NICOLAS CARON
TRANSDUCTION DE PROTÉINES DANS LE DÉVELOPPEMENT D’UN TRAITEMENT POUR LA
DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
MAI 2004 © Nicolas Caron, 2004
Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie causée par l’absence de
dystrophine, qui se manifeste par une dégénérescence progressive des muscles
squelettiques et cardiaque. Les garçons atteints ont une espérance de vie d’environ 20 ans.
Même si la prise de certains médicaments peut ralentir la progression de la maladie, il
n’existe à ce jour aucune thérapie curative. La transplantation autologue de myoblastes
génétiquement corrigés peut restaurer l’expression de la dystrophine, mais les myoblastes
des patients DMD ont une capacité proliférative très limitée. Leur prolifération nécessite
l'immortalisation avec un oncogène viral, un processus augmentant les risques associés à la
transplantation de myoblastes.
Les protéines fusionnées au domaine de transduction de Tat peuvent transduire les cellules
en culture et plusieurs tissus in vivo. La transduction de protéines pourrait s’avérer utile
dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nos objectifs étaient de
tester la capacité des protéines de fusion Tat à transduire les fibres musculaires, de mieux
comprendre le mécanisme de transduction, d’optimiser le ciblage efficace des cellules en
culture et de développer des outils permettant l’immortalisation transitoire des myoblastes
avant leur transplantation.
In vivo, nos travaux indiquent que les fibres musculaires résistent à l’internalisation des
protéines de fusion Tat, qui se retrouvent en périphérie associées à la matrice
extracellulaire. In vitro, la distribution intracellulaire ponctuée, la cinétique
d’internalisation, la sensibilité aux basses températures et l’augmentation fonctionnelle
exercée par les agents lysosomotropiques révèlent un mécanisme d’endocytose classique.
Ces données suggèrent que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale,
évitent les lysosomes, et sont ensuite séquestrées en périphérie du noyau. Un trafic
intracellulaire inadéquat serait le principal facteur limitant l’efficacité de l’internalisation
fonctionnelle des cargos fusionnés au domaine de transduction de Tat. Cette meilleure
compréhension du mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat, nous permit de
développer une méthode efficace pour immortaliser de façon réversible les myoblastes d'un
ii
patient DMD. En utilisant un protéine de fusion Tat-Cre, nous avons déimmortalisé des
myoblastes DMD transformés par l'AgT flanqué de sites LoxP. Cette technique permet de
proliférer extensivement les myoblastes DMD, tout en rendant plus sécuritaire la
déimmortalisation.
iii
Abstract
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by the absence of dystrophin and leads to
progressive weakness in heart and skeletal muscles. Affected boys can only hope to live for
20 years since there is still no effective therapy for DMD. Autologous transplantation of
genetically modified myoblasts can restore dystrophin expression, but the rapid death, the
specific immune response and limited cellular migration severely limit the efficiency of the
treatment. Immortalization, although a risky procedure, is necessary to proliferate
myoblasts isolated from dystrophic patients, since by age five; their myogenic cells are
practically senescent.
Proteins and cargos fused to the Tat protein (HIV) can be internalized in cells and living
tissue. The mechanism of Tat internalization is still misunderstood and controversial. Our
objectives were to test the susceptibility of muscle fibers to be transduced by Tat fusion
proteins, to better understand the mechanism of entry of Tat fusions, to optimize
intracellular delivery and to develop techniques allowing the immortalization reversal of
myoblasts using Tat-fusion proteins.
The low susceptibility of muscle fibers to be transduced and the strong interaction between
Tat-fusion proteins and the extracellular matrix surrounding muscle fibers resulted in poor
protein delivery. Our work shows that the nuclear localization signal comprised in Tat is
not sufficient to confer nuclear delivery to eGFP. The punctuate intracellular distribution,
the internalization kinetics, the inhibitory effect of low temperatures and the functional
increase exerted by lysosomotropic agents are coherent with a classical endocytosis
internalisation mechanism. Our data suggests that Tat-fusion proteins proceed through the
endosomal pathway, avoid lysosomes and are then sequestered in the periphery of the
nucleus. Hence, improper intracellular trafficking is the main factor limiting the efficiency
of Tat-mediated protein internalization. With a better understanding of this internalization
mechanism, we were able to optimize the delivery of a Tat-Cre fusion protein to mediate
the complete and efficient removal of an oncogene necessary for the proliferation of
myoblasts isolated from DMD patients. Therefore this technique should help in the design
iv
of a successful treatment based on the autologous transplantation genetically-modified
cells.
Avant-Propos
Malgré les avertissements de rigueur servis par “les anciens” au tout début des études
graduées, il est difficile d’imaginer que le cheminement vers la réalisation d’une thèse de
doctorat puisse être aussi complexe. L’exercice de la méthode scientifique, dans une
perspective thérapeutique, génère un ratio échec/réussite tellement élevé qu’on en vient
parfois à croire Homer J. Simpson lorsqu’il dit “You tried your best and you failed
miserably ...the lesson is never try”. Ceux qui croient que seuls les frappeurs au baseball
peuvent considérer comme une réussite le fait de sa faire retirer trois fois sur quatre n’ont
jamais entrepris des études graduées en sciences biologiques. Heureusement, il y a toujours
une solution. Mais pourquoi faut-il qu’elle soit si simple?....
Je tiens à remercier mon directeur de thèse, Jacques Tremblay, qui m’a laissé m’amuser
dans son laboratoire à tester des combinaisons de réactifs et d’assemblages moléculaires à
faire dresser les cheveux des plus extravagants écrivains de science-fiction. Jamais je
n’accepterai que soit mis en doute devant moi son désir sincère de réussite pour ses
étudiants. Travailler avec le Dr. Tremblay m’a fait comprendre une chose très importante.
C’est que ce sont souvent les gens les plus occupés qui ont le plus de temps à donner.
Je voudrais évidemment remercier mes collègues passés et présents pour leur chaleur, leur
humour, leur sérieux, leur compréhension, leur aide, leurs faux pas, mais surtout leurs rires.
Ils sont beaucoup trop nombreux pour que je puisse tenter de les nommer de peur d’en
oublier. J’ai partagé des moments inoubliables avec eux et plusieurs resteront à jamais mes
amis.
Et finalement, je voudrais remercier mes parents pour leur soutien et leur amour
inconditionnel qui n’ont jamais hésité à se sacrifier pour ma réussite et mon bonheur.
Si une expérience fonctionne au premier essai, c'est qu'on a fait une erreur. Mais
heureusement, la souris est un petit animal merveilleux. Si on la tue en assez grande
quantité et avec suffisamment d'originalité, elle engendrera un PhD. (anonyme)
Table des matières Liste des abréviations..............................................................................................................1 Chapitre 1 - Introduction.........................................................................................................3
1 ère partie : LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE .................................3
1.1 Historique et description de la maladie.....................................................................3 1.2 Clonage du gène de la dystrophine ...........................................................................4 1.3 Rôle et fonction de la dystrophine ............................................................................5
2 ième partie : STRUCTURE ET PHYSIOLOGIE DU MUSCLE SQUELETTIQUE........9
2.1 Structure du muscle squelettique ..............................................................................9 2.2 La régénération musculaire.....................................................................................12 2.3 Les cellules satellites et les myoblastes ..................................................................13
3 ième partie : LES TRAITEMENTS EN DÉVELOPPEMENT CONTRE LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE .........................................................15
3.1 Diagnostic prénatal .................................................................................................15 3.2 Traitements pharmacologiques ...............................................................................16 3.3 Thérapie génique.....................................................................................................17
3.3.1 Lentivirus .........................................................................................................18 3.3.2 Adénovirus.......................................................................................................18 3.3.3 Virus adéno-associé (Parvovirus) ....................................................................19 3.3.4 Herpès Simplex type 1.....................................................................................20 3.3.5 Les approches non virales................................................................................21
3.4 Transplantation de cellules souches pluripotentes..................................................22 3.5 La transplantation de myoblastes............................................................................23
3.5.1 Historique des expérimentations chez l'animal et évolution du modèle expérimental..............................................................................................................25 3.5.2 Essais cliniques de transplantation de myoblastes chez l'humain ...................26 3.5.3 Limites de la transplantation de myoblastes ....................................................27
3.5.3.1 La faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injections................29 3.5.3.2 La mort rapide des myoblastes suite à l’injection.....................................30 3.5.3.3 Le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique.........30
3.5.4 Immortalisation des cellules myogéniques ......................................................31 3.5.4.2 L’antigène T..............................................................................................32 3.5.4.3 Les télomères et la télomérase ..................................................................36
4 ième partie: TAT ET LES DOMAINES DE TRANSDUCTION PROTÉIQUES...........38
4.1 La protéine Tat du VIH-1 .......................................................................................38 4.2 Le domaine de transduction de Tat, un historique..................................................40
viii
4.3 Les domaines de transduction protéiques ...............................................................46 4.4 Mécanismes d’entrée ..............................................................................................48
4.4.1 La membrane plasmique et le transport transmembranaire .............................48 4.4.2 Mécanismes d’entrée des domaines de transduction .......................................53
5ième partie : Hypothèse de travail et objectifs ..................................................................60
5.1 Résumé de la problématique...................................................................................60 5.2 Hypothèse de travail ...............................................................................................60 5.3 Objectifs..................................................................................................................61
Chapitre 2:.............................................................................................................................63 Transport intracellulaire d’une protéine de fusion Tat-eGFP dans les cellules musculaires63
Résumé..............................................................................................................................64 Abstract.............................................................................................................................66 Introduction.......................................................................................................................67 Material and Methods .......................................................................................................70 Results...............................................................................................................................73 Discussion.........................................................................................................................77 Acknowledgments ............................................................................................................81 Figure legends...................................................................................................................82 Figures ..............................................................................................................................84
Chapitre 3:.............................................................................................................................89 La déstabilisation des endosomes augmente l'accès fonctionnel des protéines de fusion Tat au noyau................................................................................................................................89
Résumé..............................................................................................................................90 Abstract.............................................................................................................................92 Introduction.......................................................................................................................93 Materials and methods ......................................................................................................95 Results...............................................................................................................................98 Discussion.......................................................................................................................103 Acknowledgements.........................................................................................................106 Figure legends.................................................................................................................107 Figures ............................................................................................................................111
Chapitre 4:...........................................................................................................................119 Immortalisation réversible de myoblastes humains par la transduction d'une protéine de fusion Tat-Cre recombinase................................................................................................119
Résumé............................................................................................................................120 Abstract...........................................................................................................................122
ix
Introduction.....................................................................................................................123 Results.............................................................................................................................126 Discussion.......................................................................................................................132 Materials and methods ....................................................................................................135 Acknowledgments ..........................................................................................................140 Figure legends.................................................................................................................141 Figures ............................................................................................................................144
Conclusion générale............................................................................................................149 Annexe:...............................................................................................................................173 Transduction de protéines dans les cellules musculaires: Optimisation et applications.....173
Résumé............................................................................................................................174 Abstract:..........................................................................................................................176 Introduction.....................................................................................................................177
Muscular dystrophies and their treatment...................................................................177 Muscle tissue structure................................................................................................178 Extracellular matrix and proteoglycans ......................................................................180 In vivo delivery...........................................................................................................181 Application to cell-mediated therapies .......................................................................185
Perspectives ....................................................................................................................188 References.......................................................................................................................189
Liste des tableaux Tableau 1 Cargos internalisés par la domaine de transduction de Tat.................................45 Tableau 2 Principaux domaines de transduction et séquences référencées dans la littérature.
......................................................................................................................................47
Liste des figures Chapitre 1 Figure 1 Le complexe de la dystrophine.................................................................................6 Figure 2 Structures de la dystrophine et de la minidystrophine. ............................................8 Figure 3 Structure du muscle squelettique............................................................................11 Figure 4 Transplantation de myoblastes. ..............................................................................24 Figure 5 Trois facteurs limitants le succès clinique de la transplantation de myoblastes. ...28 Figure 6 Activation de la prolifération cellulaire par l’oncogène viral de SV-40. ...............33 Figure 7 Implication des télomères dans la sénescence cellulaire........................................37 Figure 8 Génome et transcription du VIH-1. ........................................................................39 Figure 9 Tat du VIH-1, Séquence et structure. .....................................................................42 Figure 10 Stratégies de purification de protéines de fusion Tat. ..........................................44 Figure 11 Représentation schématique de la bicouche phospholipidique qui constitue la
structure fondamentale des membranes biologiques. ...................................................50 Figure 12 Représentation schématique simplifiée des compartiments intracellulaires
impliqués dans l’endocytose et la sécrétion de macromolécules..................................52 Figure 13 Modèle du "Leading edge" de l’importation de peptides contenant un signal de
translocation membranaire hydrophobe........................................................................55 Figure 14 Modèle de la translocation transmembranaire de peptides hydrophobes via la
formation de micelles inversées....................................................................................56 Figure 15 Modèle de la translocation membranaire de protéines de fusion Tat dénaturées.57 Figure 16 Modèle de l’endocytose des protéines de fusion Tat. ..........................................58 Chapitre 2 Figure 1 Schematic representation of Tat-fusion protein constructs and purification
strategy..........................................................................................................................84 Figure 2 Intracellular delivery of Tat-eGFP in NIH/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts.
......................................................................................................................................85 Figure 3 Rapid uptake of rhodamine-labeled Tat-eGFP in C2C12 myoblasts. ....................86 Figure 4 Intracellular delivery of Tat-eGFP in cultured primary cells. ................................87 Figure 5 Intracellular localization of Tat-eGFP in myofibers and retention to the
extracellular matrix. ......................................................................................................88 Chapitre 3 Figure 1 Effects of incubation at 4°C and early intracellular distribution of Tat-fusion
proteins........................................................................................................................111 Figure 2 Subcellular localization of Tat-fusion proteins. ...................................................112 Figure 3 Functional nuclear Cre assay................................................................................113 Figure 4 Effects of lysosomotropic agents known to promote endosomal release on the
functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC)..................................114 Figure 5 Effects of lysosomotropic agents on the Tat-Cre fusion protein (HTNC) uptake
and binding to NIH SSR. ............................................................................................115
xii
Figure 6 Effects of vacuolar H+-ATPase inhibitors, BFLA and CCM, on the functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC) in NIH SSR...............................116
Figure 7 Tat-Cre fusion protein (HTNC) stability following internalization. ....................117 Figure 8 Effects of the proteasome inhibitor MG 132 on the functional nuclear delivery of
HTNC..........................................................................................................................118 Chapitre 4 Figure 1 Immortalization of myoblasts using the SSR 69 retroviral vector. ......................144 Figure 2 Optimization of Cre internalization in human myoblasts. ...................................145 Figure 3 Myoblasts immortalized with Tag and hTERT retain myogenic characteristics in
culture. ........................................................................................................................146 Figure 4 Reversal of Tag immortalization using HTNC in human myoblasts. ..................147 Figure 5 Expansion of proliferation capacity of human primary myoblasts clones. .........148 Annexe Figure 1 Structural model of the skeletal muscle including its connective tissue. .............179 Figure 2 Tat-fusion protein localization after in vivo delivery...........................................183
Liste des abréviations AAV : Adeno-associated virus
ANTP : Antennapedia
bFGF : basic fibroblast growth factor
CAR : Coxsakie and Adenovirus Receptor
CDK : Cycline dependant kinase
DMD : Duchenne muscular dystrophy
DTP : Domaine de transduction protéique
eGFP : enhanced green fluorescent protein
GST : glutathione serine transferase
HBGF : Heparin binding growth factor
HGF/SF : Hepatocyte growth factor/scatter factor
HSV : Herpes simplex virus
hTERT : human telomerase reverse transcriptase
IGF : Insulin-like growth factor
LTR : Long terminal repeats
Mdx : Muscular dystrophy X-linked
Ni-NTA : Nickel-Nitrilitriacetic acid
PCR : Polymerase chain reaction
2
PGSH : Protéoglycanes de sulfate d’héparane
RE : Reticulum endoplasmique
SIDA : Syndrome d’immunodéficience acquise
SLN : signal de localisation nucléaire
TAR : Transactivation responsive elements
TBP : TATA box binding protein
TGF-β : Transformaing growth factor β
uPA : urokinase plasminogen activator
VIH : Virus de l’immunodéficience humaine
3
Chapitre 1 - Introduction
1 ère partie : LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
1.1 Historique et description de la maladie La myopathie connue sous le nom de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) a été
décrite pour la première fois par Edward Meryon en 1852. Le physiologiste français G.
Duchenne de Boulogne a ensuite mieux caractérisé la maladie qui porte son nom, en la
décrivant comme une hypertrophie musculaire provoquée par des problèmes cérébraux,
vers 1860 (Engel et al. 1994). La DMD est un désordre récessif liée au chromosome X. Son
incidence est d'environ un cas sur 3500 chez les nouveaux nés mâles partout à travers le
monde. C'est l'une des dystrophies les plus sévères et elle se caractérise par une perte
progressive de la force musculaire perceptible dès l'âge de 2 ou 3 ans. Vers l'âge 4 ans un
patient atteint de la dystrophie musculaire de Duchenne souffre d'un déficit de force
notoire. La détérioration des muscles atteint une telle amplitude que vers l'âge de 10 ans, les
patients, rendus invalides par la perte de force dans les bras et les jambes, sont confinés à la
chaise roulante. C'est à cet âge qu'apparaissent également des difficultés respiratoires qui
peuvent résulter en des infections pulmonaires parfois mortelles. La DMD se caractérise
par des taux sériques de créatine phosphokinase humorale très élevés dès la naissance, ce
qui met en évidence le dommage généralisé du tissu musculaire. En effet, le tissu
musculaire des patients Duchenne est constamment en régénération. Avec le temps, on
observe une augmentation progressive des tissus conjonctif (fibrose) et graisseux qui
finissent par remplir tout le muscle. Les patients meurent généralement d'une insuffisance
respiratoire, cardiaque ou d'infections pulmonaires. Aujourd'hui, l'espérance de vie des
patients atteints de la DMD ne dépasse guère 20 ans. Les femmes peuvent également être
affectées par des symptômes similaires à la DMD (Penn et al. 1970). Les symptômes
cliniques chez certaines femmes porteuses de la DMD se rapprochent beaucoup de ceux des
patients atteints de la dystrophie musculaire de Becker; la plupart des femmes porteuses
sont cependant asymptomatiques.
4
1.2 Clonage du gène de la dystrophine Plusieurs années se sont écoulées entre la caractérisation clinique finale de la maladie et la
localisation du gène impliqué dans le développement de la pathologie. C'est vers la fin des
années 1970 que les premières observations permettant de localiser le gène de la
dystrophine furent effectuées (Lindenbaum et al. 1979). C'est l'analyse de l'ADN d'un
patient présentant plusieurs pathologies associées à la DMD qui allait paver la voie à la
découverte du gène responsable de la maladie (Kunkel et al. 1985). C'est en 1985 que la
dystrophine fut localisée sur le bras cour du chromosome X par le groupe de Kunkel
(Monaco et al. 1985). Le gène est formé d'environ 2,6 millions de paires de bases (pb),
contient 79 exons séparés par des introns inhabituellement longs, et transcrit en un ARN
messager de 14 Kb (Hoffman et al. 1987).
La mutation du gène codant pour la dystrophine cause aussi des pathologies musculaires
chez les animaux. En 1984, une souris dystrophique fut décrite (mdx pour Muscular
Dystrophy X-linked), elle démontrait une concentration plasmatique élevée de créatine
kinase ainsi que des lésions caractéristiques de la DMD (Bulfield et al. 1984). La souris
mdx possède une substitution d'une seule base à l'intérieur d'un exon du gène de la
dystrophine causant une terminaison prématurée de la chaîne polypeptidique (Cavanna et
al. 1988). La souris mdx est un excellent modèle expérimental de la DMD au point de vue
biochimique, mais demeure un modèle médiocre pour le physiologie musculaire et comme
modèle phénotypique du patient DMD (Huard 1993). En effet, même si toutes les études
immunohistochimiques démontrent que les muscles de la mdx sont dépourvus de
dystrophine, à l'exception des fibres révertantes, elles ne présentent pas d'anomalies
musculaires ultrastructurales graves, de cardiomyopathies ou la dégénérescence musculaire
progressive observée chez les patients DMD (Cavanna et al. 1988; Huard 1993).
5
La DMD n'est pas la seule maladie ayant pour cause une mutation dans le gène de la
dystrophine. En effet, la dystrophie musculaire de Becker se caractérise par des symptômes
moins sévères, une progression plus lente et une nécrose musculaire moins importante que
la DMD (Mostacciuolo et al. 1987). Le phénotype Duchenne est causé par les mutations
introduisant un changement dans le cadre de lecture ou un codon stop de sorte que la
protéine entière est désorganisée (Monaco et al. 1987). Les patients Becker ont une protéine
conservant une certaine fonctionnalité, leurs mutations étant plutôt des délétions ou des
duplications n'affectant pas le cadre de lecture, dans une région n'étant pas impliquée dans
l'interaction avec les autres membres du complexe oligomérique de la dystrophine.
1.3 Rôle et fonction de la dystrophine La dystrophine est une protéine d’une masse moléculaire de 427 kDa. Elle est située sur la
partie interne de la membrane de la cellule musculaire, à laquelle elle est ancrée par un
complexe de nombreuses autres protéines (Fig. 1) (Michele et Campbell 2003). La présence
de la dystrophine et de son complexe est importante pour la stabilité mécanique de la
membrane cellulaire pendant la contraction musculaire et la résistance des fibres
musculaires à l’étirement. Quatre domaines majeurs composent la dystrophine. D'abord, les
240 premiers acides aminés de la portion N-Terminale de la dystrophine constituent le
domaine de liaison à l'actine (Hammonds 1987). Le second domaine se compose de 24
répétitions en tandem qui donnent sa forme de bâtonnet à la dystrophine. Cette structure est
similaire à celle de la spectrine, une autre protéine du cytosquelette. Le troisième domaine
est riche en cystéines et se lie à la β-dystroglycane, la pièce centrale du complexe
multimérique de la dystrophine. En effet c’est la β-dystroglycane qui fait le pont
transmembranaire entre les protéines intracellulaires et extracellulaires. Le quatrième
domaine, positionné en C-terminal, sert de domaine de liaison à d'autres membres du
complexe (Michele et Campbell 2003).
6
Figure 1 Le complexe de la dystrophine.
La région C-terminale de la dystrophine se lie aux autres protéines du complexe alors que la région N-terminale se lie à l’actine. La portion centrale forme une tige hélicoïdale élastique. Le complexe associé à la dystrophine agit comme une charnière trans-sarcolemmale liant le cytosquelette à la matrice extracellulaire (adaptée de Michele et Campbell 2003)
7
On retrouve la dystrophine dans tous les types de tissus musculaires. L'absence de la
dystrophine, et par conséquent du complexe protéique associé à la dystrophine, provoque
une instabilité membranaire des fibres musculaires. Ainsi, chez les patients Duchenne, le
stress physique occasionné par la contraction ou l’étirement musculaire occasionne des
ruptures membranaires (Zubrzycka-Gaarn et al. 1988). Celles-ci entraînent une succession
de cycles de dégénérescence/régénération des myofibres qui épuisent rapidement le
réservoir de cellules satellites, résultant en une dégénérescence musculaire progressive
caractéristique de la maladie.
Le gène de la dystrophine code pour plus d'un produit. On peut retrouver plusieures des
isoformes (de 70 à 260 kDa) dans d’autres tissus que le muscle (Luna et Hitt 1992). Le
gène de la dystrophine code en effet pour au moins six produits additionnels: deux
isoformes non musculaires sont transcrites par des promoteurs localisés dans la région-5' du
gène et quatre isoformes plus petites sont transcrites sous le contrôle de promoteurs internes
plus loin en aval du site d'initiation utilisé pour les isoformes longues (Wang et al. 1998).
La fonction précise des isoformes non musculaires de la dystrophine est encore mal
caractérisée, mais l'absence d'une isoforme neurale chez les DMD pourrait potentiellement
expliquer le retard mental parfois observé (Wang et al. 1998).
La dystrophine peut conserver une bonne part de sa fonctionnalité même lorsqu’elle perd
une portion importante de sa séquence (Fig. 2). Des patients Becker ayant une délétion
représentant 48% de la séquence codante ont pu conserver une capacité ambulatoire jusqu’à
plus de 60 ans (England et al. 1990). Ces observations ont amené le groupe de Chamberlain
à étudier la possibilité de diminuer la taille de la séquence codante pour générer des
versions fonctionnelles tronquées de la dystrophine (Harper et al. 2002). Certaines des ces
versions, même si elles conservent moins de 50% de la séquence codante de la dystrophine,
démontrent une fonctionnalité quasi similaire à la dystrophine pleine longueur (Harper et
al. 2002).
8
Figure 2 Structures de la dystrophine et de la minidystrophine.
Les patients souffrant de la dystrophie musculaire de Becker expriment une version tronquée de la dystrophine où plusieurs répétitions semblables à celles retrouvées dans la spectrine sont absentes (adaptée de Harper et al. 2002).
9
2 ième partie : STRUCTURE ET PHYSIOLOGIE DU MUSCLE SQUELETTIQUE
2.1 Structure du muscle squelettique Le muscle squelettique est constitué de très longues cellules (jusqu'à 30 cm chez l'humain)
multinucléées et cylindriques d'un diamètre de 10 à 100 µm. Les fibres musculaires
résultent de la fusion de cellules myogéniques mononucléées. Les fibres musculaires,
comme la plupart des autres cellules, sont enchâssées dans une matrice extracellulaire riche
en protéines et en hydrates de carbone. Chaque muscle est constitué de paquets de fibres
contenus à l’intérieur d’un réseau de tissu conjonctif (Sanes 1994). Le tissu conjonctif
entourant les fibres musculaires transmet la force mécanique sur toute la longueur du
muscle, confère de l’élasticité au muscle, permet d’accumuler de l’eau et sert également de
réservoir de facteurs de croissance impliqués dans la régénération et la croissance
musculaire. L’epimysium, le feuillet externe entourant le muscle entier, s’étend à l’intérieur
du muscle pour former le perimysium, qui sépare les paquets de fibres appelés fascicules
(Fig. 3). Les fibres musculaires individuelles sont entourées par l’endomysium qui contient
la lame basale, la lame réticulaire et des cellules comme les fibroblastes ou les
macrophages. La lame basale est constituée de deux couches, la lamina densa (de 10-15 nm
d'épaisseur) et la lamina rara (de 2-5 nm d'épaisseur). Le glycocalyx est formé par les
domaines extramembranaires des protéines intégrales de la membrane qui lient le
cytosquelette interne de la fibre à la matrice extracellulaire. Les fibres musculaires
squelettiques sont entourées d’une matrice extracellulaire composée de glycoprotéines, de
collagènes, et de protéoglycanes comme le sulfate d’héparane, le sulfate de chondroïtine et
l’acide hyaluronique. On a identifié à ce jour le perlecane, l’agrine, le syndécane, le
glypicane et le collagène de type XVIII comme étant des protéoglycanes de sulfate
d’héparane (PGSH) faisant partie de la lame basale (Jenniskens et al. 2000). Même s’ils
sont virtuellement ubiquitaires, les PGSH sont principalement localisés dans la couche
extérieure de la lamina densa adjacente au tissu conjonctif, mais beaucoup moins associés à
la lamina rara située près de la membrane plasmique (Kogaya et al. 1990). La plupart du
10
temps, les cellules musculaires ne s'étendent pas d'une extrémité à l'autre du muscle. Elles
ont donc besoin d'ancrage. Il est à noter que la matrice extracellulaire est fonctionnellement
et structurellement différente dans les régions où le muscle rencontre le tendon ou le nerf. À
la jonction myotendineuse, la surface du muscle forme des invaginations complexes et la
lame basale y est plus épaisse.
La membrane basale agit comme échafaudage pour la régénération. Lorsque le muscle
squelettique est soumis à un stress ischémique, pharmacologique, thermique ou mécanique,
les fragments de la fibre abîmée sont phagocytés mais les différentes couches de la lame
basale survivent (Grounds 1991). Comme nous le verrons, les cellules satellites résidentes,
qui sont situées sous la lame basale, viendront participer à la régénération des fibres
endommagées. Même si les macrophages font leur chemin à travers les couches du tissu
conjonctif pour phagocyter les débris laissés par les fibres endommagées, ce n'est pas le cas
pour les cellules satellites. En effet, celles-ci pénètrent difficilement la lame basale à moins
qu'elle soit brisée ou digérée par des protéases (Bischoff 1975). Les nouveaux myotubes se
forment à l'intérieur des anciennes couches de tissu conjonctif même si par la suite il peut y
avoir une synthèse additionnelle de protéines extracellulaires. Donc, en contraignant la
croissance et la migration des cellules satellites activées, la lame basale oriente la
régénération des nouvelles fibres musculaires (Sanes 1994).
11
Figure 3 Structure du muscle squelettique.
Représentation schématique d’une micrographie de la coupe transversale d’un muscle de souris. Dans un muscle squelettique, chaque fibre musculaire est revêtue d’une fine gaine de tissu conjonctif, l’endomysium, les faisceaux des fibres musculaires sont délimités par une gaine plus épaisse appelée périmysium. L’ensemble du muscle est renforcé et recouvert par une gaine grossière de tissu conjonctif, l’épimysium.
12
2.2 La régénération musculaire Contrairement au muscle cardiaque ou au muscle lisse qui ont un faible potentiel
régénérateur, le muscle squelettique peut se régénérer de façon extensive et autonome. La
régénération du muscle squelettique strié s'effectue toujours de la même façon, le type de
traumatisme important peu (Allbrook 1981). En effet, la régénération musculaire est
toujours précédée d'une réaction dégénérative se manifestant en deux étapes: une phase
initiale non inflammatoire et une phase de dégénérescence inflammatoire. La phase initiale,
qui se limite aux minutes sinon à l'heure suivant le traumatisme, se caractérise par l'entrée
de calcium extracellulaire et par la désintégration des organites comme les mitochondries,
les ribosomes et les myofibrilles (Hansen-Smith et Carlson 1979). Cette désintégration des
organites est causée par une nécrose et une autodigestion par des protéases intrinsèques à la
fibre (Carpenter et Karpati 1989).
L'envahissement par des cellules du système immunitaire caractérise la deuxième phase de
la dégénérescence musculaire. On retrouve des neutrophiles au site de dégénérescence de
deux à trois heures suivant le traumatisme et des macrophages entre huit et dix heures post-
trauma. La fonction principale des macrophages est de phagocyter les débris cellulaires à
l'intérieur du tube endomysial ou relargués par les fibres endommagées et aussi de produire
des facteurs chimioattractants qui viendront attirer les myoblastes, dérivés des cellules
satellites, nécessaires à la régénération du tissus. C'est alors que les cellules satellites sont
activées (Bischoff 1994). Environ trois jours après le début de la dégénérescence, les
myoblastes, dérivés des cellules satellites, entrent dans une phase de prolifération intensive.
À ce moment, l'ancienne lame basale se désintègre et il y a formation d'une nouvelle lame
basale par les myotubes nouvellement formés (Vracko et Benditt 1972). On peut distinguer
les fibres musculaires qui sont dans un processus de régénération par la centronucléation de
leurs noyaux. En effet, la dernière étape de la régénération musculaire est le retour des
noyaux vers la périphérie de la fibre.
13
2.3 Les cellules satellites et les myoblastes Les noyaux situés dans le syncytium des fibres musculaires sont incapables de progresser
vers la mitose. Ce sont donc les cellules satellites qui l'entourent qui forment un réservoir
de cellules régénératrices pour les myofibres. Les cellules satellites du muscle squelettique
sont normalement retrouvées dans un état quiescent chez l'adulte. Quand des dommages
mineurs ou des blessures surviennent, des signaux sont générés à l'intérieur du muscle
activant les cellules satellites et stimulant leur migration et leur entrée dans le cycle
cellulaire (Tatsumi et al. 1998). Les cellules satellites ont été décrites pour la première fois
suite à des observations faites chez la grenouille (Mauro 1961). Elles possèdent des
caractéristiques distinctives reliées à leur état de quiescence. En effet ce sont des cellules
avec peu d'organelles cellulaires et un noyau hétérochromatique, ce qui est caractéristique
des cellules inactives. On retrouve les cellules satellites enchâssées sous la lame basale
entourant chaque fibre musculaire. On peut maintenant identifier les cellules satellites par
la présence de c-met, le récepteur du HGF/SF ou la présence de Pax7 (Seale et al. 2000). Le
récepteur du HGF doit se retrouver à la surface de toutes cellules satellites puisque c'est lui
qui permet leur activation permettant de quitter la quiescence (Tatsumi et al. 1998).
Les cellules satellites originent des cellules myogéniques embryonnaires. Les myocytes
prolifèrent durant le début du développement embryonnaire, et plus tard, ils se retirent du
cycle cellulaire pour devenir quiescents. On a longtemps cru que les cellules satellites
étaient emprisonnées sous la lame basale qui se forme durant le développement. Cela
impliquait que la lame basale soit liée aux cellules satellites à la surface de la myofibre. Il
en va tout autrement, puisque les cellules myogéniques se regroupent à la surface des
myotubes avant même la formation de la lame basale. Il a été démontré que les cellules
satellites ont une affinité adhésive pour les myotubes (Bischoff 1994) et qu'elles peuvent
migrer à travers la lame basale dans diverses conditions expérimentales (Bischoff 1986).
L'âge est un facteur important qui influence la quantité et la qualité des cellules satellites du
muscle. Celles-ci sont plus abondantes pendant les premières étapes du développement
musculaire, où elles contribuent à la croissance musculaire. Leur nombre dininue
graduellement dans la dernière partie de la vie (Bischoff 1994).
14
Puisque notre intérêt pour les myoblastes est motivé par la volonté de les utiliser dans le
contexte de la transplantation cellulaire, pour les définir nous utilisons des critères qui
peuvent différer de ceux utilisés dans le domaine fondamental du développement. Dans le
contexte de la transplantation de myoblastes, le terme myoblaste a été généralement utilisé
comme décrivant les cellules mononucléées, non terminalement différenciées qui ont le
potentiel d’initier un programme myogénique, de se soustraire au cycle cellulaire et de
différencier pour former du muscle squelettique (Beauchamp et al. 1999). Suite à la
découverte récente de l'existence de cellules souches pluripotentes dans une variété de
tissus adultes chez plusieurs espèces, nous modifions la définition de myoblaste pour y
ajouter le critère d'engagement vers la différenciation myogénique afin d'exclure les
cellules souches pluripotentes. Selon ces critères, les cellules satellites deviennent donc des
myoblastes lorsqu’elles entrent en prolifération pendant la régénération musculaire. À
cause du potentiel thérapeutique des cellules satellites humaines pour le traitement des
myopathies, la capacité proliférative in vitro de cellules humaines a été testée. Des clones
de cellules satellites humaines isolées de muscles adultes produisent une progéniture
capable de proliférer jusqu'à 25 à 30 passages, alors que des cellules isolées de foetus
peuvent proliférer de 60 à 70 fois in vitro (Ham et al. 1990). La capacité proliférative ainsi
que la longueur des télomères des cellules satellites diminuent de façon importante durant
les deux premières décennies de la vie d'un humain pour se stabiliser par la suite (Decary et
al. 1997). La capacité proliférative des cellules satellites n'est donc pas illimitée chez les
patients Duchenne dont les muscles subissent des cycles continuels de
dégénérescence/régénération.
15
3 ième partie : LES TRAITEMENTS EN DÉVELOPPEMENT CONTRE LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Plusieurs avenues sont actuellement explorées pour retarder la progression de la maladie,
augmenter la force musculaire ou suppléer au moins partiellement à l’absence de la
dystrophine. Il n’existe cependant encore aucune thérapie curative contre la DMD. Ce
chapitre a pour but de faire une revue des stratégies testées dans le passé ainsi que des
approches thérapeutiques actuellement en développement. Il est en effet nécessaire de
résumer le chemin parcouru, mais aussi d'être conscient des obstacles restants à franchir
pour mieux comprendre comment s’insère les expériences décrites plus loin ainsi que les
circonstances qui les justifient. Avant de discuter plus en détails de la transplantation de
cellules myogéniques nous allons récapituler les traitements principaux aujourd’hui en
développement.
3.1 Diagnostic prénatal Même s’il n’est pas à proprement parler un traitement contre la DMD, le diagnostic
prénatal doit être tout de même considéré comme une des méthodes permettant de diminuer
l’impact de la maladie sur la population en général et plus spécifiquement chez les familles
déjà affligées. L’état actuelle des technologies pour le diagnostic prénatal ne permet pas
encore de cribler la population dans son ensemble pour y détecter les porteurs de mutations
causant la DMD. Cependant l’avènement des technologies de microdétection moléculaire
pourrait bientôt changer cette donne. Pour l’instant, à cause des coûts, mais principalement
à cause des risques associés à l'amniocentèse, le diagnostic prénatal est encore réservé aux
familles où il y a déjà un patient ou un historique familial. Puisqu'environ 60% des patients
DMD ont une délétion, il est possible de diagnostiquer l’absence d’un ou plusieurs des 79
exons du gène de la dystrophine par PCR. La détection de mutations ponctuelles est
cependant beaucoup plus complexe, et nécessite le séquençage complet du gène. Malgré la
progression rapide des techniques de détection prénatale, la DMD ne pourra, à moins d’une
16
diminution drastique du taux de complications associées à l’amniocentèse, être éliminée
d'une population en utilisant l’avortement sélectif des embryons porteurs. En effet, 25% des
mutations ne sont pas héritées des parents mais apparaissent spontanément lors du
développement embryonnaire, ce qui génère constamment de nouvelles mutations.
3.2 Traitements pharmacologiques Tant que les efforts pour supplémenter de façon satisfaisante à l’absence de dystrophine
avec la thérapie génique ou le transfert cellulaire ne seront pas couronnés de succès, des
médicaments permettant de diminuer l’impact des symptômes de la DMD seront étudiés.
Les premiers essais pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant de la DMD
ont impliqué l'utilisation de médicaments visant à ralentir la progression de la maladie.
Bien qu’il n’existe aucune thérapie pharmacologique à ce jour contre la DMD, certains
médicaments comme la prednisone, la prednisolone et le deflasacort peuvent, pendant une
durée limitée, réduire la dégénérescence musculaire (Drachman et al. 1974; Mendell et al.
1989; Barton-Davis et al. 1999).
Certains antibiotiques comme les aminoglycosides ont pour cibles des composantes de la
machinerie traductionnelle et peuvent induire des modifications dans la reconnaissance des
codons. La gentamicine peut amener le complexe ribosomal à ne pas interpréter le codon
UAG comme un stop permettant ainsi d’outrepasser une mutation nonsense (Barton-Davis
et al. 1999). Certains patients souffrant de la DMD pourraient être susceptibles de répondre
à un tel traitement, mais les essais cliniques en cours n’ont pas encore démontré un effet
positif sur l’expression de la dystrophine (Wagner et al. 2001). D’autres stratégies, moins
conventionnelles, impliquant l’utilisation de protéines recombinantes ou d’anticorps sont
maintenant à l’étude. En effet, on a découvert qu’une délétion dans le gène de la myostatine
chez une race de bovins Belges résultait en une masse musculaire 20% plus importante
(Grobet et al. 1997; McPherron et Lee 1997). De plus les souris transgéniques sans le gène
de la myostatine sont jusqu’à 3 fois plus massive que les souris normales (Lee et
McPherron 2001). Puisque le produit du gène de la myostatine agit comme un régulateur
17
négatif de la croissance musculaire, on cherche maintenant à bloquer son activité. Certains
groupes sont actuellement en train de tester l’efficacité d’anticorps dirigés contre la
myostatine. L’injection hebdomadaire d’anticorps contre la myostatine a déjà permis
d’augmenter le poids d’environ 12% chez des souris mdx et d’augmenter leur force
musculaire (Bogdanovich et al. 2002).
