Dépollution d’effluents gazeux halogénés par des micro-organismes déshydratés en réacteur solide/gaz:
Etude de la stabilité du biocatalyseur
Pierre Marchand
Sous la direction du Pr. M-D Legoy et du Dr. I. Goubet
Agence De l’Environnement et de la Maîtrise de l’Energie
Région Poitou-Charentes
Introduction
Problématique
Résultats
Conclusions
Perspectives
Introduction
Les Composés Organiques Volatils (COV)
Traitements et intérêt de la catalyse solide/gaz
Définition et caractéristiques
Réglementation Sources
Les COV
Définition et caractéristiques
Introduction
Composés de carbone et d’hydrogène
Hydrogène peut être substitué par un atome d’oxygène, d’azote, de soufre, d’halogène (chlore, brome ou fluor)
Ces composés ont une pression de vapeur > 0,01kPa à 293°K
Les COV
Effets sur la santé et l’environnement
Introduction
Effets sur la santé : • Irritations, troubles cardiaques, digestifs, rénaux, du système nerveux
• Certains sont Cancérigènes, Mutagènes, Reprotoxiques (CMR)
• Tous les COV halogénés : phrase de risque R40 (possibles effets
irréversibles pour la santé)
Effets sur l’environnement :
• Impliqués dans l’augmentation de l’effet de serre (O3 dans la troposphère)
• Toxiques pour les végétaux et l’environnement aquatique
Introduction
Les COV
Textes Européens et Internationaux
1050Plafond imposé pour la France en 2010
Émissions annuelles de COV (kt/an)
1972 - Conférence de Stockholm
1979 - Conférence de Genève
1992 - Conférence de Rio
Fixer des objectifs de limitation des rejets : Directive 2001/81/CE
Procédés industriels
Procédés industriels
Sources COV utilisés
Dégraissage Perchloroéthylène (PCE) Dichlorométhane (DCM) Tétrachloroéthylène (TCE)
Nettoyage de textiles PCE
Diluants de colles DCM/TCE
Solvants de peinture Chlorobenzène
Chimie/ pharmacie mono/multihalogénés
Chlorés/bromés
Plusieurs halogènes
Aliphatiques
Chlorés
Introduction
Les sources de COV halogénés
Les COV
Introduction
Les Composés Organiques Volatils (COV)
Traitements et intérêt de la catalyse solide/gaz
Définition et caractéristiques
Réglementation Sources
Du type de COV et ses caractéristiques physicochimiques
Du débit et concentration de l’effluent
De l’humidité relative de l’air
De la présence d’autres molécules et/ou de poussières
…dépend :
Introduction
Les Traitements
Le choix de la méthode…
Traitements COVTraitements COV
DestructionDestruction RécupérationRécupération
Introduction
Les Traitements
Les grandes familles
• Convertir en CO2/H2O • Séparer le COV de l’effluent• Concentrer• Recycler
100
100
1 000 10 000 100 000
0,1
1
10
Adsorption
Oxydation thermique
et catalytique
Débit Nm3.h-1
Con
cen
trat
ion
g.N
m-3
10
Introduction
Les Traitements
Traitement des COV halogénés (industrie)
100
100
1 000 10 000 100 000
0,1
1
10
Adsorption
Oxydation thermique
et catalytique
Débit Nm3.h-1
Con
cen
trat
ion
g.N
m-3
10
Introduction
Relativement onéreux (régénérer l’adsorbat)
Rentable si récupération et réutilisation du solvant
Hydrolyse des COV halogénés
Les Traitements
Traitement des COV halogénés (industrie)
100
100
1 000 10 000 100 000
0,1
1
10
Oxydation thermique
et catalytique
Débit Nm3.h-1
Con
cen
trat
ion
g.N
m-3
10
Introduction
Les Traitements
Besoin de procédés complémentaires
pour éliminer l’halogène
Traitement des COV halogénés (industrie)
Alcool Alcool GazeuxGazeux
Biocatalyseur (Cellules entières déshydratées)Biocatalyseur (Cellules entières déshydratées)SolideSolide
COV halogénéCOV halogéné GazeuxGazeux
Introduction
La catalyse solide/gaz
Nouvelle génération de biofiltre (solide/gaz)
Polluant dégradé directement sous forme gazeuse
Procédé continu
Pas de problème de toxicité (à prouver)
PRESSION
TEMPERATURE
CPG
Introduction
La catalyse solide/gaz
Le réacteur solide/gaz
Formation du gaz pollué Dégradation du gaz pollué Analyse
COV EAU
(Lamare & Legoy 1993)
Activité thermodynamique correspond à la disponibilité d’une molécule pour le catalyseur
ax=Ppx
Psatx
… pour l’eau aw
Introduction
Problématique
Résultats
