Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale

Anomalies des gènes et leur exploration

Alain Hovnanian

Service de Génétique Médicale

Hôpital Purpan

Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00

EnhancerSilencer

Locus controlregion

5 ’ 3 ’CAAT  TATA

promoteurséquences amont

TAATGATAG AATAAAATG

codond’initiation

stop signal de polyadénylation

GèneTranscription clivage

Unité de transcription

exons introns

Structure générale d ’un gène chez l ’homme

EnhancerSilencer

Locus controlregion

Expression d ’un gène chez l ’homme

5 ’ 3 ’CAAT  TATA

promoteurséquences amont

TAATGATAG AATAAAATG

codond’initiation

stop signal de polyadénylation

CAP

AAAAAAAA

Gène

ARNm immature

ARNm mature

3 ’5 ’

5 ’ 3 ’

Transcription

Maturation

AAAAAAAA

Noyau

CytoplasmeNH2 COOHTraduction Protéine

clivage

exons introns

épissage des introns

MUTATIONS

Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme)

Origines:- Spontanées:

- Anomalies de la réplication de l ’ADN- les plus fréquentes (10-6 paires de bases par

génération)- erreurs de l  ’ADN polymérase (misapariements)- favorisées par les séquences répétées

- Accidents de recombinaison méiotique- surviennent lors de la méiose- favorisés par des séquences d ’homologie entre chromosomes- délétions, duplications, recombinaisons illégitimes

Origines des mutations (suite):

- Spontanées:- Désamination d ’une cytosine méthylée

- très fréquent en pathologie humaine- non reconnu par les systèmes de réparation de l ’ADN- ex: Arg CGA -> Stop TGA

- Provoquées:- agents génotoxiques - 3 types: chimiques, physiques (radioactivité naturelle et autres rayonnements ionisants, UV…) ou biologiques (virus)- normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ’ADN- déficients dans certaines maladies génétiques (ex: ataxie télangiectasie, xéroderma pigmentosum…)(cancers)

Types de mutations

A - Mutations ponctuelles

B - Insertion ou délétions de plusieurs bases

C - Expansions de triplets (mutations instables)

D - Macrolésions

A - Mutations ponctuelles

Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques

1 - Substitutions de baseDéfinition: remplacement d ’un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène:

- régions codantes:- mutation silencieuse- mutation faux-sens

- changement d ’un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe)

ou non conservatrice- mutation non-sens

- changement d ’un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)

1 - Substitutions de base (suite)

- régions codantes:

cas particuliers:

- codon d ’initiation de la traduction

- codon de terminaison de la traduction

- séquences « Exonic splicing enhancer  »

(-> anomalie d ’épissage)

- mutation non-sens entraînant le saut de

l ’exon correspondant

(-> rétablissement de la phase)

1 - Substitutions de base (suite)

- régions non codantes:- introns:

- sites consensus d ’épissage (site donneur gt, site accepteur ag)- sites non consensus d ’épissage- site de branchement- conséquences:

-> saut d ’exon-> rétention d ’intron-> activation d ’un site cryptique d ’épissage, exonique ou intronique

- séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription

- séquences 3 ’UTR -> instabilité de l ’ARNm

Exemples anomalies d ’épissage

gtgt gtag ag

c

gtgt gtag ag

a

gtgt gtag ag

stop

gt

Saut d ’exon

Activation d ’un site cryptique d ’épissage

Saut d ’exon

2 - Délétion ou insertion d ’une base

- régions codantes:

entraînent un décalage du cadre de lecture

(« mutations décalantes ») conduisant le plus

souvent à un codon stop prématuré

- régions non codantes:selon leur localisation:- région promotrice; anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage- région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions)

Perte ou ajout de plusieurs bases

- régions codantes:

- Si multiple de 3:

perte ou ajout d ’un ou plusieurs acides aminés

- Si non multiple de 3

entraînent un décalage du cadre de lecture

conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré

- régions non codantes:selon leur localisation:- région promotrice: anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage- région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

6081del28

6847del27

Délétions génomiques de COL7A1 dans l’EBD dominante

Conséquences des mutationsMutation respectant le cadre de lecture:

- ex: mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de 3,

anomalie d ’épissage respectant ou rétablissant la phase

- conduisent à la synthèse d ’une protéine anormale présentant:

- le remplacement d ’un acide aminé par un autre

- la perte ou le gain d ’un ou plusieurs acides aminés

-> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises

Conséquences des mutations (suite)Mutation interrompant le cadre de lecture:

- ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3

- conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner:

- instabilité de l ’ARNm muté (NMRD)

- synthèse d ’une protéine tronquée ayant une extrémité

COOH anormale

- synthèse d ’une protéine amputée d ’une séquence

peptidique (saut d ’exon portant un PTC)

-> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle

C - Expansions de triplets (mutations instables)

- Répétitions instables de triplets nucléotidiques

- Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables

- Souvent maladies neuro-dégénératives

- Le plus souvent transmission autosomique dominante

- Exemples

Syndrome de l ’X fragile CGG 5 ’UTR XR Xq27

Dystrophie myotonique de Steinert CTG 3 ’UTR AD 19q13

Chorée de Huntington CAG codante AD 4p16

Ataxie de Friedreich GAA intron 1 AR 9q13

D - Macrolésions

- Conséquences délétères en pathologie et au cours de

l ’évolution

- Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb

- Duplications

- Fusion de gènes suite à une double cassure de l ’ADN

(ex. translocation)

- Inversions de gènes (orientation tête-bêche d ’un fragment

d ’ADN)

Stratégies de recherche d ’anomalie des gènes(Maladie et gène connus +++)

Analyse directe

Mutation connue

de petite taille de grande taille

PCR

- Enzyme de restriction- Hybridation spécifique d ’allèles- Séquençage +++

- Long PCR ou- Southern-blot

Identification d ’une mutation non sens de COL7A1 par séquençage

Arg->StopCGA -> TGA

EB

Mère

Père

Tropho

Arg->StopCGA -> TGA

Analyse directe

Mutation inconnue

PCR

Détection:- SSCP Single strand conformational polymorphism- DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis- CSGE Conformation sensitive gel electrophoresis- DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography

Identification:- Séquençage +++

Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

Pic d ’élution anormal

Analyse directe

Macrolésions

Cytogénétique Biologie moléculaire

- Hybridation sur chromosome

(FISH, Fluorescent in situ hybridization)

- Southern-blot

- PCR:

Perte d ’hétérozygotie

Défaut d ’amplification de l ’ADN

Analyse indirecte

Etude de marqueurs génétiques polymorphes:

- intra-géniques ou flanquant le gène

- microsatellites ou bi-alléliques

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

SNPs: single nucleotide polymorphism)

A

3p21

COL7A 48,948-48,980PvuIID3S1581D3S1568

D3S1588 54,62

45

50

Mb

D3S3582 43,88

D3S3629 46,47-48,91

48,985

49,48

Distance physiqueMarqueurs génétiques

Centromère

TélomèreEtude de liaison génétiqueutilisant les marqueurs de COL7A1

Chromosome 3

219 221

227 237

219 237

Père

Mère

Enfant atteintd ’EB récessive

Génotypage de marqueurs de COL7A1

219 221

227 237

219 237

Père atteint

Mère

Enfant atteintd’ EB dominante familiale

Génotypage de marqueurs de COL7A1

Père Mère

Enfant EBDR Enfant sain Trophoblaste Porteur sain

Diagnostic prénatal d ’EBDR par étude indirecte (marqueurs de COL7A1)

ADN

Génotypage (marqueurs de COL7A1)et Recherche de mutations de COL7A1

COL7A1amplifié

Sang

Diagnostic moléculaire des EB dystrophiques

Vérification des mutations

Exemples de conséquences des mutations

Codons stop prématurés

Instabilité ARNm

Protéine non produite

Allèle nul(perte de fonction)

Maladies récessivesMaladies dominantes par haploinsuffisance

Mutations faux-sens

Protéine qualitativement anormale

Stabilité variable

Fonction anormale(diminution, perte

ou nouvelle fonction)

Maladies dominantes (effet dominant négatif)Cancers

Nomenclature des mutations

Mutations faux-sens: ex: E117K

Mutations non-sens: ex: R542X

Mutations d ’épissage: ex: 621 +1G ->A, 622 -2A->C

Délétions, insertions: ex: F508del

6232-6236del ou

6232delATAAG

409-410insC ou 409insC