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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 637 Preliminary Notes PN 2IOI 4 Radioactivit~s sp~cifiques compar6es de I'iode des deux cycles des iodothyronines (T4,T~) de la thryo'ide chez le rat I1 est admis depuis HARINGTON 1 que la biosynth~se de T 4 implique la condensation de deux mol6cules de DIT avec 61imination de la chalne alanine de l'une d'elles. Le m6canisme de cette r6action hypoth6tique in vivo est encore inconnu. En particulier on ne connalt pas la nature des molecules de DIT (combin6es i.e. faisant partie int6- grante des chalnes peptidiques de thyroglobuline, ou libres, ou les deux) participant ~ la r6action. La d6termination de la radioactivit6 sp6cifique de l'iode de chacun des cycles de T4 devrait donner des indications sur la participation ~ la condensation de mol6cules ou de r6sidus de DIT de radioactivit6 sp~cifique 6ventuellement diff6rentes et per- mettre d'orienter les recherches sur le mdcanisme de la r6action. PLASKETT ~ a r6cemment conclu que, ~ des temps relativement courts (1-6 h) apr~s l'injection de 1311 au rat ou au lapin, les atomes radioactifs de T, et de T 3 isol6es de la thyroide ~taient 6galement distribu6s entre les deux cycles. A la diff6rence de ces r~sultats, ceux d6crits dans cette note montrent que, 5-1o rain apr~s l'injection de 131I au rat, la radioactivit6 sp6cifique de l'iode des deux cycles des hormones thyroidiennes (T4 et Ts) est tr~s diff6rente. Des lots de 8-1o rats m~les Wistar (poids moyen 280 g) adapt6s ~. un apport quotidien d'iode de 5 et 50 ~g (respectivement groupes 5 et 50) ont 6t6 maintenus en ~quilibre isotopique avec 1~I (ref. 3) ce qui permet selon le principe de cette m6thode d'6valuer directement 1~I par mesure de la radioactivit6 de ~I. 5-1o min apr~s l'injection d'une dose traceuse de ~3~I (200-600 ~C) les thyro~des sont pr61ev6es, congel6es (--6o°), dialys6es contre NH~OH o.oi M ~ o °, homog6n6is6es et dig6r~es pendant 24 h ~ 37 ° par la Pronase ~. Les iodoth~onines sont purifi6es par filtration de l'hydrolysat sur Sephadex G-25 (ref. 5) et s6pardes par chromatographie sur papier en tert.-amylol satur6 de NHaOH 2 N. Apr~s autoradiographie on 61ue les bandes correspondant k T4 et T, par le m6thanol-NH,OH (99: I). Apr~s 61imination du solvant, les iodothyronines sont dissoutes dans un tampon phosphate o.I M (pH 7.5) et soumises ~ la d6gradation photochimique a6robie en pr6sence de FMN selon la technique d6crite pr6c6demment ~. Des parties aliquotes du milieu d'incubation en pr6sence de FMN sont analys~es ~ des temps variables par chromatographie sur papier en n-butanol-acide ac6tique-eau (78:5:17). Les mesures de radioactivit6 en ~31I et ~"~I des z6nes de papier contenant I-, DIT, T~ (ou T~) sont faites en spectrom6trie ~ avec une pr6cision de 1%. A titre d'exemple, la Fig. IA montre la cin6tique de la d~gradation de la thyroxine Abr6viations: MIT, 3-iodotyrosine; DIT, 3,5-diiodotyrosine; MIT~, DIT1, MIT, DIT libres; MITe, DITe, MIT, DIT combin6es; T~, thyroxine; T~, 3,5,3'-triiodothyronine; DIHPPA, acide 4-hydroxy-3,5-diiodoph6nylpyruvique; MIHPPA, acide 4-hydroxy-3-iodoph6nylpyruvique. Biochirn. Bioph3,s. Acta, 86 (1964) 637-639

Radioactivés spécifiques comparées de l'iode des deux cycles des iodothyronines (T4,T3) de la thryoïde chez le rat