Conclusions
Perspectives
Problématique
Stratégie
Réaction modèle (substrat/bactérie)
Conditions (préparation/réaction)
Travaux antérieurs
Objectifs
Problématique
Travaux antérieurs
Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005)
Rhodococcus erythropolis NCIMB 13064 (DhaA)
Xanthobacter autotrophicus GJ10 (DhlA)
Escherichia coli recombinant (DhaA ou DhlA)
+ H2O R-OH + H-X
Cellules déshydratées
( )halidohydrolase
R-X
Déhalogénases et souches étudiées
Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005)
Travaux antérieurs
Bactéries déshydratées actives en réacteur solide/gaz
« Screening » sur de nombreux substrats (mono et multichlorés, bromés)
Etude de l’effet de différents paramètres physicochimiques (Température/activité thermodynamique de l’eau (aw)/pH)
Problématique
Problème : biocatalyseur instable
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120
Act
ivit
é ré
lati
ve (
%)
0
20
40
60
80
100
120
Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005)
Travaux antérieurs
Problématique
Problème : biocatalyseur instable
Expliquée par l’effet de l’hydrohalogène
Problématique
Stratégie
Réaction modèle (substrat/bactérie)
Conditions (préparation/réaction)
Travaux antérieurs
Objectifs
Objectifs
Travaux antérieurs
Problématique
Déterminer et quantifier les phénomènes responsables de la perte de vitesse catalytique
Améliorer la stabilité (plusieurs semaines)
Proposer un procédé respectueux de l’environnement
Problématique
Stratégie
Réaction modèle (substrat/bactérie)
Conditions (préparation/réaction)
Travaux antérieurs
Objectifs
Cl + H2O OH + HCl
E. coli BL21 DE3 DhaA
1-chlorobutane 1-butanol
La réaction modèle
Stratégie
Problématique
Cl + H2O OH + HCl
E. coli BL21 DE3 DhaA
1-chlorobutane 1-butanol
La réaction modèle
Facile à cultiver (milieu riche)
ProductionInductible par l’IPTG
Bien décrite
Stratégie
Problématique
Cl + H2O OH + HCl
E. coli BL21 DE3 DhaA
1-chlorobutane 1-butanol
La réaction modèle
Stratégie
Problématique
Substrat référence
Stratégie
Problématique
Culture
LavagesSolution mère (SM)
Conditions (préparation/réaction)
Tampon Borate (pH 9,0)
Cellules entières
Dilution
Tampon Borate (pH 9,0)
Conditions (préparation/réaction)
Stratégie
Problématique
Culture
LavagesSolution mère (SM)
Cellules entières
Dilution
Lyophilisation
Tampon Borate (pH 9,0)40°Caw 0,7
+ 1-chlorobutane
Congélation
Tampon Borate (pH 9,0)
Introduction
Problématique
Résultats
Conclusions
Perspectives
Résultats
Paramètres responsables de la perte d’activité
Etude du lyophilisat
Effets des sels du tampon borate
Résultats (I)
Hypothèses
Paramètres responsables de la perte d’activité
Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol
Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme
Dénaturations liées au couple Température/aw
Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH)
Inhibition par les substrat et produit organiques
Cl + H2O OH + HCl
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Inhibition par les substrat et produit organiques
Cl + H2O OH + HCl
Après 48 heures de réaction Eau
(hydrophile) Décane
(hydrophobe)
Analyse CPG
Pas d’accumulation sur le lyophilisat
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol
Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme
Dénaturations liées au couple Température/aw
Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH)
Hypothèses
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Viabilité durant la préparation du biocatalyseurV
iabi
lité
en
%
0
20
40
60
80
100
120
140
Après récolte
Après lavages
Congelée
s (-20°C)
Lyophilisées
Viabilité en fonction du traitement
Mortalité > 90%
Pas de lien entre viabilité et activité
« réservoirs à enzymes »
protéases
0% bactéries revivifiables
Bactéries toujours actives
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Viabilité durant la réaction
Effet de l’ajout d’antiprotéases
Pas d’activité protéolytique significative
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Act
