des Rayons X au seuil K du Fe (exemple de la
vivianite). A : Le spectre présente un seuil d’absorption dont l’énergie dépend de la nature de
l’élément absorbeur. Ce spectre est divisé en deux parties : le XANES qui donne des
informations sur la valence de l’atome central (Fe) et sur la géométrie et la nature des atomes
l’entourant ; l’EXAFS fournit des informations précises sur l’ordre local autour des atomes de
fer. B : Les prépics du fer fournissent une information semi-quantitative sur le ratio
Fe(II)/Fe(III). C et D : Le χ(k) (ici pondéré par un facteur k3 pour amplifier les oscillations à
grands k) et la transformée de Fourier obtenus par traitement de la partie EXAFS des spectres
7000 7200 7400 7600 7800 8000
Ab
so
rban
ce
no
rmalis
ée
Energie, eV
XANES EXAFS
Seuild'absorption
3 4 5 6 7 8
k3χ
(χ
(χ
(χ
(k)) ))
k, Å-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
FT
Mag
nit
ud
e
R(Å)
A
B
C
D
7000 7200 7400 7600 7800 8000
Ab
so
rban
ce
no
rmalis
ée
Energie, eV
XANES EXAFS
Seuild'absorption
3 4 5 6 7 8
k3χ
(χ
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(χ
(k)) ))
k, Å-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
FT
Mag
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ud
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A
B
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7000 7200 7400 7600 7800 8000
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Energie, eV
XANES EXAFS
Seuild'absorption
3 4 5 6 7 8
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k, Å-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
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7000 7200 7400 7600 7800 8000
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Energie, eV
XANES EXAFS
Seuild'absorption
3 4 5 6 7 8
k3χ
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k, Å-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
FT
Mag
nit
ud
e
R(Å)
A
B
C
D
87
permettent de déterminer la nature et l’agencement des atomes voisins du fer dans
l’échantillon.
Principaux résultats et perspectives. L’étude que nous avons menée sur des cultures de
BoFeN1 en présence de vivianite révèle la transformation progressive et totale de ce
phosphate de Fe(II) cristallisé en un phosphate de Fe(III) amorphe. Cette transformation passe
par la précipitation d’une phase intermédiaire verdâtre ayant la composition d’un phosphate
de Fe(II)-Fe(III) amorphe, spécifique de l’oxydation de la vivianite. Cette phase se transforme
ensuite progressivement en une phase rouille constituée de phosphate de Fe(III), présentant un
rapport Fe/P de 0.36 environ après 2 mois d’incubation.
Par ailleurs, les analyses STXM indiquent que le taux d’oxydation du fer est plus élevé
au contact des bactéries que dans les minéraux extracellulaires issus de la transformation de la
vivianite initiale. Ainsi, au cours de la culture, le fer présent à distance des bactéries est
toujours moins oxydé que le fer présent au contact direct des cellules. Ceci suggère que le
Fe(II) soluble est d’abord oxydé au niveau des bactéries, ce qui induit une sous-saturation du
milieu vis-à-vis de la vivianite, qui commence à se dissoudre et à exporter plus de Fe(II) vers
les cellules. En retour, soit le Fe(III) directement produit par les cellules, soit un oxydant, est
transporté vers les minéraux extracellulaires issus de la transformation de la vivianite, qui
ainsi s’oxydent progressivement.
Cette oxydation du fer, y compris à distance des microorganismes, est catalysée par les
bactéries, de façon directe (export de Fe(III) sous forme dissoute, complexée à des molécules
organiques ou sous forme de colloïdes) ou indirecte (export d’oxydants). Dans le but de
rechercher un oxydant potentiel du Fe(II) dans ce système, nous avons débuté des dosages des
espèces azotées (nitrates, nitrites) en collaboration avec le laboratoire Sisyphe (Anniet
Lavermann, Université Paris 6) dans les cultures de BoFeN1 en présence de vivianite ou de
Fe(II) dissous et dans des témoins abiotiques (vivianite + nitrites). En effet, si le rôle des
nitrates dans l’oxydation du Fe(II) peut être écarté (car le témoin abiotique vivianite + nitrates
ne s’oxyde pas dans le temps de l’expérience), le rôle potentiel des nitrites doit en revanche
être évalué. Les nitrites sont produits comme intermédiaires de la réduction des nitrates au
cours de l’oxydation du Fe(II) par BoFeN1 (Kappler et al., 2005a) et s’accumulent à des
concentrations de l’ordre de 1.5 mM dans le milieu de culture. Kappler et al. (2005a) ont
montré que le taux d’oxydation du Fe(II) dissous par les bactéries était nettement supérieur à
celui de l’oxydation abiotique du Fe(II) par les nitrites (d’un facteur 7 environ). Dans notre
88
système, nous observons que l’oxydation du Fe(II) sur les précipités extracellulaires est 3 à 5
fois moins rapide que sur les bactéries. Ceci suggère que l’oxydation du fer qui précipite au
contact des bactéries est catalysée enzymatiquement par les cellules, tandis que l’oxydation
extracellulaire du fer pourrait résulter de la réaction chimique du Fe(II) avec des nitrites. Les
dosages complémentaires en cours permettront très probablement d’élucider ce point.
Dans l’hypothèse d’un export de Fe(III) depuis les cellules vers le milieu
extracellulaire, nos résultats suggèrent qu’une fraction colloïdale de phosphates de fer pourrait
intervenir. Une étude plus approfondie de cette fraction colloïdale pourrait apporter des
éléments importants dans la compréhension générale de la mobilité du Fe(III) à pH neutre
dans les systèmes naturels. En outre, dans les systèmes où l’oxydation du fer a été incomplète,
les hétérogénéités de degré d’oxydation du fer mises en évidence à l’échelle sub-
micrométrique pourraient constituer l’un des marqueurs permettant de rechercher ce type de
métabolisme dans des environnements actuels et anciens.
89
Transformation of vivianite by anaerobic iron-oxidizing bacteria
Short running title: Oxidation of vivianite by iron-oxidizing bacteria
Jennyfer Miot (1), Karim Benzerara (1), Guillaume Morin (1), Sylvain Bernard (2), Olivier
Beyssac (2), Eric Larquet (1), Georges Ona-Nguema (1), Andreas Kappler (3), François
Guyot (1).
(1) Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,
Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.
140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.
(2) Laboratoire de Géologie, Ecole normale supérieure, CNRS, 24 rue Lhomond, 75005
Paris, France.
(3) Geomicrobiology Center for Applied Geoscience (ZAG), University of Tuebingen,
Sigwartstrasse 10, 72076 Tuebingen, Germany.
*Corresponding author:
[email protected] ; Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785
To be submitted to Geobiology
90
ABSTRACT
In phosphate-rich environments, vivianite (FeII
3(PO4)2.8H2O) is an important sink for
dissolved Fe(II) and is considered as a very stable mineral due to its low solubility at neutral
pH. In the present study, we report the mineralogical transformations of vivianite in cultures
of the nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria strain BoFeN1. Vivianite was first transformed
into a greenish phase consisting mostly of an amorphous mixed valence Fe-phosphate. This
precipitate became progressively orange and the final product of iron oxidation consisted of
an amorphous Fe(III)-phosphate (in the form of FeIII
14(PO4)5(OH)27). The sub-micrometer
analysis by Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) of the iron redox state in
samples collected at different stages of the culture indicated that iron was progressively
oxidized at the contact of the bacteria and at distance of the cells in extracellular minerals.
Iron oxidation in the extracellular minerals was delayed by a few days compared to cell-
associated Fe, leading to local heterogeneities of redox within the samples. On the other hand,
at each time point, the variability of Fe redox state among the extracellular minerals was very
low. These results suggest that vivianite transformation proceeds through a dissolution-
precipitation pathway. Vivianite dissolution leads to the release of Fe(II) in solution, followed
by precipitation of a mixed valence Fe(II)-Fe(III) phosphate which progressively equilibrates
with the solution until Fe(II) is completely oxidized. Processes leading to the export of Fe(III)
or of an oxidant from oxidation sites on cells to extracellular minerals are discussed including
the possible role of colloids observed by cryo-transmission electron microscopy in the culture
medium and the possible role of nitrites.
91
INTRODUCTION
A huge proportion of ferrous iron found at the Earth surface is immobilized in solid
phases. Basalts represent a significant surface reservoir, in which iron is incorporated in
diverse minerals, including sulphur minerals such as pyrite (FeS2) or ferrous sulphide (FeS),
titanomagnetite and Fe-silicates (Schippers & Joergensen, 2002, Edwards et al., 2003). At
distance from the ridge, Fe(II) is progressively oxidized into Fe(III) through abiotic and
possibly through microbial processes (e.g. Schippers & Joergensen, 2002). An increasing
number of studies have attempted to assess the capabilities of microbes such as iron-oxidizing
bacteria to oxidize solid-phase Fe(II) and to use it as source of energy. However, the
mechanisms by which microbes uptake Fe(II) from solid phases are still poorly understood,
especially under pH conditions close to neutrality.
A few microorganisms are known to oxidize soluble Fe(II) at neutral pH under strictly
anoxic conditions (e.g. Widdel et al., 1993; Ehrenreich and Widdel, 1994, Heising and
Schink, 1998): specifically, some bacteria use nitrate as an electron acceptor for the oxidation
of Fe(II) (Hafenbradl et al., 1996; Straub et al., 1996; Benz et al., 1998, Straub and Buchholz-
Cleven, 1998, Kappler et al., 2005a), following the reaction (Eqn. 1):
2Fe2+
+ 5H2O + NO3- = 2Fe(OH)3 + 4H
+ + NO2
- (Eqn. 1)
wherein the by-product of the soluble Fe(II) oxidation is symbolized as Fe(III)-hydroxides
Fe(OH)3 for simplicity. While most of the studies on Fe-oxidizing bacteria have used Fe(II)
under a soluble form, it has been shown that these bacteria can also enhance the dissolution
and oxidation of various solid-phase Fe(II) compounds, such as siderite (FeCO3), ferrous
sulphide (FeS) or magnetite (Fe3O4) (Weber et al., 2001, Schippers & Joergensen, 2002,
Kappler & Newman, 2004). Such metabolisms might thus play a crucial role in the
weathering of Fe(II)-bearing minerals and consequently impact the geochemical cycle of iron
and heavy metals in neutral-pH anoxic environments, such as river sediments, lakes or deep-
sea environments (e.g. Edwards et al., 2003).
In non marine environments and at high phosphate concentration, Fe(II) can be in the
form of amorphous or crystalline ferrous phosphate. In particular, vivianite (FeII
3(PO4)2.8H2O)
is considered as one of the most important sink of P in lakes (Nriagu & Dell, 1974, Manning
et al., 1991, Viollier et al., 1997, Sapota et al., 2006). This mineral, which is very stable
(KS=10-36
; Nriagu et al., 1972) controls partly the geochemical cycles of Fe and P and thereby
the trophic status of lakes. Illustrating that idea, Fe(II,III) salts additions can be used to
efficiently reduce P concentrations in eutrophic environments (see e.g. Frossard et al., 1996).
92
Moreover, phosphate amendments are also commonly used for the remediation of polluted
environments: natural phosphate rocks (NPR) additions in acid mine drainages lead to the
immobilization of heavy metals as secondary metal phosphate precipitates within mining
wastes (Ueshima et al., 2004). In the same way, vivianite nanoparticles have been shown to be
efficient in immobilizing heavy metals in the environment (e.g. Liu et al., 2007). Both
treatments influence the precipitation or dissolution of iron-phosphate minerals, which depend
on redox conditions, pH, availability of dissolved elements (in particular P and Fe) and
organic matter content (Nriagu & Dell, 1974, Manning et al., 1991). All these parameters can
be affected by microbial activities, in particular by anaerobic iron bio-oxidation. However,
due to its low solubility at neutral pH (Nriagu et al., 1972), vivianite is supposed to remain
very stable under anoxic conditions and it is usually assessed that it can not be transformed by
anaerobic iron-oxidizing bacteria.
In this study, the nitrate-dependent iron-oxidizing bacteria strain BoFeN1 (Kappler et
al., 2005a) was cultured in the presence of vivianite. This mineral was initially at equilibrium
with a saturated solution and we studied the displacement of this equilibrium driven by iron
bio-oxidation. The resulting mineralogical transformations of vivianite and the oxidation of
Fe(II)-minerals were followed along the time course of a batch culture down to the
nanometer-scale, using a combination of Transmission Electron Microscopy (TEM) and
synchrotron-based Scanning Transmission X-Ray Microscopy (STXM). We evidence
significant mineralogical transformations of vivianite as well as a progressive oxidation of
dissolved and solid Fe(II) driven by bacteria.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strain and growth conditions
The nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1, isolated from Lake Constance
littoral sediments (Kappler et al., 2005a), was cultivated in freshwater mineral medium
prepared after Ehrenreich & Widdel (1994), containing 4.4 mM phosphate. BoFeN1 was
grown in this medium supplemented with 5 mM acetate (provided as sodium acetate) and 10
mM nitrate (provided as sodium nitrate) in the presence or absence of Fe(II) (provided as
FeCl2). The addition of Fe(II) at a total concentration of 10 mM led to the precipitation of a
white Fe-rich precipitate identified as vivianite and resulting in a dissolved Fe(II)
concentration of ~ 3 mM. For each culture, 25 mL of medium were transferred into a 58 mL
93
serum bottle that was flushed with N2/CO2 (80% / 20%), closed with a butyl rubber stopper
and crimped. BoFeN1 was inoculated at 10% from an acetate-nitrate-grown culture (culture
without iron). Cultures were incubated at 30°C. For X-ray Absorption Spectroscopy (XAS),
X-ray Diffraction (XRD) and Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) analyses,
samples of the same culture were collected at several time steps in an O2-free glove-box (pO2
< 50 ppm).
Analytical methods
Bacterial growth was followed by measuring the total content of soluble proteins using
the Bradford assay (Bradford, 1976). 1 mL of culture was mixed with 840 µL of a solution of
oxalic acid (pH 3, 0.2M) in order to dissolve iron-bearing minerals and with 160 µL of 6.1 M
trichloroacetic acid to precipitate proteins. After centrifugation (11000 g, 30 min) and
removal of the supernatant, proteins were dissolved in 1mL of 0.1 M NaOH at 60°C for 6
min. The absorbance of the samples was measured at 595 nm after reaction with the Bradford
reagent (BioRad, microassay).
In order to measure the concentration of dissolved iron, 100 µL of a culture suspension
or the abiotic control were sampled with a syringe and filtered through 0.22 µm Millipore
filter in an anoxic glove-box. The dissolved Fe(II) content of the filtrate was determined by
the ferrozine assay (Viollier et al., 2000) after dilution with 900 µL of 1 M HCl.
The composition of the culture medium was additionally simulated using the JChess
software taking into account the complete chemistry of the solution, including pH and gases
partial pressures. These simulations provided the theoretical concentrations of the dissolved
compounds and the nature of the solid phases precipitating in the medium at the
thermodynamic equilibrium.
Synthesis of model compounds
The Fe redox state of the samples was determined at the submicrometer-scale by using
STXM at the Fe L2,3-edges. The Fe(II) and Fe(III) reference end-members used for this study
were pure Fe(II)- and Fe(III)-phosphates. Both were synthesized under anoxic conditions.
Fe(II)-phosphate was obtained by adding 10 mM Fe(II) (as FeCl2), 5 mM acetate and 10 mM
nitrate to the growth medium, which led to the precipitation of a whitish phase identified as
pure vivianite by XRD. X-ray amorphous Fe(III)-phosphate was obtained by adding 10 mM
Fe(III) (as FeCl3), 5 mM acetate and 10 mM nitrate to the growth medium. Both precipitates
94
were rinsed twice with degassed distilled water and dried under vacuum inside an anoxic
glove-box.
Mineral characterization by X-ray diffraction
The mineralogical compositions of the solid phases collected from 4-day, 16-day and
1-year old cultures, as well as of the Fe(II)- and Fe(III)-phosphate references were determined
by XRD. The whole sample preparation procedure described hereafter was carried out in an
anoxic glove-box in order to guarantee strict anoxic conditions for XRD analyses. The
cultures were centrifuged (5000 g, 10 min) and the solid phases were systematically rinsed
twice using degassed distilled water and vacuum-dried. The resulting powder was ground in
an agate mortar and dispensed in a borosilicate capillary that was sealed with glue before
analysis in the diffractometer. XRD measurements were performed with CoKa radiation on a
Panalytical® X’Pert Pro MPD diffractometer mounted in Debye-Scherrer configuration using
an elliptical mirror to obtain a high flux parallel incident beam and an X'Celerator®
detector to
collect the diffracted beam. Data were recorded in the continuous-scan mode within the 5 -
90° 2θ range with a step of 0.03°, and a counting time of 12 to 24 h per sample.
Bulk XAS analyses
XAS data were measured on the products of Fe(II) bio-oxidation by BoFeN1 at the Fe
K-edge. Samples were transferred from the glove-box into a liquid nitrogen bath and then into
the cryostat, where they were placed under He atmosphere. This procedure preserved anoxic
conditions during sample transfer and analysis. The data were recorded on beamline 10-2 at
the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL) using a Si(220) double-crystal
monochromator. Due to the low amount of sample available, data were collected on samples
mixed with cellulose, in fluorescence detection mode using a 13-element Ge-array detector
and a 3 ∆µ Mn filter to attenuate elastic scattering. Energy was calibrated by using a double-
transmission setup; the first inflection point of the Fe metal foil K-edge was set at 7111.1 eV
(Wilke et al. 2001). In order to limit Fe(III) reduction under the X-ray beam and to enhance
EXAFS signal on our nano-sized and poorly-ordered mineral phases, all data were recorded at
10-15 K using a modified Oxford®
liquid He cryostat. Details on the experimental setup and
on data acquisition for the reference samples are given in Supporting Information.
X-ray absorption spectra were averaged using the SixPack software (Webb, 2004).
EXAFS data were extracted using the XAFS program (Winterer, 1997) and were fit following
95
classical procedures, as detailed previously in Miot et al., submitted (see Supporting
Information).
Analytical transmission electron microscopy
Two types of samples were prepared for TEM analyses. For conventional
Transmission Electron Microscopy (TEM) and Energy Dispersive X-ray Spectrometry
(EDXS) measurements, a drop of the culture medium was deposited and air-dried on a
carbon-coated 200-mesh copper grid after two rinses in degassed distilled water within an
anoxic glove-box. In that case, the redox state of iron was not preserved and TEM
observations were thus not used for that purpose.
For cryo-electron microscopy observations, grids covered with holey carbon films were
prepared and vitrified by flash freezing in liquid ethane (Adrian et al., 1984). Images were
recorded under low dose conditions (10 electrons per Ų) on a GATAN Ultrascan 1000 CCD
Camera.
Observations and EDXS analyses were performed with a JEOL2100F microscope operating at
200kV equipped with an Si(Li) diode. P/Fe atomic ratios were estimated from the EDXS
spectra using the IDFix software.
Scanning Transmission X-ray Microscopy
Sample preparation
We kept the samples under an anoxic atmosphere from preparation to transfer into the
microscope, following the method detailed in Miot et al., submitted. The entire preparation
was performed in an anoxic glove-box. One mL of a suspension of BoFeN1 culture (or of
reference compounds) was sampled at different stages of each culture (30 minutes to 6 days,
and 1 year). Each sample was rinsed twice in degassed distilled water. 0.3 µL of each sample
was sandwiched in between two silicon nitride membranes (Norcada Inc., Canada) that were
sealed under the anoxic atmosphere using epoxy. Using this protocol, we verified that we
could preserve the original redox state of iron of vivianite.
STXM experiments
STXM observations at the Fe L2,3-edges were performed on the PolluX beamline at the
Swiss Light Source (SLS, Villigen). Additional information on the PolluX beamline can be
96
found in Bernard et al. (2007). This beamline has an energy resolving power E/∆E > 3000.
Energy calibration was achieved using the major absorption peak of hematite at 708.7 eV for
the Fe L3-edge.
Data processing
Image stacks were acquired at the Fe L2,3-edges. They were performed by scanning the
sample in the x-y direction at each energy increment over the energy range of interest.
Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e. changes of the Fe redox
state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-edge with increasing
dwell times up to several tens of ms (Fig.SI-1). However, no significant changes were
observed for typical dwell times used during analyses of the samples (i.e. around 0.8 ms per
energy- and image-point). The aXis2000 software-package (Hitchcock, 2001) was used for
processing image stacks and XANES spectra. Images were recorded on transmission scale
and converted into optical density (OD) according to Equation (3).
OD = -ln(I/I0) (Eqn. 3)
wherein I represents the measured photon intensity at the point of interest and I0 represents the
intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150
Fe(I
II)/
Fe t
ota
l
dt, ms
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
0 10 20 30 40 50 60 70
Fe
(III)/
Fe t
ota
l
dt, ms
Figure SI-1. Beam radiation damage on reference Fe(II)-phosphate (a) and on Fe(III)-
encrusted bacteria (b). Evolution of the Fe(III)/Fe(total) ratio as function of dwell time,
estimated by fitting Fe L2,3-edges XANES spectra recorded on reference Fe(II)-phosphate
and Fe(III)-encrusted bacteria respectively.
Quantitative Fe-speciation maps were calculated from the image stacks by singular
value decomposition using the stack-fit routine in aXis2000. The algorithm fits the spectra of
a b
97
each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference spectra
(Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model compounds) plus a constant, accounting for the
absorption background. Composite maps were obtained by overlaying on the same image the
Fe(II) (blue) and the Fe(III) (red) maps using a common intensity scale for both colour
channels.
XANES spectra were extracted from the stacks on regions of interest. We normalized
the area below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the absorbance of the compounds
containing mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5 correction factor to take into
account the difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+
and Fe3+
ions, neglecting the
variation of radial integrals (Thole et al., 1994). We fit the normalized spectra with linear
combinations of the normalized reference spectra of the Fe(II)-phosphate model compound
(vivianite) and of the 1-year old BoFeN1 sample standing for a Fe(III)-reference, applying the
CGO (Conjugate Gradient Optimization method) curve fit routine in Axis2000. Fit results
allowed estimating the Fe(III)/Fe(total) content of regions of interest. Standard deviations
calculated from the deviation between the fit and the data were systematically less than 1%.
Moreover, Fe(II) and Fe(III) maps were used to evaluate the variability of the Fe(III)/Fe(total)
ratio within each sample (i.e. at each stage of the culture): the Fe(II)-map was multiplied by
the 4/5 correction factor (see above) and added to the Fe(III)-map to obtain a Fe(total) map.
The Fe(III)-map was subsequently divided by the Fe(total) map. An histogram of the resulting
map was plotted, giving the number of pixels as a function of Fe(III)/Fe(total) ratio. These
histograms allowed discriminating the different populations of Fe according to their redox
state within the image. The mean Fe(III)/Fe(total) ratios were calculated as the maxima of
each peak in the histogram and the variability as the width at mid height of the peak.
RESULTS
XRD and XAS study of mineralogical transformations of vivianite in BoFeN1 cultures
Addition of 10 mM Fe(II) in the culture medium before inoculation of BoFeN1 led to the
instant precipitation of a white phase (Fig. 1a) characterized by XRD as vivianite (Fig. 2).
This phase was at the equilibrium with the solution that contained dissolved Fe(II) at around 3
mM, consistently with thermodynamic calculations taking into account the medium culture
composition and the solubility of vivianite ([Fe2+
]eq=3.4 mM, as indicated by JChess
98
simulations). The concentration of soluble Fe(II) remained constant over the period of the
experiment in the abiotic control, whereas it dropped to undetectable levels within 5 days in
BoFeN1 cultures (Fig. 1b). Fe(II) consumption (oxidation) was related to bacterial growth,
with the stationary phase starting after 3 days of culture. Moreover, the progressive oxidation
of dissolved Fe(II) was associated with a macroscopic change of the colour of the precipitate
from white initially (vivianite) to green after 4 days of culture and finally orange after 16 days
(Fig. 1a), whereas no change in colour was observed in abiotic controls, in which the
precipitate remained white.
0
10
20
30
40
50
60
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 50 100 150 200
To
tal
pro
tein
co
nce
ntr
ati
on
, µµ µµg
.mL
-1 Dis
so
lved
Fe
(II) co
nce
ntra
tion
, mM
Time, hours
Figure 1. Growth of BoFeN1 in the presence of vivianite. a: Evolution of the colour of the
precipitates forming in the culture medium, before inoculation (Day 0) and after 4 and 16
days of culture. b: Growth curve of BoFeN1 and dissolved Fe(II) concentration in the
presence of acetate (5 mM), nitrate (10 mM), dissolved ferrous iron and vivianite over a
period of 7 days. (■): Total protein concentration, (○): Dissolved Fe(II) concentration in the
BoFeN1 culture, (X): Dissolved Fe(II) concentration in the abiotic control.
Day 0 4 days 16 days
b
a
99
XRD analyses were performed on the successive phases formed in these cultures in order to
better understand this change in colour of the precipitates. These analyses revealed the
progressive transformation of crystalline vivianite into an amorphous compound
(characterized by XRD after 1 year of incubation, Fig. 2). The intermediate greenish phase (4-
day old precipitate) was mostly amorphous but still contained a small amount of vivianite and
possibly a Fe(III)-oxyhydroxynitrate phase (FeO(NO3)x(OH)1-x) previously described by
Schwertmann et al. (1996). All these different amorphous phases were further characterized
using XAS at the Fe K-edge (Fig. 3 and Table 1). Absorption maxima in the pre-edges of the
4-day old BoFeN1 sample were observed at 7111.8 eV and 7113.7 eV suggesting the
coexistence of Fe(II) and Fe(III) oxidation states after 4 days of culture (Fig. 3, Wilke et al.,
2001). In the 16-day old and the 1-year old samples, the position of the pre-edge at 7113.7 eV
indicated the transformation into a mostly Fe(III) mineral, consistently with the shift of 2 eV
in the absorption maximum of the XANES spectrum compared to the vivianite model
compound. Best fits of the EXAFS data of the BoFeN1 samples are compared to those of the
end-members amorphous Fe(III)-phosphate and vivianite in Fig. 3c and 3d. Corresponding
parameters are listed in Table 1. The first-neighbour shell in EXAFS data of the 4-day and the
1-year old BoFeN1 cultures is fitted with oxygen ligands at 2.08±0.05 Å and 1.98±0.05 Å
respectively. The second-neighbour shell of these two samples is fitted with phosphorus
ligands at 3.32±0.05 Å and 3.23±0.05 Å respectively. These distances are consistent with
those measured in vivianite and in the amorphous Fe(III)-phosphate, respectively (Table 1).
The 16-day old sample is fit with intermediate distances. All these results suggest the
progressive transformation of vivianite into an amorphous Fe(III)-phosphate.
100
10 20 30 40 50 60 70 80
Co
un
ts,
a.u
.
Degrees 2θθθθ (Co Kαααα)
BoFeN1, 4 days
Vivianite
Fe(III)-phosphate
Viv
(6
.60 A
)
Fen
(2
.55 A
)
Fe
n (
1.5
1 A
)
BoFeN1, 1 year
Figure 2. X-Ray diffractograms of precipitates collected from BoFeN1 cultures after 4 days
and 1 year and of reference Fe(II)- and Fe(III)-phosphate. All peaks of the reference Fe(II)-
phosphate are explained by vivianite. Viv: vivianite, Fen: Fe(III)-oxyhydroxynitrate
(FeO(NO3)x(OH)1-x).
Sample N (± 0.3)
Bond R (Å) (± 0.05)
σσσσ (Å)
(± 0.02)
E0 (eV) (± 3)
χχχχ2
Fe(III)-phosphate 3.3 Fe-O 1.98 0.06 8 15 1.0 Fe-P 3.24 0.06 -
0.5 Fe-Fe 3.62 - -
BoFeN1, 1 year 4.0 Fe-O 1.98 0.09 2 5 1.7 Fe-P 3.23 0.08 - 0.2 Fe-Fe 3.57 - -
BoFeN1, 16 days 3.6 Fe-O 1.98 0.09 6 3 1.6 Fe-P 3.29 0.08 - 0.2 Fe-Fe 3.60 - -
BoFeN1, 4 days 3.5 Fe-O 2.08 0.09 10 52 1.0 Fe-P 3.32 0.05 - 0.2 Fe-Fe 3.66 - - 0.5 Fe-Fe 4.81 - -
Vivianite 3.8 Fe-O 2.10 0.10 10 7 1.5 Fe-P 3.30 0.08 -
0.4 Fe-Fe 2.96* - -
1.9 Fe-O 3.97* - - 1.7 Fe-Fe 4.70* - - 2.0 Fe-Fe 5.25* - - 4.3 Fe-Fe 6.29 - -
(*) fixed at values expected from the structure of vivianite (Fedji et al., 1980).
(-) kept equal to the free parameter placed above in the table.
TABLE 1. Fitting results for Fe K-edge EXAFS data of 4-day old, 16-day old and 1-year old
BoFeN1 cultures and of the 2-line ferrihydrite, Fe(II)- and Fe(III)-phosphate model
compounds. Coordination number (N), interatomic distance (R), Debye-Waller parameter (σ)
and energy offset (E0). Fit quality was estimated by a reduced χ2 parameter (see text).
101
7108 7110 7112 7114 7116
No
rma
lize
d a
bs
orb
an
ce
, a
.u.
Energy, eV
Vivianite
Fe(III)-phosphate
BoFeN116 days
BoFeN11 year
BoFeN14 days
7113.7 eV
7111.8 eV
7100 7120 7140 7160 7180 7200
No
rma
lized
ab
so
rba
nc
eEnergy, eV
7132 eV
7127.5 eV
BoFeN11 year
2
Fe(III)-phosphate
BoFeN116 days
BoFeN14 days
Vivianite
3 4 5 6 7 8 9 10 11
k3χχ χχ
(k)
k (Å-1
)
10Fe(III)-phosphate
BoFeN1 - 16 days
BoFeN1 - 4 days
Vivianite
BoFeN1 - 1 year
0 1 2 3 4 5 6 7
FT
mag
nit
ud
e
R + ý (Å)
10
Fe(III)-phosphate
BoFeN1 - 16 days
BoFeN1 - 4 days
Vivianite
BoFeN1 - 1 year
Figure 3. X-ray Absorption Spectroscopy measurements on the bulk cultures of BoFeN1
after 4 days, 16 days and 1 year. a and b: pre-edges and whole XANES spectra at the Fe
K−edge of 4-day, 16-day and 1-year old BoFeN1 cultures and of Fe(III)-phosphate and
vivianite model compounds. c: unfiltered k3χ(k) data compared with the spectra of the model
compounds Fe(III)-phosphate and vivianite. d: corresponding Fourier Transforms. Dashed
lines show the data and solid lines the best fits of the k3χ(k) data (see Table 1).
b
c d
a
102
TEM study of mineralogical transformations of vivianite in BoFeN1 cultures
To better determine the spatial relationships existing between the bacterial cells and
extracellular vivianite, TEM observations were performed at the same successive stages of the
culture. In BoFeN1 cultures, we observed the coexistence of extracellular and periplasmic
iron-rich precipitates. Both had a composition of Fe-phosphates. Periplasmic precipitates were
similar to those previously described in BoFeN1 cultures grown in the presence of soluble
Fe(II) only (Figure SI-2, Miot et al., submitted). The morphology and chemical composition
of the extracellular minerals were investigated by TEM, Cryo-TEM and EDXS (Fig. 4). In
abiotic controls, we observed vivianite platelets exhibiting a P/Fe atomic ratio estimated to
0.75±0.07 by EDXS, which is consistent with the stoechiometry of vivianite (Fe3(PO4)2, 8
H2O, theoretical P/Fe=0.67). In the presence of bacteria, the P/Fe ratio of the extracellular
minerals dropped to 0.55±0.12 after 2 days and to 0.36±0.15 after 2 months. In addition, we
observed that these extracellular minerals kept a platelet morphology. These TEM
observations are thus consistent with XRD and XAS analyses, suggesting the progressive
transformation of vivianite platelets into an amorphous Fe(III)-phosphate phase exhibiting a
P/Fe ratio of 0.36±0.15.
Figure SI-2: STEM images of BoFeN1 cells grown in the presence of vivianite (V). (A):
BoFeN1 cell with encrusted periplasm (p). (B): BoFeN1 cells with membrane bound globules
(g).
500 nm
V
p
g
A
B
500 nm
V
p
g
500 nm500 nm
V
p
g
A
B
103
Figure 4. Electron microscopic study of Fe-rich minerals forming in BoFeN1 cultures. a: TEM image of vivianite precipitates forming in the non-inoculated culture medium. b: TEM
image of iron-phosphate minerals in a 2-day old culture of BoFeN1. The arrow points colloids
at the surface of the platelets. c: Cryo-TEM image of colloids in a 15-day old BoFeN1
culture. d: XEDS spectra measured on vivianite (abiotic control) and on extracellular
precipitates and colloids (spectrum multiplied by a factor 4) from a BoFeN1 culture. These
data highlight the presence of colloids having a composition of Fe-phosphate in BoFeN1
cultures.
Moreover, after 2 days of culture, colloidal particles (diameter < 10 nm) were observed at the
surface of the platelets (Fig. 4b). This observation is consistent with chemical measurements
of iron concentration in filtered culture medium. Indeed, iron concentrations were
systematically higher in 0.2-µm filtrates than in 10-kDa filtrates of the abiotic control as well
as the BoFeN1 culture supernatants. These measurements indicate that Fe-bearing particles of
a diameter < 200 nm (colloids) were present in solution. This < 200 nm mineral fraction was
imaged by cryo-TEM on a BoFeN1 culture frozen in a 100-nm thick film of amorphous ice
Control 2 days
50 nm 50 nm
100 nm 2.4 3.2 4 4.8 5.6 6.4 7.2
Co
un
ts,
a.u
.
Energy, keV
Colloids
Precipitates
Vivianite
Fe Kαααα
Fe KββββK Kαααα
P Kαααα
(x4)
A B
C D
104
(Fig. 4c). This preparation retained only the <100 nm fraction of the culture. After exposure to
the electron beam and subsequent sublimation of the vitreous ice, we were able to detect
numerous colloids in the culture medium, with a diameter of 5.9±1.7 nm. Direct EDXS
analyses of these colloids under cryo-conditions revealed that they also had a composition of
iron phosphates (Fig. 4d). All these results indicate that in parallel to the transformation of the
vivianite platelet, there is a production of iron-phosphate colloids in BoFeN1 cultures.
Fe oxidation at the nanometer-scale in BoFeN1 cultures
The temporal evolution of iron redox state in extracellular as well as in cell precipitates was
analyzed in BoFeN1 cultures at the sub-micrometer scale by STXM analyses at the Fe L2,3-
edges (Fig. 5). As shown on Fe(II)-Fe(III) maps, bacteria and extracellular precipitates both
contained mainly Fe(II) at the beginning of the culture (30 min.) and both became
progressively oxidized over the course of the culture (Fig. 5). However, as shown on
histograms (Fig. 6c), the extracellular precipitates and the bacterial cells could be
discriminated at each time point according to their redox state: the extracellular precipitates
(solid lines) exhibit a lower Fe(III)/Fe(total) ratio than Fe-precipitates associated with bacteria
(dashed lines). Moreover, the Fe(III)/Fe(total) ratio measured on bacteria evolved from
0.28±0.19 (here deviation represents the intrinsic variability within the sample) after 3 h to
0.94±0.22 after 6 days of culture, indicating that iron associated with bacteria was completely
oxidized after 6 days of culture. In contrast, the Fe(III)/Fe(total) ratio measured on
extracellular precipitates evolved from 0.18±0.13 after 3 h towards 0.50±0.2 after 6 days of
culture, i.e. a fairly homogenous mixed-valence iron phase. Similar estimations could be
drawn by direct fitting of the XANES spectra extracted from bacteria and extracellular
precipitates respectively (Fig. 6a,b and Table 2). After 1 year, iron oxidation state was similar
on the bacteria and the extracellular precipitates. All these results indicate that iron oxidation
rate is slower in the extracellular precipitates than at the cell contact.
105
Figure 5. Evolution of iron redox state 30 min. to 6 days and 1 year after inoculation. Fe
redox mapping after 30 min, 3 h, 1 day, 3 days, 6 days and 1 year of culture. We observe the
progressive oxidation of iron associated with bacteria and extracellular precipitates. Iron
oxidation in the extracellular precipitates is delayed with respect to iron associated with
bacteria.
TABLE 2. Fe(III)/Fe(total) quantification obtained from the fit of Fe L2,3-edge XANES
spectra extracted from stacks on bacteria and precipitates at different stages of the culture.
Fe(III)/Fe(total) values result from at least two spectra fits. Standard deviations (SD) were
calculated as the SD of the fit to the data. Values reported in this Table are means of the
standard deviations obtained for each fit.
Area Time Mean Fe(III)/Fe(total) Bacteria 3 h 0.27
1 day 0.65 3 days 0.91 6 days 0.99
Precipitates 0.5 h 0.17 3 h 0.17
1 day 0.26
3 days 0.59
6 days 0.62
30 min
3 h
3 h 1 day
3 days 6 days
1 year
106
705 710 715 720 725
707eV
708.7eV
Bacteria
3h
1 day
3 days
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
6 days
1 year
Op
tica
l d
en
sit
y, a
.u.
Photon energy, eV
705 710 715 720 725
708.7eV
Precipitates
Op
tic
al d
en
sit
y, a
.u.
707eV
Photon energy, eV
3h
1 day
3 days
Fe(II)-phosphate
Fe(III)-phosphate
6 days
1 year
30 min
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Nu
mb
er
of
pix
els
Fe(III)/Fe(total)
3 h
1 day
3 days
6 days
0.18+/-0.13
0.28+/-0.19
0.27+/-0.13
0.39+/-0.2
0.80+/-0.18
0.50+/-0.2
0.94+/-0.22
0.55+/-0.12
50
Figure 6. a-b: XANES spectra at the Fe L2,3-edge obtained on bacteria and extracellular
precipitates respectively, collected on 30 min-old to 6-days old and 1 year-old cultures. Solid
lines show the data and dashed lines the best fits. The numerical results of the fits are
displayed in Table 2. c: Histograms obtained from the Fe(II) and Fe(III) stack maps, giving
the Fe(III)/Fe(total) ratio on precipitates (solid lines) and precipitates (dashed lines)
respectively. Numbers indicated on the plot are the means +/- the width at mid height of the
peaks. All these results indicate the progressive oxidation of iron at the contact of the bacteria
and the delayed oxidation of iron in the extracellular precipitates.
To summarize, our results indicate the progressive transformation of vivianite FeII
3(PO4)2, 8
H2O into (1) a green phase consisting of amorphous platelets composed of mixed valence Fe-
phosphate, with a P/Fe atomic ratio of 0.55 and eventually into (2) an orange phase consisting
a b
c
107
of an amorphous Fe(III)-phosphate mineral in the form of platelets, with a P/Fe atomic ratio
of 0.36. Additionally, iron phosphate colloids were observed all along the culture. Finally,
iron oxidation rate was higher on the bacteria than on the extracellular precipitates.
DISCUSSION
Mineralogy of the oxidation products of vivianite in BoFeN1 cultures
Vivianite was progressively transformed into an amorphous Fe(III)-phosphate in BoFeN1
cultures (Fig. 2 and 3). This was documented by a progressive decrease of the vivianite
diffraction peaks in XRD (Fig. 2), by a change of the P/Fe ratio measured by EDXS on the
precipitates formed in the cultures (Fig. 4) and finally by the progressive change of the Fe-
redox state documented by XAS both at the bulk- (Fig. 3) and the submicrometer-scale (Fig. 5
and 6). An intermediate greenish iron-phosphate solid, identified after 4 days of culture,
exhibited a mixed Fe oxidation state, as assessed by XAS (Fig. 2 and 5, Table 1 and 2). The
homogeneity of the Fe redox state and of the P/Fe ratio at the few-nanometer scale suggests
that this solid consists of a single phase or of mixture of multiple phases that appears
homogeneous at the few-nanometer scale. In contrast, no greenish phase was identified when
BoFeN1 was cultured in the presence of soluble Fe(II) only (Miot et al., submitted),
suggesting that this green precipitate is a specific (intermediate) product of vivianite
oxidation. XRD pattern of the 4-day old sample was dominated by very broad diffusion bands
corresponding to nanocrystalline or amorphous material. Although, some Bragg peaks are
present, they could not be attributed unequivocally to any known mineral phase, excepts a
broad peak consistent with poorly ordered vivianite at 6.6 Å and two peaks at 2.25 Å and 1.51
Å that could be consistent with the XRD pattern of FeO(NO3)x(OH)1-x, which is a poorly
ordered compound with an akaganeite-like structure (Schwertmann et al., 1996). If present,
such a phase would modify the availability of nitrate in the medium. Unfortunately, due to its
ill-defined XRD pattern, this phase could not be identified unambiguously in our samples and
more investigations will be needed in the future to assess its presence.
Interestingly, a grey-greenish phase has been previously identified by XRD as carbonate-
bearing green rust in cultures of the nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria Dechlorosoma
suillum in the presence of soluble Fe(II) (Chaudhuri et al., 2001). In contrast, the end-product
of iron-biooxidation by BoFeN1 did not exhibit the pattern characteristic of green rust by
108
XRD (Fig. 2). The broad peak at d=10.5 Å (2θ=9.8°) could correspond to the (003) peak of a
phosphate-exchanged carbonate green rust, wherein phosphate partially replaces carbonate
groups in the interlayer, leading to a wider layer spacing (Hansen & Poulsen, 1999).
However, the resonance (006) peak was not observed in our diffraction patterns. Thus, it is
more likely that the broad peak at d=10.5 Å is due to an amorphous Fe-phosphate compound.
It is likely that under our culture conditions, the high P/Fe ratio in the system inhibited the
precipitation of green rust and favoured the precipitation of an amorphous Fe-phosphate as
end-product vivianite oxidation.
The green mixed-valence phase eventually turned progressively orange as Fe became
completely oxidized. This final product of iron bio-oxidation consisted of an amorphous
Fe(III)-phosphate as indicated by XRD and EXAFS results (Fig. 2 and 3, Table 1) similar to
the one formed in BoFeN1 cultures in the presence of soluble Fe(II) only (Miot et al.,
submitted). Amorphisation of vivianite by abiotic oxidation of iron can be ruled out, given the
precautions taken during all the experiments to preserve the Fe redox state from the culture to
the analyses. Moreover, this final product is structurally close to our reference Fe(III)-
phosphate (Fig. 3 and Table 1) and exhibits structural similarities with the natural oxidation
product of vivianite, namely santabarbaraite (Pratesi et al., 2003). According to the Fe-P and
Fe-Fe distances at 3.25 Å and 3.6 Å identified in the present study, the structure of this
amorphous Fe(III)-phosphate phase is likely similar to that of amorphous Fe(III)-arsenate
recently reported by Paktunc et al. (2008), where arsenate tetrahedra share corners with chains
of corner-sharing FeO6 octahedra. The absence of Fe-Fe bonds by edges (at 3.0-3.2 Å) that
are the basis of all iron oxyhydroxides, rules out the possibility this phase be an iron
oxyhydroxide with adsorbed phosphate. In contrast, our EXAFS results clearly indicate that
the final Fe-oxidation product in BoFeN1 cultures consists of a mixed Fe-PO4 hydroxide.
Mechanisms of bacteria-mediated oxidation of vivianite
Several previous studies have shown that the capability of a bacterial strain to oxidize Fe(II)
present in a solid phase depends on different parameters related to the solution chemistry and
to the mineralogy of the solid phase, and primarily to the solubility. For instance, nitrate-
reducing iron-oxidizing bacteria were shown to catalyze the oxidation of FeS2 at slightly
acidic pH values, based on NO3- and SO4
2- profiles (Postma et al., 1991, Engesgaard & Kipp,
1992), whereas no bio-oxidation of FeS2 was observed at pH 8 in a saline medium (Schippers
& Joergensen, 2002). In contrast, FeS oxidation has been reported under the latter conditions
109
in the presence of nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria (Schippers & Joergensen, 2002), as
well as in cultures of photoautotrophic iron-oxidizing bacteria at neutral pH (Kappler &
Newman, 2004). However, the same phototrophic strains were not able to oxidize magnetite,
pyrite or vivianite, which was suggested to result from the high insolubility of these minerals
(Kappler & Newman, 2004). In the present study, in spite of its very low solubility product
(Nriagu et al., 1972), vivianite was completely transformed within 16 days into an amorphous
Fe(III)-phosphate, which kept the platelet morphology of vivianite (Fig. 3 and Table 1). No
transformation of vivianite was observed in non-inoculated sterile media over the duration of
the experiment and hence bacterial activity is directly or indirectly responsible for vivianite
transformation and oxidation.
In addition, composite Fe(II)-Fe(III) maps indicate that iron oxidation started on the bacteria,
very early after inoculation (a few hours). After 3 days of culture, iron associated with
bacteria was almost completely oxidized, whereas the oxidation of extracellular minerals (i.e.
initially vivianite) was delayed with respect to intracellular iron, with only 50±20% iron
oxidized in the extracellular minerals after 6 days against 94±22% on the bacteria (Table 2).
The following scenario can tentatively be proposed: dissolved Fe(II) is first oxidized at the
contact of the bacterial cells. This would induce an undersaturation of the medium with
vivianite which would then dissolve, thus exporting more Fe(II) to the cells. Then, this Fe(II)
would be oxidized into Fe(III) by the bacteria. Fe(III) is highly insoluble at neutral pH, so the
precipitation is expected to occur on or within the cells. However, the progressive increase of
the Fe(III)/Fe(total) ratio that is observed in the extracellular mineral phases as well questions
the mechanisms that could transport Fe(III) to the extracellular minerals or oxidize Fe(II) in
situ in these minerals.
On the one hand, the persistence of the platelet morphology of the initial vivianite over the
time course of the culture suggests an epigenetic replacement of vivianite by amorphous
Fe(III)-phosphate. This preservation of morphology during the transformation of one solid
phase into another can be interpreted either as a mechanism of solid-state transformation or as
a transformation of a solid in the presence of a fluid phase by interface-coupled dissolution-
reprecipitation (Putnis & Putnis, 2007). However, the main issue is to determine where the
oxidation of Fe precipitating extracellularly takes place. Two scenarii can be proposed:
First, extracellular vivianite can be oxidized by an oxidant produced by BoFeN1 cells. As no
oxidation is observed in abiotic nitrate-rich controls over several days, oxidation by nitrates
can be discarded. Nitrites that have been shown to form as a product of nitrate reduction in
BoFeN1 cultures (Kappler et al., 2005a) can be considered. Kappler et al. (2005a) performed
110
bulk measurements of nitrogen species in cultures of BoFeN1 in the presence of dissolved
Fe(II) only (no vivianite) and demonstrated that BoFeN1 cells mediate Fe(II) oxidation at a
faster rate than nitrites (around 7 times faster). This may be consistent with our observations
in the present study: Fe(II) oxidation occurs at a faster rate on the cells than in extracellular
precipitates (around 3 to 5 times faster). Hence, while Fe(II) oxidation on the cells results
from a direct cellular catalysis, Fe(II) oxidation outside the cells might result from oxidation
by nitrites.