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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 637

Preliminary Notes

PN 2 I O I 4

Radioactivit~s sp~cifiques compar6es de I'iode des deux cycles des iodothyronines (T4,T~) de la thryo'ide chez le rat

I1 est admis depuis HARINGTON 1 que la biosynth~se de T 4 implique la condensation de deux mol6cules de DIT avec 61imination de la chalne alanine de l 'une d'elles. Le m6canisme de cette r6action hypoth6tique in vivo est encore inconnu. En particulier on ne connalt pas la nature des molecules de DIT (combin6es i.e. faisant partie int6- grante des chalnes peptidiques de thyroglobuline, ou libres, ou les deux) participant ~ la r6action.

La d6termination de la radioactivit6 sp6cifique de l'iode de chacun des cycles de T4 devrait donner des indications sur la participation ~ la condensation de mol6cules ou de r6sidus de D I T de radioactivit6 sp~cifique 6ventuellement diff6rentes et per- mettre d'orienter les recherches sur le mdcanisme de la r6action.

PLASKETT ~ a r6cemment conclu que, ~ des temps relativement courts (1-6 h) apr~s l'injection de 1311 au rat ou au lapin, les atomes radioactifs de T, et de T 3 isol6es de la thyroide ~taient 6galement distribu6s entre les deux cycles.

A la diff6rence de ces r~sultats, ceux d6crits dans cette note montrent que, 5-1o rain apr~s l'injection de 131I au rat, la radioactivit6 sp6cifique de l'iode des deux cycles des hormones thyroidiennes (T4 et Ts) est tr~s diff6rente.

Des lots de 8-1o rats m~les Wistar (poids moyen 280 g) adapt6s ~. un apport quotidien d'iode de 5 et 50 ~g (respectivement groupes 5 et 50) ont 6t6 maintenus en ~quilibre isotopique avec 1~I (ref. 3) ce qui permet selon le principe de cette m6thode d'6valuer directement 1~I par mesure de la radioactivit6 de ~ I . 5-1o min apr~s l'injection d'une dose traceuse de ~3~I (200-600 ~C) les thyro~des sont pr61ev6es, congel6es (--6o°), dialys6es contre NH~OH o.oi M ~ o °, homog6n6is6es et dig6r~es pendant 24 h ~ 37 ° par la Pronase ~. Les iodoth~onines sont purifi6es par filtration de l 'hydrolysat sur Sephadex G-25 (ref. 5) et s6pardes par chromatographie sur papier en tert.-amylol satur6 de NHaOH 2 N. Apr~s autoradiographie on 61ue les bandes correspondant k T4 et T , par le m 6 t h a n o l - N H , O H (99: I). Apr~s 61imination du solvant, les iodothyronines sont dissoutes dans un tampon phosphate o.I M (pH 7.5) et soumises ~ la d6gradation photochimique a6robie en pr6sence de FMN selon la technique d6crite pr6c6demment ~. Des parties aliquotes du milieu d'incubation en pr6sence de FMN sont analys~es ~ des temps variables par chromatographie sur papier en n-butanol-acide ac6t ique-eau (78:5:17). Les mesures de radioactivit6 en ~31I et ~"~I des z6nes de papier contenant I - , DIT, T~ (ou T~) sont faites en spectrom6trie ~ avec une pr6cision de 1%.

A titre d'exemple, la Fig. IA montre la cin6tique de la d~gradation de la thyroxine

Abr6viations: MIT, 3-iodotyrosine; DIT, 3,5-diiodotyrosine; MIT~, DIT1, MIT, DIT libres; MITe, DITe, MIT, DIT combin6es; T~, thyroxine; T~, 3,5,3'-triiodothyronine; DIHPPA, acide 4-hydroxy-3,5-diiodoph6nylpyruvique; MIHPPA, acide 4-hydroxy-3-iodoph6nylpyruvique.

Biochirn. Bioph3,s. Acta, 86 (1964) 637-639

638 P R E L I M I N A R Y NOTES

des rats du groupe 5 exprim~e en ~eTI et la Fig. IB l'6volution de la radioactivit6 sp~cifique de T4 et des produits form6s au cours de sa d6gradation (I-, DIT).