Même si ce type de stratégies ne s’attaque pas à la source du problème, il pourrait quand
même permettre aux patients Duchenne de rester plus forts plus longtemps et pourrait
potentiellement augmenter leur espérance de vie. Il est cependant possible que
l’augmentation de la croissance musculaire obtenue en bloquant la myostatine ne soit que
transitoire et accélère éventuellement la faiblesse musculaire puisque dans ce contexte, les
myoblastes pourraient atteindre la sénescence plus rapidement.
3.3 Thérapie génique Il est raisonnable de croire que le transfert d’une quantité suffisante de copies
fonctionnelles du gène de la dystrophine dans les noyaux des fibres musculaires mènerait à
la synthèse de la dystrophine et subséquemment à sa localisation correcte pour restaurer à la
membrane le complexe glycoprotéique lui étant associé. Deux types d'approches ont été
utilisées pour transférer l'ADN aux cellules : les vecteurs viraux et les vecteurs non viraux
qui montrent différents avantages en ce qui concerne leur efficacité, leur facilité de
production et leur sécurité. Les virus sont très efficaces pour transfecter la cellule cible avec
leur propre ADN. En remplaçant les gènes qui ne sont pas nécessaires à la phase de
réplication du virus par des gènes d'intérêts d'origine étrangère, les recombinants viraux
peuvent infecter le type cellulaire ciblé. Le tropisme des virus peut aussi être modifié en
changeant les glycoprotéines de surface pour favoriser l’infection spécifique de cellules
cibles. Même si plusieurs virus ont été développés, quatre types se démarquent plus
spécialement: les lentivirus, les adénovirus, les virus adéno-associés, et l'herpès simplex de
type 1.
18
3.3.1 Lentivirus Les lentivirus forment une sous-classe de rétrovirus qui possèdent la capacité d'infecter les
cellules en prolifération et les cellules qui ne se divisent pas. Ils sont considérablement plus
complexes que les autres rétrovirus, leur génome codant pour six gènes additionnels
(Naldini et al. 1996). Les vecteurs pour produire des lentivirus sont maintenant constitués
d’un promoteur puissant en 5’ et d’un LTR 3’ muté qui s’auto-inactive lors de la première
ronde de réplication du virus; ceci génère des virions incapables de produire des ARNs
codant pour le génome viral. Un promoteur interne doit donc être inséré pour diriger
l’expression du transgène. En plus de pouvoir médier le transfert de gène dans les cellules
en prolifération, les lentivirus pseudotypés avec des glycoprotéines d’enveloppe provenant
des virus Mokola ou Ébola ont démontré la capacité d'infecter des fibres musculaires chez
les embryons de souris (MacKenzie et al. 2002). En effet, suite à l’injection
intramusculaire/intra-utérine de lentivirus codant pour la β-Galactosidase chez des
embryons, on a pu détecter des fibres musculaires exprimant ce transgène jusqu’à 6 mois
après l’injection. Bien que les lentivirus ne soient pas dotés d’une capacité d’encapsidation
suffisante pour transporter une version complète du gène de la dystrophine, ils pourraient
transduire des versions tronqués du gène. Des travaux récents montrent que des mini-gènes
de la dystrophine sont efficaces pour améliorer le phénotype des souris mdx (Harper et al.
2002; Watchko et al. 2002).
3.3.2 Adénovirus Les adénovirus ne causent chez l'humain que des infections bénignes des voies
respiratoires. Ils ne s'intègrent pas au génome de la cellule hôte mais se maintiennent plutôt
sous la forme d'un élément épisomal. La taille du génome des adénovirus sauvages est
d'environ 35 kb et peut ainsi contenir la séquence codante complète de la dystrophine
(Kremer et Perricaudet 1995a). Les adénovirus recombinants peuvent transduire les fibres
musculaires squelettiques ainsi que le muscle cardiaque (Acsadi et al. 1996). Par contre
l’infection des fibres musculaires par les adénovirus est tributaire de la présence du
récepteur CAR qui voit son expression fortement diminuée pendant la maturation des fibres
musculaires (Nalbantoglu et al. 1999). Ceci explique en partie pourquoi la plupart des
19
études avec ce vecteur ont été effectuées chez des nouveaux-nés. Suite à l’injection d'un
vecteur de troisième génération codant pour la dystrophine pleine longueur, jusqu’à 30%
des fibres musculaires des souris dystrophiques expriment la dystrophine (Acsadi et al.
1996). Les résultats les plus impressionnants obtenus jusqu’à maintenant chez la souris
proviennent de l’utilisation d’un vecteur contenant deux copies complètes de l’ADN
complémentaire de la dystrophine en aval du très puissant promoteur composite
cytomégalovirus/β-Actine (Gilbert et al. 2003). Malgré la nature épisomale de l’ADN
transféré, 42% des fibres musculaires des souris injectées dans les premiers jours de leur
vie exprimaient la dystrophine à 30 jours; ce pourcentage baisse à 24% à 6 mois. Il est
cependant important de mentionner que malgré l’absence de gènes viraux dans ce vecteur,
une réponse immunitaire humorale forte fut observée dans tous les groupes.
3.3.3 Virus adéno-associé (Parvovirus) Les virus adéno-associés (AAVs) ne sont pas pathogèniques et sont capables d'infecter les
cellules en division et les cellules quiescentes comme les fibres musculaires (Kremer et
Perricaudet 1995b). L’AAV-2 est le plus étudié, mais de nouveaux sérotypes comme le
AAV-6 ont démontré encore plus d’efficacité à infecter les fibres musculaires (Hauck et
Xiao 2003). Les virus sauvages s'intègrent dans le génome de la cellule hôte en un point
spécifique (19q 13.4) à une fréquence importante (Kotin et al. 1990). Quand les AAVs sont
utilisés comme vecteurs, les gènes viraux rep et cap sont remplacés par le transgène et ses
séquences régulatrices associées. Les virus recombinants perdent ainsi la capacité de
s’intégrer dans le génome des cellules infectées. La longueur totale de l'insert ne peut guère
dépasser 5,2 kb (Dong et al. 1996). Les méthodes actuelles pour produire des AAVs ne
permettent pas d'obtenir des titres aussi élevés qu'avec les adénovirus. Les vecteurs AAVs
peuvent exprimer un transgène jusqu'à 18 mois dans un tissu immunocompétent (Xiao et al.
1996). Les AAVs ne seraient d’aucune utilité dans le développement de traitements contre
la DMD sans des développements importants dans l’étude des domaines structuraux de la
dystrophine (Harper et al. 2002). Le groupe de Xiao-Xiao publia en 2000, les résultats de
leur étude sur l’administration de vecteurs AAVs contenant des mini-gènes de la
20
dystrophine de moins de 4,2 kb. Des vecteurs AAVs recombinants ayant en commun des
délétions des domaines R4 à R21 injectés en intramusculaire démontrèrent un taux
d’infection très élevé (50-88%) et une capacité à améliorer la pathologie de la maladie
jusqu’à 6 mois après l’administration (Wang et al. 2000). Il reste à confirmer que ces mini-
gènes permettront d’améliorer la condition d'un patient DMD pour le rendre similaire à un
patient Becker. Il faudra aussi démontrer que malgré l’absence d’intégration des vecteurs
recombinants, l’expression du transgène sera vraiment prolongée. Finalement, il faudra
développer de nouvelles méthodes pour rendre possible l’administration systémique et la
production d’AAVs en quantité suffisante pour la thérapie chez l’humain.
3.3.4 Herpès Simplex type 1 Le virus herpès simplex de type 1 (HSV-1) est un virus neurotropique humain, mais il peut
être utilisé pour infecter des tissus ou des cellules qui ne sont pas dérivés du système
nerveux (Efstathiou et Minson 1995). Le génome viral des virus HSV-1 est constitué d'un
ADN linéaire double brin d'une longueur de 152 kb. Ces virus sont donc doués d’une
grande capacité d’encapsidation. Un fois débarrassé de toute séquence virale, les vecteurs
basés sur le HSV sont peu toxiques et peuvent être utilisés soit pour infecter directement les
muscles ou pour infecter des cellules myogéniques in vitro. En effet, l’injection directe de
vecteurs HSV recombinants peut générer jusqu’à 50% de fibres positives pour le transgène
utilisé (Wang et al. 2002). L'équipe du Dr. Jacques Tremblay a démontré que les vecteurs
HSV pouvaient être utilisés dans le contexte de la thérapie génique indirecte basée sur
l’infection in vitro des myoblastes (Bujold et al. 2002). Suite à la transplantation de
myoblastes infectés avec un amplicon HSV contenant la dystrophine et l’eGFP chez des
souris dystrophiques immunosupprimées, jusqu’à 50% de fibres positives pour la
dystrophine ont pu être observées (Bujold et al. 2002). Les vecteurs HSV demeurent quand
même peu attirants à cause de leur faible capacité d’intégration. Cependant, des travaux
sont actuellement en cours pour générer des vecteurs hybrides HSV-AAVs qui exhiberaient
la propriété de s’intégrer comme des vecteurs AAVs tout en ayant la grande capacité de
stockage du HSV.
21
3.3.5 Les approches non virales Tous les vecteurs décrits précédemment peuvent potentiellement provoquer des réponses
immunes ou causer du tort à la cellule infectée (par leur toxicité ou par mutagenèse
d'insertion). Le thème général des approches non virales est d'imiter les avantages des
composantes des vecteurs viraux en les séparant de leurs fonctions limitantes. L'injection
d'ADN nu implique l'injection d'ADN circulaire plasmidique directement dans le tissu
musculaire. On a pu détecter l'expression du transgène provenant de l'injection
intramusculaire d'un plasmide pendant 60 jours (Wolff et al. 1990). La stimulation
électrique du muscle peut augmenter de façon très importante la perméabilisation du
sarcolemme pour l’ADN (Vilquin et al. 2001). L’occlusion momentanée de la vena cava
peut augmenter le transfert de plasmide dans le diaphragme chez les souris mdx (Liu et al.
2001). Toutes ces améliorations méthodologiques ne parviennent cependant pas à résoudre
le problème de persistance limitée de l’expression avec des plasmides. Il est aussi à prévoir
que l’adaptation de ces méthodes à de gros muscles sinon à tout le corps d’un patient
Duchenne sera difficile.
Plutôt que d’introduire un gène complet pour remplacer le gène muté, d’autres stratégies
impliquent l’utilisation de séquences nucléotidiques capables de moduler la transcription ou
de corriger les mutations dans un génome cible. Les ARNs antisens peuvent être utilisés
pour interférer avec l’épissage normal de divers transcrits. La transfection de séquences
ciblant l'exon muté peut permettre d'omettre ce dernier pour produire une dystrophine
tronquée mais encore fonctionnelle (van Deutekom et al. 2001). Les méthodes qui optent
pour la correction génétique sont l’utilisation de chimeraplastes (Yoon et al. 1996) et le
remplacement homologue avec de courts fragments d'ADN simple brin (Kapsa et al. 2001).
Ces méthodes sont en principe très attirantes puisqu’elles ont le potentiel de restaurer au
moins un phénotype intermédiaire sans déclencher une réponse immune. Leur efficacité est
encore réduite et des améliorations sont nécessaires avant d'en arriver à des essais cliniques.
22
3.4 Transplantation de cellules souches pluripotentes L’intérêt pour les cellules souches a littéralement explosé ces dernières années. L'équipe de
Caplan (Wakitani et al. 1995) a été la première à montrer que des cellules pluripotentes
mésenchymateuses isolées de la moëlle osseuse de rat pouvaient se différencier en cellules
myogéniques lorsqu'elles étaient exposées à un agent antimitotique. Les cellules extraites
de la moëlle osseuse d'une souris transgénique pouvaient, suite à une injection systémique,
migrer au site du dommage musculaire, se différencier et fusionner avec les fibres
endommagées pour participer à la régénération (Ferrari et al. 1998). Un peu plus tard, on a
découvert qu’une population de cellules isolées du muscle pouvait repopuler de façon
efficace la moëlle osseuse de souris exposées à une dose létale de radiation (Jackson et al.
1999). En même temps, il a été démontré qu’une sous-population cellulaire exhibant la
capacité de pomper en milieu extracellulaire un marqueur fluorescent (Hoechst 33342),
ressemblait beaucoup aux cellules souches retrouvées dans la moëlle osseuse. Tout comme
les cellules non purifiées du muscle, ces cellules négatives pour le Hoechst 33342 sont
aussi capables de repopuler non seulement la moëlle osseuse (Gussoni et al. 1999), mais
aussi le muscle dans une moindre mesure (McKinney-Freeman et al. 2002). C’est donc tout
autant pour leur capacité extensive de prolifération que pour leur potentiel de dispersion à
travers la circulation que les cellules souches pluripotentes suscitent tant d’intérêt. Un
exemple très impressionnant de dispersion des cellules souches fut publié récemment par le
groupe de Cossu (Sampaolesi et al. 2003). Ils ont démontré que l’injection intra-artérielle
de mésoangioblastes (une nouvelle classe de cellules souches associées aux vaisseaux
sanguins) dans l’artère fémorale de souris mdx pouvait mener à la correction
morphologique et fonctionnelle des muscles irrigués. Les récentes découvertes de
populations cellulaires multipotentes dans presque tous les tissus du corps ont provoqué
une révision radicale de notre conception de la stabilité de la différenciation cellulaire
(Partridge 2003). Les cellules souches offrent le potentiel de fournir une source continue de
cellules pouvant participer à la régénération à divers sites dans le corps. De l’aveu même
des initiateurs de la technique de transplantation de moëlle osseuse pour le traitement d'une
neuropathologie musculaire, le potentiel thérapeutique réel de cette technologie reste
23
questionnable (Ferrari et Mavilio 2002). En effet, moins de 0,5% des muscles des souris
transplantées avec de la moëlle osseuse montrèrent des fibres musculaires hybrides (Ferrari
et al. 1998).
3.5 La transplantation de myoblastes La transplantation de myoblastes normaux dans les muscles dystrophiques peut
potentiellement créer un réservoir de myoblastes normaux capables de fusionner et de
restaurer l'expression de dystrophine (Partridge 1991). Le principe de la thérapie par
transplantation de myoblastes repose sur les bases simples des propriétés observées chez les
cellules musculaires. Il s'agit de construire in vivo des hybrides fonctionnels entre des
cellules saines et des cellules musculaires squelettiques contenant le gène muté (Fig. 4). Les
fibres musculaires sont des syncytia plurinucléés formés à partir de la fusion de myoblastes.
Suite à un traumatisme, ces fibres musculaires sont régénérées par la fusion de cellules
myogéniques mononucléées. Cette propriété intrinsèque rend possible l'introduction de
noyaux normaux (ou modifiés génétiquement) à l'intérieur de fibres musculaires
dystrophiques par l'injection de myoblastes normaux (Huard et al. 1993).
24
Figure 4 Transplantation de myoblastes.
La cible du transfert de myoblastes (ou de cellules myogéniques) est le muscle squelettique. (1) Le tissu musculaire peut être prélevé d'un donneur. (2) Les cellules satellites, situées en périphérie des fibres musculaires (3), peuvent être cultivées et proliférées in vitro (4). Après avoir obtenu un nombre suffisant de cellules, elles peuvent être implantées dans le muscle (5) pour participer à la régénération induite au site d’injection par les dommages causés par les injections. Avant la transplantation, les cellules peuvent être modifiées génétiquement pour exprimer des gènes traceurs (comme la β-Galactosidase) ou des gènes candidats comme la dystrophine. (5) Le panneau (6) montre une coupe transversale des fibres multinucléées générées dans le biceps d'un singe greffé avec des cellules marquées à la β-Galactosidase (adapté (Skuk et Tremblay 2001).
25
3.5.1 Historique des expérimentations chez l'animal et évolution du modèle expérimental Même si la transplantation de muscles complets se pratiquait depuis plusieurs années,
l'équipe de Partridge a été la première à montrer que les myoblastes contenus dans le
muscle du donneur pouvaient participer à la régénération des muscles du receveur
(Partridge et al. 1978). En 1979, on a démontré que des cellules myogéniques issues de
cellules satellites, suivies à l’aide d’un marqueur radioactif, pouvaient participer à la
régénération musculaire suite à leur implantation dans un muscle normal (Lipton et Schultz
1979). Les premiers essais de transplantation de myoblastes dans un muscle de souris ayant
pour but de corriger une myopathie ont été publiés par le groupe de Peter Law (Law 1982).
Ces expériences ont été éxécutées chez des souris dystrophiques C57BL/6J dy/dy qui
présentent une atrophie musculaire importante et une dégénérescence musculaire
progressive, mais qui n’est pas un modèle de la DMD.
La confirmation de la validité, au niveau moléculaire du moins, de la souris mdx comme
modèle d'étude de la transplantation de myoblastes dans la thérapie de la DMD, allait paver
la voie à plusieurs expériences montrant la légitimité de cette technique. L’équipe de
Partridge fut la première à démontrer que l'on pouvait réintroduire la dystrophine dans les
muscles de souris mdx en transplantant des myoblastes normaux (Partridge et al. 1989).
Subséquemment, des travaux démontrèrent qu'en inactivant les cellules satellites de l'hôte
par irradiation on pouvait augmenter l’efficacité de la procédure jusqu’à obtenir 70% de
fibres positives pour la dystrophine (Morgan et al. 1990). Ces résultats laissaient présager
que la transplantation de myoblastes normaux chez les patients Duchenne pourrait restaurer
l'expression de dystrophine à long terme et ainsi constituerait un traitement prometteur. Ces
résultats donnèrent donc rapidement lieu à des essais cliniques.
26
3.5.2 Essais cliniques de transplantation de myoblastes chez l'humain La restauration de l'expression de dystrophine chez la souris mdx par l’équipe de Partridge
(Karpati et al. 1989; Partridge et al. 1989; Morgan et al. 1990) suggérait la faisabilité de la
transplantation de myoblastes chez l’humain. Cinq équipes ont débuté des essais cliniques
au début de années 90 chez des patients DMD (Law et al. 1990; Huard et al. 1991; Gussoni
et al. 1992; Karpati et al. 1993; Tremblay et al. 1993b; Mendell et al. 1995).
Le groupe de Karpati (Karpati et al. 1993) démontra un effet thérapeutique très pauvre
exercé par la transplantation de myoblastes chez des patients immunosupprimés avec de la
cyclophosphamide. L'analyse de l'expression de la dystrophine dans les muscles
transplantés n'a cependant pas montré d'augmentation significative. Le groupe de Miller a
démontré que l'on pouvait détecter le transcrit normal de la dystrophine provenant du
donneur suite à la transplantation de myoblastes chez des patients DMD (Gussoni et al.
1992). La quantité de messagers observés était cependant très faible, ne permettant pas de
conclure au succès de la greffe. Dans une seconde étude, le messager de la dystrophine fut
détecté dans trois des dix patients un mois après la transplantation et dans un patient six
mois après la transplantation (Miller et al. 1997). Aucun gain de force ne fut imputé à la
transplantation de myoblastes, mais cette étude montra que la cyclosporine pouvait
augmenter la force chez les patients Duchenne. La cyclosporine augmente le calcium
disponible pour la libération hors du reticulum sarcoplasmique des musles squelettiques
chez les patients DMD, ceci pourrait expliquer les gains de force observés (Miller et al.
1997).
L'équipe de Jacques Tremblay a aussi effectué des transplantations de myoblastes chez des
patients Duchenne (Huard et al. 1991; Tremblay et al. 1993b). Une restauration
significative de l'expression de la dystrophine a été observée dans les muscles greffés.
Certains patients ont aussi manifesté une augmentation de force volontaire dans les muscles
transplantés (Huard et al. 1992). Par contre, les augmentations au niveau de l'expression de
la dystrophine et les gains de force furent transitoires. Ces travaux ont révélé que les
27
myoblastes injectés étaient immunogéniques et pouvaient causer le rejet de la greffe, et ceci
même dans les cas de parfaite immunocompatibilité pour les antigènes majeurs (Huard et
al. 1992). Le groupe de Mendell apporta une variante aux essais cliniques précédents, i.e.
qu'ils multiplièrent le nombre d'injections de myoblastes. Ils injectèrent 110 millions de
myoblastes, provenant d'un membre de la famille du patient, une fois par mois pour une
durée de six mois à 12 garçons souffrant de la DMD (Mendell et al. 1995). La moitié des
patients furent immunosupprimés avec la cyclosporine A. Aucun gain de force ne fut
observé six mois après la dernière injection, mais une production significative de
dystrophine du donneur fut détectée chez un patient.
3.5.3 Limites de la transplantation de myoblastes Le succès limité des essais cliniques effectués par ces cinq groupes a confirmé qu'il était
nécessaire d'améliorer la méthode de transplantation de myoblastes pour augmenter
l'efficacité thérapeutique de cette technique. Le groupe de Tremblay a identifié trois types
de problèmes pouvant expliquer la faible efficacité de la transplantation de myoblastes (Fig.
5) (Skuk et al. 2002b; Skuk et Tremblay 2003b) :
1) la faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injections;
2) la mort rapide des myoblastes suite à l’injection;
3) le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique.
28
Figure 5 Trois facteurs limitants le succès clinique de la transplantation de myoblastes.
Représentation schématique de la transplantation de myoblaste dans le muscle squelettique. La faible dispersion des cellules transplantées, la mort rapide des myoblastes et la réponse immune spécifique sont les principaux obstacles freinant la transplantation de myoblastes. (1) Histochimie pour révéler le produit du transgène de la β-Galactosidase dans un muscle de singe illustrant la faible dispersion des myoblastes transplantés hors des sites d’injection. (2) Pochettes cellulaires démontrant une entrée rapide du calcium extracellulaire (Rouge Alizarine) quelques heures après l’injection. (3) Infiltration de lymphocytes en périphérie des myofibres exprimant le transgène un mois après une transplantation allogénique chez le singe (Adapté (Skuk et Tremblay 2001).
29
3.5.3.1 La faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injections La migration limitée des myoblastes dans les muscles transplantés est considérée comme
un facteur responsable du faible succès des transplantations de myoblastes chez les patients
dystrophiques (Rando et al. 1995; Skuk et Tremblay 2000b). Pour obtenir des succès de
greffe chez les primates excédant 60% de fibres positives pour la β-Galactosidase, il est
nécessaire d'effectuer des trajectoires d’injections séparées par seulement 1 mm (Skuk et al.
2002a). Le tissu musculaire représente plus de 40% de la masse corporelle et est réparti
dans environ 600 muscles différents. On se doit donc d’augmenter la capacité de migration
des cellules transplantées avant qu’elles ne fusionnent avec les fibres endommagées. Deux
types de solutions s'offrent à nous pour augmenter la dispersion des myoblastes à travers les
muscles ciblés. Il est possible d’injecter les cellules dans la circulation sanguine en espérant
que celles-ci atteignent les muscles ou on peut tenter de stimuler la capacité migratoire des
cellules greffées intramusculairement. Certains groupes ont expérimenté l'injection
intrasystémique de cellules souches ou myogéniques, mais obtenant des succès moindre
que ceux obtenus en faisant des injections directement dans le muscle (Neumeyer et al.
1992; Robinson et al. 1996; Ferrari et al. 1998; Skuk et al. 1999). On a montré que l'on
pouvait augmenter la dispersion des cellules autour du site d'injection en traitant les
cultures de myoblastes avec une lectine, la concanavaline A, 24 heures avant leur injection
dans le muscle (Ito et al. 1998). La concanavaline A est connue comme une molécule
pouvant induire l'expression des métalloprotéases qui sont des enzymes impliquées dans
l'augmentation de la locomotion cellulaire, l'invasion tumorale, mais également dans la
migration des myoblastes (El Fahime et al. 2000). La surexpression d'une métalloprotéase
ciblant la matrice extracellulaire, comme la matrilysine ou l’uPA, permet aux myoblastes
de former davantage de fibres hybrides (Caron et al. 1999) et d'augmenter leur dispersion
(El Fahime et al. 2002) respectivement, suite à la transplantation. L’utilisation de facteurs
de croissance comme l’IGF-I et le bFGF pour stimuler la dispersion radiale des myoblastes,
a permis de faire progresser de 300 µm à 900 µm la migration maximale hors du site
d’injection.
30
3.5.3.2 La mort rapide des myoblastes suite à l’injection
Plusieurs expériences suggèrent qu'un pourcentage élevé des myoblastes injectés dans les
muscles de souris meurent peu de temps après leur transplantation suite à la réponse
inflammatoire (Fan et al. 1996; Guérette et al. 1997; Beauchamp et al. 1999; Skuk et al.
2003). L’importance réelle de la mort rapide des myoblastes suite à la transplantation reste
encore controversée (Skuk et al. 2003). Cette cytotoxicité pourrait être causée par les
leucocytes infiltrant le muscle (Guérette et al. 1997) ou par l'activation de la cascade du
complément (Skuk et Tremblay 1998). Les agents anti-inflammatoires administrés aux
souris avant la transplantation, n'ont pas permis de réduire la mort des myoblastes, mais les
modifications génétiques des cellules du donneur avec le TGF-β (Merly et al. 1998), le
récepteur de l'Interleukine-1 (Qu et al. 1998) ou l'administration d'un anticorps contre le
LFA-1 (Guérette et al. 1997) ont permis d’augmenter la survie des cellules transplantées.
Plus récemment, on a démontré que la co-injection de Tubulyzine, une molécule stimulant
la régénération tissulaire, pouvait réduire la mort cellulaire des myoblastes injectés dans le
muscle (El Fahime et al. 2003).
3.5.3.3 Le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique Pour que la transplantation de myoblastes soit efficace chez les patients Duchenne, on se
doit de contourner les défenses immunes spécifiques de l'hôte. Deux possibilités s'offrent à
nous dans la perspective d’une greffe allogénique de cellules issues d’un donneur sain. On
peut immunosupprimer le receveur ou induire chez lui une tolérance spécifique aux cellules
du donneur. Le FK 506 (Tacrolimus) est très efficace pour immunosupprimer et empêcher
le rejet des myoblastes greffés, tant chez la souris (Kinoshita et al. 1994b) que chez le singe
(Kinoshita et al. 1996). Le FK 506 est couramment utilisé pour divers types de
transplantations, mais il demeure quand même toxique. Un traitement prolongé avec des
immunosuppresseurs peut causer des effets secondaires de neurotoxicité et de
néphrotoxicité (McDiarmid et al. 1995). Des protocoles d’induction de tolérance sont
présentement à l’étude dans diverses unités de recherche pour permettre l’acceptation de
transplantations cellulaires excluant la prise d’agents immunosuppresseurs. On a
31
développé, chez la souris, plusieurs protocoles permettant de prolonger l’acceptation de la
greffe par l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre des récepteurs (comme
le LFA-1, le CD-45, le CD-154 ) impliqués dans la signalisation entre les lymphocytes
(Guerette et al. 1997; Camirand et al. 2002). Même si les résultats sont prometteurs,
l’efficacité de ces approches doit aussi être démontrée chez l’humain. En effet,
contrairement aux agents immunosuppresseurs, l’induction de tolérance n’est pas encore
couramment utilisée chez l’humain.
Il est aussi possible de minimiser la réponse immune de l'hôte en lui transplantant ses
propres cellules modifiées pour exprimer la dystrophine, donc de faire une autogreffe de
cellules génétiquement modifiées pour exprimer le gène manquant (Floyd et al. 1998;
Moisset et al. 1998). Même si la greffe autologue de myoblastes génétiquement transformés
pour exprimer la dystrophine normale peut permettre de diminuer l'immunogénicité des
greffes de myoblastes, elle fait face à un nouveau problème. Les cellules satellites obtenues
de biopsies de patients DMD ont une capacité proliférative limitée. En effet, la capacité
proliférative des myoblastes isolés de patients DMD est faible (Decary et al. 1997). Il a été
avancé, que cette faible capacité proliférative, comparée à celle des myoblastes isolés
d'individus normaux, serait causée par un raccourcissement hâtif des télomères des cellules
myogéniques qui sont soumises à des cycles dégénérescence/régénération dans les muscles
dénués de dystrophine (Decary et al. 1997). On peut concevoir que les cellules satellites
d'un patient DMD puissent voir leur potentiel prolifératif être augmenté par l'expression
transitoire d’oncogènes ou de la télomérase, l'enzyme normalement responsable de
l'allongement des télomères chez les cellules souches hématopoïétiques.
3.5.4 Immortalisation des cellules myogéniques Plusieurs virus contiennent des oncogènes venant perturber le fonctionnement normal de la
cellule hôte pour favoriser sa progression dans le cycle cellulaire. Ces oncogènes viraux
peuvent contribuer à l’apparition de tumeurs. Malgré leur participation au développement
32
de certains cancers, on les utilise également pour immortaliser des cellules ayant une
capacité de prolifération limitée. Les principaux oncogènes étudiés jusqu’à maintenant pour
l’immortalisation de cellules humaines sont c-myc, E6/E7 de papillomavirus, E1A de
l’adénovirus et l'antigène T de SV40.
3.5.4.2 L’antigène T Le génome du virus SV-40 code pour l’antigène grand T (AgT), une oncoprotéine
impliquée dans l’immortalisation cellulaire. L’AgT est une phosphoprotéine nucléaire
contenant 708 acides aminés. Elle interagit avec plusieurs protéines cellulaires soient p53,
pRb, p107, DNA polymérase II, le facteur de transcription AP-2, la protéine de choc
thermique p73 et le TBP (TATA box binding protein). Les deux principales cibles de l’AgT
sont pRb et p53. Les protéines p53 et pRb sont en quelque sorte des suppresseurs de
tumeur, c’est-à-dire qu’elles empêchent la prolifération illimitée des cellules. En réponse à
un dommage causé à l’ADN, p53 immobilise la cellule dans le cycle cellulaire en phase G1
pour permettre à la cellule d’effectuer les réparations nécessaires avant de poursuivre son
cycle de réplication ou d’entrer en sénescence. La protéine p53, qui a une durée de vie très
courte, s’accumule dans les cellules où il y a des dommages à l’ADN ou celles qui ont subit
un stress important (Sherr 1996). pRb agit également au niveau G1 du cycle cellulaire.
Lorsque pRb est hypophosphorylé, il bloque le cycle cellulaire en G1. En présence de
cyclins-CDKs, il devient phosphorylé et les cellules peuvent progresser dans la phase S
(Mittnacht 1998). Une fois liées à l’AgT, pRb et p53 sont séquestrées et incapables de
participer normalement à la régulation du cycle cellulaire (Fig. 6).
33
Figure 6 Activation de la prolifération cellulaire par l’oncogène viral de SV-40.
Le virus SV-40 utilise une protéine multi-usages (antigène T) qui vient séquestrer les deux suppresseurs de tumeurs p53 et Rb. Le taux de p53 augmente lorsque l'ADN est endommagé ou lorsque les télomères ont atteint une longueur critique. p53 peut alors conduire la cellule vers l'apoptose ou stimuler la réparation de l'ADN ou provoquer l'arrêt du cycle. L'arrêt en G1 est en effet induit par p53 qui active la transcription du gène Cip1 codant pour p21, inhibiteur de cdk/cyclines. Rb est une protéine qui inhibe l’entrée dans la cycle cellulaire en séquestrant le facteur de transcription E2F. L'inactivation, sa séquestration ou l'absence de Rb favorise la progression dans le cycle cellulaire (adapté de Alberts 2002).
34
L’AgT fut utilisé très tôt pour étudier la possibilité d’augmenter la capacité proliférative
des cellules myogéniques (Shay et al. 1993; Morgan et al. 1994). Afin de se débarrasser des
effets oncogéniques indésirables à long terme inhérent à l’utilisation d’une oncoprotéine,
ces groupes ont privilégié l’utilisation d’une version thermosensible de l’AgT (Jat et Sharp
1989). Même si plusieurs types cellulaires ont été immortalisés avec l’AgT, ce sont les
expérience exécutées sur les myoblastes qui attirent le plus notre attention. On a démontré
qu’il était possible de produire une culture à long terme de myoblastes issus de patients
DMD (Simon et al. 1996b). Comme pour les exemples précédents, c’est la version
thermosensible de l’AgT, ayant une activité optimale à 33°C et inactive à 39°C, qui fut
utilisée. D’autres équipes avaient également effectué les mêmes expériences mais sur des
myoblastes humains normaux (Iujvidin et al. 1990), sur des fibroblastes isolés de rat (Jat et
Sharp 1989) et sur des myoblastes de souris mdx (Yang et al. 1992).
Comme l’utilisation d’une version thermosensible de l’AgT ne semblait pas suffisante pour
que les cellules immortalisées puissent recouvrer leur capacité à se différencier de façon
aussi efficace que des cellules normales, plusieurs équipes ont remplacé le promoteur
constitutif par un promoteur vimentine afin d’arrêter l’expression dans les cellules
fusionnées (Pincon-Raymond et al. 1991; Vicart et al. 1994; Deschenes et al. 1997). Bien
que les cellules modifiées avec l’AgT puissent conserver la capacité de fusionner en
culture, les travaux exécutés dans notre laboratoire indiquent que la participation à la
régénération in vivo demeure encore problématique (Seigneurin-Venin et al. 2000b). En
effet, en plus d'être immunogénique et de faciliter la dédifférenciation, l’AgT réduit
considérablement le succès de greffe lorsqu'il est présent dans les cellules transplantées
(Skuk et al. 2003).
Puisque l’utilisation d’oncogènes mutants thermosensibles est limitée par des
considérations de sécurité et d’efficacité, plusieurs groupes ont expérimenté
35
l’immortalisation conditionnelle à l’aide de vecteurs permettant l’excision de l’oncogène
(Westerman et Leboulch 1996; Berghella et al. 1999; Salmon et al. 2000). Dans ce système
expérimental, l’AgT entouré de sites LoxP est excisé en présence de la recombinase Cre. Le
vecteur recombinant transportant l’AgT et les sites LoxP est transféré dans les cellules
cibles à l’aide d’un rétrovirus. Leurs travaux montrent qu’il est possible d’immortaliser de
façon réversible les cellules douées d’une capacité proliférative limitée. Leur système
nécessite cependant une étape tardive d’infection massive pour exprimer la recombinase
Cre dans toutes les cellules. Dans la perspective d’une transplantation de plusieurs
centaines de millions de cellules myogéniques, l’utilisation de vecteurs intégratifs
résulterait en une très grande quantité d’événements d'intégration pouvant causer de la
mutagenèse par insertion. L’utilisation de vecteurs non intégratifs comme les adénovirus
permet d’éviter ces risques. Cependant les vecteurs adénoviraux codent pour des protéines
hautement immunogéniques qui persistent plusieurs jours après l’infection. Dans le cadre
d’une transplantation massive chez des patients DMD, il serait donc préférable de limiter
l’utilisation de vecteurs viraux.
Les oncogènes comme l’AgT ne permettent pas l’immortalisation complète des cellules
humaines. En effet, ils n’amènent la cellule qu’à ignorer le raccourcissement excessif des
télomères pendant environ 15 à 25 passages supplémentaires. Pour les cellules
myogéniques isolées des muscles des patients DMD, cet effet est encore plus limité et une
véritable immortalisation nécessite l’allongement des télomères. Pour certaines
applications, comme la greffe autologue d’une centaine de millions de cellules, une telle
expansion de la capacité proliférative pourrait être suffisante. Mais la modification
génétique, la prolifération nécessaire pour générer assez de cellules pour injecter dans
plusieurs muscles du patient, ainsi que les contrôles nécessaires pour s’assurer de la
sécurité de la procédure imposent une immortalisation impliquant l’allongement des
télomères.
36
3.5.4.3 Les télomères et la télomérase Les cellules de mammifères cultivées à partir de tissus somatiques ont une capacité
proliférative limitée. Après 10 à 40 divisions, elles atteignent une première limite (M1),
décrite pour la première fois par Hayflick (Hayflick 1965). Cette limite peut être
outrepassée avec des oncogènes viraux, comme nous l’avons vu plus tôt. Les cellules
exprimant des oncogènes immortalisants sont amenées à ignorer le fait que la réduction des
télomères approche alors un seuil critique (Fig. 7). Après encore une trentaine de divisons,
les cellules entrent en sénescence, i.e. qu’elles refusent de continuer à proliférer et adoptent
une morphologie caractéristique.
La sénescence chez les mammifères est due en partie au raccourcissement des télomères
imposé à chaque division cellulaire (Johnson et al. 1998). Les télomères sont situés aux
extrémités des chromosomes et sont composés de répétitions de la séquence TTAGGG
(Morin 1989). Durant la phase S, ils ne sont pas répliqués en entier par les polymérases et
raccourcissent de façon graduelle à chaque division cellulaire à moins que leur longueur ne
soient maintenus (Prescott et Blackburn 1999). La télomérase est un complexe protéique
ayant une activité de transcriptase inverse qui est impliquée dans l’immortalisation
cellulaire via l’allongement des télomères (Colgin et Reddel 1999). La télomérase est active
dans les cellules cancéreuses et les cellules germinales mais elle est absente des cellules
somatiques chez l’humain. La sous-unité catalytique de la transcriptase inverse humaine
(hTERT) a été clonée et on a démontré que son expression transitoire pouvait résulter en
une extension significative des capacités prolifératives des cellules en culture (Bodnar et al.
1998). On considère donc que les télomères sont en quelque sorte l’horloge mitotique
contenant l’information sur le nombre de divisions qu’a vécu une cellule (Prescott et
Blackburn 1999). On a démontré que l’expression seule de hTERT ne suffisait pas pour
immortaliser des myoblastes isolés de patients DMD (Seigneurin-Venin et al. 2000a). En
effet pour les immortaliser, la présence d'un oncogène viral est également nécessaire. Une
fois immortalisés avec l’AgT, des myoblastes DMD-Tag-Telo ont démontré une capacité
de prolifération extensive ainsi qu’une capacité à fusionner (Seigneurin-Venin et al. 2000a).
37
Figure 7 Implication des télomères dans la sénescence cellulaire.
Pendant la prolifération en culture, les cellules humaines voient leurs télomères diminuer en longueur. Plusieurs cellules montrent un arrêt dans le cycle cellulaire dépendant de Rb/p16 (M0, non illustré ici). Les cellules n’ayant pas été impliquées dans un processus de différenciation terminale peuvent ensuite entreprendre entre 40 et 50 divisions avant d’entrer en sénescence (M1), un état de crise dépendant de p53. Les cellules immortalisées avec un oncogène, comme l’AgT, peuvent franchir cette limite et ajouter entre 30 et 40 divisions avant d'atteindre la limite M2. L’allongement des télomères, à l’aide de la sous-unité catalytique (TERT) de la télomérase, peut permettre de franchir cette limite proliférative en maintenant la longueur des télomères (adapté de Prescott et Blackburn 1999 et de Johnson et al. 1998).
38
4 ième partie: TAT ET LES DOMAINES DE TRANSDUCTION PROTÉIQUES
4.1 La protéine Tat du VIH-1 Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) code pour la petite protéine activatrice de
la transcription Tat (Jeang et al. 1999). Tat est nécessaire pour la réplication et est
relativement conservée chez tous les lentivirus ciblant les primates (Ruben et al. 1989). La
fonction première de Tat est de réguler la transcription du promoteur LTR (Long Terminal
Repeat) du VIH-1. Tat se lie aux structures TAR (Transactivation Responsive Elements)
présentes en 5’ de l’ARN messager viral (Brigati et al. 2003). Par cette interaction, Tat
recrute une série de complexes de transcription qui modifient la conformation de la
chromatine au site d’intégration proviral et qui phosphorylent l’ARN polymérase II pour
promouvoir l’élongation de la transcription de l’ARN viral (Kao et al. 1987). NF-κB est
impliqué dans l’activation de plusieurs gènes qui viennent subséquemment augmenter
l’expression à partir du promoteur LTR (Brigati et al. 2003). Toutes ces fonctions cumulées
sont responsables de l’augmentation de plus de mille fois du taux de transcription de l’ARN
proviral en présence de Tat (Jeang et al. 1999). Deux isoformes de la protéine existent; une
de 101 acides aminés qui est générée par l’épissage complet de l’ARN messager et une
isoforme de 72 acides aminés qui résultent d'un épissage incomplet (Fig. 8). Puisque la
transcriptase inverse du VIH n'est pas très fiable et génère des mutations, il existe plusieurs
variantes de la protéine Tat dans la population infectée.