Alternatively, Fe(III) may be exported from the cells. In that case, two scenario have been
proposed in the literature to explain how Fe(III), which is very insoluble at neutral pH, can be
transported to the extracellular medium: (1) a previous study on the phototrophic iron-
oxidizing bacteria Rhodobacter ferrooxidans sp. strain SW2 (Kappler & Newman, 2004) has
suggested that a local drop of pH around the cells may favour Fe(III) export. In the present
case, this local drop of pH would also enhance vivianite dissolution. (2) Kappler & Newman
(2004) have suggested a release of Fe(III) from the cells as an inorganic aqueous complex
and/or as a colloidal aggregate. In the present work, we show the presence of 5.9±1.7-nm
sized iron-phosphate colloids in BoFeN1 cultures. Although it was not possible to determine
the iron redox state of these colloids (due to their small size), we suggest that they could play
a role in Fe(III) export from the bacteria to the extracellular minerals.
In any case, our results suggest that vivianite transformation is driven by bacteria directly (i.e.
Fe(III) exported from the cells) or indirectly (i.e. involvement of nitrites). The question
whether they can retrieve energy from this reaction remains open. We observed that the total
protein concentration reached in stationary phase (Fig. 1) was not very different from the
concentration obtained in cultures performed in the presence of soluble Fe(II) only (Miot et
al., submitted). Moreover, additions of Fe(II) in cultures grown with dissolved Fe(II) only in
the stationary phase lead to a second exponential growth (data not shown). These results
indicate that dissolved Fe(II) was supplied at a limiting concentration in our system. This
could support the fact that vivianite is not used by the cells as an energy source. Further
investigations, including a complete mass balance of the chemical species involved in the
bacterial metabolism, are needed to verify this hypothesis.
In conclusion, in the presence of vivianite, BoFeN1 cells used rapidly soluble Fe(II) but had
also the capability to drive the complete transformation of vivianite into an amorphous
Fe(III)-phosphate. Colloildal iron-phosphate observed in this system might play a role in the
extracellular transfer of Fe(III) to the solid phases. This colloidal fraction could have been
111
overlooked so far and has to be studied with more details given its potentially important role
in controlling the mobility of Fe(III) at neutral pH. The delay of Fe oxidation on extracellular
minerals compared to Fe associated with bacteria leads to a well-documented redox
heterogeneity at the sub-micrometer scale. Such redox heterogeneity corresponding to micro-
environments have been previously described in natural systems (e.g. Benzerara et al., 2005)
and could be tested as markers for the identification of such metabolisms in present
environments or in the geological record.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are indebted to the SSRL staff, especially Serena DeBeer George, and Mike
Toney for their technical assistance during the XAS experiments. The authors also thank the
SSRL, LURE, SOLEIL and ESRF synchrotron facilities to have provided beamtime for this
study. This work was supported by the ECCO/ECODYN CNRS/INSU Program, by ACI/FNS
grant #3033, by SESAME IdF grant #1775, and by NSF-EMSI Grant CHE-0431425
(Stanford Environmental Molecular Science Institute). We are also grateful to Region Ile-de-
France for convention SESAME 2000 E1435 for the support to cryo-electron microscope
JEOL 2100F installed at IMPMC UMR 7590. This is IMPMC contribution #nnnn and IPGP
contribution #nnnn.
REFERENCES
Adrian M., Dubochet J., Lepault J., MacDowall AW. (1984) Cryo-electron microscopy of
viruses. Nature, 308, 32-36.
Benz M, Brune A, Schink B (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral
pH by chemohetereotrophic nitrate-reducing bacteria. Archives of Microbiology. 169, 159-
165.
Benzerara K, Yoon TH, Menguy N, Tyliszczak T, Brown Jr GE (2005) Nanoscale
environments associated with bioweathering of a Mg-Fe-pyroxene. Proceedings of the
National Academy of Science. 102, 979-982.
112
Bernard S, Benzerara K, Beyssac O, Menguy N, Guyot F, Brown GE and Goffé B (2007)
Exceptionnal preservation of fossil plant spores in high-pressure metamorphic rocks. Earth
and Planetary Science Letters, 262, 257-272.
Bradford, MM (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry
72, 248-254.
Chaudhuri SK, Lack JG, Coates JD (2001) Biogenic magnetite formation through anaerobic
biooxidation of Fe(II). Applied and Environmental Microbiology. 67, 2844-2848.
Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003) Isolation and characterization of
a novel psychrophilic, neutrophilic, chemolithoautotrophic alpha- and gamma-Proteobacteria
from the deep sea. Applied and Environmental Microbiology. 69, 2906-2913.
Ehrenreich A, Widdel F (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron by purple bacteria, a new-
type of phototrophic metabolism. Applied and Envrionmental Microbiology. 60, 4517-4526.
Engesgaard P, Kipp KL (1992) A geochemical transport model for redox-controlled
movement of mineral fronts in groundwater-flow systems – a case of nitrate removal by
oxidation of pyrite. Water Resources Research. 28, 2829-2843.
Fejdi P, Poullen J-F, Gasperin M (1980) Affinement de la structure de la vivianite.
Fe3(PO4)2•8H2O. Bulletin de Mineralogie 103, 135-138
Frossard E, Bauer JP, Lothe F (1996) Evidence of vivianite in FeSO4-floculated sludges.
Water Research. 31, 2449-2454.
Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossnagel P, Burggraf S, Huber H, Stetter
KO (1996) Ferroglobus placidus gen nov, sp nov, a novel hyperthermophilic archeum that
oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions. Archives of Microbiology. 166, 308-314.
Hansen CBH, Poulsen IF (1999) Interaction of synthetic suphate “green rust” with phosphate
and the crystallization of vivianite. Clays and Clay Minerals. 47, 312-218.
Heising S, Schink B (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium
vannielii strain. Microbiology. 144, 2263-2269.
Hitchcock AP (2001) Soft X-ray spectromicroscopy of polymers and biopolymer interfaces,
Journal of Synchrotron Radiation. 8, 66-71.
Kappler A, Newman DK (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing
phototrophic bacteria. Geochimica et Cosmochimica Acta, 68, 1217-1226.
Kappler A, Schink B, Newman DK (2005a) Fe(III) mineral formation and cell encrustation by
the nitrate-dependent Fe(II)-oxidizer strain BoFeN1. Geobiology, 3, 235-245.
113
Kukkadapu RK, Zachara JM, Frederickson JK, Kennedy DW (2004) Biotransformation of
two-line silica-ferrihydrite by a dissimilatory Fe(III)-reducing bacterium: Formation of green
rust in the presence of phosphate. Geochimica et Cosmochimica Acta. 68, 2799-2814.
Liu R, Zhao D (2007) In situ immobilization of Cu(II) in soils using a new class of iron
phosphate nanoparticles. Chemosphere. 68, 1867-1876.
Manning PG, Murphy TP, Prepas EE (1991) Intensive formation of vivianite in the bottom
sediments of mesotrophic Narrow Lake, Alberta. Canadian Mineralogist. 29, 77-85.
Miot J, Benzerara K, Morin G, Kappler A, Bernard S, Obst M, Férard C, Skouri-Panet F,
Guigner JM, Posth N, Galvez M, Borwn Jr GE, Guyot F (submitted) Iron biomineralization
by neutrophilic iron-oxidizing bacteria.
Nriagu JO (1972) Stability of vivianite and ion-pair formation in the system Fe3(PO4)2-
H3PO4H3PO4-H2O. Geochimica et Cosmochimica Acta. 36, 459-472.
Nriagu JO, Dell CI (1974) Diagenetic formation of iron phosphates in recent lake sediments.
American Mineralogist. 59, 934-946.
Paktunc D, Dutrizac J, Gertsman V (2008) Synthesis and phase transformations involving
scorodite, ferric arsenate and arsenical ferrihydrite: Implications for arsenic mobility.
Geochimica et Cosmochimica Acta. 72, 2649-2672.
Postma D, Boesen C, Kristiansen H, Larsen F (1991) Nitrate reduction in an unconfined
sandy aquifer-water chemistry, reduction processes, and geochemical modelling. Water
Resources Research. 27, 2027-2045.
Pratesi G., Cipriani C., Giuli G., Birch W.D. (2003) Santabarbaraite: a new amorphous
phosphate mineral. Eur. J. Mineral. 15, 185-192.
Putnis A, Putnis CV (2007) The mechanism of reequilibration of solids in the presence of a
fluid phase. J. Sol. State Chem., 180, 1783-1786.
Rose J, Manceau A, Bottero JY, Masion A, Garcia F (1996) Nucleation and growth
mechanism of Fe oxyhydroxide in the presence of PO4 ions. 1. Fe K-edge EXAFS study.
Laangmuir, 12, 6701-6707.
Sapota T, Aldahan A, Al-Aasm I (2006) Sedimentary facies and climate control on formation
of vivianite and siderite microconcretions in sediments of Lake Baikal, Siberia. Journal of
Paleolimnology. 36, 245-257.
Schippers A, Jorgensen BB (2002) Biogeochemistry of pyrite and iron sulfide oxidation in
marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 66, 85-92.
114
Schwertmann U, Cornell RM (1991) Iron oxides in the laboratory: preparation and
characterization. VCH Publishers, Germany.
Schwertmann U, Friedl J, Pfab G (1996) A new iron(III) oxyhydroxynitrate. Journal of Solid
State Chemistry. 126, 336.
Straub KL, Benz M, Schink B, Widdel F (1996) Anaerobic, nitrate-dependent microbial
oxidation of ferrous iron. Applied and Environmental Microbiology. 62, 1458-1460.
Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Enumeration and detection of anaerobic ferrous
iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments. Applied and
Environmental Microbiology. 64, 4846-4856.
Thole BT, Van der Laan G, Fabrizio M (1994) Magnetic ground state properties and spectral
distributions. I. X-ray absorption spectra. Physical Reviews B., 50, 11466-11473.
Ueshima M, Fortin D, Kalin M (2004) Development of iron-phosphate biofilms on pyritic
mine waste rock surfaces previously treated with natural phosphate rocks. Geomicrobiology
Journal. 21, 313-323.
Viollier E, Michard G, Jézéquel D, Pèpe M, Sarazin G (1997) Geochemical study of a crater
lake: Lake Pavin, Puy de Dôme, France. Constraints afforded by the particulate matter
distribution in the element cycling within the lake. Chemical Geology. 142, 225-241.
Viollier E, Inglett PW, Hunter K, Roychoudhury AN, Van Cappellen P (2000) The ferrozine
method revisited: Fe(II)/Fe(III) determination in natural waters. Applied Geochemistry. 15,
785-790.
Von Guten U, Schneider W (1991) Primary products of oxygenation of iron(II) at an oxic-
anoxic boundary: nucleation, aggregation and aging. Journal of Colloid and Interface
Science. 145, 127-139.
Webb S (2004) SIXPACK: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.
Physica Scripta, T115, 1011-1014.
Weber KA, Picardal FW, Roden EE (2001) Microbially catalyzed nitrate-dependent oxidation
of biogenic solid-phase Fe(II) compounds. Envrionmental Science and Technology. 35, 1644-
1650.
Widdel F, Schnell S, Heising S, Ehrenreich A, Assmus B, Schink B (1993) Ferrous iron
oxidation by anoxygenic phototrophic bacteria. Nature. 362, 834-836.
Wilke M, Farges F, Petit PE, Brown Jr GE, Martin F (2001) Oxidation state and coordination
of Fe in minerals: An Fe K-XANES spectroscopic study. American Mineralogist. 86, 714-
730.
115
Winterer M (1997) XAFS – A data analysis program for material science. Journal of Physics
IV, 7, 243-244.
116
117
Chapitre 1.C.
Biominéralisation extracellulaire du fer par une bactérie ferro-oxydante
photoautotrophe
Problématique et objectifs. La seconde souche que nous avons étudiée au cours de cette
thèse, Rhodobacter sp., souche SW2 est une souche photosynthétique, qui utilise le Fe(II)
comme donneur d’électrons (photosynthèse anoxygénique) et synthétise des minéraux riches
en Fe(III) comme produit de son métabolisme. L’étude de cette souche présente un intérêt
fondamental pour l’étude de la mise en place des BIF. En effet, cette forme potentiellement
primitive de photosynthèse (Xiong et al., 2000) est invoquée par certains auteurs pour
expliquer le dépôt des ces immenses gisements de fer au Précambrien, lorsque l’atmosphère
était pauvre en O2 (Konhauser et al., 2002). De plus, il a été montré récemment que ces
bactéries produisaient un fractionnement isotopique du fer cohérent avec ce qui a été mesuré
dans certaines couches d’oxydes de BIF datés à -2.5 Ga (Croal et al., 2004). Cependant, les
mécanismes biologiques d’oxydation du fer pouvant expliquer ce fractionnement restent très
mal compris.
A l’opposé de la souche dénitrifiante BoFeN1 dont nos résultats précédents ont montré
qu’elle accumulait des minéraux riches en fer dans le périplasme, la souche SW2 a la
particularité de ne précipiter le fer qu’en dehors de la cellule (Kappler & Newman, 2004,
Schaedler et al., soumis). Bien que ces deux bactéries soient cultivées dans les mêmes
conditions (aux nitrates et à l’acétate près), elles présentent donc des réponses différentes à la
production de Fe(III) qui pourraient être le reflet de stratégies évolutives d’oxydation du fer
en conditions anoxiques distinctes. Tandis qu’il a été montré que d’autres bactéries, telles que
des espèces acidophiles des genres Gallionella et Leptothrix (Emerson & Revsbech, 1994,
Chan et al., 2004), produisaient des polymères organiques extracellulaires qui facilitent la
nucléation des oxydes de fer en dehors des cellules, l’existence de tels polymères chez les
bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles n’a pas été démontrée jusqu’à présent.
Notre étude a donc consisté à caractériser les polymères organiques susceptibles de
contrôler la biominéralisation extracellulaire du fer chez SW2 en utilisant le STXM. Nos
résultats démontrent le rôle essentiel joué par les polymères organiques dans la
biominéralisation du fer et met en évidence pour la première fois l’existence d’un gradient
redox autour des cellules de SW2.
118
Méthodologie.
Analyse des polymères organiques en STXM au seuil K du C. L’un des atouts majeurs du
STXM est la possibilité qu’il offre de caractériser les polymères organiques à l’échelle
nanométrique de façon qualitative et quantitative en fournissant l’accès aux énergies
d’absorption des éléments légers tels que le carbone. Afin de caractériser les fibres organiques
produites par SW2, nous avons donc effectué des analyses STXM au seuil K du C (autour de
280 eV). Les spectres XANES obtenus sont comparés à des spectres de référence afin
d’identifier les groupements fonctionnels présents et d’évaluer la nature biochimique des
molécules composant ces fibres. Il est en principe possible de quantifier les différentes
composantes car l’absorbance mesurée est directement proportionnelle à la concentration (ou
l’épaisseur) de cette composante (loi de Beer-Lambert). Pour obtenir des résultats quantitatifs,
les spectres des éléments de référence sont préalablement normalisés à une épaisseur de 1 nm.
Pour cela, un spectre XANES de référence est calculé à l’aide du logiciel aXis2000. Ce
spectre calculé ne présente pas de structures fines et simule donc uniquement le saut de seuil,
pour une épaisseur de 1 nm. La normalisation du spectre mesuré est obtenue en divisant le
spectre mesuré sur l’échantillon par ce spectre calculé. La quantification reste néanmoins
difficile dans notre cas, les composantes des structures organiques étudiées n’étant pas
déterminées de façon univoque, en raison de la grande variabilité des signatures XANES des
différentes classes de composés biochimiques, en particulier les lipides et les polysaccharides.
Détermination des corrélations entre les quantités de fer et de carbone organique. Nous
avons cherché à évaluer la corrélation entre les concentrations en fer et en carbone organique
dans les échantillons. Pour cela, après alignement des stacks aux seuils du fer et du carbone
enregistrés sur une même zone, nous avons calculé les cartes de spéciation du fer et du
carbone en utilisant la procédure de stack fit d’aXis2000 : après normalisation des spectres
des composés de référence à une épaisseur de 1 nm, les stacks enregistrés sur les échantillons
sont décomposés sur la base de ces spectres de référence et d’une constante. Nous avons ainsi
obtenu des valeurs proportionnelles aux quantités de fer et de carbone organique en chaque
pixel de la région analysée. Ces valeurs ont ensuite été reportées dans un graphe donnant la
quantité de Fe en fonction de la quantité de carbone organique en chaque pixel de l’image
(~2500 pixels au total) afin de vérifier l’existence de possibles corrélations (voir aussi Wan et
al., 2007).
119
Principaux résultats et perspectives.
Rôle des fibres lipo-polysaccharidiques dans le contrôle de la biominéralisation du fer. La
biominéralisation du fer par SW2 est exclusivement extracellulaire, contrairement à ce qui a
été observé dans le cas de la souche dénitrifiante BoFeN1. Dans les cultures de SW2, des
fibres organiques ont été mises en évidence, qui émergent généralement d’un des pôles de la
cellule. L’analyse STXM de ces fibres montre qu’elles sont organiques et composées
majoritairement, soit d’un mélange de lipides et de polysaccharides, soit de lipo-
polysaccharides. En outre, nous mettons en évidence l’existence d’une corrélation linéaire
entre la quantité de fer précipité et la quantité de carbone organique sur ces fibres.
L’assemblage d’oxydes de fer sur des matrices organiques, telles que des filaments de
polysaccharides a été décrit dans le cas de bactéries ferro-oxydantes acidophiles (Chan et al.,
2004, Banfield et al., 2000, Nesterova et al., 2003) et neutrophiles (Miot et al., in press, voir p.
43). En outre, Archibald & Mann (1993) ont montré que la precipitation abiotique d’oxydes
de fer chargés positivement à la surface de microtubes lipidiques enrichis en sucres chargés
négativement pouvait conduire à l’obtention de matériaux composites organique-inorganique
présentant une forte ressemblance avec les textures que nous avons observées dans les
cultures de SW2. Les fibres organiques produites par SW2 pourraient présenter un certain
nombre de groupements fonctionnels hydrophiles (par exemple phosphates, sulfates,
hydroxyls) auxquels pourrait se lier le Fe(III), servant ainsi de point de nucléation pour
l’assemblage des oxydes de fer. Afin d’expliquer la relation linéaire entre les quantités de
carbone organique et de fer précipité sur ces fibres, le scénario suivant peut être proposé
(Figure 1C-2) : le fer pourrait initialement s’adsorber sur les fibres en quantité proportionnelle
à la quantité de ligands organiques carbonés présents à la surface des fibres. Ensuite, cette
relation linéaire est préservée tant que la taille des minéraux nucléés à la surface de ces fibres
reste limitée. La limitation de la taille des minéraux formés pourrait s’expliquer par l’action
des polymères organiques qui inhiberaient leur croissance (Nesterova et al., 2003).
Il est intéressant de noter qu’une relation différente entre les quantités de fer et de
carbone organique est observée sur les filaments polysaccharidiques minéralisés de BoFeN1
(Figure 1C-1). Dans ca cas, on observe un large intervalle de quantités de fer pour une
quantité de carbone donnée. Cette observation suggère un mécanisme de nucléation suivi
d’une croissance non limitée (contrairement à ce qui est observé pour SW2) des minéraux
riches en fer à la surface des filaments organiques. Les corrélations obtenues directement sur
les cellules minéralisées de BoFeN1 montrent en revanche une relation linéaire entre la
quantité de fer minéralisé et la quantité de carbone organique (essentiellement des protéines),
120
suggérant que la croissance des minéraux riches en fer nucléés dans le périplasme de BoFeN1
est limitée (voir Chapitre 1D).
Figure 1C-1. A : Image STXM montrant la répartition des précipités riches en fer (rouge),
des protéines (vert) et des polysaccharides (bleu) et la zone d’analyse (ovale jaune) utilisée
pour la corrélation. B : Corrélation entre les quantités de fer et de carbone organique sur les
filaments polysaccharidiques minéralisés de la souche dénitrifiante BoFeN1 (> 5000 pixels).
On observe un large panel de quantités de fer pour une quantité de carbone organique donnée,
suggérant un mode de minéralisation de type nucléation-croissance.
Existence d’un gradient redox le long des fibres minéralisées. Nous avons mis en évidence
l’existence d’un gradient de redox du fer le long des fibres organiques produites par SW2,
avec des minéraux de plus en plus riches en Fe(III) relativement au Fe(II) à mesure que l’on
se rapproche de la cellule. Ce gradient peut être expliqué par deux modèles alternatifs, qui
pourraient cependant fonctionner en synergie (Figure 1C-2):
(1) Le Fe(II) pourrait être oxydé dans le périplasme et exporté à distance des cellules sous
forme de Fe(III) dissous (Kappler & Newman, 2004), de Fe(III) complexé à un ligand
organique (Kappler & Newman, 2004) ou de colloïdes (article #2, p. 87). En
particulier, l’existence d’un microenvironnement à pH acide autour des cellules
pourrait faciliter l’export de Fe(III) soluble. L’existence de colloïdes dans le milieu de
Qua
ntité
de
fer
Quantité de carbone organique
B
1 µm
FeProtéines
Polysaccharides
A
Qua
ntité
de
fer
Quantité de carbone organique
B
Qua
ntité
de
fer
Quantité de carbone organique
Qua
ntité
de
fer
Quantité de carbone organique
B
1 µm
FeProtéines
Polysaccharides
A
1 µm
FeProtéines
Polysaccharides
A
121
culture de SW2 n’a pas été testée dans le cadre de cette étude et devrait être évaluée
dans le futur.
(2) L’oxydation du Fe(II) pourrait aussi se produire en dehors des cellules, directement au
contact des fibres, soit suite à la production d’un oxydant par les cellules, soit en
relation avec l’expression et l’activité enzymatique de Fe(II)-oxydases à la surface de
ces fibres.
Similarité des fibres observées avec les nanowires des bactéries ferri-réductrices. Les fibres
observées chez SW2 présentent des similarités morphologiques avec les nanowires décrits
chez la bactéries ferri-réductrice Shewanella oneidensis (Reguerra et al., 2005, Gorby et al.,
2006) et chez d’autres microorganismes. Les nanowires de Shewanella sp. sont des
appendices de 50 à >150 nm de diamètre et de quelques dizaines de microns ou plus de long.
Il a été montré qu’ils peuvent conduire un courant électrique et il a été proposé qu’ils sont
impliqués dans le transfert d’électrons depuis la bactérie jusqu’aux oxydes de fer solides. Les
fibres identifiées chez SW2 présentent un gradient de redox du fer reflétant une différence de
potentiel électrique entre les deux extrémités de la fibre (Fig. 1C-2). Il serait intéressant de
tester leur potentielle conductivité électrique dans le futur, afin d’évaluer si SW2 pourrait tirer
des électrons de l’oxydation du fer à distance sur ces fibres. En outre, dans le but de
déterminer plus précisément la composition biochimique exacte de ces fibres, des analyses
STXM complémentaires aux seuils de l’oxygène et de l’azote pourraient être réalisées. Enfin,
il serait particulièrement important de rechercher l’existence d’éventuelles enzymes
impliquées dans l’oxydation du fer dans ces fibres organiques.
Bio-signatures potentielles. Les caractéristiques des assemblages organique-minéral décrites
ici chez SW2 pourraient constituer des bio-signatures potentielles de métabolismes qui
pourraient avoir joué un rôle important sur la Terre archéenne. En particulier, les assemblages
de fibres organiques – minéraux riches en fer pourraient être recherchés dans des roches
anciennes, de même que les gradients redox observés le long de ces fibres. De telles
hétérogénéités redox reflétant l’existence de micro-environnements ont déjà été décrits dans
des systèmes naturels (Benzerara et al., 2007) et pourraient être recherchées pour
l’identification de tels métabolismes dans des environnements actuels ou dans le registre
fossile.
122
Figure 1C-2. Schéma bilan des mécanismes potentiellement impliqués dans la
biominéralisation du fer chez SW2. L’oxydation du Fe(II) dans le périplasme libère des
électrons, qui pourraient être ensuite transportés par une chaîne de transporteurs d’électrons
jusqu’au CO2 dissous (HCO3-), qui est alors fixé (à l’aide d’une source d’énergie lumineuse,
hν) sous forme de matière organique (<CH2O>). Alternativement, l’oxydation du Fe(II)
pourrait se produire à distance des cellules, directement sur la fibre organique. On pourrait
imaginer que les électrons libérés par cette réaction seraient conduits via une chaîne de
transporteurs (non figurée sur ce schéma) jusqu’à la cellule pour la synthèse de matière
organique. Dans tous les cas, l’oxydation du Fe(II) libère du Fe(III), sous trois formes
possibles : Fe3+
soluble, Fe3+
complexé par un ligand organique ou sous forme de colloïdes
riches en Fe(III). En outre, il est possible que la cellule produise un oxydant non identifié à ce
jour. La minéralisation du Fe(III) sur la fibre pourrait débuter par une étape d’adsorption
faisant intervenir les potentiels groupements fonctionnels chargés négativement exposés sur la
surface de la fibre (symbolisés ici par un groupement hydroxyl). Après une étape de
nucléation, la croissance cristalline reste limitée. Cette précipitation d’oxydes de fer (goethite,
FeOOH) libère des protons qui pourraient d’une part amplifier l’acidité du
microenvironnement entourant la cellule, favorisant en conséquence la solubilité du Fe(III) et
d’autre part renforcer le gradient de protons de part et d’autre de la paroi cellulaire, qui
pourrait alimenter les ATPases. Enfin, les minéraux qui précipitent à proximité de la cellule
présentent un rapport Fe(III)/Fetotal plus élevé que les minéraux qui précipitent à distance de la
cellule. La différence de potentiel redox induite (∆Ε=Emax-Emin) peut être interprétée
comme une différence de potentiel électrique entre les deux extrémités de la fibre (∆Ψ).
pH min pH max
CYTOCYTO--
PLASMEPLASMEMb
PlMb
Ext
Ppl
H+H+
ADP
ATP
HCO3-+5H++4e-
<CH2O>+2H2O Fe2+
Fe3+
Fe3+ soluble
Fe3+-ligand organique
Fe2+Fe3+
e-
Colloïdes
e-
e-
HO-
Fe3+
1. Adsorption
2. Nucléation
3. Croissance
limitée
FIBREFIBRE
Fe3+
+2H2OFeOOH
+3H+
Fe(III)/Fetot
Fe(III)/Fetot
(hν)
E max E min∆Ε ⇒ ∆Ψ
MILIEU MILIEU
EXTERIEUREXTERIEUR
Oxydant?
pH min pH max
CYTOCYTO--
PLASMEPLASMEMb
PlMb
Ext
Ppl
H+H+
ADP
ATP
HCO3-+5H++4e-
<CH2O>+2H2O Fe2+
Fe3+
Fe3+ soluble
Fe3+-ligand organique
Fe2+Fe3+
e-
Colloïdes
e-
e-
HO-
Fe3+
1. Adsorption
2. Nucléation
3. Croissance
limitée
FIBREFIBRE
Fe3+
+2H2OFeOOH
+3H+
Fe(III)/Fetot
Fe(III)/Fetot
(hν)
E max E min∆Ε ⇒ ∆Ψ
MILIEU MILIEU
EXTERIEUREXTERIEUR
Oxydant?
123
Légendes : Mb Pl = Membrane plasmique, Mb Ext = Membrane externe, Ppl = Périplasme.
Les échelles ne sont pas respectées.
Variabilité de la minéralogie des phases formées par SW2. En complément des résultats
présentés dans l’article qui suit, nous avons mis en évidence une variabilité de la minéralogie
des phases riches en fer formées dans les cultures de SW2. La souche a été inoculée dans
deux proportions différentes (1/10 et 1/100) dans un milieu de culture contenant du Fe(II) à 4-
6 mM, à partir d’une pré-culture effectuée en présence d’H2 et en l’absence de fer (pas de
minéraux dans l’inoculum). Comme le montre la Figure 1C-3, le Fe(II) est totalement
consommé (oxydé) en 10 jours dans les deux cas. Pourtant, l’analyse minéralogique par DRX
des produits d’oxydation dans ces deux conditions de culture montre que les minéraux formés
sont différents (Figure 1C-4): le produit de la culture inoculée au 1/100 est cristallin et
consiste en une goethite, tandis que le produit de la culture inoculée au 1/10 est totalement
amorphe. Dans le cas où SW2 est inoculé à partir d’une pré-culture en présence de fer
(l’inoculum contient alors des bactéries et des minéraux riches en fer produits dans la
préculture), un mélange d’amorphe et de goethite est obtenu, que les bactéries soient
inoculées au 1/10 ou au 1/100. Les analyses MET-EDX du produit amorphe obtenu suggèrent
qu’il s’agit d’un phosphate de fer. Le ou les paramètres contrôlant la cristallinité des phases
formées n’ont pas encore été identifiés. La minéralogie pourrait être contrôlée par la présence
éventuelle de minéraux riches en fer au début de la culture, par le taux d’oxydation initial du
Fe(II), par la durée de la phase de latence ou encore par l’état métabolique de l’inoculum
(inoculum en phase stationnaire ou en phase exponentielle). Ces paramètres n’avaient pas été
finement contrôlés au cours de ces expériences préliminaires. Il conviendra donc de reprendre
l’ensemble de ces paramètres afin d’identifier dans le futur ceux pouvant participer au
contrôle de la minéralogie des phases produites par SW2.
124
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8 10 12
SW2(H2)Fe*1/100SW2(H2)Fe*1/10
Co
nce
ntr
ati
on
en
Fe d
iss
ou
s, m
M
Temps, jours
Figure 1C-3. Courbes de croissance de SW2 cultivée en présence de 4-6 mM Fe(II), à partir
d’une pré-culture en H2, inoculée au 1/10 ou au 1/100.
20 40 60 80 100
Co
un
ts,
a.u
.
2θθθθ angle (°)
SW2, 1/100
Viv
(6.6
0 A
)
SW2, 1/10
Figure 1C-4. Analyse par DRX de la minéralogie des phases produites par SW2 cultivée en
présence de Fe(II) dissous, à partir d’une pré-culture en H2 inoculée au 1/10 ou au 1/100.
Tandis que le produit obtenu dans la culture inoculée au 1/10 est totalement amorphe, le
produit de la culture au 1/100 est cristallisé. Le pic indiqué à 6.60 A est attribué à de la
vivianite. Tous les autres pics sont expliqués par la goethite.
125
Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic iron-oxidizing bacteria
Jennyfer Miot (1), Karim Benzerara (1), Martin Obst (2), Andreas Kappler (3), Florian Hegler
(3), Camille Bouchez (1), François Guyot (1), Guillaume Morin (1).
(1) Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,
Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.
140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.
(2) BIMR McMaster University Hamilton & Canadian Light Source, 101 Perimeter Road,
Saskatoon, SK, Canada, S7N OX4.
(3) Geomicrobiology Center for Applied Geoscience (ZAG), University of Tuebingen,
Sigwartstrasse 10, 72076 Tuebingen, Germany.
*Corresponding author:
[email protected] ; Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785
To be submitted to Applied & Environmental Microbiology
126
ABSTRACT
Iron oxidation at neutral pH by the phototrophic anaerobic iron-oxidizing bacteria
Rhodobacter sp. strain SW2 leads to the production of iron-rich minerals. These minerals
consist mainly of goethite (FeOOH), which precipitates exclusively outside the cells, mainly
on fibres emerging from one of the poles of the cell. Scanning Transmission X-ray
Microscopy (STXM) analyses performed at the C K-edge suggest that these fibres consist of a
mixture of lipids and polysaccharides or of lipo-polysaccharides. The iron and the organic
carbon contents on these fibres are linearly correlated at the 25-nm scale, which in addition to
the texture suggests that the fibres act as a template for the precipitation of the minerals,
followed by a limited crystal growth. Moreover, we demonstrate the existence of a gradient of
the iron redox state along the mineralized fibres at the micrometer-scale, with an increasing
reduced iron proportion at distance from the cells. This could be explained by an export of
Fe(III) from the cells and/or an oxidation of Fe(II) taking place outside the cells, directly at
the contact of the fibres. Furthermore, the redox gradient reflects a difference of electrical
potential in between the two extremities of the fibre. These fibres share morphological
similarities with the electrically conductive nanowires described in Shewanella oneidensis,
but the demonstration of their potential role in electron transfer to the cells from long-distance
iron oxidation would need further investigations.
127
INTRODUCTION
Fe(II) can serve as a source of electrons for phylogenetically diverse microorganisms
that precipitate iron minerals as by-products of their metabolism (see e.g. 1-4). For example,
mixotrophic bacteria can couple the oxidation of Fe(II) to the reduction of nitrate in anoxic
and neutral-pH environments. Fe(III) being highly insoluble at neutral pH, this metabolism
leads to the formation of poorly- to well-crystallized iron minerals (3, 5, 6) that partly
precipitate within the cell periplasm in some strains (7). Similar Fe-minerals are also
synthesized by autotrophic bacteria that perform anoxygenic photosynthesis, using Fe(II) as
an electron donor and light as a source of energy for CO2 fixation (2, 8, 9), following Eqn 1:
HCO3- + 4 Fe
2+ + 10 H2O = <CH2O> + 4 Fe(OH)3 + 7 H
+ (Eqn 1)
However, the biological mechanisms of iron oxidation in these bacteria, and in
particular the way they cope with the formation of minerals within their ultrastructures are
still not fully understood. Indeed, iron minerals are potentially lethal since their precipitation
may alter cellular ultrastructures, but also catalyze the production of free radicals (10).
Recent genetic studies of the phototrophic iron-oxidizing bacteria Rhodobacter sp., strain
SW2 (11) and Rhodopseudomas palustris strain TIE-1 (12) have identified genes (fox and pio
operons respectively) encoding proteins specific for iron oxidation. Interestingly, Jiao &
Newman (12) suggested that one of these proteins could have a periplasmic localization.
However, on the contrary to what has been observed in some other phototrophic iron-
oxidizers (4) and in some nitrate-reducing iron-oxidizing bacteria (7), there is no iron-mineral
precipitation occurring within the periplasm of the purple non-sulfur iron-oxidizing bacteria
Rhodobacter sp. strain SW2 (4). Similarly to some other neutrophilic (4, 7) and acidophilic
iron-oxidizing bacteria (13, 1), this strain has indeed the ability to localize iron
biomineralization at distance from the cells, leaving large areas of the cells free of precipitates
(14). While it has been shown that the acidophilic Gallionella and Leptothrix genera for
example produce extracellular polymers that facilitate the nucleation of iron minerals outside
the cells (e.g. 15, 1), only little is known about the existence of such polymers in anaerobic
neutrophilic iron-oxidizing bacteria, and especially in the phototrophic strain SW2. In the
present study, we investigate iron biomineralization by the photoautotrophic iron-oxidizing
bacteria Rhodobacter sp. strain SW2. We use Scanning Transmission X-ray Microscopy
(STXM) to map and characterize organic polymers produced by the cells as well as the redox
state of iron at the 25-nanometer scale over the time course of a culture. These results
128
demonstrate the primordial role of organic polymers in iron biomineralization and provide
first evidences for the existence of a redox gradient around SW2 cells.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strain and growth conditions. The phototrophic Fe(II)-oxidizing bacterium
Rhodobacter sp., strain SW2 (2), was cultivated in batch freshwater mineral medium prepared
after Ehrenreich & Widdel (8) buffered at pH 6.8 with bicarbonate in equilibrium with a
N2/CO2 (80/20) atmosphere . SW2 was grown in this medium with Fe(II) as an electron
donor. For experiments using Fe(II) as an electron donor, Fe(II) was added as FeCl2 at a total
concentration of 10 mM, which led to the precipitation of a white phase characterized as
vivianite Fe3(PO4)2 (7). This precipitate was removed prior to inoculation by filtration through
0.22 µm Millipore filters in an anoxic glovebox (p(O2) < 50 ppm). After filtration, the
medium contained 2 to 6 mM dissolved Fe(II). SW2 was inoculated at 100%. Cultures were
incubated at 20°C in the light. For STXM analyses, samples of the same culture were
collected in an O2-free glove-box (p(O2)<50 ppm) at several subsequent time steps (3 h, 4, 7,
11 and 15 days).
Dissolved Fe(II) measurement. The concentration of dissolved iron was followed over the
time course of the cultures. In that purpose, 200 µL of a culture suspension were sampled with
a syringe and filtered through 0.22 µm Millipore filter in an anoxic glovebox. The dissolved
Fe(II) content of the filtrate was determined by the ferrozine assay (16) after dilution in 1 M
HCl. In all samples, no measurable dissolved Fe(III) could be detected after reduction with
hydroxylamine hydrochloride.
Synthesis of model compounds for Fe redox analyses. To determine the Fe redox state of
the samples by STXM at the Fe L2,3-edges, a pure Fe(II) end-member and a pure Fe(III) end-
member are needed, both as close as possible in structure to the phases that are formed by
SW2. Pure Fe(II)-vivianite and goethite (FeOOH) were used as the Fe(II)- and Fe(III) end-
members respectively. The mineralogical purity of these compounds was checked by XRD
and the redox state of Fe in both compounds was also controlled by bulk XANES at the Fe K-
edge. Both reference minerals were rinsed twice with degassed distilled water and dried under
vacuum inside an anoxic glove-box.
129
Mineral characterization by X-ray diffraction. The bulk mineralogical composition of the
solid phases formed in SW2 cultures was determined by X-ray diffraction (XRD)
measurement and compared to vivianite and goethite model compounds. Samples were
prepared under anoxic conditions in an anoxic glove-box. The cultures were centrifuged
(6500 rpm, 10 min). The solid phases were rinsed twice using degassed distilled water and
vacuum-dried. The powders were ground in an agate mortar and dispensed in borosilicate
capillaries that were sealed with glue before analysis in the diffractometer. This preparation
guaranteed strict anoxic conditions for XRD analyses. XRD measurements were performed
with CoKa radiation on a Panalytical® X’Pert Pro MPD diffractometer mounted in Debye-
Scherrer configuration using an elliptical mirror to obtain a high flux parallel incident beam
and an X'Celerator®
detector to collect the diffracted beam. Data were recorded in the
continuous-scan mode within the 5 - 80° 2θ range with a step of 0.03°, and a counting time of
12 to 24 h per sample.
Scanning Transmission X-ray Microscopy. The samples were constantly kept under an
anoxic atmosphere from preparation to transfer and analysis within the STXM microscope,
following the method detailed in Miot et al. (7). The entire preparation was performed in an
anoxic glove-box. 1 mL of a suspension of SW2 culture (or of reference compounds) was
sampled at different stages of each culture (3 h to 15 days). Each sample was rinsed twice in
degassed distilled water. 0.3 µL of each sample was dried on a silicon nitride window, then
sandwiched by addition of a second silicon nitride membranes (Norcada Inc., Canada), the
whole sealed under an anoxic atmosphere using epoxy.
Some of the STXM observations at the Fe L2,3-edges were performed at the Swiss
Light Source (SLS, Villigen) on the PolluX beamline. Some of the observations at the Fe L2,3-
edges and all the observations at the C K-edge were performed at the spectromicroscopy
beamline 10ID-1 at the Canadian Light Source (CLS, Saskatoon). Additional information on
the PolluX beamline can be found in Bernard et al. (17). The beamline 10ID-1 at the CLS was
described in detail by Kaznatcheev (18). Both beamlines have an energy resolving power
E/∆E > 3000. The energy scales for this study were calibrated using the well-resolved 3p
Rydberg peak of gaseous CO2 for the C K-edge and the major peak of hematite at 708.7 eV
for the Fe L3-edge.
Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edges. They were
performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the
130
energy range of interest. Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e.
changes of the Fe redox state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-
edge with increasing dwell times up to several tens of ms (7). However, no significant
changes were observed for typical dwell times used during analyses of the samples (i.e.
around 0.8 ms per energy- and image-point). The aXis2000 software-package (19) was used
for processing image stacks and NEXAFS spectra. Images were recorded on transmission
scale and converted into optical density (OD) according to Equation (2).
OD = -ln(I/I0) (Eqn. 2)
wherein I represents the measured intensity at the point of interest and I0 represents the
intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.
Qualitative speciation maps were obtained by subtracting OD images obtained at an energy
below the absorption edge from OD-images taken at the energies of specific absorption peaks.
NEXAFS spectra were extracted from the stacks on regions of interest. For Fe L2,3-
edges spectra, we normalized the area below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the
absorbance of the compounds containing mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5
correction factor to take into account the difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+
and Fe3+
ions, neglecting the variation of radial integrals (20). We fit the normalized spectra
with linear combinations of the normalized reference spectra of the Fe(II)-phosphate and
goethite model compounds, applying the CGO (Conjugate Gradient Optimization method)
curve fit routine in Axis2000. Fit results allowed estimating the Fe(III)/Fe(total) content of
regions of interest. Standard deviations (SD) were calculated from the deviation between the
fit and the data and were systematically less than 1%. Fe(III)/Fe(total) ratio profiles were
obtained using the Fe(III) and Fe(II) OD-maps resulting from stack fits. Additionally, Fe(II)
and Fe(III) stack maps were used to evaluate the variability of the Fe(III)/Fe(total) ratio
within each sample (i.e. at each stage of the culture): the Fe(II)-map was multiplied by the 4/5
correction factor (see above) and added to the Fe(III)-map to obtain a Fe(total) map. The
Fe(III)-map was subsequently divided by the Fe(total) map. A histogram of the resulting map
was plotted, giving the number of pixels for each Fe(III)/Fe(total) ratio. This histogram
allowed discriminating the major areas with different Fe redox states within the image. The
mean Fe(III)/Fe(total) ratios were calculated as the maxima of each peak in the histogram and
the variability as the width at mid-height of the peak.
Spectra recorded at the C K-edge were normalized to 1-nm thickness and fit with
normalized reference albumin (protein), xanthan (polysaccharide) and 1,2-dipalmitoyl-sn-
glycero-3-phosphocholine (lipid, Hitchcock pers. comm..).
131
Using aligned stacks recorded at the Fe L-edges and at the C K-edge on the same area
and normalized reference spectra (vivianite, goethite, albumin, xanthan, 1,2-dipalmitoyl-sn-
glycero-3-phosphocholine), we calculated Fe and C-speciation maps from image stacks by
singular value decomposition using the stack fit routine in aXis2000. The algorithm fits the
spectra of each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference
spectra plus a constant, accounting for the absorption background. We subsequently obtained
numbers that are proportional to the amount of iron and of organic carbon for each pixel of
this area. Those values are then used to plot the amount of C relatively to the amount of Fe at
each pixel of the area (~2500 pixels in total) and assess the existence of possible correlations
(see ref 21 for additional explanations).
RESULTS
Association of iron minerals with organic carbon. As shown in Fig. 1, Fe(II) is almost
completely consumed (oxidized) within 10 days in cultures of SW2. In contrast, no significant
oxidation could be detected in abiotic controls. XRD analyses indicate that the end-product of
iron oxidation by SW2 is crystalline and consists of goethite (FeOOH) (Fig. 2).
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 2 4 6 8 10 12
Fe
co
nc
en
tra
tio
n,
mM
Time, days
Figure 1. Concentration of remaining soluble Fe(II) in SW2 culture at an initial Fe(II)
concentration of 4-6 mM over a period of 12 days.
132
20 40 60 80 100
Co
un
ts, a.u
.
2θθθθ angle (°)
SW2
Viv
(6.6
0 A
)
Vivianite
Goethite
Figure 2. X-ray diffraction patterns of the precipitates collected from a 15-day old culture of
SW2, of goethite and of the reference vivianite used for STXM analyses. In the “SW2”
pattern, a vivianite peak is observed (Viv) and all other peaks are explained by goethite.
Cell-mineral assemblages were imaged by SEM (Fig. 3). In addition, iron-rich minerals were
localized with respect to the cells by analyzing the cultures using STXM at the Fe L2,3-edges.
Maps of Fe(II) and Fe(III) were obtained by fitting stacks with a linear combination of Fe(II)
and Fe(III) reference compounds. As shown on Fig. 3 and 4d, iron-rich minerals are
exclusively localized outside the cells, mostly on extracellular fibres and in a very low
proportion at the cell surface. Usually attached to one of the poles of the cell, extracellular
fibres are a few µm in length and a few nm in diameter (Fig. 3). Moreover, maps of organic
carbon reveal that these iron-bearing fibres are rich in organic carbon (Fig. 4b and 4c).
XANES spectra at the C K-edge obtained on these regions exhibit maxima of absorption at
285.2 eV, 287.4 eV and 288.6 eV, which can be attributed to alkene (C=C), aliphatic (C-C) or
carbonyl (C=O) and carboxylic (COOH) functional groups respectively (Fig. 3e, 22). The
biochemical indexation of such spectra is more difficult, given the significant variations of the
XANES signatures within some biochemical groups such as lipids or polysaccharides
(Hitchcock, pers. comm.). However, the XANES spectrum of the fibres can be reasonably
well fitted using a linear combination of polysaccharides, such as xanthan, and lipids, such as
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (fully saturated lipid). The peak at 285.2 eV
that is not well fitted in intensity with our set of reference spectra can be attributed to
additional unsaturated C=C bonds that could be present on the aliphatic tail of the fatty acid.
133
Thus, our results suggest that organic fibres attached to SW2 cells consist of a mixture of
partially unsaturated lipids and polysaccharides or of lipo-polysaccharides. Less than 3% of
proteins might be present as well in these fibres. In contrast, XANES spectra at the C K-edge
obtained on bacteria have a maximum absorption at 288.2 eV that is unambiguously attributed
to the absorption of the peptidic bond, characteristic of proteins.
Figure 3. SEM micrograph showing fibres emerging from SW2 cell poles. From Schaedler
et al., submitted.
The existence of a correlation between the concentrations of Fe and of organic carbon
has been investigated separately on the cells and on the extracellular mineralized fibres (Fig.
5) by plotting the Optical Density (OD) levels measured on each pixel of the region of interest
on the Fe map and on the organic carbon map. Interestingly, the Fe and organic carbon
contents are correlated on the mineralized filaments (Fig. 5a) following a linear relation:
[Fe] = 2.5 [C] + 100, r=0.98 (Eqn. 3)
Given that iron associated with these fibres consists mainly of mineral precipitates, this
relation suggests that the amount of iron precipitated is proportional to the amount of organic
carbon.
