BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 637

Preliminary Notes

PN 2 I O I 4

Radioactivit~s sp~cifiques compar6es de I'iode des deux cycles des iodothyronines (T4,T~) de la thryo'ide chez le rat

I1 est admis depuis HARINGTON 1 que la biosynth~se de T 4 implique la condensation de deux mol6cules de DIT avec 61imination de la chalne alanine de l 'une d'elles. Le m6canisme de cette r6action hypoth6tique in vivo est encore inconnu. En particulier on ne connalt pas la nature des molecules de DIT (combin6es i.e. faisant partie int6- grante des chalnes peptidiques de thyroglobuline, ou libres, ou les deux) participant ~ la r6action.

La d6termination de la radioactivit6 sp6cifique de l'iode de chacun des cycles de T4 devrait donner des indications sur la participation ~ la condensation de mol6cules ou de r6sidus de D I T de radioactivit6 sp~cifique 6ventuellement diff6rentes et per- mettre d'orienter les recherches sur le mdcanisme de la r6action.

PLASKETT ~ a r6cemment conclu que, ~ des temps relativement courts (1-6 h) apr~s l'injection de 1311 au rat ou au lapin, les atomes radioactifs de T, et de T 3 isol6es de la thyroide ~taient 6galement distribu6s entre les deux cycles.

A la diff6rence de ces r~sultats, ceux d6crits dans cette note montrent que, 5-1o rain apr~s l'injection de 131I au rat, la radioactivit6 sp6cifique de l'iode des deux cycles des hormones thyroidiennes (T4 et Ts) est tr~s diff6rente.

Des lots de 8-1o rats m~les Wistar (poids moyen 280 g) adapt6s ~. un apport quotidien d'iode de 5 et 50 ~g (respectivement groupes 5 et 50) ont 6t6 maintenus en ~quilibre isotopique avec 1~I (ref. 3) ce qui permet selon le principe de cette m6thode d'6valuer directement 1~I par mesure de la radioactivit6 de ~ I . 5-1o min apr~s l'injection d'une dose traceuse de ~3~I (200-600 ~C) les thyro~des sont pr61ev6es, congel6es (--6o°), dialys6es contre NH~OH o.oi M ~ o °, homog6n6is6es et dig6r~es pendant 24 h ~ 37 ° par la Pronase ~. Les iodoth~onines sont purifi6es par filtration de l 'hydrolysat sur Sephadex G-25 (ref. 5) et s6pardes par chromatographie sur papier en tert.-amylol satur6 de NHaOH 2 N. Apr~s autoradiographie on 61ue les bandes correspondant k T4 et T , par le m 6 t h a n o l - N H , O H (99: I). Apr~s 61imination du solvant, les iodothyronines sont dissoutes dans un tampon phosphate o.I M (pH 7.5) et soumises ~ la d6gradation photochimique a6robie en pr6sence de FMN selon la technique d6crite pr6c6demment ~. Des parties aliquotes du milieu d'incubation en pr6sence de FMN sont analys~es ~ des temps variables par chromatographie sur papier en n-butanol-acide ac6t ique-eau (78:5:17). Les mesures de radioactivit6 en ~31I et ~"~I des z6nes de papier contenant I - , DIT, T~ (ou T~) sont faites en spectrom6trie ~ avec une pr6cision de 1%.

A titre d'exemple, la Fig. IA montre la cin6tique de la d~gradation de la thyroxine

Abr6viations: MIT, 3-iodotyrosine; DIT, 3,5-diiodotyrosine; MIT~, DIT1, MIT, DIT libres; MITe, DITe, MIT, DIT combin6es; T~, thyroxine; T~, 3,5,3'-triiodothyronine; DIHPPA, acide 4-hydroxy-3,5-diiodoph6nylpyruvique; MIHPPA, acide 4-hydroxy-3-iodoph6nylpyruvique.