39
Figure 8 Génome et transcription du VIH-1.
Le transcrit primaire du VIH-1 contient de multiples sites accepteurs et donneurs qui peuvent générer plus de 30 ARNs messagers alternatifs dont plusieurs sont polycistroniques. L’ARN non épissé peut générer les protéines virales Gag et Gag-Pol ou l'ARN génomique destiné à l'empaquetage. Les transcrits épissés de façon incomplète codent pour Env, Vif, Vpu, Vpr et Tat (72 a.a.) alors que ceux dont les deux introns ont été épissés codent pour Rev, Nef et Tat (101 a.a.) (adaptée de Jeang et al. 1999).
40
En plus de ses fonctions transcriptionnelles, Tat exhibe plusieurs autres propriétés
inhabituelles pour un facteur de transcription. Tat peut être libéré de la cellule infectée par
le VIH-1 pour entrer dans les cellules voisines tout en conservant sa propriété de
transactivateur (Frankel et Pabo 1988). Tat peut se lier au récepteur flk-1/KDR et activer la
tyrosine kinase qui lui est associée (Albini et al. 1996). Tat se lie également à d’autres
récepteurs comme l’intégrine αvβ5 (Vogel et al. 1993; Weeks et al. 1993). Dans certaines
circonstances, Tat manifeste des activités comparables à un facteur de croissance et montre
des propriétés immunosuppressives. Elle est aussi impliquée dans la pathogenèse du
sarcome de Kaposi (Watson et Edwards 1999). Tat favorise la progression de cette
pathogenèse en induisant l’expression de molécules d’adhésion, en modulant l’apoptose des
cellules, en induisant l’angiogenèse, en stimulant la croissance et la prolifération des
cellules tumorales, en induisant la chémotaxie et en induisant la réplication du HSV-8
(Foreman et al. 2001).
4.2 Le domaine de transduction de Tat, un historique Tat possède une séquence peptidique, baptisée domaine de transduction protéique (DTP),
conférant à cette protéine la propriété d’être transportée à l’intérieur des cellules sans
l’intermédiaire d’un récepteur spécifique (Ezhevsky et al. 1997). Ce domaine peptidique
fusionné à d'autres protéines ou macromolécules permet leur internalisation leur donnent
ainsi accès au cytoplasme (Mann et Frankel 1991). La protéine Tat, synthétique ou purifiée,
peut après son internalisation dans le cytoplasme, se concentrer au noyau et transactiver la
transcription de gènes viraux (Frankel et Pabo 1988; Green et Loewenstein 1988). Suite à la
mort ou suite à un processus de transport encore mal caractérisé, Tat peut être relarguée de
la cellule infectée par le VIH pour ensuite être internalisée dans une cellule voisine non
infectée (Ensoli et al. 1993) et venir transactiver l'expression de gènes comme celui du
TNF-α (Buonaguro et al. 1992) et certaines interleukines (Scala et al. 1994). Mann et
Frankel furent les premiers à suggérer l’utilisation de Tat comme instrument pour faciliter
la transduction intracellulaire de protéines ou de macromolécules d'intérêts (Mann et
Frankel 1991).
41
Ce sont des chercheurs de la compagnie Biogen qui furent les premiers à exploiter Tat
comme un outil de transport de protéines comme la β-galactosidase à l’intérieur des
cellules (Fawell et al. 1994). Ils déterminèrent également que c’est le domaine situé entre
les acides aminés 37 et 72 qui était responsable de l’internalisation de cargos hétérogènes.
Suite à l’injection intraveineuse de Tat(37-72)-β-galactosidase, l’enzyme fut détectée dans
le foie, le cœur, la rate, et dans une moindre mesure les poumons et les muscles (Fawell et
al. 1994). Ce sont les groupes de Dowdy (Ezhevsky et al. 1997) et de Lebleu (Vives et al.
1997) qui ont identifié le domaine basique minimal (a.a. 49-57) responsable de la
transduction intracellulaire de la protéine Tat (Fig. 9). C’est en 1997 que Tat a cessé de
n’être qu’une curiosité scientifique pour être utilisée comme instrument d’étude de la
fonction de Rb dans le cycle cellulaire (Ezhevsky et al. 1997). En effet, la première
méthode pratique pour exploiter les propriétés de Tat fut développée par le groupe de
Dowdy. Dans ce système, des protéines d’intérêt fusionnées au DTP de Tat sont purifiées à
partir de lysats de bactéries par une série de chromatographies (Schwarze et al. 2000) (Fig.
10).
42
Figure 9 Tat du VIH-1, Séquence et structure.
(A) Séquence et structure secondaire de l’ARN reconnue par Tat (d’après Rana et Jeang, 1999). (B) Régions composant la protéine Tat de HIV-1 (d’après (Rana et Jeang 1999). (C) Séquence des acides aminés de Tat (#d’accès Genbank :AAL12703). En rouge, le domaine basique, composante minimale de tous les domaines de transduction protéiques basés sur Tat. (D) Structure du domaine de transduction de la protéine Tat (d’après (Ho et al. 2001). Le domaine de transduction de Tat forme une hélice amphipathique, i.e. ayant une distribution asymétrique des charges favorisant une de ses faces. Sur la représentation tridimensionnelle, les résidus chargés positivement sont illustrés en bleu. La vue à 90° montre un côté gauche très chargé (bleu), principalement constitué de résidus arginines, et un côté droit neutre.
43
Un protocole de purification de protéine recombinante polyhistidine-Tat (Fig. 10) a été
utilisé avec succès pour transduire une variété de types cellulaires résultant en des
phénotypes mesurables pour plusieurs protéines dont p16, p27, E1A, E7, caspase-3, Rho,
Rb et etc...(Tableau 1). C’est la publication des études effectuées in vivo chez la souris avec
la Tat-β-Galactosidase qui attira l'attention de la communauté scientifique sur le potentiel
du domaine basique de Tat pour la transduction protéique (Schwarze et al. 1999). On
démontra suite à l’injection intrapéritonéale de Tat-β-Galactosidase, que l’activité
enzymatique de la β-Galactosidase pouvait être détectée dans presque tous les tissus de la
souris, incluant le cerveau, ce que les auteurs interprétèrent comme la démonstration que
les protéines de fusion Tat pouvaient traverser la barrière hémato-encéphalique (Schwarze
et al. 1999). Dans les années qui suivirent, une multitude de nouvelles applications
technologiques émergèrent de plusieurs laboratoires (Chellaiah et al. 2000; Kwon et al.
2000; Wender et al. 2000; Caron et al. 2001; Embury et al. 2001; Kunieda et al. 2002).
Cependant, le mécanisme permettant la transduction intracellulaire des protéines de fusion
Tat resta nébuleux et incertain, sinon controversé.
L’observation que certaines protéines soient douées de la capacité d’être internalisées sans
utiliser des récepteurs spécifiques a attiré beaucoup d’intérêts pour le développement de
nouveaux outils de transduction cellulaire. Une grande variété de cargos ont été transportés
à l’intérieur de cellules à l’aide du DTP de Tat. En effet, les expériences de transduction
intracellulaire ne sont pas restreintes aux protéines (Fawell et al. 1994); des
oligonucléotides (Astriab-Fisher et al. 2000), des liposomes (Torchilin et al. 2001), des
phages (Eguchi et al. 2001) et de courts peptides (Dostmann et al. 2000) ont aussi été
internalisés avec le DTP de Tat.
44
Figure 10 Stratégies de purification de protéines de fusion Tat.
Le vecteur d’expression bactérien pTat produit une protéine de fusion avec une séquence de polyhistidine et le DTP de Tat attachés à l’extrémité N-terminale. Les bactéries (BL21) induites sont soumises à une sonication pour fragmenter l'ADN et extraire les protéines insolubles des corps d’inclusion. Les protéines sont purifiées sous une forme native ou dénaturée selon les besoins. En conditions dénaturantes, les lysats sont ensuite chargés successivement sur une colonne d'affinité (Ni-NTA), une colonne échangeuse d'ions (Sépharose Q) et une colonne de filtration sur gel (PD-10). En conditions natives, les protéines sont soniquées dans un tampon phosphate/NaCl avant d’être chargées sur la colonne Ni-NTA, éluées avec de l'imidazole et dialysées dans un tampon permettant une conservation efficace à -80°C.
45
Tableau 1 Cargos internalisés par la domaine de transduction de Tat
Protéine Type cellulaire Réponse observée Référence Anticorps Carcinome Immunospécificité (Anderson et al. 1993}
β-Galactosidase Hela, NIH 3T3, Cos....etc,
ainsi que plusieurs tissus
Cellules bleues (Fawell et al. 1994},
(Schwarze et al. 1999}
P27Kip1
inhibiteur de Cdk
Jurkat, carcinomes
hépatiques
Division cellulaire et
migration (Nagahara et al. 1998}
Caspase-3 Jurkat Apoptose (Vocero-Akbani et al.
1999}
eGFP fibroblastes, myoblastes Fluorescence (Caron et al. 2001}
Catalase PC12, peau de souris Augmentation de la viabilité
cell. suite à un stress oxydatif
(Jin et al. 2001}
RhoA éosinophiles humains Migration (Alblas et al. 2001}
H-Ras éosinophiles humains Activation de ERK-1/2 et
survie
(Hall et al. 2001}
Filamin-1 HEK-293 Activation de ERK-1/2 (Hjalm et al. 2001}
Bcl-Xl cellules pancréatiques Diminution de l’apoptose (Embury et al. 2001}
p16 fibroblastes humains Progression dans le cycle
cellulaire
(Ezhevsky et al. 1997}
HPC-1 PC12 Relarguage de noradrénaline
et de dopamine
(Fujiwara et al. 2001}
Cdc42 cellules endothéliales Augmentation de la motilité
cellulaire endothéliale
(Soga et al. 2001}
APO-BEC-1 hépatocytes Augmentation de la sécrétion
de VLDL
(Yang et al. 2002a}
Recombinase
CRE
fibroblastes CV-1,
splénocytes, cellules
souches embryonnaires
Recombinaison de sites LoxP (Peitz et al. 2002}
46
4.3 Les domaines de transduction protéiques Tat n’est pas la seule protéine qui puisse être internalisée de façon efficace par les cellules.
D’autres protéines exhibent des propriétés similaires, comme la protéine antennapedia
(ANTP) de Drosophila (Derossi et al. 1994) et VP-22 du virus de l’herpes (HSV-1) (Elliott
et O'Hare 1997) (Tableau 2). On a rapporté que VP-22 de HSV-1, une protéine structurale
de 38 kDa qui ne contient pas de séquence d’exportation, pouvait être sécrétée dans le
milieu de culture par la cellule infectée pour être ensuite internalisée par des cellules
voisines non infectées (Elliott et O'Hare 1997). De plus, les auteurs ont montré que VP-22
était dirigée et accumulée au noyau par les cellules receveuses. Des homéoprotéines comme
ANTP de Drosophila, HoxB4, Engrailed du poulet HoxA5 et Penetratin, une séquence
synthétique dérivée de ANTP seraient sécrétées et réinternalisées suivant des voies non
conventionnelles (Prochiantz 2000). Les séquences cationiques répétées comme les poly-
arginines ont également démontré la capacité de médier l’internalisation de cargos variés
comme des peptides, des molécules non polaires (Tanaka et al. 1998) ou des enzymes
comme la β-Galactosidase (Mai et al. 2002).
Il est à noter que plusieurs autres domaines de transduction synthétiques ont été dérivés de
Tat, ANTP, Transportan et FGF. La liste dépasse maintenant une centaine de variations
ayant des efficacités variables selon les conditions testées (Tableau 2). Les principaux types
de séquences caractérisées jusqu’à maintenant sont : les peptides fortement cationiques
(poly–arginines/lysines/histidines), les hélices amphipathiques (Tat, VP-22, Penetratin,
ANTP), les hélices hydrophobes (Peptide signal, Transportan) et finalement le peptide Pep-
1, un peptide de synthèse où un domaine hydrophobe à été lié à un domaine cationique.
47
Tableau 2 Principaux domaines de transduction et séquences référencées dans la littérature.
Domaine Séquence Références Tat (DTP) : YGRKKRRQRRR (Green et Loewenstein
1988}, (Frankel et Pabo
1988}
Peptide signal (NF-
κB)
AAVALLPAVLLALLAP (Lin et al. 1995}
SLN (FGF-1, aFGF
ou HBGF-1)
NYKKPKL (Imamura et al. 1990}
Antennapedia
(ANTP), Penetratin
RQIKIWFQNRRMKMKK (Derossi et al. 1994},
(Prochiantz 2000}
Transportan GWTLNSAGYLLGPHIDNHRSFHDKYGLA (Pooga et al. 1998}
SLN (AgT SV-40) PKKKRKV (Jo et al. 2001}
VP-22 (HSV-1) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (Elliott et O'Hare 1997}
Poly-arginines 5R - 12R (aussi poly-D-arginines) (Wender et al. 2000}, (Mai
et al. 2002}, (Mi et al.
2000}
Poly-lysines 5K - 12K (Murphy et al. 1998}
Poly-histidines 5H - 6H (Mai et al. 2004},(Kichler
et al. 2003}}
Pep-1 KETWWETWWETWSQPKKKRKKV (Morris et al. 2001}
48
4.4 Mécanismes d’entrée Depuis la découverte des propriétés étonnantes exhibées par les protéines contenant des
domaines de transduction comme Tat, VP-22, ANTP et les fibroblast growth factors
(FGFs), plusieurs études furent entreprises pour élucider leur mécanisme d’entrée. Tous les
modèles exposés ne sont pas mutuellement exclusifs et ils peuvent potentiellement
s’appliquer en partie à certains domaines, malgré leur homologie de séquence et/ou
seulement à certains types de cargos. Par exemple, il est possible que les séquences
peptidiques hydrophobes (Transportan, peptide signal du FGF-4) puissent s’infiltrer à
travers la bicouche lipidique de la membrane plasmique, alors que des cargos massifs
comme des phages recouverts à leur surface par des séquences cationiques ne soient
internalisés qu’à l’aide de l’endocytose classique. Mais, avant d’élaborer sur l’étude du
mécanisme d’entrée des domaines de transduction protéique, il serait préférable de réviser
les restrictions imposées par la membrane plasmique ainsi que les voies de transport
transmembranaire déjà bien caractérisées.
4.4.1 La membrane plasmique et le transport transmembranaire La membrane plasmique des cellules eucaryotes exerce de multiples fonctions dans la vie
cellulaire. Elle est constituée de phospholipides, de glycolipides, de cholestérol et de
protéines (Fig. 11). Une bicouche phospholipidique lui donne une structure fluide et la rend
relativement imperméable à la plupart des molécules et macromolécules solubles dans l’eau
(Darnell et al. 1993). La membrane plasmique constitue une barrière imperméable séparant
les milieux externes et internes de la cellule et elle permet des échanges contrôlés entre les
deux compartiments. En effet, la surface externe de la membrane plasmique est criblée de
protéines comportant des sites de reconnaissances spécifiques qui permettent la réception
de signaux moléculaires de différentes origines. Elles sont capables d'adapter leur forme
très rapidement pour, par exemple, résister à des cycles de contraction/relaxation des
cellules musculaires.
49
Les microdomaines nommés radeaux lipidiques “lipid rafts” sont des régions spécialisées
de la membrane où des composantes comme les glycosphingolipides, le cholestérol et
certaines protéines y sont concentrées (Brown et London 1997; Rietveld et Simons 1998).
Les radeaux lipidiques se forment dans le réseau trans-golgien et dans la membrane
plasmique quand les glycosphingolipides et le cholestérol s'associent en des microagrégats.
Les sphingolipides ont tendance à contenir des chaînes d'acides gras plus long (en parti
parce qu'ils sont saturés), formant ainsi une bicouche phospholipidique plus épaisse que
dans le restant de la membrane. Les protéines de membranes qui sont constituées de
domaines transmembranaires plus longs que la moyenne se regroupent ainsi dans ces
radeaux. De plus, les radeaux lipidiques contiennent préférentiellement des protéines
ancrées au GPI et quelques lectines qui peuvent aider à stabiliser cet assemblage (Alberts et
al. 2002).
À cause de son intérieur hydrophobe, la bicouche lipidique de la membrane cellulaire
constitue une barrière au passage des molécules chargées. Cette fonction est cruciale
puisqu’elle permet de conserver une concentration ionique interne différente de
l’environnement extérieur à la cellule (Alberts et al. 2002). Seules les petites molécules
hydrophobes ou chargées et non polaires comme les gaz (l’oxygène, l’azote, le CO2) ou des
molécules comme l’urée, le glycérol, le benzène, le glucose ou les stéroïdes peuvent
diffuser à travers la bicouche phospholipidique. La diffusion facilitée, les canaux ioniques
ainsi que le transport actif sont des voies qui permettent l’internalisation de molécules
chargées, mais ils ne permettent pas l'entrée de grosses molécules comme les protéines. Ces
voies ne sont donc pas des candidates pour expliquer l'internalisation de protéines
fusionnées à un DTP puisqu'elles sont réservées à des molécules de petites tailles.
50
Figure 11 Représentation schématique de la bicouche phospholipidique qui constitue la structure fondamentale des membranes biologiques.
La bicouche phospholipidique constitue la structure de base des membranes biologiques. Les queues d'acides gras hydrophobes constituants les phospholipides forment le milieu de la bicouche, les têtes hydrophiles des phospholipides s'enlignent aux surfaces internes et externes de la membrane. Les protéines intégrales ont une ou plusieurs régions transmembranaires enchâssées dans la membrane. Les protéines périphériques sont associés de façon préférentielle avec la membrane par des interactions protéine-protéine. Les oligosaccharides se lient principalement aux protéines de la membrane; cependant quelque uns se lient aux lipides pour former des glycolipides (adapté de Darnell et al. 1993).
51
Certaines cellules, comme les neutrophiles et les macrophages, exercent une forme
spécialisée d’endocytose que l’on appelle la phagocytose. Cette dernière est peu répandue
contrairement à l’endocytose. Virtuellement toutes les cellules eucaryotes ingèrent de façon
continuelle des petits morceaux de leur membrane plasmique en formant des petites
vésicules endocytiques qui seront plus tard retournées à la surface (Alberts et al. 2002)
(Fig. 12).
L’internalisation des vésicules formées à la membrane permet l’entrée de toutes les
substances extracellulaires dissoutes dans la phase fluide. Pour la plupart des cellules
animales, les puits tapissés de clathrines offrent une voie efficace pour internaliser des
molécules spécifiques présentes dans le milieu extracellulaire. Ce processus est nommé
l’endocytose médiée par des récepteurs (Alberts et al. 2002). L’endocytose commence par
la formation de puits recouverts de clathrines. Les vésicules formées se séparent rapidement
de la membrane et entrent dans le trafic intracellulaire qui les amènera vers les endosomes
tardifs. Les particules internalisées seront ensuite soumises à un mécanisme de triage
complexe pouvant les diriger vers l’appareil de Golgi, vers les lysosomes pour être
dégradées ou même vers le noyau. En plus de l’internalisation par des vésicules tapissées
de clathrines, il y a aussi un autre mécanisme par lequel les cellules peuvent former des
vésicules d’internalisation. L’endocytose cavéolaire se forme dans des régions riches en
radeaux lipidiques (Le et Nabi 2003). Les cavéoles sont des invaginations ayant la forme de
petits flasques lisses. La formation de ces structures est indépendante de la présence de
clathrines. L’internalisation des radeaux lipidiques est plutôt associée aux cavéolines
(cavéolines-1, 2 et 3), des protéines qui tirent évidemment leur nom de cette association (Le
et al. 2002). Ce sentier d’internalisation est aussi utilisé par certains rétrovirus, des AAVs et
des toxines comme celle du choléra (Le et al. 2002).
52
Figure 12 Représentation schématique simplifiée des compartiments intracellulaires impliqués dans l’endocytose et la sécrétion de macromolécules.
Les compartiments illustrés communiquent entre eux et avec l'extérieur de la cellule à l'aide des vésicules de transport. Dans la voie de sécrétion biosynthétique (en rouge), les protéines sont transportées du RE vers la membrane ou vers les lysosomes. Dans la voie endocytique (en vert), les molécules sont ingérées dans les vésicules dérivées de la membrane plasmique et dirigées vers les endosomes précoces et ensuite vers les lysosomes (via les endosomes tardifs). Plusieurs molécules endocytées sont redirigées des endosomes vers la surface de la cellule pour être réutilisées; de façon similaire, quelques molécules sont redirigées des endosomes tardifs vers le Golgi et quelques unes sont retournées au RE. Ces voies de transport rétrograde sont illustrées en bleu (adapté de Alberts et al. 2002).
53
4.4.2 Mécanismes d’entrée des domaines de transduction Les toutes premières études sur l'internalisation de la protéine Tat montrèrent une
distribution intracellulaire ponctuée, mais elles suggéraient aussi que cette internalisation
était due à une liaison non spécifique à la membrane (Mann et Frankel 1991). De plus,
Mann et Frankel démontrèrent que la co-incubation en présence d’héparine, de sulfate
d’héparane, d'un anticorps monoclonal dirigé contre Tat ou l’incubation à 4°C inhibait
l’internalisation (Mann et Frankel 1991). Toutes ces données, à l’exception de l’absence
d’un récepteur spécifique, pointaient vers un mécanisme classique d’internalisation par
endocytose. L’implication du domaine basique de Tat (a.a. 48-57) dans ces propriétés de
transduction furent établies par des études fonctionnelles et structurales (Fawell et al. 1994;
Vives et al. 1997). Ce sont les travaux des groupes de Prochiantz (Derossi et al. 1994),
O'Hare (Elliott et O'Hare 1997), Hawiger (Hawiger 1999) et Dowdy (Nagahara et al. 1998),
décrivant des modèles d’entrée cellulaire indépendants des récepteurs et efficaces à 4°C qui
sont venus suggérer un mécanisme de translocation non classique et indépendant de
l’endocytose.
Certaines séquences peptidiques hydrophobes comme celle contenue dans le peptide signal
permettent aux protéines de s'enchâsser dans la membrane plasmique. Une protéine
contenant une séquence hydrophobe à une de ses extrémités pourraient donc pénétrer les
membranes ou les vésicules phospholipidiques pour médier la translocation membranaire
du cargo protéique dans son entier (Hawiger 1999). On postule donc que ces séquences
puissent agir comme un front avancé “Leading Edge” permettant l’entrée de séquences ou
de cargos greffés (Lin et al. 1995) (Fig. 13). Une autre hypothèse, cette fois-ci impliquant la
présence de résidus cationiques dans la séquence d’importation, fut émise par le groupe de
Prochiantz. Utilisant l’ANTP comme séquence modèle, ils proposèrent que ce peptide
amphipatique provoque l’apparition de micromicelles pouvant déstabiliser la membrane et
résulter en une translocation du cargo (Derossi et al. 1996; Prochiantz 2000). La première
étape de ce processus consiste en une interaction entre la portion cationique du peptide et la
portion chargée négativement des lipides de la membrane plasmique (Fig. 14). La présence
de résidus hydrophobes comme le tryptophane sur la face opposée aux acides aminés
54
cationiques provoquerait la formation de micelles permettant l’entrée subséquente du cargo.
L’étude des caractéristiques majeures de l’internalisation des peptides issus de Tat et ANTP
a indiqué que leur entrée était très rapide (moins de 10 minutes) et qu’elle n’était pas
inhibée à basse température (Derossi et al. 1996; Vives et al. 1997; Schwarze et al. 1999).
Les travaux exécutés par le groupe de Dowdy ont révélé, par la suite, que la translocation
de protéines de fusion Tat à travers la membrane plasmique nécessitait la dénaturation
préalable de celles-ci pour qu'elles puissent s’infiltrer à travers le feuillet bilipidique et
outrepasser les restrictions de taille et de charge imposées par la membrane (Fig. 15)
(Nagahara et al. 1998; Schwarze et Dowdy 2000). Il existe cependant peu de preuves
expérimentales non-ambiguës qui puissent confirmer l’absence d’effets inhibiteurs de
l’incubation à 4°C sur l’internalisation de protéines complètes (Vives et al. 2003).
Le modèle de l’endocytose par adsorption (Fig. 16) proposé initialement par le groupe de
Frankel fut peu étoffé par la suite (Mann et Frankel 1991). Ceux-ci avaient montré que la
co-incubation de la protéine recombinante Tat avec la chloroquine, un agent
lysosomotropique inhibant l'acidification des endosomes, augmentait de façon significative
la transactivation du promoteur LTR du VIH contenu dans des cellules. Plus récemment,
des études ont démontré que les sulfates d’héparanes associées à la surface des cellules
agissaient comme récepteurs pour les protéines de fusion Tat ajoutées au milieu
extracellulaire (Tyagi et al. 2001). En effet, des cellules modifiées pour être déficientes
dans la biosynthèse des protéoglycanes constituées de sulfate d’héparane montrent une
capacité très limitée à internaliser des protéines de fusion GST-Tat-eGFP. Puisque
l’internalisation des peptides cationiques peut être restaurée en pré-traitant les cellules
déficientes dans la biosynthèse des protéoglycanes avec du dextran sulfate, on a émis
l’hypothèse que cette interaction est un événement précoce favorisant la forte concentration
de peptides cationiques à proximité de la membrane (Mai et al. 2002).
55
Figure 13 Modèle du "Leading edge" de l’importation de peptides contenant un signal de translocation membranaire hydrophobe.
Les peptides perméables aux cellules sont construits en utilisant la région h du peptide signal (représenté par une hélice dans la portion avancée de la protéine) lié de façon covalente au domaine amino-terminal ou au domaine carboxy-terminal d'une protéine intracellulaire d'intérêt (adapté de Hawiger 1999).
56
Figure 14 Modèle de la translocation transmembranaire de peptides hydrophobes via la formation de micelles inversées.
Suivant l’adhésion des peptides, le résidu W48 contenu dans la Penetratin déstabilise la membrane et induit la formation de micelles inversées. (A) Les peptides sont emprisonnés dans les micelles, qui s’ouvrent ensuite vers l’intérieur de la cellule. (B) Les micelles perturbent la structure de la bicouche lipidique, permettant la translocation du peptide (adapté de Prochiantz 2000).
57
Figure 15 Modèle de la translocation membranaire de protéines de fusion Tat dénaturées.
(a) Les charges positives du DTP de Tat permettent le contact avec les charges négatives de l’extérieur de la membrane plasmique. (b) La protéine transloque à travers la membrane sous une forme dénaturée. (c) Un fois internalisée dans le cellule, des membres de la famille des protéines de choc thermique renaturent la protéine sous sa forme active. (adapté de Schwarze et Dowdy 2000).
58
Figure 16 Modèle de l’endocytose des protéines de fusion Tat.
Le domaine de transduction cationique fortement chargé des protéines de fusion Tat est adsorbé à la surface des glycoprotéines contenant des sulfates d’héparanes. Ils sont ensuite internalisés dans la cellule par un processus d’endocytose classique.
L’hypothèse voulant que les protéoglycanes formées d’héparane sulfate agissent comme
récepteurs pour les protéines de fusion Tat est supportée par le fait que les protéines de
fusion Tat peuvent être internalisées dans virtuellement tous les types cellulaires. Aucun
récepteur spécifique à Tat n’a encore été identifié dans tous les types cellulaires transduits
(Tyagi et al. 2001). Cependant l’endocytose ne peut être responsable de l’internalisation
rapide des DTPs au noyau (en moins de 10 minutes) telle que décrite par plusieurs groupes
(Vives et al. 1997; Schwarze et al. 1999; Mai et al. 2002). Par contre, des observations
récentes soulèvent un doute sur la validité de plusieurs expériences démontrant cette rapide
localisation nucléaire. En effet, on a observé que la fixation au méthanol des cellules
traitées avec des peptides constitués de domaines de transduction issus de VP-22, un
polypeptide cationique comme le DTP de Tat, pouvait mener à une localisation nucléaire
artéfactuelle des protéines adsorbées à la surface cellulaire (Lundberg et Johansson 2001).
Ces auteurs en concluent que certaines des expériences démontrant une localisation rapide
au noyau ne pourraient être que le résultat d’une fixation inadéquate, résultant en une
perméabilisation nucléaire (Lundberg et Johansson 2001). Comme les peptides cationiques
sont très avides des acides nucléiques, la localisation nucléaire rapide souvent observée
pour Tat ou VP-22, ne serait qu’un artéfact post-fixation.
60
5ième partie : Hypothèse de travail et objectifs
5.1 Résumé de la problématique La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie causée par l’absence de
dystrophine, qui cause une dégénérescence progressive des muscles squelettiques et
cardiaque. Les garçons atteints ont une espérance de vie d’environ 20 ans. Même si la prise
de certains médicaments peut ralentir la progression de la maladie, il n’existe à ce jour
encore aucune thérapie curative. La transplantation cellulaire et la thérapie génique médiée
par des virus recombinants sont handicapées par la réponse immune spécifique qui réduit
l’efficacité des traitements et impose l'immunosuppression. Idéalement, la correction
génétique ex vivo des myoblastes du patient suivie par leur transplantation devrait réduire
l'incompatibilité. Cependant, la capacité proliférative limitée des myoblastes isolés de
patients DMD limite notre habilité à les modifier génétiquement et à les proliférer pour leur
utilisation dans le contexte de la transplantation de myoblastes. Les myoblastes de patients
DMD peuvent être proliférés seulement s'ils sont transformés par un oncogène
immortalisant. L'excision de cet oncogène juste avant la transplantation est possible, mais
nécessite une dernière modification génétique potentiellement risquée.
.
5.2 Hypothèse de travail La technologie de la transduction de protéines pourrait permettre de franchir certains des
obstacles ayant restreint le développement de la thérapie génique directe et de la
transplantation cellulaire. En effet, les protéines de fusion Tat ont démontré la capacité de
transduire plusieurs tissus in vivo. Puisque les muscles sont bien irrigués, des protéines de
fusion Tat injectées dans la circulation sanguine devraient pouvoir atteindre les cellules
musculaires pour y introduire leur cargo. Cette technologie pourrait ultimement servir à
transporter directement une protéine permettant de suppléer à l’absence de dystrophine
fonctionnelle.
61
La transduction de protéines pourrait également contribuer à la manipulation des cellules
myogéniques avant la greffe. On a montré qu'il est possible de faire proliférer des
myoblastes issus de patients DMD en utilisant un vecteur rétroviral codant pour l'AgT
flanqué de sites LoxP. Les protéines de fusion Tat peuvent efficacement transduire des
cargos protéiques actifs dans les cellules en culture pour modifier leur comportement. Une
protéine de fusion Tat-Cre pourrait servir de vecteur pour générer la recombinaison
nécessaire à la réversion de l'immortalisation, diminuant ainsi les risques de tumorigénicité
associés à l’utilisation d'oncogènes viraux et de vecteurs intégratifs juste avant la
transplantation.
Même si les domaines de transduction protéiques suscitent beaucoup d'intérêts, leur
efficacité demeure relativement limitée et controversée. En effet, même si les premières
études indiquèrent que les protéines de fusion Tat étaient internalisées dans virtuellement
tous les types cellulaires ainsi que dans une variété de tissus vivants, les publications
démontrant des applications fonctionnelles restent peu nombreuses. Pour expliquer cette
contradiction apparente, nous émettons l'hypothèse que l'entrée des protéines de fusion Tat
n'est pas médiée par une translocation membranaire, mais par un processus d'endocytose
classique. Ainsi, comme c'est le cas pour les vecteurs viraux et les méthodes de
transfection, le passage de la membrane plasmique ne garantirait pas nécessairement une
localisation intracellulaire correcte ou l'intégrité du cargo.
5.3 Objectifs Même si certains groupes ont déjà utilisé des protéines de fusion Tat pour cibler des
cellules en culture ou certains tissus in vivo, aucune étude du potentiel de cette technologie
ne s’est intéressée au muscle. De plus, le mécanisme impliqué dans l’internalisation des
protéines de fusion Tat reste encore mal compris, ce qui a limité leur efficacité comme outil
62
pour manipuler les culture cellulaires. Notre travail s’est concentré sur trois objectifs
principaux :
1- Tester le potentiel in vivo des protéines de fusion Tat à être internalisées dans les fibres
musculaires;
2- Mieux comprendre le mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat afin
d’optimiser le ciblage fonctionnel dans les cellules en culture;
3- Développer un protocole d’immortalisation conditionnelle et transitoire des myoblastes
de patients DMD en utilisant la transduction de protéines comme instrument.
63
Chapitre 2:
Transport intracellulaire d’une protéine de fusion Tat-eGFP dans les cellules musculaires
Nicolas J. Caron, Yvan Torrente, Geoffrey Camirand, Mathieu Bujold, Pierre Chapdelaine,
Karine Leriche, Nereo Bresolin et Jacques P. Tremblay
Contribution de chaque auteur:
J’ai effectué le travail dans son entier, à l'exception de la Fig.5H, et rédigé l’article. Yvan
Torrente a mis au point les techniques chirurgicales et a effectué les injections intra-
artérielles pour les expériences liées à la Fig.5H. Mes collègue Goeffrey Camirand et
Mathieu Bujold ont fourni une assistance technique pour les expériences animales et Karine
Leriche a effectué la culture des fibroblastes humains. Pierre Chapdelaine a été un guide
irremplacable à mes premières armes en purification de protéines. Jacques P. Tremblay et
Nereo Bresolin ont supervisé ces travaux.
(publié dans Molecular Therapy en mars 2001)
64
Résumé La protéine Tat du VIH-1, lorsque fusionnée à une protéine ou un peptide, peut traverser les
membranes biologiques en suivant un processus nommé la transduction protéique. Nous
avons purifié une protéine de fusion Tat-eGFP à partir de cultures bactériennes pour étudier
la cinétique d'internalisation dans les cellules myogéniques en culture et dans les fibres
musculaires in vivo. In vitro, Tat-eGFP atteint un niveau d’accumulation intracellulaire
maximal en 30 minutes, alors que la fluorescence de l'eGFP n'est détectée qu’après 14
heures. Le signal de localisation nucléaire de Tat ne semble pas suffisant pour conférer une
localisation nucléaire au cargo eGFP, suggérant que le mécanisme d’internalisation utilisé
pourrait être influencé par la conformation de la protéine de fusion. Chez la souris,
l’injection sous-cutanée ou intra-artérielle de la protéine Tat-eGFP mène à un petit nombre
de fibres positives en périphérie de l’injection ou près des vaisseaux sanguins.
L'administration intramusculaire produit un marquage intense au niveau de la matrice
extracellulaire locale, suggérant que certaines de ses composantes viennent interférer avec
le processus d’internalisation.
65
Intracellular Delivery of a Tat-eGFP Fusion Protein into Muscle Cells Nicolas J. Caron,* Yvan Torrente,*† Geoffrey Camirand,* Mathieu Bujold,* Pierre Chapdelaine,* Karine Leriche,* Nereo Bresolin†§ and Jacques P. Tremblay*1 *Unité de Recherche en Génétique Humaine, Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université Laval, Université Laval, Ste-Foy (Qc), Canada, G1V 4G2 †Centro Dino Ferrari, Institute of Clinical Neurology, University of Milan, Milan, Italy. §IRCCS Ospedale Maggiore Policinico and IRCCS Eugenio Medale, Bosisio Parini, Italy. Running title: Tat-eGFP transduction into muscle cells 1 To whom correspondence and reprint requests should be addressed Pr Jacques P. Tremblay Unité de Recherche en Génétique Humaine Centre de Recherche du CHUL 2705 boulevard Laurier Ste-Foy, (Qc), Canada, G1V 4G2 tel: (418) 654-2186 fax: (418) 654-2207 [email protected] 2Abbreviations used: TA, Tibialis anterior; PTD, protein transduction domain; eGFP, enhanced Green Fluorescent Protein; ECM, extracellular matrix; NLS, nuclear localization signal; HS, heparan sulfate. Keywords: Tat; protein transduction domain; skeletal muscle; eGFP; internalization; extracellular matrix; cationinc peptides. (published in Molecular Therapy, March 2001)
66
Abstract
The Tat protein from HIV-1, when fused with heterologous proteins or peptides, can
traverse biological membranes in a process named “protein transduction”, delivering its
cargo into cells. A Tat-eGFP fusion protein was purified from bacteria to study the
transduction kinetics of Tat fusion proteins into cultured myoblasts and in the muscle
tissue. Correctly folded Tat-eGFP reaches a maximum intracellular level in nearly 30 min,
while its endogenous fluorescence is first detected only after 14 h. The nuclear localization
signal from the basic domain of Tat was not sufficient to confer nuclear localization to Tat-
eGFP, suggesting that the nuclear import pathway used by the exogenously added Tat-
eGFP might be sensitive to the folding state of eGFP. In mice, the direct delivery to the
muscle tissue using subcutaneous injections or the intra-arterial pathway led to few positive
fibers in the muscle periphery or surrounding the blood vessels. Muscles injected with Tat-
eGFP showed intense labeling of the extracellular matrix (ECM), suggesting that, although
Tat fusion proteins can transduce muscle fibers, their binding by components of the ECM
surrounding myofibers could interfere with the intracellular transduction process.
67
Introduction
Direct viral-mediated and ex vivo cell-mediated gene therapy have been studied for years
for the potential treatment of genetic diseases. The success of gene therapy protocols is
often limited by toxicity and immunological problems. Recent protocols for cell-mediated
gene therapy often require, in addition to a corrective therapeutic gene, the delivery of
several transgenes to immortalize, increase the life span of, or switch the differentiation
program of cells isolated from the patients, before they can be transplanted back into the
host. Previously, the potential for the therapeutic use of proteins to supplement for the
product of mutated genes was limited by the impermeable nature of the cell membrane to
such macromolecules. However, reports in the last decade showed that some proteins could
bypass the molecular cutoff imposed by the cell membrane, opening new possibilities in the
field of molecular therapy.
Small regions of proteins and synthetic peptides, called protein transduction
domains (PTDs), were recently identified in Drosophilia (ANTP), HSV-1 (VP22) and HIV-
1 (Tat) (Elliott et O'Hare 1997; Mi et al. 2000; Schwarze et Dowdy 2000; Wender et al.
2000). Even fused with heterologous proteins or peptides, PTDs can traverse biological
membranes efficiently in a process termed “protein transduction”, delivering their cargo
into the cell. Cellular uptake of the Tat protein was first reported by two groups who
showed that the exogenously added Tat protein from HIV-1 could enter cells and
subsequently trans-activate the HIV-1 LTR promoter (Frankel et Pabo 1988; Green et
Loewenstein 1988). In 1991, Frankel suggested that Tat might prove a useful vehicle to
deliver proteins or peptides into cells (Mann et Frankel 1991). Later, antibodies (Anderson
et al. 1993) and enzymes (HRP and β-Galactosidase) (Fawell et al. 1994) were shown to
transduce into cells when crosslinked to a Tat peptide. The study of several Tat-derived
peptides showed that residues 47 to 57 from the basic domain were responsible for the
functional internalization into cells (Jeang et al. 1999; Schwarze et Dowdy 2000; Schwarze
et al. 2000).
68
While studies aimed at better understanding the transducing capabilities exhibited
by the HIV-1 Tat protein, the first convenient method to apply the protein delivery potential
of Tat was developed by the group of Dowdy (Ezhevsky et al. 1997; Nagahara et al. 1998).