Similarly, Fe and organic carbon contents are also correlated on the cells, following a linear
relation. It can be noted that the concentration of iron on the cells is however much lower than
on the fibres and may correspond either to very small precipitates forming directly at the cell
contact (Fig. 5b), or to adsorbed Fe.
134
Figure 4. Spectromicroscopy study of organics associated with SW2 biominerals (3-day old
culture). The 3 different organic carbon maps (a, b, c) were obtained by fitting the stack with
a linear combination of albumin (protein), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
(lipid) and xanthan (polysaccharide). a: Map of proteins, mainly concentrated in the bacterial
cell. Scale bar: 500 nm. b: Map of lipids, mainly present in the extracellular fibre. Scale bar:
500 nm. c: Map of polysaccharides, mainly present in the fibre. Scale bar: 500 nm. d: Fe(III)
map obtained by fitting the stack at the Fe L-edge with reference goethite. Scale bar: 250 nm.
e: XANES spectra at the C K-edge obtained on bacteria and extracellular fibre respectively,
compared with the spectra of reference albumin, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-
phosphocholine (lipid) and xanthan (polysaccharide). The XANES spectrum of the fibre was
fitted with a linear combination of xanthan and 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
(dashed line) and yielded thicknesses of 1.31 and 1.28 nm respectively. These results indicate
that fibres are associated with extracellular iron-rich precipitates are composed of a mixture of
lipids and polysaccharides or of lipo-polysaccharides.
0
0 0
0
60 125
150 3.8
a b
c d
e
284 288 292 296 300
Op
tic
al
de
ns
ity
Photon energy, eV
0.01
albumin
bacteria
fibre
xanthan
lipid
285.2 eV
288.2 eV
289.2 eV
288.6 eV
287.4 eV
fit-fibre0
0 0
0
60 125
150 3.8
a b
c d
e
284 288 292 296 300
Op
tic
al
de
ns
ity
Photon energy, eV
0.01
albumin
bacteria
fibre
xanthan
lipid
285.2 eV
288.2 eV
289.2 eV
288.6 eV
287.4 eV
fit-fibre
135
Figure 5. Correlation analysis of iron versus carbon content on a: extracellular filaments and
b: bacteria of a 3-day old SW2 culture. Fe and organic carbon contents were estimated at each
pixel of the STXM image presented in Figure 3 from the Fe(III), the polysaccharide (for the
extracellular fibres) and the protein (for the cell) maps respectively. These results indicate that
(a) iron content is proportional to organic carbon (mostly polysaccharides) content on
extracellular precipitates following: [Fe] = 2.5 [C] + 100, r=0.98 and (b) cells are covered by
a small amount of iron that is also proportional to organic carbon content.
Organic carbon content, a.u.
Organic carbon content, a.u.
Extracellular filament
Bacteria
Fe c
on
ten
t, a
.u.
a
b
Fe c
on
ten
t, a
.u.
136
Iron redox state at the nanoscale. Using STXM at the Fe L2,3-edges, the evolution of iron
redox state in these extracellular iron-rich minerals was followed over the time course of a
culture (3 h to 15 days) at a spatial resolution of 25 nm. XANES spectra recorded on these
samples were fit with a linear combination of vivianite (Fe(II)-reference compound) and
goethite (Fig. 6, Fig. SI-1 and Table 1). Numerical results of these fits indicate that the
minerals that form initially in SW2 cultures are composed of mixed valence iron
(Fe(III)/Fe(total) = 0.39 after 3 h of culture). With time, iron contained in these minerals
becomes increasingly oxidized. After 7 days of culture, iron-rich minerals are mostly
composed of Fe(III) (Fe(III)/Fe(total) = 0.84) and the end-product of iron bio-oxidation by
SW2 is a pure Fe(III) compound (goethite obtained after 15 days).
705 710 715 720 725
Op
tica
l d
en
sit
y,
a.u
.
Photon energy, eV
Vivianite
707eV
708.7eV
15 days / goethite
11 days
7 days
4 days
3h
Figure 6. Evolution of iron redox state in SW2 cultures. Solid lines show the data and
dashed lines the best fits of the Fe L2,3-edges spectra of the minerals formed in SW2 cultures.
Numerical results of the best fits are displayed in Table 1. Spectra of 4 to 11-day old samples
were fit with a combination of reference goethite and vivianite. The spectrum of the sample
collected after 3h of culture was fit with a linear combination of reference Fe(III)-phosphate
and vivianite. These results indicate the progressive oxidation of iron into Fe(III) under the
form of goethite in SW2 cultures respectively.
137
Sample Culture time Mean Fe(III)/Fetotal Standard deviation
SW2(H2), Fe* 3h 0.39 0.006 4 days 0.66 0.005 7 days 0.84 0.005 11 days 0.84 0.004 15 days 1
Table 1. Fe(III)/Fe(total) quantification obtained from the fit of Fe L2,3-edge NEXAFS
spectra extracted from stacks on precipitates collected at different stages of SW2 culture.
Fe(III)/Fe(total) values result from at least two spectra fits. Standard deviations (SD) were
calculated as the SD of the fit to the data. Values reported in this Table are means of the
standard deviations obtained for each fit.
0
5
10
15
20
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
OD
lev
el,
a.u
.
Fe(III)/Fe(total)
0.4+/-0.19
0.77+/-0.27
0.95+/-0.1
Figure SI-1. Spatial variability of the Fe(III)/Fe(total) within SW2 cultures at different
stages of the culture : (green) : 3h, (pink) : 4 days, (black): 7 days. Numbers are means +/-
width at mid-height of the peaks.
Local heterogeneities of the redox state of Fe were investigated at different stages of the
culture (Fig. 7). Fe(II) and Fe(III) OD-maps of the bacteria and associated extracellular iron-
rich minerals were obtained by fitting stacks recorded at the Fe L2,3-edges with a linear
combination of the Fe(II)- and Fe(III)-model compounds. Using these maps, Fe(II), Fe(III)
and Fe(total) intensity profiles were obtained along the mineralized fibres. Plotted in Fig. 7c
are the resulting Fe(III)/Fe(total) profiles obtained on extracellular fibres from the bacterial
pole (A) towards the end of the fibre at distance of the cell (B), at different time points (5 h
and 11 days). This analysis reveals a gradient of the redox state of Fe along the mineralized
138
fibre, iron being systematically more oxidized at the cell contact than at distance from the
cells. This gradient can be observed over the time course of the culture, the average iron redox
state on the filaments increasing with time (Fig. 5 and Table 1). Near the end of the culture, as
iron is almost completely oxidized, the redox gradient is attenuated (11 days).
Figure 7. Iron redox gradient along the mineralized filaments associated with SW2 cells. a and b: STXM images taken at 702 eV of bacteria and associated extracellular filament after
5h and 11 days of culture respectively. c: Fe(III)/Fetotal ratios along the A-B profiles
displayed on panel a (●) and b (□) and corresponding linear curve fits (solid lines) following
the equation: y=0.67-0.26x, r=0.88 for the 5-h old sample and y=0.98-0.10x, r=0.82 for the
11-days old sample. Fe is more oxidized at the cell contact than at distance from the cells and
the Fe redox gradient attenuated with time.
a
A
B
1 µm 500 nm
A
B b
0 0.5 1 1.50.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Fe
(III
)/F
e t
ota
l
Distance, µm
a
139
DISCUSSION
Lipo-polysaccharidic fibres act as a template for iron biomineralization. Iron
biomineralization by the phototrophic SW2 strain occurs outside the cells (14, 4), producing
Fe-mineral located, partly as patches at the cell surface and leaving large areas uncovered, and
mostly on extracellular fibres (Fig. 3 and 4). This pattern of extracellular iron mineralization
differs from that produced by the anaerobic nitrate-reducing BoFeN1 strain that was shown to
mineralize iron within its periplasm (4, 7). In SW2 cultures, extracellular fibres emerge from
the cells usually at one of the cell poles (Fig. 3). These fibres show a XANES spectrum at the
C K-edge similar to that of a mixture of partly unsaturated lipids and polysaccharides (Fig. 4).
Processes of iron oxide particles assembly on organic carbon containing fibrils have been
widely described in the case of iron biomineralization in association with polysaccharides (1,
23, 24). It has been suggested that heterogeneous nucleation of iron oxides at the surface of
exopolysaccharides would proceed through binding to functional groups, leading to a
minimization of the surface energy that would consequently stabilize potentially unstable
nuclei (24) leading to mineral-organic assemblages with morphologies very similar to those
evidenced in SW2 cultures. Similar hypotheses can be driven for lipids. Indeed, it has been
shown by Archibald & Mann (25) that precipitation of positively-charged iron oxides at the
surface of negatively-charged lipid microstructures can lead to tubular organic-inorganic
composites (25). In particular, iron oxide (ferrihydrite, magnetite, lepidocrocite or goethite)
precipitation is activated by addition of low levels of sulphated derivatives on galacto-
cerebroside microtubules that template mineral assembly (25). These sugar-based lipids
exhibit a high negative charge that enhances the binding of Fe(III) cationic species by
electrostatic attraction. These binding sites could thus serve as initial foci for mineral
nucleation (25). Fibres identified in SW2 cultures may exhibit different types of hydrophilic
moieties that could bind Fe(III) (possibly phosphate, sulphate, hydroxyl groups) and serve as
foci for mineral nucleation. This could explain the organic-mineral assemblages consisting in
nanoparticles of iron oxides clustered at the surface of the organic fibres that are observed in
SW2 cultures as well as the existence of a linear relationship between the Fe and the organic
C content on these mineralized fibres (Fig. 5). The following scenario for iron precipitation
could thus be proposed: Fe could initially adsorb onto the fibres proportionally to the amount
of organic carbon binding ligands present at the surface of the fibres. Then, this linear
relationship can be preserved after nucleation of Fe-minerals at the surface of the fibres as
long as the size of the minerals remains small, as observed in the present study. In contrast,
140
crystal growth would increase the Fe content for a given organic carbon content, leading in
turn to a wide range of Fe concentrations at a given organic carbon concentration. As shown
by Nesterova et al. (24), organic polymers can stabilize very small mineral particles and
inhibit further growth.
The organic fibres that act as a template for iron biomineralization in SW2 cultures are
elongated appendages emerging from one of the cell pole (Fig. 3). XANES spectroscopy
suggests that less than 3% of proteins might be present in these fibres. In contrast, contrary to
pili or flagella that are mostly composed of proteins, fibres observed in SW2 cultures are
mainly composed of lipids and polysaccharides. Further analyses will be required to elucidate
the origin and the detailed biochemical composition of SW2 fibres.
Mineralized fibres exhibit a Fe redox state gradient. The organic fibres record the redox
conditions along a section across the microenvironment surrounding SW2 cells. In this study,
we evidence a gradient of the Fe redox state along these organic fibres, with more oxidized
iron minerals at the cell contact and more reduced iron minerals precipitating at distance from
the cell. With time, as dissolved Fe(II) becomes completely oxidized, this redox gradient is
attenuated and mostly Fe(III)-minerals are observed at distance of the cells on the organic
fibres. Two different models that are not exclusive from each other could account for these
observations:
(1) Fe(II) could be oxidized within the periplasm and exported at distance from the cells.
Periplasmic oxidation is indeed suggested by previous reports of SW2 proteins that are
involved in the iron oxidation pathway and that exhibit motifs typical of periplasmic proteins
(11, 12). Oxidation within the periplasm is also supported indirectly by the observation of iron
precipitation within the periplasm in the anaerobic nitrate-reducing iron-oxidizer BoFeN1
strain (7). In this model, Fe(III) produced in the periplasm of SW2 cells would be exported
either as a soluble Fe(III)-organic ligand complex (14), as dissolved Fe(III) or as colloidal
particles (26). In particular, the acidic pH microenvironment reported around SW2 colonies
grown on agar plates could facilitate the export of dissolved Fe(III) (14, 27).
(2) Alternatively, iron oxidation could take place outside the cells, directly at the fibre contact.
No chemical oxidant is present in the strictly anoxic culture medium of SW2. Thus, this
model requires either the production of an oxidant by the bacteria that would oxidize
dissolved Fe(II) at the contact of the fibres, or the expression of an iron-oxidase at the surface
141
of the fibres. In both cases, this would lead to the precipitation of Fe(III)-containing minerals
that could nucleate on the lipo-polysaccharidic template.
In both scenarii, as soluble Fe(II) is increasingly oxidized over the time course of a culture,
mixed-valence Fe-minerals would become increasingly oxidized, leading to a progressive
attenuation of the gradient of the Fe redox state along the fibres (Fig. 6). These two
mechanisms could coexist and work in synergy. By generating protons following (Eqn 5):
Fe2+
+ 2 H2O = FeO(OH) + 4 H+
+ 2 e- (Eqn 5)
iron oxidation at distance of the cells (on organic fibres) could in return facilitate the export of
Fe that is oxidized within the cell periplasm. The resulting additional Fe(III) could then
aggregate on the organic fibres, reinforcing the gradient of Fe redox along the fibres.
Fibres emerging from SW2 cells and acting as a template for iron mineralization show
similarities in morphology and size with the nanowires described in the dissimilatory iron
reducing bacteria Shewanella oneidensis (28, 29). These bacterial appendages are 50 to >150
nm in diameter and extend tens of microns or longer (29). They were shown to be electrically
conductive and were proposed to mediate electron transfer from bacteria to solid iron oxides,
without the need for a direct contact between the cell and the mineral surface (28, 29). The
chemical composition of these nanowires is however still unknown, although they have been
shown to contain cytochromes. Although the electrical conductivity of the fibres identified in
SW2 cultures is not demonstrated, the gradient of iron redox along these fibres reflects a
difference of electrical potential between the two extremities of the fibres. It can be tentatively
proposed that these bacteria may retrieve electrons from long-distance iron oxidation.
Oxidation and precipitation of iron at distance from the cells would also generate protons. As
proposed by Chan et al. (1) for other iron-oxidizers at acidic pH, these protons could harness
the proton gradient across the cell membrane potentially increasing energy generation. The
possibility that bacteria could retrieve energy from oxidation reactions taking place at distance
from the cells open new perspectives of research for the understanding of bacteria-mediated
metal oxidation. Further studies are now required to define the surface composition and
electrical properties of lipo-polysaccharidic fibres produced by SW2 and to localize the sites
of iron oxidation.
142
ACKNOWLEDGMENTS
We gratefully acknowledge the support of an ANR “Jeunes Chercheurs” Grant (JM &KB).
The STXM measurements have been performed at the Canadian Light Source, Saskatoon,
Canada. The CLS is supported by NSERC, CIHR, NRC and the University of Saskatchewan.
We thank Konstantine Kaznatcheev, Chithra Karunakaran and Drew Bertwistle for their
expert support of the CLS STXM. The contribution from AK and FH was funded by an
Emmy-Noether fellowship and additional funding from the German Research Foundation
(DFG) to AK. This is IPGP contribution No. xxx.
REFERENCES
(1) Chan C.S., De Stasio G., Welch S.A., Girasole M., Frazer B.H., Nesterova M.V., Fakra S.
and Banfield J.F. (2004) Microbial polysaccharides template assembly of nanocrystal fibers.
Science, 303, 1656-1658.
(2) Widdel F., Schnell S., Heising S., Ehrenreich A., Assmus B. and Schink B. (1993) Ferrous
iron oxidation by anoxygenic phototrophic bacteria. Nature, 362, 834-836.
(3) Benz M., Brune A. and Schink B. (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron
at neutral pH by chemohetereotrophic nitrate-reducing bacteria. Arch. Microbiol., 169, 159-
165.
(4) Schaedler S. Burkhardt C., Hegler F., Straub KL., Miot J., Benzerara K., Kappler A.
(submitted) Formation of cell-iron-mineral aggregates by phototrophic and nitrate-dependent
anaerobic Fe(II)-oxidizing bacteria.
(5) Straub K.L. and Buchholz-Cleven B.E.E. (1998) Enumeration and detection of anaerobic
ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments. Appl.
Environ. Microbiol., 64, 4846-4856.
(6) Kappler A., Schink B. and Newman D.K. (2005) Fe(III) mineral formation and cell
encrustation by the nitrate-dependent Fe(II)-oxidizer strain BoFeN1. Geobiology, 3, 235-245.
(7) Miot J, Benzerara K, Morin G, Kappler A, Bernard S, Obst M, Férard C, Skouri-Panet F,
Guigner JM, Posth N, Galvez M, Borwn Jr GE, Guyot F (sumitted) Iron biomineralization by
neutrophilic iron-oxidizing bacteria.
(8) Ehrenreich A. and Widdel F. (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron by purple
bacteria, a new-type of phototrophic metabolism. Appl. Envrion. Microbiol., 60, 4517-4526.
143
(9) Heising S. and Schink B. (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a
Rhodomicrobium vannielii strain. Microbiology, 144, 2263-2269.
(10) Auffan M., Achouak W., Rose J., Roncato MA., Chanéac C., Waite DT., Masion A.,
Woicik JC., Wiesner MR., Bottero JY. (2008) Relation between the redox state of iron-based
nanoparticles and their cytotoxicity toward Escherichia coli. Environ. Sci. Technol. 42, 6730-
6735.
(11) Croal L.R., Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The fox operon from Rhodobacter strain
SW2 promotes phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodobacter capsulatus SB1003. J.
Bacteriol., 189, 1774-1782.
(12) Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The pio operon is essential for phototrophic Fe(II)
oxidation in Rhodopseudomonas palustris TIE-1. J. Bacteriol., 189, 1765-1773.
(13) Hallberg R., Ferris FG. (2004) Biomineralization by Gallionella. Geomicrobiology
Journal. 21, 325-330.
(14) Kappler A. and Newman D.K. (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing
phototrophic bacteria. Geochim. Cosmochim. Acta, 68, 1217-1226.
(15) Emerson D., Revsbech NP. (1994) Investigation of an iron-oxidizing microbial mat
community located near Aarhus, Denmark – Laboratory study. Appl. and Environm.
Microbiol. 11, 4032-4038.
(16) Viollier E., Inglett P.W., Hunter K., Roychoudhury A.N. and Van Cappellen P. (2000)
The ferrozine method revisited: Fe(II)/Fe(III) determination in natural waters. Appl.
Geochem., 15, 785-790.
(17) Bernard S., Benzerara K., Beyssac O., Menguy N., Guyot F., Brown G.E. and Goffé B.
(2007) Exceptionnal preservation of fossil plant spores in high-pressure metamorphic rocks.
Earth Plan. Sc. Lett., 262, 257-272.
(18) Kaznatcheev K.V. (2007) Soft X-ray spectromicroscopy beamline at the CLS:
Commissioning results. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A:
Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment, 582, 96-99.
(19) Hitchcock AP (2001) Soft X-ray spectromicroscopy of polymers and biopolymer
interfaces, Journal of Synchrotron Radiation. 8, 66-71.
(20) Thole B.T., Van der Laan G., Fabrizio M. (1994) Magnetic ground state properties and
spectral distributions. I. X-ray absorption spectra. Phys. Rev. B., 50, 11466-11473.
(21) Wan J., Tyliszczak T., Tokunaga TK. (2007) Organic carbon distribution, speciation and
elemental correlations within soil micro-aggregates: applications of STXM and NEXAFS
spectroscopy. Geochimica et Cosmochimica Acta. 71, 5439-5449.
144
(22) Hitchcock AP., Li J., Reijerkerk SR., Foley P., Stöver HDH., Shirley I. (2007) X-ray
absorption spectroscopy of polyureas and polyurethanes and their use in characterizing
chemical gradients in thin-walled polyurea capsules. Journal of electron Spectroscopy and
related phenomena. 156-158, 467-471.
(23) Banfield JF., Welch SA., Zhang H., Ebert TT., Penn RL. (2000) Aggregation-based
crystal growth and microstructure development in natural iron oxyhydroxide
biomineralization products. Science, 289, 751.
(24) Nesterova M., Moreau J., Banfield JF. (2003) Model biomimetic studies of templated
growth and assembly of nanocrystalline FeOOH. Geochimica et Cosmochimica Acta, 67,
1177-1187.
(25) Archibald DD., Mann S. (1993) Template mineralization of self-assembled anisotropic
lipid microstructures. Nature, 364, 430-433.
(26) Miot J., Benzerara K., Morin G., Bernard S., Larquet E., Ona-Nguema G., Kappler A.,
Guyot F. (in prep) Transformation of vivianite by anaerobic iron-oxidizing bacteria.
(27) Hegler F., Posth NR., Jiang J., Kappler A. (2008) Physiology of phototrophic iron(II)-
oxidizing bacteria – implications for modern and ancient environments. Submitted to FEMS
Microbiology Ecology. In press.
(28) Reguera G., McCarthy KD., Mehta T., Nicoll JS., Tuominen MT., Lovley DR. (2005)
Extracellular electron transfer via microbial nanowires. Nature, 435, 1098-1101.
(29) Gorby YA., Yanina S., McLean JS., Rosso KM., Moyles D., Dohnalkova A., Beveridge
TJ., Chang IS., Kim BH., Kim KS., Culley DE., Reed SB., Romine MF., Saffarini DA., Hill
EA., Shi L., Elias DA., Kennedy DW., Pinchik G., Watanabe K., Ishii S., Logan B., Nealson
KH., Frederickson JK. (2006) Electrically conductive bacterial nanowires by Shewanella
oneidensis strain MR-1 and other microorganisms. Proceedings of the National Academy of
Science, USA. 103, 11358-11363.
145
Chapitre 1.D.
Les premiers stades de la biominéralisation du fer et la fossilisation de
protéines
Problématique et objectifs. L’activité bactérienne peut laisser des traces dans les
biominéraux, autrement dit des biosignatures pouvant être recherchées dans le registre fossile.
Dans le cadre de l’étude des biominéralisations du fer par la souche dénitrifiante BoFeN1,
nous nous sommes donc intéressés à la possible préservation de structures organiques dans
des cellules complètement minéralisées pouvant s’apparenter à des microfossiles bactériens. Il
est couramment admis que la matière organique, du fait de sa grande labilité, est rapidement
dégradée. Cependant, il a été montré que sa dégradation peut être efficacement atténuée voire
inhibée par l’adsorption sur des oxydes de fer, en particulier des oxyhydroxydes mal
cristallisés (e.g. Kaiser & Guggenberger, 2000). En retour, ceux-ci peuvent être stabilisés
(Kennedy et al., 2004). Dans l’article qui suit, nous montrons que des protéines peuvent être
préservées au sein des biominéralisations riches en fer formées dans le périplasme de
BoFeN1. En outre, nous avons suivi les étapes de la précipitation des minéraux riches en fer
dans la cellule en conditions quasi-natives. Nos résultats apportent de nouveaux éclairages
pour la compréhension des premières étapes de la biominéralisation périplasmique.
Méthodologie.
Cryo Electron Microscopy of Vitreous Sections (CEMOVIS). La cryo-microscopie
électronique en transmission de sections vitreuses est utilisée depuis une vingtaine d’années
environ par des équipes s’intéressant à la biologie cellulaire (Al-Amoudi et al., 2004a, Al-
Amoudi et al., 2004b) et moléculaire (e.g. Leforestier et al., 2001). Son intérêt en biologie
structurale repose sur le fait qu’elle offre la possibilité d’observer des échantillons biologiques
en coupe en MET dans des conditions natives : sans aucun traitement chimique préalable,
l’échantillon est congelé dans une glace vitreuse préservant les structures cellulaires dans leur
état hydraté-congelé. Quelques travaux en particulier traitent de la structure membranaire des
bactéries Gram-positives et Gram-négatives (Dubochet et al., 1983, Graham & Beveridge,
1994, Matias et al., 2003, Zuber et al., 2008). Dans le cadre de cette thèse, nous utilisons pour
la première fois cette technique en géomicrobiologie pour imager en conditions natives les
assemblages molécules organiques - minéraux.
146
• Congélation des échantillons. L’observation d’échantillons biologiques en conditions
natives requiert la préservation de l’état hydraté des structures cellulaires. La solidification de
l’échantillon sans traitement chimique préalable est possible par congélation. Plusieurs types
de glace peuvent être obtenus en fonction des conditions de congélation. La glace vitreuse est
celle qui présente le plus de similarités structurales avec l’eau liquide. Elle peut être obtenue
par une congélation très rapide (1-2 ms) à très basse température (-196 °C) et sous haute
pression (2 kbars). Afin de préserver au mieux les structures biologiques, un cryoprotectant,
tel que le Dextran de haut poids moléculaire, peut être utilisé. Le protocole qui a été utilisé
dans le cadre de notre étude est le suivant :
- On effectue des prélèvements dans les cultures bactériennes, qu’on concentre et qu’on rince
par centrifugation douce (2000 g, 1 min.) et dilution dans du milieu de base (milieu de culture
sans fer, non inoculé) en conditions anoxiques (boîte à gants).
- En dehors de la boîte à gants, juste avant la congélation, on reprend les culots dans quelques
µL (volume à volume) de Dextran de haut poids moléculaire à 40% (dilution finale < 20%).
Les facteurs de dilution ont été mis au point afin que les échantillons soient suffisamment
concentrés pour l’observation, mais pas trop concentrés pour éviter la nucléation des cristaux
de glace sur les minéraux présents dans les cultures.
- On dépose une goutte de l’échantillon dans une planchette en aluminium, préalablement
recouverte d’hexadécène (92%) pour faciliter la congélation.
- On insère la planchette dans le porte-échantillon.
- On effectue la congélation à haute pression dans un congélateur Bal-Tech (Congélation
effectuée sur la plateforme de microscopie ultrastructurale de l’Institut Pasteur, Paris).
- Les planchettes congelées sont conservées dans l’azote liquide jusqu’à l’étape de coupe en
cryo-ultramicrotomie.
147
Figure 1D-1. Coupe d’un échantillon à l’aide d’un cryo-ultramicrotome pour le CEMOVIS.
L’échantillon a été préalablement vitrifié dans un porte-échantillon (ici un tube en cuivre.
Dans le cadre de nos expériences, les échantillons étaient congelés dans des planchettes en
aluminium). Le porte échantillon est placé dans le bras articulé de l’ultramicrotome. Une
pyramide est taillée à sa surface (dimensions : ~ 20×20 µm²) à l’aide d’un couteau spécifique
(Cryotrim). Le passage de cette pyramide à plusieurs reprises sur la lame du couteau diamant
(bas) produit des rubans de coupes de l’échantillon. On peut préparer de nombreux rubans de
4-5 coupes (cf photo) ou un long ruban que l’on dépose au fur et à mesure qu’il est coupé sur
la grille MET. Dans tous les cas, la récupération des coupes est effectuée à l’aide d’un cil.
L’ensemble de ces opérations se déroule dans le chambre refroidie du cryo-ultramicrotome (-
140 °C).
rubans de coupes
Lame du couteau (diamant)
Bras articulBras articuléé de lde l’’ultramicrotomeultramicrotome
Porte-échantillon en cuivre
(tube)Echantillon
vitreux(noir)
Pyramide
rubans de coupes
Lame du couteau (diamant)
Bras articulBras articuléé de lde l’’ultramicrotomeultramicrotome
Porte-échantillon en cuivre
(tube)Echantillon
vitreux(noir)
Pyramide
148
• Coupe des échantillons à froid. La coupe des échantillons vitrifiés a été réalisée à
l’aide d’un cryo-ultramicrotome Leica UC6-FC6 au Laboratoire de Physique des Solides
d’Orsay (Amélie Leforestier). Pour éviter la dévitrification des échantillons, la température de
l’ultramicrotome doit nécessairement rester inférieure à -135 °C. Nous travaillons donc dans
les vapeurs d’azote avec des outils tous préalablement refroidis (dans la chambre de
l’ultramicrotome ou dans l’azote liquide). Le moindre contact de l’échantillon avec un outil
non refroidi conduit à la dévitrification immédiate de l’échantillon. Lors de nos expériences,
nous avons systématiquement travaillé dans une chambre à -140 °C. Un des problèmes
important auquel nous sommes confrontés lors de la pratique de la cryo-ultramicrotomie est la
contamination par l’eau atmosphérique qui cristallise sous forme de neige dans
l’ultramicrotome et éventuellement sur l’échantillon (Figure 1D-2C). Pour limiter cette
contamination, le cryo-ultramicrotome est donc installé dans une pièce en atmosphère sèche
(humidité relative < 30%).
Une fois l’épaisseur d’aluminium coupée (à l’aide d’un cryotrim en carbure de
tungstène), une pyramide est taillée dans l’échantillon (à l’aide d’un cryotrim 45° diamant),
de préférence dans des zones non fracturées (Figure 1D-1). Le sommet de la pyramide est
ensuite taillé à l’aide d’un couteau diamant et des coupes de 50 nm d’épaisseur sont collectées
sur le couteau (vitesse de coupe : 0.4 nm/sec). Contrairement au principe de l’ultramicrotomie
à température ambiante, où les coupes sont collectées à la surface de l’eau remplissant un
réservoir à l’arrière du couteau, les coupes vitreuses sont directement prélevées sous forme de
rubans sur la lame de couteau à l’aide d’un cil, et déposées sur une grille MET recouverte
d’un film de carbone (membranes Lacey). Les coupes doivent être autant que possible étalées
sur la grille MET. Cette opération est rendue d’autant plus délicate qu’une forte électricité
statique règne généralement dans la chambre de l’ultramicrotome en raison de la très basse
température. Pour la limiter, un appareil antistatique est placé face au couteau lors de la coupe
et de la récupération des coupes.
Les coupes sont ensuite pressées sur la grille préalablement déposée sur un film
d’indium (pour favoriser l’adhésion des coupes). Cette étape est, elle aussi, cruciale. En effet,
une parfaite adhésion des coupes à la membrane de carbone est requise pour éviter que les
coupes ne bougent lors de l’imagerie en cryo-microscopie électronique (drift, Figure 1D-2D).
Les grilles sont ensuite stockées dans l’azote liquide jusqu’à observation au cryo-MET.
• Imagerie en cryo-microscopie électronique à transmission. Les grilles sont chargées
sur un porte-échantillon dans une chambre de transfert remplie d’azote liquide. Le porte-
149
échantillon est ensuite inséré dans le microscope, dont la colonne a été préalablement
refroidie (~ -180 °C). L’imagerie en cryo-microscopie électronique à transmission est
particulière, puisqu’elle est effectuée sous faible dose d’électrons, afin de limiter les dégâts
d’irradiation sur les coupes vitreuses. En conséquence, les images obtenues présentent un
faible contraste. Plusieurs types de dégâts d’irradiation peuvent être observés en cas de trop
longue ou trop forte exposition aux électrons :
- Amorphisation (si présence de glace cristalline).
- Bubbling, lié à la libération de radicaux libres par la matière organique (Figure 1D-2E
et F). Il peut être utilisé pour vérifier la présence de matière organique associée à des
phases minérales.
- Sublimation de l’eau conduisant à une perte de masse. Ce dégât d’irradiation
augmente le contraste mais diminue fortement la résolution.
Pour éviter ces dégâts d’irradiation, une dose d’environ 10 électrons par Ų est couramment
utilisée. De plus, afin de limiter le temps d’exposition, la mise au point est effectuée sur une
zone différente de la zone à imager, et un nombre minimum d’images est pris sur une zone
donnée.
L’état vitreux des coupes est contrôlé en acquérant un diagramme de diffraction
électronique dans la coupe. Une glace vitreuse (Figure 1D-2B) présente des anneaux diffus.
Des spots de diffraction apparaissent lorsque la glace est cristalline.
La résolution maximale qui peut être obtenue en cryo-TEM est de l’ordre de 9-15 Å.
Des séries focales sont réalisées (défocalisation à différents ∆z) afin d’imager les structures
d’intérêt.
Les images obtenues nécessitent une interprétation, en particulier des artefacts induits par
la coupe (Figure 1D-2) :
- Les marques de couteau, très superficielles (donc n’affectant pas la structure des objets
congelés), indiquent la direction de coupe (Figure 1D-2G). Ces marques disparaissent
lorsque la zone a reçu une dose trop forte d’électrons. Cet artefact est donc un bon
indice de la dose d’électrons reçue par la zone imagée.
- La compression modifie l’épaisseur des structures coupées dans une direction (dans la
direction de coupe, indiquée par les marques de couteau, Figure 1D-2G). Elle dépend
de l’épaisseur de la coupe et de l’angle du couteau. Elle est cependant
unidirectionnelle et localement assez constante. Elle peut être quantifiée en comparant
l’épaisseur de structures organiques (par exemple la paroi cellulaire) dans la direction
de coupe (maximum de compression) et dans la direction orthogonale (minimum de
150
compression). Cette compression doit être prise en compte lors de la détermination de
l’épaisseur de structures cellulaires.
- Les crevasses, limitées pour les coupes moins épaisses (< 50 nm), indiquent le sens de
la coupe (Figure 1D-2H). Elles peuvent fortement détériorer l’organisation interne des
structures coupées.
- Les ondulations à grande distance (~500 nm) sont liées à des problèmes de vibration
lors de la coupe. Elles peuvent être contrôlées en jouant sur la vitesse de coupe.
bc
c
mc
5 µm
A
100 nm
D
C
g
100 nm
mc
E
b
100 nm
F
b
mc
100 nm
Marques de couteau
-
Direction
de coupe
Compression
Mesure d’épaisseur
G
100 nm
H
Sens de coupe
Aplati
Courbé
500 nm
B
100 nm
g
bc
c
mc
5 µm
A
100 nm
D
C
g
100 nm
mc
E
b
100 nm
F
b
mc
100 nm
Marques de couteau
-
Direction
de coupe
Compression
Mesure d’épaisseur
G
100 nm
H
Sens de coupe
Aplati
Courbé
500 nm
B
100 nm
bc
c
mc
5 µm
A
100 nm
D
C
g
100 nm
mc
E
b
100 nm
F
b
mc
100 nm
Marques de couteau
-
Direction
de coupe
Compression
Mesure d’épaisseur
G
100 nm
H
Sens de coupe
Aplati
Courbé
500 nm
B
100 nm
bc
c
mc
5 µm
A
bc
c
mc
5 µm
A
100 nm
D
100 nm
D
C
g
100 nm
mc
C
g
100 nm
mc
E
b
100 nm
E
b
100 nm
F
b
mc
100 nm
F
b
mc
100 nm
Marques de couteau
-
Direction
de coupe
Compression
Mesure d’épaisseur
G
100 nm
Marques de couteau
-
Direction
de coupe
Compression
Mesure d’épaisseur
G
100 nm
H
Sens de coupe
Aplati
Courbé
500 nm
H
Sens de coupe
Aplati
Courbé
500 nm
B
100 nm
B
100 nm
g
Figure 1D-2. Principaux artefacts de coupe et dégâts d’irradiation interprétés dans des
cryosections. (A) : Vue à bas grandissement d’une cryosection (c) déposée sur une grille
MET (bc=barreau de cuivre de la grille MET), recouverte d’une membrane de carbone à trous
(mc) de type Lacey. (B) : Détail d’une cryosection partiellement dévitrifiée, aspect de la
151
glace cristallisée. (C) : Contamination à la surface d’une cryosection : dépôt d’un cristal de
glace (g). (D) : Drift. L’encart montre la transformée de Fourier de la zone imagée, qui
présente une anisotropie marquée dans la direction de déplacement de la coupe. (E) et (F) :
Bubbling (b) de la matière organique respectivement dans une vésicule lipidique et dans des
filaments polysaccharidiques partiellement minéralisés. (G) : Utilisation des marques de
couteau pour déterminer la direction de coupe. Mise en évidence de la compression
orthogonalement à la direction de coupe et indication de la zone où pourrait être mesurée une
épaisseur. (H) : Mise en évidence du sens de coupe et interprétation des déformations subies
par les cellules (aplatissement et courbure).
• Structures cellulaires identifiables en CEMOVIS. Contrairement aux méthodes
classiques d’inclusion en résine (voir Protocoles p. 261), le CEMOVIS préserve les
échantillons dans un état hydraté-congelé, sans aucun traitement chimique préalable. Des
structures habituellement dégradées par les traitements chimiques imposés par l’inclusion en
résine peuvent alors être observées. En particulier, toute la complexité de la structure de la
paroi cellulaire est révélée par cette technique (Figure 1D-3A et B). On peut en effet
distinguer la présence d’une ligne de granules légèrement plus denses que le dextran dans le
périplasme, i.e. l’espace compris entre la membrane plasmique et la membrane externe. En
outre, des structures extracellulaires telles que des exopolysaccharides, peuvent également
être préservés, tandis qu’ils sont presqu’inévitablement dégradés par les méthodes d’inclusion
en résine. Différentes structures peuvent être distinguées dans le cytoplasme des bactéries :
des inclusions lipidiques (stockage intracellulaire), l’ADN partiellement condensé, les
ribosomes (Figure 1D-3C). Enfin, les différents stades de la division cellulaire, incluant la
mise en place de septae (invagination de la paroi cellulaire qui se met en place lors de la
division cellulaire), peuvent également être imagés (Figure 1D-3D et E).
152
100 nm
Mem
bran
e in
tern
e
Mem
bran
e ex
tern
e
Pep
tidogl
ycan
e
Pér
ipla
sme
50 nm
ADN
VL
r
100 nm 500 nm
mc
100 nm
A B
C D E
100 nm
Mem
bran
e in
tern
e
Mem
bran
e ex
tern
e
Pep
tidogl
ycan
e
Pér
ipla
sme
50 nm
ADN
VL
r
100 nm 500 nm
mc
100 nm
A B
C D E
100 nm
Mem
bran
e in
tern
e
Mem
bran
e ex
tern
e
Pep
tidogl
ycan
e
Pér
ipla
sme
50 nm
ADN
VL
r
100 nm 500 nm
mc
100 nm
100 nm
Mem
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Mem
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VL
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100 nm
ADN
VL
r
100 nm 500 nm
mc
500 nm
mc
100 nm100 nm
A B
C D E
Figure 1D-3. Structures cellulaires observables en CEMOVIS. Images de cryosections de
BoFeN1. (A) et (B) : Structure de la paroi cellulaire. Dans le périplasme, localisée entre la
membrane plasmique et la membrane externe, une ligne de granules correspondant au
peptidoglycane peut être observée. (C) : Cellule dans le cytoplasme de laquelle on peut
observer des vésicules lipidiques (VL), l’ADN partiellement condensé et de nombreux
ribosomes (r). (D) : Fin de division d’une cellule (flèche). (E) : Mise en place d’un septum
lors de la division dans une bactérie en cours d’encroûtement (flèches).
g : cristaux de glace. mc : membrane de carbone.
153
Principaux résultats et perspectives.
Fossilisation de protéines. La paroi cellulaire des bactéries non minéralisées est constituée
d’une membrane plasmique et d’une membrane externe délimitant un périplasme d’une
épaisseur de 41.6±7.2 nm, à l’intérieur duquel on distingue une ligne de granules de 6.6±1.4
nm d’épaisseur correspondant au peptidoglycane. Le peptidoglycane est un polymère de
glycosaminopeptide (liaison de N-acétyl-glucosamine avec l'acide N-acétyl-muramique par
des liaisons osidiques et liaison des chaines osidiques par des peptides) et assure la forme des
cellules ainsi qu’une protection mécanique et physique (e.g. Meroueh et al., 2006). Dans des
cellules complètement minéralisées, on observe que l’épaisseur du périplasme est préservée et
qu’une couche centrale de 6.2±1.5 nm persiste. Nos résultats suggèrent donc qu’il s’agit du
peptidoglycane et qu’il est préservé malgré la formation d’une couche de minéraux riches en
fer dans le périplasme.
Par ailleurs, les résultats de STXM obtenus au seuil K du C indiquent que des protéines sont
effectivement accumulées dans le périplasme des bactéries minéralisées. Les quantités de fer
et de protéines dans le périplasme de ces cellules sont corrélées linéairement, suggérant que
les protéines servent de point de nucléation aux minéraux riches en fer, dont la croissance est
limitée ou inhibée. Ces assemblages protéine-minéral sont directement visualisés en
CEMOVIS, les protéines apparaissant sous forme de globules de 8.2±1.8 nm de diamètre.
L’ensemble de ces résultats prouve que des protéines peuvent être fossilisées et les structures
cellulaires très fines comme le peptidoglycane préservées par des biominéralisations massives
de fer.
Etapes de la biominéralisation du fer dans le périplasme. Les étapes de la biominéralisation
du fer dans le périplasme de BoFeN1 ont été suivies en CEMOVIS. On observe que la
biominéralisation du fer débute dans le périplasme à la surface de la membrane plasmique ou
de la membrane externe. Les premiers nuclei de fer sont localisés en des points discrets de la
membrane. Leur croissance dans le périplasme s’effectue jusqu’à remplissage de toute
l’épaisseur de l’espace périplasmique. La couche biominéralisée de fer est alors discontinue
dans le périplasme. Enfin, à des stades tardifs, le périplasme est totalement encroûté et comme
indiqué précédemment, le peptidoglycane est préservé. Cette succession d’étapes est
cohérente avec les études génétiques de Croal et al. (2007) suggérant la localisation
périplasmique des enzymes impliquées dans l’oxydation du fer chez la souche phototrophe
SW2. En effet, même si cette interprétation reste très indirecte, on peut proposer que les sites
où l’on observe le début de nucléation des phases riches en fer correspondent à ces sites
154
d’oxydation du fer. Dans ce cas, on observe une répartition discontinue des sites d’oxydation
du fer, qui pourrait expliquer la discontinuité de la couche minérale formée à des stades
intermédiaires de biominéralisation.
En complément, il serait intéressant dans le futur d’observer des cellules de la souche
phototrophe SW2 en CEMOVIS afin de tester si d’éventuelles différences morphologiques
(en particulier au niveau de la paroi cellulaire) pourraient expliquer les différences de motifs
de biominéralisation observés entre ces deux souches et afin d’étudier plus en détail
l’ultrastructure des fibres mises en évidence par STXM chez SW2 (Chapitre 1C) ainsi que la
disposition des premiers nuclei de goethite sur ces fibres.
Spectromicroscopie X en conditions hydratées. En complément des résultats présentés dans
l’article qui suit et toujours dans le souci d’observer et d’analyser les cellules biominéralisées
dans des conditions proches des conditions natives, nous avons initié des analyses en STXM
en conditions hydratées. Ces observations préliminaires ont été effectuées au Canadian Light
Source. Les échantillons ont été préparés en boîte à gants, en déposant une goutte de
l’échantillon entre deux fenêtres de nitrure de silicium, scellées avec de l’Epoxy et transférées
en conditions anoxiques dans la chambre du STXM (sous pression atmosphérique d’hélium).
Au seuil K du C, des filaments organiques extracellulaires, similaires aux filaments
d’exopolysaccharides décrits précédemment (voir Chapitre 1A) ont été observés (Figure 1D-
4). Au seuils L2,3 du Fe, on observe cependant que les échantillons pourtant précoces (4 h
après inoculation des souches en présence de Fe(II) dissous) sont très oxydés (Figure 1D-4). Il
est très probable que les dégâts d’irradiation sous le faisceau sont plus importants en
conditions hydratées qu’à sec (en raison de la déshydratation de l’échantillon et des réactions
de photolyse de l’eau). Ces dégâts devront être quantifiés dans le futur afin de tester la
possibilité d’utiliser ce dispositif expérimental pour la détermination du redox du fer en
conditions hydratées à l’échelle sub-micrométrique.
155
Figure 1D-4. Analyse STXM dans l’eau de cellules de BoFeN1 cultivées en présence de
Fe(II) dissous et prélevées 4 h après inoculation. A : Cartographie du carbone organique
obtenue en faisant la soustraction d’une image acquise à 320 eV d’une image acquise à 280
eV. On observe la présence de filaments organiques extracellulaires entre les deux cellules.
B : Cartographie du Fe(II) (bleu) et du Fe(III) (rouge) sur une cellule partiellement
minéralisée. Une décomposition linéaire des spectres XANES enregistrés sur cette bactérie
indique qu’elle est composée à ~ 75% de Fe(III).
200 nm1 µm
A B
200 nm1 µm 200 nm1 µm
A B
156
157
Looking at the first stages of bacteria fossilization: evidences for the preservation of
proteins and cellular ultra-fine structures in microfossils.
Jennyfer Miot, Kirsty MacLellan, Guillaume Morin, Nicolas Boisset, Karim Benzerara.
Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, Institut de Physique du Globe
de Paris, UMR 7590, CNRS, Universités Paris 6 et Paris 7.
140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France.
158
Fossilization is an exceptional process that can preserve very precisely the cellular
structures of multicellular eukaryotes through the replacement of organic matter by
minerals, as exemplified by the famous fossils of soft-bodied organisms from Ediacara
(e.g. Hagadorn et al., 2006, Raff et al., 2006, Yin et al., 2007). In contrast, deciphering
organic remains or imprints of prokaryotes in recent, ancient and extraterrestrial rocks
has been much more challenging and highly debated in the past (e.g. Schopf et al., 2002,
Brasier et al., 2002). This partly relies on the common belief that only very few details of
the ultrastructure of bacteria can be preserved by fossilization. Using a combination of
synchrotron-based X-ray microscopy and transmission electron cryo-microscopy, we
provide here an unprecedented view of protein-mineral assemblages formed during the
very first steps of fossilization of iron-oxidizing bacteria. Iron minerals precipitated
within the periplasm of these Gram-negative bacteria entomb protein globules as well as
the peptido-saccharidic polymers constituting the peptidoglycan. This provides strong
constraints on the mechanisms of biomineralization of microorganisms and highlights
very fine biochemical and structural details from bacteria that can be preserved during
the early stages of fossilization and that may have been overlooked so far.
159
The finding of microfossils and/or mineral by-products formed by iron-oxidizing
bacteria may constitute evidences for the crucial role these bacteria may have played in the
past geochemical cycles and especially in the formation of Proterozoic massive iron deposits
known as Banded Iron Formations (Little et al., 2004, Konhauser, 1998; Kappler et al., 2005;
Posth et al., 2008). Indeed, iron-oxidizing bacteria produce a wide diversity of iron
biominerals with unique morphologies (Fortin & Langley, 2005). However, those criteria
remain ambiguous as complex morphologies can also be produced by abiotic processes
(Garcia-Ruiz et al., 2003). Iron minerals precipitated by iron-oxidizing bacteria in acidic or
pH-neutral environments are usually in close association with organic templates (Chan et al.,
2004, Miot et al., 2008) and may protect this organic matter from subsequent degradation
during diagenesis or thermal metamorphism (e.g. Kaiser & Guggenberger, 2000). However,
the fineness of the preservation of the organic structures achieved during the very first stages
of fossilization remains unevaluated. Here, we simulate experimentally the taphonomy of
anaerobic neutrophilic Fe-oxidizing bacterial cells by incubating them under specific
conditions where they biomineralize and thus form microfossils. We then analyse the
preservation of their ultrastructure down to the few nm-scale.