ivit
é re
lati
ve e
n %
0
20
40
60
80
100
120
140
(-) antiprotéases
(+) antiprotéases
Cellules entières Cellules soniquées Extraits cellulaires0
20
40
60
80
100
120
140
Activité après 2 heures en phase aqueuse + ou - antiprotéases
40°C; pH 9,0
Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme
Dénaturations liées au couple Température/aw
Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH)
Hypothèses
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol
Effet du couple température/aw
40°Caw 0,7
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Mesure de l’activité résiduelle
40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane
0 heure
20 heures
50 heures
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
02
4 6 8 10 12 14 16
Temps en minutes
n(H
Cl)
en
µm
ol50 heures
t0
20 heures
Effet du couple température/aw
Dénaturations irréversibles dues au couple Température/aw
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Conditions : 40°C et aw 0,7
Temps d’incubation (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat
Dénaturations liées au couple Température/aw
Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH)
Hypothèses
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol
Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme
Devenir du HCl
Cl
+
HH22OO
OH
HCl ?
+
Lyophilisat de E. coli DhaA
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
[Cl- libre]
Devenir du HCl
La totalité du HCl est retenue sur le biocatalyseur
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Dosage du HCl sur le lyophilisat durant la réaction
Temps d’incubation (h)
0 10 20 30 40 50 60
[HC
l] e
n µ
mol
/g
0
500
1000
1500
2000
2500
Quantité totale d’HCl produit
Quantité mesurée sur le lyophilisat
Calculée par intégration du 1-butanol
Devenir du HCl
Cl
+
HH22OO
Gazeux
OH
Gazeux
HCl sorbé
pH
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Effet du HCl
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Mesure de l’activité résiduelle
40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane
0 heure
20 heures
50 heures
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
02
4 6 8 10 12 14 16
Temps en minutes
n(H
Cl)
en
µm
ol50 heures
t0
20 heures
40°Caw 0,7
Effet du HCl
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Mesure de l’activité résiduelle
40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane
0 heure
20 heures
50 heures
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
02
4 6 8 10 12 14 16
Temps en minutes
n(H
Cl)
en
µm
ol50 heures
t0
20 heures
40°Caw 0,7
+ 1-chlorobutane
40°Caw 0,7
Effet du HCl
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Mesure de l’activité résiduelle
40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane
0 heure
20 heures
50 heures
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
02
4 6 8 10 12 14 16
Temps en minutes
n(H
Cl)
en
µm
ol50 heures
t0
20 heures
+ 1-chlorobutane
Effet du HCl (séparation)
(i) (ii) (iii)
(iv)
(v)(vi)
Mesure d’activité résiduelle
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Effet du HCl
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
40°C/aw 0,7 avec 1-chlorobutane
Temps d’incubation (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat
Effet du HCl
40°C/aw 0,7
40°C/aw 0,7 avec 1-chlorobutane
Inactivation par le HCl : réversible ?
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Temps d’incubation (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
20
40
60
80
100
120
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat
Effet du HCl
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
(a) Activité résiduelle (b) Activité en phase gaz
Conclusion (Résultats I)
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol
Lien entre viabilité et activité des bactéries
Dénaturations thermiques à 40°C/aw 0,7
Inactivation par accumulation du HCl
55%
45%
Aucun
Aucun
Irréversible
Réversible
EffetHypothèses Quantification
Pourquoi conserve-t-on une partie de l’activité?