In this system, in-frame polyhistidine-Tat fusion proteins are purified from a bacterial
lysate in denaturing conditions through a series of affinity, ion-exchange and desalt
columns. Isolated denatured Tat-fusion proteins are made soluble in an aqueous buffer and
added directly to the cell culture medium. While this strategy was used before, the exact
transduction mechanism by which Tat fusion proteins cross lipid bilayers is still unknown.
Tat PTD fusion proteins can be transduced into cells simply by adding them to the cell
culture medium (Schwarze et al. 2000). After their exogenous application to cultured cells,
Tat-fusion proteins, purified under denaturing conditions, are internalized in a rapid,
concentration-dependent manner to achieve maximum intracellular concentration in a
matter of minutes and are also found in the nucleus (Nagahara et al. 1998; Schwarze et al.
1999). The internalized proteins are then correctly refolded in the cytoplasm, perhaps by
intracellular chaperones. The use of denaturing conditions for the purification of Tat fusion
proteins is necessary to solubilize proteins from bacterial inclusion bodies and is also
involved in increasing transduction efficiency and speed (Nagahara et al. 1998). Two
previous studies examined the possibility of direct delivery of Tat proteins in animals.
Results published by Fawell using a folded Tat-conjugated β-Galactosidase protein injected
intravenously showed strong activity in the spleen, heart and liver but low staining into
skeletal muscles and lungs (Fawell et al. 1994). Schwarze reported that the intraperitoneal
delivery of the denatured Tat-β-Galactosidase fusion protein allowed the uptake into many
tissues in mice, including the heart, the liver and the kidneys, while skeletal muscles and
the brain showed weaker signals (Schwarze et al. 1999).
In the present work, we have purified a Tat-eGFP fusion protein from bacteria to
study the transduction kinetics of Tat fusion proteins into cultured myoblasts and into the
muscle tissue. The aim of our study was to examine the potential of this new technology to
deliver proteins into cultured cells and into the muscle tissue, to better understand the
power and limits of Tat-mediated transduction. We report that correctly folded Tat-eGFP
labeled with rhodamine can transduce C2C12 myoblasts to reach a maximum intracellular
69
level in nearly 30 minutes, while its endogenous green fluorescence was first detected only
after 14 h. The Tat basic domain nuclear localization signal (NLS) was not sufficient to
confer nuclear localization to the Tat-eGFP fusion protein in the first 18 h of treatment,
suggesting that the nuclear import pathway used by the exogenously added Tat fusion
proteins might be impaired by the folded structure of Tat-eGFP. In mice, the direct delivery
into muscles using subdermal injections or the intra-arterial pathway led to a few positive
fibers in the muscle periphery or surrounding the blood vessels. Muscles injected with the
Tat-eGFP fusion protein showed intense labeling of the extracellular matrix (ECM)
suggesting that, although Tat fusion proteins can transduce muscle fibers, their binding by
components of the extracellular matrix surrounding myofibers could interfere with the
intracellular transduction process.
70
Material and Methods
Fusion protein purification. The pTat-eGFP expression vector was constructed by
inserting eGFP from pIRES-eGFP (Clontech) in pTAT-HA vector (gift from Dr. Steven F.
Dowdy) to produce an in frame fusion protein. The pTAT-HA vector has an N-terminal 6-
histidine leader followed by the 11-amino-acid TAT protein transduction domain flanked
by glycine residues (GYGRKKRRQRRRG), a hemaglutinin tag (GYPYDVPDYAG)
flanked by glycine residues and a polylinker (Nagahara et al. 1998). The peGFP control
vector was generated by BamHI digestion and religation of pTat-eGFP, resulting in the
deletion of 51 bp containing the Tat PTD. HIS-tagged fusion proteins were purified from
BL21(DE3)pLysS (Novagen) as previously described (Nagahara et al. 1998) with only
minor modifications. BL21 cells from overnight culture were spun down and then sonicated
in buffer Z (8 M urea, 100 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 8.0). Centrifugation cleared cell
lysates were adjusted to 10 mM imidazole, loaded into a 3 ml Ni-NTA agarose column
(Qiagen), washed with buffer Z + 10 mM imidazole and eluted with buffer Z + 250 mM
imidazole. Fluorescent fractions were then applied to a 3 ml Q Sepharose column (Bio Rad)
in 4 M urea, 50 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 9.5) and eluted in 1 M NaCl, 20 mM Hepes
pH 8.0. Eluted proteins were then desalted on PD-10 column in PBS, aliquoted, flash
frozen in 10 % glycerin and stored at -80°C. Tat-E7 was purified from BL21 cells
containing the pTat-E7 expression vector as previously published (Lissy et al. 1998).
Rhodamine-labeled fusion proteins were generated by NHS-Rhodamine labeling according
to the manufacturer's protocol (Pierce), followed by gel filtration on a PD-10 column.
Purified fusion protein concentrations were determined by Coomassie blue staining of
SDS-PAGE compared to BSA standards.
Cells and cell culture. C2C12 mouse myoblasts, NIH/3T3 mouse fibroblasts, mouse
primary myoblast cultures and human skin fibroblasts (graciously provided by Dr. François
Auger, Hopital St-Sacrement, Quebec, Canada) were grown in DMEM HG medium
supplemented with 10% FBS, 10 000 U/ml penicillin/streptomycin in 5% CO2 at 37°C.
71
Primary myoblast cultures were established from muscle biopsies of newborn BALB/C
mice as previously described (Kinoshita et al. 1994a). Mouse myotubes were obtained by
inducing differentiation of mouse primary myoblast cultures in DMEM with lowered 2%
Newborn Calf Serum for 4 days. Human myoblasts were obtained from the biopsy of a 15-
year-old patient suffering from Duchenne muscular dystrophy (DMD) as previously
described (Tremblay et al. 1993a) and grown in MCDB120 containing 15% FBS, 0.5
mg/ml BSA, 0.39 µg/ml dexamethazone, 5 µg/ml insulin and 10 ng/ml bFGF (Ham et al.
1990; Huard et al. 1994).
In vitro intracellular transduction assays. Intracellular transduction assays were
performed in 35 mm petri dishes (Fisher) and 24 well plates (Costar). Cells treated with
eGFP, Tat-eGFP, rhodamine labeled Tat-eGFP and Tat-E7 at various concentrations were
examined directly or were quickly rinsed once during approximately 5 s in PBS after
different time intervals and fixed in 4% paraformaldehyde for 5 min, rinsed twice in PBS
and mounted in PBS/glycerol (1 for 1) under coverslips before their observation. To study
the time course of TAT-eGFP transduction into muscle cells, rhodamine-labeled Tat-eGFP
(20 µg/ml) was added to the culture medium of C2C12 cells in 96 wells plate (Corning) for
various time intervals at 37°C. Following the cell fixation with 4% paraformaldehyde and
PBS rinsing, the fluorescence was read with a cytofluorometer (Cytofluor 2350; Perseptive
Biosystems; EX, 530 nm; EM, 590 nm).
Animal studies. Animals were deeply anesthetized with 0.15 ml of ketamine/xylazine (10
mg/ml) prior to all surgeries. Intramuscular injections of recombinant proteins were
performed in 12 C57BL/10J mdx/mdx mice. Fifty microliters of Tat-eGFP or control eGFP
in 10% glycerin/PBS (500 µg/ml) were injected slowly through the skin into the belly of
the Tibialis anterior (TA) muscle along the rostrocaudal axis. U-100 0.5 cc Insulin syringes
(Becton Dickinson) were used for these injections, applying low pressure as previously
described (Caron et al. 1999).
72
The subcutaneous delivery of Tat fusion proteins was performed in 10 BALB/C mice. In
short, a pouch of highly concentrated fusion proteins was created beneath the skin, in direct
contact with the leg muscles. To do this, a very small incision was performed through the
skin above the proximal region of the TA muscle, near the knee. The skin was carefully
detached from the leg muscles using fine-tip forceps, to create a void. In some cases, the
aponeuroses (the thin membrane recovering muscles and bones) from the lower leg, was
very carefully removed using fine-tip forceps. A 50-µl volume, of Tat-eGFP or control
eGFP (800 µg/ml), was injected under the skin using a Pipetman P200 (Gilson). Animals
exhibiting significant leakage were rejected. Mice were sacrificed 16 h after treatment.
Fusion proteins were also delivered in the muscle limbs of four female BALB/C mice
using the artery route as previously described (Torrente et al. 1999). Surgical exposure of
the right iliac artery was performed by opening the abdomen followed by the peritoneal
cavity and then displacing the bowels. Injections of 200 µl rhodamine-labeled fusion
proteins in 10% glycerin/PBS (250 µg/ml) were performed in mice with a 0.20-mm-gauge
needle (Becton Dickinson) caudally inserted into the iliac artery. There was no visible
damage to the vessel wall during or after the operation. The abdomen was then sutured.
Mice were sacrificed after 2 hours. All animals were housed in microisolator cages with
sterile water and food, and maintained in accordance with the guidelines set by the
Canadian Council of Animal Care.
Muscle biopsy and histology. Mice were sacrificed by cervical dislocation after being
deeply anesthetized with 0.3 ml of ketamine/xylazine (10 mg/ml). Muscle biopsies were
dissected out and transversally oriented in cryomatrix embedding medium (Shandon) to be
immediately frozen in liquid nitrogen. Thin frozen sections (14 µm) were cut with a
cryomicrotome at -24°C , placed on gelatin-coated slides and kept frozen at -80°C. Sections
were fixed for 5 min with 4% paraformaldehyde/PBS, rinsed twice with PBS and mounted
under coverslips. Hematoxylin-eosine and alizarin red staining were performed as
previously described (Dubowitz 1985).
73
Results
We selected eGFP as a study tool because its fluorescence can only be observed when it is
correctly folded. The use of rhodamine labeled eGFP as a cargo in a Tat fusion protein
made possible the live observation of the translocation and the refolding processes. GFP
and its variants like eGFP are very resistant to denaturation. GFP is not unfolded with 8 M
urea, its denaturation requires treatment with 6 M guanidium hydrochloride at 90°C or a pH
lower than 4 or greater then 12 (Yang et al. 1996). The eGFP protein has a newly
caracterized folding structure named β-can. On the outside, 11 antiparallel β strands form a
compact cylinder, surrounding an α helix and the chromofore. The β-can protein structure
of eGFP is responsible for its resiliency to denaturation, but the N-terminal portion of Tat-
eGFP, encompassing the 6-histidine leader and Tat PTD is free and therefore not protected.
The fusion proteins used in this work (Fig. 1A) kept their fluorescence during the entire
protein purification process (Fig. 1B), producing more than 95% pure yields (Fig. 1C)
ranging from 2.5 mg/L to 6 mg/L of LB bacterial growth medium at a final concentration of
0.5 mg/ml to 2 mg/ml.
Intracellular localization and time course of Tat-eGFP transduction in cultured cell lines
Samples of the Tat-eGFP fusion protein and eGFP control were applied to C2C12
and NIH/3T3 cells at concentrations ranging from 15 to 300 µg/ml to assess their
intracellular transduction capacity on cultured mouse myoblasts and fibroblasts. When cells
were treated with Tat-eGFP at a concentration of 150 µg/ml (Fig. 2A and 2B), intracellular
green fluorescence from the refolded protein was detected in the cytoplasm starting at 14
hr, increasing progressively until approximately 24 h. C2C12 and NIH/3T3 cells treated
with Tat-eGFP concentrations in excess of 25 µg/ml consistently revealed cytoplasmic
green fluorescence, without nuclear localization. Even at the highest concentration tested
(300 µg/ml), no fluorescence was detected in cells treated with control eGFP (Fig. 2C and
2D). The rhodamine-labeled Tat-eGFP fusion protein was rapidly taken up by 100% of
74
cells (Fig. 2E and 2F), reaching a maximum intracellular concentration in nearly 30 min
(Fig. 3) in C2C12 myoblasts. Cells treated with rhodamine-labeled Tat-eGFP mainly
showed perinuclear cytoplasmic fluorescence after 24 h, without nuclear localization in the
majority of cells (Fig. 2G). Less than 1% of cells exhibited a low level nuclear rhodamine
fluorescence after 24 h. Rhodamine-labeled Tat-E7 (Lissy et al. 1998), a fusion protein that
does not resist to denaturing conditions, was applied to cells to compare with Tat-eGFP. In
contrast with Tat-eGFP, Tat-E7 localized in less than 1 h to the nucleus (Fig. 2H to 2J). No
significant toxicity was observed in all cell types studied, even when using concentrations
of Tat fusion proteins in excess of 300 µg/ml.
Intracellular transduction of Tat-eGFP cultured primary cells
To determine if Tat-eGFP could be internalized in primary cells, mouse primary
myoblast cultures, human DMD myoblasts and human skin fibroblasts were treated with
rhodamine-labeled Tat-eGFP (75 µg/ml). Cells isolated from the muscle tissue of newborn
mice were grown in conditions permitting fusion for 3 days to give rise to multinucleated
myotubes. As it was the case with C2C12 and NIH/3T3 cells, primary cells internalized
rhodamine-labeled Tat-eGFP rapidly in less than 30 min before leveling off in
approximately 4 h. Rhodamine-labeled Tat-eGFP was internalized less efficiently into
myotubes than in undifferentiated mononucleated cells (Fig. 4A and 4B). Highly
contrasted, round cells consistently showed the most intense fluorescent labeling. Cultured
human muscle cells and human skin fibroblasts can also be very efficiently transduced by a
Tat-eGFP fusion protein. Nearly 100% of DMD human myoblasts (Fig. 4C) and human
skin fibroblasts (Fig. 4D), showed internalization of rhodamine-labeled Tat-eGFP.
Tat-eGFP is found associated to the ECM following intramuscular injection
To examine the intramuscular distribution and the potential for Tat fusion protein to
be delivered to the muscle tissue, we first performed intramuscular 25 µg injections of Tat-
75
eGFP and control eGFP in TA muscles of C57BL/10J mdx/mdx mice (the mouse model of
Duchenne muscular dystrophy). Intense eGFP fluorescence inside myofibers was rapidly (5
min) detected, for both Tat-eGFP and control eGFP (results not shown). Further
investigation revealed massive extracellular calcium entry into myofibers found in the
vicinity of the injection sites as indicated by alizarin red staining, indicating that the
fluorescent myofibers at the injection sites were mechanically damaged or pressure
perfused (results not shown). After 4 h, eGFP fluorescence was partially washed out of
these mechanically damaged fibers and was mainly associated with the ECM surrounding
muscle fibers in the case of Tat-eGFP (Fig. 5A). After 18 h, myofibers in the vicinity of the
Tat-eGFP injection site still showed strong ECM associated fluorescence, while there was
total clearance from inside myofibers at the site of injection (Fig. 5B). Also, the ECM
associated fluorescence was significantly stronger in C57BL/10J mdx/mdx muscles
injected with Tat-eGFP (Fig. 5B) than in muscles injected with control eGFP (Fig. 5C).
Some muscle fibers outside damaged areas (as indicated by the lack of alizarin red staining)
in Tat-eGFP injected muscles exhibited weak intracellular fluorescence, indicating that
some muscle fibers might have been transduced by the Tat fusion protein. After two days,
eGFP fluorescence could still be observed in muscles injected with Tat-eGFP while no
fluorescence remained attached to the to ECM in control muscles injected with eGFP.
Subcutaneous and intra-arterial delivery to the muscle fibers
Light injuries, not leading to fiber necrosis, could explain the intracellular
fluorescence in some muscle fibers outside damaged areas in Tat-eGFP injected muscles.
We, thus, proceeded to deliver fusion proteins to the muscles without creating trauma.
Subcutaneous injections were performed, leading to the accumulation of liquid pockets
between the skin and the lower leg muscles (gastrocnemius, soleus and TA). Such
interventions led only to the labeling of mononucleated cells embedded into the conjunctive
tissue surrounding the leg muscles (Fig. 5D). The removal of the aponeuroses before the
subcutaneous injection was necessary to obtain fluorescently labeled muscle fibers in the
superficial layers of the TA (Fig. 5E), while myofibers from muscles treated with eGFP
showed no significant fluorescence (Fig. 5F). In some cases, several external muscle fiber
76
layers showed intracellular fluorescence (gradually decreasing toward the inside of the
muscle) after the subdermal injection of Tat-eGFP, as revealed by longitudinal cryosections
from a gastrocnemius muscle (Fig. 5G). To exclude the possibility that the microsurgery
consisting in cutting the aponeuroses could produce muscle fiber injury, leading to
mechanical perfusion, we then proceeded to inject Tat-eGFP through the right iliac artery.
Such direct delivery to the leg completely eliminated the possibility of undesired injuries to
muscle fibers of the lower leg, since the injection and the surgery took place several
centimeters away from the muscles of interest. The delivery of rhodamine-labeled Tat-
eGFP (50 µg) through the iliac artery led to a few red fluorescent myofibers locally
surrounding blood vessels (Fig. 5H) in the quadriceps and gastrocnemius.
77
Discussion
Several proteins can traverse biological membranes by protein transduction. Small regions
of proteins, 10 to 16 residues long are responsible for this phenomenon (Schwarze et al.
2000). It was previously showed that fusion proteins containing the protein transduction
domain from the HIV-1 Tat protein could transduce through the cell membrane to deliver
their cargo into the cell body (Schwarze et Dowdy 2000). After their exogenous application
to cultured cells, Tat fusion proteins purified in denaturing conditions are rapidly
internalized in a matter of minutes and are also located in the nucleus. In addition, their
refolding into the host cell makes possible the observation of in vivo biological effects
resulting from their interactions with nuclear proteins (Nagahara et al. 1998; Schwarze et
al. 2000). While previous studies were conducted using cargo proteins sensitive to
denaturation in 8 M urea, the eGFP beta-can structure of our Tat-eGFP fusion protein
resisted to the denaturing steps of our purification protocol. Intracellular transduction
assays conducted with this folded fluorescent cargo resulted in a delay in reaching
maximum intracellular levels (approximately 30 min) when compared with previous
studies using chemically synthesized Tat peptides and denatured Tat fusion proteins that all
attained their peek in less than 15 minutes (Vives et al. 1997; Nagahara et al. 1998;
Schwarze et al. 1999; Truant et Cullen 1999).
Our data, showing intracellular transduction of native Tat-eGFP in several cell
types, illustrate that a folded Tat fusion protein can decrease the efficiency and speed of the
internalization process when compared with completely denatured fusion proteins
(Nagahara et al. 1998; Schwarze et al. 1999; Truant et Cullen 1999), but that unfolding
prior to the application to cells is not necessary. The fluorescent Tat-eGFP fusion protein is
unfolded, at least partially to loose its fluorescence, during the translocation process and is
then slowly renatured in a matter of hours to reach detectable levels of fluorescence after 14
h. The apparent discrepancy between our results and those obtained by the group of
Dowdy, stating that mammalian cells appear to be unable to refold GFP into a fluorescent
conformation (Schwarze et al. 2000), might be explained by the fact that the eGFP variant
78
used in our study is 35 times more fluorescent than its parental counterpart, wild type GFP
(Cormack et al. 1996). To analyze the ability of the Tat-eGFP fusion protein to transduce
into cells prior to its intracellular refolding, it was conjugated with rhodamine and added to
C2C12, NIH/3T3 or human fibroblasts. Our experiments revealed that contrarily to PTD-5
(RRQRRTSKLMKR) (Mi et al. 2000), the NLS (RKKRRQRRR), part of Tat PTD, was not
sufficient to confer nuclear localization to eGFP following its intracellular transduction.
The absence of a nuclear localization is not entirely surprising since previous work showed
that the exogenous application of folded Tat protein did not result in nuclear localization
(Ensoli et al. 1993; Elliott et O'Hare 1997). In addition, the nuclear localization pathway
taken by the Tat protein was shown to be sensitive to the folding state of Tat. Indeed,
Bonifaci et al. showed that the pre-treatment of cells with MTX, an analogue of
methotrexate that stabilizes the three-dimensional structure of DHFR, blocked the nuclear
localization of the Tat-DHFR fusion protein (Bonifaci et al. 1995). This last case shares
striking similarities with our denaturation resistant Tat-eGFP fusion protein which is
internalized more slowly than many other proteins. Recent reports also suggested that the
Tat NLS might be part of a novel class of basic NLS that functions independently from
Importin α by binding directly to Importin β (Efthymiadis et al. 1998; Truant et Cullen
1999). The nuclear import pathway used by the exogenously added Tat protein might be
more sensitive to the folding state of the proteins to be imported than the classical Importin
α-dependent pathway.
As discussed in the introduction, previous attempts at the in vivo delivery of Tat
fusion proteins into skeletal muscle cells gave poor staining results when compared with
other well vascularized organs and mostly when compared with the intense staining
observed throughout the heart muscle (Fawell et al. 1994; Schwarze et al. 1999). Our
attempts to deliver Tat-eGFP to muscle fibers through intra-arterial and subdermal
injections were successful, but gave rise to a limited number of fibers of low level
fluorescence intensity located only in the periphery of blood vessels or at the surface of the
muscle. The number of fluorescent muscle fibers was very small (less than 1%), indicating
that the transduction of muscle fibers using intra-arterial injection of concentrated Tat
fusion proteins is possible, but not very efficient in the case of Tat-eGFP. Twenty-four
79
hours after intramuscular injections in C57BL/10J mdx/mdx mice, most of the Tat-eGFP
fluorescence was found associated to the ECM. In agreement with these results, myotubes
obtained from primary mouse myoblast cultures, ensheathed by an ECM-rich basement
membrane, failed to be transduced by Tat-eGFP as efficiently as some adjacent
mononuclear cells not imbedded beneath a basal lamina. Our data suggests that Tat PTD
shows an affinity for components of the ECM. Previous studies demonstrated that Tat
shared many characteristics with growth factors (Jeang et al. 1999) and that it is, in fact, a
heparin binding protein that interacts with heparan sulfate (HS), proteoglycans of the cell
surface and ECM (Rusnati et al. 1998). Heparin was found to bind specifically to
recombinant HIV-1 GST-Tat fusion protein, and like HS, can inhibit HIV-LTR trans-
activation induced by extracellular GST-Tat (Rusnati et al. 1997). Residues 49 to 57 of Tat,
part of our fusion protein, are responsible for its affinity to heparin/HS (Rusnati et al.
1998). Interestingly, HS-proteoglycans are abundant in the muscle tissue. The basal lamina
surrounding muscle fibers is composed of laminin, fibronectin, collagen and HS containing
proteoglycan (Sanes 1994). Clonal mouse myoblasts were shown to synthesize and secrete
collagen and other extracellular proteins and incorporate these macromolecules in an
insoluble and organized matrix (Beach et al. 1985; Rao et al. 1985). Yet, we showed that
C2C12 cells rapidly internalized Tat-eGFP. We thus hypothesize, that the association
between Tat PTD and the ECM surrounding myofibers interferes with the intracellular
transduction process in the case of Tat-eGFP or that this retention to the conjunctive tissue
diminishes its local bioavailability to the cell membrane of myofibers.
In conclusion, we have focused our efforts on the use of Tat-fusion proteins for
protein replacement therapy in muscle cells and muscle tissue. If the poor efficiency of Tat
mediated transduction in muscle fibers is due to its retention to the ECM, it would be
important to determine whether, recently designed PTDs derived from known sequences
such as, poly-arginine (Wender et al. 2000) or PTD-5 (Mi et al. 2000) also interact so
strongly with components of the ECM. Although we could not deliver Tat fusion proteins
in a high percentage of muscle fibers using none invasive techniques, our experiments
showed that Tat fusion proteins could be used to deliver proteins in human primary
cultured DMD myoblasts. This could prove to be very interesting since primary myoblasts
demonstrate a poor efficiency of transfection and infection in culture, where the goal is to
80
maximize delivery of therapeutic molecules. In addition, several ex vivo gene therapy
protocols require genetic engineering to correct a particular defect, increase the life span of
the targeted cells or overexpress a therapeutically significant gene, thus necessitating the
use of several different vectors at high dosage. Among the proteins that could be delivered
to cells, there are proteins to transiently immortalize, increase the life span or switch the
differentiation program of cells. Such tools could significantly help cell-mediated based
gene therapies.
81
Acknowledgments
We thank Dr. Steven F. Dowdy and his team for pTAT-HA, pTAT-E7 and their helpful
comments. We also thank Dr. El Bachir Affar for helpful comments on cytofluorometry
and Philippe Girard, Marlyne Goulet and Brigitte Roy for their technical assistance. This
work was supported in part by l'Association Française contre les Myopathies (AFM), the
Muscular Dystrophy Association (MDA) and a graduate research scholarship from La
Fondation de l'Université Laval (N.J.C.).
82
Figure legends
Figure 1 Schematic representation of Tat-fusion protein constructs and purification
strategy.
(A) Diagram of Tat-eGFP recombinant protein and control used for protein transduction
assays and (B) HIS-tagged recombinant protein purification procedures. Overnight bacterial
cultures of pTat-eGFP and peGFP were sonicated in 8 M urea and spun, before their
purification over a Ni-NTA column, followed by a Q Sepharose column and a gel filtration
step. (C) Yield from protein purification steps. Fluorescent fractions were analyzed by
SDS-PAGE stained with Coomassie blue. Lane 1, eGFP (34 kDa); lane 2, Tat-eGFP (35
kDa); M, molecular weight markers.
Figure 2 Intracellular delivery of Tat-eGFP in NIH/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts.
Fluorescence micrographs of NIH/3T3 treated with (A) Tat-eGFP (150 µg/ml) or (C) eGFP
(150 µg/ml) for 18 h and corresponding phase contrast images (B and D). (E and G) C2C12
treated for 4 h with rhodamine-labeled Tat-eGFP (40 µg/ml) and corresponding phase
contrast image (F). (I) NIH/3T3 treated with rhodamine-labeled Tat-E7 (15 µg/ml),
corresponding phase contast (H) and DAPI staining (J). After the treatment, cells were
rinsed quickly in PBS and fixed for 10 min in 4% paraformaldehyde before they were
mounted and examined. Bars, 50 µm.
Figure 3 Rapid uptake of rhodamine-labeled Tat-eGFP in C2C12 myoblasts.
To study the time course of TAT-eGFP transduction into cells, rhodamine-labeled Tat-
eGFP (20 µg/ml) was added to the culture medium of C2C12 cells in 96 wells plate for
83
various time intervals at 37 °C. The cells were rinsed quickly in PBS and fixed for 10
minutes in 4% paraformaldehyde and read with a cytofluorometer. The intensity is
expressed as arbitrary units, dots correspond to means and bars to standard errors of five
duplicate wells.
Figure 4 Intracellular delivery of Tat-eGFP in cultured primary cells.
Fluorescent micrographs of cells treated with 75 µg/ml rhodamine-labeled Tat-eGFP. After
4 h, cells were rinsed quickly in PBS and fixed for 10 min in 4% paraformaldehyde before
they were mounted and examined. Rhodamine fluorescence in (A) differentiated myogenic
cells isolated from newborn BALB/C mice and (B) corresponding phase contrast, (C)
proliferating DMD myoblasts isolated from a 15-year-old patient and (D) proliferating
human skin fibroblasts. Arrowheads point toward myotubes. Bars, 100 µm.
Figure 5 Intracellular localization of Tat-eGFP in myofibers and retention to the
extracellular matrix.
Fluorescence micrograph sections of TA muscles. (A) The injection site of a TA muscle of
a C57BL/10J mdx/mdx mouse injected with Tat-eGFP (25 µg) after 4 h. ECM surrounding
myofibers near the Tat-eGFP (B) injection site or control eGFP (C) after 18 h. Fluorescence
micrograph sections of whole leg muscles of BALB/C mice 18 h following the subdermal
delivery of Tat-eGFP (D, E and G) or control eGFP (F). (D) Mononuclear cells inside the
conjunctive tissue surrounding a TA muscle with intact aponeuroses. (E and F) Myofibers
from the periphery of a TA muscle (on the left) with injured aponeuroses. (G) Longitudinal
myofibers from the soleus muscle. (H) TA muscle fibers 2 h following the intra-arterial
delivery of rhodamine-labeled Tat-eGFP (50 µg). The star shows a blood vessel. Bars, 50
µm.
84
Figures
Figure 1 Schematic representation of Tat-fusion protein constructs and purification strategy.
85
Figure 2 Intracellular delivery of Tat-eGFP in NIH/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts.
86
Figure 3 Rapid uptake of rhodamine-labeled Tat-eGFP in C2C12 myoblasts.
87
Figure 4
Figure 4 Intracellular delivery of Tat-eGFP in cultured primary cells.
88
Figure 5 Intracellular localization of Tat-eGFP in myofibers and retention to the extracellular matrix.
89
Chapitre 3:
La déstabilisation des endosomes augmente l'accès fonctionnel des protéines de fusion Tat au noyau
Nicolas J. Caron, Simon P. Quenneville and Jacques P. Tremblay*
Contribution de chaque auteur:
J’ai effectué le travail dans son entier et j’ai rédigé l’article. Simon Quenneville m’a assisté
dans les manipulations liées à la Fig.2. Jacques P. Tremblay a supervisé mes travaux.
(publié dans Biochemical and Biophysical Research Communications en Juin 2004)
90
Résumé La protéine Tat de VIH-1 peut transporter des cargos protéiques biologiquement actifs in
vivo et suscite beaucoup d’intérêts pour les thérapies protéiques. Le mécanisme
responsable de l’internalisation des protéines de fusion Tat est mal connu et controversé. La
distribution intracellulaire ponctuée, la cinétique d’internalisation et la sensibilité aux
basses températures, que nous avons observées, sont cohérentes avec un mécanisme
d’endocytose. Après quelques heures, les protéines de fusion Tat s’accumulent autour du
noyau, sans qu’on les retrouve à l’intérieur. En utilisant un essai fonctionnel basé sur le
système CRE/Lox, des agents lysosomotropiques connus pour déstabiliser les endosomes,
ont augmenté jusqu’à 23 fois l’efficacité du transport au noyau des protéines de fusion Tat-
CRE recombinase sans augmenter leur entrée dans les cellules. Ceci démontre que la
déstabilisation des endosomes peut augmenter de façon significative l’accès des cargos au
cytosol et au noyau. De plus, nous avons observé que les protéines de fusion Tat, pouvaient
persister pendant plusieurs heures dans les cellules ciblées, et que des inhibiteurs de
l’acidification des lysosomes n’avaient aucun effet sur l’efficacité du transport jusqu’au
noyau. Ceci suggère que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale, pour
ensuite contourner la dégradation dans les lysosomes, mais qu’elles sont ensuite
séquestrées en périphérie du noyau. Nos travaux indiquent qu’un trafic intracellulaire
inadéquat est le principal facteur limitant l’efficacité de l’internalisation fonctionnelle des
cargos fusionnés au domaine de transduction de Tat.
91
Endosome disruption enhances the functional nuclear delivery of Tat-fusion proteins
Nicolas J. Caron, Simon P. Quenneville and Jacques P. Tremblay*
Human Genetic Research Unit, Laval University Hospital Center, Quebec City, Canada
*corresponding author:
Jacques P. Tremblay, Ph.D Laboratoire de Génétique humaine (RC-9300) Centre de recherche du CHUL 2705, boul. Laurier Ste-Foy, (Qc), Canada, G1V 4G2 Phone: (418) 654-2186 Fax: (418) 654-2207 E-mail: [email protected]
(published in Biochemical and Biophysical Research Communications, June 2004)
92
Abstract
Tat protein from human immunodeficiency virus (HIV-1) can deliver biologically
active proteins in vivo and is of considerable interest for protein therapeutics. The
mechanism responsible for Tat-fusion protein internalization is still poorly understood and
controversial. The punctuate distribution, timing and temperature sensitivity observed in
our experiments with Tat-fusion-proteins are consistent with endocytosis. After a few
hours, Tat-fusion proteins accumulated around the nucleus without any significant visible
nuclear targeting. Using a Cre/Lox based functional assay, lysosomotropic agents known to
disrupt endosome integrity, increased by up to 23-fold the nuclear delivery of functional
Tat-Cre recombinase without increasing cell uptake in a similar fashion. This shows that
endosome disruption can significantly increase Tat-fusion protein access to the cytosol and
nucleus. In addition, we found that internalized Tat-fusion proteins persisted several hours
and that inhibitors of lysosome acidification did not increase functional nuclear delivery of
Tat-Cre. This suggests that Tat-fusion proteins enter via the endosomal pathway,
circumvent lysosomal degradation and are then sequestered in the periphery of the nucleus.
Most importantly, our work indicates that an inadequate intracellular trafficking is the main
factor limiting the efficiency of protein cargo delivery using Tat.
Keywords: Tat, Endocytosis, Uptake, Transduction, Cre recombinase, Lysosomotropic
agents, Perinuclear accumulation, Chloroquine
93
Introduction
The Tat protein from HIV-1 was shown to be taken up by cells when added
exogenously and to trans-activate the HIV-1 LTR promoter in the nucleus. Full-length
proteins can also be delivered inside cells or tissues when conjugated or expressed in fusion
with the basic domain of Tat (Fawell et al. 1994; Schwarze et al. 1999). The basic domain
(RKKRRQRRR) extending from residues 49 to 57 is generally considered to be the
minimal sequence responsible for the internalization. Since the early 90s, other small
regions of proteins such VP-22 (Elliott et O'Hare 1997), ANTP (Joliot et al. 1991) and
Kaposi FGF (Hawiger 1999) or arginine/lysine-rich peptides (Mai et al. 2002) were shown
to enter cells to carry diverse bio-molecules in the cytoplasm and the nucleus. The
underlying mechanism of cellular internalization and intracellular trafficking of cell-
penetrating-peptides (CPPs) remains misunderstood (Silhol et al. 2002).
An early study concluded that the full-length Tat protein entered cells via adsorptive
endocytosis (Mann et Frankel 1991). Since the observed uptake of CPPs is relatively cell-
type independent and not completely inhibited at 4°C, these CPPs were first called "protein
transduction domains" (PTDs) and assumed to be internalized using a novel and unknown
mechanism involving translocation through the cell membrane (Hawiger 1999; Schwarze et
al. 2000). Recently, controversy has spurred when groups showed that fixation could lead
to artifactual uptake and nuclear localization of Tat, arginine-rich peptides (Richard et al.
2003) or VP-22 fusion proteins (Lundberg et Johansson 2001). Interestingly, the
exogenously added Tat-eGFP fusion protein accumulated outside the nucleus, whereas the
same fusion protein expressed using a transfection system had a nucleolar localization
(Caron et al. 2001; Yang et al. 2002b). Tat peptide internalization was not abolished at 4°C,
while the uptake of Tat-GST-eGFP was totally inhibited (Silhol et al. 2002).
94
Although several full-length Tat-fusion proteins (TFPs) can be internalized in
cultured cells following their addition in the culture medium, it is often assumed that they
are internalized in the same manner as short CPPs using an unknown
receptor/endosome/energy-independent mechanism. However more recently, TFPs were
shown to be internalized by the cells through a temperature-dependent endocytic pathway
that follows caveolar endocytosis (Fittipaldi et al. 2003). In this study, we sought to
reexamine the contribution of the endocytic pathway in Tat-fusion protein internalization
and to better understand the events implicated in the intracellular trafficking. To do so, we
monitored the subcellular localization of a variety of TFPs using fluorescence microscopy
against markers relevant to targeted cell compartments. Also, using a novel reporter system
based on the in vivo quantification of functional nuclear Cre recombinase, we tested the
effects of compounds known to destabilize endosome integrity and acidification or block
protein degradation, to better assess the factors influencing the fate of internalized proteins.
95
Materials and methods
Constructs and protein purification The pTat-eGFP.4 expression vector was
constructed by inserting eGFP from pIRES-eGFP (Clontech) in pTat vector (from Dr. S. F.
Dowdy) to produce an in frame fusion protein (Caron et al. 2001). The pTat vector contains
a 6-histidine leader followed by the PTD of Tat and a polylinker (Schwarze et al. 1999).
The plasmid pTat-Myc was obtained by PCR amplification from pcDNA-Myc (from Dr. D.
Jung). The pTat-βGal plasmid was obtained through cohesive (KpnI-BstBI) ligation of the
LacZ gene from pEF6/V5-His-Topo/LacZ (Invitrogen) in pTat. Negative control pβGal.1
was generated by BamHI digestion excising the Tat peptide from pTat-βGal. SSR 69 is a
polycistronic retroviral vector that contains the hygro-tk fusion and the SV40T antigen
flanked by LoxP sites and followed by neo (Westerman et Leboulch 1996). The pTriEx-
HTNC plasmid coding for a 6xHis-Tat/PTD-SV40/NLS-Cre (HTNC) fusion protein (from
Dr. F. Edenhofer) (Peitz et al. 2002). The HTNC, Tat-Myc Tat-β-Gal and β-Gal (Peitz et al.
2002) and Tat-eGFP (Caron et al. 2001) fusion proteins were purified as previously
described. In short, BL21 Plus RL (Stratagene) bacteria transformed with proper construct
were inoculated in LB medium, grown at 37°C to reach 0.8 OD595nm and induced using 0.5
mM IPTG for 3 h. Cells were spun down and sonicated in buffer A (100 mM Hepes pH 8.0,
300 mM NaCl, 10 mM imidazole) and centrifugation cleared cell lysates were loaded on a
Ni-NTA agarose (Qiagen). Afterwards, the resin was washed twice in buffer A +20 mM
imidazole and eluted in buffer A +250 mM imidazole. The eluate was dialyzed against 50
mM NaH2PO4, 5 mM TRIS, 450 mM NaCl, 5% glycerol overnight at 4°C. Rhodamine
labeling and gel filtration were conducted as previously described (Caron et al. 2001).
Purified fusion protein concentrations were determined by Coomassie Blue staining of
SDS-PAGE compared to BSA standards.
Cell culture NIH 3T3, NIH SSR and Psi2 (ecotropic retrovirus producing cell line)
were grown in DMEM HG medium supplemented with 10% Newborn Calf Serum, 10 000
96
U/ml penicillin/streptomycin in 5% CO2 at 37°C. Psi2 SSR 69 are Psi2 cells stably
transfected with the SSR 69 construct using Metafectene lipofectant (Wisent) and selected
for 21 days in a culture medium containing 400 µg/ml hygromycin B (Roche). The NIH
SSR cell line was established by infecting NIH 3T3 cells with Psi2 SSR 69 supernatant
with 8 µg/ml polybrene and selecting with 400 µg/ml hygromycin for 21 days. DTT
(DMD-TAg-hTERT) were derived from the myoblasts of a Duchenne Muscular Dystrophy
(DMD) patient and were proliferated in MCDB120 as previously described (Seigneurin-
Venin et al. 2000b).
Functional nuclear Cre recombinase assay Prior to treatment, NIH SSR were
seeded at 10 000 cells per well in 24-well plates (Corning). After 24 h, cells were washed
twice in HBSS before they were co-incubated in serum-free DMEM HG containing HTNC
for 1 h. Cells were co-incubated with chloroquine (Sigma), sucrose (Lab Mat), bafilomycin
A1 (Sigma), concanamycin A (Sigma) or MG 132 (Calbiochem) in some experiments. The
incubation mix was removed and cells were then proliferated overnight in complete
medium. 24 h later, treated NIH SSR cells were trypsinized and plated 1:2 or 1:4 in T-25
flasks in complete medium containing 800 µg/ml G418. Cells were grown until distinct
colonies appeared (9 days). Cells were rinsed twice in HBSS, then colored with Coomassie
blue and colonies were counted.