We used the anaerobic iron-oxidizing bacteria strain BoFeN1 (Kappler et al., 2005a)
that couples Fe(II) oxidation to nitrate reduction. Due to its high insolubility at neutral pH
(Cornell & Schwertmann, 2003), Fe(III) precipitates instantaneously within the periplasm of
the cells (Miot et al., 2008). The progressive mineralization of BoFeN1 cells was imaged
along the time course of a culture (5 hours to 2 weeks) using thin vitreous cryo-sections
prepared by high-pressure freezing and cryo-ultramicrotomy. Cryo-Electron Microscopy Of
VItreous Sections (CEMOVIS) was used to visualize directly cellular ultrastructures at the
nanometer-scale in their near-native frozen-hydrated state (Dubochet et al., 1983). Non-
mineralized cells observed by CEMOVIS can be observed at every stage of the culture and
exhibit numerous ribosomes, appearing as dense nanometric particles in the cytoplasm, as
well as large electron dense poly-β-hydroxy-butyrate storage granules (Fig. 1A). Additionally,
the cell wall of these cells shows an inner membrane and an undulating outer membrane
enclosing the periplasm. An electron dense granular layer corresponding to the peptidoglycan
can be observed within the periplasmic space (Zuber et al., 2006).
160
Figure 1. CEMOVIS images of BoFeN1 cells at different stages of cell encrustation. A:
Non-mineralized cells. b and c: Mineralization starts at discrete places on the plasmic
membrane, within the periplasm. d: The mineral layer inside the periplasm is initially
discontinuous and grows in thickness. e: Heavily mineralised cells present a completely
mineralized periplasm. Scale bars: 100 nm.
After a few hours of culture in the presence of Fe(II), iron biomineralization intiates at
discrete sites within the periplasm, with iron nanoparticles attached to the periplasmic face of
the inner membrane (Fig. 1B). These particles then aggregate in a discontinuous layer along
the plasmic membrane (Fig. 1C). This layer grows in thickness within the periplasm until
reaching the contact with the outer membrane (Fig. 1D). At ultimate stages (~ 24 hours), the
161
periplasm is completely and continuously encrusted with iron minerals (Fig. 1E). In the latest
stages of biomineralization, iron-rich globules start forming at the outer surface of the cells.
Recent genetic and biochemical studies of the anaerobic phototrophic iron-oxidizing bacterial
strain SW2 suggest that proteins involved in the pathway of iron oxidation may have a
periplasmic location (Jiao & Newman, 2007). Given the high insolubility of Fe(III) at neutral
pH, Fe oxidation and the precipitation of Fe(III) by-products may occur at the same location.
Hence, supporting Jiao & Newman (2007) results, the discrete sites on the inner membrane
where biomineralization is shown to initiate in BoFeN1 cells may correspond to the sites of
active iron oxidation.
Cells at the latest stages of biomineralization (older than 1 day) are good
candidates to represent microfossils that could be looked for in the fossil record: highly
insoluble iron-minerals fill the whole periplasm and hence preserve the morphology of these
cells. By acquiring iron and carbon maps with a 25-nm spatial resolution using STXM, we
moreover observed that organic molecules are fossilized by iron-minerals within the
periplasm of BoFeN1 cells (Fig. 2). In addition, NEXAFS (Near-Edge X-ray Absorption Fine
Structure) spectra measured at the C K-edge on mineralized cells show that this organic
carbon trapped within Fe-minerals in the cell wall corresponds mainly to proteins. In contrast,
non-mineralized cells exhibit a fairly homogeneous distribution of proteins within the
cytoplasm and the cell wall. Eventually, we demonstrate a linear correlation between the iron
and the protein contents within the cell wall of Fe-mineralized cells (Fig. 3). This supports
unambiguously the association of Fe-minerals with proteic moieties at the nanometer-scale.
162
Figure 2. Overlay organic carbon- and iron-maps of mineralized and non mineralized cells
and corresponding XANES spectra at the C K-edge compared with reference albumin. The
periplasm of mineralized cells is enriched in proteic moieties. Scale bar: 500 nm.
Figure 3. Fe and organic C correlations on mineralized BoFeN1 cells, demonstrating the
linear relation between the Fe and organic carbon contents on these cells.
These protein-Fe associations were further studied down to the nanometre scale using
CEMOVIS. In non-mineralized cells (e.g. BoFeN1 cell grown without Fe(II)), the periplasm
has a thickness of 41.6±7.2 nm and encloses the peptidoglycan that appears as a 6.6±1.4 nm-
thick electron-dense granular layer (Fig. 4A). The periplasm and the peptidoglycan are
perfectly preserved in completely mineralized cells. First, the periplasm thickness (39.4±7.7
163
nm) in mineralized cells is similar to the one measured in non-mineralized cells. Second, the
peptidoglycan can be recognized in the mineralized cells as it exhibits the same thickness
(6.2±1.5 nm), the same absolute electron density (which appears electron-transparent
relatively to surrounding electron-dense iron-rich minerals) and the same relative position
within the periplasm relatively to the two membranes as in non-mineralized cells. Finally, the
periplasm of highly mineralized cells shows a very granular texture (Fig. 5) with numerous
round-shaped granules of low density to electrons that measure 8.2±1.8 nm in diameter.
Based on STXM analyses and on their morphology, size and density to electrons, these
granules can be unambiguously identified as globular proteins encapsulated within iron
biominerals.
The identity of the proteins stored within the periplasm of BoFeN1 is not known but
reference to known proteins which notoriously impact the biomineralization of iron provides
some ideas on the possible processes that might account for the formation of the mineral-
protein assemblages evidenced in the present study. For example, proteins such as DNA-
protecting proteins during starvation (Dps) or eubacterial ferritins, which have a similar
morphology and size (inner and outer core diameter of 12 and 8 nm respectively) with the
granules observed in BoFeN1 (Fig. 5) can store up to 1000 iron atoms, in the form of
ferrihydrite or Fe-phosphate in Bacteria (Chasteen & Harrison, 1999) and Archea (Zeth et al.,
2004). Similarly, specific proteins such as those ferritins or the protein Mms6 in the
magnetotactic bacteria Magnetospirillum magneticum AMB-1 can act as an organic template
for iron mineral nucleation (Chasteen & Harrison, 1999, Zeth et al., 2004, Amemiya et al.,
2007). Based on what is known from these model proteins, the following scenario of iron
biomineralization in BoFeN1 periplasm can be proposed: iron nucleation initiates on
negatively charged residues exposed on the inner face of the proteins bound to the periplasmic
face of the inner membrane. At the same time, proteins progressively accumulate within the
periplasm, most probably upon cell aging (Lindner et al., 2008) and serve as additional sites
for iron nucleation. Once the iron nanoparticles have reached a critical size, mineral growth
proceeds, but is limited and results in very small mineral phases. This scenario is consistent
with the linear relationship between Fe and protein contents evidenced in mineralized
BoFeN1 cells and with the subtleness of the preservation of cellular ultrastructures.
164
Figure 4. Histograms of the intensity of electron density along A-B profiles in the cell wall
of non-mineralized (A) and mineralized (B) BoFeN1 cells (CEMOVIS images). The location
and thickness of the plasma membrane, the outer membrane and the periplasm are displayed.
The periplasm and the peptidoglycan are preserved in heavily mineralized cells. Scale bars:
100 nm.
165
Figure 5. CEMOVIS image of a mineralized BoFeN1 cell highlighting the presence of
electron-transparent globules of 8.2 ± 1.8 nm in diameter (inset) interpreted as protein
globules. Scale bar: 100 nm.
Whereas usual criteria of biogenicity rely on morphology or isotopic fractionations
(that are often difficult to attribute unequivocally to bacterial activity, especially in the case of
iron fractionation, Croal et al., 2004), processes such as iron biomineralization appear to be
efficient in sequestering organic molecules within iron minerals and in preserving very fine
ultrastructures such as the peptidoglycan. Although the preservation of such features after
diagenesis and metamorphism has yet to be investigated, proteins and the peptidoglycan
might be efficiently preserved by the iron minerals that armour them (e.g. Kaiser &
Guggenberger, 2000) and the latter in turn might be protected from recrystallization by
organic molecules (Kennedy et al., 2004).
High-resolution (spectro)microscopy analyses on modern bacterial systems should
promote a better understanding of the mechanisms of biomineralization and improve our
knowledge of potential biosignatures that might be looked for in the geological record.
166
Materials and Methods.
Bacterial strain and growth conditions
The nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing strain BoFeN1, isolated from Lake Constance littoral
sediments (Kappler et al., 2005a), was cultivated in freshwater mineral medium prepared after
Ehrenreich & Widdel (1994), containing 4.3 mM phosphate. BoFeN1 was grown in this
medium complemented with 5 mM acetate (provided as sodium acetate) and 10 mM nitrate
(provided as sodium nitrate) in the presence or absence of Fe(II) (provided as FeCl2). The
addition of Fe(II) at a total concentration of 10 mM led to the precipitation of a white Fe-rich
precipitate resulting in a dissolved Fe(II) concentration of ~ 3 mM. For each culture, 25 mL of
medium were transferred into a 58 mL serum bottle that was flushed with N2/CO2 (80% /
20%), closed with a butyl rubber stopper and crimped. BoFeN1 was inoculated at 10% from
an acetate-nitrate-grown culture (culture without iron). Cultures were incubated at 30°C. For
X-ray Absorption Spectroscopy (XAS), X-ray Diffraction (XRD) and Scanning Transmission
X-ray Microscopy (STXM) analyses, samples of the same culture were taken in an O2-free
glove-box (pO2 < 50 ppm) at several time steps.
Synthesis of model compounds
The Fe redox state of the samples was determined at the submicrometer-scale by using
STXM at the Fe L2,3-edges. The Fe(II) and Fe(III) reference end-members used for this study
were pure Fe(II)- and Fe(III)-phosphates. Both were synthesized under anoxic conditions.
Fe(II)-phosphate was obtained by addition of 10 mM Fe(II) (as FeCl2), 5 mM acetate and 10
mM nitrate in the growth medium, which led to the precipitation of a whitish Fe(II)-phosphate
phase. Fe(III)-phosphate was obtained by the addition of 10 mM Fe(III) (as FeCl3), 5 mM
acetate and 10 mM nitrate in the growth medium. Both precipitates were rinsed twice with
degassed distilled water and dried under vacuum inside an anoxic glove-box.
Scanning Transmission X-ray Microscopy.
The samples were constantly kept under an anoxic atmosphere from preparation to
transfer and analysis within the STXM microscope, following the method detailed in Miot et
al. (2008). The entire preparation was performed in an anoxic glove-box. 1 mL of a
suspension of BoFeN1 culture (or of reference compounds) was sampled at different stages of
each culture (3 h to 15 days). Each sample was rinsed twice in degassed distilled water. 0.3
µL of each sample was dried on a silicon nitride window, then sandwiched by addition of a
167
second silicon nitride membranes (Norcada Inc., Canada), the whole sealed under an anoxic
atmosphere using epoxy.
STXM analyses were performed at the spectromicroscopy beamline 10ID-1 at the
Canadian Light Source (CLS, Saskatoon). The beamline 10ID-1 at the CLS was described in
detail by Kaznatcheev (2007). This beamline has an energy resolving power E/∆E > 3000.
The energy scales for this study were calibrated using the well-resolved 3p Rydberg peak of
gaseous CO2 for the C K-edge and the major peak of hematite at 708.7 eV for the Fe L3-edge.
Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edges. They were
performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the
energy range of interest. Potential sample damages caused by the incident photon beam (i.e.
changes of the Fe redox state) were quantified by monitoring spectral changes at the Fe L2,3-
edge with increasing dwell times up to several tens of ms (Miot et al., 2008). However, no
significant changes were observed for typical dwell times used during analyses of the samples
(i.e. around 0.8 ms per energy- and image-point). The aXis2000 software-package
(Hitchcock, 2001) was used for processing image stacks and NEXAFS spectra. Images were
recorded on transmission scale and converted into optical density (OD) according to Equation
(2).
OD = -ln(I/I0) (Eqn. 2)
wherein I represents the measured intensity at the point of interest and I0 represents the
intensity outside the sample that includes the absorption by silicon nitride windows.
XANES spectra were extracted from the stacks on regions of interest. For Fe L2,3-
edges spectra, we normalized the area below the L2 and L3 edges to 1 and multiplied the
absorbance of the compounds containing mainly Fe(II) (major peak at 707 eV) by a 4/5
correction factor to take into account the difference in the occupancy of the 3d orbitals in Fe2+
and Fe3+
ions, neglecting the variation of radial integrals (Thole et al., 1994). We fitted the
normalized spectra with linear combinations of the normalized reference spectra of the Fe(II)-
and Fe(III)-phosphate model compounds, applying the CGO (Conjugate Gradient
Optimization method) curve fit routine in Axis2000. Fit results allowed estimating the
Fe(III)/Fe(total) content of regions of interest. Standard deviations (SD) were calculated from
the deviation between the fit and the data and were systematically less than 1%.
Spectra recorded at the C K-edge were normalized to 1-nm thickness and fit with
normalized reference albumin (protein) and xanthan (polysaccharide).
Using aligned stacks recorded at the Fe L-edges and at the C K-edge on the same area
and normalized reference spectra, we calculated Fe and C-speciation maps from image stacks
168
by singular value decomposition using the stack fit routine in aXis2000. The algorithm fits the
spectra of each individual pixel with a linear combination of the two normalized reference
spectra plus a constant, accounting for the absorption background. We subsequently obtained
numbers that are proportional to the amount of iron and of organic carbon for each pixel of
this area. Those values are then used to plot the amount of C relatively to the amount of Fe at
each pixel of the area (~2500 pixels in total) and assess the existence of possible correlations
(see Wan et al., 2007 for additional explanations).
Vitrification and high pressure freezing.
Samples of BoFeN1 grown in the presence or absence of Fe(II), as described above, were
mixed with high molecular weight dextran (approximate mass 40kDa, Sigma-Aldrich, Buchs,
Switzerland) to give a 20% solution (v/v). Samples were placed into an aluminum planchette
with (Ø 2.0 mm sample cavity depth 100 µm; Waldner, Uetliburg, Switzerland) prior to
vitrification in a HPM 010 high pressure freezer (Bal-Tech, Baltzers, Liechtenstein).
Cryosectioning.
The planchettes were loaded into a FCS Ultracut S cryomicrotome held at -140°C (Leica) and
were trimmed at -140°C using a tungsten knife (Leica) followed by a diamond knife
(Diatome). Ultrathin sections were produced with a 35° cryo-immuno diamond cutting knife
(Diatome, Biel, Switzerland) at a nominal feed of 50 nm with a cutting speed of 0.8 mm/s.
Cryo-electron microscopy of vitreous sections.
Sections were transferred onto Lacey carbon covered 1,000-mesh copper grids (Agar
Scientific, Essex, United Kingdom). The grids were transferred into a Gatan cryo-holder
(Gatan, Warrendale, PA) kept at a temperature below −170°C and inserted into a Jeol 2100F
cryo-electron microscope (Jeol) equipped with a LaB6 cathode at an accelerating voltage of
200 kV. The electron dose was kept to a minimum during observation and recording. Images
were recorded at nominal magnifications ranging from 7,000 to 25,000 using a 2K CCD
camera (Gatan Inc, USA).
169
References.
Amemiya Y., Arakaki A., Staniland SS., Tanaka T., Matsunaga T. (2007) Controlled
formation of magnetite crystal by partial oxidation of ferrous hydroxide in the presence of
recombinant magnetotactic bacterial protein Mms6. Biomaterials. 28, 5381-5389.
Chan C.S., De Stasio G., Welch S.A., Girasole M., Frazer B.H., Nesterova M.V., Fakra S. and
Banfield J.F. (2004) Microbial polysaccharides template assembly of nanocrystal fibers.
Science, 303, 1656-1658.
Brasier, M. D., Green, O. R., Jephcoat, A. P., Kleppe, A. K., Van Kranendonk, M. J., Lindsay,
J. F., Steele, A., and Grassineau, N. V. (2002) Questioning the evidence for Earth's oldest
fossils. Nature 416, 76-81.
Chasteen ND., Harrison PM. (1999) Mineralization in ferritin: an efficient means of iron
storage. Journal of Structural Biology, 126, 182-194.
Cornell R.M. and Schwertmann U. (2003) The iron oxides: structure, properties, reactions,
occurrences and uses. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, Weinheim, Germany.
Croal L.R., Johnson C.M., Beard B.L. and Newman D.K. (2004) Iron isotope fractionation by
Fe(II)-oxidizing photoautotrophic bacteria. Geochim. Cosmochim. Acta, 68, 1227-1242.
Dubochet J., McDowall AW., Menge B., Schmid EN., Lickfeld KG. (1983) Electron
microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology, 155, 381-390.
Fortin D. and Langley S. (2005) Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals.
Earth Sc. Rev., 72, 1-19.
Garcia-Ruiz JM., Hyde ST., Carnerup AM., Christy AG., Van Kranendonk MJ., Welham NJ.
(2003) Self-assembled silica-carbonate structures and detection of ancient microfossils.
Science, 302, 1194-1197.
Hagadorn JW, Xiao SH, Donoghue PCJ, Bengtson S, Gostling NJ, Pawlowska M, Raff EC,
Raff RA, Turner FR, Chongyu Y, Zhou C, Yuan X, McFeely MB, Stampanoni M, Nealson
KH (2006) Cellular and subcellular structure of neoproterozoic animal embryos. Science, 314,
291-294.
Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The pio operon is essential for phototrophic Fe(II)
oxidation in Rhodopseudomonas palustris TIE-1. J. Bacteriol., 189, 1765-1773.
Kaiser K., Guggenberger G. (2000) The role of DOM sorption to mineral surfaces in the
preservation of organic matter in soils. Organic Geochemistry, 31, 711-725.
170
Kappler A., Schink B. and Newman D.K. (2005a) Fe(III) mineral formation and cell
encrustation by the nitrate-dependent Fe(II)-oxidizer strain BoFeN1. Geobiology, 3, 235-245.
Kappler A., Pasquero C., Konhauser K.O. and Newman D.K. (2005). Deposition of Banded
Iron Formations by photoautotrophic Fe(II)-oxidizing bacteria. Geology, 33, 865-868.
Konhauser K.O. (1998) Diversity of bacterial iron mineralization. Earth Sc. Rev., 43, 91-121.
Lindner A.B., Madden R., Demarez A., Stewart E.J. and Taddei F. (2008) Asymmetric
segregation of protein aggregates is associated with cellular aging and rejuvenation. PNAS,
105, 3076-3081.
Little C.T.S., Glynn S.E.J. and Mills R.A. (2004) Four-hundred-and-ninety-million-year
record of bacteriogenic iron oxide precipitation at sea-floor hydrothermal vents.
Geomicrobiol. J., 21, 415-429.
Miot J, Benzerara K, Morin G, Kappler A, Bernard S, Obst M, Férard C, Skouri-Panet F,
Guigner JM, Posth N, Galvez M, Borwn Jr GE, Guyot F (2008) Iron biomineralization by
neutrophilic iron-oxidizing bacteria. Geochimica et Cosmochimica Acta, in press.
Posth N.R., Konhauser K.O. and Kappler A. (2008) Microbiological Processes in BIF
Deposition. Journal of Sedimentology, in press.
Raff EC, Villinski JT, Turner FR, Donoghue PCJ, Raff RA (2006) Experimental taphonomy
shows the feasibility of fossil embryos. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 103, 5846-5851.
Schopf, J. W., Kudryavtsev, A. B., Agresti, D. G., Wdowiak, T. J., and Czaja, A. D. (2002)
Laser-Raman imagery of Earth's earliest fossils. Nature 416, 73-76.
Yin LM, Zhu MY, Knoll AH, Yuan XL, Zhang JM, Hu J (2007) Doushantuo embryos
preserved inside diapause egg cysts. Nature, 446, 661-663.
Zeth K., Offermann S., Essen LO., Oesterhelt D. (2004) Iron-oxo clusters biomineralizing on
protein surfaces: Structural analysis of Halobacterium Salinarum DpsA in its low- and high-
iron states. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 101, 13780-13785.
Zuber B., Haenni M., Ribeiro T., Minnig K., Lopes F., Moreillon P., Dubochet J. (2006)
Granular layer in the periplasmic space of Gram-positive bacteria and fine structures of
Enterococcus gallinarum and Streptococcus gordonii septa revealed by cryo-electron
microscopy of vitreous sections. Journal of Bacteriology, 188, 6652-6660.
171
Chapitre 1.E.
Etude préliminaire de la viabilité des cellules BoFeN1 lors de la
biominéralisation du fer
Problématique et objectifs. Au cours des chapitres précédents, nous avons abondamment
analysé les processus de biominéralisation au cours de l’oxydation du Fe(II) par BoFeN1. En
particulier, la précipitation de minéraux riches en fer dans le périplasme a été mise en
évidence (Chapitre 1A) et les étapes de cet encroûtement périplasmique ont été détaillées
(Chapitre 1D). La minéralisation du périplasme soulève cependant des questions
fondamentales d’importance. En effet, le périplasme est le lieu de transit de l’ensemble des
molécules prélevées ou exportées par la cellule depuis ou vers le milieu extérieur, en
particulier les nutriments et les déchets ou molécules toxiques (Nikaido, 2003). Son
encroûtement pourrait donc limiter les échanges avec le milieu extracellulaire. En
conséquence, l’encroûtement périplasmique de la bactérie BoFeN1 pourrait être létal.
Pourtant, nous avons fait différentes observations troublantes vis-à-vis de ce problème : tout
d’abord, il semble que l’on peut propager cette culture sur plusieurs générations, ce qui
indique qu’il reste des cellules vivantes même après plusieurs repiquages. De plus, nous avons
par exemple observé en microscopie de nombreuses cellules encroûtées en cours de division
(Figure 1E-2), ce qui pourrait signifier soit que l’encroûtement est plus rapide que le
processus de division, soit qu’une cellule peut se diviser même lorsqu’elle encroûtée. Enfin,
alors que certains ont proposé que l’encroûtement chez BoFeN1 est létal (peut-être en raison
d’une moins bonne adaptation de ces souches à l’oxydation du fer), on peut aussi imaginer
que l’encroûtement aurait lieu après la mort des cellules et n’aurait donc aucune conséquence
sur la viabilité. Des problématiques similaires ont été posées avec d’autres microorganismes
(e.g. Dupraz et al., soumis), dont certains utiliseraient la biominéralisation de structures
organiques comme protection contre l’encroûtement (Phoenix & Konhauser, 2008, Caldwell
& Caldwell, 2004, Schultze-Lam et al., 1992). L’ensemble de nos observations sur la souche
BoFeN1 nous a amené à tester plusieurs méthodes et à mettre au point des protocoles
spécifiques pour évaluer la viabilité des cellules de BoFeN1 au cours du processus de
biominéralisation du fer.
172
Méthodologie.
Suivi de la croissance bactérienne et de l’encroûtement. Pour suivre l’évolution de
l’encroûtement des cellules au cours de la culture, des observations ont été effectuées au MET
en mode STEM. Du fait de la sensibilité de ce mode d’imagerie aux éléments lourds (qui
apparaissent blancs sur les images de MET), en particulier au Fe, les cellules encroûtées
peuvent être repérées rapidement. Des comptages du nombre de cellules encroûtées et du
nombre de cellule en cours de division (chacun effectué en duplicat, sur deux cultures
indépendantes) ont été effectués par cette technique à différents pas de temps au cours de la
culture de BoFeN1 en présence de Fe(II) dissous à une concentration initiale de 4-6 mM.
En outre, nous avons cherché à suivre l’évolution de la croissance bactérienne et de la
viabilité des cellules au cours de ces cultures. En raison de l’apparition de minéraux dans les
cultures réalisées en présence de fer, qui contribuent à troubler le milieu, il n’a pas été
possible de suivre la croissance bactérienne par les techniques classiques de
spectrophotométrie (e.g. OD 600 nm). Nous avons donc utilisé deux autres approches : la
première a consisté à suivre au cours du temps l’évolution de la concentration des protéines
solubles obtenues après lyse des cellules (voir Protocole p. 261). Celle-ci est au premier ordre
reliée directement à la quantité de cellules. Cependant, il n’est pas possible ainsi de distinguer
les cellules vivantes des cellules mortes non lysées. La deuxième approche a donc consisté à
suivre spécifiquement le nombre de cellules viables par étalement sur milieu solide (voir
Protocole p. 261). Cette seconde approche est détaillée ci-dessous.
Estimation de la viabilité à l’échelle de la population – Cultures en milieu solide.
L’estimation du nombre de cellules viables consiste à effectuer des étalements sur un milieu
solide de cellules prélevées à différents stades de la culture en présence de Fe(II) dissous.
Pour cela, un protocole de culture de BoFeN1 sur milieu solide en conditions anoxiques
strictes a été développé (voir Protocoles, p. 261). L’étalement sur milieu solide des cellules
prélevées dans la culture liquide à différents pas de temps conduit au développement de
colonies. En faisant l’hypothèse que chaque bactérie vivante au moment de l’étalement forme
une colonie par divisions successives (Colony Forming Unit, CFU), on peut évaluer le
nombre de bactéries viables au moment de l’étalement. Les colonies sont comptées après un
temps d’incubation de la boîte (à 30 °C) de 10 jours minimum. Ces expériences peuvent
donner des indications sur la relation viabilité/encroûtement à l’échelle de la population
bactérienne.
173
Modélisation des courbes de croissance bactérienne. Une approche de la relation
viabilité/encroûtement consiste à modéliser la courbe de croissance bactérienne à l’aide d’un
modèle testant l’effet létal ou non de l’encroûtement. C’est avec cet objectif que les courbes
obtenues par dosage des protéines dans les cultures de BoFeN1 en présence ou en l’absence
de Fe(II) dissous ont été fittées à l’aide d’une équation logistique du type :
K
NKrN
dt
dN )( −= (Eqn. 1)
où : N est la quantité de protéines à un temps t,
r, le taux d’accroissement, i.e. taux de natalité - taux de mortalité.
K, la charge biotique maximum.
Cette équation s’intègre sous la forme :
)exp(1 rta
KN
−+= (Eqn. 2)
Avec : a = ln(K − No
No) et N0, la quantité initiale de protéines (inoculum).
Les simulations peuvent être interprétées en relation avec les courbes d’encroûtement et les
courbes de viabilité obtenues à l’aide des cultures en milieu solide (voir infra).
Principaux résultats.
Effet du fer sur la courbe de croissance bactérienne. Les courbes d’accroissement du
nombre de protéines totales obtenues sur des cultures en présence ou en l’absence de Fe(II)
dissous ont été simulées à l’aide de l’équation logistique (Eqn. 2, Figure 2E-1). Les résultats
numériques des fits sont donnés en Table 1E-1. Ils indiquent que la concentration de protéines
totales suit une loi logistique, classiquement obtenue pour les croissances bactériennes, avec
une phase de latence initiale, une phase exponentielle de croissance et enfin une phase
stationnaire. Ils montrent en outre que la charge biotique maximale (K) en l’absence de fer est
assez proche de celle estimée en présence de fer. La quantité finale de protéines est donc
relativement similaire en présence ou en l’absence de fer dans les cultures. De même, le taux
d’accroissement (r) n’est pas significativement différent dans les deux conditions de culture.
Des courbes de croissance mieux résolues dans la phase exponentielle pourraient cependant
permettre d’évaluer si les cultures suivent finement cette croissance de type logistique ou si
des écarts à cette loi, en particulier dans les cultures en présence de fer, peuvent être observés.
174
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5
Co
nc
en
tra
tio
n e
n p
roté
ine
s,
µg
.L-1
Temps, jours
Figure 2E-1. Courbes d’accroissement de la quantité totale de protéines de BoFeN1 cultivée
en l’absence (○) ou en présence de Fe(II) dissous à 5 mmol.L-1
(■). Les courbes en pointillés
correspondent aux fits par une équation logistique, dont les résultats numériques sont donnés
en Table 1E-1.
Culture K r N0 χχχχ² R
Sans Fe(II) 25.9±0.2 4.0±0.2 2.0±0.3 0.15 0.9998
5 mM Fe(II) 22.1±0.6 4.7±1.5 0.8±1.1 2.4 0.996
Table 1E-1. Résultats des fits des courbes d’accroissement de la quantité totale de protéines
de BoFeN1 présentées en Figure 2E-1 par une équation logistique (Eqn. 2). K, charge biotique
maximale ; r, taux d’accroissement ; N0, concentration initiale ; χ², moindres carrés du fit ; R,
coëfficient de régression du fit.
Relation avec l’évolution du nombre de bactéries encroûtées. Bien que la présence de fer
dans le milieu de culture ne semble pas modifier fondamentalement l’allure des courbes
d’accroissement de la quantité totale de protéines (au moins au premier ordre), nous avons
observé en MET, tout au long de ces cultures, de nombreuses cellules encroûtées, dont
certaines présentent des figures de division (Figure 1E-2). Ces cellules sont aisément repérées
en STEM grâce au contraste du fer. Selon le stade de croissance de la culture au moment de
l’observation, les cellules en cours de division peuvent être seulement partiellement (Figure
1E-2A) ou totalement (Figure 1E-2B) encroûtées dans le périplasme. Nous avons également
observé une cellule en début de division partiellement encroûtée en CEMOVIS. Une seule
175
cellule présentant ces caractéristiques a pu être imagée, malgré l’acquisition de plusieurs
centaines d’images. La probabilité d’obtenir une coupe d’une cellule encroûtée en cours de
division dans le plan passant par le septum est en effet très faible. Il est intéressant de noter
qu’on observe de nouveau l’initiation de la minéralisation dans le périplasme en des sites
discrets (voir Chapitre 1D). En outre, on observe l’absence de minéralisations sur les portions
de membranes constituant le septum.
Nous avons également quantifié l’évolution du nombre de cellules encroûtées au cours de ces
cultures et l’avons comparé à l’évolution de la croissance bactérienne et au nombre de cellules
en cours de division estimé en STEM (Figure 1E-3). Nous observons de façon reproductible
un maximum d’encroûtement des cellules (proche de 100%) en pleine phase exponentielle de
croissance, après 1 jour de culture. Ce stade coïncide avec le maximum de cellules en cours
de division estimé en STEM. Ces observations posent clairement la question de la viabilité de
ces cellules encroûtées.
Figure 1E-2. Figures de division observées sur des bactéries BoFeN1 encroûtées. A et B : images STEM de bactéries issues de cultures âgées de 30 minutes et de 3 jours
respectivement, dont le périplasme est en cours d’encroûtement (A) ou complètement
encroûté (B). C : Image de CEMOVIS d’une coupe de cellule en cours de division et
d’encroûtement. On observe des particules de fer (denses aux électrons) dans le périplasme et
la mise en place d’un septum. On peut noter l’absence de particules minérales dans le septum.
Septum
50 nm
A B
C
Septum
50 nm
Septum
50 nm
Septum
50 nm
A B
C
176
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Temps30min 3h 6h 1 jour 3 jours 6 jours
Figure 1E-3. Evolution du nombre de cellules encroûtées et du nombre de cellules en
division estimée en STEM au cours d’une culture de BoFeN1 en présence de 5 mmol.L-1
de
Fe(II) dissous. En blanc : rapport du nombre de cellules encroûtées sur le nombre total de
cellules imagées. En noir : rapport du nombre de cellules en cours de division sur le nombre
total de cellules imagées. Les barres d’erreur ont été calculées correspondent à l’écart-type
calculé à partir de deux séries d’observation sur deux cultures indépendantes.
Viabilité et encroûtement. L’évolution de la viabilité bactérienne a été suivie au cours de
cultures réalisées en présence ou en l’absence de Fe(II) dissous, en effectuant des étalements
sur milieu solide à différents stades de ces cultures (Figure 1E-4). Le nombre de cellules
viables initial est similaire dans les deux conditions de culture. Après 1 jour de croissance
(phase exponentielle), on observe dans les deux cas une augmentation du nombre de cellules
viables d’un facteur 10 par rapport au nombre de cellules viables inoculées, c’est-à-dire que la
croissance a compensé le facteur de dilution utilisé lors de l’inoculation (inoculations au
1/10). Cependant, si le nombre de viables reste ensuite constant (pendant les 4 jours
d’observation) dans les cultures en l’absence de fer, il chute dans les cultures en présence de
fer dès le deuxième jour de culture (entrée en phase stationnaire) et se maintient ensuite à des
valeurs proches du nombre de cellules viables initial. Ainsi, en présence de fer, il y a autant de
bactéries viables après 4 jours de culture que dans la culture à J0.
Ces résultats apportent plusieurs contraintes à la relation entre viabilité et encroûtement et
ouvrent un certain nombre de perspectives.
• Il est possible que l’encroûtement ait un effet létal sur les cellules. Dans ce cas, nos
résultats suggèrent que cet encroûtement est très rapide et peut donc fossiliser des
177
cellules en plein stade de division. Dans cette même perspective, une façon de
réconcilier l’ensemble de ces résultats est d’imaginer que la relation entre le nombre
de bactéries vivantes et la quantité de protéines est différente selon que le milieu
contient du fer ou non. Ainsi, dans une culture en l’absence de fer, les cellules mortes
seraient rapidement dégradées. La quantité de protéines dosée serait donc
proportionnelle au nombre de bactéries vivantes, quel que soit le stade de la culture.
Un plateau est ainsi observé sur les courbes du nombre de protéines totales (Figure
1E-1) comme sur les courbes de viabilité (Figure 1E-4). En revanche, en présence de
fer, l’encroûtement périplasmique pourrait protéger les protéines de la dégradation. En
supposant que l’encroûtement a effectivement un effet létal, on pourrait donc
expliquer que la quantité de protéines reste constante (phase stationnaire) alors que le
nombre de bactéries viables diminue (à partir de J2). Cette interprétation est en outre
cohérente avec les résultats de spectroscopie et de microscopie présentés au Chapitre
1D, concernant la préservation de protéines par les phases minérales dans le
périplasme des bactéries.
• D’autre part, ces résultats suggèrent que le nombre de bactéries viables est identique
en début et en fin de culture en présence de fer. Ceci impliquerait qu’aucune
croissance ne sera observée dans une culture en présence de fer repiquée plusieurs fois
au 1/10 dans un milieu contenant du fer. Cette hypothèse pourra être facilement testée
dans le futur. Une autre possibilité est que le nombre de bactéries viables dans les
cultures en présence de fer augmente de nouveau d’un facteur 10 au-delà des 4 jours
de culture suivis lors de cette expérience. En effet, on peut imaginer que la viabilité
cellulaire augmente de nouveau lorsque tout le Fe(II) initialement présent dans le
milieu de culture a disparu de la solution par précipitation. Ce scénario serait cohérent
avec l’observation de la diminution du nombre relatif de bactéries encroûtées à partir
de 3 jours. Cette hypothèse pourra être testée dans le futur en reprenant les expériences
de viabilité mais sur une durée plus longue.
• Dans tous les cas, il est intriguant d’observer que le nombre relatif de bactéries
encroûtées est déjà très élevé (80%) dès le début de la culture (3 h), donc en pleine
phase exponentielle. Ce résultat suggère soit que l’encroûtement n’a pas d’effet sur la
mortalité cellulaire, soit que les cellules à des stades précoces d’encroûtement ont un
périplasme encore peu minéralisé et moins chargé en fer qui n’empêche ni leur activité
métabolique, ni leur division. Une estimation de la quantité de fer périplasmique
178
moyenne dans les cellules au cours de la culture pourrait permettre de mieux
comprendre ces résultats.
104
105
106
107
0 1 2 3 4 5
CF
U / 1
0 µ
L
Temps, jours
Figure 1E-4. Evolution de la viabilité cellulaire dans des cultures de BoFeN1 en l’absence
(○) ou en présence (■) de Fe(II) dissous à 5 mmol.L-1
. La viabilité est évaluée par le nombre
d’unités formant des colonies (CFU) compté après étalement sur milieu solide de 10 µL de la
culture liquide suivie. Les barres d’erreur correspondent à l’écart-type calculé à partir d’au
moins deux étalements sur milieu solide d’une même culture en milieu liquide.
En conclusion, l’estimation de la viabilité cellulaire n’est pas triviale. En particulier, la
définition d’une bactérie vivante ou morte est problématique, puisque les différentes
approches méthodologiques fournissent des informations sur l’activité métabolique, la
division cellulaire ou bien la présence d’acides nucléiques, qui correspondent toutes à des
définitions différentes de ces notions. Nos résultats montrent toutefois les implications
diverses et importantes de telles expériences, qui devront être poursuivies et multipliées dans
le futur. Nous proposons ci-dessous quelques pistes méthodologiques complémentaires qui
pourraient être envisagées.
Perspectives méthodologiques.
Evaluation de la viabilité à l’échelle de la cellule – Méthodes utilisant la fluorescence. En
complément, nous pourrions tester des méthodes permettant d’évaluer la relation
viabilité/encroûtement à l’échelle de l’individu. Pour cela, nous recherchons une méthode
179
permettant de déterminer sur une même cellule sa viabilité et son taux d’encroûtement. Dans
cette perspective, les techniques d’épifluorescence sont tout particulièrement intéressantes.
Par exemple, une technique telle que le FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) pourrait
fournir des informations à la fois sur l’activité d’une bactérie et sur son taux d’encroûtement.
En effet, des sondes (complémentaires d’ARNr plus ou moins spécifiques) couplées à des
molécules fluorescentes (fluorophores) peuvent être employées pour déterminer l’état
physiologique des bactéries : la présence de fluorescence indique la présence d’ARNr et le
taux d’ARN présent dans une cellule est en première approximation proportionnel à son
activité métabolique (Schmid et al., 2001). En outre, même si la résolution spatiale reste
nettement inférieure à celle d’un MET, l’imagerie à l’aide d’un microscope à épifluorescence
peut fournir des informations complémentaires sur la présence éventuelle de minéraux
associés aux structures cellulaires. Le FISH fournit de plus la possibilité d’envisager dans le
futur son couplage avec le MET. Il est en effet possible de coupler les sondes utilisées en
FISH à des billes d’or avant l’hybridation et d’observer ensuite ces billes d’or hybridées au
MET, de façon à obtenir une résolution spatiale accrue, autorisant à visualiser sans ambiguïté
le taux d’encroûtement des cellules. Différentes méthodes basées sur l’utilisation de sondes
fluorescentes ont donc été testées de façon préliminaire, en collaboration avec Emmanuelle
Gérard (Géobiosphère Actuelle et Primitive, IPGP).
• Estimation de la viabilité cellulaire par marquage des acides nucléiques au SYTO 9.
Nous avons effectué de premiers tests de viabilité à l’échelle de la cellule, à l’aide d’un kit de
viabilité (Molecular Probes, voir Protocoles p. 261) utilisant deux sondes fluorescentes
marqueurs des acides nucléiques : le SYTO 9 (vert) marque en principe toutes les cellules
indépendamment de leur état physiologique, tandis que l’iodure de propidium (PI, rouge) ne
pénètre que dans les cellules dont la paroi n’est pas intacte, donc en principe les cellules
mortes. Le protocole utilisé a donné de bons résultats pour les cultures de BoFeN1 en
l’absence de fer : on observe un mélange de bactéries vivantes et de bactéries mortes aux
différents stades de la culture. En revanche, on a observé que les sondes ne pénétraient pas
dans les cellules encroûtées (ni le SYTO 9, ni le PI), c’est-à-dire qu’il n’est pas possible de
déterminer si elles sont vivantes ou mortes. Ce biais rend donc difficile l’estimation des ratios
bactéries vivantes/bactéries mortes dans les cultures en présence de fer.
• Estimation de la viabilité cellulaire par la méthode FISH. Pour ces premiers tests,
différentes sondes ont été testées (voir Protocole p. 261). Plusieurs problèmes ont toutefois été
180
rencontrés. Tout d’abord, les minéraux fluorescent. D’autre part, l’état physiologique des
cellules (phase exponentielle/stationnaire) n’avait pas été bien contrôlé, ce qui peut expliquer
les défauts d’hybridation observés avec la plupart des sondes. Enfin, la moins bonne
hybridation des cellules encroûtées pourrait être un biais lié, là encore, à une moins bonne
pénétration des sondes, hypothèse qui devra être testée et quantifiée dans le futur.
• Estimation de la vitalité cellulaire en épifluorescence. Un kit de vitalité est
disponible (Molecular Porbes), qui pourrait peut-être permettre de quantifier le taux d’activité
métabolique des cellules dans différentes conditions de culture. Il consiste à utiliser de la
résazurine non fluorescente qui peut être réduite par les cellules viables en résorufine
fluorescente (rouge). La pénétration de cette sonde dans les cellules encroûtées pourra être
testée dans le futur.
• Suivi de la division cellulaire dans une cellule anoxique. Afin de tester si des cellules
encroûtées peuvent effectivement se diviser complètement, une démarche très directe pourrait
consister à suivre en microscopie optique (en contraste de phase par exemple) plusieurs
bactéries encroûtées sur un laps de temps donné, dans le but d’observer une éventuelle
division. Ceci nécessiterait la mise au point d’une cellule anoxique dans laquelle les bactéries
seraient inoculées, puis observées in situ pendant au moins plusieurs heures afin d’avoir
l’opportunité d’observer une division.
181
Chapitre 2.
Biominéralisation du fer et
détoxification de l’arsenic par des
eucaryotes unicellulaires du genre
Euglena
182
183
Le second volet de cette thèse a eu pour objectif de déterminer les adaptations biologiques
développées par des eucaryotes unicellulaires photosynthétiques, exposés dans le milieu
naturel à des concentrations très élevées en éléments lourds. Ces microorganismes – Euglena
mutabilis et Euglena gracilis – sont parmi les seuls eucaryotes présents dans les drainages
miniers acides (AMD). Dans le cadre de notre recherche, nous avons collecté des cellules d’E.
mutabilis dans l’AMD de Carnoulès (Figure 2.1).
La mine de Pb et Zn de Carnoulès, abandonnée en 1962, contient actuellement près de 1.5
Mt de stériles miniers, principalement constitués de quartz (75 poids-%) et de pyrite (5-15
poids-%). La pyrite contient 1 à 4 poids-% d’arsenic (Leblanc et al., 1996). Son altération par
les eaux de pluie libère de fortes concentrations d’arsenic dans le cours d’eau qui prend sa
source à la sortie des stériles, le Reigous. Ce cours d’eau présente un pH acide (2.7-3.4) et de
fortes teneurs en Fe(II) (0.7-1.7 g.L-1
) et en As (80-260 mg.L-1
) atteignant jusqu’à plus de 20
000 fois la limite fixée par l’OMS pour les eaux potables (10 µg.L-1
). A la source, l’arsenic
dissous est majoritairement présent sous forme d’As(III). Il précipite quelques dizaines de
mètres en aval sous l’action de bactéries arsenite-oxydantes (e.g. Thiomonas sp., Bruneel et
al., 2003, Casiot et al., 2003, Duquesne et al., 2007) et/ou ferro-oxydantes (e.g.
Acidithiobacillus ferroxidans, Duquesne et al., 2003, Casiot et al., 2003, Casiot et al., 2006)
sous forme d’hydroxysulfates de fer-arsenic (tooeleite) ou d’(hydr)oxydes amorphes de fer-
arsenic (Fe(III)-As(III) ou Fe(III)-As(V)) (Morin et al., 2003). Le taux de précipitation du fer
et de l’arsenic dans l’AMD, ainsi que la spéciation de ce dernier, présentent des variations
saisonnières, vraisemblablement liées à des variations de l’activité bactérienne (Casiot et al.,
2003, Morin et al., 2003). Si la concentration en As(V) dissous dans le Reigous est
négligeable en hiver, elle peut atteindre 100 mg.L-1
en été (Casiot et al., 2004). C’est à ces
conditions chimiques extrêmes, proches de celles régnant potentiellement dans des
environnements de la Terre primitive, que sont exposés les eucaryotes E. mutabilis (Casiot et
al., 2004) et E. gracilis (Arsène-Ploetze et al., soumis) : pH acide, fortes concentrations en fer
et en arsenic, fort taux de minéralisation.
Notre approche a donc consisté dans un premier temps à évaluer les adaptations de ces
deux eucaryotes aux fortes teneurs en fer dissous, via une étude microscopique d’E. mutabilis
directement prélevée dans l’AMD de Carnoulès et d’E. gracilis (Figure 2.2) cultivée en
laboratoire dans un milieu de culture à pH acide, enrichi en Fe(II) à des concentrations
proches de celles observées sur le terrain (Chapitre 2A). Dans le Chapitre 2B, nous étudions
les mécanismes de résistance à l’As(III) et As(V) dans des expériences de laboratoire sur
184
l’espèce cultivable E. gracilis, exposée à des concentrations de l’ordre de celles mesurées
dans l’AMD de Carnoulès.
Figure 2.1. Le drainage minier acide de Carnoulès. Localisation géographique et coupe de
l’AMD du Reigous, depuis la source très riche en As(III) et Fe(II) dissous jusqu’au lieu de
prélèvement d’E. mutabilis. L’atténuation naturelle des concentrations en fer et arsenic
dissous dans le cours d’eau s’explique par l’activité de microorganismes (ba : bactéries) tels
qu’Acidithiobacillus ferroxidans ou Thiomonas sp. catalysant l’oxydation du Fe(II) ou de
l’As(III) par l’O2 et en conséquence la formation de phases minérales riches en fer et arsenic
(oxyhydroxydes de Fe(III)-As(III) ou de Fe(III)-As(V), tooeleite, Morin et al., 2003). Des
images MEB montrent la diversité morphologique de quelques bactéries et biominéraux
typiques de l’AMD de Carnoulès ainsi qu’une cellule d’E. mutabilis prélevée dans le cours
d’eau.
1 000 mg/L FeII
100 – 300 mg/L AsIII
600 mg/L FeII
50 - 100 mg/L AsIII
Thiomonas sp.
AsIII AsV
Oxy-hydroxydes FeIII-AsV
Acidithiobacillus ferrooxidans
FeII FeIII
Oxy-hydroxydes FeIII-AsIII
Tooéléite
E. mutabilis
1 000 mg/L FeII
100 – 300 mg/L AsIII
600 mg/L FeII
50 - 100 mg/L AsIII
Thiomonas sp.
AsIII AsV
Oxy-hydroxydes FeIII-AsV
Acidithiobacillus ferrooxidans
FeII FeIII
Oxy-hydroxydes FeIII-AsIII
Tooéléite
E. mutabilis
1 000 mg/L FeII
100 – 300 mg/L AsIII
600 mg/L FeII
50 - 100 mg/L AsIII
Thiomonas sp.