Comme DIT provient du noyau A* des iodothyronines et l'iodure, du noyau B* puis de la d~siodation de la DIT form6e ~ partir du noyau A 6, l 'extrapolation au

t e m p s o de la courbe de radioactivit6 sp6cifique de l'iodure donnera la valeur de la radioactivit6 sp6cifique de l'iode contenu darts le noyau B.

1 0 0 -

8 0 -

6 0 -

~ :

~ 2 0 -

1 0 -

0

g~ ._

: = o ~ 1

. . x . ~ ~, x ~- -~ ~ - ~ " ~ ~

o.: ~ =o e~ ~

O ~ o ~b ~o

remO$ (minutes)

B

-~-- -X-- _ - X - - --X- ~

q O-O<M>O---O O O----

~ ~ ~ ~ ~ •

DIT

• ! 2 0 E~O ' 120

Temps (minutes)

F i g . I . A , c i n 6 t i q u e d e d 6 g r a d a t i o n d e l a t h y r o x i n e d e s r a t s d u g r o u p e 5 e x p r i m g e e n 1~7I; B, 6 v o - l u t i o n d e r a d i o a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d e T , e t d e s p r o d u i t s f o r m 6 s a u c o u r s d e s a d 6 g r a d a t i o n .

T A B L E A U I

RADIOACTIVIT~ SP]~CIFIQUE DES IODOTYROSINES

RAS de l'iode du RAS de Groupe Composd Temps* B]A DIT~ MITI

dtudid (rain) RAS*~" cycle A cycle B DIT e MITe (DIT) (I-) MIT~ DITI MIT e DIT e

T4 IO 0 .82 0 .65 I.O . . . .

T~ 5 O. IO 0 . 0 6 8 O"156 1 0 . 5 0 4 .5 ° 2.9O 1.82 2.3 2.5 - - Ta 5 o .12 o . o 6 8 o . 2 1 6 3 .2 - - 5 .7

5 ° T~ 5 o . o 2 2 O.Ol 5 o . o 3 4 2.3 3 .7 T s 5 ° . o 2 5 o . o i 7 o -o4o 2.31 o .92 o .44 o .25 2.3 - - 9 .2

* T e m p s a p r b s l ' i n j e c t i o n d e 13tI. ** R a d i o a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e ( R A S ) e x p r i m 6 e e n d o s e ~3~I × ~o ~ p a r ~ g ~ I .

Le Tableau I compare, pour les groupes 5 et 50, les radioactivit6s spdcifiques de l'iode des noyaux A et B de T 4 et Ta, 5 et zo min apr~s l'injection de 131I ainsi que les radioactivit6s sp6cifiques des iodotyrosines libres et combin6es.

Les constatations suivantes peuvent 6tre faites: (I) La radioactivit6 sp6cifique de l'iode du cycle 13 de T4 ou T3 est sup6rieure A la radioactivit6 sp6cifique de l'iode du cycle A. (2) La radioactivi% sp6cifique de l'iode du cycle A est identique pour T 4 et Ta. (3) L'iode du cycle 13 de Ta a une radioactivit6 sp6cifique plus grande que l'iode du cycle B de T 4. (4) Les radioactivit6s sp6cifiques des iodotyrosines libres sont plus 61ev6es que celles des iodotyrosines combin6es avec radioactivit6 sp6cifique MIT > radioactivit6 sp6cifique DIT. (5) Les rapports des radioactivit6s sp6cifiques de iode cycle B/iode cycle A de T4 et de DIT~/DITe sont sup6rieurs/~ I ainsi que les rapports

* L e n o y a u A p o r t e l a c h a i n e a l a n i n e , le n o y a u B la f o n c t i o n p h 6 n o l .

Bioch im . B i o p h y s . Ac la , 86 (1964) 6 3 7 - 6 3 9

PRELIMINARY NOTES 639

radioactivit6s sp6cifiques iode cycle B/radioactivit6s sp6cifiques iode cycle A de Ts et MIT1/DITc.