Enzymes dénaturées Enzymes protégées
Hypothèse : 2 environnements pour les DhaA
Paramètres responsables de la perte d’activité
Résultats (I)
40°C et aw 0,7
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
Résultats
Paramètres responsables de la perte d’activité
Etude du lyophilisat
Effets des sels de tampon borate
Observation au MEB
Etude du lyophilisat
Résultats (II)
Photo MEB : bactéries après lyophilisation
La structure des bactéries semble conservée après lyophilisation
Observation au MEB
Etude du lyophilisat
Résultats (II)
Tampon borate après lyophilisation X 1500
Sels du tampon borate = Support des bactéries
Bactéries + tampon après lyophilisation X 1500
Y a-t-il des échanges au travers des enveloppes bactériennes ?
50 % du lyophilisat est composé de sels
Localisation de l’activité déhalogénase
Etude du lyophilisat
Une partie des enzymes n’est pas fortement maintenue à l’intérieur des bactéries
Résultats (II)
Act
ivit
é sp
écif
iqu
e (%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
Cellules après récolte
Cellules congelées (-20°C)
Cellules lyophilisées
CulotSurnageant
Mesure de l’activité en milieu aqueux après différents traitements
Résultats (II)
Réhydratation durant la réaction
Etude du lyophilisat
Echanges probables au travers de l’enveloppe bactérienne
Réhydratation du lyophilisat durant la réaction (40°C/aw 0,7)
Après 4h de catalyseAvant catalyse
Après 100h de catalyseAprès 16h de catalyse
Etude du lyophilisat
Conclusion
Matrice cellulaire
Sels de tampon borate
Quel environnement favorise la stabilité à 40°C et aw 0,7 ?
Deux environnements sont possibles pour les DhaA
Résultats (II)
Etude du lyophilisat
Effet « thermostabilisateur » des sels
Quel environnement favorise la stabilité à 40°C et aw 0,7 ?
Résultats (II)
En solution aqueuse ou en milieu non-conventionnel (disponibilité en eau restreinte)
Anderson & Hahn-Hagerdal 1987 Combes et al., 1989 et 2003Triantafillou et al., 1997Lindsay et al., 2004Yu et al., 2005
En réacteur solide/gaz Sels de tampon phosphate (ADH de Thermoanaerobacter)
Trivedi et al., 2006
Etude du lyophilisat
Première approche
Lavages
Cellules entières
Solution mère (SM)
Dilution
Culture
Résultats (II)
Cellules soniquées
Dilution
Traitement aux ultrasons
Observation du lyophilisat de cellules soniquées(a) X3000 (b) X800
Augmentation de la proportion d’enzymes directement en contact avec les sels de tampon borate
Résultats (II)
Etude du lyophilisat
75% de lyse après sonication
Cellules soniquées
Effet de la sonication et de la quantité de sels
Résultats (II)
Etude du lyophilisat
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120
Act
ivit
é en
UI/
g de
bac
téri
es
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules entières Cellules soniquées
50% de sels de tampon 70% de sels de tampon
Effet de la sonication et de la quantité de sels
La sonication et l’augmentation de sels semblent stabiliser l’activité
Résultats (II)
Etude du lyophilisat
40°C/aw 0,7
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120A
ctiv
ité
en U
I/g
de b
acté
ries
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules entièresCellules soniquées
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120
Act
ivit
é en
UI/
g de
bac
téri
es
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules entières Cellules soniquées
50% de sels de tampon 70% de sels de tampon
Effet de la sonication et de la quantité de sels
Résultats (II)
Etude du lyophilisat
40°C/aw 0,7
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120A
ctiv
ité
en U
I/g
de b
acté
ries
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules soniquées
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120
Act
ivit
é en
UI/
g de
bac
téri
es
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules entières
50% de sels de tampon 70% de sels de tampon
?