Immunoblotting After rinsing 3 times with PBS, cells were recovered directly from
culture dishes by adding sample buffer (50 mM TRIS pH 6.8, 2% SDS, 0,1% Bromophenol
Blue, 10% Glycerol) and were then frozen at –20°C immediately until analysis. Sample
protein concentration was established using protein dot densitometry stained with amido
black 10B curved fitted against a BSA standard curve (Chapdelaine et al. 2001). Samples
were subjected to 10% SDS-PAGE electrophoresis and transferred on Trans-blot
nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Membranes were washed once in water and then
blocked in PBS containing 10% dried milk for 1 h at room temperature. Membranes were
blotted with an anti-polyhistidine mouse antibody (Amersham Biosciences) or an anti-Cre
97
rabbit antibody (Novagen) according to the manufacturer’s protocol in PBS containing 10%
dried skim milk. Membranes were washed 3 times in PBS containing 0.05% Tween 20
between each step. Afterward, they were blotted with an appropriate secondary HRP-
conjugated antibody (Dako Diagnostics) and later visualized with Western Lightning
Chemoluminescent Plus (Perkin Elmer) and Hyperfilm ECL films (Amersham Biosciences)
according to the manufacturer’s protocol. Images were digitized with a Nikon CoolPix
4500 camera. Spot densitometry of the 45 kDa HTNC band was performed using NIH
Image 1.62.
In vitro intracellular internalization assays Intracellular delivery assays were
performed in 8-well Lab-Tek chamber slides (Nalge Nunc Int.) or with cells adhered on a
glass coverslip in a 35 mm dish. For fluorescence microscopy analysis, cells were treated
with rhodamine-labeled proteins for 2 h (unless stated otherwise) at indicated
concentrations. Cells were then kept in complete medium for the remainder of the
experiment, washed three times in HBSS before they were fixed in 4% paraformaldehyde
in PBS for 10 min, rinsed once in PBS, stained with 100 ng/ml DAPI for 2 min, rinsed
twice in PBS and mounted under PBS/glycerol (1:1) for observation. Phase contrast and
fluorescence images were digitized with a Nikon CoolPix 4500 camera mounted on a Zeiss
Axiophot microscope at 100X and 200 X magnifications.
Statistical methodology Statistical analysis of the data was performed using
analysis of variance (ANOVA) test and P<0.05 was selected as significant threshold. Data
was drawn as mean ± SD for each time point or concentration.
98
Results
Tat-fusion protein uptake is temperature sensitive and does not lead to rapid nuclear
accumulation.
Recently, it was shown that incubation at 4°C strongly inhibited uptake of Tat-
fusion proteins (TFPs), suggesting that unlike short cationic peptides, full-length protein
internalization requires energy (Silhol et al. 2002). In order to assess the participation of the
endosomal pathway in TFP internalization, we first evaluated the effects of low
temperatures on protein uptake in NIH SSR mouse fibroblasts. As shown previously by our
group and others, uptake occurs in nearly 100% of cells treated with TFPs even at relatively
low concentrations (Schwarze et al. 1999; Caron et al. 2001). When applied on cells at 4°C,
the detection of Tat-β-Gal is reduced to a level comparable to the β-Gal control (Fig 1A).
Because mild fixation procedures, such as glutaraldehyde fixation, can lead to artifactual
cellular uptake of highly charged peptides (Lundberg et Johansson 2001; Richard et al.
2003), we examined TFP internalization using fluorescence microscopy. Incubation at 4°C
also resulted in a strong inhibition when the uptake was examined using rhodamine-labeled
Tat-β-Gal, illustrating even more clearly that the uptake of TFPs is reduced at low
temperatures. In contrast to enzymatic detection, when the uptake of TFPs was followed by
fluorescence microscopy, there was no detectable binding of the fluorescently labeled
proteins to the external cell surface at 4°C (Fig. 1B).
To examine the kinetics of TFP internalization, cells were incubated with
rhodamine-labeled Tat-eGFP for times varying from 10 to 60 min (Fig 1C). Fluorescence
microscopy clearly indicated that in contrast to short Tat peptides that rapidly accumulated
in the nucleus (Vives et al. 1997), full-length TFPs were not rapidly internalized in the
cytosol and nucleus. After 10 min, Tat-eGFP generally localized to the cell surface. After
30 min, Tat-eGFP further proceeded inside the cell clearly demonstrating a punctuate
appearance, indicative of localization in transport vesicles like endosomes or lysosomes.
99
After 60 min, Tat-eGFP started accumulating around the nucleus. Interestingly, even if the
TFPs used in this study contained the strong nuclear localization signal of Tat; none were
detected in the nucleus using fluorescence microscopy.
TAT-fusion proteins accumulate in the perinuclear region
To better characterize the final subcellular localization of TFPs, NIH SSR
fibroblasts were pulse treated for 2 h with rhodamine-labeled Tat-β-Gal or Tat-eGFP,
rinsed and then proliferated for 4 h in regular culture medium. Rhodamine-labeled Tat-β-
Gal and Tat-eGFP accumulated in the periphery of the nucleus (Fig.2A). Since some
endocytic pathways are known to target the ER and Golgi (Le et Nabi 2003), we sought to
establish if TFPs co-localized with these compartments. The cell region where TFPs
accumulated was stained by concanavalin A (con A), a lectin that recognizes sugars
commonly found in the ER and Golgi. While conA and TFPs were detected in the same
general intracellular region, they did not co-localize. Perinuclear accumulation was not
restricted to Tat-eGFP and Tat-β-Gal (Fig. 2A). Tat-Myc and Tat-Cre, a fusion protein
further investigated below, also accumulated around the nucleus (Fig. 2B). This was also
the case for Tat-eGFP in human myoblasts (Fig 2B). In our hands, all TFPs showed
perinuclear accumulation, without any significant visible nuclear targeting in all
investigated cell types, showing that this phenomenon is not restricted to mouse fibroblasts.
These results confirm previous work with Tat-eGFP indicating that internalized TFPs
demonstrate an intracellular distribution different from what is observed with similar
constructs expressed through transfection (Yang et al. 2002b).
Functional nuclear Cre recombinase assay
If TFPs proceed through the endosomal pathway to be later directed to a
compartment where they are degraded or sequestered, promoting endosomal release and
access to the cytosol should theoretically increase functional nuclear delivery. To exclude
potential artifacts in our study, we have designed an assay based on the detection of the
100
biological activity of the Cre recombinase in the nucleus. When added exogenously to
cultured cells, the native Cre protein from Bacteriophage P1 is internalized and performs
site specific recombination of DNA between LoxP sites (Will et al. 2002). Fusion of Cre to
PTDs such as the leader sequence from Kaposi FGF-4 (Jo et al. 2001) or the Tat peptide
(Peitz et al. 2002) can greatly enhance its cellular uptake and subsequent recombination. A
target cell line (NIH SSR) was generated by infection with SSR 69 (Westerman et
Leboulch 1996), a retroviral vector yielding G418 resistance following LoxP recombination
in the presence of Cre recombinase (Fig. 3A). When treated with a Tat-Cre fusion protein
(HTNC), NIH SSR cells undergo LoxP specific recombination. After selection with G418,
resistant colonies are generated and can be counted to evaluate the efficacy of the treatment
(Fig. 3A). NIH SSR cells were exposed to increasing concentrations of HTNC and
subjected to functional nuclear Cre assay. The quantification of neomycin resistant colonies
shows concentration-dependant increase relative to the HTNC added in the culture medium
(Fig.3B). This shows that our method can detect relatively small variations in the amounts
of biologically active HTNC delivered into the nucleus of the targeted cells.
Endosome-disrupting compounds dramatically increase functional nuclear delivery
We tested compounds known to increase the delivery of macromolecules, like
DNA, that enter cells via the endosomes. Chloroquine is a lysosomotropic agent thought to
have a buffering capacity preventing endosomal acidification. In addition, it can lead to
swelling and bursting of the endosomes and was shown to enhance DNA transfection
(Mellman et al. 1986; Erbacher et al. 1996; Ciftci et Levy 2001). When target cells were
co-incubated with 500 nM HTNC and 200 µM chloroquine, genomic recombination was
increased up to 23-fold in NIH SSR fibroblasts (Fig. 4A). Sucrose was also tested because
mammalian cells, in general, lack the intracellular dissaccharidase enzyme for metabolizing
sucrose. Adding sucrose to the cell culture medium has thus been noted to cause
intracellular cytoplasmic swelling within endosomes (Kato et al. 1984) and was used
previously to enhance plasmid DNA transfection efficiency in fibroblasts (Ciftci et Levy
2001). Indeed, sucrose co-incubation with HTNC resulted in up to 18-fold increased
101
recombination efficiency in NIH SSR (Fig. 4B) submitted to functional nuclear Cre
recombinase assay.
Increased functional nuclear delivery induced by lysosomotropic agents is not the result of
increased uptake
Membrane permeation or glycoprotein over-expression resulting in increased uptake
could have been responsible for the increased LoxP recombination measured when co-
incubating HTNC respectively with chloroquine or sucrose. To demonstrate that the
increased functional nuclear delivery of HTNC was caused by endosome disruption and
subsequent intracellular trafficking modifications and not by an increased cell uptake, we
examined the internalization of HTNC in cells co-incubated with a lysosomotropic agent.
We quantified the effects of chloroquine and sucrose on cell uptake, using an antibody
directed against the poly-His Tag, part of the HTNC fusion protein. Chloroquine treatment
did not significantly increase HTNC internalization as measured in total proteins recovered
from treated cells (Fig. 5A and 5C). Far from increasing HTNC uptake, sucrose co-
treatment resulted in significant decreases in HTNC immunodetection (Fig. 5B and 5D).
Most strikingly, co-treatment with 500 mM sucrose that increased 18-fold the functional
nuclear delivery of HTNC, decreased by 9-fold the levels of HTNC uptake. These results
clearly show that treatment with chloroquine or sucrose led to strong increases in LoxP
recombination due to a modification in intracellular trafficking and not increased cell
uptake.
Once internalized, the HTNC fusion protein is not rapidly degraded in lysosomes
The perinuclear accumulation observed in fluorescence microscopy 4 h post-
incubation could possibly have resulted from the recycling of labeled-amino acids in the
ER for neosynthesis following the rapid degradation by lysosomal enzymes or the
proteasome complex. The effects of chloroquine are not restricted to its buffering capacity
and thus interfere with intracellular transport beyond lysosomal enzyme degradation. To
102
evaluate more specifically the influence of lysosomal enzymes on internalized proteins, we
tested the effects of inhibitors of vacuolar H+-ATPases, bafilomycin A1 (BFLA) and
concanamycin A (CCM) (Ouar et al. 2003) on the functional delivery of HTNC to the
nucleus in NIH SSR cells. These inhibitors of lysosomal acidification, which do not result
in transport vesicle swelling, did not increase the functional HTNC delivery to the nucleus
(Fig. 6A and 6B).
While lysosomal enzymes did not seem to be significantly involved in HTNC
degradation, we wanted to confirm that internalized proteins persisted inside cells long
enough to be shipped to a proper compartment. We evaluated the apparent degradation of
the internalized HTNC using immunodetection. Immunoblotting against an epitope of the
Cre protein shows a slow decrease in intracellular Cre (Fig. 7). Nonetheless, more than 50
% of the internalized HTNC still remains intact after 8 h.
Proteasome inhibitor MG 132 increases HTNC functional nuclear delivery
The degradation of internalized TFPs by the proteasome complex could be
responsible for limited access to the nucleus and the decrease in the intracellular content of
HTNC and Tat-β-GAL after the uptake. To examine whether TFPs were degraded by the
proteasome, NIH SSR cells were co-treated with HTNC and increasing amounts of MG
132 and then subjected to functional Cre nuclear delivery. MG 132 is a potent, reversible,
and cell-permeable proteasome inhibitor targeting the chemotrypsin-like activity of the
proteasome (Tsubuki et al. 1996). As shown in figure 8, HTNC functional nuclear delivery
was increased respectively by 48% and 56% using MG 132 concentrations of 5 µM and 10
µM. At a higher dose, MG 132 showed some toxicity resulting in decreased recombination
efficiency.
103
Discussion
In this study, we have investigated the events implicated in the intracellular
transport of Tat-fusion proteins (TFPs) using a novel reporter system based on the detection
of the functional nuclear delivery of a Tat-Cre fusion protein. Our results showed that the
endosomal pathway plays a major role in the process of TFP internalization. TFPs
demonstrated a punctuate and temperature sensitive internalization. TFPs slowly
accumulated around the nucleus, not inside. Mild fixation procedure (0.25%
glutaraldehyde) imposed by β-Gal enzymatic detection led to a higher background in β-Gal
controls and to an apparently faint nuclear localization, which was never detected using
fluorescent detection. We attribute this discrepancy to the mild fixation procedure used in
this experiment that can lead to artifactual nuclear uptake of highly charged peptides
(Lundberg et Johansson 2001; Richard et al. 2003). Co-treatment with molecules known to
disrupt endosomal integrity (chloroquine or sucrose) caused large increases in functional
delivery of HTNC to the nucleus. Chloroquine treatment was previously reported to inhibit
endosomal acidification leading to a reduction in endosome delivery to lysosomes
(Mellman et al. 1986) and to cause membrane disruption (Erbacher et al. 1996). However,
the co-treatment with inhibitors of endosome/lysosome acidification did not increase LoxP
recombination efficiency, suggesting that vesicles containing TFPs did not fuse with
lysosomes or that the neutralization of endocytic vesicles is not sufficient. When cells were
co-incubated with rhodamine-labeled TFPs and lysosomotropic agents, there was no
apparent increase in the fluorescent labeling of the nuclei (results not shown). This
indicates that only a small proportion of delivered proteins can escape endosomes, even in
cells treated with lysosomotropic agents. This small amount of proteins is nevertheless
sufficient to produce a detectable recombinase activity. This capacity to evade endocytic
vesicles could be the result of the amphipathic helix structure found in the basic domain of
Tat.
104
These observations bring us to reconsider the main factors limiting direct protein
delivery using cationic peptides such as the basic domain from Tat. While most groups
have been developing means to increase the intracellular uptake (Ho et al. 2001; Mai et al.
2002), our data suggests that an inadequate intracellular trafficking of TFPs, resulting in
perinuclear sequestration, is the major factor limiting functional delivery. We can not
exclude the possibility that proteolysis played a role in the limited access of Tat fusion
proteins to the nucleus, since inhibitors of the proteasome did produce small increases in
LoxP recombination efficiency. As shown in figure 8 using anti-Cre immunoblotting,
internalized HTNC is degraded slowly by the cell, more than 50 % remaining after 8 h.
Therefore, perinuclear accumulation could not result exclusively from the recycling of
labeled amino acids through neosynthesis in the ER. Inhibitors of vacuolar H+-ATPases
produced no effect on functional nuclear delivery of HTNC, while proteasome inhibitor
MG 132 resulted in limited increases compared to endosome disrupting agents. We cannot,
however, exclude the possibility that the perinuclear accumulation is also responsible for
the absence of a rapid degradation. The small proportion TFPs that escape endocytic
vesicles, with or without help from disrupting molecules, could be more accessible to the
proteolytic machinery. In consequence, it would be interesting to test the synergistic effects
of chloroquine in combination with MG 132.
TFPs can bind to many cell types by associating non-specifically to sulfated-
membrane-bound glycoproteins (Tyagi et al. 2001). Our results confirm that TFPs purified
from bacteria, unlike small cationic peptides, enter cells via the endosomal pathway.
Endocytic vesicles containing TFPs mainly follow the caveolar endocytosis pathway
(Fittipaldi et al. 2003) or the lipid raft macropinocytosis pathway (Wadia et al. 2004). They
are then mainly segregated in the surroundings of the nucleus, where they are non-
functional. Only a very small proportion of internalized TFPs can reach the nucleus. While
the general localization of internalized TFPs is consistent with the ER or Golgi, and would
be a logical outcome for proteins entering using the caveolar endocytic pathway (Le et Nabi
2003) the exact compartmentalization is still uncertain. Indeed in accordance with recent
observations (Fittipaldi et al. 2003), and although TFPs generally accumulate in structures
105
resembling the ER/Golgi, we can not rigorously co-localize TFPs with markers of those
compartments. Interestingly, the cholera toxin (CTX) and ricin localize to the ER/Golgi and
are internalized via the clathrin-independent/caveolae-mediated endocytic pathway (Le et
Nabi 2003). In fact, CTX which possesses the ability to be internalized in cells is directed
to the Golgi through caveolae/raft-dependent endocytosis. It is still unclear whether this
perinuclear sequestration of TFPs is due to their internalization pathway or if this
phenomenon is restricted to proteins produced in bacteria being recognized as misfolded.
Internalized TFPs might be sorted back to follow a path that is analogous to the
retrotranslocation process imposed by the quality control mechanism to aggregated or
misfolded proteins directed to the ER or TGN for degradation or refolding (Chapman et
Munro 1994). Perinuclear accumulation is not uncommon with fusion proteins. It is often
observed in the case of over-expressed or misfolded recombinant proteins (Cudna et
Dickson 2003).
The punctuate fluorescence observed following the application of TFPs and the
stimulating effects of lysosomotropic agents on their efficient nuclear delivery
unquestionably point toward endocytosis. It was previously demonstrated that the basic
domain of the Tat protein could not bind to negatively charged membrane glycoproteins as
efficiently as polylysines or polyarginines (Mai et al. 2002). The properties exhibited by the
basic domain of Tat could extend beyond binding to sulfated proteoglycans. While TFPs
can not translocate across the cell membrane like small peptides, the Tat peptide may
confer some endosomolysis capacities resulting from the charge distribution found in its
helix (Ho et al. 2001). We therefore postulate that the unexpected efficiency reported in the
literature in recent years, with which the basic domain from Tat can internalized large
active cargos inside cells, does not result from a new membrane-translocating mechanism.
It is most probably the result of the multitasking nature of the Tat basic domain (strongly
cationic, amphipathic helix and nuclear localization signal). Our hypothesis, far from
disqualifying the basic domain of Tat as an instrument to perform the internalization of
active cargos in cells, suggests that its properties could be enhanced to optimize active
intracellular delivery.
106
Acknowledgements
We thank Dr. S.F. Dowdy for pTat, Dr. D. Jung for pcDNA-Myc, Dr. F. Edenhofer
pTriEx-HTNC, Dr. K Westerman for SSR 69, Dr R. Faure, P. Chapdelaine for helpful
discussions. This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. N.J.
Caron received a graduate scholarship from the CIHR.
107
Figure legends
Figure 1. Effects of incubation at 4°C and early intracellular distribution of Tat-fusion
proteins.
(A) Phase contrast microscopy analysis of Tat-β-Gal uptake and influence of low
temperature on the internalization process. NIH SSR fibroblasts were treated with Tat-β-
Gal or β-Gal (250 nM) for 2 h in complete medium, rinsed 3 times, fixed in glutaraldehyde
and stained with X-Gal. (B) Fluorescence microscopy analysis of NIH SSR treated with
rhodamine-labeled Tat-β-Gal or rhodamine-labeled β-Gal (500 nM) for 2 h in complete
medium, rinsed 3 times, fixed in 4% paraformaldehyde and stained with DAPI. (C)
Fluorescence microscopy analysis of the early subcellular localization of Tat-eGFP in NIH
SSR. NIH SSR treated with rhodamine-labeled Tat-eGFP (150 µg/ml) at 37°C for 10, 30
and 60 min, paraformaldehyde fixed and stained with DAPI.
Figure 2. Subcellular localization of Tat-fusion proteins.
(A) Fluorescence microscopy analysis of NIH SSR fibroblasts pulse treated with
rhodamine-labeled proteins Tat-β-Gal or Tat-eGFP (50 µg/ml) for 2 h. After a 4 h
incubation in complete medium, they were fixed, labeled with concanavalin A-FITC (50
µg/ml) and stained with DAPI. The lectin conA recognizes glycoproteins and core
oligosaccharides commonly found in the endoplasmic reticulum and Golgi. (B) Perinuclear
accumulation of Tat-Myc and TAT-Cre in fibroblasts and Tat-eGFP in myoblasts. Same
experiment as in A, using rhodamine-labeled Tat-Myc, Tat-Cre in NIH SSR fibroblasts and
rhodamine-labeled Tat-eGFP in DTT myoblasts.
108
Figure 3. Functional nuclear Cre assay.
(A) Schematic representation of functional nuclear Cre assay and dose dependent increase
in G418 resistant CFU generated by exogenously added HTNC to NIH SSR cells. (B)
Concentration-dependant HTNC functional delivery in NIH SSR fibroblasts. Cells were
treated with increasing concentrations of HTNC for 1 h in serum-free conditions and then
subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay. Resistant colonies were stained
and then counted. Fold increase was measured using the mean CFU of each group against
the control (0.25 µM HTNC). Each column represents the mean ± SD of duplicates.
Figure 4. Effects of lysosomotropic agents known to promote endosomal release on the
functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC).
Dose dependence of the increase of genomic DNA recombination mediated by exogenously
added HTNC in cells by lysosomotropic agents: chloroquine (A) or sucrose (B). NIH SSR
fibroblasts were rinsed in HBSS once and then co-treated with 0.5 µΜ HTNC and one of
the lysosomotropic agents, chloroquine (0-400 µM) or sucrose (0-500 mM), in serum free
culture medium for 45 min and subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay.
Fold increase was measured using the mean CFU of each group against the control
(concentration = 0). Each column represents the mean ± SD of duplicates.
Figure 5. Effects of lysosomotropic agents on the Tat-Cre fusion protein (HTNC) uptake
and binding to NIH SSR.
NIH SSR fibroblasts were co-incubated for 1 h with 0.5 µM HTNC and concentrations of 0
to 500 µM chloroquine (A, B) or 0 to 500 mM sucrose (C, D) in serum-free DMEM. Cells
were proliferated for 1 h and then rinsed three times in HBSS before recuperation in Protein
sample buffer. In (A, C) immunoblot analysis cell lysates using an anti-polyhistidine
antibody. Results of band densitometry are illustrated in (B, D). Each measurement is
expressed as a percentage of relative densitometry compared to the untreated control
109
(defined as 100%). Each column represents the mean ± SD of two readings per sample
from duplicates. Asterisks indicate significance level (P-value < 0.05) attained in
comparison to the control group (concentration = 0).
Figure 6. Effects of vacuolar H+-ATPase inhibitors, BFLA and CCM, on the functional
nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC) in NIH SSR.
Cells were pre-treated for 2 h with increasing concentrations of BFLA or CCM (0-200 nM)
in complete DMEM. Cells were then co-incubated in 1 µM HTNC with BFLA or with
CCM (0-200 nM) in serum-free medium and then subjected to the functional nuclear Cre
recombinase assay. Fold increase was measured using the mean CFU of each group against
the control (concentration = 0). Each column represents the mean ± SD of duplicates.
Figure 7. Tat-Cre fusion protein (HTNC) stability following internalization.
(A) Immunoblot analysis of the intracellular stability of the HTNC internalized by NIH
SSR cells. Cells were pulse-treated with 1 µM HTNC in serum-free DMEM for 1 h before
cells were rinsed and proliferated in HTNC-free culture medium for different amounts of
time. After proliferation, cells were directly harvested in protein sample buffer. Cell lysates
were analyzed by immunoblotting using an anti-Cre antibody. (B) Results of band
densitometry are expressed as percentage of the relative densitometry compared to the time
0 control (defined as 100%). Each column represents the mean ± SD of duplicates from
three separate experiments. Asterisks indicate significance level (P-value < 0.05) attained in
comparison to the control group (Time = 0).
110
Figure 8. Effects of the proteasome inhibitor MG 132 on the functional nuclear delivery of
HTNC.
NIH SSR cells were submitted to functional nuclear Cre recombinase assay in the presence
of MG 132. Cells were pulse treated with 1 µM Tat-Cre (HTNC) and increasing amounts
of MG 132 (0 to 100 µM) in serum-free DMEM HG for 1 h. Cells were then washed in
HBSS, submitted to an additional treatment of MG 132 (0 to 100 µM) in complete medium
for 3 h and then submitted to functional nuclear Cre recombinase assay. Fold increase was
measured using the mean CFU of each group against the control (concentration = 0). Each
column represents the mean ± SD of triplicates.
111
Figures
Figure 1 Effects of incubation at 4°C and early intracellular distribution of Tat-fusion proteins.
112
Figure 2 Subcellular localization of Tat-fusion proteins.
113
Figure 3 Functional nuclear Cre assay.
114
Figure 4 Effects of lysosomotropic agents known to promote endosomal release on the
functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC).
115
Figure 5 Effects of lysosomotropic agents on the Tat-Cre fusion protein (HTNC) uptake and binding to NIH SSR.
116
Figure 6 Effects of vacuolar H+-ATPase inhibitors, BFLA and CCM, on the functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC) in NIH SSR.
117
Figure 7 Tat-Cre fusion protein (HTNC) stability following internalization.
118
Figure 8 Effects of the proteasome inhibitor MG 132 on the functional nuclear delivery of HTNC.
119
Chapitre 4:
Immortalisation réversible de myoblastes humains par la transduction d'une protéine de fusion Tat-Cre recombinase
Nicolas J. Caron, Marie-Eve Ducharme, Philippe Mills, Simon P. Quenneville and Jacques
P. Tremblay
Contribution de chaque auteur:
J’ai effectué le travail dans son entier à l'exception de la culture cellulaire humaine menant
à la lignée cellulaire HPM 45 par Marie-Ève Ducharme. J’ai rédigé l’article, Simon
Quenneville et Philippe Mills m’ont assisté dans la culture cellulaire. Jacques P. Tremblay
a supervisé mes travaux.
(à soumettre à Molecular Therapy en mai 2004)
120
Résumé
La capacité proliférative limitée des myoblastes isolés de patients DMD limite notre
habilité à les modifier génétiquement et les produire en quantité suffisante pour leur
utilisation dans le contexte thérapeutique de la transplantation de myoblastes. Notre groupe
de recherche a précédemment immortalisé et proliféré des myoblastes issus de patients
DMD en utilisant l'Antigène T de SV40 (AgT) et hTERT. En utilisant un vecteur rétroviral
codant pour l'AgT flanqué de sites LoxP, la réversion de l'immortalisation peut être
effectuée avec la recombinase Cre. Pour contourner la nécessité d'effectuer une infection
additionnelle avec un vecteur codant pour la Cre, nous avons utilisé une protéine de fusion
Tat-Cre pour générer la recombinaison nécessaire à la réversion de l'immortalisation. Nos
travaux démontrent qu'en optimisant le ciblage nucléaire en utilisant des concentrations
élevées de Tat-Cre, en co-incubant avec de la chloroquine et en sélectionnant les cellules ne
contenant plus de vecteur non recombiné, l'excision complète de l'AgT a pu être réussie à
l'aide d'un seul traitement de 1 h. En plus de données moléculaires démontrant l'excision de
la cassette immortalisante, le traitement Tat-Cre/chloroquine produit un arrêt de la
prolifération cellulaire en moins de 2 jours. La culture cellulaire résultante peut être
maintenue pendant plus de 2 semaines. Ces résultats indiquent que le ciblage nucléaire avec
une protéine Tat-Cre recombinante pourrait être utile dans plusieurs applications
thérapeutiques nécessitant la manipulation génétique de cellules en culture.
121
Tat-mediated Cre recombinase delivery for the reversal of
human myoblast immortalization
Nicolas J. Caron*, Marie-Eve Ducharme*, Philippe Mills*, Simon P. Quenneville*and Jacques P. Tremblay*,1 *Unité de Recherche en Génétique humaine, Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université Laval, Québec, Québec, Canada 1corresponding author: Jacques P. Tremblay, Ph.D Laboratoire de Génétique humaine (RC-9300) Centre de recherche du CHUL 2705, boul. Laurier Ste-Foy, (Qc), Canada, G1V 4G2 Phone: (418) 654-2186 Fax: (418) 654-2207 E-mail: [email protected] 2Abbreviations used: CFU, colony forming units; CPP cell-penetrating peptide; DMD, Duchenne muscular dystrophy; DTT, DMD-Tag-Telo; GCV, Gancyclovir; hTERT, human telomerase reverse transcriptase; IRES, internal ribosomal entry site; HPM, human primary myoblast; MPD, mean population doublings; MTS, membrane translocating sequence; PTD, protein transduction domain; TAg, SV40 T-Antigen. Running title: Tat-Cre mediated reversal of myoblast immortalization
(To submit to Molecular Therapy in Mai 2004)
122
Abstract
The reduced proliferating capacity of DMD myoblasts limits their ability to be genetically
modified and proliferated in vitro for their use in autologous transplantation. Previously,
our research group has successfully immortalized and extensively proliferated DMD
myoblasts using the SV-40 Large T antigen (Tag) and hTERT. Using a retroviral vector
coding for TAg flanked by LoxP sites, immortalization reversal can be performed by Cre
delivery. To circumvent the requirement for an additional infection, we used a Tat-Cre
recombinase fusion protein to exert the recombination necessary for immortalization
reversal. Here, we demonstrate that by optimizing the delivery using a high concentration
Tat-Cre protein, by co-incubating with chloroquine and by selecting against cells
containing copies of the unrecombined vector, complete TAg removal could be achieved
with a single 1 h treatment. In addition to the molecular evidence demonstrating
immortalizing cassette removal, Tat-Cre/chloroquine treatment also resulted in growth
arrest within 2 days. The resulting cell culture could be maintained for at least 2 weeks.
These results indicate that the intracellular delivery of a recombinant Tat-Cre protein could
be a useful tool for a variety of applications that necessitate the manipulation of cells in
culture.
123
Introduction
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary disease caused by the absence of
functional dystrophin in muscle fibers (Hoffman et al. 1987). To this day, there is still no
efficient therapy available for DMD patients. The transplantation of myoblasts, proliferated
from muscle biopsies, is a potential treatment for DMD and other hereditary diseases
(Partridge et al. 1978). The poor results obtained in clinical trials of myoblast transfer
performed in the early 90s indicated that serious problems were limiting the efficiency of
the procedure (Skuk et Tremblay 2000a). The limited migration outside the injection site,
the early death of injected cells and the host specific immune response against hybrid fibers
were identified as major factors limiting the efficacy of myoblast transplantation (Skuk et
Tremblay 2003a). We have shown that by controlling the immune response with
immunosuppressive drugs such as FK 506 could lead to very efficient myoblast
allotransplantation (Kinoshita et al. 1994c; Skuk et al. 2002a). However, prolonged
treatment with FK 506 is known to cause adverse affects such as neuro- and nephrotoxicity
(McDiarmid et al. 1995).
Ultimately, to minimize the presence of foreign antigens, myoblasts isolated from the
patient should be genetically corrected to express functional dystrophin and serve as a
vehicle for the therapeutic gene. For a significant correction of the dystrophic defect, a
large quantity of cells would need to be transplanted in DMD patients. This would require a
large expansion of myoblasts before transplantation. Unfortunately, the proliferation of
myoblasts isolated from patients suffering from DMD is hampered by a major challenge
due to the limited life span of these cells in culture (Webster et Blau 1990). Myoblasts
isolated from young DMD patients (5 to 6-year old) have already undergone an extensive
number of cell doublings in response to constant muscle fiber regeneration (Decary et al.
1997). Their replicative life span being almost completely exhausted, they rapidly become
senescent and cannot be expanded in culture to reach therapeutically significant numbers.
The SV-40 large T antigen (Tag) can extend the proliferation capacity of DMD myoblasts
124
by about 20 divisions (Simon et al. 1996a). We have successfully immortalized and
extensively proliferated DMD myoblasts using the SV-40 large T antigen (Tag) and
hTERT, the catalytic subunit of human telomerase (Seigneurin-Venin et al. 2000b).
Although oncogenes can confer a partial yet functional immortalization to human
myoblasts, reversing their immortalized phenotype before transplantation would be highly
desirable. TAg can interact with muscle regulatory factors and can interfere with the normal
differentiation process leading to the formation of myofibers (Mouly et al. 1996). When we
compared the transplantation efficiency of Tag immortalized myoblasts against primary-
cultured myoblasts, we found that they died faster, more massively and they triggered a
more rapid CD8+ cell infiltration (Skuk et al. 2003). To circumvent the undesirable effects
exerted by long-term expression of a viral oncogene several strategies were utilizied: a heat
inactivated mutant Tag (Jat et Sharp 1989), the expression of Tag under the control of a
promoter down-regulated during differentiation (Mouly et al. 1996) and a Cre removable
expression cassette located between LoxP sites (Westerman et Leboulch 1996). To be
effective, the immortalization reversal must be performed shortly before transplantation.
Cell manipulation using viral vectors to carry cDNA of interest can be very effective, but
the infection of millions of cells prior to their transplantation raises safety issues. The use
of high titers of recombinant viruses to infect cells in culture can create some difficulties
such as broad cell-to-cell intracellular concentration ranges, cytotoxicity, insertional
mutagenesis and immune response against viral structural proteins (Kunieda et al. 2002).
The intracellular delivery of exogenously added active proteins has recently been improved
by their fusion to short peptides known as protein transduction domains (PTDs) or cell-
penetrating peptides (CPPs) (Vives et al. 2003). These highly cationic peptides include Tat
(Frankel et Pabo 1988; Mann et Frankel 1991), Antennapedia (Joliot et al. 1991) and
arginine-rich peptides (Wender et al. 2000). Recent and mounting evidence shows, that in
contrast with amphipathic short peptides, full-length protein, fused to basic sequences such
as Tat, do not translocate through the membrane but rather enter cells through caveolar
125
endocytosis (Fittipaldi et al. 2003; Richard et al. 2003; Caron et al. 2004). Recombinant
fusion proteins bearing the PTD from the Kaposi fibroblast growth factor (FGF-4) (Jo et al.
2001) and the PTD from Tat (Peitz et al. 2002) have already been used to transduce
enzymatically active Cre proteins directly into mammalian cells. We have previously
demonstrated that the proliferative capacity of DMD myoblasts can be significantly
increased by their infection with a retrovirus containing the SV40 TAg inserted between
LoxP sites (Seigneurin-Venin et al. 2000b). In addition, myogenic cells can be transduced
at high efficiency by Tat-fusion proteins (Caron et al. 2001).
The purpose of our study was to examine whether the Cre recombinase fused to the PTD of
the Tat protein could be efficiently delivered in immortalized human myoblasts to exert
complete removal of the TAg flanked by LoxP sites. In the present work, we demonstrated
the ability of an exogenously added Tat-Cre fusion protein to induce the recombination
between LoxP sites previously inserted in myogenic cells lines through retroviral infection.
We showed that by optimizing the delivery using a high concentration Tat-Cre protein, by
co-incubating with chloroquine and by selecting against cells containing copies of the
unrecombined vector, complete removal could be achieved with a single 1 h treatment. In
addition to the molecular evidence demonstrating immortalizing cassette removal, the
treatment also resulted in growth arrest within 2 days.
126
Results
Vector design for the reversible immortalization of myoblasts
We have previously demonstrated that primary myoblasts isolated from DMD patients
could be immortalized and extensively proliferated in culture following their infection with
constructs coding for TAg and hTERT (Seigneurin-Venin et al. 2000b). The DMD-TAg-
Telomerase myogenic cell line (DTT) was generated by transfection with the SSR 69
retroviral vector and subsequent infection with the polycistronic retroviral vector pBabe-
hTERT-puro as previously described (Seigneurin-Venin et al. 2000a).The pBabe-hTERT-
puro vector does not contain recombination target and is not affected by the presence of Cre
recombinase. SSR 69 is a polycistronic vector that contains an TAg expression cassette
surrounded by two LoxP sites and thus can be excised by the Cre recombinase. The
polycistronic expression cassette contains an initiation codon followed by a LoxP
recombination target, the hygromycin resistance/tk(HSV-1)-fusion gene, the
encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry site, that allows the initiation of
translation of the TAg from SV40 (Westerman et Leboulch 1996). Following the second
LoxP site, the vector also encodes for the neomycin resistance gene (neo) missing the ATG
initiation codon, which can thus be translated only when the integrated construct is
subjected to CRE mediated site-specific recombination (Fig. 1A). Cells containing the
unrecombined vector are immortalized by TAg, resistant to hygromycin and are sensitive to
Gancyclovir (GCV) treatment. After recombination, cells loose the previous characteristics
and become resistant to G418.
Tat-Cre intracellular transduction produces site-specific recombination of SSR 69
Tat/PTD promotes the cellular uptake of recombinant Cre recombinase and delivers its
biologically active cargo to living cells (Peitz et al. 2002). To assess the potential of a Tat-
Cre fusion protein (polyhistidine-Tat/PTD-NLS-Cre fusion protein, HTNC) to excise the
Tag oncogene from immortalized cells, we first tested the principle on the packaging cell
127
line PA317 SSR 69. We have designed a PCR diagnosis strategy for rapidly detecting site
specific recombination in targeted cells. In short, DNA purified from cells of interest are
submitted to multiplex competitive PCR using three primers (Pp, Ph and Pn) designed to
generate a 870 bp product in presence of the unrecombined vector and a 550 bp product
following recombination (Fig 1A). As shown by figure 1B, treatment of PA317 SSR 69
cells with 500 nM HTNC for 45 min generated site specific recombination as demonstrated
by the presence of a 500 bp band in treated samples.
We then proceeded to test the immortalization reversal of DTT cells using Tat-mediated
delivery of the Cre recombinase. DTT cells were treated with 1 µM HTNC, selected with
1.2 mg/ml G418 and 20 µM Gancyclovir (GCV). Cells selected using G418 did not exhibit
growth arrest typical of immortalization reversal (Westerman et Leboulch 1996; Noguchi et
al. 2002). Their subsequent selection in GCV resulted in rapid death within 5 days. This
apparent contradiction was elucidated when clones derived from G418 resistant HTNC
treated DTT cells were subjected to SSR 69 multiplex PCR diagnosis. Eight clones isolated
from G418-resistant HTNC-treated cells tested positive for both the intact SSR 69 vector
and the recombined version. This indicates that the DTT immortalized cell line contained
multiple copies of the vector in their genome (Fig. 1C).
Optimization of Cre functional delivery in human myoblasts
In order to optimize the functional delivery of active Cre in targeted cells, we tested various
conditions that had previously been shown to affect Cre PTD-mediated internalization.
First, we compared the efficiency of different Cre-fusion proteins used previously (Jo et al.
2001; Peitz et al. 2002). We tested the efficiency of those constructs with a functional
nuclear Cre recombinase assay that we recently introduced (Caron et al. 2004). In short,
this assay is based on the properties of the SSR 69 vector. It contains only one initiation
codon selectively permitting translation of the hygro/tk-IRES-Tag cassette in the
unrecombined vector or the neo gene following recombination. Thus, neo can be translated
128
only when the integrated plasmid is subjected to Cre mediated site-specific recombination
of the two LoxP sites (Fig. 1A). After selection with G418, resistant colonies are generated
and can be counted. The quantification of neomycin resistant colonies shows increases
which are proportional to the amount of active Cre recombinase reaching the nucleus
(Caron et al. 2004). We compared HTNC against a Cre-fusion protein comprising the 12
amino acid membrane translocation sequence (MTS) from the Kaposi fibroblast growth
factor (HNCM) and a Cre-polyhistidine control (CH) to transduce enzymatically active Cre
proteins directly into mammalian cells. HTNC was respectively 4 times more efficient than
HNCM and 3.4 times more efficient than CH to mediate the recombination of the LoxP
sites contained in the DTT human myoblast cell line (Fig. 2A).
Successful myoblast transplantation would require a large quantity of cells to be
transplanted in DMD patients. Cre-fusion proteins delivery is optimized in serum-free
medium. Therefore, we had to establish conditions in which intracellular delivery was
maximized without affecting cell viability. When incubating DTT cells in presence of 500
nM HTNC in serum-free DMEM, the maximum efficiency as expressed in G418 resistant
colony forming units (CFU) was obtained after 60 min (Fig. 2B). While incubation for
more than 60 min could increase intracellular delivery, the increased cytotoxicity resulting
from serum deprivation led to a decrease in CFU counts. Because electrostatic interactions
with glycoproteins play an important role in the process by which PTDs enter cells, dextran
sulfate (DS) pre-treatment can enhance the transduction efficiency (Mai et al. 2002). In
addition, we have recently demonstrated that since Tat-fusion proteins enter cells through
endocytic transport, co-incubation with endosomolytic agents such as chloroquine or
sucrose can increase by up to 24-fold the efficiency of HTNC functional nuclear delivery in
human myoblasts (Caron et al. 2004). Moreover, because polyhistidine purification tags
can be further protonated in subphysiologic pH conditions, their interaction with negatively
charged glycoproteins at the cell surface can be increased in acidified medium (Mai et al.