A un temps court apr~s l'injection de ~zI au rat, l'iode port6 par les 2 cycles des iodothyronines thyroidiennes est donc h6t6rog~ne vis ~t vis du renouvellement.

Les r6sultats obtenus d6montrent que T a ne provient pas de la d6siodation de T~. Ils sont compatibles avec un m6canisme de biosynth~se des iodothyronines pouvant impliquer soit la condensation directe de r6sidus d'iodotyrosines combin6es compte tenu de l'h6t~rog6n6it6 structurale et fonctionnelle de thyroglobuline v soit la conden- sation du DIHPPA (ou du MIHPPA) avec les r6sidus de DIT de thyroglobuline comme il a 6t~ sugg~r6 r~cemment ~-~°.

Laboratoire de Biochimie Mddicale, Facultd de Mddecine, SERGE LlSSlTZKY Marseille, et CLAUDE SIMON

Ddpartement de Biologie, Centre d'Etudes Nucldaires, CLAUDE BENABDELJLIL

Saclay, Seine et Oise (France)

1 C. R. HARINGTON, Biochem. J., 20 (1926) 300. ~ L. G. PLASKETT, Biochem. J., 78 (1961) 649 et 657. a C. SIMON, Biochim. Biophys. Acta, 74 (1963) 565 . ~ J . l ~'. B. HANEY ET S. LlSSI~ZK¥, Gen. Cutup. Endocrinol., 3 (1963) 139. ~ S. LlSSlTZKY, J. BIS~tUT~ ~ r M. ROLLAND, Glin. Chim. Acta, 7 (1962) 183. s M. T. BENEVENT, M. I~OQUES, J. TORRESANI ET S. LISSITZKY, Bull. Soc. Chim. Biol., 45 (1963) 969. 7 S. BOUCHILLOUX, M. ROLLAND, J. TORRESANI, M. ROQUES tgT S. LISSITZKY, Biochim. Biophys.

~ cta, sous presse. 8 T. SHIBA ET H. J. CAHNMANN, Biochim. Biophys. Acta, 58 (1962) 6o9. ~ J. F. 13. HANE¥ t~T S. LlSSlTZKY, Bio~him. Biophys. Acta, 63 (1962) 557.

i0 K. ToI, G. SALVATORE ET H. J. CAHNMANN, Biochim. Biophys. Acta, 78 (1963) 805.

Re~u le I I Mars, 1964 Biochim. Biophys. Acta, 86 (1964) 637-639

PN 21013 The role of the granulosa cell in the biosynthesis

of ovarian steroid hormones

Granulosa cells were isolated from the ovaries of young pigs before sexual matu- ration z. About 5 ° mg of pure cells were incubated with various labelled steroids (13-2oo m~moles) in 5 ml of isotonic Krebs-Ringer-NaHCOa buffer with glucose (pH 7-3) for 3-4 h in a gas phase composed of 93.5 % O2 and 6.5 % CO2.

The steroids were extracted with dichloromethane. Additional extraction with hot alcohol-acetone did not improve the efficiency of the extraction. After extraction, the steroids were isolated by paper chromatography in conventional Bush type systems 2 and by reversed phase chromatography on acetylated filter paper a. The oestrogens were finally separated on thin-layer chromatograms, extracted with NaOH and methylated. Oestrone 3-methyl ether and oestradiol-I7~ 3-methyl ether were isolated after thin-layer chromatography in the system ethyl acetate, 35 parts by vol.; cyclohexane, 65 parts. Testosterone was finally acetylated in pyridine-acetic anhydride and chromatographed on paper. The radioactivity was determined in a window-less gas-flow counter at infinite thinness.

AS-Pregnene-3fl-ol-2o-one was converted to progesterone in about IO % yield and to 2o~-hydroxyprogesterone in about 2 % yield without the addition of co-factors.

Biochim. Biophys. Acta, 86 (1964) 639-640