Effet de la sonication et de la quantité de sels
Réelle amélioration de la stabilité liée à l’augmentation de la proportion de DhaA au contact des sels de tampon borate
Résultats (II)
Etude du lyophilisat
40°C/aw 0,7
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120A
ctiv
ité
en U
I/g
de b
acté
ries
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules soniquées
Temps (h)
0 20 40 60 80 100 120
Act
ivit
é en
UI/
g de
bac
téri
es
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Cellules entières
50% de sels de tampon 70% de sels de tampon
La totalité recondense
= =
Résultats
Paramètres responsables de la perte d’activité
Etude du lyophilisat
Effet des sels de tampon borate
Effets des sels
Vis-à-vis des dénaturations thermiques
Vis-à-vis du HCl
Effet de la proportion de sels
Résultats (III)
Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Lyophilisat d’extraits cellulaires
Lavages
Cellules entières
Solution mère (SM)
Dilution
Extrait cellulaire
17000 g30 minutes4°C
Surnageant
Cellules soniquées
Culture
Dilution
Résultats (III)
Traitement aux ultrasons
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Lyophilisat d’extraits cellulaires
Extrait cellulaire
Résultats (III)
DhaA directement au contact des sels de tampon borate
Elimination des enveloppes bactériennes et des cellules entières
Effets des sels
Vis-à-vis des dénaturations thermiques
Vis-à-vis du HCl
Effet de la proportion de sels
Résultats (III)
Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Stabilité thermique (cellules/extraits)
Résultats (III)
aw 0,7
Activité résiduelle après 150 heures à 40°C
Cellules entières Extraits cellulaires
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
Réhydratation ?
Aucune perte d’activité
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Résultats (III)
Isotherme de sorption (cellules/extraits)
Extrait cellulaire
Cellules entières
aw
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Hyd
rata
tion
du
lyop
hili
sat %
0
10
20
30
40
50
La résistance du lyophilisat d’extrait cellulaire n’est pas liée à une réhydratation inférieure
Réhydratation du lyophilisat durant la réaction à 40°C
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Résultats (III)
Interactions sels-protéines
Modification de la disponibilité de l’eau autour de la protéine
Effets des sels : protection contre les dénaturations thermiques
Le mécanisme exact de l’effet « thermostabilisateur » des sels reste à élucider
Explications en milieu non-conventionnel
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Résultats (III)
Stabilité thermique (cellules/extraits)
aw 0,65
Cellules entières Extraits cellulaires
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
aw 0,7
Activité résiduelle après 150 heures à 40°C
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Stabilité thermique (cellules/extraits)
Résultats (III)
Cellules entières Extraits cellulaires
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
aw 0,65
Activité résiduelle après 150 heures à 40°C
Limiter au maximum le risque de dénaturations thermiques
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Effets des sels
Vis-à-vis des dénaturations thermiques
Vis-à-vis du HCl
Effet de la proportion de sels
Résultats (III)
Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
Effet des sels : en réacteur solide/gaz
Résultats (III)
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/aw 0,65)
Temps (h)
0 20 40 60 800,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
50% de sels
Act
ivit
é sp
écif
ique
(U
I/g
de p
roté
ines
)
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Effets des sels
Effet de la proportion des sels
Résultats (III)
Vis-à-vis des dénaturations thermiques
Vis-à-vis du HCl
Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
Effet des sels : en réacteur solide/gaz
Résultats (III)
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Temps (h)
0 20 40 60 800,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
50% de sels31% de sels20% de sels4% de sels
Act
ivit
é sp
écif
ique
(U
I/g
de p
roté
ines
)
Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/aw 0,65)
Effet de la proportion de sels
Résultats (III)
Lyophilisats d’extraits cellulaires
% de sels au sein du biofiltre0 20 40 60 80
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Sans 1-chlorobutane
Activité résiduelle après 80 heures (40°C/aw 0,65)
Effet de la proportion de sels
Résultats (III)
Lyophilisats d’extraits cellulaires