2004). We tested several variations to determine which condition would result in the most
efficient delivery of HTNC in DTT myoblasts as followed by functional nuclear Cre
recombinase assay. DTT were incubated with 500 nM HTNC in serum-free conditions for
129
60 min and then subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay. In addition to
HTNC treatment, DTT were incubated in DS (pre-incubation for 2 h in 500 µg/ml dextran
sulfate), chloroquine (co-incubation with 200 µM chloroquine), acidified medium
(incubation in acidic pH 5.6) or combinations of the three treatments. Overall, the
maximum floxing was obtained using chloroquine co-incubation (Fig. 2C). Chloroquine
co-incubation led to 24-fold increase in the generation of G418 resistant CFUs while DS
pre-treatment resulted in a 4.3-fold increase and acidification of the culture medium to a
more modest 70% increase. The combinations of those treatment led to very important
increases, but never exceeding the results obtained using incubation with 200 µM
chloroquine alone.
Immortalization and characterization of myogenic cell lines
We hypothesized that the presence of multiple SSR 69 insertions in DTT cells explains
why we could not efficiently remove all copies of the TAg oncogene, even after using
selective agents. Our goal was to perform complete immortalization reversal of myoblasts,
but also to diminish the risks associated with the procedure as much as possible. To
facilitate the process, we established immortalized myogenic cell clones that would contain
only one SSR 69 integrative event. Thus, new immortalized cell lines were derived from
muscle necropsy of a 45-year-old man. Primary cultured satellite cells were obtained from
the necropsy of abdominal muscles. Human primary myoblasts (HPM) were first infected
using serial dilutions of the supernatant from PA317 SSR 69 amphotropic packaging cells.
Infected cells were then proliferated in medium containing 800 µg/ml G418 until distinct
colonies appeared (12 days). To minimize the possibility of multiple integrative events, the
lowest retroviral titer used still yielding G418 resistant colonies was used to isolate clones.
Twelve clones were further studied and two clones (HPM A3 and HPM B1), that
demonstrated the most obvious myogenic characteristics (such as shape and desmin
positivity), were used for further experiments. Both G418 resistant clones were then
infected with supernatant from PA317 pBabe-hTERT-puro and proliferated in complete
medium with 1 mg/ml puromycin for 15 days. As it was the case for DTT myoblasts, HPM
130
TAg-hTERT (HPM TT) A3 and B1 were all positive for desmin, a marker of the myogenic
lineage (Fig. 3A). In addition, when cultured in differentiation conditions for 4 days, both
cell lines demonstrated extensive fusion leading to the formation of polynucleated
myofibers (Fig. 3B). While HPM TT clones could readily form multinucleated myotubes
without having to proceed to immortalization reversal, DTT myoblasts did not fuse very
well (Fig.3C). In striking contrast, when DTT cells were treated with HTNC/chloroquine
and selected in 1.2 mg/ml G418 for 10 days before they were cultured in differentiation
medium, they formed multinucleated myotubes (Fig.3C). This extensive fusion capacity
was maintained even after 100 mean population doublings (MPDs).
Complete excision of the TAg oncogene from immortalized HPM cell lines
We tested TAg removal efficiency from the two HPM TT clones in comparison to DTT
cells (Fig. 4A). The 3 clones were treated with a low concentration of HTNC (400 nM) and
subsequently selected with 1.2 mg/ml G418 for 12 days. As shown by immunoblot analysis
of total proteins recovered from treated cells, both HPM TT clones showed a complete
removal of TAg production while DTT cells only demonstrated a decrease (Fig 4B). Figure
4C shows the time course of TAg removal from HPM TT B1 clone treated 2 successive
days with HTNC/chloroquine (2 µM/200µM) followed by selection in 800 µg/ml G418.
After 3 days of selection, only traces of TAg could be detected in HPM TT B1 cells. After
10 days, G418 selection resulted in complete TAg removal. Then we examined the
percentage of TAg-positive cells using immunofluorescence staining (Fig. 4D): TAg
nucleus labeling gradualy decreased, going from nearly 100% prior to HTNC treatment, to
51% after the first day, 11% after two treatments, and 4% after 3 days in selection (Fig.
4E). It is still unclear whether the weak TAg signal that is observed after 3 days of selection
is truly the result of cells still containing an unrecombined version of the SSR 69 vector
(Fig 4D). Fluorescence microscopy cytology shows that the few cells still demonstrating
TAg in their nucleus have a very weak signal in comparison to controls (Fig. 4E). In
addition, virtually no cell death occurred after 3 days during these experiments. These weak
Tag positive cells could be the result of some TAg protein left behind after the removal of
131
the TAg gene due to slower degradation or delayed action of the recombinase in these few
cells.
TAg excision leads to growth arrest
As we have previously reported that myoblasts isolated from DMD patients overexpressing
TAg and hTERT were efficiently immortalized and that they could be proliferated well
beyond 100 MPDs (Seigneurin-Venin et al. 2000b). HPM TT clones also saw their life
span dramatically increased by the double infection procedure (Fig. 5). Primary cultured
cells (HPM 45) from which we derived both HPM TT clones could only be proliferated for
approximately 40 days in culture. Between 15 to 17 MPDs, their growth rate decreased
significantly and they could not reach confluency. On the other hand, both HPM TT A3 and
B1 proliferated beyond 60 MPDs, outpacing their non-infected primary cultured parents by
more than 40 population doublings, and are still proliferating without any signs of a
senescence. When subjected to HTNC/chloroquine treatment and G418 selection, as
described earlier and illustrated in figure 4, HPM TT clones A3 and B1 underwent
complete growth arrest. Hence, HTNC/chloroquine treatment does not only lead to TAg
removal using molecular detection tools, but HPM TT A3 and B1 also shows phenotypical
signs of immortalization reversal (see grey arrows and growth curves on figure 5).
132
Discussion
One major concern, related to the use of immortalizing oncogenes to increase the
proliferation capacity of cells prior to their transplantation, is the generation of transformed
cells unfit for their safe implantation into a human host. Previous strategies to conditionally
immortalize cell lines using the Cre/Lox system relied on the sustained expression of the
Cre recombinase with high titer retrovirus (Westerman et Leboulch 1996), adenovirus
(Berghella et al. 1999) or lentivirus (Salmon et al. 2000) vectors for the removal of the TAg
oncogene. The large scale application of myoblast transplantation into a DMD patient
designed to reach therapeutically significant results would require the transplantation of at
least several hundreds millions of cells. The use of a reversible immortalization strategy to
assist myoblast transfer dictates that the reversal procedure would have to be performed in
the days preceeding the transplantation. The great number of integrating events imposed by
the infection of hundreds of millions of cells using integrating retroviruses could potentially
lead to insertional mutagenesis. On the other hand, the use of high titers of non-integrating
viruses such as the adenovirus can be cytotoxic and can leave viral proteins that could be
immunogenic once the cells are transplanted inside the host. In itself, the long-term
expression of the Cre recombinase in transplanted cells may also be risky. First, the
overexpression of a foreign Cre protein inside the transplanted cells is in contradiction with
our goal of minimizing the presence of foreign antigens through an autotransplantation
strategy. Secondly, it was shown that the continuous expression of the Cre recombinase in
cultured cells lacking LoxP sites could cause decreased growth, cytopathic effects, and
chromosomal aberrations (Silver et Livingston 2001). These safety concerns led us to
examine the potential of a Cre recombinase fused to the Tat PTD to produce an efficient
and complete removal of the TAg flanked by LoxP sites in immortalized human myoblasts.
Our work to optimize the delivery of HTNC in DTT myoblasts led us to the conclusion that
multiple integration of the immortalizing vector could be problematic. While the pulse
treatment of cultured cells using a Tat-fusion protein has advantages in terms of safety, it
133
also has its limitations. Groups that worked on similar strategies, using viral vectors instead
of PTD-mediated delivery, did not describe such limitations related to the multiplicity of
immortalizing vector copies contained in the target cells. The pulse treatment using a Tat-
Cre fusion protein is probably not as powerful as the long-term expression inherent to
recombinant DNA delivery using viral vectors. But the generation of immortalized cell
lines in conditions that favored the integration of a single copy of the TAg carrying vector
made our more subtle approach as effective. Ironically, the presence of multiple copies of
the SSR 69 vector in DTT cells was very useful for the optimization of Cre delivery to
myoblasts. Since myoblasts such as HPM TT clones underwent growth arrest even when
using low HTNC concentrations followed by selection in G418, they could not have been
used in our functional nuclear Cre assay because proliferation is necessary to form colonies.
We observed that DTT cells could not undergo extensive terminal differentiation in vitro
unless TAg was removed at least partially from its genome. In contrast, HPM TT clones
could differentiate efficiently even without being submitted to HTNC/chloroquine
treatment and selection. As we have previously discussed, the DTT cell line has most
probably incorporated several copies of TAg and should therefore express larger amounts
of the gene product. These observations are in agreement with previously published data
showing that high level expression of TAg could interfere with the formation of myotubes
(Mouly et al. 1996) while constructs designed to be down-regulated during myogenic
differentiation were more favorable to the process (Deschenes et al. 1997). Although TAg
removal was incomplete, as shown by the absence of growth arrest, the HTNC/chloroquine
treatment of DTTs dramatically increased their fusion capacity.
In conclusion, this work provides the proof of principle that Tat/PTD-mediated delivery of
the Cre recombinase can exert the efficient removal of the TAg to result in immortalization
reversal of myoblasts previously immortalized using a retroviral vector. Using such a
strategy should increase the proliferation capacity of myoblasts isolated from DMD patients
to the extent of permitting their genetic correction as well as their extensive proliferation.
134
Most importantly, using Tat-mediated Cre recombinase delivery, we have circumvented the
use of recombinant viruses in the de-immortalization process, which could represent
significant risks to the patient. In addition, this type of system could be adapted for the
manipulation of a variety of human cells that would suffer from prolonged Cre expression
or that can not be easily infected with recombinant viruses.
135
Materials and methods
Constructs and purification of fusion protein purification. SSR 69 is a polycistronic
retroviral vector that contains the hygro-tk fusion gene and the SV40 T-antigen gene
flanked by LoxP sites and followed by neo gene (Westerman et Leboulch 1996). The
pTriEx-HTNC plasmid coding for a 6xHIS-TAT/PTD-SV40/NLS-Cre fusion protein
(HTNC) and pTriEx-CH plasmid coding for a Cre-8xHIS fusion protein were provided by
Dr. F. Edenhofer (Peitz et al. 2002). The pHNCM plasmid codes for a 6xHIS-SV40/NLS-
Cre-FGF4/MTS and was graciously provided by Dr. E. Ruley (Jo et al. 2001). The pBabe-
hTERT-puro plasmid is a polycistronic vector coding for the human telomerase catalytical
subunit and the puromycin resistance gene constitutively expressed via the LTR promoter.
It does not contain any LoxP recombination targets and was constructed as previously
described (Seigneurin-Venin et al. 2000b). Cre-fusion proteins were overexpressed in
bacteria and were purified under native condition by affinity chromatography on a Ni-NTA
column followed by dialysis in PBS. by In short, BL21 Plus RL (Stratagene, La Jolla, CA)
colonies freshly transformed with pTriEx-HTNC were inoculated in LB medium containing
34 µg/ml chloramphenicol, and 50 µg/ml ampicilin overnight in 200 ml. On day 2, bacteria
were inoculated 1:10 (2L) and grown at 37°C until they reached 0.8 OD595nm. They were
then induced using 0.5 mM IPTG for 3 h at 37°C. Cells were harvested and spun down to
be stored at –80°C. β-Gal fusion proteins were produced in the same manner, except that no
induction was performed and cells were grown at 32°C during their final stage. Bacteria
were sonicated 5 min in two stages in buffer A (Hepes 100 mM pH 8.0, NaCl 300 mM,
Imidazole 10 mM) and centrifugation (2500g, 10 min) cleared cell lysates (50 ml total)
were loaded on 5 ml Ni-NTA agarose (Qiagen, Mississauga, ON) column. Afterwards, the
resin was washed twice with buffer A (50 ml), twice in buffer A adjusted at 20 mM
imidazole and eluted twice in 5 ml buffer A adjusted to 250 mM Imidazole. The eluate was
dialyzed against 50 mM NaH2PO4, 5 mM TRIS, 450 mM NaCl, 5% glycerol overnight at
4°C. Purified fusion protein concentrations were determined by Coomassie Blue staining of
SDS-PAGE compared to BSA standards.
136
PCR diagnosis. Total genomic DNA of cell samples was extracted using QIAmp DNA
mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's protocol. Primers were
designed to generate two distinct bands specifically at 870 bp for the unrecombined vector
and 550 bp for the recombined vector. The forward primer was based on the ψ packaging
signal (Pp: 5'-CAGGTTAAGATCAAGGTCTT-3') while the reverse primers (Ph: 5'-
GTGTCGTCCATCACAGTT-3' and Pn: 5'-GTGAGATGACAGGAGATC-3') and were
based respectively on the hygro and neo resistance genes. Fifty microliters of PCR mixture
contained 1 mM dNTPs, 30 pmol of each of the three primers, 500 ng of sample DNA, and
1.25 units of Taq DNA polymerase (Qiagen, Hilden, Germany). Thirty-four cycles were
carried out at 95°C for 45 s, 61 °C and 72 °C. PCR products were separated on a 1.5%
agarose gel in 0.5X TBE buffer. Gels were stained with ethidium bromide and images were
digitized using an AlphaImager imaging system (Alpha Innotech, San Leonado, CA)
Cell culture and cell lines. The PA317 cell line (amphotropic retrovirus packaging cell
line) was grown in DMEM HG medium supplemented with 10% Newborn Calf Serum, 10
000 U/ml penicillin/streptomycin in 5% CO2 at 37°C. PA317 SSR 69 and PA317 pBabe-
hTERT-puro are PA317 cells stably transfected respectively with the SSR 69 and pBabe-
hTERT-puro construct. Retroviral packaging cell lines were transfected with Metafectene
lipofectant (Wisent, Montreal, Qc) and selected for 21 days with the appropriate selective
agent 400 µg/ml hygromycin B (Roche, Laval, Qc) or 2 µg/ml puromycin (Invitrogen,
Carlsbad, CA). DTT (DMD-TAg-hTERT) were derived from the myoblasts of a Duchenne
Muscular Dystrophy (DMD) patient as previously described (Seigneurin-Venin et al.
2000b). These myoblasts were immortalized with the SSR 69 vector and pBabe-hTERT-
puro and were proliferated in MCDB 120 medium (BioMedia) supplemented with 10%
FBS (BioMedia), 10 ng/mL of Epidermal Growth Factor (EGF); 0,5 mg/mL of Bovine
Serum Albumine (BSA); 0,4 µg/mL of dexamethasone; 5 µg/mL of insulin; 100-units/mL
of penicillin and 100 µg/mL of streptomycin. Retroviral infections were carried out by spin
137
infection of target cells with PA317 supernatant with 8 µg/ml polybrene. SSR 69
immortalized clones were established using cloning rings.
Human primary myoblast culture. Human donor skeletal muscle tissues were obtained
through the “Quebec transplant” network, according to the guidelines of the Comité
d’Éthique de la Recherche Clinique du CHUL. Skeletal muscles necropsy was performed
under sterile conditions from the abdomen of a 45-year-old man and collected in HBSS
(Invitrogen). After collection, tissues were dissected out to eliminate conjunctive tissues
and fatty tissues. Minced tissues were digested in HBSS solution containing 2,5 mg/ml
dispase II (Roche) and 2 mg/ml collagenase (Sigma) at 37oC with a gentle agitation for 1
hour. Digested tissues were separated from undigested tissues (fibers) by a weak and quick
spinning (75G) and the pellet was digested with 0,25% trypsin (BioMedia) at 37oC with a
gentle agitation for another 30 minutes. After digestion, was added to inhibit the activity of
enzymes. The fibers were separated again by a weak and quick spinning of digested tissues.
The pellet were washed once with HBSS and resuspended in complete MCDB 120 media.
Roughly 2 to 3 ml was placed for each T-25 flask to permit satellite cells to detach from
fibers and adhere on bottom flask after 3 days of culture. Fibers were then eliminated and
media was changed every 3 days. For the analysis of proliferation, the mean number of
population doublings at every passage was calculated as logN/log2, where N is the number
of cells initially seeded on the dish as previously described (Seigneurin-Venin et al. 2000b).
Functional nuclear Cre recombinase assay. Prior to treatment, DTT cells were seeded at
10 000 cells per well in 24-well plates (Corning, Cambridge, MA). Two days later, cells
were washed twice in HBSS before they were co-incubated in serum-free DMEM HG
containing 0.5 µM or 1 µM HTNC for 1 h. Cells were co-incubated with 200 µM
chloroquine (Sigma) or pre-incubated with 500 µg/ml dextran sulfate. Unless stated
otherwise, the incubation mix was removed and cells were then proliferated overnight in
complete medium. 24 h later, cells were trypsinized and plated (1:1 for DTT and 1:2
dilution for NIH SSR) in T-25 flasks containing complete medium and 1200 µg/ml G418
138
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Cells were passaged until distinct colonies appeared (12 days
for DTT). Cells were rinsed twice in HBSS, then colored with Coomassie blue and rinsed
in an acetic acid/ethanol/water (1/1/3) solution. Colony forming units were counted. Each
point corresponds to mean of duplicate or triplicate wells with standard deviation.
Immunoblotting. After rinsing 3 times with PBS, cells were recovered directly from
culture dishes by adding sample buffer (50 mM TRIS pH 6.8, 2% SDS, 0,1% Bromophenol
Blue, 10% Glycerol) and were then frozen at –20°C immediately until analysis. Sample
protein concentration was established using protein dot densitometry stained with amido
black 10B curved fitted against a BSA standard curve (Chapdelaine et al. 2001). 10% β-
mercaptoethanol was added to samples before they were boiled. 10 µg of total proteins
were loaded per well for each sample. They were then subjected to 10% SDS-PAGE
electrophoresis and transferred on Trans-blot nitrocellulose membrane (Bio-Rad,
Mississauga, ON). Membranes were washed once in water and then blocked in PBS
containing 10% dried milk for 1 h at room temperature. Membranes were blotted with 2
µg/ml anti-SV40-T-Antigen mouse antibody (Oncogene Research Products, Boston, MA)
in PBS containing 10% dried skim milk. Membranes were washed 3 times in PBS
containing 0.05% Tween 20 between each step. Afterward, they were blotted with an
appropriate secondary HRP-conjugated antibody (Dako Diagnostics Canada, Mississauga,
ON) and later visualized with Western Lightning Chemoluminescent Plus (Perkin Elmer,
Boston, MA) and Hyperfilm ECL films (Amersham Biosciences, Baie d’Urfé, Qc)
according to the manufacturer’s protocol. Images were digitized with a Nikon CoolPix
4500 camera.
Cytology. For fluorescence microscopy analysis, cells were plated in 8-well Lab-Tek
chamber slides (Nalge Nunc Int., Rochester, NY). For desmin and TAg staining,
subconfluent cells were rinsed in HBSS and then fixed in 95% ethanol for 5 min. Cells
were blocked in 10% FBS for 1h and then stained with 3.5 µg/ml anti-Desmin mouse
antibody (Dako Diagnostics Canada, Mississauga, ON) or 2.5 µg/ml anti-T-Antigen mouse
139
antibody (Oncogene Research Products, Boston, MA). Between each steps, cells were
rinsed in 3 times in PBS. Afterward, cells were stained with 4 µg/ml Alexa Fluor 546-
conjugated goat anti-mouse antibody (Dako Diagnostics Canada, Mississauga, ON) for 1 h.
Finally, cells were rinsed once in PBS, stained with 100 ng/ml DAPI for 2 min, rinsed
twice in PBS and mounted under PBS/glycerol (1:1) for observation. To monitor terminal
myoblast differentiation, cells were stained with eosin and DAPI. In short, cells were fixed
for 5 min in 4% paraformaldehyde and then stained in eosin for 1 min, rinsed 2 min under
tap water, then stained for 2 min in 100 ng/ml DAPI before they were rinsed twice.
Fluorescent micrographs were digitized with a Nikon CoolPix 4500 camera mounted on a
Zeiss Axiophot microscope at 100X and 200X magnification.
140
Acknowledgments
We thank Dr. K. Westerman for graciously providing the SSR 69 vector, Dr. F. Edenhofer
for sharing pTriExHTNC and pTriExCH vectors and Dr.E. Ruley for pHNCM. This work
was supported by l'Association française contre les myopathies (AFM) and the Canadian
Institute of Health Research. N.J. Caron is a scholar from the Canadian Institute of Health
Research. M.-E. Ducharme and S.P. Quenneville are both scholars from the Canadian Stem
Cell Network.
141
Figure legends
Figure 1 Immortalization of myoblasts using the SSR 69 retroviral vector.
(A) Schematic representation of the SSR 69 immortalizing vector and PCR diagnosis
strategy. Using multiplex PCR with Psi, hygro and neo primers the unrecombined vector
generates a 870 bp product while a 550 bp product can be observed following
recombination. (B) A single treatment of HTNC can induce recombination the SSR 69
vector in treated cell line. PA317 SSR69 retroviral producing cell line were treated with
500 nM HTNC. Genomic DNA was isolated and submitted to PCR diagnosis for SSR69
recombination. Lane 1: Untreated cells and 3 primers. Lane 2: Untreated cells and primers
Pp and Pn. Lane 3: TAT-Cre treated cells and 3 primers. Lane 4: TAT-Cre treated cells and
primers Pp and Pn. (C) DTT myoblasts contain several SSR69 integrative events. PCR
diagnosis of the recombination efficiency of DTT myoblasts treated with 1 µM HTNC for 1
hour and selected for 12 days in proliferating medium containing G418. Eight clones were
isolated after selection and were then submitted to PCR disgnosis.
Figure 2 Optimization of Cre internalization in human myoblasts.
(A) HTNC is more efficient than HNCM and CH fusion proteins to carry the Cre
recombinase activity to the nucleus of myoblasts. DTT myoblasts were treated with various
concentrations of HTNC HNCM and CH control protein for 1h in serum free conditions
and then subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay. Resistant colonies were
then counted. (B) HTNC rapidly associates to the cell membrane. HTNC was applied to
DTT myoblasts at a concentration of 500 nM for different amounts of time in serum-free
culture medium. DTT myoblasts were then subjected to the functional nuclear Cre
recombinase assay. (C) Comparison of different treatments and combinations of treatments
on functional HTNC delivery to DTT myoblasts. DTT myoblasts were incubated with 500
nM HTNC in serum-free conditions for 60 min and then subjected to the functional nuclear
142
Cre recombinase assay. DS: DTT were pre-incubated for 2 h in 500 µg/ml dextran sulfate
prior to HTNC treatment. C: DTT were co-incubated with 200 µM chloroquine in addition
to HTNC. 5.6: Cells were incubated in HTNC in acidic pH (5.6). Each data point or column
represents the mean of duplicate (A and B) or triplicate (C) wells, and standard deviations
are shown as error bars.
Figure 3 Myoblasts immortalized with Tag and hTERT retain myogenic characteristics in
culture.
(A) Fluorescence microscopy analysis of immortalized DMD myoblasts (DTT) and normal
myoblast clones (HPM TT) immunostained for Desmin and counterstained with DAPI. (B)
Fusion of immortalized myoblasts cultured in differentiation conditions. DTT myoblasts
could form myotubes after TAg removal, while HPM TT clones could form myotubes with
or without TAg removal. (C) Fusion capacity comparison between HTNC-treated DTT
myoblasts and untreated DTT myoblasts. DTT myoblasts treated once with 400 nM HTNC
and proliferated for 10 days in 1.2 mg/ml G418 and their fusion was compared to untreated
controls. For B and C, cells were grown to confluency and left to differentiate in 2% serum
for 4 days before they were stained with eosin and DAPI.
Figure 4 Reversal of Tag immortalization using HTNC in human myoblasts.
Immunobloting for the detection of TAg in myoblasts in untreated cells (A) and
HTNC/chloroquine treated cells selected for 12 days in 1.2 mg/ml G418 (B). (C) Kinetics
of immortalization reversal in HPM TT B1 clone using HTNC/chloroquine massive
treatment. HPM TT B1 cells were treated with 3 µM HTNC and 200 µM in serum-free
DMEM HG for 45 min once (1x), twice (2x) and selected for 3 days (S(3d) or 10 days
(S(10d)) in 800 mg/ml G418 and 100 ng/ml GCV in proliferation medium. (D)
Immunofluorescence study for TAg in cells described in C and counterstained with DAPI.
(E) Percentage of Tag positive cells following treatment with HTNC and selection listed in
143
C. Each column represents the mean of cells counted in 3 random fields, and standard
deviations are shown as error bars.
Figure 5 Expansion of proliferation capacity of human primary myoblasts clones.
Growth curves of human primary myoblasts (HPM 45) and clones of HPM 45 (A3 and B1)
immortalized with Tag and hTERT. Human primary myoblasts were isolated from a 45-
year-old man and infected with the SSR 69 retrovirus (see black arrow). Tag immortalized
clones were infected with a hTERT expressing retrovirus and proliferated. Grey arrows
indicate immortalization reversals exerted on HPM TT clones by massive
HTNC/chloroquine treatment followed by culture under G418 selective pressure. The
number of MPDs was determined as indicated under Materials and method.
144
Figures
Figure 1 Immortalization of myoblasts using the SSR 69 retroviral vector.
145
Figure 2 Optimization of Cre internalization in human myoblasts.
146
Figure 3 Myoblasts immortalized with Tag and hTERT retain myogenic characteristics in
culture.
147
Figure 4 Reversal of Tag immortalization using HTNC in human myoblasts.
148
Figure 5 Expansion of proliferation capacity of human primary myoblasts clones.
149
Conclusion générale
Les travaux présentés dans cette thèse consacrée à l'étude des domaines de transduction
protéiques peuvent être divisés en trois axes: l'application de protéines de fusion Tat au
tissu musculaire, l'élucidation du mécanisme d'internalisation des protéines de fusion Tat et
le développement d'une stratégie d'immortalisation réversible des myoblastes impliquant
l'utilisation de la transduction de protéines pour exciser l'oncogène immortalisant.
La capacité des domaines de transduction protéiques (DTPs) à être internalisés fut
démontrée dans plusieurs types cellulaires in vitro ainsi que dans plusieurs tissus in vivo
(Fawell et al. 1994; Schwarze et al. 1999). L'entrée des protéines de fusion Tat fut décrite
comme un processus non endocytique ne passant pas par l'intermédiaire d'un récepteur
spécifique (Vives et al. 1997; Schwarze et Dowdy 2000). Nous avons donc entrepris de
tester la capacité des protéines de fusion Tat à transduire directement les fibres musculaires
dans le but de tester la possibilité de les utiliser pour transporter directement des cargos
avec un potentiel thérapeutique pour la DMD. Nos travaux furent les premiers, avec ceux
du groupe de Giacca (Tyagi et al. 2001), à démontrer que le DTP de Tat pouvait médier
l'internalisation de l'eGFP dans toutes les cellules mononucléées en culture. Par contre, les
myotubes semblaient internaliser la Tat-eGFP beaucoup moins efficacement. Même si elles
contiennent un signal de localisation nucléaire (SLN) efficace, les protéines de fusion Tat
internalisées ne se retrouvaient que dans le cytoplasme. Des études, comparant la
localisation intracellulaire d'une protéine Tat-eGFP ajoutée au milieu de culture avec celle
résultant de l'expression endogène de la même construction, révèlent que c'est le mode
d'entrée de la protéine Tat-eGFP, et non l'efficacité du SLN, qui prévient la nucléarisation
du cargo (Yang et al. 2002b). Nos premières observations effectuées avec la protéine de
fusion Tat-eGFP nous avaient amené à théoriser que le mécanisme d'internalisation et de
localisation au noyau des protéines de fusion Tat pouvait être sensible à la conformation du
cargo. En effet, nous avions attribué à la très résistante structure du cargo eGFP l'absence
de localisation nucléaire observé in vitro. Notre étude du mécanisme d'entrée des protéines
150
de fusion Tat montra que cette absence de localisation nucléaire était plutôt le résultat d'une
séquestration périnucléaire suite à l'endocytose des protéines de fusion (Chapitre 3).
Le ciblage des fibres musculaires via l'injection directe de protéines de fusion Tat chez la
souris mdx ne produit que très peu de fibres transduites. Même si le matériel injecté est
retrouvé hors du site d'injection, les fibres marquées sont principalement situées au site où
les fibres musculaires ont été endommagées par l'injection. Nos tentatives pour transduire
les fibres en utilisant des techniques d'injection subdermique ou intra-artérielle eurent du
succès mais n'ont marqué que des fibres directement en contact avec la solution injectée ou
en périphérie des vaisseaux sanguins visés. Ces expériences ont également démontré la très
forte affinité du DTP de Tat pour la matrice extracellulaire entourant le muscle. Des
expériences subséquentes, exécutées chez des souris normales avec le DTP de Tat marqué à
la rhodamine ou avec une protéine de fusion Tat-β-Galactosidase, n'ont pu générer plus de
fibres positives (voir annexe). Le cumul de ces données vient infirmer nos hypothèses de
travails concernant le ciblage in vivo des fibres musculaires. Les fibres musculaires
résistent à l'entrée des protéines de fusion Tat et sont peu susceptibles d'être transduites à
l'aide de protéines de fusion Tat.
Même si la dystrophine est une protéine énorme (427 kDa), des versions tronquées
fonctionnelles ont pu être isolées de patients souffrant de dystrophies musculaires moins
sévères. Des mini gènes se sont montrés efficaces pour remplacer de façon fonctionnelle la
dystrophine manquante chez des souris mdx (Harper et al. 2002). Potentiellement, des
protéines de fusion Tat-microdystrophine pourraient être produites par des bactéries ou des
levures pour être ensuite administrées aux patients DMD et suppléer à la perte de la
dystrophine. Même si les fibres musculaires ne pourraient être ciblées de façon efficace
avec une telle stratégie, les cellules cardiaques, par contre, ont démontré une susceptibilité
accrue à être transduites par des peptides cationique et des protéines de fusion Tat (Fawell
et al. 1994; Schwarze et al. 1999). Cette approche pourrait être complémentaire au
traitement des muscles squelettiques par la transplantation de myoblastes. Cibler plus
151
efficacement les muscles squelettiques ou le diaphragme, nécessiterait des modifications
substantielles aux domaines de transduction utilisés afin de modifier leur affinité à la
matrice extracellulaire. Malheureusement, comme l'internalisation des protéines de fusion
Tat est d'abord médiée par une adsorption au sulfate d'héparane constituant les
glycoprotéines de la membrane, de telles modifications risquent d'abroger les propriétés
transductrices de ces protéines.
Plusieurs de nos observations entraient en contradiction avec le modèle de translocation
membranaire suggéré par le groupe de Dowdy. Celui-ci décrivait l'entrée des protéines de
fusion Tat comme une infiltration à travers les membrane plasmique, indépendante des
récepteurs membranaires et ne nécessitant aucun processus énergétique (Schwarze et al.
2000). De plus, plusieurs de nos tentatives destinées à utiliser le DTP de Tat en fusion avec
des protéines comme l'AgT, E7 de HPV, l'ubiquitine et MyoD n'ont démontré aucune
fonctionnalité du cargo transduit (résultats non décrits dans cette thèse). Nous avons donc
essayé de mieux comprendre le mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat. Le
troisième chapitre de cette thèse était donc consacré à l'élucidation du mécanisme d'entrée
afin d’optimiser le ciblage efficace des cellules en culture.
Comme le groupe de Giacca avait démontré que l'entrée des protéines de fusion Tat
nécessitait la présence de glycoprotéines constituées de sulfate d'héparane à leur surface
(Tyagi et al. 2001), nous avons décidé de tester l'hypothèse que l'entrée de celles-ci ne soit
qu'un processus d'endocytose hautement efficace et non spécifique. Notre hypothèse a été
confirmée par des études plus approfondies. En effet, nos observations montrant une
distribution intracellulaire ponctuée, une cinétique d’internalisation classique et une
sensibilité aux basses températures sont tout à fait cohérentes avec un mécanisme
d’endocytose. Après quelques heures, les protéines de fusion Tat s’accumulent autour du
noyau, sans y entrer. La co-incubation avec des agents lysosomotropiques démontre que la
déstabilisation des endosomes peut augmenter de façon significative l’accès au cytosol et
au noyau. De plus, nous avons observé que les protéines de fusion Tat, pouvaient persister
152
pendant plusieurs heures dans les cellules ciblées, et que des inhibiteurs de l’acidification
des lysosomes n’avaient aucun effet sur l’efficacité du transport jusqu’au noyau. Ceci
suggère que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale, pour ensuite éviter
la dégradation dans les lysosomes, mais qu’elles sont ensuite séquestrées en périphérie du
noyau. Nos travaux indiquent donc qu’un trafic intracellulaire inadéquat est le principal
facteur limitant l’efficacité de la nucléarisation fonctionnelle des cargos fusionnés au DTP
de Tat.
Des publications récentes confirment nos observations. D'abord, on a montré que la fixation
au méthanol des cellules traitées avec VP-22, un polypeptide cationique similaire au DTP
de Tat, pouvait mener à une localisation nucléaire artéfactuelle des protéines adsorbées à la
surface des cellules (Lundberg et Johansson 2001). Cette observation fut étendue aux autres
DTPs comme Tat et les poly-arginines (Richard et al. 2003). Ces derniers auteurs ont
également montré que les basses températures inhibaient l'internalisation des protéines de
fusion Tat. Ces travaux ont provoqué une réévaluation des données publiées plus tôt,
décrivant une translocation membranaire et une localisation nucléaire rapide des peptides
cationiques (Elliott et O'Hare 1997; Vives 2003). Plus récemment, le groupe de Giacca a
démontré que les protéines de fusion contenant le domaine de transduction de Tat étaient
internalisées via l’endocytose cavéolaire (Fittipaldi et al. 2003). En effet, leurs travaux ont
montré la co-localisation intracellulaire de protéines de fusion Tat-eGFP avec des
marqueurs caractéristiques du transport via les radeaux lipidiques que sont la cavéoline et la
toxine du choléra (Fittipaldi et al. 2003). De plus, leurs travaux ont également mis en
évidence une cinétique d’entrée des protéines de fusion très différente de celle prévue dans
le cadre d’une translocation membranaire (Fittipaldi et al. 2003).
Nos travaux furent les premiers à montrer à l'aide d'un essai fonctionnel que les protéines
de fusion Tat doivent transiter par des vésicules endocytiques avant d'accéder au noyau.
L'absence de localisation nucléaire visible montre également que leur entrée dans les
cellules visées ne signifie pas nécessairement qu'elles seront par la suite localisées dans le
153
bon compartiment cellulaire. La plupart des approches pour augmenter l'efficacité de la
transduction de protéines ont été dirigées vers la génération de nouvelles séquences
permettant d'augmenter l'adhésion aux glycoprotéines membranaires. Il est de notre avis
que la recherche d'un meilleur ciblage au niveau des compartiments intracellulaires
représente la prochaine étape importante. Certains liposomes sont modifiés pour s'évader
des endosomes, certaines séquences peptidiques provenant de toxines d'origine naturelle
peuvent déstabiliser les vésicules endocytiques pour accéder au cytosol (Rozema et al.
2003). Des séquences composites comprenant à la fois un DTP et une séquence dérivée
d'une toxine comme celle du venin d'abeilles, par exemple, pourraient augmenter
grandement la fonctionnalité de la transduction protéique. Par contre, ces protéines
pourraient s'avérer toxiques, non seulement pour les cellules ciblées, mais aussi pour les
bactéries utilisées pour les produire.
Malgré leur efficacité plus limitée qu'initialement escomptée, les protéines produites en
fusion avec des DTPs restent quand même des instruments intéressants. Le quatrième
chapitre de cette thèse montre que les protéines de fusion Tat peuvent être utilisées pour
suppléer à l'utilisation de virus recombinants et intervenir sur des cultures cellulaires. Nous
avons réussi à optimiser le ciblage fonctionnel des myoblastes en utilisant des
concentrations élevées de Tat-Cre, en co-incubant avec la chloroquine et en sélectionnant
contre les cellules contenant encore des copies du vecteur non recombiné. L'excision
complète de l'AgT n'a pu être atteinte qu'en sélectionnant les cellules floxées avec la G418.
Malgré un arrêt de la croissance en moins de 2 jours, les cellules sélectionnées restent
parfaitement viables et pourraient ainsi être transplantées. L'efficacité de l'internalisation de
la Cre recombinase en fusion avec Tat reste encore sous optimale. Il sera nécessaire
d'optimiser le processus avant d'envisager l'utilisation sécuritaire de cette méthode. Le cycle
cellulaire semble influencer l'efficacité de la transduction de la Cre recombinase (Jo et al.
2003). Il est donc possible que l'excision complète des copies de la casette immortalisante
sans sélection ne soit possible qu'en proliférant les cellules en continu dans un milieu
contenant la Tat-Cre. Pour ce faire, il faudra contourner les principaux obstacles à son
154
optimisation accrue qui proviennent de la toxicité des composés endosomolytiques utilisés
en concomitance au traitement.
L'immortalisation des myoblastes isolés d'un patient DMD s'insert dans une stratégie de
transplantation autologue. L'infection des myoblastes isolés de patients DMD à l'aide de
vecteurs intégratifs pour les corriger génétiquement et les immortaliser peut favoriser
l'émergence de transformants. Ainsi, les deux étapes de transductions rétrovirales
nécessaires à l'immortalisation des cellules de patients DMD pourraient également résulter
en des mutations par insertions. Par contre, l'immortalisation rend possible le clonage des
cellules ainsi générées et leur caractérisation subséquente pour s'assurer de la sécurité de la
procédure. Sans que l'on puisse totalement éliminer la possibilité que des transformants
soient générés, la caractérisation du transcriptome ainsi que des tests in vitro et in vivo dans
des souris SCIDS pourraient être effectués sur chacun des clones. On pourrait ainsi
éliminer des clones surexprimant des gènes communément retrouvés dans les cellules
cancéreuses, des clones ne démontrant pas les caractéristiques moléculaires et
phénotypiques des cellules déimmortalisées ainsi que les clones formant des tumeurs ou
manifestant une capacité de fusion limitée in vivo. Cette caractérisation est impossible après
la déimmortalisation, ce qui rend risquée l'utilisation de vecteurs viraux pour cette dernière
étape. La transduction de protéines devrait donc être plus sécuritaire puisqu'elle ne génère
pas de nouvel évènement intégratif.
