Applications biologiques de la spectroscopie Raman de résonance et de la spectroscopie micro-Raman...

BIOCHIMIE, 1981, 63, 927-929.

Applications biologiques de la spectroscopie Raman de r&onance et de la spectroscopic micro-Raman de r6sonance.

R. CAVAGNAT, F. CRUEGE et PHAM V. HUONG o.

Laboratoire de Spectroscopie lnfrarouge et Raman, Universitd de Bordeaux 1, 351, cours de la Liberation, 33405 Talence Cedex.

Mots-cl~s : spectroscopic Raman de r~sonanee / spectroscopic micro-Raman de r~sonance/ m~talloporphyrines.

Key-words : resonance Raman spectroscopy / resonance micro-Raman spectroscopy / metalloporphyrins.

S u m m a r y .

Advantages are given to illustrate the possibili- ties of resonance Raman spectroscopy in the stu- dies of biological systems.

A relation giving the size of porphinato-core o[ metalloporphyrins from resonance Raman fre- quency is proposed. It can be applied to heine, even in lived state.

By illuminating the sample through a micro- scope, resonance Raman effect can be collected from 1 (tzm) ~ of sample. Spectra of a vegetal-cell wall (pimento) and of a red corpuscle (hemoglo- bin) are shown as examples.

Spectres Raman de rdsonance, Intensification et sdlectivitd.

L'effet Raman de r6sonance apparalt lorsque la fr6quence de l'excitation s'approche ou atteint celle d'un niveau 61ectronique excit6 discret mais non stationnaire d'une mol6cule. L'intensit6 des raies Raman caract6ristiques de ce chromophore est exal t&: l'exaltation peut atteindre plus d'un million de lois.

II en r6sulte des possibilit6s immenses de d6tec- tion et d'obtention d'informations ~ l'6chelle mol& culaire et sub-mol6culaire [1-5].

La s61ectivit6 permet en outre de s'int6resser h la fonction d'un site donn6 dans le grand 6difice mol6culaire qu'est le syst~me biologique. Par un choix ad6quat de la longueur d'onde du laser inci-

A qui toute correspondance doit ~tre adressde.

dent, on peut exalter s61ectivement les raies Raman correspondant au chromophore choisi. La plupart des autres vibrations mol&ulaires restent actives dans le spectre Raman, mais leur intensit6 est comparativement si faible qu'elles sont nov6es dans le bruit de fond du spectre.

C'est ainsi qu'en 6clairant avec une raie laser 514,5 nm une plaquette de globule rouge d'un

sang humain (fig. 1), seules les raies Raman r6son- nantes du noyau porphyrine du fer sont observ6es.

Ce spectre peut &re analys6 en comparaison avec ceux d'autres m&alloporphyrines [2, 4].

La relation propos& par Huong [2, 4] permet une d&ermination facile de la taille du cceur por- phyrine ou de l'6tat d'oxydation de l'atome m&al- lique central.

Rappelons que le rayon Rct-.~ du c0eur porphy- fine est donn6 par :

Rct-.~'(g) = A - B . ,o

od 'J repr6sente les fr6quences Raman de rOso- nance caractgristiques des liaisons C = C du ma- crocyle, nomm6es [4] bande IV et bande V. Pour la bande IV : A = 4,86 et B = 0,00180 ; pour la bande V : A = 5,87 et B = 0,00236.

Cette relation a 6t6 vdrifi6e avec un grand nom- bre de m6talloporphyrines [2-4] et &endue pour expliquer d'autres propri6t6s g6om6triques [6].

Spectroscopie micro-Raman de rdsonance.

En 6clairant l'6chantilton ~ travers un micro- scope, on peut recueillir l'effet Raman d'une sur- face de l 'ordre de 1 p,m 2. Cette s61ectivit6 spa-

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A p p l i c a t i o n s b io logiques de la spec troscopie R a m a n . 929

tiale permet d'obtenir le spectre vibrationnel de chaque <~ point ~> d'un 6chantillon h6t6rogbne.

Cet arrangement optique que nous utilisons a 6t6 dessin6 par Dhamelincourt et Delhaye [7, 8] pour la MOLE de Jobin Yvon. Un dispositif diff6- rent mais qui donne la m~me performance a 6t6 propos6 h NBS Washington par Rosasco et Etz [9, 10].

Cette s61ectivit~ spatiale permet d'enregistrer ais6ment le spectre Raman d'un <~ point >> localis6 sur une micro-pattie d'une cellule biologique.

La figure 2 donne l'exemple du spectre d'un point localis6 sur la paroi d'une cellule v6g6tale. On y reconna~t facilement les bandes caract6risti- ques d'un carot6noide dans te piment d'Espelette.

En combinant la spectroscopic micro-Raman (6chantillon de dimension de l'ordre du micro- m~tre) et de l'effet Raman de r~sonance (concen- tration pouvant atteindre une part par dix mil- lions), nous avons rCussi h r6duire encore Ia quan- tit6 d'6chantillonnage n6cessaire pour l'obtention du spectre mol~culaire Raman. C'est ainsi que le spectre Raman de certains pigments dans les mem- branes nerveuses a pu atre enregistr6 [11].

BIBLIOGRAPHIE.

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9. Rosasco, G. J. in <~ Advances in lnfrared and Raman Spectroscopy, VoL 7, Eds. Clark and Hester, Hey- den, London, 1980.

10. Etz, E. S. & Blaha, J. J. (1980) Nat. Bur. Standards, Special Publication, 533, 153.

11. Huong, P. V., New Analytical Possibilities o] Raman and Resonance Raman Spectroscopy, in ¢ Reviews on Analytical Chemistry >>, L. Nininsto, Budapest, 1982.

BIOCHIMIE, 1981, 63, n ° 11-12.