Biochirn. Bioph3,s. Acta, 86 (1964) 637-639

638 P R E L I M I N A R Y NOTES

des rats du groupe 5 exprim~e en ~eTI et la Fig. IB l'6volution de la radioactivit6 sp~cifique de T4 et des produits form6s au cours de sa d6gradation (I-, DIT).

Comme DIT provient du noyau A* des iodothyronines et l'iodure, du noyau B* puis de la d~siodation de la DIT form6e ~ partir du noyau A 6, l 'extrapolation au

t e m p s o de la courbe de radioactivit6 sp6cifique de l'iodure donnera la valeur de la radioactivit6 sp6cifique de l'iode contenu darts le noyau B.

1 0 0 -

8 0 -

6 0 -

~ :

~ 2 0 -

1 0 -

0

g~ ._

: = o ~ 1

. . x . ~ ~, x ~- -~ ~ - ~ " ~ ~

o.: ~ =o e~ ~

O ~ o ~b ~o

remO$ (minutes)

B

-~-- -X-- _ - X - - --X- ~

q O-O<M>O---O O O----

~ ~ ~ ~ ~ •

DIT

• ! 2 0 E~O ' 120

Temps (minutes)

F i g . I . A , c i n 6 t i q u e d e d 6 g r a d a t i o n d e l a t h y r o x i n e d e s r a t s d u g r o u p e 5 e x p r i m g e e n 1~7I; B, 6 v o - l u t i o n d e r a d i o a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d e T , e t d e s p r o d u i t s f o r m 6 s a u c o u r s d e s a d 6 g r a d a t i o n .

T A B L E A U I

RADIOACTIVIT~ SP]~CIFIQUE DES IODOTYROSINES

RAS de l'iode du RAS de Groupe Composd Temps* B]A DIT~ MITI

dtudid (rain) RAS*~" cycle A cycle B DIT e MITe (DIT) (I-) MIT~ DITI MIT e DIT e

T4 IO 0 .82 0 .65 I.O . . . .

T~ 5 O. IO 0 . 0 6 8 O"156 1 0 . 5 0 4 .5 ° 2.9O 1.82 2.3 2.5 - - Ta 5 o .12 o . o 6 8 o . 2 1 6 3 .2 - - 5 .7

5 ° T~ 5 o . o 2 2 O.Ol 5 o . o 3 4 2.3 3 .7 T s 5 ° . o 2 5 o . o i 7 o -o4o 2.31 o .92 o .44 o .25 2.3 - - 9 .2

* T e m p s a p r b s l ' i n j e c t i o n d e 13tI. ** R a d i o a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e ( R A S ) e x p r i m 6 e e n d o s e ~3~I × ~o ~ p a r ~ g ~ I .

Le Tableau I compare, pour les groupes 5 et 50, les radioactivit6s spdcifiques de l'iode des noyaux A et B de T 4 et Ta, 5 et zo min apr~s l'injection de 131I ainsi que les radioactivit6s sp6cifiques des iodotyrosines libres et combin6es.

Les constatations suivantes peuvent 6tre faites: (I) La radioactivit6 sp6cifique de l'iode du cycle 13 de T4 ou T3 est sup6rieure A la radioactivit6 sp6cifique de l'iode du cycle A. (2) La radioactivi% sp6cifique de l'iode du cycle A est identique pour T 4 et Ta. (3) L'iode du cycle 13 de Ta a une radioactivit6 sp6cifique plus grande que l'iode du cycle B de T 4. (4) Les radioactivit6s sp6cifiques des iodotyrosines libres sont plus 61ev6es que celles des iodotyrosines combin6es avec radioactivit6 sp6cifique MIT > radioactivit6 sp6cifique DIT. (5) Les rapports des radioactivit6s sp6cifiques de iode cycle B/iode cycle A de T4 et de DIT~/DITe sont sup6rieurs/~ I ainsi que les rapports

* L e n o y a u A p o r t e l a c h a i n e a l a n i n e , le n o y a u B la f o n c t i o n p h 6 n o l .

Bioch im . B i o p h y s . Ac la , 86 (1964) 6 3 7 - 6 3 9

PRELIMINARY NOTES 639

radioactivit6s sp6cifiques iode cycle B/radioactivit6s sp6cifiques iode cycle A de Ts et MIT1/DITc.