Il reste cependant à démontrer que ces cellules déimmortalisées maintiennent toujours une
capacité à participer à la régénération musculaire suite à leur transplantation et générer des
résultats comparables à ceux obtenues avec des cellules de mammifères normaux (Skuk et
al. 2002a). En effet, pendant la régénération musculaire, une phase de prolifération des
myoblastes précède habituellement la fusion avec les fibres endommagées. On pense que
cette prolifération puisse être importante pour contrecarrer les effets négatifs de la mort
rapide observée suite à la transplantation de myoblastes (Skuk et al. 2003). Par contre, la
transplantation de myoblastes proliférés avec l'AgT et ensuite déimmortalisés avec un
155
adénovirus codant pour la Cre recombinase a déjà montré de bons succès de greffe
(Berghella et al. 1999). Il est nécessaire de procéder vers la prochaine étape qui consiste à
greffer des cellules humaines déimmortalisées pour analyser leur comportement in vivo et
valider la pertinence de ce protocole de déimmortalisation dans le contexte de la
transplantation de myoblastes. Si les myoblastes peuvent participer à la régénération des
fibres endommagées, il serait important de confirmer que ceux-ci peuvent aussi persister
sous la forme de cellules satellites mononucléées suite à la greffe. Si l'arrêt de croissance
observé chez les myoblastes déimmortalisés est permanent, ils seront incapables de
participer à la régénération musculaire à long terme. Même des muscles protégés par la
présence de dystrophine entrent en régénération suivant un processus normal. L'addition
d'une réserve de cellules satellites pourrait s'avérer cruciale pour l'amélioration à long terme
du phénotype de la maladie.
L'amélioration de la qualité de vie de jeunes patients DMD requiert la transplantation de
plusieurs groupes musculaires. Chez le singe, l'obtention de plus de 50% de fibres hybrides
dans un biceps complet nécessite l'injection de 30 millions de myoblastes par cm3. On
estime donc que pour traiter tous les muscles (environ 25 kg ou 25 000 cm3) d'un patient
Duchenne, il faudrait 600 milliards de myoblastes. L'immortalisation devrait permettre de
proliférer de façon extensive les cellules myogéniques du patient pour atteindre les
quantités nécessaires à une greffe massive. En effet, à partir d'un seul clone, on génère plus
d'un milliard de cellules après 30 divisions et on atteint 600 milliards de cellules avant 40
divisions. Les clones étudiés au chapitre 3 ont tous dépassés 70 divisions et ne montrent
aucun signe de sénescence. Un culture clonale peu dépasser ce nombre en 40 divisions.
Même après avoir obtenu une quantité suffisante de cellules, le principal obstacle au succès
thérapeutique de la transplantation de myoblastes demeure leur faible dispersion hors du
site d'injection. On devra améliorer de façon significative le potentiel migratoire des
myoblastes transplantés pour diminuer le nombre de sites d'injections nécessaires à la
réussite d'une telle intervention. L'expérimentation chez la souris illustre bien la
156
problématique de la transplantation cellulaire massive. La transplantation massive chez la
souris peut générer plus de 90% de fibres hybrides, mais l'application de ce protocole
résulte en une diminution de force du muscle greffé. Avant de passer à des essais cliniques
visant des greffes massives dans plusieurs muscles, il serait souhaitable de s'assurer que des
gains de force peuvent être obtenus et pas seulement une démonstration moléculaire du
succès.
Globalement nos travaux ont permis de mieux comprendre les limites et les avantages
associés à l'utilisation de la transduction de protéines dans le cadre du développement d'un
traitement pour la DMD. Nos observations indiquent que le ciblage intracellulaire avec des
protéines de fusion Tat recombinantes est une technique prometteuse dans plusieurs
applications nécessaires à la manipulation de cellules en culture.
Bibliographie Acsadi, G., Lochmuller, H., Jani, A., Huard, J., Massie, B., Prescott, S., Simoneau, M.,
Petrof, B. J., and Karpati, G. (1996). Dystrophin expression in muscles of mdx mice after adenovirus-mediated in vivo gene transfer. Hum Gene Ther 7, 129-140.
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P. (2002). Molecular biology of the cell, Forth edn (New York, Garland Science).
Albini, A., Soldi, R., Giunciuglio, D., Giraudo, E., Benelli, R., Primo, L., Noonan, D., Salio, M., Camussi, G., Rockl, W., and Bussolino, F. (1996). The angiogenesis induced by HIV-1 tat protein is mediated by the Flk-1/KDR receptor on vascular endothelial cells. Nat Med 2, 1371-1375.
Alblas, J., Ulfman, L., Hordijk, P., and Koenderman, L. (2001). Activation of Rhoa and ROCK are essential for detachment of migrating leukocytes. Mol Biol Cell 12, 2137-2145.
Allbrook, D. (1981). Skeletal muscle regeneration. Muscle Nerve 4, 234-245. Anderson, D. C., Nichols, E., Manger, R., Woodle, D., Barry, M., and Fritzberg, A. R.
(1993). Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochem Biophys Res Commun 194, 876-884.
Astriab-Fisher, A., Sergueev, D. S., Fisher, M., Shaw, B. R., and Juliano, R. L. (2000). Antisense inhibition of P-glycoprotein expression using peptide-oligonucleotide conjugates. Biochem Pharmacol 60, 83-90.
Barton-Davis, E. R., Cordier, L., Shoturma, D. I., Leland, S. E., and Sweeney, H. L. (1999). Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Invest 104, 375-381.
Beach, R. L., Rao, J. S., and Festoff, B. W. (1985). Extracellular-matrix synthesis by skeletal muscle in culture. Major secreted collagenous proteins of clonal myoblasts. Biochem J 225, 619-627.
Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., and Partridge, T. A. (1999). Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol 144, 1113-1122.
Berghella, L., De Angelis, L., Coletta, M., Berarducci, B., Sonnino, C., Salvatori, G., Anthonissen, C., Cooper, R., Butler-Browne, G. S., Mouly, V., et al. (1999). Reversible immortalization of human myogenic cells by site-specific excision of a retrovirally transferred oncogene. Hum Gene Ther 10, 1607-1617.
Bischoff, R. (1975). Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat Rec 182, 215-235.
Bischoff, R. (1986). Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol 115, 129-139.
Bischoff, R. (1994). The satellite cell and muscle regeneration. In Myology, basic and clinical, A. G. Engel, and C. Franzini-Armstrong, eds. (New York, Mcgraw-Hill).
Bodnar, A. G., Ouellette, M., Frolkis, M., Holt, S. E., Chiu, C. P., Morin, G. B., Harley, C. B., Shay, J. W., Lichtsteiner, S., and Wright, W. E. (1998). Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells [see comments]. Science 279, 349-352.
158
Bogdanovich, S., Krag, T. O., Barton, E. R., Morris, L. D., Whittemore, L. A., Ahima, R. S., and Khurana, T. S. (2002). Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420, 418-421.
Bonifaci, N., Sitia, R., and Rubartelli, A. (1995). Nuclear translocation of an exogenous fusion protein containing HIV Tat requires unfolding. Aids 9, 995-1000.
Brigati, C., Giacca, M., Noonan, D. M., and Albini, A. (2003). HIV Tat, its TARgets and the control of viral gene expression. FEMS Microbiol Lett 220, 57-65.
Brown, D. A., and London, E. (1997). Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes? Biochem Biophys Res Commun 240, 1-7.
Bujold, M., Caron, N., Camiran, G., Mukherjee, S., Allen, P. D., Tremblay, J. P., and Wang, Y. (2002). Autotransplantation in mdx mice of mdx myoblasts genetically corrected by an HSV-1 amplicon vector. Cell Transplant 11, 759-767.
Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., and Moore, K. J. (1984). X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 1189-1192.
Buonaguro, L., Barillari, G., Chang, H. K., Bohan, C. A., Kao, V., Morgan, R., Gallo, R. C., and Ensoli, B. (1992). Effects of the human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on the expression of inflammatory cytokines. J Virol 66, 7159-7167.
Camirand, G., Caron, N. J., Turgeon, N. A., Rossini, A. A., and Tremblay, J. P. (2002). Treatment with anti-CD154 antibody and donor-specific transfusion prevents acute rejection of myoblast transplantation. Transplantation 73, 453-461.
Caron, N. J., Asselin, I., Morel, G., and Tremblay, J. P. (1999). Increased myogenic potential and fusion of matrilysin-expressing myoblasts transplanted in mice. Cell Transplant 8, 465-476.
Caron, N. J., Torrente, Y., Camirand, G., Bujold, M., Chapdelaine, P., Leriche, K., Bresolin, N., and Tremblay, J. P. (2001). Intracellular delivery of a Tat-eGFP fusion protein into muscle cells. Mol Ther 3, 310-318.
Caron, N. J., Quenneville, S. P., and Tremblay, J. P. (2004). Endosome disruption enhances the functional nuclear delivery of Tat-fusion proteins. Biochem Biophys Res Commun 319, 12-20.
Carpenter, S., and Karpati, G. (1989). Segmental necrosis and its demarcation in experimental micropuncture injury of skeletal muscle fibers. J Neuropathol Exp Neurol 48, 154-170.
Cavanna, J. S., Coulton, G., Morgan, J. E., Brockdorff, N., Forrest, S. M., Davies, K. E., and Brown, S. D. (1988). Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics 3, 337-341.
Chapdelaine, P., Vignola, K., and Fortier, M. A. (2001). Protein estimation directly from SDS-PAGE loading buffer for standardization of samples from cell lysates or tissue homogenates before Western blot analysis. Biotechniques 31, 478, 480, 482.
Chapman, R. E., and Munro, S. (1994). Retrieval of TGN proteins from the cell surface requires endosomal acidification. Embo J 13, 2305-2312.
Chellaiah, M. A., Soga, N., Swanson, S., McAllister, S., Alvarez, U., Wang, D., Dowdy, S. F., and Hruska, K. A. (2000). Rho-A is critical for osteoclast podosome organization, motility, and bone resorption. J Biol Chem 275, 11993-12002.
Ciftci, K., and Levy, R. J. (2001). Enhanced plasmid DNA transfection with lysosomotropic agents in cultured fibroblasts. Int J Pharm 218, 81-92.
159
Colgin, L. M., and Reddel, R. R. (1999). Telomere maintenance mechanisms and cellular immortalization [published erratum appears in Curr Opin Genet Dev 1999 Apr;9(2):247]. Curr Opin Genet Dev 9, 97-103.
Cormack, B. P., Valdivia, R. H., and Falkow, S. (1996). FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene 173, 33-38.
Cudna, R. E., and Dickson, A. J. (2003). Endoplasmic reticulum signaling as a determinant of recombinant protein expression. Biotechnol Bioeng 81, 56-65.
Darnell, J., Lodish, H., and Baltimore, D. (1993). Biologie moléculaire de la cellule (Bruxelles, De Boeck).
Decary, S., Mouly, V., Hamida, C. B., Sautet, A., Barbet, J. P., and Butler-Browne, G. S. (1997). Replicative potential and telomere length in human skeletal muscle: implications for satellite cell-mediated gene therapy. Hum Gene Ther 8, 1429-1438.
Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., and Prochiantz, A. (1994). The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem 269, 10444-10450.
Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G., and Prochiantz, A. (1996). Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J Biol Chem 271, 18188-18193.
Deschenes, I., Chahine, M., Tremblay, J., Paulin, D., and Puymirat, J. (1997). Increase in the proliferative capacity of human myoblasts by using the T antigen under the vimentin promoter control. Muscle Nerve 20, 437-445.
Dong, J. Y., Fan, P. D., and Frizzell, R. A. (1996). Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Hum Gene Ther 7, 2101-2112.
Dostmann, W. R., Taylor, M. S., Nickl, C. K., Brayden, J. E., Frank, R., and Tegge, W. J. (2000). Highly specific, membrane-permeant peptide blockers of cGMP-dependent protein kinase Ialpha inhibit NO-induced cerebral dilation. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 14772-14777.
Drachman, D. B., Toyka, K. V., and Myer, E. (1974). Prednisone in Duchenne muscular dystrophy. Lancet 2, 1409-1412.
Dubowitz, V. (1985). Muscle biopsy: A practical approach (2nd ed) (London, Bailliere Tindall).
Efstathiou, S., and Minson, A. C. (1995). Herpes virus-based vectors. Br Med Bull 51, 45-55.
Efthymiadis, A., Briggs, L. J., and Jans, D. A. (1998). The HIV-1 Tat nuclear localization sequence confers novel nuclear import properties. J Biol Chem 273, 1623-1628.
Eguchi, A., Akuta, T., Okuyama, H., Senda, T., Yokoi, H., Inokuchi, H., Fujita, S., Hayakawa, T., Takeda, K., Hasegawa, M., and Nakanishi, M. (2001). Protein transduction domain of HIV-1 Tat protein promotes efficient delivery of DNA into mammalian cells. J Biol Chem 276, 26204-26210.
El Fahime, E., Torrente, Y., Caron, N. J., Bresolin, M. D., and Tremblay, J. P. (2000). In vivo migration of transplanted myoblasts requires matrix metalloproteinase activity. Exp Cell Res 258, 279-287.
El Fahime, E., Mills, P., Lafreniere, J. F., Torrente, Y., and Tremblay, J. P. (2002). The urokinase plasminogen activator: an interesting way to improve myoblast migration following their transplantation. Exp Cell Res 280, 169-178.
El Fahime, E., Bouchentouf, M., Benabdallah, B. F., Skuk, D., Lafreniere, J. F., Chang, Y. T., and Tremblay, J. P. (2003). Tubulyzine, a novel tri-substituted triazine, prevents
160
the early cell death of transplanted myogenic cells and improves transplantation success. Biochem Cell Biol 81, 81-90.
Elliott, G., and O'Hare, P. (1997). Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell 88, 223-233.
Embury, J., Klein, D., Pileggi, A., Ribeiro, M., Jayaraman, S., Molano, R. D., Fraker, C., Kenyon, N., Ricordi, C., Inverardi, L., and Pastori, R. L. (2001). Proteins linked to a protein transduction domain efficiently transduce pancreatic islets. Diabetes 50, 1706-1713.
Engel, A. G., Yamamoto, M., and Fischbeck, K. H. (1994). Muscular dystrophies. In Myology, basic and clinical, A. G. Engel, and C. Franzini-Armstrong, eds. (New York, Mcgraw-Hill), pp. 1133-1187.
England, S. B., Nicholson, L. V., Johnson, M. A., Forrest, S. M., Love, D. R., Zubrzycka-Gaarn, E. E., Bulman, D. E., Harris, J. B., and Davies, K. E. (1990). Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin. Nature 343, 180-182.
Ensoli, B., Buonaguro, L., Barillari, G., Fiorelli, V., Gendelman, R., Morgan, R. A., Wingfield, P., and Gallo, R. C. (1993). Release, uptake, and effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on cell growth and viral transactivation. J Virol 67, 277-287.
Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., and Midoux, P. (1996). Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Exp Cell Res 225, 186-194.
Ezhevsky, S. A., Nagahara, H., Vocero-Akbani, A. M., Gius, D. R., Wei, M. C., and Dowdy, S. F. (1997). Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 10699-10704.
Fan, Y., Maley, M., Beilharz, M., and Grounds, M. (1996). Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy. Muscle Nerve 19, 853-860.
Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore, C., Chen, L. L., Pepinsky, B., and Barsoum, J. (1994). Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 664-668.
Ferrari, G., Cusella-De Angelis, G., Coletta, M., Paolucci, E., Stornaiuolo, A., Cossu, G., and Mavilio, F. (1998). Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 279, 1528-1530.
Ferrari, G., and Mavilio, F. (2002). Myogenic stem cells from the bone marrow: a therapeutic alternative for muscular dystrophy? Neuromuscul Disord 12 Suppl 1, S7-10.
Fittipaldi, A., Ferrari, A., Zoppe, M., Arcangeli, C., Pellegrini, V., Beltram, F., and Giacca, M. (2003). Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem 278, 34141-34149.
Floyd, S. S., Clemens, P. R., Ontell, M. R., Kochanek, S., Day, C. S., Yang, J., Hauschka, S. D., Balkir, L., Morgan, J., Moreland, M. S., et al. (1998). Ex vivo gene transfer using adenovirus-mediated full-length dystrophin delivery to dystrophic muscles. Gene Ther 5, 19-30.
Foreman, K. E., Friborg, J., Chandran, B., Katano, H., Sata, T., Mercader, M., Nabel, G. J., and Nickoloff, B. J. (2001). Injection of human herpesvirus-8 in human skin
161
engrafted on SCID mice induces Kaposi's sarcoma-like lesions. J Dermatol Sci 26, 182-193.
Frankel, A. D., and Pabo, C. O. (1988). Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193.
Fujiwara, T., Yamamori, T., and Akagawa, K. (2001). Suppression of transmitter release by Tat HPC-1/syntaxin 1A fusion protein. Biochim Biophys Acta 1539, 225-232.
Gilbert, R., Dudley, R. W., Liu, A. B., Petrof, B. J., Nalbantoglu, J., and Karpati, G. (2003). Prolonged dystrophin expression and functional correction of mdx mouse muscle following gene transfer with a helper-dependent (gutted) adenovirus-encoding murine dystrophin. Hum Mol Genet 12, 1287-1299.
Green, M., and Loewenstein, P. M. (1988). Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1188.
Grobet, L., Martin, L. J., Poncelet, D., Pirottin, D., Brouwers, B., Riquet, J., Schoeberlein, A., Dunner, S., Menissier, F., Massabanda, J., et al. (1997). A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17, 71-74.
Grounds, M. D. (1991). Towards understanding skeletal muscle regeneration. Pathol Res Pract 187, 1-22.
Guerette, B., Wood, K., Roy, R., and Tremblay, J. P. (1997). Efficient myoblast transplantation in mice immunosuppressed with monoclonal antibodies and CTLA4 Ig. Transplant Proc 29, 1932-1934.
Guérette, B., Skuk, D., Célestin, F., Huard, C., Tardif, F., Asselin, I., Roy, B., Goulet, M., Roy, R., Entman, M., and Tremblay, J. P. (1997). Prevention by Anti- LFA-1 of acute myoblast death following transplantation. J Immunol 159, 2522-2531.
Gussoni, E., Pavlath, G. K., Lanctot, A. M., Sharma, K. R., Miller, R. G., Steinman, L., and Blau, H. M. (1992). Normal dystrophin transcripts detected in Duchenne muscular dystrophy patients after myoblast transplantation. Nature 356, 435-438.
Gussoni, E., Soneoka, Y., Strickland, C. D., Buzney, E. A., Khan, M. K., Flint, A. F., Kunkel, L. M., and Mulligan, R. C. (1999). Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature 401, 390-394.
Hall, D. J., Cui, J., Bates, M. E., Stout, B. A., Koenderman, L., Coffer, P. J., and Bertics, P. J. (2001). Transduction of a dominant-negative H-Ras into human eosinophils attenuates extracellular signal-regulated kinase activation and interleukin-5-mediated cell viability. Blood 98, 2014-2021.
Ham, R. G., St Clair, J. A., and Meyer, S. D. (1990). Improved media for rapid clonal growth of normal human skeletal muscle satellite cells. Adv Exp Med Biol 280, 193-199.
Hammonds, R. G., Jr. (1987). Protein sequence of DMD gene is related to actin-binding domain of alpha-actinin. Cell 51, 1.
Hansen-Smith, F. M., and Carlson, B. M. (1979). Cellular responses to free grafting of the extensor digitorum longus muscle of the rat. J Neurol Sci 41, 149-173.
Harper, S. Q., Hauser, M. A., DelloRusso, C., Duan, D., Crawford, R. W., Phelps, S. F., Harper, H. A., Robinson, A. S., Engelhardt, J. F., Brooks, S. V., and Chamberlain, J. S. (2002). Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Nat Med 8, 253-261.
Hauck, B., and Xiao, W. (2003). Characterization of tissue tropism determinants of adeno-associated virus type 1. J Virol 77, 2768-2774.
162
Hawiger, J. (1999). Noninvasive intracellular delivery of functional peptides and proteins. Curr Opin Chem Biol 3, 89-94.
Hayflick, L. (1965). The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res 37, 614-636.
Hjalm, G., MacLeod, R. J., Kifor, O., Chattopadhyay, N., and Brown, E. M. (2001). Filamin-A binds to the carboxyl-terminal tail of the calcium-sensing receptor, an interaction that participates in CaR-mediated activation of mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 276, 34880-34887.
Ho, A., Schwarze, S. R., Mermelstein, S. J., Waksman, G., and Dowdy, S. F. (2001). Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo. Cancer Res 61, 474-477.
Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr., and Kunkel, L. M. (1987). Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919-928.
Huard, J., Bouchard, J. P., Roy, R., Labrecque, C., Dansereau, G., Lemieux, B., and Tremblay, J. P. (1991). Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin Sci (Lond) 81, 287-288.
Huard, J., Roy, R., Bouchard, J. P., Malouin, F., Richards, C. L., and Tremblay, J. P. (1992). Human myoblast transplantation between immunohistocompatible donors and recipients produces immune reactions. Transplant Proc 24, 3049-3051.
Huard, J. (1993) La dystrophie musculaire de Duchenne: Localisation de la dystrophine dans le système nerveux et recherche sur la mise au point d'un traitement pour les patients DMD, Université Laval, Québec.
Huard, J., Tremblay, G., Verreault, S., Labrecque, C., and Tremblay, J. P. (1993). Utilization of an antibody specific for human dystrophin to follow myoblast transplantation in nude mice. Cell Transplant 2, 113-118.
Huard, J., Roy, R., Guerette, B., Verreault, S., Tremblay, G., and Tremblay, J. P. (1994). Human myoblast transplantation in immunodeficient and immunosuppressed mice: evidence of rejection. Muscle Nerve 17, 224-234.
Imamura, T., Engleka, K., Zhan, X., Tokita, Y., Forough, R., Roeder, D., Jackson, A., Maier, J. A., Hla, T., and Maciag, T. (1990). Recovery of mitogenic activity of a growth factor mutant with a nuclear translocation sequence. Science 249, 1567-1570.
Ito, H., Vilquin, J. T., Skuk, D., Roy, B., Goulet, M., Lille, S., Dugre, F. J., Asselin, I., Roy, R., Fardeau, M., and Tremblay, J. P. (1998). Myoblast transplantation in non-dystrophic dog. Neuromuscul Disord 8, 95-110.
Iujvidin, S., Fuchs, O., Nudel, U., and Yaffe, D. (1990). SV40 immortalizes myogenic cells: DNA synthesis and mitosis in differentiating myotubes. Differentiation 43, 192-203.
Jackson, K. A., Mi, T., and Goodell, M. A. (1999). Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle [see comments]. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14482-14486.
Jat, P. S., and Sharp, P. A. (1989). Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large-T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Mol Cell Biol 9, 1672-1681.
Jeang, K. T., Xiao, H., and Rich, E. A. (1999). Multifaceted activities of the HIV-1 transactivator of transcription, Tat. J Biol Chem 274, 28837-28840.
163
Jenniskens, G. J., Oosterhof, A., Brandwijk, R., Veerkamp, J. H., and van Kuppevelt, T. H. (2000). Heparan sulfate heterogeneity in skeletal muscle basal lamina: demonstration by phage display-derived antibodies. J Neurosci 20, 4099-4111.
Jin, L. H., Bahn, J. H., Eum, W. S., Kwon, H. Y., Jang, S. H., Han, K. H., Kang, T. C., Won, M. H., Kang, J. H., Cho, S. W., et al. (2001). Transduction of human catalase mediated by an HIV-1 TAT protein basic domain and arginine-rich peptides into mammalian cells. Free Radic Biol Med 31, 1509-1519.
Jo, D., Nashabi, A., Doxsee, C., Lin, Q., Unutmaz, D., Chen, J., and Ruley, H. E. (2001). Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase. Nat Biotechnol 19, 929-933.
Jo, D., Lin, Q., Nashabi, A., Mays, D. J., Unutmaz, D., Pietenpol, J. A., and Ruley, H. E. (2003). Cell cycle-dependent transduction of cell-permeant Cre recombinase proteins. J Cell Biochem 89, 674-687.
Johnson, F. B., Marciniak, R. A., and Guarente, L. (1998). Telomeres, the nucleolus and aging. Curr Opin Cell Biol 10, 332-338.
Joliot, A., Pernelle, C., Deagostini-Bazin, H., and Prochiantz, A. (1991). Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 1864-1868.
Kao, S. Y., Calman, A. F., Luciw, P. A., and Peterlin, B. M. (1987). Anti-termination of transcription within the long terminal repeat of HIV-1 by tat gene product. Nature 330, 489-493.
Kapsa, R., Quigley, A., Lynch, G. S., Steeper, K., Kornberg, A. J., Gregorevic, P., Austin, L., and Byrne, E. (2001). In vivo and in vitro correction of the mdx dystrophin gene nonsense mutation by short-fragment homologous replacement. Hum Gene Ther 12, 629-642.
Karpati, G., Pouliot, Y., Zubrzycka-Gaarn, E., Carpenter, S., Ray, P. N., Worton, R. G., and Holland, P. (1989). Dystrophin is expressed in mdx skeletal muscle fibers after normal myoblast implantation. Am J Pathol 135, 27-32.
Karpati, G., Ajdukovic, D., Arnold, D., Gledhill, R. B., Guttmann, R., Holland, P., Koch, P. A., Shoubridge, E., Spence, D., Vanasse, M., and et al. (1993). Myoblast transfer in Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol 34, 8-17.
Kato, T., Okada, S., Yutaka, T., and Yabuuchi, H. (1984). The effects of sucrose loading on lysosomal hydrolases. Mol Cell Biochem 60, 83-98.
Kichler, A., Leborgne, C., Marz, J., Danos, O., and Bechinger, B. (2003). Histidine-rich amphipathic peptide antibiotics promote efficient delivery of DNA into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 1564-1568.
Kinoshita, I., Huard, J., and Tremblay, J. P. (1994a). Utilization of myoblasts from transgenic mice to evaluate the efficacy of myoblast transplantation. Muscle Nerve 17, 975-980.
Kinoshita, I., Vilquin, J. T., Guerette, B., Asselin, I., Roy, R., Lille, S., and Tremblay, J. P. (1994b). Immunosuppression with FK 506 insures good success of myoblast transplantation in MDX mice. Transplant Proc 26, 3518.
Kinoshita, I., Vilquin, J. T., Guerette, B., Asselin, I., Roy, R., and Tremblay, J. P. (1994c). Very efficient myoblast allotransplantation in mice under FK506 immunosuppression. Muscle Nerve 17, 1407-1415.
164
Kinoshita, I., Roy, R., Dugre, F. J., Gravel, C., Roy, B., Goulet, M., Asselin, I., and Tremblay, J. P. (1996). Myoblast transplantation in monkeys: control of immune response by FK506. J Neuropathol Exp Neurol 55, 687-697.
Kogaya, Y., Kim, S., Haruna, S., and Akisaka, T. (1990). Heterogeneity of distribution pattern at the electron microscopic level of heparan sulfate in various basement membranes. J Histochem Cytochem 38, 1459-1467.
Kotin, R. M., Siniscalco, M., Samulski, R. J., Zhu, X. D., Hunter, L., Laughlin, C. A., McLaughlin, S., Muzyczka, N., Rocchi, M., and Berns, K. I. (1990). Site-specific integration by adeno-associated virus. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 2211-2215.
Kremer, E. J., and Perricaudet, M. (1995a). Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer. Br Med Bull 51, 31-44.
Kremer, E. J., and Perricaudet, M. (1995b). Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer. Br Med Bull 51, 31-44.
Kunieda, T., Kobayashi, N., Sakaguchi, M., Okitsu, T., Totsugawa, T., Watanabe, T., Matsumura, T., Maruyama, M., Noguchi, H., Takesue, M., et al. (2002). Transduction of immortalized human hepatocytes with p21 to enhance differentiated phenotypes. Cell Transplant 11, 421-428.
Kunkel, L. M., Monaco, A. P., Middlesworth, W., Ochs, H. D., and Latt, S. A. (1985). Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient with an X chromosome deletion. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 4778-4782.
Kwon, H. Y., Eum, W. S., Jang, H. W., Kang, J. H., Ryu, J., Ryong Lee, B., Jin, L. H., Park, J., and Choi, S. Y. (2000). Transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase mediated by an HIV-1 Tat protein basic domain into mammalian cells. FEBS Lett 485, 163-167.
Law, P. K. (1982). Beneficial effects of transplanting normal limb-bud mesenchyme into dystrophic mouse muscles. Muscle Nerve 5, 619-627.
Law, P. K., Bertorini, T. E., Goodwin, T. G., Chen, M., Fang, Q. W., Li, H. J., Kirby, D. S., Florendo, J. A., Herrod, H. G., and Golden, G. S. (1990). Dystrophin production induced by myoblast transfer therapy in Duchenne muscular dystrophy. Lancet 336, 114-115.
Le, P. U., Guay, G., Altschuler, Y., and Nabi, I. R. (2002). Caveolin-1 is a negative regulator of caveolae-mediated endocytosis to the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 277, 3371-3379.
Le, P. U., and Nabi, I. R. (2003). Distinct caveolae-mediated endocytic pathways target the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum. J Cell Sci 116, 1059-1071.
Lee, S. J., and McPherron, A. C. (2001). Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9306-9311.
Lin, Y. Z., Yao, S. Y., Veach, R. A., Torgerson, T. R., and Hawiger, J. (1995). Inhibition of nuclear translocation of transcription factor NF-kappa B by a synthetic peptide containing a cell membrane-permeable motif and nuclear localization sequence. J Biol Chem 270, 14255-14258.
Lindenbaum, R. H., Clarke, G., Patel, C., Moncrieff, M., and Hughes, J. T. (1979). Muscular dystrophy in an X; 1 translocation female suggests that Duchenne locus is on X chromosome short arm. J Med Genet 16, 389-392.
Lipton, B. H., and Schultz, E. (1979). Developmental fate of skeletal muscle satellite cells. Science 205, 1292-1294.
165
Lissy, N. A., Van Dyk, L. F., Becker-Hapak, M., Vocero-Akbani, A., Mendler, J. H., and Dowdy, S. F. (1998). TCR antigen-induced cell death occurs from a late G1 phase cell cycle check point. Immunity 8, 57-65.
Liu, F., Nishikawa, M., Clemens, P. R., and Huang, L. (2001). Transfer of full-length Dmd to the diaphragm muscle of Dmd(mdx/mdx) mice through systemic administration of plasmid DNA. Mol Ther 4, 45-51.
Luna, E. J., and Hitt, A. L. (1992). Cytoskeleton--plasma membrane interactions. Science 258, 955-964.
Lundberg, M., and Johansson, M. (2001). Is VP22 nuclear homing an artifact? Nat Biotechnol 19, 713-714.
MacKenzie, T. C., Kobinger, G. P., Kootstra, N. A., Radu, A., Sena-Esteves, M., Bouchard, S., Wilson, J. M., Verma, I. M., and Flake, A. W. (2002). Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes. Mol Ther 6, 349-358.
Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., and Robbins, P. D. (2002). Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J Biol Chem 277, 30208-30218.
Mai, J. C., Caron, N. J., Ng, B., Spencer, J. V., Tremblay, J. P., and Robbins, P. D. (2004). Functional cellular delivery of polyhistidine-tagged cargos. Nat Biotech, submitted.
Mann, D. A., and Frankel, A. D. (1991). Endocytosis and targeting of exogenous HIV-1 Tat protein. Embo J 10, 1733-1739.
Mauro, A. (1961). Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol 9, 493-495.
McDiarmid, S. V., Busuttil, R. W., Ascher, N. L., Burdick, J., D'Alessandro, A. M., Esquivel, C., Kalayoglu, M., Klein, A. S., Marsh, J. W., Miller, C. M., and et al. (1995). FK506 (tacrolimus) compared with cyclosporine for primary immunosuppression after pediatric liver transplantation. Results from the U.S. Multicenter Trial. Transplantation 59, 530-536.
McKinney-Freeman, S. L., Jackson, K. A., Camargo, F. D., Ferrari, G., Mavilio, F., and Goodell, M. A. (2002). Muscle-derived hematopoietic stem cells are hematopoietic in origin. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1341-1346.
McPherron, A. C., and Lee, S. J. (1997). Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 12457-12461.
Mellman, I., Fuchs, R., and Helenius, A. (1986). Acidification of the endocytic and exocytic pathways. Annu Rev Biochem 55, 663-700.
Mendell, J. R., Moxley, R. T., Griggs, R. C., Brooke, M. H., Fenichel, G. M., Miller, J. P., King, W., Signore, L., Pandya, S., Florence, J., and et al. (1989). Randomized, double-blind six-month trial of prednisone in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 320, 1592-1597.
Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R., and et al. (1995). Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 333, 832-838.
Merly, F., Huard, C., Asselin, I., Robbins, P. D., and Tremblay, J. P. (1998). Anti-inflammatory effect of transforming growth factor-beta1 in myoblast transplantation. Transplantation 65, 793-799.
166
Mi, Z., Mai, J., Lu, X., and Robbins, P. D. (2000). Characterization of a class of cationic peptides able to facilitate efficient protein transduction in vitro and in vivo. Mol Ther 2, 339-347.
Michele, D. E., and Campbell, K. P. (2003). Dystrophin-glycoprotein complex: post-translational processing and dystroglycan function. J Biol Chem 278, 15457-15460.
Miller, R. G., Sharma, K. R., Pavlath, G. K., Gussoni, E., Mynhier, M., Lanctot, A. M., Greco, C. M., Steinman, L., and Blau, H. M. (1997). Myoblast implantation in Duchenne muscular dystrophy: the San Francisco study. Muscle Nerve 20, 469-478.
Mittnacht, S. (1998). Control of pRB phosphorylation. Curr Opin Genet Dev 8, 21-27. Moisset, P. A., Skuk, D., Asselin, I., Goulet, M., Roy, B., Karpati, G., and Tremblay, J. P.
(1998). Successful transplantation of genetically corrected DMD myoblasts following ex vivo transduction with the dystrophin minigene. Biochem Biophys Res Commun 247, 94-99.
Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Middlesworth, W., Colletti, C. A., Aldridge, J., Fischbeck, K. H., Bartlett, R., Pericak-Vance, M. A., Roses, A. D., and Kunkel, L. M. (1985). Detection of deletions spanning the Duchenne muscular dystrophy locus using a tightly linked DNA segment. Nature 316, 842-845.
Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Colletti-Feener, C., and Kunkel, L. M. (1987). Localization and cloning of Xp21 deletion breakpoints involved in muscular dystrophy. Hum Genet 75, 221-227.
Morgan, J. E., Hoffman, E. P., and Partridge, T. A. (1990). Normal myogenic cells from newborn mice restore normal histology to degenerating muscles of the mdx mouse. J Cell Biol 111, 2437-2449.
Morgan, J. E., Beauchamp, J. R., Pagel, C. N., Peckham, M., Ataliotis, P., Jat, P. S., Noble, M. D., Farmer, K., and Partridge, T. A. (1994). Myogenic cell lines derived from transgenic mice carrying a thermolabile T antigen: a model system for the derivation of tissue-specific and mutation-specific cell lines. Dev Biol 162, 486-498.
Morin, G. B. (1989). The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell 59, 521-529.
Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., and Divita, G. (2001). A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol 19, 1173-1176.
Mostacciuolo, M. L., Lombardi, A., Cambissa, V., Danieli, G. A., and Angelini, C. (1987). Population data on benign and severe forms of X-linked muscular dystrophy. Hum Genet 75, 217-220.
Mouly, V., Edom, F., Decary, S., Vicart, P., Barbert, J. P., and Butler-Browne, G. S. (1996). SV40 large T antigen interferes with adult myosin heavy chain expression, but not with differentiation of human satellite cells. Exp Cell Res 225, 268-276.
Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., and Zuckermann, R. N. (1998). A combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1517-1522.
Nagahara, H., Vocero-Akbani, A. M., Snyder, E. L., Ho, A., Latham, D. G., Lissy, N. A., Becker-Hapak, M., Ezhevsky, S. A., and Dowdy, S. F. (1998). Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nat Med 4, 1449-1452.
Nalbantoglu, J., Pari, G., Karpati, G., and Holland, P. C. (1999). Expression of the primary coxsackie and adenovirus receptor is downregulated during skeletal muscle
167
maturation and limits the efficacy of adenovirus-mediated gene delivery to muscle cells. Hum Gene Ther 10, 1009-1019.
Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272, 263-267.
Neumeyer, A. M., DiGregorio, D. M., and Brown, R. H., Jr. (1992). Arterial delivery of myoblasts to skeletal muscle. Neurology 42, 2258-2262.
Noguchi, H., Kobayashi, N., Westerman, K. A., Sakaguchi, M., Okitsu, T., Totsugawa, T., Watanabe, T., Matsumura, T., Fujiwara, T., Ueda, T., et al. (2002). Controlled expansion of human endothelial cell populations by Cre-loxP-based reversible immortalization. Hum Gene Ther 13, 321-334.
Ouar, Z., Bens, M., Vignes, C., Paulais, M., Pringel, C., Fleury, J., Cluzeaud, F., Lacave, R., and Vandewalle, A. (2003). Inhibitors of vacuolar H+-ATPase impair the preferential accumulation of daunomycin in lysosomes and reverse the resistance to anthracyclines in drug-resistant renal epithelial cells. Biochem J 370, 185-193.
Partridge, T. (1991). Animal models of muscular dystrophy--what can they teach us? Neuropathol Appl Neurobiol 17, 353-363.
Partridge, T. A., Grounds, M., and Sloper, J. C. (1978). Evidence of fusion between host and donor myoblasts in skeletal muscle grafts. Nature 273, 306-308.
Partridge, T. A., Morgan, J. E., Coulton, G. R., Hoffman, E. P., and Kunkel, L. M. (1989). Conversion of mdx myofibres from dystrophin-negative to -positive by injection of normal myoblasts. Nature 337, 176-179.
Partridge, T. A. (2003). Stem cell route to neuromuscular therapies. Muscle Nerve 27, 133-141.
Peitz, M., Pfannkuche, K., Rajewsky, K., and Edenhofer, F. (2002). Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 4489-4494.
Penn, A. S., Lisak, R. P., and Rowland, L. P. (1970). Muscular dystrophy in young girls. Neurology 20, 147-159.
Pincon-Raymond, M., Vicart, P., Bois, P., Chassande, O., Romey, G., Varadi, G., Li, Z. L., Lazdunski, M., Rieger, F., and Paulin, D. (1991). Conditional immortalization of normal and dysgenic mouse muscle cells by the SV40 large T antigen under the vimentin promoter control. Dev Biol 148, 517-528.
Pooga, M., Hallbrink, M., Zorko, M., and Langel, U. (1998). Cell penetration by transportan. Faseb J 12, 67-77.
Prescott, J. C., and Blackburn, E. H. (1999). Telomerase: Dr Jekyll or Mr Hyde? Curr Opin Genet Dev 9, 368-373.
Prochiantz, A. (2000). Messenger proteins: homeoproteins, TAT and others. Curr Opin Cell Biol 12, 400-406.
Qu, Z., Balkir, L., van Deutekom, J. C., Robbins, P. D., Pruchnic, R., and Huard, J. (1998). Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol 142, 1257-1267.
Rana, T. M., and Jeang, K. T. (1999). Biochemical and functional interactions between HIV-1 Tat protein and TAR RNA. Arch Biochem Biophys 365, 175-185.
Rando, T. A., Pavlath, G. K., and Blau, H. M. (1995). The fate of myoblasts following transplantation into mature muscle. Exp Cell Res 220, 383-389.
168
Rao, J. S., Beach, R. L., and Festoff, B. W. (1985). Extracellular matrix (ECM) synthesis in muscle cell cultures: quantitative and qualitative studies during myogenesis. Biochem Biophys Res Commun 130, 440-446.
Richard, J. P., Melikov, K., Vives, E., Ramos, C., Verbeure, B., Gait, M. J., Chernomordik, L. V., and Lebleu, B. (2003). Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J Biol Chem 278, 585-590.
Rietveld, A., and Simons, K. (1998). The differential miscibility of lipids as the basis for the formation of functional membrane rafts. Biochim Biophys Acta 1376, 467-479.
Robinson, S. W., Cho, P. W., Levitsky, H. I., Olson, J. L., Hruban, R. H., Acker, M. A., and Kessler, P. D. (1996). Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant 5, 77-91.
Rozema, D. B., Ekena, K., Lewis, D. L., Loomis, A. G., and Wolff, J. A. (2003). Endosomolysis by masking of a membrane-active agent (EMMA) for cytoplasmic release of macromolecules. Bioconjug Chem 14, 51-57.