AsIII AsV
Oxy-hydroxydes FeIII-AsV
Acidithiobacillus ferrooxidans
FeII FeIII
Oxy-hydroxydes FeIII-AsIII
Tooéléite
E. mutabilis
185
Figure 2.2. Ultrastructure d’E. gracilis. Coupe d’une cellule incluse en résine Epoxy et
contrastée (acétate d’uranyl et citrate de plomb) observée en MET. Chl : Chloroplaste ; V :
Vacuole de stockage (paramylon) ; M : Mitochondrie ; Nl : Nucléole ; Chr : Chromatine ;
EN : Enveloppe nucléaire ; G : Goulet ; F : Flagelle ; PC : Paroi cellulaire.
PC
Nl
Chr
EN
Chl
G
F
M
V
PC
Nl
Chr
EN
Chl
G
F
M
V
186
187
Chapitre 2.A.
Bioaccumulations de fer par E. mutabilis issue de l’AMD de Carnoulès et
par E. gracilis
Problématique et objectifs. E. mutabilis et E. gracilis sont parmi les seuls eucaryotes
adaptés aux conditions extrêmes des AMD, en particulier, capables de résister à de fortes
concentrations en Fe(II) dissous et en arsenic dissous. En comparaison, les procaryotes
présents dans ces environnements résistent également à ces concentrations chimiques
extrêmes via la biominéralisation de phases riches en fer et en arsenic : formation
d’hydroxysulfates de fer-arsenic (tooeleite) ou d’(hydr)oxydes amorphes de fer-arsenic
(Morin et al., 2003). Jusqu’à maintenant, la capacité des eucaryotes adaptés aux AMD à
minéraliser le fer et/ou l’arsenic n’a cependant été que très peu étudiée. Une étude d’E.
mutabilis prélevée dans l’AMD de Carnoulès a cependant suggéré par une méthode chimique
indirecte la possible accumulation de fer et d’arsenic par ces algues (Casiot et al., 2004). En
outre, des observations d’E. mutabilis prélevées dans des AMD ont suggéré la présence
d’oxydes de fer intracellulaires chez ces eucaryotes (Mann et al., 1987, Brake et al., 2001).
Notre étude a donc consisté à caractériser à l’échelle sub-micrométrique les potentielles
accumulations de fer et/ou d’arsenic chez E. mutabilis issue de l’AMD de Carnoulès et dans
l’algue modèle E. gracilis cultivée en présence de fortes concentrations en Fe(II) et As(III)
dissous.
Méthodologie. Afin de caractériser ces bioaccumulations, des méthodes microscopiques et
spectroscopiques ont été combinées :
• Microscopie électronique à transmission, en particulier sur des coupes ultrafines
obtenues par ultramicrotomie de cellules incluses dans une résine Epoxy (voir
Protocole p. 261).
• Spectroscopie en perte d’énergie (EELS) afin de co-localiser les associations
élémentaires dans les bioaccumulations intracellulaires.
• Spectromicroscopie X (STXM) au seuil du fer, afin de déterminer le redox du fer dans
les bioaccumulations de fer chez E. mutabilis.
Principaux résultats et perspectives. Cette étude a mis en évidence l’accumulation de fer
dans des vacuoles intracellulaires, sous forme de (poly)-phosphates de fer de taille
188
nanométrique, aussi bien chez E. mutabilis que chez E. gracilis. Ces dépôts vacuolaires sont
systématiquement dépourvus d’As (concentrations inférieures au seuil de détection de l’EDX
dans les coupes de 70 nm d’épaisseur étudiées, i.e. environ 1%). L’analyse locale du redox du
fer dans ces bioaccumulations chez E. mutabilis a montré que le fer était présent
majoritairement sous forme de Fe(II). En outre, ces phosphates de Fe(II) sont associés à des
polymères de carbone organique. L’ensemble de ces observations fournit des clés pour une
éventuelle recherche de traces de l’activité de microorganismes eucaryotes dans le registre
fossile. Par ailleurs, le découplage entre les cycles du fer et de l’arsenic dans l’euglène
contraste fortement avec ce qui est connu des mécanismes d’immobilisation du fer et de
l’arsenic dans les AMD, qu’ils soient abiotiques ou catalysés par des bactéries.
189
Intracellular iron accumulation in Euglena mutabilis from the Carnoulès arsenic-rich acid mine drainage (Gard, France) and in the model
microorganism Euglena gracilis.
Jennyfer Miot a,*
, Guillaume Morin a, Tae Hyun Yoon
b, Fériel Skouri-Panet
a,
Céline Férard a, Magali Zbinden
c, Karim Benzerara
a, Joël Briand
d, Corinne Casiot
e, Jean-
Pierre Lechaire f , Gordon E. Brown
g,h and François Guyot
a
a Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS, Paris 6,
Paris 7 and Institut de Physique du Globe de Paris.
140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France b Laboratory of Nanoscale Characterization and Environmental Chemistry,
Department of Chemistry, Hanyang University, Seoul, 133-791, Korea c Laboratoire de Systématique, Adaptation, Evolution, UMR 7138, CNRS, Université Paris 6,
4, place Jussieu. 75 252 Paris cedex 05, France d Laboratoire d’Electrophysiologie des Membranes, EA 3514, Université Paris 7,
4, place Jussieu. 75 252 Paris cedex 05, France e Laboratoire Hydrosciences Montpellier, UMR 5569, CNRS, Université Montpellier 2,
Place E. Bataillon, 34095 Montpellier Cedex 05, France f Service de Microscopie Electronique, IFR 83, Université Paris 6,
9, quai St Bernard. 75 252 Paris cedex 05, France g Surface & Aqueous Geochemistry Group, Department of Geological & Environmental
Sciences, Stanford University, Stanford, CA 94305-2115, USA
h Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, SLAC, Menlo Park, CA 94025, USA
To be submitted to
*Corresponding author:
Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensés, UMR 7590, CNRS,
Universités Paris 6 et Paris 7, et IPGP.
140, rue de Lourmel. 75 015 Paris, France
Tel: 0033144279832
Fax: 0033144273785
190
ABSTRACT
The acidophilic microalga Euglena mutabilis, exposed to high Fe(II) and As(III)
concentrations was collected at the Carnoulès acid mine drainage. Analytical transmission
electron microscopy evidenced intracellular amorphous electron dense accumulations of iron
phosphates compartmentalized within vacuoles. Similar results were reproduced in laboratory
cultures of the model alga E. gracilis under high Fe(II) levels. In addition, we used
synchrotron-based Scanning Transmission X-ray Microscopy to investigate the Fe redox state
and the carbon content of these sub-micrometer-size accumulations. They were shown to
consist exclusively of Fe(II)-phosphate associated to organic carbon polymers. Arsenic, a
pervasive element at this acid mine drainage, was absent from these accumulations, both in E.
mutabilis, and in E. gracilis cultured in the presence of Fe(II) and As(III). The decoupling
between As(III) and Fe(II) pathways in these algae contrasts with what is known from abiotic
and bacteria-mediated processes in acid mine drainage systems and could possibly provide a
signature for such eukaryotic metabolisms in recent and ancient Fe/As rich natural systems.
Keywords: euglena, iron phosphate, bioaccumulation, acid mine drainage, arsenic,
spectromicroscopy.
191
INTRODUCTION
Euglena mutabilis is a benthic photosynthetic unicellular eukaryote, ubiquitous in acid
mine drainage (AMD) and one of the few eukaryotes adapted to these extreme environments.
This green alga is tolerant to acidity (pH = 3), to several heavy metals (Zn, As, Pb) and to
elevated iron concentrations (0.7 g.L-1
to 12.1g.L-1
) (Kapfer, 1998; Brake et al., 2001, Casiot
et al., 2004). In the Carnoulès AMD (Gard, France), E. mutabilis is exposed to 0.6-1.0 g.L-1
of
Fe(II) and to 80-250 mg.L-1
of As(III), that latter value largely exceeding the current World
Health Organization maximum contaminant level (10 µg.L-1
). Intracellular red-brownish
granules were described in E. mutabilis cells collected from AMD (Brake et al., 2001) and
were interpreted as intracellular accumulations of the iron oxide lepidocrocite (Mann et al.,
1987). More recently, Casiot et al. (2004) proposed from an indirect chemical approach that
E. mutabilis cells sampled at the Carnoulès AMD, were able to accumulate arsenic and iron.
Besides, intracellular compartmentalization of copper was suggested to be part of a metal
detoxification pathway in another metal-resistant euglena, E. gracilis (Einicker-Lamas et al.
2002), closely related to E. mutabilis (Woongghi & Triemer, 2004). However, none of these
studies did provide a direct chemical and mineralogical characterization of iron and/or arsenic
accumulations in Euglenae.
Our study aimed at following the fate of iron in E. mutabilis cells collected at the Carnoulès
arsenic-rich AMD (France) and in E. gracilis cells cultured in the laboratory in the presence
of Fe(II) and As(III) at concentrations similar to those reached in the Carnoulès AMD.
Combination of Transmission electron microscopy (TEM), Scanning transmission electron
microscopy (STEM), both coupled to Energy Dispersive X-ray Spectrometry (EDXS),
Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) and spectroscopic analyses (Electron
Energy Loss Spectroscopy (EELS) and X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy (XANES))
provided us with new insights into the nature of intracellular iron-rich accumulations in E.
mutabilis and E. gracilis.
MATERIALS AND METHODS
E. mutabilis sampling
E. mutabilis cells were collected from the Reigous AMD. This creek surges from the
Carnoulès abandoned mine (Gard, France, Figure 1) (Leblanc et al., 1996) and exhibits Fe(II)
192
concentrations ranging from 1.0g.L-1
at the spring to 0.6g.L-1
30m downstream, as well as
high As(III) concentrations (up to 250mg.L-1
at the spring) (Casiot et al., 2003).
Green benthic mats of E. mutabilis are localized at the surface of Fe-As-rich bacterial
precipitates, mainly 30m downstream from the acidic spring (Casiot et al., 2004). The
eukaryotic mats were scraped with a stainless steel spatula, then placed in sterile plastic
capped vials and transported to the laboratory, where they were immediately processed. Cells
were separated from the sediments following the procedure by Casiot et al. (2004), which
uses the phototactic properties of these algae. The collected material was deposited in a sterile
Petri dish and was then recovered with three layers of Nylon filter. After 2 hours exposure to
artificial light, the two upper layers of Nylon were rinsed with 0.22 µm-filtered Reigous water
to recover the migrating cells. Cell shape and mobility, and presence of extracellular
precipitates were checked under a light microscope (up to x1000 magnification).
Figure 1. Map of the Carnoulès mining site and location of the sampling site of E. mutabilis
on a cross-section of the Reigous AMD.
E. gracilis culture
E. gracilis Z (n°1224-5d, Cambridge) was cultured at room temperature (20 +/- 2°C),
under permanent light exposure, in a culture medium composed of KH2PO4 (0.5 g/L),
193
MgSO4.7H2O (0.5 g/L), CaCl2.2H2O (0.26 g/L), (NH4)2HPO4 (0.5 g/L) and a complement of
vitamins, zinc (as ZnSO4) and manganese (as MnSO4), at an initial pH of 3.2 (Briand &
Calvayrac, 1980). Lactic acid was supplied as a carbon source and its assimilation by the cells
progressively raised the pH of the culture medium up to pH 7 after 1 week of incubation. In
test cultures, iron (as FeSO4) and/or arsenic (as As(III)NaO2) were added at concentrations
close to those reached in the Carnoulès AMD: 100, 500 or 1000 mg.L-1
Fe and 200 mg.L-1
As.
These cultures were examined after 1 week of incubation.
Transmission Electron Microscopy
Intracellular structures were characterized in ultrathin sections by Transmission
Electron Microscopy (TEM). Cells were fixed for 2 hours in 1% glutaraldehyde at 4°C,
centrifuged (6,500 rpm), rinsed three times in 0.1 M acetic buffer (pH 4.4) for 18 hours at
4°C. They were then post-fixed for 90 minutes in 1% OsO4 in the same buffer, rinsed three
times in distilled water, dehydrated in graded ethanol and propylene oxide-1,2 and
progressively embedded in epoxy resin. Ultrathin sections (70 nm-thick) were cut with a
LEICA ultramicrotome (Ultracut E). Ultrathin sections, deposited on copper grids, were
stained with uranyl acetate (2% w/v) and lead citrate (2 g.L-1
) and observed in a PHILIPS 201
Transmission Electron Microscope at 80 kV.
Samples analyzed by Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) and
Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDXS) were neither post-fixed, nor stained. The
70nm-thick sections were carbon-coated and observed in a Tecnai G2 F20 Microscope
operating at 200kV, in Dark Field (DF) and Bright Field (BF) modes. EDXS analyses were
performed with a focused electron beam (spatial resolution: 30 nm).
Energy Filtered Transmission Electron Microscopy (EFTEM) was performed on
70nm-thick non-osmicated and unstained sections in a LEO 912 TEM, equipped with a LaB6
source, operating at 120kV and 4µA. Parallel Electron Energy Loss Spectra (PEELS) and
Electron Spectroscopic Images (ESI) were acquired with a slow-scan CCD camera using the
ESIvision program. The exposure time was 1 second for each ESI. Each PEELS was acquired
for 1 second and the integration was maintained up to 3 seconds. For the spectra recorded at
the phosphorus L2,3-edge, a background subtraction was applied according to a power law.
Scanning Transmission X-ray Microscopy
Scanning Transmission X-ray Microscopy (STXM) observations were performed at
194
the Advanced Light Source (ALS, Lawrence Berkeley National Laboratory) on branch line
11.0.2.2, following the same procedures as those described in Bluhm et al. (2006), Yoon et al.
(2004) or Benzerara et al. (2004). The synchrotron storage ring was operating at 1.9 GeV and
200-400 mA stored current. Energy calibrations were made using the well-resolved 3p
Rydberg peak of gaseous CO2 for the C K-edge and using the major peak of hematite at 709.5
eV for the Fe L2,3-edge. The STXM sample chamber was filled with He to minimize
attenuation of soft X-rays. The detector used was a Si photodiode or a PMT with a phosphor
scintillator. Image stacks were acquired at the C K-edge and at the Fe L2,3-edge. They were
performed by scanning the sample in the x-y direction at each energy increment over the
energy range of interest. X-ray Absorption Near-Edge Spectroscopy (XANES) spectra were
normalized and background subtracted by dividing each spectrum by a second one (I0) taken
at a location on the sample where the element of interest was absent. Possible beam damage
was monitored by looking at the changes in the C K-edge and FeL2,3-edge spectra over the
course of each experiment. However, no significant changes were observed. Axis2000
software (Hitchcock, 2001) was used to process the image stacks and XANES spectra.
Enhanced contrast images were obtained by subtracting the image taken at an energy just
above the absorption edge of interest from another image obtained at an energy below the
absorption edge of interest.
RESULTS AND DISCUSSION
Fe(II)-(poly)phosphate accumulation in E. mutabilis
TEM observations of E. mutabilis reveal the presence of intracellular electron dense
deposits compartmentalized within vacuoles (Figure 2a). Electron diffraction indicates that
these dense deposits are amorphous or poorly crystalline. They are composed of Fe and P,
with a Fe/P atomic ratio ranging from 0.5 to 1 as shown by EDXS (Figure 2a).
195
Figure 2. STEM observations (Dark Field) of E. mutabilis collected from the Carnoulès
AMD and separated from the bulk sediment through Nylon filters and EDXS analyses of the
areas pointed by arrows: (a) intracellular electron dense deposits within or at the edge of
vacuoles and containing Fe, P and O. Carbon is also present (see Figure 4) but is
indistinguishable from the carbon of the TEM grid (b) extracellular precipitates containing Fe,
P, Al, S, As and O. Copper is due to sample holder. CW: cell wall, V: vacuole, Chl:
chloroplast.
196
Owing to their submicrometer size, determination of the iron oxidation state in these
deposits is challenging. EELS proved difficult because of instability of the material under the
focused electron beam. STXM spectromicroscopy, a less destructive method, provides a 30
nm-scale spatial resolution combined to a very fine spectral resolution (< 0.1 eV, see e.g.
Hitchcock et al., 2003; Bluhm et al., 2006). The energy of the main absorption edge in
XANES spectra recorded at the Fe L2,3-edge provides insight into the local iron oxidation
state. Iron reference compounds exhibit two main absorption edges at 707 and around 709 eV
(Figure 3). The relative intensity of each absorption edge is directly related to the iron
oxidation state: in Fe(II) compounds (such as vivianite Fe3(PO4)2 • 8H2O), the former edge
(707 eV) is the most intense one, whereas in Fe(III) compounds (such as hematite Fe2O3) the
latter (709 eV) is predominant. The low quantity of iron in the nanometer-scale vacuolar
deposits in E. mutabilis thin sections accounts for the low signal obtained by X-ray absorption
spectroscopy (Figure 3). However, XANES spectra of these vacuolar accumulations indicate
unambiguously that iron is present mostly as Fe(II).
Figure 3. STXM analysis of E. mutabilis thin section: (a) STXM image below the C K-edge
(280 eV), (b) below the Fe L2,3-edge (700 eV) and (c) at 707 eV. (d) Fe map obtained by
subtracting image B from image C. (e) XANES spectra at the Fe L2,3-edge of a vacuolar
deposit and of reference vivianite and hematite. The red square in (a) corresponds to the zoom
shown in b, c and d.
197
Then, Fe-bearing compounds were mapped at the submicrometer-scale in E. mutabilis
thin sections by acquiring energy-filtered images: subtraction of the image recorded at 700 eV
(below the Fe L-edge) from the image recorded at 707 eV provides a map of Fe(II) in the
study area. As shown in Figure 3, Fe(II) is co-localized with the electron-dense phases
deposited in E. mutabilis vacuoles. Fe(II) phosphates or linear Fe(II) polyphosphates have
compositions that can be expressed as FeII
(n+2)/2PnO(3n+1). As iron is present as Fe(II) and
knowing from EDXS that the Fe/P atomic ratio ranges from 0.5 to 1, we infer that the
composition of the vacuolar deposits ranges from FeII
2P2O7 (n=2, Fe/P=1) toward a
composition of long-chain iron polyphosphate FeIIP2O6 (n → ∞, Fe/P=0.5). Of course, these
phases may be partially hydrated.
The composition of these intracellular deposits, in which no arsenic was detected,
significantly differs from that of the extracellular minerals observed in the vicinity of E.
mutabilis cells (Figure 2b). Indeed, these extracellular precipitates are mainly composed of
iron, arsenic, phosphorus, aluminum, oxygen and sulfur and are amorphous by electron
diffraction. As reported in a previous study (Morin et al., 2003), similar precipitates,
appearing as yellow minerals observed beneath the E. mutabilis mats at the sampling station
(Figure 1), are mainly composed of amorphous Fe(III)-As(V) hydroxysulfates, that were
shown to result from the activity of As(III)-oxidizers, including Thiomonas sp. Similar phases
have also been described in hot springs (Inskeep et al. 2004). Accordingly, the extracellular
precipitates observed by TEM-EDXS in the present study could consist of a mixture of
bacterial Fe(III)-As(V) hydroxysulfates and of aluminum phosphate that may have formed in
the vicinity of the cells upon drying.
Additionally, we acquired STXM images on the same samples at the C K-edge. At this
edge, maximum absorption energies are specific of the type of carbon functional groups (e.g.
Benzerara et al., 2004; Dynes et al., 2006; Benzerara et al., 2008). Maps of organic carbon
polymers in E. mutabilis thin sections were obtained by subtracting the absorbance below the
C K-edge (280 eV) from the main absorbance of the peptidic bound in proteins (-(C=O)-
(NH)-, 288.2 eV). Comparison of the organic carbon map with the Fe(II) map of the same
area (Figure 4) underlines the systematic association of organic polymers with the vacuolar
Fe(II) phosphates in E. mutabilis, whereas no organics are detected in association with
extracellular iron-bearing minerals.
198
Figure 4. STXM images of E. mutabilis thin section: (a) STXM image below the C K-edge
(280 eV), (b) organic carbon map obtained by subtracting the image at 288.2 eV from the
image at 280 eV, (c) Fe map obtained by subtracting the image at 707 eV from the image at
700 eV. Scale bars: 1 µm.
To our knowledge, the present work provides the first experimental evidence of
intracellular ferrous phosphates in E. mutabilis. Previous works reported optical microscope
observations of red-brown granules in E. mutabilis collected in AMD (Brake et al., 2001), that
were interpreted as iron oxides, possibly lepidocrocite (Mann et al., 1987). However, neither
direct relation between the granules and the iron minerals, nor direct evidence of intracellular
iron minerals, were provided in these studies. Here, we show that the iron-rich deposits
contain iron exclusively as Fe(II) and are not related to the red-brownish granules. Such
granules are not observed in fresh cells, but develop progressively upon a few days of storage
at the laboratory in a minimum medium without iron (KH2PO4 1 g.L-1
, MgSO4 0.25g.L-1
,
(NH4)2SO4 0.75g.L-1
) (Figure 5). These coloured granules might be attributed to the
degeneration of chloroplasts induced by the culture in a minimum medium (Buetow, 1968).
199
Figure 5. Optical micrographs of (a) E. mutabilis cells from the Reigous AMD, after 5 days
of culture in a minimum medium, exhibiting red granules pointed by arrows and (b) fresh E.
mutabilis directly observed after sampling in the Reigous Creek. The arrow in b shows the
photoreception center (stigma). Extracellular minerals were identified as Fe(III)-As(V)
hydroxysulfates. Scale bars : 5 µm.
Iron (poly)-phosphate mineralization in the model eukaryote E. gracilis
In order to reproduce these biomineralization patterns in a model euglena amenable to
reproducible culture conditions, E. gracilis was cultured in the presence of ferrous iron and/or
arsenite at concentrations of the same order of magnitude as the concentrations measured in
the Carnoulès AMD. Culture of E. mutabilis in the laboratory was not possible because of the
low growth rates obtained in a minimum culture medium and because of contamination by
endogeneous bacteria and fungi in the rich medium used for E. gracilis. Moreover, E. gracilis
was shown to be phylogenetically very close to E. mutabilis (Woongghi & Triemer, 2004),
thus constituting a good analogue of E. mutabilis. We observed that growth kinetics of E.
gracilis does not depend on iron concentration (for initial iron concentrations ranging from 0
to 500 mg.L-1
), which suggests that E. gracilis is resistant to high Fe(II) concentrations.
Moreover, previous results indicated that this alga is also resistant to As(III) up to 200 mg.L-1
200
(Miot et al., 2008).
Under these conditions, E. gracilis cells accumulate iron as electron dense deposits
(Figure 6), in association with phosphorus and oxygen (Figure 7), in the same way as what is
observed in E. mutabilis. Electron energy loss spectra recorded on these phases at the Fe and
P L2,3 edges and EFTEM images confirm the colocalization of Fe and P (Figure 7). In
contrast, electron dense accumulations are absent from the control cells cultured without iron
(Figure 6). Moreover, in a medium supplemented with both As(III) and Fe(II), no arsenic is
detected, neither in the vacuolar deposits nor elsewhere inside the cells. A previous study of
E. gracilis resistance to As(III) (Miot et al., 2008) showed that As(III) detoxification proceeds
via the glutathione pathway and leads to the export of arsenite from the cells.
Figure 6. TEM observations of E. gracilis cells (a) cultured without iron nor arsenic, (b) transferred twice in a 100 mg.L
-1 Fe(II) containing medium (3 weeks of culture) or (c)
cultured with 1000 mg.L-1
Fe(II) and 200 mg.L-1
As(III) during 7 days. Arrows indicate the
electron dense vacuolar deposits.
a
b c
201
Figure 7. Elemental maps of electron dense deposits in E. gracilis cultured during 7 days in
a medium enriched with 500 mg.L-1
Fe(II), obtained by EFTEM microanalysis: Carbon pre-
edge image (at 250 eV, a), phosphorus (b) and iron (c) maps. Scale bars: 100 nm.
Fe/P ratios are constant from one deposit to another in a single cell and from cell to
cell. After 7 days of culture in a medium containing 100 or 500 mg.L-1
Fe (with or without
arsenic), Fe/P atomic ratios are close to 1. After 3 weeks of culture in a medium containing
100 mg.L-1
Fe, the deposits exhibit mean proportions of 66 +/-4% P and 33 +/-4% Fe, which
in turn gives an atomic Fe/P ratio of 0.5. As in E. mutabilis, these results suggest that
orthophosphate units do polymerize in the cells, the stoechiometry evolving from FeIII
PO4
(n=1) toward FeIII
P4O13 (n=4) or from FeII
2P2O7 (n=2) toward a composition of long-chain
iron polyphosphate (n → ∞). Alternatively, the evolution of the Fe/P ratio could also be
explained by the transformation of FeII
2P2O7 into FeIII
2P4O13, involving both Fe(II) oxidation
and phosphate polymerization. Determination of the local iron oxidation state in E. gracilis
cells would help to better constrain the stoechiometry of these mineral phases.
Biological and environmental implications
The biological role of the observed intracellular iron phases is still unknown. They
could play a detoxification role in Euglena cells exposed to very high Fe(II) concentrations in
AMD. Alternatively, they might have a similar function as iron polyphosphates often
described in prokaryotic cells (Lechaire et al., 2002) and in unicellular algae (Nagasaka et al.,
2004), that can be expressed in response to various stresses, such as light stress (Smillie &
Krotkov, 1960) or exposition to toxic compounds (Appanna & Hamel, 1996; Nishikawa et al.,
2003; Chavez et al., 2004; Nagasaka et al., 2004). Owing to their polymorphism, size
(between 500 nm and a few microns in diameter) and to their chemical content (phosphorus-
a
c
b
202
rich electron dense material associated to divalent cations), E. mutabilis vacuolar ferrous
phosphates are comparable to the Ca polyphosphates accumulating within single membrane
intracellular acidic organelles, known as acidocalcisomes (Docampo et al., 2005; Miranda et
al., 2004). Relationships between the organelles observed in this study and acidocalcisomes
would deserve future structural and biochemical investigations.
In the Carnoulès AMD, iron is mostly immobilized by massive precipitation of
crystalline and amorphous iron-arsenic hydroxysulfates, which have been demonstrated to
result from bacterial activity (Morin et al., 2003). In contrast, the intracellular ferrous
phosphates in E. mutabilis cells do not contain arsenic, although it is known that both arsenite
and arsenate easily sorb on iron oxides and that arsenate usually substitutes to phosphate
groups (e.g. Morin et al. 2006 and references therein). These results are consistent with the
low concentration of intracellular arsenic reported by Casiot et al., 2004 in E. mutabilis from
the Carnoulès AMD, namely 336 µg.g-1
of dry weight corresponding to approximately 3
mg.L-1
arsenic in living cells (against 80-250 mg.L-1
in the Reigous water). The absence of
intracellular accumulation of arsenic in E. mutabilis contrasts with the behaviour of other
toxic elements in the model alga E. gracilis, such as Cu2+
and Zn2+
(Einicker-Lamas et al.,
2002), which have been found to accumulate within intracellular phosphate-rich phases. A
previous study investigating the mechanism of arsenic resistance in E. gracilis, highlighted
the role of the glutathione pathway (Miot et al., 2008) and the absence of intracellular arsenic
accumulation, potentially relying on an arsenic excretion pathway. This arsenic excretion
mechanism could thus adequately explain the low arsenic, iron-rich deposits observed in both
Euglenae. Noteworthy, the decoupling between As(III) and Fe(II) pathways in E. mutabilis
and in E. gracilis contrasts with what is known from abiotic and bacteria-mediated processes
in AMD systems (Morin & Calas, 2006) and could provide a signature of such eukaryotic
metabolisms in recent and ancient Fe/As rich natural systems.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors are indebted to Dr. Guillaume Wang (CNRS-CECM, Vitry-sur-Seine) for STEM
imaging and microanalysis. This work was supported by the ECCO/ECODYN CNRS/INSU
Program, by ACI/FNS grant #3033, by SESAME IdF grant #1775, and by NSF-EMSI Grant
CHE-0431425 (Stanford Environmental Molecular Science Institute). This is IPGP
203
contribution #nnnn.
REFERENCES
Appanna VD and Hamel R (1996) Aluminum detoxification mechanism in Pseudomonas
fluorescens is dependent on iron. FEMS Microbiology Letters, 143, 223-228.
Aviles C, Loza-Tavera H, Terry N, Moreno-Sanchez R (2003) Mercury pretreatment selects
an enhanced cadmium-accumulating phenotype in Euglena gracilis. Archives of
Microbiology, 180, 1-10.
Benzerara K, Morin G, Yoon TH, Miot J, Tyliszczak T, Casiot C, Bruneel O, Farges F,
Brown GE, Jr. (2008) Nanoscale study of As biomineralization in an acid mine drainage
system. Geochimica et Cosmochimica Acta, 72, 3949-3963.
Benzerara K, Yoon TH, Tyliszczak T, Constantz B, Spormann AM, and Brown Jr GE (2004)
Scanning transmission x-ray microscopy study of microbial calcification. Geobiolgy. 2, 249-
259.
Bluhm H, Andersson K, Araki T, Benzerara K, Brown Jr., GE, Dynes JJ, Ghosal S, Gilles
MK, Hansen HC, Hemminger JC, Hitchcock AP, Ketteler G, Kilcoyne ALD, Kneedler E,
Lawrence JR, Leppard GG, Majzlam J, Mun BS, Myneni SCB, Nilsson A, Ogasawara H,
Ogletree DF, Pecher K, Salmeron M, Shuh DK, Tonner B, Tyliszczak T, Warwick T, and
Yoon TH (2006) Soft X-ray microscopy and spectroscopy at the molecular environmental
science beamline at the Advanced Light Source. Journal of Electron Spectroscopy and
Related Phenomena. 150, 86-104.
Brake SS, Dannelly HK, Connors KA, Hasiotis ST (2001) Influence of water chemistry on the
distribution of an acidophilic protozoan in an acid mine drainage system at the abandoned
Green Valley coal mine, Indiana, USA. Applied Geochemistry, 16, 1641-1652.
Buetow DE (1968) The Biology of Euglena. Academic Press, New York.
Casiot C, Leblanc M, Bruneel O, Personne JC, Koffi K, Elbaz-Poulichet F (2003)
Geochemical processes controlling the formation of As-Rich waters within a tailings
impoundment (Carnoulès, France). Aquatic Geochemistry, 9, 273-290.
Casiot C, Morin G, Juillot F, Bruneel O, Personné JC, Leblanc M, Duquesne K, Bonnefoy V,
Ebaz-Poulichet F (2003b) Bacterial immobilization and oxidation of arsenic in acid mine
drainage (Carnoulès creek, France). Water Research, 37, 2929-2936.
Casiot C, Bruneel O, Personné JC, Leblanc M, Elbaz-Poulichet F (2004) Arsenic oxidation
204
and bioaccumulation by the acidophilic protozoan, Euglena mutabilis, in acid mine drainage
(Carnoulès, France). Science of the Total Environment, 320, 259-267.
Chavez FP, Lunsdörf H, Jerez CA (2004) Growth of polychlorinated-biphenyl-degrading
bacteria in the presence of biphenyl and chlorobiphenyls generates oxidative stress and
massive accumulation of inorganic polyphosphate. Applied Environmental Microbiology, 70,
3064-3072.
Docampo R, De Souza W, Miranda K, Rohloff P, Moreno SNJ (2005) Acidocalcisomes -
conserved from bacteria to man. Nature, 3, 251-261.
Duquesne K, Lebrun S, Casiot C, Bruneel O, Personné J-C, Leblanc M, Elbaz-Poulichet F,
Morin G, Bonnefoy V (2003) Immobilization of arsenite and ferric iron by Acidithiobacillus
ferrooxidans and its relevance to acid mine drainage. Applied Environmental Microbiology,
69(10), 6165-6173.
Dynes JJ, Lawrence JR, Korber DR, Swerhone GDW, Leppard GG, Hitchcock AP (2006)
Quantitative mapping of chlorhexidine in natural river biofilms. Science of the total
environment, 369, 369-383.
Einicker-Lamas M, Mezian GA, Fernandes TB, Silva FLS, Guerra F, Miranda K, Attias M.,
Oliveira MM (2002) Euglena gracilis as a model for the study of Cu2+
and Zn2+
toxicity and
accumulation in eukaryotic cells. Environmental Pollution, 120, 779-786.
Hitchcock AP (2001) Soft X-ray spectromicroscopy of polymers and biopolymer interfaces,
Journal of Synchrotron Radiation. 8, 66-71.
Inskeep W, Macur RE, Harrison G, Bostick BC, Fendorf S (2004) Biomineralization of
As(V)-hydrous ferric oxyhydroxide in microbial mats of an acid-sulfate-chloride geothermal
spring, Yellowstone National Park. Geochimica et Cosmochimica Acta. 68, 3141-3155.
Kapfer M (1998) Assessment of the colonization and primary production of
microphytobenthos in the littoral of acidic mining lakes in Lusatia (Germany). Water, Air and
Soil Pollution, 108, 331-340.
Leblanc M, Achard B, Ben Othman D, Luck JM (1996) Accumulation of arsenic from acidic
mine waters by ferruginous bacterial accretions (stromatolites). Applied Geochemistry, 11,
541-549.
Lechaire JP, Shillito B, Frébourg G, Gaill F (2002) Elemental characterization of
microorganism granules by EFTEM in the tube wall of a deep-sea vent invertebrate. Biology
of the Cell, 94, 243-249.
Mann H, Tazaki K, Fyfe WS, Beveridge TJ, Humphrey R (1987) Cellular lepidocrocite
precipitation and heavy metal sorption in Euglena sp. (unicellular alga): implications for
205
biomineralization. Chemical Geology, 63, 39-43.
Miot J, Morin G, Skouri-Panet F, Ferard C, Briand J, Guyot F, Brown GE (submitted)
EXAFS study of arsenic coordination in Euglena gracilis exposed to arsenite.
Miranda K, Rodrigues CO, Hentchel J, Vercesi A, Plattner H, de Souza W, Docampo R
(2004) Acidocalcisomes of Phytomonas françai possess distinct morphological characteristics
and contain iron. Microscopy and Microanalysis, 10, 647–655.
Morin G, Juillot F, Casiot C, Bruneel O, Personné J-C, Elbaz-Poulichet F, Leblanc M,
Ildefonse Ph, Calas G (2003) Bacterial formation of tooeleite and mixed arsenic(III) or
arsenic(V)-iron(III) gels in the Carnoulès acid mine drainage, France. A XANES, XRD and
SEM study. Environmental Science and Technology, 37, 1705-1712.
Morin G and Calas G (2006) Arsenic in soils, mine tailings, and former industrial sites.
Elements, 2(2), 97-101.
Nagasaka S, Nishizawa NK, Mori S, Yoshimura E (2004) Metal metabolism in the red alga
Cyanidium caldarium and its relationship to metal tolerance. Biometals, 17, 177-181.
Nishikawa K, Yamakoshi Y, Uemura I, Tominaga N (2003) Ultrastructural changes in
Chlamydomonas acidophila (Chlorophyta) induced by heavy metals and polyphosphate
metabolism. FEMS Microbiology Ecology, 44, 253-259.
Perales-Vela HV, Pena-Castro JM, Canizares-Villanueva RO (2006) Heavy metal
detoxification in eukaryotic microalgae. Chemosphere, 64, 1-10.
Ruiz FA, Marchesini N, Seufferheld M, Govindjee, Docampo R (2001) The polyphosphate
bodies of Chlamydomonas reinhardtii possess a proton-pumping pyrophosphatase and are
similar to acidocalcisomes. The Journal of Biological Chemistry, 276/49, 46196-46203.
Ruiz FA, Lea CR, Oldfield E, Docampo R (2004) Human platelet dense granules contain
polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.
TheJournal of Biological Chemistry, 279(43), 44250-7.
Seufferheld M, Vieira MC, Ruiz FA, Rodrigues CO, Moreno SN, Docampo R (2003)
Identification of organelles in bacteria similar to acidocalcisomes of unicellular eukaryotes.
The Journal of Biological Chemistry, 278(32), 29971-8.
Smillie RM and Krotkov G (1960) Phosphorus-containing compounds in Euglena gracilis
grown under different conditions. Archives of Biochemistry and Biophysics, 89, 83-90.
Vercesi AE, Moreno SNJ, Docampo R (1994) Ca2+
/H+
exchange in acidic vacuoles of
Trypanosoma brucei. Biochemistry Journal, 304, 227–233.
Woongghi S and Triemer RE (2004) Phylogenetic analysis of the genus Euglena
(Euglenophyceae) with particular reference to the type species Euglena viridis. Journal of
206
Phycology, 40, 759-771.
Yoon TH, Johnson SB, Benzerara K, Doyle CS, Tyliszczak T, Shuh DK, Brown GE (2004) In
situ characterization of aluminium-containing mineral-microorganism aqueous suspensions
using Scanning Transmission X-ray Mircroscopy. Langmuir, 20, 10361-10366.
207
Chapitre 2.B.
Détoxification et toxicité de l’arsenic (As(III) et As(V)) chez E. gracilis
Problématique et objectifs.
Toxicité de l’arsenic. Outre les fortes teneurs en fer dissous, les AMD tels que celui de
Carnoulès sont également très riches en arsenic. L’arsenic sous ses deux états redox As(III) et
As(V) en solution présente une forte toxicité vis-à-vis des organismes vivants. La toxicité de
l’As(III) est généralement attribuée à sa capacité à pénétrer dans les cellules de façon passive
via des aquaglycéroporines (Rosen, 2002) et à entraîner la production de radicaux libres dans
la cellule (Bau et al., 2002). Par ailleurs, la toxicité de l’As(V) est attribuée à la similarité
entre les deux oxyanions arsenate et phosphate. Ainsi, l’arsenate se substitute aux
groupements phosphate et aux têtes de choline dans les phospholipides de la membrane
plasmique (Tuan et al., 2008). L’arsenate peut aussi pénétrer dans les cellules par les
transporteurs phosphate (Yompakdee et al., 1996, Rosen, 2002). Une fois dans la cellule, il
peut se substituer aux groupements phosphate des molécules biologiques, telles que l’ADP,
l’ATP ou les pompes ioniques (Moore et al., 1983, Slooten & Nuyten, 1983, Kenney &
Kaplan, 1988). Enfin, quoique dans une moindre mesure que l’As(III), l’As(V) peut entraîner
la production de radicaux libres pouvant endommager l’ADN (Ding et al., 2005).
Mécanismes de résistance à l’arsenic chez les procaryotes et chez les eucaryotes. Différents
mécanismes de résistance ont été développés par les procaryotes et les eucaryotes pour
résister à la toxicité de l’arsenic. Dans les écosystèmes de type AMD, la première stratégie de
détoxification est la précipitation extracellulaire de phases solides riches en Fe-As (Morin et
al., 2003, Morin & Calas, 2006). Mais les mécanismes intracellulaires jouent également un
rôle important en permettant de maintenir les concentrations cytoplasmiques d’As à des
niveaux bas et vont se révéler d’importance majeure pour les Euglènes étudiées dans l’AMD
de Carnoulès. Le schéma classique de détoxification cellulaire de l’arsenic passe par (1) le
prélèvement de l’arsenic sous forme d’As(III) via des aquaglycéroporines ou sous forme
d’As(V) via des transporteurs phosphate ; (2) la réduction de l’As(V) en As(III) par des
arsenate réductases et (3) l’export ou la séquestration intracellulaire de l’As(III) (Rosen,
2002). Cependant, si le schéma global est similaire chez les procaryotes et les eucaryotes,
certaines protéines spécifiques sont le fruit de convergences évolutives. En particulier, au
moins trois familles d’arsenate réductases ont été identifiées, qui seraient issues de chemins
évolutifs différents (Mukhopadhyay & Rosen, 2002) : l’arsenate réductase ArsC du plasmide
208
pI258 de Staphylococcus aureus (Ji et al., 1994), l’arsenate réductase procaryote ArsC
d’Escherichia coli (Rosen, 1999) et l’arsenate réductase Acr2p de Saccharomyces cerevisiae
(Bobrowicz et al., 1997) qui est la seule arsenate réductase eucaryote identifiée à ce jour. Par
ailleurs, les enzymes impliquées dans le cycle du glutathion jouent un rôle clé dans la phase
de réduction de l’As(V) en As(III) et dans la complexation de l’As(III) avant son export ou sa
séquestration vacuolaire, aussi bien chez les procaryotes, que chez les plantes ou les
mammifères (Zaman et al., 1995, Mukhopadhyay et al., 2000, Cobbett, 2000). Le glutathion
est un peptide de trois acides aminés (γ-Glu-Cys-Gly), dont la synthèse s’effectue en deux
étapes ATP-dépendantes, catalysées successivement par la γ-glutamyl-cystéine-synthase et
par la glutathion-synthase. Sous sa forme réduite (GSH), il réduit l’As(V) en As(III), selon
l’équation 1:
H2AsO4- + 2 GSH + H
+ � H3AsO3 + GS-SG + H2O (Eqn. 1)
Les glutarédoxines, oxydoréductases ubiquistes de la famille des thiorédoxines, ont également
été identifiées chez E. coli, chez la levure (Fernandes & Holmgern, 2004) et plus récemment
dans une plante (Sundaram et al., 2008), qui peuvent aussi jouer ce rôle de réducteur.
La polymérisation du glutathion, catalysée par la phytochélatine-synthase, conduit à la
formation de peptides de plus haut poids moléculaire, les phytochélatines : γ-(Glu-Cys)n-Gly,
avec n<10. Ces peptides jouent un rôle dans la détoxification de l’arsenic mais aussi d’autres
métaux lourds, tels que le Cd chez de nombreux microorganismes ou plantes (Cobbett, 2000).
Le rôle de la méthylation de l’arsenic comme mécanisme de détoxification est largement
remis en question depuis quelques années. Plusieurs auteurs observent que les espèces
méthylées (et plus particulièrement les espèces méthylées d’As(III)) sont responsables d’une
toxicité accrue de l’arsenic (Styblo et al., 2002).
Objectifs de cette étude. Dans les environnements extrêmes que représentent les AMD, les
concentrations en As(III) et en As(V) dissous peuvent atteindre des concentrations létales
pour la plupart des organismes vivants (de l’ordre de 260 et 100 mg.L-1
respectivement dans
l’AMD de Carnoulès). Pourtant, même si la diversité microbienne est plus faible dans ces
environnements que dans des systèmes non pollués (Bruneel et al., 2006), plusieurs espèces
procaryotes et de rares eucaryotes sont adaptés à ces conditions. E. gracilis et E. mutabilis
sont parmi les seuls eucaryotes résistant à ces concentrations en métalloïdes, ce qui pose la
question des mécanismes de résistance à l’arsenic de ces microorganismes. Si les mécanismes
209
de résistance ont été déjà en partie élucidés chez les mammifères ou chez des procaryotes, ils
restent largement inexplorés chez les eucaryotes présents dans les AMD.
Méthodologie.
Utilisation de la spectroscopie d’absorption X pour l’analyse d’éléments traces. Pour fournir
des éléments de réponse à cette question, nous avons déterminé la spéciation de l’arsenic dans
des cellules d’E. gracilis, cultivées au laboratoire dans des milieux enrichis en As(III) (article
#6, p. 201) ou As(V) (article #7, p. 207). Dans ces deux cas, la spéciation de l’arsenic a été
explorée par spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS) au seuil K de l’As. Cette
technique permet d’accéder aux caractéristiques de l’environnement atomique de l’élément
d’intérêt dans des systèmes dilués (quelques dizaines de mg.kg-1
). Il permet par ailleurs de
déterminer la nature des ligands de la première sphère de coordination de l’arsenic (O, C, S en
particulier). En revanche, ne permettant pas d’accéder à la nature des atomes situés à plus de 5
Å de l’atome central d’arsenic dans des matériaux non cristallins, cette méthode ne permet pas
de discriminer une unité peptidique d’un polymère composé de plusieurs de ces unités. En
conséquence, les techniques classiques de biologie moléculaire (e.g. HPLC, spectrométrie de
masse) sont complémentaires de cette approche.
Principaux résultats et perspectives.
Nos résultats indiquent qu’E. gracilis est plus résistante à l’As(III) qu’à l’As(V). A faible
concentration en As(V), les mécanismes de détoxification passent par une étape de réduction
en As(III). Ensuite, que l’arsenic soit initialement fourni sous forme d’As(III) ou d’As(V),
l’As(III) est complexé dans le cytoplasme à des ligands protéiques de faible poids moléculaire
via des liaisons thiols, avant d’être exporté de la cellule. L’utilisation d’une molécule inhibant
des enzymes participant à la synthèse du glutathion (la buthionine sulfoximine) montre que le
cycle du glutathion est impliqué dans l’étape de complexation de l’As(III). Nous avons
également testé d’autres inhibiteurs enzymatiques afin de mieux cerner les protéines en jeu
dans le mécanisme de détoxification de l’As(III) chez E. gracilis (Fig. 2B-1). Les résultats
préliminaires que nous avons obtenus nécessiteront d’être répliqués dans le futur, afin de
confirmer les hypothèses que nous émettons. La molécule MK-571 est un inhibiteur des
multidrug resistance proteins (MRP), impliquées dans l’export des complexes métal-
glutathion des cellules chez les mammifères. A une concentration de 5 µmol.L-1
, cette
molécule n’a aucun effet sur la croissance des cellules cultivées en l’absence d’arsenic. En
revanche, en présence de 100 mg.L-1
d’As(III) dans le milieu de culture, la densité cellulaire
210
obtenue en phase stationnaire est diminuée. Ceci suggère une potentielle implication de MRP
ou d’autres transporteurs sensibles au MK-571, dans l’export d’As(III) depuis la cellule d’E.
gracilis. Par ailleurs, il serait également intéressant de tester l’effet du Vérapamil, inhibiteur
des P-glycoprotéines, une autre famille de transporteurs impliqués dans l’export de complexes
glutathion-métal. En effet, une étude a identifié de tels transporteurs chez E. gracilis
surexprimés en présence de cadmium (Einicker-Lamas et al., 2003).
A des concentrations initiales en As(V) dépassant 100 mg.L-1
, l’As(V) n’est majoritairement
pas réduit en As(III) et affecte fortement la croissance cellulaire. Dans ces conditions, l’As(V)
est presqu’exclusivement concentré dans la fraction insoluble des cellules
(membranes+organites). Notre étude suggère que deux étapes pourraient être responsables de
la toxicité accrue de l’As(V) dans E. gracilis : (1) le prélèvement préférentiel de l’As(V) en
solution par comparaison avec l’As(III) et (2) la compétition entre la réduction de l’As(V) et
la substitution de l’arsenate aux groupements phosphate dans les composants cellulaires.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
WTWT + 0.5 µM MK 571WT + 2 µM MK 571WT + 5 µM MK 571
Ab
so
rban
ce (
64
0 n
m)
Temps, jours
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
As 100As 100 + 0.5 µM MK571As 100 + 2 µM MK571As 100 + 5 µM MK 571
Ab
so
rban
ce (
64
0 n
m)
Temps, jours
Figure 2B-1. Courbes de croissance d’E. gracilis en présence en l’absence (WT) ou en
présence d’As(III) à 100 mg.L-1
(As 100) et en présence de l’inhibiteur MK 571, inhibiteur
des multidrug resistance proteins (MRP1).