A un temps court apr~s l'injection de ~zI au rat, l'iode port6 par les 2 cycles des iodothyronines thyroidiennes est donc h6t6rog~ne vis ~t vis du renouvellement.

Les r6sultats obtenus d6montrent que T a ne provient pas de la d6siodation de T~. Ils sont compatibles avec un m6canisme de biosynth~se des iodothyronines pouvant impliquer soit la condensation directe de r6sidus d'iodotyrosines combin6es compte tenu de l'h6t~rog6n6it6 structurale et fonctionnelle de thyroglobuline v soit la conden- sation du DIHPPA (ou du MIHPPA) avec les r6sidus de DIT de thyroglobuline comme il a 6t~ sugg~r6 r~cemment ~-~°.

Laboratoire de Biochimie Mddicale, Facultd de Mddecine, SERGE LlSSlTZKY Marseille, et CLAUDE SIMON

Ddpartement de Biologie, Centre d'Etudes Nucldaires, CLAUDE BENABDELJLIL

Saclay, Seine et Oise (France)

1 C. R. HARINGTON, Biochem. J., 20 (1926) 300. ~ L. G. PLASKETT, Biochem. J., 78 (1961) 649 et 657. a C. SIMON, Biochim. Biophys. Acta, 74 (1963) 565 . ~ J . l ~'. B. HANEY ET S. LlSSI~ZK¥, Gen. Cutup. Endocrinol., 3 (1963) 139. ~ S. LlSSlTZKY, J. BIS~tUT~ ~ r M. ROLLAND, Glin. Chim. Acta, 7 (1962) 183. s M. T. BENEVENT, M. I~OQUES, J. TORRESANI ET S. LISSITZKY, Bull. Soc. Chim. Biol., 45 (1963) 969. 7 S. BOUCHILLOUX, M. ROLLAND, J. TORRESANI, M. ROQUES tgT S. LISSITZKY, Biochim. Biophys.

~ cta, sous presse. 8 T. SHIBA ET H. J. CAHNMANN, Biochim. Biophys. Acta, 58 (1962) 6o9. ~ J. F. 13. HANE¥ t~T S. LlSSlTZKY, Bio~him. Biophys. Acta, 63 (1962) 557.

i0 K. ToI, G. SALVATORE ET H. J. CAHNMANN, Biochim. Biophys. Acta, 78 (1963) 805.

Re~u le I I Mars, 1964 Biochim. Biophys. Acta, 86 (1964) 637-639

PN 21013 The role of the granulosa cell in the biosynthesis

of ovarian steroid hormones

Granulosa cells were isolated from the ovaries of young pigs before sexual matu- ration z. About 5 ° mg of pure cells were incubated with various labelled steroids (13-2oo m~moles) in 5 ml of isotonic Krebs-Ringer-NaHCOa buffer with glucose (pH 7-3) for 3-4 h in a gas phase composed of 93.5 % O2 and 6.5 % CO2.

The steroids were extracted with dichloromethane. Additional extraction with hot alcohol-acetone did not improve the efficiency of the extraction. After extraction, the steroids were isolated by paper chromatography in conventional Bush type systems 2 and by reversed phase chromatography on acetylated filter paper a. The oestrogens were finally separated on thin-layer chromatograms, extracted with NaOH and methylated. Oestrone 3-methyl ether and oestradiol-I7~ 3-methyl ether were isolated after thin-layer chromatography in the system ethyl acetate, 35 parts by vol.; cyclohexane, 65 parts. Testosterone was finally acetylated in pyridine-acetic anhydride and chromatographed on paper. The radioactivity was determined in a window-less gas-flow counter at infinite thinness.

AS-Pregnene-3fl-ol-2o-one was converted to progesterone in about IO % yield and to 2o~-hydroxyprogesterone in about 2 % yield without the addition of co-factors.

Biochim. Biophys. Acta, 86 (1964) 639-640