% de sels au sein du biofiltre0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Avec 1-chlorobutaneSans 1-chlorobutane
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
Activité résiduelle après 80 heures (40°C/aw 0,65)
Une proportion de sels inférieure à 50% n’est pas suffisante pour neutraliser le HCl accumulé
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Effets des sels
Effet de la proportion des sels
Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
Résultats (III)
Vis-à-vis des dénaturations thermiques
Vis-à-vis du HCl
Effet de la proportion de sels
Résultats (III)
Lyophilisats d’extraits cellulaires
% de sels au sein du biofiltre0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Avec 1-chlorobutaneSans 1-chlorobutane
Act
ivit
é ré
sidu
elle
(%
)
Activité résiduelle après 80 heures (40°C/aw 0,65)
Temps (jours)
0 20 40 60 80 100 120
Act
ivit
é en
UI
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Extrait cellulaire (2,8 g)
Expérience à une échelle supérieure
Résultats (III)
Les sels semblent tamponner le microenvironnement des DhaA jusqu’à saturation
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/aw 0,65)
Introduction
Problématique
Résultats
Conclusions
Perspectives
Conclusions
Lyophilisat de cellules entières
Stabilité
Cellules entières
Viabilité
Substrat et produit organiques(1-chlorobutane et 1-butanol) Protéases
bactériennes
HCl produit Sels du tampon borate
Eau
Pas de sorptionX
Pas d’activité protéolytique
X
Contact direct avec les DhaA
(+)
« Réservoir à enzyme »
X
Sorption importante (20%)
(-) 55%Sorption totale
(-)45%
Conclusions
(+)Participe aux échanges
Lyophilisats de cellules entières
Stabilité
Cellules entières
Conclusions
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Stabilité
Extraits cellulaires
ViabilitéProtéases
bactériennes
HCl produit Sels du tampon borate
EauContact direct avec les DhaA
(+)
Sorption importante (20%)
Sorption totale
Conclusions
Lyophilisats d’extraits cellulaires
Stabilité
Extraits cellulaires
(+)
X150 heures
(+)
XJusqu’à saturation
Pas d’activité protéolytique
XPas de bactéries
entièresX
Introduction
Problématique
Résultats
Conclusions
Perspectives
Introduction
Problématique
Résultats
Conclusions
Perspectives
Perspectives
Travailler sur des substrats communément utilisés en industrie(TCE/DCM/PCE)
Développer l’effet des sels en catalyse solide/gazOptimiser le système en vue d’une applicationOptimiser le système en vue d’une application
Déterminer quelle est l’influence du ratio sels/enzyme Tester d’autres sels (KCl, LiCl, NaCl) Travailler avec des lyophilisats dépourvus totalement de sels
Comprendre l’effet des sels pour optimiser l’activité et la stabilité du
biocatalyseur
Optimiser la géométrie du réacteur
Régénérer le biocatalyseur Par évaporation (ne fonctionne pas car le HCl est neutralisé par les sels) Dialyse (pas viable économiquement) Trouver une autre méthode
Perspectives
Développer l’effet des sels en catalyse solide/gaz
Tester d’autres sels sur d’autres réactions avec des enzymes sensibles aux
dénaturations thermiques
Tester des enzymes d’intérêt sensibles à des aw élevées (ADH/Lipase pour des
réactions d’hydrolyse)
Effet des sels sur les dénaturations thermiques en réacteur solide/gaz Utiliser le réacteur solide/gaz comme outil
pour extrapoler aux milieux non-conventionnels
Développer l’étude de l’effet des sels en catalyse solide/gaz
Perspectives
Développer l’effet des sels en catalyse solide/gazPublications
Marchand P., Lamare S., Legoy M.-D. and Goubet I.Dehalogenation of gaseous 1-chlorobutane by dehydrated whole cells: influence of the microenvironment of the halidohydrolase on the stability of the biocatalyst.
Marchand P., Crémont M., Lamare S. and Goubet I.Dehalogenation of a gaseous effluent by dehydrated whole cells in a solid/gas reactor: Study of the catalyst’s stability
Marchand P., Rosenfeld E., Lamare S., Maugard T., Erable B., Goubet I.Coupled oxidation–reduction of butanol–hexanal by resting Rhodococcuserythropolis NCIMB 13064 cells in liquid and gas phases (Volume 43, Issue 6, 6 November 2008, Pages 423-430)
Remerciement
Le Pr Sylvain Lamare : Directeur du laboratoire LIENSs
Le Pr Marie-Dominique Legoy : Directeur de thèse
Les Pr Stéphane Vuilleumier et Didier Combes : Rapporteurs
Mme Anne Paillier et Dr Anne-Sophie Lepeuple : Examinatrices
Dr Isabelle Goubet : Directeur Scientifique
Et tous ceux qui ont participé à ce travail de près ou de loin
Développer l’effet des sels en catalyse solide/gazRemerciements