Ruben, S., Perkins, A., Purcell, R., Joung, K., Sia, R., Burghoff, R., Haseltine, W. A., and Rosen, C. A. (1989). Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus tat protein. J Virol 63, 1-8.
Rusnati, M., Coltrini, D., Oreste, P., Zoppetti, G., Albini, A., Noonan, D., di Fagagna, F., Giacca, M., and Presta, M. (1997). Interaction of HIV-1 Tat protein with heparin. Role of the backbone structure, sulfation, and size. J Biol Chem 272, 11313-11320.
Rusnati, M., Tulipano, G., Urbinati, C., Tanghetti, E., Giuliani, R., Giacca, M., Ciomei, M., Corallini, A., and Presta, M. (1998). The basic domain in HIV-1 Tat protein as a target for polysulfonated heparin-mimicking extracellular Tat antagonists. J Biol Chem 273, 16027-16037.
Salmon, P., Oberholzer, J., Occhiodoro, T., Morel, P., Lou, J., and Trono, D. (2000). Reversible immortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer of specific genes. Mol Ther 2, 404-414.
Sampaolesi, M., Torrente, Y., Innocenzi, A., Tonlorenzi, R., D'Antona, G., Pellegrino, M. A., Barresi, R., Bresolin, N., De Angelis, M. G., Campbell, K. P., et al. (2003). Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science 301, 487-492.
Sanes, J. (1994). The extracellular matrix. In Myology, basic and clinical, A. G. Engel, and C. Franzini-Armstrong, eds. (New York, Mcgraw-Hill), pp. 242-260.
Scala, G., Ruocco, M. R., Ambrosino, C., Mallardo, M., Giordano, V., Baldassarre, F., Dragonetti, E., Quinto, I., and Venuta, S. (1994). The expression of the interleukin 6 gene is induced by the human immunodeficiency virus 1 TAT protein. J Exp Med 179, 961-971.
Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., and Dowdy, S. F. (1999). In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse [see comments]. Science 285, 1569-1572.
Schwarze, S. R., and Dowdy, S. F. (2000). In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA [In Process Citation]. Trends Pharmacol Sci 21, 45-48.
Schwarze, S. R., Hruska, K. A., and Dowdy, S. F. (2000). Protein transduction: unrestricted delivery into all cells? Trends Cell Biol 10, 290-295.
169
Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., and Rudnicki, M. A. (2000). Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells [In Process Citation]. Cell 102, 777-786.
Seigneurin-Venin, S., Bernard, V., Moisset, P. A., Ouellette, M. M., Mouly, V., Di Donna, S., Wright, W. E., and Tremblay, J. P. (2000a). Transplantation of normal and DMD myoblasts expressing the telomerase gene in SCID mice. Biochem Biophys Res Commun 272, 362-369.
Seigneurin-Venin, S., Bernard, V., and Tremblay, J. P. (2000b). Telomerase allows the immortalization of T antigen-positive DMD myoblasts: a new source of cells for gene transfer application. Gene Ther 7, 619-623.
Shay, J. W., Van Der Haegen, B. A., Ying, Y., and Wright, W. E. (1993). The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 large T-antigen. Exp Cell Res 209, 45-52.
Sherr, C. J. (1996). Cancer cell cycles. Science 274, 1672-1677. Silhol, M., Tyagi, M., Giacca, M., Lebleu, B., and Vives, E. (2002). Different mechanisms
for cellular internalization of the HIV-1 Tat-derived cell penetrating peptide and recombinant proteins fused to Tat. Eur J Biochem 269, 494-501.
Silver, D. P., and Livingston, D. M. (2001). Self-excising retroviral vectors encoding the Cre recombinase overcome Cre-mediated cellular toxicity. Mol Cell 8, 233-243.
Simon, L. V., Beauchamp, J. R., O'Hare, M., and Olsen, I. (1996a). Establishment of long-term myogenic cultures from patients with Duchenne muscular dystrophy by retroviral transduction of a temperature- sensitive SV40 large T antigen. Exp Cell Res 224, 264-271.
Simon, L. V., Beauchamp, J. R., O'Hare, M., and Olsen, I. (1996b). Establishment of long-term myogenic cultures from patients with Duchenne muscular dystrophy by retroviral transduction of a temperature-sensitive SV40 large T antigen. Exp Cell Res 224, 264-271.
Skuk, D., and Tremblay, J. P. (1998). Complement deposition and cell death after myoblast transplantation. Cell Transplant 7, 427-434.
Skuk, D., Roy, B., Goulet, M., and Tremblay, J. P. (1999). Successful myoblast transplantation in primates depends on appropriate cell delivery and induction of regeneration in the host muscle. Exp Neurol 155, 22-30.
Skuk, D., and Tremblay, J. P. (2000a). Progress in myoblast transplantation: a potential treatment of dystrophies [In Process Citation]. Microsc Res Tech 48, 213-222.
Skuk, D., and Tremblay, J. P. (2000b). Progress in myoblast transplantation: a potential treatment of dystrophies. Microsc Res Tech 48, 213-222.
Skuk, D., and Tremblay, J. P. (2001). Engineering Myoblast Transplantation. Graft 4, 558-570.
Skuk, D., Goulet, M., Roy, B., and Tremblay, J. P. (2002a). Efficacy of myoblast transplantation in nonhuman primates following simple intramuscular cell injections: toward defining strategies applicable to humans. Exp Neurol 175, 112-126.
Skuk, D., Vilquin, J. T., and Tremblay, J. P. (2002b). Experimental and therapeutic approaches to muscular dystrophies. Curr Opin Neurol 15, 563-569.
Skuk, D., Caron, N. J., Goulet, M., Roy, B., and Tremblay, J. P. (2003). Resetting the problem of cell death following muscle-derived cell transplantation: detection, dynamics and mechanisms. J Neuropathol Exp Neurol 62, 951-967.
170
Skuk, D., and Tremblay, J. P. (2003a). Myoblast transplantation: the current status of a potential therapeutic tool for myopathies. J Muscle Res Cell Motil 24, 285-300.
Skuk, D., and Tremblay, J. P. (2003b). Cell therapies for inherited myopathies. Curr Opin Rheumatol 15, 723-729.
Soga, N., Namba, N., McAllister, S., Cornelius, L., Teitelbaum, S. L., Dowdy, S. F., Kawamura, J., and Hruska, K. A. (2001). Rho family GTPases regulate VEGF-stimulated endothelial cell motility. Exp Cell Res 269, 73-87.
Tanaka, A. S., Tanaka, M., and Komuro, K. (1998). A highly efficient method for the site-specific integration of transfected plasmids into the genome of mammalian cells using purified retroviral integrase. Gene 216, 67-76.
Tatsumi, R., Anderson, J. E., Nevoret, C. J., Halevy, O., and Allen, R. E. (1998). HGF/SF is present in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells. Dev Biol 194, 114-128.
Torchilin, V. P., Rammohan, R., Weissig, V., and Levchenko, T. S. (2001). TAT peptide on the surface of liposomes affords their efficient intracellular delivery even at low temperature and in the presence of metabolic inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8786-8791.
Torrente, Y., D'Angelo, M. G., Del Bo, R., DeLiso, A., Casati, R., Benti, R., Corti, S., Comi, G. P., Gerundini, P., Anichini, A., et al. (1999). Extracorporeal circulation as a new experimental pathway for myoblast implantation in mdx mice. Cell Transplant 8, 247-258.
Tremblay, J. P., Malouin, F., Roy, R., Huard, J., Bouchard, J. P., Satoh, A., and Richards, C. (1993a). Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant 2, 99-112.
Tremblay, J. P., Malouin, F., Roy, R., Huard, J., Bouchard, J. P., Satoh, A., and Richards, C. L. (1993b). Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant 2, 99-112.
Truant, R., and Cullen, B. R. (1999). The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Mol Cell Biol 19, 1210-1217.
Tsubuki, S., Saito, Y., Tomioka, M., Ito, H., and Kawashima, S. (1996). Differential inhibition of calpain and proteasome activities by peptidyl aldehydes of di-leucine and tri-leucine. J Biochem (Tokyo) 119, 572-576.
Tyagi, M., Rusnati, M., Presta, M., and Giacca, M. (2001). Internalization of HIV-1 tat requires cell surface heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem 276, 3254-3261.
van Deutekom, J. C., Bremmer-Bout, M., Janson, A. A., Ginjaar, I. B., Baas, F., den Dunnen, J. T., and van Ommen, G. J. (2001). Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 10, 1547-1554.
Vicart, P., Schwartz, B., Vandewalle, A., Bens, M., Delouis, C., Panthier, J. J., Pournin, S., Babinet, C., and Paulin, D. (1994). Immortalization of multiple cell types from transgenic mice using a transgene containing the vimentin promoter and a conditional oncogene. Exp Cell Res 214, 35-45.
Vilquin, J. T., Kennel, P. F., Paturneau-Jouas, M., Chapdelaine, P., Boissel, N., Delaere, P., Tremblay, J. P., Scherman, D., Fiszman, M. Y., and Schwartz, K. (2001).
171
Electrotransfer of naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies. Gene Ther 8, 1097-1107.
Vives, E., Brodin, P., and Lebleu, B. (1997). A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem 272, 16010-16017.
Vives, E. (2003). Cellular uptake of the Tat peptide: an endocytosis mechanism following ionic interactions. J Mol Recognit 16, 265-271.
Vives, E., Richard, J. P., Rispal, C., and Lebleu, B. (2003). TAT peptide internalization: seeking the mechanism of entry. Curr Protein Pept Sci 4, 125-132.
Vocero-Akbani, A. M., Heyden, N. V., Lissy, N. A., Ratner, L., and Dowdy, S. F. (1999). Killing HIV-infected cells by transduction with an HIV protease-activated caspase-3 protein [see comments]. Nat Med 5, 29-33.
Vogel, B. E., Lee, S. J., Hildebrand, A., Craig, W., Pierschbacher, M. D., Wong-Staal, F., and Ruoslahti, E. (1993). A novel integrin specificity exemplified by binding of the alpha v beta 5 integrin to the basic domain of the HIV Tat protein and vitronectin. J Cell Biol 121, 461-468.
Vracko, R., and Benditt, E. P. (1972). Basal lamina: the scaffold for orderly cell replacement. Observations on regeneration of injured skeletal muscle fibers and capillaries. J Cell Biol 55, 406-419.
Wadia, J. S., Stan, R. V., and Dowdy, S. F. (2004). Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat Med 10, 310-315.
Wagner, K. R., Hamed, S., Hadley, D. W., Gropman, A. L., Burstein, A. H., Escolar, D. M., Hoffman, E. P., and Fischbeck, K. H. (2001). Gentamicin treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy due to nonsense mutations. Ann Neurol 49, 706-711.
Wakitani, S., Tomoyuki, S., and Caplan, A. I. (1995). Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve 18, 1417-1426.
Wang, B., Li, J., and Xiao, X. (2000). Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13714-13719.
Wang, J., Pansky, A., Venuti, J. M., Yaffe, D., and Nudel, U. (1998). A sea urchin gene encoding dystrophin-related proteins. Hum Mol Genet 7, 581-588.
Wang, Y., Mukherjee, S., Fraefel, C., Breakefield, X. O., and Allen, P. D. (2002). Herpes simplex virus type 1 amplicon vector-mediated gene transfer to muscle. Hum Gene Ther 13, 261-273.
Watchko, J., O'Day, T., Wang, B., Zhou, L., Tang, Y., Li, J., and Xiao, X. (2002). Adeno-associated virus vector-mediated minidystrophin gene therapy improves dystrophic muscle contractile function in mdx mice. Hum Gene Ther 13, 1451-1460.
Watson, K., and Edwards, R. J. (1999). HIV-1-trans-activating (Tat) protein: both a target and a tool in therapeutic approaches. Biochem Pharmacol 58, 1521-1528.
Webster, C., and Blau, H. M. (1990). Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet 16, 557-565.
Weeks, B. S., Desai, K., Loewenstein, P. M., Klotman, M. E., Klotman, P. E., Green, M., and Kleinman, H. K. (1993). Identification of a novel cell attachment domain in the
172
HIV-1 Tat protein and its 90-kDa cell surface binding protein. J Biol Chem 268, 5279-5284.
Wender, P. A., Mitchell, D. J., Pattabiraman, K., Pelkey, E. T., Steinman, L., and Rothbard, J. B. (2000). The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13003-13008.
Westerman, K. A., and Leboulch, P. (1996). Reversible immortalization of mammalian cells mediated by retroviral transfer and site-specific recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 8971-8976.
Will, E., Klump, H., Heffner, N., Schwieger, M., Schiedlmeier, B., Ostertag, W., Baum, C., and Stocking, C. (2002). Unmodified Cre recombinase crosses the membrane. Nucleic Acids Res 30, e59.
Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., and Felgner, P. L. (1990). Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247, 1465-1468.
Xiao, X., Li, J., and Samulski, R. J. (1996). Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector. J Virol 70, 8098-8108.
Yang, F., Moss, L. G., and Phillips, G. N., Jr. (1996). The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 14, 1246-1251.
Yang, J., Seelig, M., Rayner, S., and Bredesen, D. E. (1992). Increasing the proliferative capacity of muscular dystrophy myoblasts. Muscle Nerve 15, 941-948.
Yang, Y., Ballatori, N., and Smith, H. C. (2002a). Apolipoprotein B mRNA editing and the reduction in synthesis and secretion of the atherogenic risk factor, apolipoprotein B100 can be effectively targeted through TAT-mediated protein transduction. Mol Pharmacol 61, 269-276.
Yang, Y., Ma, J., Song, Z., and Wu, M. (2002b). HIV-1 TAT-mediated protein transduction and subcellular localization using novel expression vectors. FEBS Lett 532, 36-44.
Yoon, K., Cole-Strauss, A., and Kmiec, E. B. (1996). Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA.DNA oligonucleotide. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2071-2076.
Zubrzycka-Gaarn, E. E., Bulman, D. E., Karpati, G., Burghes, A. H., Belfall, B., Klamut, H. J., Talbot, J., Hodges, R. S., Ray, P. N., and Worton, R. G. (1988). The Duchenne muscular dystrophy gene product is localized in sarcolemma of human skeletal muscle. Nature 333, 466-469.
173
Annexe:
Transduction de protéines dans les cellules musculaires: Optimisation et applications.
Nicolas J. Caron and Jacques P. Tremblay
Contribution de chaque auteur:
J’ai effectué le travail dans son entier et j’ai rédigé ce chapitre de livre. Jacques P.
Tremblay a supervisé mes travaux.
soumis à Dr. Paul Robbins (éditeur de Peptide-Mediated Transduction : Characterization,
Optimization and Application) en janvier 2003 comme chapitre de livre
174
Résumé La grande dispersion corporelle des muscles squelettiques gène de façon significative la
réussite des protocoles visant le traitement des dystrophies musculaires. Des protéines
d’intérêts thérapeutiques fusionnées à des domaines de transduction protéiques (DTPs)
pourraient potentiellement substituer l’absence de protéines fonctionnelles. Le tissu
conjonctif entourant chaque fibre musculaire est riche en collagènes et en glycoprotéines.
L’injection intramusculaire de domaines de transduction protéiques, résulte principalement
en leur association avec la matrice extracellulaire, mais très peu de fibres sont efficacement
transduites. Ceci suggère que l’affinité des DTPs pour les composantes de la matrice
extracellulaire entourant les myofibres pourrait interférer avec le processus de transduction
intracellulaire. Par contre, les cellules en culture peuvent être ciblées beaucoup plus
facilement, suggérant ainsi que les DTPs pourraient aider de façon significative la thérapie
génique cellulaire ex-vivo en la rendant plus sécuritaire.
175
Protein Transduction of Muscle Cells: Optimization and Application
Nicolas J. Caron and Jacques P. Tremblay
Laval University, Quebec City, Quebec, Canada.
submitted to Paul Robbins in January 2003 as a book chapter (editor for Peptide-Mediated
Transduction : Characterization, Optimization and Application)
176
Abstract:
The widespread distribution of skeletal muscles significantly hampers gene therapy
protocols for the treatment of muscular dystrophies. Therapeutic proteins fused to protein
transduction domains (PTDs) could potentially substitute for the non-functional gene
products. The connective tissue surrounding each muscle fiber is rich in collagens and
glycoproteins. Injection of PTDs in muscles results in localization to the extracellular
matrix but very few transduced muscle fibers. This suggests that the affinity of PTDs for
components of the ECM surrounding myofibers could interfere with the intracellular
transduction process. On the other hand, cultured cells can be targeted more easily;
suggesting that PTDs could significantly help cell-mediated based gene therapies by
permitting safer interventions on cultured cells prior to their transplantation.
Key Words: muscle, protein transduction domain, Tat
177
Introduction
The driving force behind the engineering efforts aimed at producing proteins capable to
transduce through the cell membrane of muscle cells was, to no one’s surprise, the design
of a therapy against muscular dystrophies. Several potential treatments for these diseases
were designed and tested in the last twenty years. Unfortunately, they all suffered major
drawbacks. While pharmacologists are still searching for the magic bullet, gene therapists,
using viral vectors or cells as vehicles for their therapeutic genes, always faced with an
immense challenge. They have to reach quiescent skeletal muscle cells distributed all over
the body, representing more than 40% of total bodyweight and this, without raising an
immune response. To make matters worst, the heart muscle and diaphragm are also
affected. In the last decade, increasing evidence showed that a group of cationic peptide
sequences could render cell membrane permeable to their cargo 1-4. The lure of cell and
vector-free protein replacement therapy using transducing protein technology had found a
niche.
Muscular dystrophies and their treatment
The term muscular dystrophy covers a group of genetically determined disorders, which
cause progressive weakness, wasting of skeletal muscle and which are assumed to affect the
muscle cell directly 5. Some forms cause death after 15 to 20 years, while in others, the life
expectancy may be normal but the patient becomes progressively disabled. Duchenne
muscular dystrophy (DMD), one of the most severe and frequent form of dystrophy,
became the prime target and the case study for the treatment of all muscular dystrophies.
DMD is caused by the absence of dystrophin, a fibrilar protein that serves as connection
between the internal actin cytoskeleton network and the extracellular basal lamina. The
lack of dystrophin produces progressive muscle degeneration, expressed clinically by the
loss of muscle strength early in childhood, severe weakness by the age of 10, and death by
178
the age of 20. Patients often die from respiratory or heart failure. To this day, there is still
no treatment for DMD.
Direct viral-mediated and ex vivo cell-mediated gene therapies have been studied for years
for the treatment of muscular dystrophies. Unfortunately, the success of gene therapy
protocols is often limited by toxicity concerns, large-scale production restrictions and
immunological problems. Skeletal muscle fibers are long syncitial elements composed of
many nuclei and formed by the fusion of mononucleated cells called myoblasts, the result
of the activation and proliferation of satellite cells. Satellite cells are committed stem cells
that could be transplanted as a treatment for muscular dystrophies 6. Myogenic cell
transplantation is mostly affected by a poor spread of the implanted cells and
immunological problems 7,8. In the present chapter, we not only address the direct delivery
of protein transduction domains (PTDs) to muscle fibers, but also examine their potential in
assisting cell-mediated therapy for the treatment of muscular dystrophies.
Muscle tissue structure
Muscle fibers, like most other cells, are embedded in an extracellular matrix rich in proteins
and carbohydrates. The skeletal muscle is composed of elongated multinucleated units.
Each individual skeletal muscle consists of bundles of fibers within a connective tissue
framework 9. The connective tissue surrounding fibers transmits mechanical force along
the entire length of the muscle, confers elasticity, holds water and also serves as a reservoir
for growth factors influencing growth and regeneration. The external sheath surrounding an
entire muscle is called the epimysium. It extends inward to form the perimysium, which
separates bundles of muscle fibers known as fascicles. Individual muscle fibers are
ensheathed by the endomysium that contains the basal lamina, the reticular lamina, cells
179
like fibroblast or macrophages. The basal lamina consists of two layers, the lamina densa
and lamina rara (Fig.1).
Figure 1 Structural model of the skeletal muscle including its connective tissue.
180
Extracellular matrix and proteoglycans
Arginine-rich peptides such as Tat/PTD are known to bind to sulfated compounds such as
heparan sulfate (HS) or heparin, which can inhibit the transactivating properties of
extracellular Tat 10. By contrast, dextran sulfate pre-incubation can restore cationic peptide
intracellular delivery to wild-type levels in cell lines deficient for HS or glycosaminoglycan
(GAG) synthesis 11. In addition, we have observed that Tat/PTD-fusion proteins are tightly
bound to the extracellular matrix surrounding muscle fibers following their injection in the
muscle 12. This suggests that the interactions between cationic peptides and GAGs in
muscle could be a key issue.
Skeletal muscle fibers are surrounded by extracellular matrix composed of glycoproteins,
collagens and proteoglycans like HS, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid. Perlecan,
agrin, syndecan, glypican and type XVIII collagen have been identified so far as heparan
sulfate proteoglycans (HSPGs) components of muscle basal lamina 13,14. While they are
virtually ubiquitous, HDPGs are localized at the external side of the lamina densa adjacent
to the underlying connective tissue, but not found associated to the lumina rara close to the
cell membrane 15.
Following systemic delivery, PTDs incoming from the bloodstream must interact with
sulfated proteoglycans from four different zones in the muscle before they can reach the
cell membrane of a muscle fiber. In contrast with what is observed in cell cultures, where
extracellular matrix proteins are scarcer, GAGs found in muscle are not prominently
associated with proteins located at the cell surface of fibers. A circulating PTD has to cross
the matrix surrounding blood vessel irrigating the muscle before reaching the fibers. It is
then put directly in contact with the proteoglycans of the endomysium. Then, the thick
181
basal lamina still separates the positively charged molecule from HSPG at the fiber
surface. The tissue organization of the muscle, consisting of several layers of sulfated
glycoproteins, probably plays an important role in limiting the direct delivery of cationic
peptides in muscle.
In vivo delivery
Very few groups actually studied the efficiency of in vivo delivery of full-length proteins
using PTDs. Most of the work was done using the protein transduction domain from Tat
2,4,12,16,17. The first report of the internalization of a protein coupled to Tat in muscle
cells was published by Fawell et al. in 1994 4. The intra-venous injection of a Tat(37-72)-
β-Galactosidase conjugate led to the transduction of a significant percentage of heart
muscle cells. The authors also reported low but still detectable staining in skeletal muscles.
Schwarze et al. also examined a variety of tissues following intraperitoneal delivery of a
Tat/PTD-β-Galactosidase purified under denaturing conditions 2. They reported strong
staining of heart muscle cells for β-Galactosidase and low but significant levels of
fluorescence in the quadriceps following IP injection of a FITC-labeled Tat/PTD peptide.
Both studies examined several organs and understandably did not study every tissue in
detail 2,4.
To evaluate the potential of cationic peptides in delivering proteins for the treatment of
neuromuscular disorders such as DMD, we examined with more scrutiny the in vivo
delivery to muscle cells. We first proceeded by injecting Tat-eGFP fusion protein to assess
in vivo distribution and muscle fiber susceptibility to be transduced using C57 BL10
mdx/mdx (mdx), the mouse model for DMD. It was important in our case to test protein
transduction on mdx mice to reproduce more faithfully conditions that would be
182
encountered in a DMD patient. Among other things, both the mdx mouse and the DMD
patient muscles have more abundant connective tissue than normal. Following the
intravenous injection of Tat-eGFP, fluorescence was found mainly in the liver, spleen and
kidney, superficially in the heart and diaphragm, only punctually in the brain, while no
fluorescence was detected in skeletal muscles (unpublished results). Muscles injected with
Tat-eGFP showed intense labeling localized to the extracellular matrix. This suggests that,
although Tat-eGFP proteins were found inside some muscle fibers, their binding by
components of the ECM surrounding myofibers could strongly interfere with the
intracellular transduction process (Fig. 2a). Delivery to the muscle tissue using the intra-
arterial pathway led to few positive fibers in the muscle periphery or surrounding the blood
vessels once damaged fibers were excluded (Fig.2b). Unfortunately, we were unable to
determine if the positive fibers resulting from the intra-arterial delivery were correlated
with an apposition between blood vessels and the cell membrane, thus avoiding the
sequestration by the extracellular matrix observed in intra-muscular injections.
183
Figure 2 Tat-fusion protein localization after in vivo delivery.
Mouse skeletal muscle were treated with TAT-fusion proteins or labeled peptides. A. Fluorescence microscopy examination of a muscle cryosection after the intra-muscular injection of Tat-eGFP in the Tibialis anterior of a C57 BL10 mdx/mdx. B. Fluorescence microscopy examination of a muscle cryosection after the intra-arterial delivery of rhodamine-labeled Tat-eGFP in the quadriceps of a C57 BL10 mdx/mdx. C. X-Gal histochemistry of a muscle cryosection intra-muscular injection of Tat-β-Galactosidase in the Tibialis anterior of a 10J after treatment with dextran sulfate. D. Intra-muscular injection of rhodamine-labeled TAT/PTD peptide in a Balb/C Tibialis anterior. Necropsies were all performed after 18 hours.
184
Recently, it was shown that pretreatment with dextran sulfate could enhance intracellular
delivery in cell lines deficient in HS or GAG synthesis 11 similarly to what was
demonstrated with the infection of mature muscle fiber with the HSV-1 vector 18. This
suggests that electrostatic interactions with sulfated proteoglycans could play an important
role in initiating cell contact between cationic peptides and the cell membrane. To
determine if the overdeveloped extracellular matrix observed in dystrophic mice was
responsible for the poor transduction efficiency observed with Tat-eGFP, we repeated the
experiment with wild-type C57 BL 10J mice. The intra-muscular injection of Tat-β-
Galactosidase in the skeletal muscle following pretreatment with dextran sulfate did not
lead to any improvement. β-Galactosidase was still mainly located in the endomysium and
perimysium extracellular matrix of the injected muscles (Fig.2c). The pre-treatment of
muscles with dextran sulfate only increased β-galactosidase retention to the conjunctive
tissue surrounding muscle fibers, and this fused or not with a PTD. The use of a rhodamine-
labelled Tat/PTD peptide, without a cargo, further illustrates the resiliency of skeletal
muscle fibers to be transduced by a PTDs (Fig.2d). Even without carrying a protein cargo,
the fluorescent peptide could not be found in a significant number of undamaged fibers.
Although HSPGs are ubiquitously distributed in mammals 19, syndecan (transmembrane),
part of the most studied HSPG family, is down regulated in adult muscle while glypican
(membrane-associated) is up-regulated 14. It was suggested that syndecan may function as
a bFGF presenter during myoblast proliferation and glypican as FGF sequester after
differentiation to prevent to prevent the inhibitory effect of bFGF on myogenic
differentiation on adult muscle 20. Interestingly, bFGF is not the only member of the FGF
family that interacts with membrane bound HSPGs, FGF-4 (Kaposi FGF, another cell-
permeable peptide) also depends on interaction with cellular HS 21. If the interaction
between membrane bound GAGs and cationic peptides like Tat is essential, Tat-fusion
185
proteins might be sequestered away from the plasma membrane of skeletal muscles such as
it is the case for proliferative growth factors.
While dystrophin is a huge protein (427 kDa), truncated versions of it were isolated from
patients with less severe forms of muscular dystrophy 22. Artificial minigenes were also
experimented with success in the replacement of the missing naturally occurring form in
mice 23,24. Tat-microdystrophin versions could potentially be produced in bacteria or yeast
to be delivered in circulation to supplement for the missing protein in DMD patients.
Although skeletal muscle fibers could not be reached by such a strategy, heart cells,
however, have shown a therapeutically significant susceptibility to be transduced by
cationic peptides or PTD-fusion proteins. This approach could thus be complementary to
the treatment of skeletal muscles by cell transplantation. The design of a strategy aiming at
skeletal muscle fibers or the diaphragm would necessitate further improvements. If the high
concentration of sulfated proteoglycans in the periphery of muscle fibers is responsible for
their limited permeability to cationic peptides, two solutions can be proposed. The first one
consists in the development of a cell-permeable peptide sequence with low affinity to
sulfated proteoglycans. The second one is the digestion of extracellular matrix components
part of the basal lamina and connective tissue with proteases. The feasibility of the second
potential solution is unfortunately restricted since it could severely damaged muscles.
Application to cell-mediated therapies
Aiming directly at the diseased muscle tissue is not the only potential application of PTDs
in the treatment of muscular dystrophies. Several protocols, now in development, rely on
the capacity of stem cells or myogenic cells to carry a normal genome (or added therapeutic
genes) to treat those severe diseases. Several ex vivo gene therapy protocols require genetic
engineering to correct a particular genetic defect, increase the life span of the targeted cells
186
or overexpress a therapeutically significant gene, thus necessitating the use of several
different vectors at high dosage. Among the proteins that could be delivered into cells,
there are proteins to transiently immortalize, increase the life span, switch the
differentiation program of cells, integrate DNA to specific sites in the genome or decrease
cell death. Integrating recombinant viruses (retrovirus, lentivirus, AAV) can very well
perform these tasks, but not without leaving random integrative events potentially resulting
in armful insertional mutagenesis. On the other hand, non-integrating recombinant viruses
(Adenovirus, HSV) using the "latent episome strategy" not only result in a decreased long-
term transgene expression, they also contain highly immunogenic proteins preventing re-
administration and can be toxic. Cell-penetrating proteins could significantly help cell-
mediated based gene therapies by permitting safer interventions on cultured cells prior to
their transplantation.
Cell transplantation protocols incorporating ex vivo gene correction of cells isolated for
patients were designed to minimize immunological incompatibility. Unfortunately, when
cultured in vitro, myoblasts isolated from muscle biopsies of DMD patients generally
exhibit a limited proliferative life span and enter rapidly in senescence 25. This limited
proliferative capacity severely limits their ability to be genetically modified and used for
myoblast transplantation 26,27. Three avenues are currently tested to draw from the
regenerating potential of cells isolated from patients. These solutions include the use of
pluripotent non-differentiated stem cells, the immortalization of myogenic cells or the
switching of the differentiation program of differentiated non-myogenic cells with
extensive proliferation capacity.
Pluripotent stem cells isolated from embryos or adults have a very long life span in culture,
but they do not always participate efficiently to tissue regeneration. In fact, mouse
embryonic stem cells form teratomas when transplanted, suggesting that interfering with
the differentiation process of stem cells prior to their transplantation could be beneficial.
187
Pluripotent stem cells isolated from the bone marrow or skeletal muscle of adult mice often
yield inferior intra-muscular transplantation efficiency when compared with differentiated
myoblasts (unpublished results). We are currently investigating the potential of delivering
transcription factors implicated in muscle differentiation fused with Tat/PTD to enhance
myogenic conversion of pluripotent stem cells. Other groups have already undertaken
similar efforts. For example, Cdk inhibitor p21 has already been used in fusion with Tat to
enhance immortalized hepatocyte differentiation 28.
Cell transplantation has been hampered by the inability of committed primary cultured cells
to actively divide while maintaining their stage of differentiation and regeneration potential
29. Although oncogenes can confer a partial yet functional immortalization to human
myoblasts 27, reversing the immortalized phenotype would be highly desirable. Ideally,
Tat-oncoprotein fusions could be added to the cell culture medium to confer reversible
immortalization. A Tat-E7 fusion protein has already been experimented with by Lissy et
al. 30. While this approach is feasible, the large quantities of recombinant proteins
necessary to provide daily doses of oncoproteins to proliferating cells in a large-scale
human trial could be forbidding. A very attractive development was published recently.
PTDs such as Tat can efficiently deliver the functional Cre recombinase protein from
bacteriophage P1 into cultured cells or living tissue 31,32. A cell-penetrating Cre
recombinase could be used to remove an oncogene flanked by LoxP sites previously
inserted with an integrating virus. Immortalized myoblast clones could be screened for
unfortunate integrative events before their proliferation, immortalization reversal and
subsequent transplantation. The timely and restricted delivery of a simple protein offers
potentially more control and lesser immunogenecity in contrast with non-integrating
viruses and decreased insertional mutagenesis risks compared with integrating viruses.
Early cell death due to the transplantation procedure, mechanical stress, inflammation or
localized ischemic shock plagues myoblast transplantation like most cell transplantation
188
techniques 33-35. Decreasing early cell death by any means could reduce the amount of
cells to be proliferated in culture, the cost of cell transplantation therapies and the severity
of the surgical procedure. A team working on pancreatic islet transplantation as design a
fusion protein composed of the anti-apoptotic protein Bcl-Xl fused to the PTD of Tat 34.
Although the magnitude of the contribution of apoptosis in myoblast transplantation is still
unclear, increasing cell viability could prove to be an attractive strategy. Another approach
relies on the use of the superoxide dismutase fused to Tat/PTD. The cell viability of Hela
cells treated with paraquat, an intracellular superoxide anion generator, was increased by
transduced Tat-SOD 36. This technique could be adapted to protect myoblasts against the
oxidative burst of neutrophils present in the muscle tissue in the 24 hours following
transplantation 37.
Perspectives
With the increasing evidence showing that PTDs interact with GAGs before they cross cell
membranes 10,11,38, a more profound understanding of the role played by this interaction
and of the entry mechanism of PTD-fusion proteins is needed before we can optimize their
delivery to muscle fibers. In contrast, the use of PTDs to deliver proteins in cultured cells
of interest, for DMD treatment with cell transplantation, is progressing more rapidly. While
the purification and the transduction efficiency remain problematic in some instances, the
relative safety and the potential advantages of timely and controlled delivery using PTDs
outweigh their limitations. These issues should motivate investigators involved in the cell
transplantation field to incorporate more cell-penetrating protein strategies to their
protocols to replace integrating viruses.
189
References 1. Frankel, A.D. & Pabo, C.O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-93 (1988).
2. Schwarze, S.R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. & Dowdy, S.F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse [see comments]. Science 285, 1569-72 (1999).
3. Green, M. & Loewenstein, P.M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-88 (1988).
4. Fawell, S. et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 664-8 (1994).
5. Mastaglia, F.L. & Walton, J.N. Skeletal Muscle Pathology. 2nd edition, (Churchill Livinstone, Edinbourg, 1992).
6. Partridge, T.A., Grounds, M. & Sloper, J.C. Evidence of fusion between host and donor myoblasts in skeletal muscle grafts. Nature 273, 306-8 (1978).
7. Pincon-Raymond, M. et al. Conditional immortalization of normal and dysgenic mouse muscle cells by the SV40 large T antigen under the vimentin promoter control. Dev Biol 148, 517-28 (1991).
8. Skuk, D. & Tremblay, J.P. Progress in myoblast transplantation: a potential treatment of dystrophies [In Process Citation]. Microsc Res Tech 48, 213-22 (2000).
9. Sanes, J. The extracellular matrix. in Myology, basic and clinical, Vol. 1 (eds. Engel, A.G. & Franzini-Armstrong, C.) 242-60 (Mcgraw-Hill, New York, 1994).
10. Rusnati, M. et al. Interaction of HIV-1 Tat protein with heparin. Role of the backbone structure, sulfation, and size. J Biol Chem 272, 11313-20 (1997).
11. Mai, J.C., Shen, H., Watkins, S.C., Cheng, T. & Robbins, P.D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J Biol Chem 277, 30208-18 (2002).
12. Caron, N.J. et al. Intracellular delivery of a Tat-eGFP fusion protein into muscle cells. Mol Ther 3, 310-8 (2001).
13. Jenniskens, G.J., Oosterhof, A., Brandwijk, R., Veerkamp, J.H. & van Kuppevelt, T.H. Heparan sulfate heterogeneity in skeletal muscle basal lamina: demonstration by phage display-derived antibodies. J Neurosci 20, 4099-111 (2000).
14. Velleman, S.G. The role of the extracellular matrix in skeletal development. Poult Sci 79, 985-9 (2000).
190
15. Kogaya, Y., Kim, S., Haruna, S. & Akisaka, T. Heterogeneity of distribution pattern at the electron microscopic level of heparan sulfate in various basement membranes. J Histochem Cytochem 38, 1459-67 (1990).
16. Mi, Z., Mai, J., Lu, X. & Robbins, P.D. Characterization of a class of cationic peptides able to facilitate efficient protein transduction in vitro and in vivo. Mol Ther 2, 339-47 (2000).
17. Xia, H., Mao, Q. & Davidson, B.L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nat Biotechnol 19, 640-4 (2001).
18. Yeung, S., Bockhold, K. & Tufaro, F. Efficient infection of mature skeletal muscle with herpes simplex virus vectors by using dextran sulfate as a co-receptor. Gene Ther 6, 1536-44 (1999).
19. Couchman, J.R. & Ljubimov, A.V. Mammalian tissue distribution of a large heparan sulfate proteoglycan detected by monoclonal antibodies. Matrix 9, 311-21 (1989).
20. Larrain, J., Carey, D.J. & Brandan, E. Syndecan-1 expression inhibits myoblast differentiation through a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism. J Biol Chem 273, 32288-96 (1998).
21. Olwin, B.B. & Rapraeger, A. Repression of myogenic differentiation by aFGF, bFGF, and K-FGF is dependent on cellular heparan sulfate. J Cell Biol 118, 631-9 (1992).
22. Love, D.R., Flint, T.J., Genet, S.A., Middleton-Price, H.R. & Davies, K.E. Becker muscular dystrophy patient with a large intragenic dystrophin deletion: implications for functional minigenes and gene therapy. J Med Genet 28, 860-4 (1991).
23. Watchko, J. et al. Adeno-associated virus vector-mediated minidystrophin gene therapy improves dystrophic muscle contractile function in mdx mice. Hum Gene Ther 13, 1451-60 (2002).
24. Phelps, S.F. et al. Expression of full-length and truncated dystrophin mini-genes in transgenic mdx mice. Hum Mol Genet 4, 1251-8 (1995).
25. Webster, C. & Blau, H.M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet 16, 557-65 (1990).
26. Seigneurin-Venin, S. et al. Transplantation of normal and DMD myoblasts expressing the telomerase gene in SCID mice. Biochem Biophys Res Commun 272, 362-9 (2000).
27. Seigneurin-Venin, S., Bernard, V. & Tremblay, J.P. Telomerase allows the immortalization of T antigen-positive DMD myoblasts: a new source of cells for gene transfer application. Gene Ther 7, 619-23 (2000).
191
28. Kunieda, T. et al. Transduction of immortalized human hepatocytes with p21 to enhance differentiated phenotypes. Cell Transplant 11, 421-8 (2002).
29. Westerman, K.A. & Leboulch, P. Reversible immortalization of mammalian cells mediated by retroviral transfer and site-specific recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 8971-6 (1996).
30. Lissy, N.A. et al. TCR antigen-induced cell death occurs from a late G1 phase cell cycle check point. Immunity 8, 57-65 (1998).
31. Jo, D. et al. Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase. Nat Biotechnol 19, 929-33 (2001).
32. Peitz, M., Pfannkuche, K., Rajewsky, K. & Edenhofer, F. Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 4489-94 (2002).
33. Skuk, D., Vilquin, J.T. & Tremblay, J.P. Experimental and therapeutic approaches to muscular dystrophies. Curr Opin Neurol 15, 563-9 (2002).
34. Embury, J. et al. Proteins linked to a protein transduction domain efficiently transduce pancreatic islets. Diabetes 50, 1706-13 (2001).
35. Beauchamp, J.R., Morgan, J.E., Pagel, C.N. & Partridge, T.A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol 144, 1113-22 (1999).
36. Kwon, H.Y. et al. Transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase mediated by an HIV-1 Tat protein basic domain into mammalian cells. FEBS Lett 485, 163-7 (2000).
37. Skuk, D. et al. Dynamics of the early immune cellular reactions after myogenic cell transplantation. Cell Transplant 11, 671-81 (2002).
38. Richard, J.P. et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J Biol Chem 278, 585-90 (2003).