Si nos résultats prouvent que l’utilisation de la spectroscopie d’absorption des rayons
X (XAS) permet de contraindre fortement les mécanismes de résistance à l’arsenic chez un
eucaryote unicellulaire, il est évident que le couplage à des techniques biochimiques (e.g.
HPLC, spectrométrie de masse), permettra –dans le futur – d’identifier plus précisément les
A B
211
protéines ou peptides impliqués dans ces mécanismes. De telles expériences ont récemment
débuté dans notre laboratoire et en collaboration avec Laurence Sabatier à l’Institut
Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) de Strasbourg.
212
213
214
215
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218
219
Detoxification and high toxicity of As(V) in Euglena gracilis.
Jennyfer Miot1,*, Guillaume Morin1, Fériel Skouri-Panet1, Céline Férard1, Antonine
Poitevin1, Emmanuel Aubry2, Georges Ona-Nguema1, Farid Juillot1, François Guyot1,
Gordon E. Brown Jr3,4
.
1 Institut de Minéralogie et de Physique des Milieux Condensé and Institut de Physique du
Globe de Paris, Universités Paris 6 et Paris 7, UMR 7590, CNRS.
140, rue de Lourmel 75015 Paris, France
2 Biogéochimie et Ecologie des Milieux Continentaux (Bioemco)
UMR 7618 Université Paris 6, INRA, INAPG, CNRS, ENS, ENSCP
Case 120 Tour 56, couloir 56-66 4ème étage 4 place Jussieu 75252 Paris cedex 05, France.
3Surface & Aqueous Geochemistry Group, Department of Geological & Environmental
Sciences, Stanford University, Stanford, CA 94305-2115, USA
4Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, MS 69, SLAC, Menlo Park, CA 94025, USA
Submitted to
Environmental Science & Technology
September 2008
*Corresponding author:
[email protected] Tel: 0033144279832; Fax: 0033144273785
220
Abstract
Euglena gracilis is a photosynthetic eukaryote ubiquitous in arsenic-polluted acid mine
drainages. This protozoan is locally exposed to As(III) and As(V) concentrations up to 250
mg L-1
and 100 mg L-1
respectively. In a previous study (1), we investigated the resistance of
E. gracilis to As(III), which was found to accumulate only at very small extent in the cells. In
the present paper, As(V) toxicity towards E. gracilis is evaluated by X-ray absorption
spectroscopy and selected (bio)chemical methods. We observe that E. gracilis is less resistant
to As(V) than to As(III). At As(V) concentrations < 100 mg L-1
, our results suggest the
following detoxification scheme: (1) uptake of As(V) from solution, (2) intracellular
reduction to As(III), (3) complexation by specific proteic thiol ligands of low molecular
weight in the cytoplasm, and (4) As(III) expulsion from the cell. However, at As(V)
concentrations > 100 mg L-1
, cell growth is dramatically affected, and As(V) remains mostly
unreduced. Intracellular As(V) is found to be exclusively concentrated in the insoluble
fraction, suggesting that arsenate could substitute for phosphate groups in membranes or in
phosphate-containing macromolecules. Thus, our study highlights the partitioning of arsenic,
with proteic As(III)-thiol compounds concentrated in the cytoplasmic proteic pool and As(V)-
compounds associated with the membrane+organite fraction. In addition, arsenic was not
accumulated at high levels in the cells, although accumulation was higher when arsenic was
introduced as As(V) than as As(III). We suggest that two steps could account for the higher
toxicity of As(V) compared to As(III) in E. gracilis: (1) higher bioavailability and uptake of
As(V) from solution and (2) competition between As(V) reduction and arsenate substitution
for phosphate in cell components.
221
Introduction
Water contamination by arsenic is a major health and environmental issue because its
concentration exceeds the current World Health Organization maximum contaminant level
(10 µg L-1
) in tens of thousands of sites worldwide (2). In particular, acid mine drainages
(AMD) resulting form the weathering of As-rich sulfide mine wastes exhibit extremely high
concentrations of dissolved arsenic (up to 250 mg L-1
) (3). At the acidic pH prevailing in these
systems (pH 2-4) (3), dissolved arsenic is present dominantly in two highly toxic forms:
H3AsIII
O3 and H3AsVO4. In AMD, arsenic is dominantly released as H3As
IIIO3, but dissolved
As(V) concentrations can also reach very high levels (e.g., more than 100 mg L-1
in the
Carnoulès AMD) (4).
Although biodiversity is lower in these systems than in unpolluted ones, various
microorganisms are adapted to these extreme environments (5). In particular, photosynthetic
protozoans of the genus Euglena are among the few eukaryotes ubiquitous in these systems
(4, 5, 6). At the Carnoulès site (Gard, France), Euglena mutabilis, a close relative of Euglena
gracilis (7), is locally exposed to very high As(III) concentrations, up to 250 mg L-1
and to
high levels of As(V), reaching more than 100 mg L-1
(4).
As(III) detoxification in E. gracilis has been shown to proceed through the glutathione
pathway (8), leading to the production of As(III)-thiol bonds, potentially in the form of
As(III)-(SG)3 or As(III)-phytochelatin complexes (1). The toxicity of As(V) is related to the
similarity of arsenate and phosphate oxoanions. Outside the cell, arsenate substitutes for
phosphate groups and for choline heads in phospholipids of the plasma membrane (9).
Arsenate can also enter the cell through phosphate transporters (10, 11), and once inside the
cell, it can substitute for phosphate groups in molecules such as ADP, ATP, or ion-pumps (12,
13, 14). Arsenate can also enhance the production of free radicals inducing DNA damage,
though to a lesser extent than As(III) (15). Despite these important findings, the mechanisms
of arsenate detoxification have not been studied in eukaryotic microorganisms observed in
As-rich AMD.
In the present study, we investigate the resistance of the photosynthetic protozoan E. gracilis
to As(V) concentrations reaching those encountered in AMD in order to assess possible
mechanisms accounting for the adaptation of this eukaryote to elevated As(V) concentrations
in the field. E. gracilis cells were exposed to As(V) concentrations ranging from 0 to 200 mg
L-1
in batch cultures performed at acidic pH. Arsenic speciation in the cells and intracellular
222
localization of As-bearing compounds were determined by X-ray Absorption Spectroscopy
(XAS) and by chemical and biochemical methods.
Materials and Experimental Procedures
Cell cultures. All reagent grade chemicals used for culture medium preparation were from
Sigma-Aldrich, except for FeCl3 and Na3AsVO4, which were purchased from Fluka-Chemika.
Euglena gracilis Z (n°1224-5d, Cambridge) was cultured at ambient temperature under
permanent light exposure in a pH 3.2 culture medium composed of KH2PO4 (0.5 g L-1
),
MgSO4, 7H2O (0.5 g L-1
), CaCl2, 2H2O (0.26 g L-1
), (NH4)2HPO4 (0.5 g L-1
), and a
complement of vitamins, zinc (as ZnSO4), iron (as FeCl3), and manganese (as MnSO4) (16).
Ethanol was supplied as a carbon source. In test cultures and abiotic controls, arsenic was
added as Na2HAsVO4 at the following concentrations: 10, 50, 100, and 200 mg L
-1. Growth
kinetics of the cultures were monitored by measuring the optical absorbance of the cultures at
640 nm for 8 days.
Sample preparation. For XAS analyses and arsenic concentration measurements, cells were
harvested by centrifugation (5000 g, 10 min) either in the exponential phase (Eg-As50, Eg-
As100 and Eg-As200) or the stationary phase (Eg-As100*), rinsed twice in MilliQ water,
dried at ambient temperature under vacuum, and ground in an agate mortar. Powders were
stored under nitrogen atmosphere before XAS analyses. For total arsenic analysis, 10 to 20
mg of dry powders were weighed (precision: 0.1 mg) and batch digested in 1 mL 15M HNO3
at 100°C for 24 h, sonicated for 5 minutes, and diluted to 5 mL in MilliQ water.
Supernatants of the 10-day old cultures and the abiotic controls were filtered through a
0.22µm membrane filter. A first fraction of filtered supernatants was acidified with 1M HNO3
for analysis of total As concentration in solution. A second fraction was used to separate
As(III) and As(V) on an anionic resin (Varian Bondelut JR-SAX 500mg) after a method
modified from Ficklin (17). The resin was first humidified with 5 mL of MilliQ water, and
then 5 mL of the filtered supernatant of the culture and 15 mL of MilliQ water were
successively eluted through the resin to obtain the As(III)-extract. Finally, 15 mL of 0.12M
HCl were eluted to obtain the As(V)-extract.
223
Cells used for intracellular localization of As-containing compounds by XAS and for
liquid chromatography analyses of the culture of E. gracilis cells exposed to 100 mg L-1
As(V), cells were harvested by centrifugation (5000 g, 10 min), and rinsed twice in 50 mM
Tris – 20 mM NaCl buffer (pH 7). Cells were then sonicated in the same buffer to which 0.2
µM AEBSF (antiprotease from Novagen) was added and centrifuged 2 to 4 times (11000 g,
30 min). The supernatant following centrifugation is referred to as the cytoplasmic fraction,
and the pellet, which contained a mixture of membranes and organites, is referred to as the
insoluble fraction. The insoluble fraction was dried under vacuum and ground in an agate
mortar inside an anoxic glove-box for XAS analyses. The cytoplasmic fraction was split into
two portions, one of which was used for Liquid Phase Chromatography analyses (see infra).
The other portion was prepared for XAS analyses by precipitating proteins with 6.1 M
trichloroacetic acid. Proteins were subsequently collected as a pellet by centrifugation (11000
g, 45 min), dried under vacuum, and ground in an agate mortar in an anoxic glove box.
Protein separation by liquid chromatography. Proteins from the cytoplasmic fraction were
size-separated by Liquid Phase Chromatography (LPC) using a Sephacryl S200 16/60 column
(GE Healthcare) and a 50 mM Tris-20 mM NaCl (pH 7) buffer as an eluent. Proteins were
detected at λ = 280 nm. The separated proteins of the profile were collected, and a total of 43
fractions (2 mL each) were further analyzed for their arsenic content.
Arsenic analysis in solution. Total As concentrations in the digests, in the culture
supernatants, in the fractions collected from liquid chromatography, in the abiotic controls,
and in the As(III)-extracts from the culture supernatant were determined by Flame Atomic
Absorption Spectrometry (Solaar S, Thermo electron corporation). Arsenic concentrations in
the As(V)-extracts from the culture supernatants were measured by Furnace Atomic
Absorption Spectrometry (Unicam 989 QZ, Thermo electron corporation).
Model compounds. Arsenobetaine (AB, Sigma-Aldrich) and As(III)-tris-glutathione (As-
(GS)3) were used as model compounds for the XAS experiments. As-(GS)3 was synthesized
under dry nitrogen atmosphere by adding an excess of reduced glutathione (GSH, Sigma-
Aldrich) to NaAsO2 (Fluka Chemika): 1 mg of NaAsO2 was allowed to react overnight with
100 mg of GSH in 5 mL of degassed MilliQ water. The solution was evaporated to dryness at
ambient temperature under a nitrogen atmosphere, and the resulting white precipitate was
collected as a powder.
224
XAS data collection and analyses. Data were recorded at the As K-edge (11859 eV) on
beamline 11-2 at the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL) using the same
procedure as described in Miot et al. (1) and Ona-Nguema et al. (18). X-ray absorption
spectra were averaged using the SixPack software (19). Background-subtracted EXAFS data
were extracted using the XAFS program (20) following the procedure detailed previously
(18). Least-squares fitting of the unfiltered EXAFS functions was performed with the plane-
wave formalism, using a Levenberg-Marquard minimization algorithm (18). Ab initio phase
shifts and total amplitude functions employed in this fitting procedure were calculated with
the curved-wave formalism using the ab-initio FEFF 8 code (21) and the crystallographic
parameters of phenyldichloroarsine-British Anti-Lewisite (22). For sample Eg-As100*,
XANES data were fit by linear lest-squares fitting (LSF) within the 11860 – 11890 eV energy
range, using linear combinations of XANES spectra of the As-(GS)3 model compound and the
Eg-As100*-insoluble fraction sample. This LSF procedure is detailed in a previous study by
Morin et al. (23).
Results
E. gracilis growth in the presence of arsenate. Growth kinetics of E. gracilis exposed to
arsenate at concentrations ranging from 10 to 200 mg L-1
are presented in Fig. 1. The final cell
density is highly dependent on the initial dose of As(V) in the culture medium: the cell
density is about 5 times lower in the presence of 200 mg L-1
As(V) than in the absence of
arsenic after 8 days of culture. Thus, E. gracilis is tolerant to As(V) up to 100 mg L-1
, but
growth is almost completely inhibited at an As(V) concentration of 200 mg L-1
.
Initial [AsV]
in the culture medium, mg L
-1
Total [As] in the supernatant, mg L
-1
[AsIII]/total[As] in the
supernatant, %
Total [As] in dry
cells, mg kg-1
As concentration
factor
10 8.5 ± 1 23.4 21 ± 5 0.20 ± 0.05 50 47.1 ± 1 16.6 51 ± 5 0.10 ± 0.01
100 92.4 ± 1 6.8 123 ± 10 0.12 ± 0.01 200 181.6 ± 1 3.2 946 ± 10 0.48 ± 0.005
TABLE 1. Total arsenic concentrations and As(III)/total As concentrations measured by
Atomic Absorption Spectrometry in abiotic controls, in the filtered supernatants and in the dry
cell mass of E. gracilis cultures, with initial As(V) concentrations ranging from 10 to 200 mg
L-1
, after 8 days of culture. As concentration factor in the living cells with respect to the
supernatant was calculated as: (Total [As]dry cells * 0.1) / Initial [AsV]culture medium
225
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ab
so
rban
ce (
640
nm
)
Time, days
Figure 1. Growth curves of E. gracilis cultures determined by measuring absorbance at 640
nm. Cells were cultured at increasing As(V) concentrations: (●) 0 mg L-1
, (□) 10 mg L-1
, (■)
50 mg L-1
, (∆) 100 mg L-1
, (×) 200 mg L-1
. Cells were sampled either in the exponential or in
the stationary phase (grey areas). Growth kinetics are slowed down with increasing As(V)
concentrations in the culture medium.
Measurements of As concentration in the supernatants of the cultures and in the acid-
digested pellets (Table 1) indicate that small amounts of arsenic are accumulated within the
cells. Indeed, 21±5 to 946±10 µg of As are accumulated per g of dry cells for initial As(V)
concentrations in the culture medium ranging from 10 to 200 mg L-1
. Assuming that E.
gracilis cells are composed of 90 wt% water, we deduce that As concentrations in the living
cells range from around 2 to 90 mg L-1
for initial As(V) concentrations ranging from 10 to
200 mg L-1
, respectively. Calculating the arsenic concentration factor in the living cells as:
As concentration factor = (Total [As]dry cells * 0.1) / Initial [AsV]culture medium
we conclude that As concentration in the living cells is 2 to 10 times lower than in the culture
medium. Moreover, no intracellular arsenic accumulation could be detected by EDX (Energy
Dispersive X-ray Spectroscopy) performed in a TEM (Transmission Electron Microscope) on
E. gracilis thin sections (data not shown). These results indicate that E. gracilis does not
accumulate significant amounts of arsenic. Moreover, we observe that arsenic in the
supernatants is partly reduced to As(III), the proportion of As(III) decreasing with increasing
initial As(V) concentration in the culture medium and being negligible at 200 mg L-1
As(V).
226
Arsenic speciation in E. gracilis. X-ray Absorption Near Edge Structure (XANES) spectra of
dry cells of E. gracilis exposed to 50 mg L-1
As(V) and sampled in the exponential phase (Fig.
2A) exhibit an absorption maximum at 11869.8 eV, which corresponds to As(III) coordinated
to three thiolate groups, such as in As(III)-(SG)3 (Fig. 2) (24). With increasing initial As(V)
concentration in the culture medium, we observe an absorption maximum at 11875 eV, which
corresponds to inorganic As(V). At the highest initial As(V) concentration (200 mg L-1
), only
the absorption maximum at 11875 eV remains. At intermediate values of initial As(V)
concentration (100 mg L-1
), this peak is predominant in the exponential phase sample (Eg-
As100), whereas absorption maxima at 11869.8 eV and at 11875 eV coexist in the stationary
phase sample (Eg-As100*).
11860 11870 11880 11890
No
rmali
ze
d a
bs
orb
an
ce
Energy, eV
11875 eV
11869.8 eV
CpFh-As(V)
Eg-As50
Eg-As100
Eg-As200
As-(SG)3
2
AB
Eg-As100*
11872.4 eV
4 6 8 10 12
k3χχ χχ
(k)
k, A-1
AB
As-(SG)3
Eg-As50
Eg-As100*
Eg-As200
10
CpFh-As(V)
Eg-As100
Figure 2. XAS data at the As K−edge of E. gracilis cells collected in exponential phase (Eg-
As10 to Eg-As200) or in stationary phase (Eg-As100*) exposed to As(V)
(As(V)
concentrations ranging from 50 (As50) to 200 mg L-1
(As200)), compared with the spectra of
the standards As(III)-tris glutathione (As-(GS)3), arsenobetaine (AB) and As(V) (1 wt%)
coprecipitated with ferrihydrite (CpFh-As(V)). Eg-As100 and Eg-As100* samples are from
two independent cultures at 100 mg L-1
As(V). A: XANES spectra. B: Unfiltered k3χ(k) data
and C: corresponding Fourier Transforms. Dashed lines show the data and solid lines the best
fits on the k3χ(k) data (see Table 2).
0.5 1.5 2.5 3.5
FT
mag
nit
ud
e
R(Å)
AB
As-(SG)3
Eg-As50
Eg-As100*
Eg-As100
20
CpFh-As(V)
Eg-As200
A B C
227
Sample N
(± 0.3)
Bond R (Å)
(± 0.03)
σσσσ (Å)
(± 0.02)
E0 (eV)
(± 3)
χχχχ
2
AB 3.5 As-C 1.91 0.05 14 32.0 As-(GS)3 3.2 As-S 2.25 0.05 13 20.0
Eg-50ppm 1.5 As-S 2.27 0.07 19 29.2
1.2 As-C 1.98 Eg-100ppm 1.6 As-S 2.27 0.05 17 22.6
0.8 As-C 1.99 0.2 As-O 1.72
Eg-100ppm* 0.6 As-S 2.24 0.06 3 22.3 2.5 As-O 1.68 0.4 As-M 3.23 12.3 As-O-O 3.00
Eg-100ppm*, insoluble fraction
0.2 As-S 2.27 0.05 5 46.6
3.5 As-O 1.69 0.4 As-M 3.25 12 As-O-O 3.03
Eg-100ppm*, soluble proteins
2.4 As-S 2.26 0.04 14 166
Eg-200ppm 0.2 As-S 2.31 0.05 4 29.7 3.6 As-O 1.69 0.5 As-M 3.18 12.1 As-O-O 3.00
TABLE 2. Fitting results for arsenic K-edge EXAFS data of E. gracilis cells exposed to
As(V) and collected in exponential phase (Eg-50ppm, -100ppm, -200ppm) or in stationary
phase (Eg-100ppm*) and of the As-tris-glutathione (As-(GS)3) and arsenobetaine (AB) model
compounds. Coordination number (N), interatomic distance (R), Debye-Waller parameter (σ)
and energy offset (E0). The fit quality was estimated within the 2.7 – 13 Å-1
k-range, using a
reduced χ2 of the following form:
χ2 = Nind / ( Nind - p ) Σ ( k
4 χ(k)exp – k4 χ(k)calc)
2
with Nind (the number of independent parameters) = (2∆k∆R)/π), p the number of free fit
parameters. Standard deviations indicated under bracket are estimated from the fit of the As-
tris-glutathione model compound.
Fitting results of the Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) spectra are
presented in Table 2 and plotted in Figs. 2B and 2C. At low initial As(V) concentration in the
culture medium (50 mg L-1
), the first-neighbour shell around As mainly consists of S ligands
at a distance (2.27±0.03 Å), which is consistent with the distance measured in As(III)-(SG)3
(2.25±0.03 Å). Arsenic is also partly bound to C ligands at 1.98±0.03 Å. This distance is
longer than the As(V)-C distance measured by EXAFS in the As(V)-methylated molecule
arsenobetaine (1.91±0.03 Å, Table 2) or calculated from the crystal structure of
tetramethylarsonium (1.90 ± 0.02 Å) (25). In contrast, this distance is consistent with that
reported for crystal structures of As(III)-methylated compounds (22). Therefore, our EXAFS
results suggest that arsenic is partly present as an As(III)-methylated compound.
228
At higher initial As(V) concentrations in the culture medium (100 mg L-1
), the first-
neighbor shell consists of a mixture of S ligands at 2.24±0.03 Å and O ligands at 1.68±0.03
Å, which is consistent with the distance measured in inorganic As(V) compounds (e.g. (26)).
At an initial As(V) concentration of 200 mg L-1
, S ligands are almost negligible in the first
shell that consists mainly of O ligands at 1.69±0.03 Å. These results indicate that As(V) is
reduced to As(III) and incorporated into an As(III)-thiol compound at low initial As(V)
concentrations and in minor proportions into an As(III)-methylated compound. However, with
increasing As(V) concentration in the culture medium, most of arsenic remains in an oxidized
form bound to O ligands in the cells.
Finally, EXAFS data fits require the contribution of a metal ligand at ≈ 3.2 Å to fit the second
shell in the cells exposed to 100 and 200 mg L-1
As(V). Fits were performed using an As-As
pair: however, this EXAFS signal could also be fitted by another metal ligand, such as Fe or
Zn. Indeed, intracellular Fe accumulation has been described in E. gracilis (27), and high
concentrations of Zn within E. gracilis cells were observed by XAS in fluorescence-yield
mode (data not shown). Assessing the nature of this additional component would require
further investigations.
Intracellular localization of arsenic species. Because As was not accumulated at high levels
in the cells, classic methods such as energy-dispersive X-ray microanalyses could not help in
localizing As-bearing compounds in E. gracilis. To overcome this difficulty, we disrupted E.
gracilis cells exposed to 100 mg L-1
As(V) and sampled the in stationary phase (Eg-As100*),
which were shown to contain a mixture of As(III)-thiol molecules and As(V)-bearing
compounds. Cell disruption allowed the separation of a “cytoplasmic” fraction from an
“insoluble” fraction (containing membranes and organites). Proteins in the cytoplasmic
fraction were precipitated and analyzed by XAS (fraction denoted “soluble proteins”) as well
as the insoluble fraction.
229
11860 11870 11880 11890 11900
No
rma
lize
d a
bs
orb
an
ce
Energy, eV
2
CpFh-As(V)
Eg-As100*
Eg-As100*,insoluble fraction
Eg-As100*soluble proteins
As-(SG)3
11875 eV
11869.8 eV
4 5 6 7 8 9 10 11 12
k3χχ χχ
(k)
k, A-1
10
As-(SG)3
Eg-As100*, soluble proteins
Eg-As100*
Eg-As100*,insoluble fraction
CpFh-As(V)
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
FT
ma
gn
itu
de
R(Å)
As-(SG)3
Eg-As100*, soluble proteins
Eg-As100*
Eg-As100*,insoluble fraction
20
CpFh-As(V)
Figure 3. XAS data at the As K−edge of the whole cells of E. gracilis exposed to 100 mg L-1
As(V) and collected in stationary phase, and of the soluble proteins and insoluble fraction of
the same culture, compared with the spectra of the standards As(III)-tris glutathione (As-
(GS)3) and As(V) (1 wt%) coprecipitated with ferrihydrite (CpFh-As(V)). A: X-ray
Absorption Near-Edge Structure (XANES) spectra. B: Unfiltered k3χ(k) EXAFS data and C:
corresponding Fourier Transforms. Dashed lines show the data and solid lines the best fits on
the k3χ(k) data (see Table 2).
XANES spectra of the soluble proteins exhibit an absorption maximum at 11869.8 eV,
whereas the XANES spectra of the insoluble fraction exhibit an absorption maximum at
11875 eV, with a small shoulder at 11869.8 eV (Fig. 3A). Accordingly, best fits of the
EXAFS data indicate that As is mainly bound to S ligands at 2.26±0.03 Å in the soluble
proteins, whereas As is mainly bound to O ligands at 1.69±0.03 Å in the insoluble fraction
(with a minor contribution of S ligands at 2.27±0.03 Å; Table 2). In addition, the XANES
spectrum of the whole cells exposed to 100 mg L-1
As(V) is well fit (χ2 = 4.4 10
-4) with a
linear combination of the XANES spectra of As(III)-(SG)3 (22.7 %) and the insoluble
fraction (representing an As(V) reference compound) (77.7 %) (Fig. 4). These results are
consistent with a partitioning of the As-bearing species within E. gracilis cells exposed to
As(V): the reduced As(III)-thiol compounds are mainly present in the cytoplasmic proteic
pool and the As(V) compounds are specifically associated with membranes and/or organites.
A B C
230
11860 11870 11880 11890 11900
No
rma
lize
d a
bs
orb
an
ce
Energy, eV
0,511875 eV
11869.8 eV
Eg-As100*
Eg-As100*,membranes
As-(SG)3
Figure 4. Linear decomposition of the XANES spectrum of E. gracilis cells exposed to 100
mg L-1
As(V) collected in the stationary phase (Eg-As100*) with the spectrum of As(III)-tris
glutathione (As-(GS)3) model compound and the insoluble fraction of the E. gracilis cells
exposed to 100 mg.L-1
As(V) (Eg-As(V)100*-insoluble fraction). Dashed lines represent the
data and solid lines represent the best fit. The fit gives a composition of 23 % As-(GS)3 and
78 % insoluble fraction, standing for an As(V) reference compound; χ2 = 4.4 10
-4.
Nature of As(III)-S complexes. In order to further characterize As(III)-bearing complexes
localized in the soluble protein fraction of E. gracilis cells exposed to 100 mg L-1
As(V),
proteins of the cytoplasmic fraction were size-separated by Liquid Phase Chromatography
(LPC), and total As concentration was measured in each 2-mL fraction collected after
separation. As shown in Fig. 5, the general profile is qualitatively similar in the absence and
presence of arsenic. Moreover, in the culture grown at 100 mg L-1
As(V), As concentration is
below the detection limit (2 µg L-1
) all along the profile except for two peaks near the end of
the profile (grey). This suggests that As(III) is bound by specific proteins but not by any of
protein containing thiolate groups. With an elution volume ranging from 97 to 119 mL, the
fractions enriched in As correspond to low molecular weight proteins (<6500 Da) or peptides.
Similar results have been obtained with cultures of E. gracilis cells exposed to 100 mg L-1
As(III) (data not shown), wherein As(III) was shown to bind to thiol ligands, presumably in
the form of As-(SG)3 or As-bearing phytochelatins (1). These results show that As(III)-thiol
insoluble fraction
231
complexes observed by XAS in the cytoplasmic proteic pool of E. gracilis exposed to 100
mg.L-1
As(V) consist of specific As-bearing peptides or low molecular weight proteins.
0 50 100 150
Ab
so
rba
nc
e (
280 n
m),
a.u
.
Volume (mL)
Eg-As0
Eg-As100
96 100 104 108 112 116 1200
2
4
6
8
10
As
co
nc
en
tra
tio
n (
µg
.L-1
)
Volume (mL)A
bs
orb
an
ce
(2
80
nm
)(a
.u.)
Figure 5. Arsenic partitioning in the protein profile of E. gracilis cells exposed to As(V). A: Liquid Phase Chromatography profiles (absorbance at 280 nm) of the cytoplasmic fraction of
E. gracilis cells cultured in the absence of arsenic (top) or exposed to 100 mg L-1
As(V)
(bottom). B: Analysis of the two peaks containing As (highlighted in grey in A) for the
As(V)-exposed culture: Liquid Phase Chromatography profile (solid line) and total arsenic
concentrations (■) measured in the different fractions.
Discussion
As(V) detoxification by E. gracilis. In this study, we observe that E. gracilis is resistant to
As(V) up to 100 mg L-1
(Fig. 1). At low As(V) concentration (50 mg L-1
), As(V) is mostly
reduced to As(III) that binds to S ligands and to a lesser extent to C ligands (Fig. 2 and Table
2). As(III) complexed by C ligands is presumably in the form of As(III)-methylated
compounds (Table 2). Similar complexes have been previously observed in E. gracilis
exposed to low As(III) levels (< 100 mg L-1
) (1). On the other hand, As-S distances are
consistent with those measured in the reference compound As(III)-(SG)3. These As(III)-S
complexes are specifically localized in the proteic pool of the cytoplasm (Fig. 3), and
cytoplasmic arsenic is concentrated in the proteic fraction of low molecular weight (< 6500
A B
232
Da), which is consistent with the molecular weights of glutathione (γ-Glu-Cys-Gly, MW=307
Da) or phytochelatins ((γ-(Glu-Cys)n-Gly, with n < 10, i.e. MW < 3000 Da, Fig. 5). These
results suggest that As(III) is complexed by thiol groups in the form of As-tris-glutathione
(As-(SG)3) or As-bearing phytochelatins in the cytoplasm of E. gracilis. In addition, we
observed that As speciation in the cells depends on the growth stage of the culture, with
As(V) reduction and complexation by thiol ligands being enhanced in the stationary phase
(Fig. 2). Finally, the presence of As(III) at non-negligible levels in the supernatants of the
cultures performed at low initial As(V) concentration suggests that As(III) is exported from
the cells (Table 1).
These results are consistent with the classical scheme of As(V) detoxification in
prokaryotes and eukaryotes (10). Indeed, given the chemical similarity of arsenate and
phosphate, As(V) is usually taken up by phosphate transporters, such as the Pho86p
transporter identified in Saccharomyces cerevisiae (11). Following this step, As(V) is reduced
into As(III) by an arsenate reductase, with GSH and glutaredoxin serving as electron donors
(28). As(III) then binds to S ligands in the form of glutathione or phytochelatins (29-32).
Similar complexation of As(III) by thiol ligands involved in the glutathione cycle have been
described in E. gracilis exposed to high As(III) levels (1). Finally, the As-S complexes are
either sequestered in vacuoles (10, 33) or exported from the cell through membrane proteins
such as multi-drug resistance proteins (MRP) or P-glycoproteins (33, 34). Interestingly, a P-
glycoprotein has been identified in E. gracilis exposed to Cd (35). In conclusion, the
following scheme can be proposed for As(V) detoxification in E. gracilis: (1) uptake of As(V)
from solution presumably through phosphate transporters, (2) reduction into As(III) within the
cell, (3) complexation by proteic thiol ligands of low molecular weight in the cytoplasm, and
(4) extrusion from the cell.
As(V) toxicity towards E. gracilis cells. At initial As(V) concentrations in the culture
medium equal to or higher than 100 mg L-1
, an important proportion of As(V) is not reduced
into As(III) but remains in an oxidized form bound to O ligands (Fig. 2 and Table 2). At 200
mg L-1
As(V), As(V) reduction is not detectable by XAS (i.e. less than 15% As(III)).
Interestingly, this coincides with a higher sensitivity of E. gracilis cells to As(V), the final cell
density being drastically reduced with increasing initial As(V) concentration above 100 mg L-
1 (Fig. 1). Because As(V) detoxification usually proceeds through a first step of reduction (see
supra), our results suggest that insufficient As(V) reduction in E. gracilis for initial As(V)
concentrations above 100 mg L-1
leads to relative accumulation of As(V), which appears to be
233
harmful to the cells. This limitation of As(V) reduction could account in part for the lower
resistance of E. gracilis cells to As(V) than to As(III) (this study and (1)).
The relative toxicity of inorganic As(III) vs. inorganic As(V) is not well understood.
Indeed, As(III) toxicity relies on its capacity to enter the cells by passive diffusion through
aquaglyceroporins (10) and to enhance the production of free radicals in the cell (36). In
contrast, As(V) toxicity is related to its chemical similarity to phosphate. Arsenate is taken up
through phosphate transporters (28, 37) and has been shown to substitute for phosphate
groups and for choline heads in the phopsholipids of the plasma membrane (9). Moreover,
arsenate can substitute for phosphate groups in ADP, ATP or ion-pumps (12-14). In this
study, we observe that excess As(V) that could not be reduced is specifically concentrated in
the insoluble fraction, i.e. is potentially associated either with membranes or with phosphate-
containing biomolecules. Such accumulations are likely associated with cell death or their
inability to divide and grow.
We observed a greater accumulation of As(V) in the insoluble fraction of E. gracilis
cells in the present study (21 to 946 mg kg-1
for initial As(V) concentrations of 10 to 200 mg
L-1
, respectively) than of As(III) (14 to 315 mg kg-1
for initial As concentrations of 10 to 200
mg L-1
, respectively). This relative accumulation of As(V) suggests that the rate of As uptake
is higher for As(V) than for As(III), which may be related to the fact that As(V) uptake
proceeds actively (through phosphate transporters) (28, 37), whereas As(III) uptake proceeds
passively (through aquaglyceroporins) (10). Moreover, our results suggest an additional factor
that could account for the higher toxicity of As(V) in E. gracilis. Indeed, another rate-limiting
step in As(V) detoxification in E. gracilis could be the competition between As(V) reduction
and arsenate substitution for phosphate in cell components. Rosen (10) suggested that arsenate
detoxification (through reduction to As(III)) was inherited from the evolution of resistance
mechanisms to As(III) in the primitive ocean at the contact with the primordial reduced
atmosphere. Arsenate-reductases would have evolved from widespread phosphatases, as the
oxygen level rose in the atmosphere and as As(V) concentration increased in natural systems
(38). Three independently evolved families of arsenate reductases have been identified (39),
but only one enzyme is known in eukaryotes - namely the membrane protein Acr2p, which is
a member of the superfamily of the proteins tyrosine phosphate phosphatases (28, 37).
Because the genus Euglena branches very close to the root of eukaryotes, it would be
interesting to identify and characterize the arsenate reductase of E. gracilis that could
potentially share more similarities with phosphatases.
234
Acknowledgments
The authors are indebted to the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL) staff,
especially John R. Bargar, Joe Rogers and Samuel Webb, for their technical assistance during
the XAFS experiments. This work was supported by the ECCO/ECODYN CNRS/INSU
Program, by ACI/FNS grant #3033, by SESAME IdF grant #1775, by NSF-EMSI Grant
CHE-0431425 (Stanford Environmental Molecular Science Institute), and by the France-
Stanford Institute for Interdisciplinary Studies. Portions of this research were carried out at
SSRL, a national user facility operated by Stanford University on behalf of the U.S.
Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences. This is IPGP contribution #nnnn.
Literature cited
(1) Miot, J..; Morin G.; Skouri-Panet-F.; Férard C.; Aubry E.; Briand J.; Wang Y.; Ona-
Nguema G.; Guyot F.; Brown Jr G.E. XAS study of arsenic coordination in Euglena gracilis
exposed to arsenite. Environ. Sc. Technol. 2008, 42, 5342-5347.
(2) Smedley, P.L.; Kinniburgh, D.G. A review of the source, behaviour and distribution of
arsenic in natural waters Appl. Geochem. 2002, 17, 517-568
(3) Morin, G. and Calas, G. Arsenic in soils, mines tailings and former industrial sites.
Elements 2006, 2, 97-101.
(4) Casiot, C.; Bruneel, O.; Personné, J.C.; Leblanc, M.; Elbaz-Poulichet, F. Arsenic oxidation
and bioaccumulation by the acidophilic protozoan, Euglena mutabilis, in acid mine drainage
(Carnoulès, France). Sci. Total Environ. 2004, 320, 259-267.
(5) Bruneel O.; Duran R.; Casiot C.; Elbaz-Poulichet F. ; Personné J.C. Diversity of
microorganisms in Fe-As-rich acid mine drainage waters of Carnoulès, France. Appl. Environ.
Microbiol. 2006, 72, 551-556.
(6) Kapfer, M. Assessment of the colonization and primary production of microphytobenthos
in the littoral of acidic mining lakes in Lusatia (Germany). Water, Air Soil Poll. 1998, 108,
331-340.
(7) Woongghi, S.; Triemer, R.E. Phylogenetic analysis of the genus Euglena
(Euglenophyceae) with particular reference to the type speies Euglena viridis. J. Phycol.
2004, 40, 759-771.
235
(8) Cobbett, C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiol.
2000, 123, 825-832.
(9) Tuan L.Q.; Huong T.T.T.; Hong P.T.A.; Kawakami T.; Shimanouchi T.; Umakoshi H.;
Kuboi R. Arsenic(V) induces a fluidization of algal cell and liposome membranes. Toxicol. In
Vitro. 2008, doi:10.1016/j.tiv.2008.05.012
(10) Rosen, B.P. Biochemistry of arsenic detoxification. FEBS Letters 2002, 529 (1), 86-92.
(11) Yompakdee C.; Bun-ya M.; Shikata K.; Ogawa N.; Harashima S.; Oshima Y. A putative
new membrane protein, Pho86p, in the inorganic phosphate uptake system of Saccharomyces
cerevisiae. Gene. 1996, 171, 41-47.
(12) Moore S.A.; Moennich D.M.C.; Gresser M.J. Synthesis and hydrolysis of ADP-arsenate
by beef heart submitochondrial particles. J. Biol. Chem. 1983, 258, 6266-6271.
(13) Slooten L. and Nuyten A. Arsenylation of nucleoside diphosphates in Rhodospirillum
rubrum. Biochim. Biophys. Acta. 1983, 725, 49-59.
(14) Kenney L.J. and Kaplan J.H. Arsenate substitutes for phosphate in the human red cell
sodium pump and anion exchanger. J. Biol. Chem. 1988, 263, 7954-7960.
(15) Ding W.; Hudson L.G.; Liu K.J. Inorganic arsenic compounds cause oxidative damage to
DNA and protein by inducing ROS and RNS generation in human keratinocytes. Mol. Cell.
Biochem. 2005, 279, 105-112.
(16) Briand, J.; Calvayrac, R. Paramylon synthesis in heterotrophic and photoheterotrophic
euglena. J. Phycol. 1980, 16, 234-239.
(17) Ficklin, W.H. Separation of arsenic(III) and arsenic(V) in ground waters by ion-
exchange. Talanta 1982, 30, 371-373.
(18) Ona-Nguema, G.; Morin, G.; Juillot, F.; Calas, G.; Brown, Jr G.E. EXAFS analysis of
arsenite adsorption onto two-lines ferrihydrite, hematite, goethite and lepidocrocite. Environ.
Sci. Technol. 2005, 39, 9147-9155.
(19) Webb, S. SIXPACK: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica
Scripta 2004, T115, 1011-1014. http://www-ssrl.slac.stanford.edu/~swebb/sixpack.htm
(20) Winterer, M. XAFS – A data analysis program for material science. J. Phys. IV 1997, 7,
243-244.
(21) Ankudinov, A. L.; Ravel, B.; Rehr, J. J.; Conradson, S. D. Real-space multiple scattering
calculation and interpretation of X-ray absorption near-edge structure. Phys. Rev. B 1998, 58,
7565-7576.
236
(22) Adams, E.; Jeter, D.; Cordes, A.W.; Kolis, J.W. Chemistry of organometalloid
complexes with potential antidotes: structure of organoarsenic (III) dithiolate ring. Inorg.
Chem. 1990, 29, 1500-1503.
(23) Morin, G. ; Juillot, F. ; Casiot, C. ; Bruneel, O. ; Personné, JC.; Elbaz-Poulichet, F. ;
Leblanc, M. Bacterial formation of tooeleite and mixed arsenic(III) or arsenic (V)-iron(III)
gels in the Carnoulès acid mine drainage, France. A XANES, XRD and SEM study. Environ.
Sci. Technol. 2003, 37, 1705- 1712.
(24) Smith, P.G.; Koch, I.; Gordon, R.A.; Mandoli, D.F.; Chapman, B.D.; Reimer, K.J. X-ray
absorption near-edge structure analysis of arsenic species for application to biological
environmental samples. Environ. Sci. Technol. 2005, 39, 248-254.
(25) Murray, K. and Willett, R.D. Biotransformation of arsenate to arsenosugars by Chlorella
vulgaris. Acta Crystallographica Section C – Crystal structure communications 1993, 49,
1739-1741.
(26) Morin G.; Ona-Nguema G.; Wang Y.; Menguy N.; Juillot F.; Proux O.; Guyot F.; Calas
G.; Brown Jr G.E. Extended X-ray absorption fine structure analysis of arsenite and arsenate
adsorption on maghemite. Environ. Sc. Technol. 2008, 42, 2361-2366.
(27) Miot J.; Morin G.; Yoon T.H.; Skouri-Panet F.; Férard C.; Zbinden M. ; Benzerara K. ;
Briand J. ; Casiot C. ; Lechaire J.P. ; Brown Jr. G.E. ; Guyot F. Spectromicroscopic study of
intracellular iron accumulation in Euglena mutabilis from the Carnoulès arsenic-rich acid
mine drainage (Gard, France). Submitted.
(28) Mukhopadhyay R. ; Shi J. ; Rosen B.P. Purification and characterization of Acr2p, the
Saccharomyces cerevisiae arsenate reductase. J. Biol. Chem. 2000, 275, 21149-21157.
(29) Kala, V.K.; Neely, M.W.; Kala, G.; Prater, C.I.; Atwood, D.W.; Rice, J.S.; Lieberman,
M.W. The MRP2/cMOAT transporter and arsenic-glutathione complex formation are required
for biliary excretion of arsenic. J. Biol. Chem. 2000, 275, 33404-33408.
(30) Stürzenbaum, S.R.; Winters, C.; Galay, M.; Morgan, A.J.; Kille, P. Metal ion trafficking
in earthworms. J. Biol. Chem. 2001, 276, 34013-34018.
(31) Webb, S.; Gaillard, J.F.; Ma, L.Q.; Tu, C. XAS speciation of arsenic in a hyper-
accumulating fern. Environ. Sci. Technol. 2003, 37, 754-760
(32) Zhang, W. ; Cai, Y. ; Downum, K.R. ; Ma, L.Q. Thiol synthesis and arsenic
hyperaccumulation in Pteris vittata (Chinese brake fern). Environ. Poll. 2004, 131, 337-345.
(33) Ghosh, M.; Shen, J.; Rosen, B.P. Pathways of As(III) detoxification in Saccharomyces
cerevisiae. PNAS 1999, 96, 5001-5006.
237
(34) Zaman, G.J.R.; Lankelma, J.; van Tellingen, O.; Beijnen, J.; Dekker, H.; Paulusma, C.;
Elferink, R.P.J.O.; Baas, F.; Borst, P. Role of glutathione in the export of compounds from
cells by the mutidrug-resistance-associated protein. PNAS 1995, 92, 7690-7694.
(35) Einicker-Lamas, M.; Morales, M.M.; Miranda, K.; Garcia-Abreu, J.; Oliveira, A.J.F.;
Silva, F.L.S.; Oliveira, M.M. P-glycoprotein-like protein contributes to cadmium resistance in
Euglena gracilis. J. Comp. Physiol. B 2003, 173, 559-564.
(36) Bau D.T.; Wang T.S.; Chung C.H.; Wang A.S.S.; Jan K.Y. Oxidative DANN adducts
and DNA-protein cross-links are the major DNA lesions induced by arsenite. Environ. Health
Perspect. 2002, 110, 753-756.
(37) Bobrowicz P.; Wysocki R.; Owsianik G.; Goffeau A.; Ulaszewski S. Isolation of three
contiguous genes, ACR1, ACR2 and ACR3, involved in resistance to arsenic compounds in
the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1997, 13, 819-828.
(38) Mukhopadhyay R.; Zhou Y.; Rosen B.P. Directed evolution of a yeast arsenate reductase
into a protein-tyrosine phosphatase. J. Biol. Chem. 2003, 278, 24476-24480.
(39) Mukhopadhayay R.; Rosen B.P.; Phung L.T.; Silver S. Microbial arsenic: from
geocycles to genes and enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 2002, 26, 311-325.
238
239
Conclusions
&
Perspectives
240
241
1. Mécanismes de résistance aux métaux et métalloïdes
Les environnements extrêmes (au sens entendu dans cette thèse c’est à dire
caractérisés par de fortes concentrations en éléments majeurs ou traces potentiellement
toxiques et de forts taux de minéralisation) ont pu favoriser l’émergence de systèmes
biochimiques spécifiques basés sur le transfert d’électrons et orientés soit à des fins
métaboliques, soit à des fins de détoxification uniquement. Les deux souches procaryotes
étudiées (BoFeN1 et SW2) utilisent le Fe(II) (en l’absence stricte d’O2) comme donneur
d’électrons pour leur métabolisme, ce qui conduit à la précipitation de Fe(III) à distance et/ou
au sein même des structures cellulaires (Chapitres 1A, 1B, AC). Chez la souche SW2, la
précipitation du fer est exclusivement localisée à l’extérieur des cellules sur des fibres lipo-
polysaccharidiques (Chapitre 1C et voir la Figure C-1 pour une comparaison des modes de
biominéralisation du fer chez ces deux souches). En revanche, la minéralisation du périplasme
mise en évidence chez BoFeN1 (Chapitre 1A) pose clairement la question de la viabilité
cellulaire et de la potentielle létalité de la biominéralisation intracellulaire du fer chez ces
bactéries (Chapitre 1E), question qui reste encore ouverte à l’issue de cette thèse. Les espèces
eucaryotes étudiées (Euglena mutabilis et Euglena gracilis) sont quant à elles exposées à de
fortes concentrations en Fe(II), As(III) et As(V) dans le milieu naturel, éléments dont la
toxicité vis-à-vis des cellules est très élevée (voir discussion Chapitre 1B). Des mécanismes
de réduction de l’As(V), de complexation de l’As(III) par des molécules organiques et
d’export hors de la cellule permettent à ces eucaryotes de résister à l’arsenic (Chapitre 1B et
voir la Figure C-2 pour un bilan de la détoxification de l’As chez E. gracilis comparée aux
mécanismes décrits chez la bactérie modèle E. coli et chez l’eucaryote modèle S. cerevisiae).
Concernant le fer, une compartimentation vacuolaire de cet élément lourd totalement
découplée des mécanismes de détoxification de l’arsenic, constitue d’après nos résultats une
adaptation de ces eucaryotes aux concentrations élevées rencontrées dans les drainages
miniers acides (Chapitre 1A).
