Application de la Technologie NucleofectionTM pour l’identification des protéines salivaires de

phlebotomus papatasi, candidats vaccins contre la leishmaniose cutanée chez l’Homme

Tlili Aymen 1, Soumaya Marzouki 1, Emna Chabaane 1 Maha Abdeladhim 2, Wafa Kammoun-Rebai 3, Nabil Belhadj-Hmida 1, Shaden Kamhawi 2, Hechmi Louzir 1-4 , Jesus G Valenzuela 2, Melika Ben Ahmed 1-4

1 Laboratoire de Transmission, Contrôle et Immunobiologie des Infections 2 Vector Molecular Biology Section, Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH 3 Laboratoire de Parasitologie Médicale, Biotechnologies et Biomolécules 4 Faculté de Médecine de Tunis, Université Tunis El Manar

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016

Les leishmanioses

Maladie chronique généralisée

Contamination par des parasites protozoaires flagellés: Leishmania

Mammifères

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Leishmaniose cutanée en Tunisie

•Le centre et le sud (Kairouan, Sidi Bouzid , Gafsa )

Localisation

•Lésions ulcéreuses crouteuses multiples•Taille variable •Les régions découvertes du corps

Clinique

•L. major Agent pathogène

•Phlebotomus papatasi Vecteur

LCSLCZLCA

LCZ

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Problème sanitaire d’urgence

Un taux de létalité Moyens diagnostiques et de médicaments

Prévention par une vaccination

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Vaccination

vaccin

agent pathogène

Elaboration du vaccin anti-parasite

complexe

La biologie complexe du

parasite

La variabilité antigénique

La faible immunogénicité

des antigènes

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Efficacité de l’immunisation contre la salive du vecteur

BALB/c

Souris Naïve

Souris pré-exposée

Résistance à l’infection

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Chez la souris

Extrait salivaire total

type T CD4+

IFN-ɤ et IL12

Th1

Réponse immune protectrice

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Tc2 cells

SGE

IL-10+++

CD8

Absence de protection ?

Th1 cells

SGE

IFN-

CD4

PROTECTION Candidat vaccin?

Chez l’Homme

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Résultats préliminaires

CD4 CD80.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0Unstimulated

SGE

>30KDa

<30KDa

inde

x of

pro

lifer

atio

n

CD4 CD80

10

20

30Unstimulated

SGE

>30KDa

<30KDa

Rat

io o

f IF

N-

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 Identifier les protéines salivaires de Phlebotomus papatasi cibles de la réponse immune cellulaire spécifique chez des patients vivants en zone d’endémie de LCZ en Tunisie, et plus particulièrement d’identifier celle(s) qui activent la réponse immune de type Th1 représentant des candidats vaccins potentiels contre l’infection leishmanienne.

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Choix des protéines salivaires

La fa

mille des D7

• SP28

, SP15

« Yellow related

proteins »

• SP42 et SP44

silk-proteins

• SP32

apyrases

• SP36

FAMILLES DE PROTEINES SALIVAIRES

P. argentipes, P. ariasi,P. perniciosus, L. LongipalpisP. papatasi

Immunodominante induit Th2Biomarqueur

SP34

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Impulsions électriques

NUCLEOFECTION

Plasmide recombinant

Séquence de protéine

salivaire

Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016Prélever du sang total d’individus

atteint de la leishmaniose

Séparation des PBMC avec le Ficoll -Hypaque

Transfecter les PBMC avec des plasmides recombinants par Nucleofection

Production des protéines dans les PBMC humaines

Etude de la réponse cellulaire

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PBMC de 10 donneurs immunisés contre la salive de P. papatasi et

transfectés par les plasmides recombinants

Elisa sandwich anti IFN-

Incorporation de thymidine tritiée

Cytokines

secrétéIndex de prolifération cellulaire

Activation ou non d’une

réponse immune cellulaire

Th1

Cytokines Multiplex

TH1/TH2/TH17

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Étude de la prolifération cellulaire des PBMC transfectées

Unstimulated SP15 SP28 SP34 SP36 SP42 SP441

2

3

4

inde

x of

pro

lifer

atio

n

PpSP36 , PpSP42 et PpSP44 : Résultats significatifs

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Dosage de l’IFN- dans les surnageants de PBMC transfectées

Unstimulated SP15 SP28 SP34 SP36 SP42 SP440

50

100

150

200

250

300

350

400

IFN

- c

once

ntra

tion

(pg/

ml)

PpSP36, PpSP42 et PpSP44 : induction significative d’IFN- Chez 7 donneurs

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Monitoring de cytokines Th1/Th2/Th17

IFN-

IL-10

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L’ensemble des données obtenus chez les donneurs immuns

Yellow related proteins PpSP42 et PpSP44 Apyrase ou PpSP36

Réponse immune cellulaire de type Th1

Candidats vaccins potentiels

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PpSP44

PpSP42

PpSP36

Production de la forme recombinante

Stimulant directe des PBMC fraiches de 10 donneurs immunisés contre la salivesans transfection

Taux d’IFN-ɤ secrété

Prolifération cellulaire

Etude de la réponse immune

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Étude de la prolifération cellulaire des PBMC stimulées par la rPpSP44

1

2

3

4***

0.0002p

Controls Immune donors

inde

x of

pro

lifer

atio

n

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Dosage de l’IFN- sur les PBMC stimulées par la rPpSP44

0

100

200

300

400

***

< 0.0001p

Controls Immune donors

IFN

- c

once

ntra

tion

(pg/

ml)

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PpSP36PpSP42

PpSP44

La PpSP15 n’est pas un candidat vaccin ≠ souris

LJM11LJM17

Protection

P. papatasi L. longipaplpis

Modèles murins

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Conclusion

La transfection cellulaire par Nucleofection semble une technique prometteuse permettant l’étude de la réponse immune dirigée contre les protéines salivaires des vecteurs de la leishmaniose.

Son utilisation a permis de mettre en évidence la capacité de trois protéines salivaires PpSP44, PpSP42 et PpSP36 à induire une réponse cellulaire potentiellement protectrice.

La protéine PpSP44 a montré les meilleures résultats de prolifération cellulaire et de sécrétion d’IFN- constituant ainsi le meilleur candidat vaccin contre la LCZ.

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Merci pour votre attention