242
Figure C-1. Comparaison des modes de biominéralisation du fer chez deux souches ferro-
oxydantes anaérobies neutrophiles, SW2 (A) et BoFeN1 (B). Le fer est symbolisé par la
couleur rouge. A : Sur SW2, la biominéralisation du fer est essentiellement extracellulaire,
sous forme de nanoparticules d’oxydes de fer (goethite) ou de phosphates de fer amorphes,
qui nucléent sur une fibre lipo-polysaccharidique émergeant d’un des pôles de la bactérie. La
croissance minérale sur ces fibres est limitée. Une proportion très minoritaire de fer s’adsorbe
également à la surface de la cellule. B : Dans le cas de BoFeN1, une proportion importante de
fer précipite sous forme de phosphates de fer amorphes dans le périplasme de la cellule. Cet
encroûtement débute sur la face périplasmique de la membrane plasmique de façon
discontinue. La croissance minérale dans le périplasme est ensuite limitée par la quantité de
carbone organique présente. La biominéralisation complète du périplasme conduit à la
fossilisation de protéines (points blancs dans le périplasme minéralisé apparaissant en rouge)
et du peptidoglycane (liseré jaune). Une proportion importante de fer est également
biominéralisée à l’extérieur des cellules. On observe une croissance de ces minéraux
extracellulaires, dont la nucléation débute sur des filaments polysaccharidiques.
SW2
Adsorption
NucléationCroissance limitée
Fibrelipo-polysaccharidique
Biominéralisationextracellulaire
NucléationCroissance
BoFeN1Filament
polysaccharidique
Fossilisation deprotéines
Biominéralisationpériplasmique Biominéralisation
extracellulaire
A
BFossilisation dupeptidoglycane
NucléationCroissance limitée
SW2
Adsorption
NucléationCroissance limitée
Fibrelipo-polysaccharidique
Biominéralisationextracellulaire
NucléationCroissance
BoFeN1Filament
polysaccharidique
Fossilisation deprotéines
Biominéralisationpériplasmique Biominéralisation
extracellulaire
A
BFossilisation dupeptidoglycane
NucléationCroissance limitée
243
As(OH)3As(OH)3
Glu + Cys
γγγγ−−−−GCS
γγγγ-glu-cys
GSH-synthase
GSH As-(SG) 3
GSH
PC-AsPCS
LMW complex
Export
Paroi Membrane plasmique
Milieu, pH 3.2 Cytoplasme
-BSO
AQP
?
?
H2AsO4-
Trans-P As(V)
Stress oxydatif
As(III)Acr2p
?
?
MRPP-gp
Méthylation
Dommagesmembranaires
As(OH)3As(OH)3
Glu + Cys
γγγγ−−−−GCS
γγγγ-glu-cys
GSH-synthase
GSH As-(SG) 3
GSH
PC-AsPCS
LMW complex
Export
Paroi Membrane plasmique
Milieu, pH 3.2 Cytoplasme
--BSO
AQP
?
?
H2AsO4-
Trans-P As(V)
Stress oxydatif
As(III)Acr2p
?
?
MRPP-gp
Méthylation
Dommagesmembranaires
244
Figure C-2. Mécanismes de détoxification de l’arsenic (As(III) : As(OH)3 et As(V) : AsO43-
ou H2AsO4-) chez la bactérie E. coli et l’eucaryote S. cerevisiae (levure) (Rosen, 2002) et chez
E. gracilis (notre étude). Pour le cycle du glutathion, se reporter à Cobbett, 2000. Glu, acide
glutamique. Cys, cystéine. γ-GCS, γ-glutamyl-cystéine synthase. γ-glu-cys, γ-glutamine-
cystéine. GSH, glutathion. BSO, buthionine sulfoximine, inhibiteur de la synthèse de
glutathion. PCS, phytochélatine-synthase. Pc-As, complexe As(III)-phytochélatine. LMW
complex, complexe de faible poids moléculaire. AQP : Aquaglycéroporine. ArsC et Acr2p,
arsenate réductases cytoplasmiques. ArsB et Acr3p, protéines membranaires d’export de
l’As(III) (chez les bactéries, couplée à ArsA pour former une ATPase). GlpF et Fps1p, les
protéines de transport du glycérol, qui transportent aussi l’arsenite. Trans-P, Pit et Pho87p, les
transporteurs de phosphate (et d’arsenate). PstB, PstC, PhoS, le système ATP-dépendant de
prélèvement des phosphates (et de l’arsenate). Ycf1p, le transporteur d’As(III)-GSH qui
transporte le complexe dans le compartiment vacuolaire de la levure. MRP et P-gp, Multidrug
Resistance associated Protein et P-glycoprotéine, exportant les complexes As(III)-glutathion
ou As(III)-PC.
2. Des signatures potentiellement spécifiques de l’activité de microorganismes
Nous avons mis en évidence l’existence d’un découplage entre les mécanismes de
résistance au fer et à l’arsenic chez E. gracilis et E. mutabilis. Tandis que les
biominéralisations bactériennes observées dans les AMD sont assez proches des minéraux qui
se forment par précipitation chimique dans les systèmes abiotiques de basse température Fe-
As, les accumulations ferreuses intracellulaires mises en évidence chez les euglènes ne
contiennent pas de quantités significatives d’arsenic (Chapitre 2A), ce qui d’après notre
modèle est cohérent avec l’export d’As(III) hors des cellules (Chapitre 2B). En cela, la chimie
des dépôts vacuolaires de fer observés chez ces microorganismes pourrait constituer une
signature eucaryote spécifique. Dans ce cadre, il pourrait être intéressant d’étudier les modes
de résistance à d’autres éléments traces (Zn, Cd, Se, …) chez ces algues et/ou chez les
bactéries identifiées dans les AMD. On pourrait ainsi rechercher les éléments qui seraient
couplés ou découplés des mécanismes de biominéralisation du fer. Ces études pourraient
ouvrir des perspectives pour la recherche de critères de biogénicité (en particulier spécifiques
des eucaryotes) à explorer dans le registre fossile, mais aussi pour une compréhension plus
exhaustive du mode de fonctionnement des systèmes pollués actuels, tels que les AMD et
enfin pour la compréhension des mécanismes de détoxification de ces métaux dans des
microorganismes modèles.
245
D’autre part, les minéralisations du fer étudiées au cours de cette thèse chez les
bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles BoFeN1 et SW2 présentent des spécificités
qui pourraient être également utilisées à l’avenir comme biosignatures potentielles de tels
métabolismes dans des environnements actuels ou dans des roches anciennes. Cette
perspective est d’autant plus prometteuse qu’elle pourrait permettre de rechercher
l’implication de bactéries présentant des métabolismes proches de ceux étudiés ici dans le
mise en place des gisements de fer rubanés du Précambrien (BIF, e.g. Konhauser et al., 2007).
Au cours de cette étude, nous avons effectivement mis en évidence à plusieurs reprises
l’existence d’hétérogénéités redox au sein de nos échantillons, en particulier la coexistence de
phases riches en Fe(III) au contact direct des bactéries avec des phases plus réduites à distance
des bactéries (Chapitres 1A, 1B et 1C). De telles hétérogénéités redox ont déjà été reportées
dans des échantillons naturels actuels (Benzerara et al., 2007) et pourraient être recherchées
de façon plus systématique dans les environnements actuels et dans des roches anciennes.
Cela implique cependant de mieux comprendre parallèlement l’impact des processus
secondaires (diagenèse et métamorphisme) sur ces objets car ils sont susceptibles d’effacer
entièrement de telles « signatures » ou de les créer secondairement et abiotiquement. De
manière plus intéressante peut-être pour ce problème, nous avons mis en évidence la
préservation de protéines et de structures cellulaires fines telles que le peptidoglycane dans le
périplasme des cellules de BoFeN1 (Chapitre 1D, Figure C-1). La fossilisation de ces
structures et molécules organiques fournit des perspectives prometteuses pour la recherche de
traces de vie fossile. Enfin, les associations quasi-systématiques de minéraux riches en fer et
de filaments organiques (polysaccharidiques ou lipo-polysaccharidiques) fournissent des
pistes pour étudier les potentialités de préservation de tels assemblages minéral/organique, qui
pourraient être recherchés à l’aide d’outils spécifiques dans des échantillons naturels (actuels
ou anciens).
3. Des outils pour caractériser les assemblages métal(loïde)-organique
3.a- Approches spectroscopiques et microscopiques.
L’ensemble de nos résultats montre le rôle clé des molécules organiques dans les
processus de biominéralisation et de détoxification étudiés, chez les eucaryotes comme les
procaryotes. Dans ce cadre, il est primordial de disposer d’outils performants pour caractériser
246
finement ces assemblages, que ce soit dans le but de mieux contraindre les mécanismes
moléculaires de la détoxification ou de la biominéralisation ou de rechercher ces assemblages
dans des échantillons naturels actuels ou anciens. L’approche via la spectroscopie et la
microscopie que nous avons suivie au cours de cette thèse montre l’intérêt de coupler ces
techniques ou d’utiliser des techniques mixtes telles que le STXM pour obtenir des
informations chimiques et structurales sur les systèmes que nous étudions. Le STXM permet
en effet de caractériser chimiquement à la fois les molécules organiques et les éléments lourds
comme le fer ou l’arsenic (Benzerara et al., 2008) et ce à une échelle de quelques nanomètres.
Afin d’aller plus loin dans la caractérisation des molécules organiques rencontrées dans les
systèmes d’oxydation bactérienne du fer étudiés au cours de cette thèse, il sera intéressant
d’analyser ces échantillons aux seuils d’autres éléments légers que le carbone, tels que l’azote
ou l’oxygène par exemple. En effet, la signature spectrale des protéines par exemple est très
variée à ces seuils et une approche multi-élémentaire fournirait donc des contraintes plus
fortes sur la nature des molécules organiques présentes dans nos échantillons. En outre,
l’utilisation de méthodes de microscopie préservant l’état natif des échantillons, telles que le
CEMOVIS, s’est révélée être déterminante pour mettre en évidence des assemblages minéral-
organique qui n’auraient pas été préservés par les méthodes de préparation classiques en
microscopie. L’utilisation de cette technique, certes lourde à développer mais très porteuse,
sur des échantillons naturels ou d’autres échantillons de laboratoire fournirait probablement
une vision beaucoup plus complète et fine des systèmes biogéochimiques étudiés. Dans des
perspectives très proches de cette thèse, on pourrait envisager d’étudier par cette méthode des
échantillons d’E. mutabilis ou d’E. gracilis cultivée en présence de fer afin de mieux
caractériser les accumulations ferreuses intracellulaires et éventuellement leur assemblage
avec des phases organiques ou encore d’imager SW2 pour déterminer les caractéristiques
structurales de sa paroi cellulaire et des fibres lipo-polysaccharidiques. Cette méthode pourrait
évidemment être appliquée à de nombreux autres systèmes biogéochimiques d’intérêt.
3.b- Approches biochimiques.
Une autre approche, complémentaire de celle suivie au cours de cette thèse et
indispensable à la compréhension des mécanismes biologiques sous-tendant les processus de
biominéralisation et de détoxification étudiés ici, serait de combiner les outils de la biochimie
aux outils de la spectromicroscopie. En effet, nous avons par exemple mis en évidence le rôle
de composés thiols dans la détoxification de l’As(V) et de l’As(III) chez E. gracilis (Figure C-
247
2). Ces résultats s’inscrivent dans le schéma classique de détoxification de l’arsenic chez les
microorganismes (procaryotes et eucaryotes) et les plantes. Cependant, nous avons pu mettre
en évidence les limites de l’approche spectroscopique (XAS) pour la caractérisation des
protéines impliquées dans ces mécanismes. L’utilisation complémentaire d’outils de la
protéomique, tels que la spectrométrie de masse et la chromatographie permettront dans le
futur de caractériser plus précisément ces molécules. De telles expériences ont débuté
récemment dans notre laboratoire et en collaboration avec Laurence Sabatier de l’IPHC
(Strasbourg). Dans la même perspective, la protéomique et la génétique appliquées à des
systèmes tels que les bactéries ferro-oxydantes anaérobies neutrophiles pourront permettre des
avancées fondamentales dans la compréhension des mécanismes d’oxydation du fer à
l’origine des processus de biominéralisation que nous avons étudiés. De telles approches ont
par exemple déjà permis d’identifier des gènes codant des protéines potentiellement
impliquées dans l’oxydation du fer par SW2 (Croal et al., 2007, Jiao & Newman, 2007).
3.c- Approches isotopiques.
Enfin, les résultats acquis au cours de cette thèse pourraient servir de base pour une
étude ultérieure des fractionnements isotopiques du fer (et éventuellement du carbone et de
l’azote dans le cas de la bactérie dénitrifiante BoFeN1) dans des systèmes d’oxydation
microbienne du fer en conditions anoxiques. Les fractionnements isotopiques du fer par
exemple sont au premier ordre dépendants de la spéciation de cet élément, i.e. son redox mais
aussi la nature des phases dans lesquelles il s’insère. Ainsi, la diversité des phases minérales
rencontrées dans des conditions de culture données au cours de la croissance bactérienne
montre qu’une telle étude isotopique ne peut pas se limiter à une mesure à un stade donné de
la croissance mais nécessitera un suivi au cours du temps des fractionnements isotopiques.
L’utilisation des outils isotopiques pourra permettre une approche quantitative des différents
processus impliqués dans l’oxydation bactérienne du fer et de la dénitrification dans ces
systèmes. En outre, elle pourra éventuellement fournir une base pour mieux comprendre
l’origine des compositions isotopiques dans les échantillons naturels actuels ou anciens (en
particulier les BIF).
248
4. Evolution des mécanismes de détoxification de l’arsenic au cours des temps
géologiques
Nous avons rappelé dans l’introduction de cette thèse la vision actuelle de l’évolution des
métabolismes utilisant l’arsenic au cours des temps géologiques, qui suggère une apparition
précoce des métabolismes chimiolithoautotrophes et photosynthétiques basés sur l’oxydation
de l’As(III) (Duval et al., 2008, Kulp et al., 2008) et une apparition plus tardive de la
respiration de l’As(V) (Lebrun et al., 2003). En revanche, l’évolution des mécanismes de
détoxification de l’arsenic au cours de temps géologiques, reste encore très mal connue. Il est
proposé que les mécanismes de détoxification de l’As(V) sont hérités de l’évolution des
mécanismes de résistance à l’As(III), qui auraient pu apparaître sur une Terre privée d’O2
(Rosen, 2002). Au cours de cette thèse, nous avons mis en évidence le rôle clé du cycle du
glutathion dans les mécanismes de résistance à l’arsenic chez E. gracilis. Le glutathion est un
peptide ubiquiste chez les eucaryotes, dont une des fonctions majeures est la protection contre
les stress oxydatifs (e.g. Halliwell & Gutteridge, 1999, Todorova, 2007). Il a été proposé que
la synthèse du glutathion aurait évolué à des dates contemporaines ou proches de l’évolution
de la photosynthèse oxygénique (Fahey et al., 1987). En outre, l’oxygénation de l’atmosphère
aurait pu contribuer à l’augmentation de la concentration en As(V) dans l’environnement et
favoriser l’évolution des arsenate-réductases à partir de phosphatases (Mukhopadhyay et al.,
2003). Dans le but de mieux comprendre l’évolution des mécanismes de résistance à l’arsenic
au cours des temps géologiques, plusieurs pistes pourraient être suivies dans le futur :
• Nous avons montré que différents peptides/protéines sont des candidats potentiels
pour la complexation de l’As(III) chez E. gracilis, à commencer par le glutathion ou
des phytochélatines. Il existe cependant une diversité de phytochélatines, liée à la
longueur de la chaîne polymérisée. En outre, il est intéressant de noter que des
microorganismes tels que les trypanosomes (eucaryotes unicellulaires parasites,
phylogénétiquement ancrés proche de la racine des eucaryotes, et présentant des
homologies évolutives avec Euglena gracilis (Delihas et al., 1981)) produisent des
thiols spécifiques, différents de ceux connus dans toutes les autres espèces étudiées et
impliqués dans la détoxification de l’arsenic (Mukhopadhyay et al., 1996) : les
trypanothiones sont des tri-peptides résultant de l’association de deux glutathions par
l’intermédiaire d’une chaîne polyamine (spermidine) (Krauth-Siegel & Comini, 2008).
La mise en évidence d’une trypanothione-réductase chez E. gracilis ouvre la
possibilité de l’existence de ces thiols chez cette algue (Montrichard et al., 1999). La
249
caractérisation protéomique des thiols produits par E. gracilis pourra permettre de
déterminer la nature de ces thiols et leur éventuelle parenté avec des molécules
présentes chez des organismes ancrés eux-aussi proche de la racine des eucaryotes.
• Trois familles d’arsenate-réductases ont été identifiées, mais une seule enzyme
(Acr2p), membre de la super-famille des protéines tyrosine-phosphate phosphatases a
été identifiée à ce jour chez les eucaryotes (Mukhopadhyay et al., 2002). La
caractérisation de l’arsenate réductase impliquée dans la détoxification de l’As(V)
chez E. gracilis serait très probablement riche d’enseignement, chez ce
microorganisme ancré proche de la racine des eucaryotes.
• L’étude des mécanismes de détoxification de l’arsenic chez des procaryotes pratiquant
un métabolisme adapté aux conditions de la Terre primitive pourrait fournir des
informations clés sur l’évolution précoce des systèmes de détoxification de l’arsenic
au cours des temps géologiques. Dans ce cadre, des bactéries pratiquant une
photosynthèse anoxygénique (par exemple la souche SW2 étudiée au cours de cette
thèse, qui peut être cultivée avec H2 comme source d’électrons) seraient par exemple
des objets d’étude des mécanismes de détoxification de l’arsenic, et des
métaux/métalloïdes toxiques d’une façon générale, potentiellement intéressants.
5. Retour au milieu naturel
L’étude que nous avons menée a permis de définir un certain nombre de
caractéristiques des mécanismes de détoxification et de biominéralisation de
métaux/métalloïdes dans des systèmes microbiens modèles, cultivés en laboratoire. L’étape
suivante de ces travaux consisterait naturellement à retourner sur le terrain, dans des
environnements présentant une chimie proche de celle utilisée dans nos systèmes de
laboratoire, ceux-là même qui avaient motivé notre choix des conditions de culture et des
organismes modèles pour la présente étude. On pourrait ainsi rechercher des bactéries ferro-
oxydantes neutrophiles proches de SW2 et BoFeN1 dans des environnements naturels actuels,
tels que des sédiments de rivière similaires à ceux d’où ont été isolées les souches que nous
avons étudiées, ou tels que la colonne d’eau anoxique de certains lacs. Par exemple, nous
avons constaté que le lac Pavin (Massif central) présente un ensemble de caractéristiques tout
à fait compatibles avec l’existence de tels métabolismes: la colonne d’eau est anoxique en
250
profondeur à certaines époques de l’année, contient du Fe(II) et des nitrates en abondance
(Michard et al., 1994). Il serait alors intéressant de comparer les motifs de biominéralisation
dans ces environnements naturels à ceux décrits dans cette thèse : quelle est la nature
minéralogique des phases formées ? Retrouve-t-on des hétérogénéités redox à l’échelle
nanométrique ? Observe-t-on des filaments organiques à proximité des bactéries, et de quelle
nature ? Observe-t-on des microfossiles comparables à ceux décrits dans cette thèse ? etc…
De même, l’étude de la diversité potentielle des mécanismes de détoxification de l’arsenic et
du fer dans les microorganismes (eucaryotes et procaryotes) présents dans les AMD pourrait
également compléter notre compréhension de la biogéochimie de ces systèmes. Ce retour au
terrain serait en outre une seconde étape indispensable pour l’appréhension d’échantillons
anciens.
251
Bibliographie
252
253
Al-Amoudi A., Norlen LPO., Dubochet J. (2004a) Cryo-electron microscopy of vitreous
sections of biological cells and tissues. Journal of Structural Biology, 148, 131-135.
Al-Amoudi A., Chang J., Leforestier A., McDowall A., Salamin LM., Norlen LPO., Richter
K., Blanc NS., Studer D., Dubochet J. (2004b) Cryo-electron microscopy of vitreous sections.
The EMBO Journal, 23, 3583-3588.
Anbar AD., Knoll AH. (2002) Proterozoic ocean chemistry and evolution: a bioinorganic
bridge? Science. 297, 1137-1142.
Ankudinov A.L., Ravel B., Rehr J.J., and Conradson S.D. (1998) Real space multiple
scattering calculation and interpretation of X-ray absorption near edge structure. Physical
Review B 58, 7565.
Archibald DD., Mann S. (1993) Template mineralization of self-assembled anisotropic lipid
microstructures. Nature, 364, 430-433.
Arié J.P., Miot M., Sassoon N. and Betton J.M. (2006) Formation of active inclusion bodies
in the periplasm of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 62(2), 427-437.
Arsène-Ploetze F., Bruneel O., Gallien S., Weiss S., Chaumande B., Morin G., Brown Jr. GE.,
Bardil A., Casiot C., Schaeffer C., Van Dorsselaer A., Elbaz-Poulichet F., Bertin PN.
Characterization of an ecosystem, the acid mine drainage (AMD) of Carnoulès, France, by an
integrated approach. Submitted to ISME Journal.
Aviles, C.; Loza-Tavera, H.; Terry, N.; Moreno-Sanchez, R. (2003) Mercury pre-treatment
selects an enhanced cadmium-accumulating phenotype in Euglena gracilis. Arch. Microbiol.,
180, 1-10.
Ayers DE. (1972) Genesis of iron-bearing minerals in banded iron formation mesobands in
the Dales Gorge Member, Hamersley Group, Western Australia. Economic Geology. 67,
1214-1233.
Bach W. & Edwards KJ. (2003) Iron and sulphide oxidation within the basaltic ocean crust:
implications for chemolithoautotrophic microbial biomass production. Geochimica et
Cosmochimica Acta, 67, 3871-3887.
Baker BJ., Lutz MA., Dawson SC., Bond PL., Banfield JF. (2004) Metabolically active
eukaryotic community in extremely acidic mine drainage. Applied and Environmental
Microbiology, 70, 6264-6271.
Banfield JF., Welch SA., Zhang H., Ebert TT., Penn RL. (2000) Aggregation-based crystal
growth and microstructure development in natural iron oxyhydroxide biomineralization
products. Science, 289, 751.
254
Bau M. & Moller P. (1993) Rare-earth element systematics of the chemically precipitated
component in early Precambrian iron formations and the evolution of the terrestrial
atmosphere-hydrosphere-lithosphere system. Geochimica et Cosmochimica Acta. 57, 2239-
2249.
Bau D.T.; Wang T.S.; Chung C.H.; Wang A.S.S.; Jan K.Y. Oxidative DANN adducts and
DNA-protein cross-links are the major DNA lesions induced by arsenite. Environ. Health
Perspect. 2002, 110, 753-756.
Bengtson S. & Zhao Y. (1992) Predatorial borings in late Precambrian mineralized
exoskeletons. Science. 257, 367-369.
Berry AJ, O’neill HSTC, Jayasuriya KD, Campbell SJ, Foran GJ (2003) XANES calibrations
for the oxidation state of iron in a silicate glass. American Mineralogist 88, 967–977.
Benzerara K., Morin G., Yoon TH., Miot J., Tyliszczak T., Casiot C., Farges F., Brown Jr GE.
(2008) Nanoscale study of As transformations by bacteria in an acid mine drainage system.
Geochimica et Cosmochimica Acta, 72, 3949-3963.
Benzerara K., Menguy N., Banerjee N.R., Tyliszczak T., Guyot F. and Brown, Jr. G.E. (2007)
Alteration of submarine basaltic glass from the Ontong Java Plateau: a STXM and TEM
study. Earth Planet. Sci. Lett. 260, 187-200.
Benzerara K, Yoon TH, Menguy N, Tyliszczak T, Brown Jr. GE (2005) Nanoscale
environments associated with bioweathering of a Mg-Fe pyroxene. Proc. Nat. Acad. Sci.
U.S.A. 204, 979-982.
Benzerara K, Yoon TH, Tyliszczak T, Constantz B, spormann AM, Brown Jr. GE (2004a)
Scanning transmission x-ray microscopy study of microbial calcification. Geobiology 2, 249-
259.
Benzerara K., Menguy N., Guyot F., Skouri F., de Luca G., Barakat M. and Heulin T. (2004b)
Biologically controlled precipitation of calcium phosphate by Ramlibacter tataouinensis.
Earth Plan. Sc. Lett., 228, 439-449.
Bluhm H., Andersson K. et al. (2006) Soft X-ray microscopy and spectroscopy at the
molecular environmental science beamline at the Advanced Light Source. Journal of Electron
Spectroscopy and Related Phenomena. 150, 86-104.
Brake SS, Dannelly HK, Connors KA, Hasiotis ST (2001) Influence of water chemistry on the
distribution of an acidophilic protozoan in an acid mine drainage system at the abandoned
Green Valley coal mine, Indiana, USA. Applied Geochemistry, 16, 1641-1652.
Braterman PS., Cairns-Smith AG., Sloper RW. (1983) Photo-oxidation of hydrated Fe2+ -
significance for banded iron formations. Nature, 303, 163-164.
255
Bruneel O., Personné JC., Casiot C., Leblanc M., Elbaz-Poulichet F., Mahler BJ., Le Flèche
A., Grimont PAD. (2003) Mediation of arsenic oxidation by Thiomonas sp. in acid-mine
drainage (Carnoulès, France). Journal of Applied Microbiology, 95, 492-499.
Bruneel O., Duran R., Casiot C., Elbaz-Poulichet F., Personné J.C. (2006) Diversity of
microorganisms in Fe-As-rich acid mine drainage waters of Carnoulès, France. Appl. Environ.
Microbiol., 72, 551-556.
Cairns-Smith AG. (1978) Precambrian solution photochemistry, inverse segregation, and
banded iron formations. Nature, 276, 807-808.
Caldwell DE., Caldwell SJ. (2004) The calculative nature of microbe-mineral interactions.
Microbial Ecology, 47, 252-265.
Canfield DE. & Teske A. (1996) Late Proterozoic rise in atmospheric oxygen concentration
inferred from phylogenetic and sulphur-isotope studies. Nature. 382, 127-132.
Canfield DE. (1998) A new model for Proterozoic ocean chemistry. Nature, 396, 450-453.
Canfield DE., Rosing MT., Bjerrum C. (2006) Early anaerobic metabolisms. Philosophical
Transactions of the Royal Society B. 361, 1819-1836.
Casiot C., Morin G., Juillot F., Bruneel O., Personné JC., Leblanc M., Duquesne K.,
Bonnefoy V., Elbaz-Poulichet F. (2003) Bacterial immobilization and oxidation of arsenic in
acid mine drainage (Carnoulès creek, France). Water Research, 37, 2929-2936.
Casiot C., Bruneel O., Personné J.C., Leblanc M., Elbaz-Poulichet F. (2004) Arsenic
oxidation and bioaccumulation by the acidophilic protozoan, Euglena mutabilis, in acid mine
drainage (Carnoulès, France). Sci. Total Environ. 320, 259-267.
Casiot C., Pedron V., Bruneel O., Duran R., Personné JC., Grapin G., Drakidès C., Elbaz-
Poulichet F. (2006) A new bacterial strain mediating As oxidation in the Fe-rich biofilm
naturally growing in a groundwater Fe treatment pilot unit. Chemosphere, 64, 492-496.
Catling DC, Claire MW. (2005) How Earth’s atmosphere evolved to an oxic state: A status
report. Earth and Planetary Science Letters. 237, 1-20.
Cavalier-Smith T. (2002) The phagotrophic origin of eukaryotes and phylogenetic
classification of Protozoa. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. 52, 297-354.
Chan C.S., De Stasio G., Welch S.A., Girasole M., Frazer B.H., Nesterova M.V., Fakra S. and
Banfield J.F. (2004) Microbial polysaccharides template assembly of nanocrystal fibers.
Science, 303, 1656-1658.
256
Bobrowicz P., Wysocki R., Owsianik G., Goffeau A., Ulaszewski S. (1997) Isolation of three
contiguous genes, ACR1, ACR2 and ACR3, involved in resistance to arsenic compounds in
the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 13, 819-828.
Cobalth GK. & Grenfell (1995) Review of biological affinities of Paleozoic acid-resistant,
organic-walled eukaryotic algal microfossils (including “acritarchs”). Review of Paleobotany
and Palynology, 86, 287-314.
Cobbett, C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiol.
2000, 123, 825-832.
Cornell R.M. and Schwertmann U. (2003) The iron oxides: structure, properties, reactions,
occurrences and uses. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, Weinheim, Germany.
Croal LR., Johnson CM., Beard BL., Newman DK. (2004) Iron isotope fractionation by
photoautotrophic bacteria. Geochimica et Cosmochimica Acta. 68, 1227-1242.
Croal L.R., Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The fox operon from Rhodobacter strain SW2
promotes phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodobacter capsulatus SB1003. J. Bacteriol.,
189, 1774-1782.
Delihas N., Andersen J., Andresini W., Kaufman L., Lyman H. (1981) The 5S ribosomal
RNA of Euglena gracilis cytoplasmic ribosomes is closely homologous to the 5S RNA of the
trypanosomatid protozoa. Nucleic Acids Research. 9, 6627-6633.
Ding W.; Hudson L.G.; Liu K.J. Inorganic arsenic compounds cause oxidative damage to
DNA and protein by inducing ROS and RNS generation in human keratinocytes. Mol. Cell.
Biochem. 2005, 279, 105-112.
Douzery EJP., Snell EA., Bapteste E., Delsuc F., Philippe H. (2004) The timing of eukaryotic
evolution: Does a relaxed molecular clock reconcile proteins and fossils? Proceedings of the
National Academy of Science, 101, 15386-15391.
Druschel GK., Baker BJ., Gihring TM., Banfield JF. (2004) Acid mine drainage
biogeochemistry at Iron Mountain, California. Geochemical Transactions, 5, 13-32.
Dubochet J., McDowall AW., Menge B., Schmid EN., Lickfeld KG. (1983) Electron
microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology, 155, 381-390.
Duquesne K., Lebrun S., Casiot C., Bruneel O., Personné JC., Leblanc M., Elbaz-Poulichet F.,
Morin G., Bonnefoy V. (2003) Immobilization of arsenite and ferric iron by Acidithiobacillus
ferrooxidans and its relevance to acid mine drainage. Applied and Environmental
Microbiology, 69, 6165-6173.
257
Duquesne K., Lieutaud A., Ratouchniak J., Yarzabal A., Bonnefoy V. (2007) Mechanisms of
arsenite eleminiation by Thiomonas sp. from Carnoulès acid mine drainage. European
Journal of Soil Biology, 43, 351-355.
Dupont CL., Yang S., Palenik B., Bourne PE. (2006) Modern proteome contain putative
imprints of ancient shifts in trace metal geochemistry. Proceedings of the National Academy
of Science, 103, 17822-17827.
Dupraz S., Ménez B., Gouze P., Leprovost R., Bénézeth P., Pokrovsky O., Guyot F.
Expermimental approach of CO2 biomineralization in deep saline aquifers. Submitted
Chemical Geology.
Duval S., Ducluzeau AL., Nitschke W., Schoepp-Cothenet B. (2008) Enzyme phylogenies as
markers for the oxidation state of the environment: The case of respiratory arsenate reductase
and related enzymes. BMC Evolutionary Biology. 8, 206.
Edwards KJ., Bach W., Rogers DR. (2003) Geomicrobiology of the ocean crust: a role for
chemoautotrophic Fe-Bacteria. Biological Bulletin. 204, 180-185.
Ehrenreich A. and Widdel F. (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron by purple bacteria, a
new-type of phototrophic metabolism. Appl. Envrion. Microbiol., 60, 4517-4526.
Einicker-Lamas, M.; Mezian, G.A.; Fernandes, T.B.; Silva, F.L.S.; Guerra, F.; Miranda, K.;
Attias, M.; Oliveira, M.M. (2002) Euglena gracilis as a model for the study of Cu2+
and Zn2+
toxicity and accumulation in eukaryotic cells. Environ. Poll., 20, 779-786.
Einicker-Lamas, M.; Morales, M.M.; Miranda, K.; Garcia-Abreu, J.; Oliveira, A.J.F.; Silva,
F.L.S.; Oliveira, M.M. P-glycoprotein-like protein contributes to cadmium resistance in
Euglena gracilis. J. Comp. Physiol. B 2003, 173, 559-564.
Emerson D., Peter Revsbech NP. (1994) Investigation of an iron-oxidizing microbial mat
community located near Aarhus, Denmark: Laboratory studies. Applied and Environmental
Microbiology. 60, 4032-4038.
Fahey, RC., Buschbacher RM., Newton GL. (1987) The evolution of glutathione metabolism
in phototrophic microorganisms. Journal of Molecular Evolution. 25, 81-88.
Farquhar J., Bao H., Thiemens M. (2000) Atmospheric influence of Earth’s earliest sulphur
cycle. Science, 289, 756-758.
Fernandes AP., Holmgren A. (2004) Antioxid. Redox Signal. 6, 63-74.
Fortin D. & Langley S. (2005) Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals.
Earth Sc. Rev., 72, 1-19.
258
Frei R. & Polat A. (2007) Source heterogeneity for the major components of ~3.7 Ga banded
iron formations (Isua Greenstone Belt, Western Greenland): Tracing the nature of interacting
water masses in BIF formation. Earth and Planetary Science Letters. 253, 266-281.
Furnes H., Banerjee N.R., Muehlenbachs K., Kontinen A. (2005) Preservation of
biosignatures in metaglassy volcanic rocks from the Jormua ophiolite complex, Finland.
Precambrian Res. 136, 125-137.
Galoisy L, Calas G, Arrio MA (2001) High-resolution XANES spectra of iron in minerals and
glasses: structural information from the pre-edge region. Chemical Geology 174 (1-3): 307-
319.
Gorby YA., Yanina S., McLean JS., Rosso KM., Moyles D., Dohnalkova A., Beveridge TJ.,
Chang IS., Kim BH., Kim KS., Culley DE., Reed SB., Romine MF., Saffarini DA., Hill EA.,
Shi L., Elias DA., Kennedy DW., Pinchik G., Watanabe K., Ishii S., Logan B., Nealson KH.,
Frederickson JK. (2006) Electrically conductive bacterial nanowires by Shewanella
oneidensis strain MR-1 and other microorganisms. Proceedings of the National Academy of
Science. 103, 11358-11363.
Graham LL., Beveridge TJ. (1994) Structural differentiation of the Bacillus subtilis 168 cell
wall. Journal of Bacteriology, 176, 1413-1421.
Grotzinger JP. & Kasting JF. (1993) New constraints on Precambrian ocean composition.
Journal of Geology. 101, 235-243.
Halliwell B., Gutteridge JMC. (1999) Free radicals in biology and medicine. Oxford Science
Publications, Oxford.
Han TM. & Runnegar B. (1992) Megascopic eukaryotic algae from the 2.1-billion-year-old
Negaunee iron-formation, Michigan. Science, 257, 232-235.
Hedges SB., Chen H., Kumar S., Wang DYC., Thompson AS., Watanabe H. (2004) A
molecular timescale of eukaryote and the rise of complex mutlicellular life. BMC
Evolutionary Biology. 4, 2.
Hegler F., Posth N., Jie J., Kappler A. (2008) Physiology of phototrophic iron(II)-oxidizing
bacteria – implications for modern and ancient environments. FEMS Microbiology Ecology,
in press.
Heising S. and Schink B. (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium
vannielii strain. Microbiology, 144, 2263-2269.
Hitchcock AP (2001) Soft X-ray spectromicroscopy of polymers and biopolymer interfaces,
Journal of Synchrotron Radiation. 8, 66-71.
259
Inskeep WP., Macur RE., Harrison G., Bostick BC., Fendorf S. (2004) Biomineralization of
As(V)-hydrous ferric oxyhydroxide in microbial mats of an acid-sulfate-chloride geothermal
spring, Yellowstone National Park. Geochimica et Cosmochimica Acta, 68, 3141-3155.
Ivarsson M., Lindblom S., Broman C., Holm N.G. (2008) Fossilized microorganisms
associated with zeolite-carbonate interfaces in sub-seafloor hydrothermal environments.
Geobiology, 6, 155-170.
Jacobsen SB. & PimentelKlose MR. (1988) Nd isotopic variations in precambrian banded
iron formations. Geophysical Research Letters. 15, 393-396.
Javaux E., Knoll AH., Walter MR. (2001) Morphological and ecological complexity in early
eukaryotic ecosystems. Nature, 412, 66-69.
Ji G., Garber EAE., Armes LG., Chen CM., Fuchs JA., Silver S. (1994) Arsenate reductase of
Staphylococcus aureus plasmid pI258. Biochemistry, 34, 13472-13476.
Jiao Y. and Newman D.K. (2007) The pio operon is essential for phototrophic Fe(II)
oxidation in Rhodopseudomonas palustris TIE-1. J. Bacteriol., 189, 1765-1773.
Johnson DB., Hallberg KB. (2003) The microbiology of acidic mine waters. Research in
Microbiology, 154, 466-473.
Johnson DB., Hallberg KB. (2005) Biogeochemistry of the compost bioreactor components of
a composite acid mine drainage passive remediation system. Science of the Total
Environment, 338, 81-93.
Jonhson CM., Beard BL., Roden EE. (2008) The iron isotope fingerprints of redox and
biogeochemical cycling in modern and ancient Earth. Annual Reviews of Earth and Planetary
Science. 36, 457-493.
Kaiser K., Guggenberger G. (2000) The role of DOM sorption to mineral surfaces in the
preservation of organic matter in soils. Organic Geochemistry, 31, 711-725.
Kapfer, M. Assessment of the colonization and primary production of microphytobenthos in
the littoral of acidic mining lakes in Lusatia (Germany). Water, Air Soil Poll. 1998, 108, 331-
340.
Kappler A. and Newman D.K. (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing
phototrophic bacteria. Geochim. Cosmochim. Acta, 68, 1217-1226.
Kappler A., Schink B. and Newman D.K. (2005a) Fe(III) mineral formation and cell
encrustation by the nitrate-dependent Fe(II)-oxidizer strain BoFeN1. Geobiology, 3, 235-245.
Kappler AK., Pasquero C., Konhauser KO., Newman DK. (2005b) Deposition of banded iron
formations by anoxygenic phototrophic Fe(II)-oxidizing bacteria. Geology, 33, 865-868.
260
Kasting JF. & Tazewell Howard M. (2006) Atmospheric composition and climate on the early
Earth. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 361, 1733-1742.
Kennedy CB., Scott SD., Ferris FG. (2004) Hydrothermal phase stabilization of 2-line
ferrihydrite. Chemical Geology. 212, 269-277.
Kenney L.J. and Kaplan J.H. Arsenate substitutes for phosphate in the human red cell sodium
pump and anion exchanger. J. Biol. Chem. 1988, 263, 7954-7960.
Kerr RA (2005) The story of O2. Science, 308, 1730-1732.
Kimura H. & Watanabe Y. (2001) Oceanic anoxia at the Precambrian-Cambrian boundary.
Geology. 29, 995-998.
Klein C. (2005) Some Precambrian banded iron-formations (BIFs) from around the world:
their age, geologic setting, mineralogy, metamorphism, geochemistry, and origin. American
Mineralogist. 90, 1473-1499.
Konhauser K.O. (1998) Diversity of bacterial iron mineralization. Earth Sc. Rev., 43, 91-121.
Konhauser KO., Hamade T., Raiswell R., Morris RC., Ferris FG., Southam G., Canfield DE.
(2002) Could bacteria have formed the Precambrian banded iron formations? Geology, 30,
1079-1082.
Konhauser (2007) Introduction to geomicrobiology. Blackwell Publishing.
Konhauser KO., Amskold L., Lalonde SV., Posth NR., Kappler A., Anbar A. (2007)
Decoupling photochemical Fe(II) oxidation from shallow-water BIF deposition. Earth and
Planetary Science Letters. 258, 87-100.
Kopp RE., Kirschvink JL., Hilburn IA., Nash CZ. (2005) The paleoproterozoic snowball
Earth: A climate disaster triggered by the evolution of oxygenic photosynthesis. Proceedings
of the National Academy of Science. 102, 11131-11136.
Krauth-Siegel RL., Comini MA. (2008) Redox control in trypanosomatids, parasitic protozoa
with trypanothione-based thiol metabolism. Biochimica et Biophysica Acta, doi:
10.1016/j.bbagen.2008.03.006
Kulp TR., Hoeft SE., Asao M., Madigan MT., Hollibaugh JT., Fischer JC., Stolz JF.,
Culberston CW., Miller LG., Oremland RS. (2008) Arsenic(III) fuels anoxygenic
photosynthesis in hot spring biofilms from Mono Lake, California. Science. 321, 967-970.
Kump LR. & Syfried Jr WE. (2005) Hydrothermal Fe fluxes during the Precambrian: Effect
of low oceanic sulphate concentrations and low hydrostatic pressure on the composition of
black smokers. Earth and Planetary Science Letters. 235, 654-662.
261
Leblanc M., Achard B., Ben Othman D., Luck JM. (1996) Accumulation of arsenic from
acidic mine waters by ferrugineous bacterial accretions (stromatolites). Applied Geochemistry.
11, 541-554.
Lebrun E., Brugna M., Baymann F., Muller D., Lièvremont D., Lett MC., Nitschke W. (2003)
Arsenite oxidase, an ancient bioenergetic enzyme. Molecular Biology and Evolution. 20, 686-
693.
Lécuyer C. & Ricard Y. (1999) Long-term fluxes and budget of ferric iron: implication for the
redox states of the Earth’s mantle and atmosphere. Earth and Planetary Science Letters. 165,
197-211.
Leforestier A., Dubochet J., Livolant F. (2001) Bilayers of nucleosome core particles.
Biophysical Journal, 81, 2414-2421.
Little C.T.S., Glynn S.E.J. and Mills R.A. (2004) Four-hundred-and-ninety-million-year
record of bacteriogenic iron oxide precipitation at sea-floor hydrothermal vents.
Geomicrobiol. J., 21, 415-429.
Lopez-Garcia P., Moreira D., Douzery E., Forterre P., Van Zuilen M., Claeys P., Prieur D.
(2006) Ancient fossil record and early evolution (ca. 3.8 to 0.5 Ga). In From suns to life.
Earth, Moon, and Planets, 98, 247-290. Springer.
Mann H, Tazaki K, Fyfe WS, Beveridge TJ, Humphrey R (1987) Cellular lepidocrocite
precipitation and heavy metal sorption in Euglena sp. (unicellular alga): implications for
biomineralization. Chemical Geology, 63, 39-43.
Manning PG, Murphy TP, Prepas EE (1991) Intensive formation of vivianite in the bottom
sediments of mesotrophic Narrow Lake, Alberta. Canadian Mineralogist. 29, 77-85.
Martin H., Claeys P., Gargaud M., Pinti DL., Selsis F. (2006) Environmental context. In
From suns to life. Earth, Moon, and Planets, 98, 205-245. Springer.
Matias VRF, Al-Amoudi A., Dubochet J., Beveridge TJ. (2003) Cryo-transmission electron
microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa.
Journal of Bacteriology, 185, 6112-6118.
Mendoza-Cozatl, D.; Devars, S.; Loza-Tavera, H.; Moreno-Sanchez, R. (2002) Cadmium
accumulation in the chloroplast of Euglena gracilis. Physiologia Plant., 115, 276-283.
Meroueh SO, Bencze KZ, Hesek D, et al (2006) Three-dimensional structure of the bacterial
cell wall peptidoglycan. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4404-4409.
Michard, G; Viollier, E; Jezequel, D, Sarazin G (1994) Geochemical study of a crater lake -
Pavin lake, France - identification, location and quantification of the chemical-reactions in the
lake. Chem. Geol., 115, 103-115.
262
Montrichard F., Le Guen F., Laval-Martin DL., Davioud-Charvet E. (1999) Evidence for the
co-existence of glutathione reductase and trypanothione-reductase in the non-trypanosomatid
Euglenozoa : Euglena gracilis Z. FEBS Letters, 442, 29-33.
Moore S.A.; Moennich D.M.C.; Gresser M.J. Synthesis and hydrolysis of ADP-arsenate by
beef heart submitochondrial particles. J. Biol. Chem. 1983, 258, 6266-6271.
Morin G. & Calas G. (2006) Arsenic in soils, mines tailings and former industrial sites.
Elements 2: 97-101.
Morin G., Juillot F., Casiot C., Bruneel O., Personné JC., Elbaz-Poulichet F., Leblanc M,
Ildefonse P., Calas G. (2003) Bacterial formation of tooeleite and mixed arsenic(III) or
arsenic(V)-iron(III) gels in the Carnoulès acid mine drainage, France. A XANES, XRD and
SEM study. Envrionmental Science and Technology, 37, 1705-1712.
Mukhopadhyay R., Dey S., Xu N., Gage D., Lightbody J., Ouellette M., Rosen BP. (1996)
Trypanothione overproduction and resistance to antimonials and arsenicals in Leishmania.
Proceedings of the National Academy of Science, USA, 93, 10383-10387.
Mukhopadhyay R., Rosen BP. (2002) Arsenate reductases in prokaryotes and eukaryotes.
Environmental Health Perspectives. 110, 745-748.
Mukhopadhyay R. ; Shi J. ; Rosen B.P. Purification and characterization of Acr2p, the
Saccharomyces cerevisiae arsenate reductase. J. Biol. Chem. 2000, 275, 21149-21157.
Narasaraju TSB., Rao KK., Rai US. (1978) Determination of solubility products of
hydroxylapatite, chlorapatite, and their solid solutions. Canadian Journal of Chemistry, 57,
1919-1922.
Oremland RS., Hoeft SE., Santini JM., Bano N., Hollibaugh RA., Hollibaugh JT. (2002)
Anaerobic oxidation of arsenite in Mono Lake water and by a facultative, arsenite-oxidizing
chemoautotroph, strain MLHE-1. Applied and Environmental Microbiology. 68, 4795-4802.
Oremland RS., Stolz JF. (2003) The ecology of arsenic. Science. 300, 939-944.
Nesterova M., Moreau J., Banfield JF. (2003) Model biomimetic studies of templated growth
and assembly of nanocrystalline FeOOH. Geochimica et Cosmochimica Acta, 67, 1177-1187.
Nikaido H. (2003) Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67, 593-.
Nriagu JO, Dell CI (1974) Diagenetic formation of iron phosphates in recent lake sediments.
American Mineralogist. 59, 934-946.
Nriagu JO (1972) Stability of vivianite and ion-pair formation in the system Fe3(PO4)2-
H3PO4H3PO4-H2O. Geochimica et Cosmochimica Acta. 36, 459-472.
263
Petit PE, Farges F, Wilke M, Solé VA (2001) Determination of the iron oxidation state in
Earth materials using XANES pre-edge information. Journal of Synchrotron Radiation 8,
952-954.
Phoenix VR., Konhauser KO. (2008) Benefits of bacterial biomineralization. Geobiology. 6,
303.
Pierri E., Dalas E. (1998) The precipitation of ferric phosphate on porous polymer. Colloids
and Surfaces. A: Physicochemical and Engineering Aspects, 139, 335-340.
Pinti D. (2005) in Gargaud et al. (eds). Lectures in Astrobiology. Advances in Astrobiology
and Biogeophysics. Springer-Verlag, Berlin, pp. 83-107.
Posth N.R., Konhauser K.O. and Kappler A. (2008) Microbiological Processes in BIF
Deposition. Journal of Sedimentology, in press.
Price RE., Amend JP., Pichler T. (2007) Enhanced geochemical gradients in a marine
shallow-water hydrothermal system: unusual arsenic speciation in horizontal and vertical pore
water profiles. Applied Geochemistry. 22, 1595-1605.
Raiswell R. (2006) Towards a global highly reactive iron cycle. Journal of Geochemical
Exploration. 88, 436-439.
Raymond J. & Segrè D. (2006) The effect of oxygen on biochemical networks and the
evolution of complex life. Science, 311, 1764-1767.
Reguera G., McCarthy KD., Mehta T., Nicoll JS., Tuominen MT., Lovley DR. (2005)
Extracellular electron transfer via microbial nanowires. Nature, 435, 1098-1101.
Rhine ED., Phelps CD., Young LY. (2006) Anaerobic arsenite oxidation by novel denitrifying
isolates. Envrionmental Microbiology, 8, 899-908.
Robert F., Chaussidon M. (2006) A palaeotemperature curve for the Precambrian oceans
based on silicon isotopes in cherts. Nature. 443, 969-972.
Rocchetta, I.; Ruiz, L.B.; de Molina, M.C.R.; Conforti, V. (2006) Chromium toxicity to
Euglena gracilis strains depending on the physicochemical properties of the culture medium.
Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 76, 512-521.
Rosen BP. (1999) Families of arsenic transporters. Trends in Microbiology, 7, 207-212.
Rosen, B.P. Biochemistry of arsenic detoxification. FEBS Letters 2002, 529 (1), 86-92.
Sapota T, Aldahan A, Al-Aasm I (2006) Sedimentary facies and climate control on formation
of vivianite and siderite microconcretions in sediments of Lake Baikal, Siberia. Journal of
Paleolimnology. 36, 245-257.
264
Schaedler S., Burkhardt C., Hegler F., Straub KL., Miot J., Benzerara K., Kappler A.
(submitted) Formation of cell-iron-mineral aggregates by phototrophic and nitrate-dependent
anaerobic Fe(II)-oxidizing bacteria. Submitted to Geomicrobiology Journal.
Schmid M., Schmitz-Esser S., Jetten M., Wagner M. (2001) 16S-23S rDNA intergenic spacer
and 23S rDNA of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria: implications for phylogeny and in
situ detection. Environmental Microbiology, 3, 450-459.
Schopf JW., Kudryavstev AB., Agresti DG., Wdowiak TJ., Czaja AD. (2002) Lase-Raman
imagery of Earth’s earliest fossils. Nature, 416, 73-76.
Schultze-Lam S., Harauz G., Beveridge TJ. (1992) Participation of a cyanobacterial S-layer in
fine-grain mineral formation. Journal of Bacteriology, 174, 7971-7981.
Silver S., Phung LT. (2005) Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction
of inorganic arsenic. Applied and Environmental Microbiology. 71, 599-608.
Slooten L. and Nuyten A. Arsenylation of nucleoside diphosphates in Rhodospirillum rubrum.
Biochim. Biophys. Acta. 1983, 725, 49-59.
Smedley PL. & Kinniburgh DG. (2002) A review of the source, behaviour and distribution of
arsenic in natural waters. Applied Geochemistry 17: 517-568.
Stolz JF., Basu P., Santini JM., Oremland RS. (2006) Arsenic and selenium in microbial
metabolism. Annual Reviews in Microbiology. 60, 107-130.
Styblo M., Drobna Z., Jaspers I., Lin S., Thomas DJ. (2002) The role of biomethylation in
toxicity and carcinogenicity of arsenic: a research update. Environmental Health Perspectives,
110, 767-771.
Summons RE., Jahnke LL., Hope JM., Logan GA. (1999) 2-Methylhopanoids as biomarkers
for cyanobacterial oxygenic photosynthesis. Nature. 400, 554-557.
Sundaram S., Rathinasabapathi B., Ma LQ., Rosen BP. (2008) An arsenate-activated
glutaredoxin from the arsenic hyperaccumulator fern Pteris vittata L. regulated intracellular
arsenite. The Journal of Biological Chemistry, 283, 6095-6101.
Thole B.T., Van der Laan G., Fabrizio M. (1994) Magnetic ground state properties and
spectral distributions. I. X-ray absorption spectra. Phys. Rev. B., 50, 11466-11473.
Tice MM. & Lowe DR. (2004) Photosynthetic microbial mats in the 3,416-Myr-old ocean.
Nature, 431, 549-552.
Todorova T. (2007) Glutathion S-transférases et stress oxydatif chez Saccharomyces
cerevisiae. Thèse de doctorat, Université Louis Pasteur.
265
Tuan L.Q.; Huong T.T.T.; Hong P.T.A.; Kawakami T.; Shimanouchi T.; Umakoshi H.; Kuboi
R. Arsenic(V) induces a fluidization of algal cell and liposome membranes. Toxicol. In Vitro.
2008, doi:10.1016/j.tiv.2008.05.012
Van Dijk S., Dean D.D., Liu Y., Zhao Y. Chirgwin J.M., Schwartz Z. and Boyan B.D. (1998)
Purification, amino acid sequence and cDNA sequence of a novel calcium-precipitating
proteolipid involved in calcification of Corynebacterium matruchotii. Calcified Tissue
International, 62, 350-358.
Viollier E, Michard G, Jézéquel D, Pèpe M, Sarazin G (1997) Geochemical study of a crater
lake: Lake Pavin, Puy de Dôme, France. Constraints afforded by the particulate matter
distribution in the element cycling within the lake. Chemical Geology. 142, 225-241.
Wan J., Tyliszczak T., Tokunaga TK. (2007) Organic carbon distribution, speciation and
elemental correlations within soil micro-aggregates: applications of STXM and NEXAFS
spectroscopy. Geochimica et Cosmochimica Acta. 71, 5439-5449.
Wang Y., Morin
G., Ona-Nguema
G., Menguy
N., Juillot
F., Aubry
E., Guyot
F., Calas
G.,
Brown JR. G.E. (2008) Arsenite sorption at the magnetite-water interface during aqueous
precipitation of magnetite. EXAFS evidence for a new surface complex. Geochimica et
Cosmochimica Acta 72, 2573-2586.
Watanabe Y. & Gray MW. (2000) Evolutionary appearance of genes encoding proteins
associated with box H/ACA snoRNAs: Cbf5p in Euglena gracilis, an early diverging
eukaryote, and candidate Gar1p and Nop10p homologs in archaebacteria.
Nucleic Acids Research, 28, 2342-2352.
Weber KA., Achenbach LA., Coates JD. (2006) Microorganisms pumping iron: anaerobic
microbial iron oxidation and reduction. Nature, 4, 752-764.
Widdel F., Schnell S., Heising S., Ehrenreich A., Assmus B. and Schink B. (1993) Ferrous
iron oxidation by anoxygenic phototrophic bacteria. Nature, 362, 834-836.
Wilke M, Farges F, Petit PE, Brown Jr GE, Martin F (2001) Oxidation state and coordination
of Fe in minerals: An Fe K-XANES spectroscopic study. American Mineralogist. 86, 714-
730.
Winterer M. (1997) XAFS - A data analysis program for materials science. J. de Physique IV
7, 243-244.
Xiong J., Fischer WM., Inoue K., Nakahara M., Bauer CE. (2000) Molecular evidence for the
early evolution of photosynthesis. Science, 289, 1724-1730.
266
Yompakdee C.; Bun-ya M.; Shikata K.; Ogawa N.; Harashima S.; Oshima Y. A putative new
membrane protein, Pho86p, in the inorganic phosphate uptake system of Saccharomyces
cerevisiae. Gene. 1996, 171, 41-47.
Zaman, G.J.R.; Lankelma, J.; van Tellingen, O.; Beijnen, J.; Dekker, H.; Paulusma, C.;
Elferink, R.P.J.O.; Baas, F.; Borst, P. Role of glutathione in the export of compounds from
cells by the mutidrug-resistance-associated protein. PNAS 1995, 92, 7690-7694.
Zuber B., Chami M., Houssin C., Dubochet J., Griffiths G., Daffé M. (2008) Direct
visualization of the outer membrane of native Mycobacteria and Corynebacteria. Journal of
Bacteriology. doi: 10.1128/JB.01919-07.
267
Protocoles
268
269
Protocole de préparation du milieu de culture liquide pour bactéries Fe(II)-oxydantes neutrophiles anaérobies (BoFeN1 et SW2)
A autoclaver avant de dispenser le milieu dans les flacons de 50 ou 100 mL:
� Milieu de base.
� Solution tampon NaHCO3.
� Solution d’éléments traces.
� Solution sélénite.
� Solution d’acétate, 1M.
� Solution de nitrate, 1M.
A stériliser au four:
� Flacons de 50 mL pour dispenser le milieu, recouverts d’alu.
� Bouchons en butyl (dans un bécher recouvert d’alu).
� Pinces.
� Flacon de Widdel.
Milieu de base (pour 500 mL) (à autoclaver):
On prépare 500 mL de ce milieu dans une bouteille d’1L. Les poudres sont pesées
ensemble à l’extérieur de la boîte à gants. 500 mL d’ED anoxique est ajoutée dans la
boîte à gants.
NH4Cl [MW 53.49] 0.15 g 5.61 mM
KH2PO4 [MW 136.09] 0.3 g 4.41 mM
CaCl2·2H2O [MW 147.02] 0.05 g 0.68 mM
MgSO4·7H2O [MW 246.47] 0.25 g 2.0 mM
Seulement si pas de MgSO4 disponible:
MgCl2·6H2O [MW 203.31] 0.2 g 1.97 mM
� Autoclaver le milieu.
� Autoclaver les différentes parties du flacon de Widdel, dans lequel a été introduit
un agitateur magnétique (protéger les extrémités avec de l’alu, fermer les
bouchons à moitié seulement). Assembler le flacon autoclavé sous la hotte à flux
laminaire. Refermer les bouchons à fond.
� Sous la hotte, verser les 500 mL de milieu de base dans le flacon.
� Fermer tous les bouchons.
Additions sous flux de N2/CO2 (pour 500 mL de milieu de base autoclavé):
270
Solution tampon NaHCO3 11 mL de solution mère 1 M (autoclavée)
Solution d’éléments traces 0.5 mL de solution mère (autoclavée)
Solution de vitamines 0.5 mL de solution mère (filtrée à 0.22 µm)
Solution de sélénite 0.5 mL de solution mère, autoclavée
En conditions stériles (flamme) :
� Placer le flacon de Widdel sur la paillasse.
� Agiter avec l’agitateur magnétique.
� Clamper le distributeur de milieu.
� Ouvrir la vanne IN.
� Ouvrir la vanne N2/CO2. Laisser sous flux de N2/CO2 pendant environ 30
minutes minimum.
Quand le milieu est à température ambiante :
� Ajouter les différentes solutions (tampon, éléments traces, vitamines, sélénite)
dans la vanne IN.
� Mesurer et ajuster le pH à 6.8-7.0 après les additions (en restant en conditions
stériles) : on prélève quelques mL de milieu dans la vanne OUT avec une
pipette Pasteur stérilisée dans la flamme. On mesure le pH de ce prélèvement.
Si le pH n’est pas dans l’intervalle 6.8-7.0, on l’ajuste avec du Na2CO3 ou du
HCl 37%. (utiliser les valeurs reportées dans le tableau, mais attention, elles
donnent des volumes surestimés !). Exemple : pHinitial = 7,22. Ajout de 100
uL de HCL à 37%. pH final = 7,03.
� On enlève le surplus de milieu (présent dans les tubes) dans un flacon stérile
poubelle.
� Dispenser le milieu dans les flacons autoclavés jusqu’à 25 mL : Fermer les
vannes IN et OUT. On place le flacon entièrement dans la zone de
prélèvement et on le descend au fur et à mesure du remplissage, en
déclampant temporairement le distributeur. On passe le sommet du flacon
dans la flamme. On dépose un bouchon au sommet du flacon avec la pince
stérile. On passe la seringue N2/CO2 dans la flamme. On introduit la seringue
(sans toucher le liquide) pendant environ 40 secondes dans le flacon (en
recouvrant au maximum avec le bouchon). On ferme le bouchon. On repasse
le sommet du flacon dans la flamme avant de refermer complètement le
flacon.
� Sceller les flacons.
Préparation des solutions mères: (pour 500 mL de milieu)
A) Préparation d’eau distillée anoxique
271
On remplit une bouteille d’1L d’eau MilliQ. On referme cette bouteille avec le bouchon
pour dégazage. On règle la température du bain chauffant à 80°C. On met la bouteille
dans l’eau en la fixant. Quand la température est stabilisée, on ouvre la vanne de la
bouteille d’N2 pour faire buller l’azote dans l’eau (le flux d’azote a tendance à diminuer
avec le temps, le régler un peu fort au début). On laisse la sortie d’air ouverte. On laisse
buller l’azote pendant environ 1h. Puis, on met le clamp au niveau de l’arrivée d’azote,
sans le fermer complètement. On clampe (totalement) la sortie d’air. On finit de clamper
l’arrivée d’azote. On ferme rapidement la vanne de la bouteille d’N2.
On refroidit la bouteille d’eau dans de la glace + chambre froide. On la rentre dans la
boîte à gants (ne pas pomper trop longtemps !) et on remet un bouchon normal.
B) Solution tampon NaHCO3, 1 M
� Peser 924 mg de NaHCO3 dans un flacon de 50 mL non stérile
� Parallèlement, verser 11mL d’eau distillée anoxique dans un flacon de 50 mL non
stérile dans la boîte à gants. Refermer et sceller ce flacon dans la boîte à gants et
le sortir.
� A proximité de la bouteille N2/CO2, verser rapidement les 11 mL d’eau anoxique
dans le flacon contenant la poudre de NaHCO3. Dégazer avec un flux de N2/CO2
pendant 1 minute minimum.
� Refermer et sceller le flacon.
� Autoclaver.
C) Solution d’éléments traces
On prépare 20 mL final de cette solution.
On pèse les poudres dans des falcons séparés à l’extérieur de la boîte à gants (sauf EDTA
pesé dans un flacon en verre de 50 mL).
On introduit ensuite tous les falcons + flacons dans la boîte à gants et on dissout les
poudres contenues dans les falcons dans de l’eau distillée anoxique. On ajoute environ 10
mL d’eau dans le falcon contenant FeSO4. On verse cette solution dans le flacon
contenant l’EDTA. On ajoute les prélèvements des différentes solutions contenues dans
les autres falcons. On homogénéise la solution. On la verse dans une éprouvette de 50
mL. On complète à 20 mL avec de l’ED anoxique. On remet cette solution dans le flacon
de 50 mL, qu’on ferme avec un bouchon en butyl et qu’on scelle.
� Na2-EDTA * 2 H20 [MW 372.2]
60 mg, introduits dans un flacon verre de 50 mL.
� FeSO4 * 7 H2O [MW 278.01]
22 mg, introduits dans un falcon de 15mL.
� CoCl2 * 6 H2O [MW 237.93]
272
On prépare une solution mère à 80 mM: 103.9 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� ZnCl2 [MW 136.3]
On prépare une solution mère à 0.03 M: 40.9 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� NiCl2 * 6 H2O [MW 237.7]
On prépare une solution mère à 0.01 M: 23.8 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� Na2MoO4 * 2 H2O [MW 241.95]
On prépare une solution mère à 7 mM: 17 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� H3BO4 [MW 61.83]
On prépare une solution mère à 0.49 M: 303 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� CuCl2 * 2 H20 [MW 170.48]
On prépare une solution mère à 11.7 mM: 20 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 20 µL de cette solution dans la solution finale.
� MnCl2 * 4 H20 [MW 197.91]
On prépare une solution mère à 25 mM: 49.5 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� Ajouter Na2-EDTA en premier.
� Ajuster à pH 6.5 avant d’autoclaver, dans la boîte à gants. (avec quelques
gouttes de HCl, 2N).
Qté dans la sol. mère (1L) Conc. dans le milieu (1 L)
Na2-EDTA * 2 H20 [MW 372.2] 3.0 g 8.1 µM
FeSO4 * 7 H2O [MW 278.01] 1.1 g 4.0 µM
CoCl2 * 6 H2O [MW 237.93] 190 mg 0.80 µM
ZnCl2 [MW 136.3] 42 mg 0.31 µM
NiCl2 * 6 H2O [MW 237.7] 24 mg 0.10 µM
Na2MoO4 * 2 H2O [MW 205.92 w/o H2O] 18 mg 0.087 (0.074 µM)
H3BO4 [MW 61.83] 300 mg 4.8 µM
CuCl2 * 2 H20 [MW 170.48] 2 mg 0.01 µM
273
MnCl2 * 4 H20 [MW 197.91] 50 mg 0.25 µM
D) Solution de vitamines
On prépare 10 mL final de cette solution.
On procède de la même façon en pesant les poudres dans des falcons distincts en dehors
de la boîte à gants et en effectuant les dissolutions et dilutions dans la boîte à gants.
� 4 Aminobenzoic acid [MW 137.14]
On prépare une solution mère à 29 mM: 39.8 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 100 µL de cette solution dans la solution finale.
� D (+) biotin [MW 244.3]
On prépare une solution mère à mM: 48.9 mg dissous dans 150 mL d’ED anoxique.
On introduit 300 µL de cette solution dans la solution finale. SE DISSOUT TRES MAL!
� Nicotinic acid [MW 123.11]
On prépare une solution mère à 81 mM: 20 mg dissous dans 2 mL d’ED anoxique.
On introduit 100 µL de cette solution dans la solution finale.
� Ca-(+) pantothenate [MW 476.53]
On prépare une solution mère à 0.01 M: 47.7 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� Pyridoxamine dihydrochloride [MW 241.12]
On prépare une solution mère à 0.829 M: 1 g dissous dans 5 mL d’ED. (flacon livré)
On introduit 120 µL de cette solution dans 10 mL d’ED.
On introduit 410 µL de cette solution dans la solution finale.
� Thiaminium dichloride [MW 337.3]
On prépare une solution mère à 15 mM: 25.3 mg dissous dans 5 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� Riboflavin [MW 376.4]
On prépare une solution mère à 67 mM: 25 mg dissous dans 1 mL d’ED anoxique.
On introduit 200 µL de cette solution dans la solution finale.
� On complète à 10 mL la solution finale.
274
� On filtre cette solution à 0.22 µm dans un flacon de 50 mL autoclavé. On ferme
ce flacon avec un bouchon en butyl autoclavé. On le scelle.
� Le flacon est stocké à l’abri de la lumière à 4°C.
Qté dans la sol. mère (100 mL) Conc dans le
milieu (1 L)
4 Aminobenzoic acid [MW 137.14] 4 mg 0.29 µM
D (+) biotin [MW 244.3] 1 mg 41 nM
Nicotinic acid [MW 123.11] 10 mg 0.81 µM
Ca-(+) pantothenate [MW 238.3 w/ ½ Ca)] 5 mg 0.21 µM
Pyridoxamine dihydrochloride [MW 241.12] 10 mg 0.41 µM
Thiaminium dichloride [MW 337.3] 10 mg 0.29 µM
Riboflavin [MW 376.4] 50 mg 1.32 µM
E) Solution de sélénite
On prepare 20 mL de cette solution, selon le même principe que précédemment.
� NaOH [MW 40]
On prépare une solution mère à 2 M: 8 g dissous dans 100 mL d’ED anoxique (flacon
plastique).
On introduit 125 µL de cette solution dans la solution finale.
� Na2SeO3. 5H2O [MW 263.02]
On prépare une solution mère à 11.4 mM: 30 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 20 µL de cette solution dans la solution finale.
� Na2WO4. 2H2O [MW 329.87]
On prépare une solution mère à 12.1 mM: 40 mg dissous dans 10 mL d’ED anoxique.
On introduit 20 µL de cette solution dans la solution finale.
� On complète à 20 mL.
� A autoclaver.
Qté dans la solution mère (1 L)
NaOH [MW ] 0.5 g
Na2SeO3. 5H2O [MW ] 3 mg
275
Na2WO4. 2H2O [MW ] 4 mg
Milieu pour BoFeN
On travaille près de la flamme, sur une paillasse nettoyée avec de l’éthanol et loin des
courants d’air !
� Stériliser le dessus du flacon contenant l’acétate et le dessus du flacon contenant
le milieu avec la seringue éthanol 100°, dans la flamme. (Les flacons doivent être
scellés préalablement).
� Prendre une aiguille (verte) et une seringue de 1 mL.
� Stériliser la seringue N2/CO2 dans la flamme.
� Echanger 6 à 7 fois l’air de la seringue avec le flux N2/CO2. Souffler le mélange
N2/CO2 en déplaçant la seringue vers le flacon d’acétate, jusqu’à l’introduction
de l’aiguille dans le flacon.
� Prélever le solution d’acétate :
� Près de la flamme, flacon tête en bas, rentrer totalement l’aiguille.
� Prélever (un volume plus important que le volume à inoculer).
� Retirer l’aiguille jusqu’à mi chemin dans le bouchon. Attendre 20
à 30 secondes que le trou se referme.
� Retirer doucement l’aiguille (en montant lentement le flacon).
� Enlever les bulles d’air.
� Inoculer le volume nécessaire dans le flacon contenant le milieu :
� Flacon tête en bas.
� Introduire totalement la seringue.
� Inoculer.
� Retirer la seringue jusqu’à mi chemin dans le bouchon.
� Attendre 20 à 30 secondes que le trou se referme.
� Retirer totalement l’aiguille.
Pour la souche BoFeN, on introduit dans 25 mL de milieu, selon ce protocole,
successivement :
� Acétate 5 : 125 µL de solution mère Na-acétate, 1M.
� NO3 10 : 250 µL de solution mère NaNO3, 1M.
� Fe 10 : 250 µL de solution mère FeCl2, 1M. A toujours introduire en dernier et
changer de seringue + aiguille pour chaque flacon.
Ou seulement :
� Acétate 5 : 125 µL de solution mère Na-acétate, 1M.
� NO3 10 : 250 µL de solution mère NaNO3, 1M.
276
Inoculation des souches :
� Selon le même principe, on introduit 2.5 mL de culture dans le milieu, avec une
nouvelle seringue de 5 mL à chaque inoculation.
Milieu pour SW2
Pour la souche SW2, on introduit dans 25 mL de milieu, selon ce protocole :
� Fe 10 : 250 µL de solution mère FeCl2, 1M. Changer de seringue + aiguille pour
chaque flacon.
Inoculation des souches :
� Selon le même principe, on introduit 1.5 mL de culture dans le milieu, avec une
nouvelle seringue de 2.5 mL à chaque inoculation.
Préparation des solutions mères :
A) Solution d’acétate, 1 M
� Introduire 2.05 g de Na-acétate [MW 82.03] dans 25 mL d’eau distillée
anoxique dans un flacon de 50 mL dans la boîte à gants.
� Sceller le flacon.
� Autoclaver.
B) Solution de nitrate, 1M
� Introduire 2.125 g de NaNO3 [MW 85.01] dans 25 mL d’eau distillée anoxique
dans un flacon de 50 mL dans la boîte à gants.
� Sceller le flacon.
� Autoclaver.
C) Solution de FeCl2, 1M
277
� Fermer 1 flacon de 50 mL (contenant une goutte d’eau distillée anoxique) dans la
boîte à gants avec un bouchon en butyl. Le sceller et sortir de la boîte à gants ce
flacon + la boîte de FeCl2.
� Autoclaver le flacon de 50 mL.
� Stériliser le bouchon de ce flacon avec de l’éthanol 100° dans une flamme. Le
recouvrir d’alu.
� Peser 4.97 g de FeCl2 dans un flacon de 50 mL non stérile. Le recouvrir d’alu.
� Introduire dans la boîte à gants :
� Seringue, filtre à 0.1 µm, aiguille.
� Le flacon contenant FeCl2, recouvert d’alu + son bouchon.
� La boîte de FeCl2.
� Le flacon autoclavé.
� Une éprouvette de 50 mL.
� Introduire 25 mL d’eau distillée anoxique dans le flacon contenant la poudre de
FeCl2. Agiter.
� Prélever cette solution avec la seringue.
� Filtrer cette solution dans le flacon stérile (filtre + aiguille).
278
Protocole de dosage Fe(II)/Fe(III) par la ferrozine D’après Viollier et al., 2000.
Dosage du Fe dissous :
- Dans la chambre anaérobie (N2), prélever 200 µL de culture. Filtrer à 0.22 µm.
- Prélever 100 µL de la solution filtrée et ajouter 900 µL de HCl, 1M.
- Cette solution peut être conservée dans la boîte à gants, jusqu’à analyse.
- Hors de la boîte à gants, prélever 400 µL de ce mélange. Y ajouter 2.9 mL HCl,
1M (dosage Fe(II)) OU 2.9 mL de la solution de réducteur (attente 20 minutes-
dosage du Fe(II)+Fe(III)).
- Ajouter 500 µL de la solution de ferrozine et 200 µL de tampon pH 9.5.
- Après 5 minutes, mesurer l’absorbance à 562 nm.
Dosage du Fe total (solide + dissous) :
- Dans la chambre anaérobie (N2), prélever 350 µL de culture. Y ajouter 1 650 µL
de HCl, 6M. Laisser agir 1 heure.
- Filtrer la solution à 0.22 µm.
- Cette solution peut être conservée dans la boîte à gants, jusqu’à analyse.
- Hors de la boîte à gants, prélever 400 µL de ce mélange. Y ajouter 2.9 mL HCl,
1M (dosage Fe(II)) OU 2.9 mL de la solution de réducteur (attente 20 minutes-
dosage du Fe(II)+Fe(III)).
- Ajouter 500 µL de la solution de ferrozine et 200 µL de tampon pH 9.5.
- Après 5 minutes, mesurer l’absorbance à 562 nm.
279
Protocole de dosage des protéines totales de bactéries ferroxydantes par la méthode de Bradford
Réactifs :
• NaOH, O.1 M
• Acide trichloroacétique, 6.1 N (TCA)
• Réactif de Tamm (acide oxalique – oxalate d’ammonium)
Gamme étalon :
On prépare une gamme étalon de γ-globuline 0 à 25 µg.mL-1 dans NaOH 0.1 M.
On laisse réagir 250 µL de standard avec 250 µL de réactif de Bradford pendant 5
minutes.
On mesure l’absorbance à 595 nm.
Dosage des protéines totales dans les cultures :
On prélève 1 mL de culture. On y ajoute 840 µL de réactif de Tamm (pour dissoudre les
phases amorphes porteuses de fer et lyser les bactéries) et 160 µL de TCA (pour
précipiter les protéines). On laisse les eppendorfs tourner environ 10 minutes sur la roue,
à l’obscurité.
On centrifuge 30 minutes à 13 000 rpm.
On remplace le surnageant par 1 mL de NaOH, 0.1 M. On chauffe les échantillons à 60°C
(bain à sec) pendant 6 minutes.
On mélange 250 µL d’échantillon avec 250 µL de réactif de Bradford. On mesure
l’absorbance à 595 nm après 5 minutes.
280
Préparation de géloses pour la culture de bactéries ferroxydantes neutrophiles anaérobies en milieu solide
Préparation du milieu de base :
♦ Pour 500 ml (à preparer dans une bouteille d’1L; environ 15 boîtes):
NH4Cl 0,15 g
KH2PO4 0,3 g
CaCl2 0,05 g
MgSO4 0,25 g
Agar 7,5 g
♦ Dissoudre avec 500 ml eau non dégazée.
♦ Autoclaver.
Préparation tampon carbonate de sodium :
♦ 924 mg
♦ 11 ml eau anoxique
♦ Sceller
♦ Autoclaver
Dégazage du milieu préparé :
♦ Sous PSM, verser le tampon NaHCO3 dans le milieu de base.
Laisser refroidir un peu le milieu avant d’ajouter le tampon !
♦ Adapter système dégazage avec filtre 0.22 µm sur tuyau entrée gaz. Clamper entrée /
sortie de gaz pour sortir le milieu de sous le PSM.
♦ Laisser dégazer 30-40 min à dans bain-marie 80°C sous flux N2/CO2 ou N2 seul.
Préparation des géloses dans boîte à gants :
♦ Entrer dans boîte à gants :
• milieu de base
• Solutions éléments traces, vitamines, sélénium
• Solutions Na-acétate, Na-nitrate
• Si besoin, FeCl2
• Boîtes de Pétri
• Parafilm
• Seringues, aiguilles
♦ Laisser refroidir un peu le milieu avant d’ajouter en condition stériles :
• 500 µl solutions vitamines, sélénites, éléments traces
• 2,5 ml Na-acétate
• 5 ml Na-nitrate
• éventuellement 5 ml FeCl2
281
♦ Couler dans les boîtes de Pétri (environ 25 mL par boîte) et laisser prendre en
conditions stériles.
♦ Parafilmer, sceller dans papier aluminisé, stocker à 4°C.
282
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION Protocole de fixation et inclusion des échantillons
FIXATION CHIMIQUE
Solution tampon : 630 mL d’acide acétique 0,2 mol/L + 370 mL d’acétate de sodium 0.2
mol/L. (pH 4,4)
Ou tampon phosphate
Ou tampon cacodylate
Solution de fixateur : 1 volume de Glutaraldéhyde (25%)
+ 5 volumes de solution tampon
Technique : Faire des prélèvements, centrifuger et enlever le surnageant. Répéter
l’opération jusqu’à obtenir un culot suffisamment dense. Remplacer le dernier surnageant
par la solution de fixateur.
La durée de fixation est de 1h30 minimum à +4°C.
Remplacer le fixateur par la solution tampon. L’échantillon y reste au moins 18h et peut
se conserver pendant 15 jours à +4°C.
POST FIXATION
Solution de tétroxyde d’osmium (OsO4) : une ampoule de 1 g est chauffée dans l’eau
(40°C) pour liquéfier l’OsO4, puis refroidie pour le cristalliser sur les parois de
l’ampoule. L’ampourle est cassée dans un flacon fermant hermétiquement (danger lié aux
vapeurs) et très propre. On ajoute 25 mL d’eau pure. Cette solution doit être conservée à
l’abri de la lumière sous hotte dans une double enceinte bien fermée.
Technique : remplacer la solution tampon par une solution d’OsO4 à 1% (dans la
solution tampon) pendant 1 à 2h à température ambiante. (0,5 mL d’OsO4 à 1% + 0,25
mL de solution tampon à 0,2 mol/L + 0,25 mL d’eau distillée).
DESHYDRATATION
Rinçages successifs séparés chacun par des centrifugations/éliminations du surnageant :
-H2O distillée : 3 rinçages de 5 min
-Ethanol 50° : 1 rinçage de 10 min
-Ethanol 70° : 1 rinçage de 10 min
-Ethanol 95° : 1 rinçage de 10 min
-Ethanol 100° : 3 rinçages de 20 min
Les différents alcools sont préparés à partir d’éthanol pur 100°.
283
-Oxyde de propylène1,2 : 1 rinçage de 30 min
INCLUSION
Produits : Sol A : Epon (epoxy medium) : 38%
DDSA : 62%
Sol B : Epon (epoxy medium) : 53%
MNA : 47%
On agite l’ensemble sous hotte aspirante dans les proportions : 2 volumes de Sol A pour 3
volumes de Sol B. (à préparer extemporanément). On agite lentement pendant 15 min,
puis on ajoute 2,5% de DMP 30 (accélérateur) et on agite à nouveau pendant 15 min.
Cette solution finale peut se conserver 24h à +4°C.
Technique : Le bain d’oxyde de propylène est remplacé par le mélange suivant :
1 volume de solution finale d’Epon + 1 volume d’oxyde de propylène.
Laisser le tube débouché sous la hotte aspirante à la température du laboratoire pendant
18h.
On centrifuge et on remplace le surnageant par le mélange final d’Epon (3 fois).
On laisse agir pendant 4h, en laissant le tube débouché.
La polymérisation est obtenue en chauffant les tubes débouchés à l’étuve :
24h à 37°C
24h à 45°C
48h à 60°C.
284
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION Protocole de contraste des coupes
I. CONTRASTE A L’ACETATE D’URANYL
Solution d’acétate d’uranyl : 1,25g d’acétate d’uranyl dans 25 mL d’eau distillée, dilué
de moitié dans de l’alcool 100°. A conserver à l’abri de la lumière et à 4 °C.
Filtrer la solution avant utilisation (à 0,22 µm).
Déposer des gouttes sur un parafilm. Déposer les coupes au contact des gouttes et laisser
agir 15 minutes, à l’abri de la lumière (sous un couvercle). Rincer dans l’alcool 50°
(plusieurs bains). Laisser sécher les grilles sur un papier filtre.
II. CONTRASTE AU CITRATE DE PLOMB
Solution de citrate de plomb :
Déposer des gouttes de citrate de plomb (solution filtrée à 0,22 µm) sur un parafilm posé
au fond d’une boîte de Pétri contenant des pastilles de soude. Déposer les coupes au
contact des gouttes et laisser agir pendant 7 minutes.
Rincer à l’eau distillée.
Laisser sécher les grilles sur un papier filtre sous un couvercle de boîte de Pétri.
285
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)
Tous les réactifs doivent être préparés avec de l’eau mQ, filtrés à 0.2 µm et autoclavés si
possible
1. FIXATION DES CELLULES Placer l’échantillon dans un volume 10 fois plus important de PBS + 2% formaldéhyde
(pour 50 ml ajout de 2,7 ml de formaldéhyde 37% par exemple), agiter pour imprégner
l’échantillon, laisser 1h à 4h à 4°C (plus l’incubation est longue plus les risques
d’autofluorescence sont importants).
Lavage : Centrifuger 6000 rpm, 10 minutes
Resuspendre dans PBSx1 (50ml)
Centrifuger 6000 rpm, 10 minutes
Recommencer lavage une deuxième fois
Reprendre dans PBSX1 (25 ml) et ajouter un même volume d’éthanol 100%
Stocker à -20°C
2. DEPOT SUR LAMES Utilisation de lames 10 puits 6 mm de diamètre
Lavage échantillon dans PBSx1 (2 mL)
Reprendre échantillon dans volume adéquat de PBSx1 (200 µL pour les cultures Acétate,
2 mL pour les cultures Fe)
Dépôt de 5 ou 10 µl par puits
Sécher à 46°C pendant environ 15 minutes (ne pas trop sécher sinon ça se décolle lors de
la deshydratation)
3. DESHYDRATATION Tremper les lames dans des bains successifs d’éthanols (50%, 80%, 100%), 3 minutes
(minimum) pour chaque bain. Laisser sécher à l’air.
4.HYBRIDATION
Sondes : solution stock à 500 ng/µl dans TE
working solution 50 ng/µl pour les sondes marquées au FITC 30 ng/µl pour les
sondes marquées au cy3 dans mQ
Dans la solution d’hybridation la concentration finale en sonde est de 5 ng/ul ou 3 ng/ul
Utiliser 1 ml de solution d’hybridation par lames : [ ] finale
[formamide] 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50%
NaCl 5M 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 180 ul 0,9 M
Tris-HCl pH
8, 1M
20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 mM
formamide 0 ul 50 ul 100 ul 150 ul 200 ul 250 ul 300 ul 350 ul 400 ul 450 ul 500 ul
mQ 799 ul 749 ul 699 ul 649 ul 599 ul 549 ul 499 ul 449 ul 399 ul 349 ul 299 ul
SDS 10% 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 0,01 %
286
Pour chaque puits mettre 9 ul de la solution d’hybridation + 1 ul de la sonde à 50 ng/ul ou
30 ng/ul
Placer la lame dans un tube Falcon (50 mL) avec de l’essuie tout imprégné du reste de la
solution d’hybridation (environ 1 mL, chambre humide)
Hybrider au moins 1 heure 30 à 46°C (éviter over-night car agarose low-melting à
tendance à se décoller)
5. LAVAGE 10 minutes à 48°C dans tampon préchauffé (50 ml pour deux lames)
Composition du tampon de lavage (50 ml) en fonction de la concentration en formamide
dans le tampon d’hybridation : [formamide] 0% 5% 10% 15 % 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50%
NaCl 5M 9 ml 6.30 ml 4.5 ml
3.18 ml 2.15 ml 1.49 ml 1.02 ml 0.70 ml 0.46 ml 0.3 ml 0.18 ml
Tris-HCl
pH8, 1M
1 ml 1 ml 1 ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
EDTA
à 0.5M pH 8 0 0 0 0 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
mQ Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Jusqu’à
50 ml
Tremper rapidement dans mQ à 4°C
Sécher le plus rapidement possible sous air comprimé
6. COLORATION DAPI
Solution stock de DAPI 100 ug/ml dans l’eau à -20°C
Working solution 1 ug/ml
Ajouter 10 ul de DAPI à 1 ug/ml dans chaque puits
Laisser 2 minutes au moins
Laver à l’eau (4°C, tremper) et laisser sécher (ne pas sécher à l’air comprimé pour éviter
de disperser du DAPI) .
7. MONTAGE Ajouter des petites gouttes de citifluor AF1 dans les puits
Couvrir d’une lamelle ESCO ultra propre et attendre que le citifluor difuse dans les puits
(éponger avec le papier)
Les lames avant montage peuvent se garder quelques jours à 4°C, après montage au plus
une nuit à 4°C.
8. OBSERVATION AU MICROSCOPE À ÉPIFLUORESCENCE
287
Kit de Viabilité.
288
289
290
Protocole de culture d’Euglena gracilis
Produits Formules Par litre Di-potassium
hydrogénophosphate
K2HPO4 0,5 g
Magnésium sulfate
MgSO4, 7 H2O 0,5 g
Calcium chlorure CaCl2, 2 H2O 0,265 g
di-amonium
hydrogénophosphate
(NH4)2HPO4 0,5 g
Perchlorure de fer en
solution à 27 % (0,27
g / 1 ml)
FeCl3 1 goutte (20 µL)
Acide lactique
C3H6O3 3 mL
Vitamine B1 (sol à
0,1 g / 100 ml)
Thiamine
1 mL
Vitamine B12 (sol à 2
mg / L)
0,5 mL
Solution X (ZnSO4, 7
H2O : 5 g / L +
MnSO4 : 4 g / L)
20 mL
Préparation milieu :
- Dissoudre les poudres, ajouter l’acide lactique et la solution X.
- Ajuster le pH du milieu à 3.5 avec du KOH
- Autoclaver.
- Ajouter 20 µL de FeCl3 et les vitamines (solutions préalablement filtrées à 0.2 µm).
Le lactate peut être remplacé par 3 mL d’éthanol à 95°C. Dans ce cas, préparer le milieu
sans lactate, ajuster le pH à 3.5 puis autoclaver. On rajoute l’éthanol, à température
ambiante avant de repiquer les cellules.
Ce milieu peut servir à cultiver des euglènes à la lumière (photo-organotrophie).
291
Lexique
292
293
Acidophile. Bactérie dont le pH optimum pour la croissance est acide.
Anaérobie. Se dit d’un métabolisme qui ne requiert pas d’O2 pour fonctionner.
Anoxique. Se dit d’un milieu dépourvu d’O2.
Anoxygénique. Se dit d’une réaction (ou d’un métabolisme) ne produisant pas d’O2.
Autotrophe (vis-à-vis du carbone). Utilisant une source de carbone inorganique (souvent le
CO2).
Chimiolithoautotrophe. Utilisant des réactions d’oxydo-réduction comme source
d’énergie et des sources de carbone et d’électrons inorganiques.
Chimiotrophe. Utilisant des réactions d’oxydo-réduction comme source d’énergie.
Eucaryote. Organisme dont les cellules contiennent un matériel génétique compartimenté
dans un noyau.
Génome. Ensemble du matériel génétique d’un organisme.
Gram-négative. Bactérie dont la paroi ne prend pas la coloration de Gram : la paroi est
composée d’une membrane plasmique, d’un périplasme contenant une couche de
peptidoglycane peu épaisse (réseau de polysaccharides linéaires liés entre eux par des
protéines) et d’une membrane externe.
Gram-positive. Bactérie dont la paroi prend la coloration de Gram : la paroi est composée
d’une membrane plasmique et d’un peptidoglycane épais.
Hétérotrophe (vis-à-vis du carbone). Utilisant une source de carbone organique.
Lithotrophe. Utilisant une source d’électrons inorganique.
Mitochondrie. Organite présent dans la plupart des cellules eucaryotes, issu d’une
endosymbiose primaire, impliqué dans la production de l’énergie cellulaire.
Neutrophile. Bactérie dont le pH optimum pour la croissance se situe aux alentours de la
neutralité.
Opéron. Groupe de gènes dont l’expression est contrôlée par un seul opérateur, i.e. une
région de l’ADN, à laquelle une protéine de répression peut se lier entraînant le blocage de la
synthèse des ARNm.
Organotrophe. Utilisant une source d’électrons organique.
Oxydation. Réaction conduisant à la perte d’un ou plusieurs électrons par une molécule,
parfois accompagnée d’une perte de protons (H+).
Peptidoglycane. Polymère présent dans la paroi bactérienne, composé d’N-
acétylglucosamine, d’acide N-acétylmuramique, et de quelques acides aminés.
Périplasme. Espace situé entre la membrane plasmique et la membrane externe des
bactéries Gram-négatives.
Photosynthèse anoxygénique. Mode de production primaire utilisant la lumière comme
source d’énergie et utilisant un donneur d’électrons autre que H2O (par exemple, Fe2+
), donc
ne conduisant pas à la production d’O2.
Photosynthèse oxygénique. Mode de production primaire (production de matière
organique CH2O), utilisant la lumière (hν) comme source d’énergie, H2O comme source
d’électrons et libérant O2 comme produit de la photolyse de l’eau :
CO2+H20 + hν � CH2O + O2
Phototrophe. Utilisant la lumière comme source d’énergie.
Plaste. Organite, présent dans les cellules eucaryotes photosynthétiques, issu d’une
endosymbiose (primaire, secondaire ou tertiaire). Les chloroplastes en particulier sont
impliqués, entre autres, dans les étapes de conversion de l’énergie lumineuse lors de la
photosynthèse.
Procaryote. Organisme dont les cellules contiennent un matériel génétique qui n’est pas
compartimenté dans un noyau vrai (pas de membrane nucléaire). Ils correspondent d’une
manière générale aux Bactéries et Archées.
Producteur primaire. Organisme autotrophe, produisant de la matière organique.
294
Protéome. Ensemble des protéines produites par un génome, dans des conditions données, à
un instant donné.
Réduction. Gain d’un ou plusieurs électrons par une molécule, parfois accompagné d’un
gain de protons (H+).
295
296
Processus microbiens de biominéralisation
et de détoxification des métaux/métalloïdes. ~
Oxydation du fer par des bactéries anaérobies neutrophiles et résistance au fer et à l’arsenic
chez des eucaryotes unicellulaires de drainages miniers acides.
Résumé. Nous avons exploré les mécanismes permettant à des organismes procaryotes et
eucaryotes de répondre au stress induit par la présence d’éléments toxiques comme l’arsenic
et/ou par la précipitation de phases minérales au niveau des structures cellulaires. Notre étude
a notamment impliqué le développement de techniques de microscopie et de spectroscopie
adaptées à ces objets composites phases minérales - matière organique. Les deux souches
procaryotes étudiées utilisent le Fe(II) comme donneur d’électrons en l’absence stricte d’O2 à
pH neutre, ce qui conduit à la précipitation de phases riches en Fe(III) à distance des cellules
ou au contact direct des structures cellulaires. Chez la souche phototrophe SW2, le fer
précipite exclusivement dans le milieu extracellulaire le long de fibres lipo-
polysaccharidiques. En revanche, chez la souche dénitrifiante BoFeN1, le fer précipite aussi
massivement dans le périplasme des bactéries. Nous montrons que des structures cellulaires
fines (peptidoglycane, périplasme) et des molécules organiques (globules protéiques) sont
préservées dans ces cellules encroûtées qui constituent alors de stades précoces de
microfossiles. D’autre part, l’étude d’eucaryotes unicellulaires présents dans des drainages
miniers acides riches en Fe(II) et en arsenic a révélé une accumulation intracellulaire du fer
par ces eucaryotes, découplée des mécanismes de détoxification de l’arsenic. Ces derniers
procèdent par une étape de réduction de l’As(V) en As(III) suivie de sa complexation par des
groupements thiols, mettant en jeu le cycle du glutathion, et enfin de l’export de l’As(III).
Nous avons en outre montré que l’As(V) est plus toxique que l’As(III) chez ces eucaryotes.
L’ensemble de nos résultats fournit des éclaircissements pour la compréhension des
mécanismes de biominéralisation et de détoxification des métaux/métalloïdes par des
microorganismes et ouvre également la perspective de rechercher des bio-signatures
potentielles de métabolismes spécifiques dans des échantillons naturels actuels ou anciens.
Abstract. This work aimed at studying the response of microorganisms to toxic elements,
such as arsenic and to the lethal effects of mineral precipitation within cellular structures. We
applied microscopic and spectroscopic tools adapted to the study of these organic-mineral
assemblages. In a first section, we studied two different bacterial strains, both using Fe(II) as
an electron donor under strictly anoxic conditions at neutral pH. The phototrophic strain SW2
precipitated iron on lipo-polysaccharidic fibres only at distance from the cells, whereas the
denitrifying strain BoFeN1 precipitated iron within its periplasm. Ultrafine cellular structures
and proteins were preserved within these encrusted cells that can be considered as
microfossils. In a second section, we studied unicellular eukaryotes from a Fe and As-rich
acid mine drainage. Iron accumulation within the cells was shown to be completely decoupled
from the processes of arsenic detoxification. Arsenic detoxification starts with As(V)
reduction to As(III), followed by its complexation by thiol groups, involving the glutathione
pathway and leading to its export from the cell. However, we show that As(V) was more toxic
to the cells than As(III). Our results altogether provide new insights on the mechanisms of
microbial biomineralization and detoxification of metals/metalloids and opens new
perspectives for the search of biosignatures of specific metabolisms.