Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

Cours

d'Hémostase

DUT ABB

3- Exploration de la Coagulation

Quand explorer la coagulation ?

•Manifestations cliniques hémorragiques

•Incident hémorragique per- ou post-opératoire

•Bilan pré-opératoire

•Thromboses

•Surveillance traitement anticoagulant

Schéma simplifié de la coagulation

Facteurs Contacts Facteur Tissulaire

PL Ca2+ VIIIa

PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa VIIa

PL Ca2+

X XaPL Ca2+ Va

II IIa

Fibrinogène Fibrine

Voie endogène Voie exogène

Facteur Tissulaire

VIIa

PL Ca2+

X XaPL Ca2+ Va

II IIa

Fibrinogène Fibrine

Mesure du Temps de Quick (TQ) ou Taux de Prothrombine (TP): Exploration de Fonctionnalité Voie exogène

Réactifs:

•Thromboplastine tissulaire = Facteur Tissulaire + PL

•CaCl2

•Plasma

Mesure du Temps de Quick

Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence de FT, PL et Ca2+

Plasma 100µl Préchauffage

2 min 37°c

Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37°C 200µl

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop Chrono

TQ

• N = 11-13 sec

•Expression TQ en pourcentage Taux de Prothrombine (TP): besoin étalonnage Droite de Thivolle

Etalonnage:

Mesure TQ sur Plasmas calibrés TP 100%, 50%, 33%,….

Droite de ThivolleTQ sec

%TP100 50 33

•TP Pathologique si < 70% = TQ allongé

•Expression TQ en INR (International Normalized Ratio) : réservé aux surveillances de patients traités aux AntiVitamines K

ISI: Indice de Sensibilité Internationale de la thromboplastine

TQ Témoin INR=( )ISITQ Patient

Facteurs Contacts

PL Ca2+ VIIIa

PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa

X XaPL Ca2+ Va

II IIa

Fibrinogène Fibrine

Mesure du Temps de Céphaline + Activateur (TCA): Exploration de Fonctionnalité Voie endogène

Réactifs:

•Activateurs « Contacts »: Kaolin, Silice, Célite, Acide

éllagique

•Substitut PL: Céphaline

•CaCl2

•Plasma

Plasma 100µl

Préchauffage 3 min 37°c

CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop Chrono

TCA

Mesure du Temps de Céphaline + activateur

Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’activateur des facteurs « contacts », de PL et de Ca2+

Activateur 100µl

• N: 30-35 sec

•Résultat exprimé en secondes par rapport à un plasma Témoin normal

•TCA allongé si ratioTCA PatientTCA Témoin

> 1,2

Détection de la formation du caillot de Fibrine

•« Lectures oculaires » 

Technique du crochet accrochage

caillot/filament gélatineux

Barreau aimanté en rotation

Bain-marie électromagnétique arrêt de rotation du

barreau

•« Lecture électromagnétique » sur semi- ou automates complets

Bobine électromagnétique

Bille aimantée

Oscillation pendulaire de la bille ralentissement puis arrêt mouvement pendulaire par caillot fibrine

Micro-cuvette immobile

Bobine électromagnétique

« Ergot central »Bille aimantée

Micro-cuvette en rotation

Aimant

Immobilité de la bille par aimantation emprisonnement dans caillot de fibrine provoque mise en rotation associée à la micro-cuvette

•« Lecture optique » par turbidimétrie à 650 nm: moins utilisée

- DO départ: turbidité plasma (+réactifs)

-variation DO: addition réactif déclenchant

-variation DO: formation caillot fibrine

-Sur semi- ou automates complets,

•Déclenchement chrono simultané à addition réactif « déclenchant » (Thromboplastine pour TQ, CaCl2 pour TCA) par pipette reliée électriquement

•Arrêt Chrono automatique par détection caillot fibrine:

- arrêt mouvement pendulaire bille (diminution intensité champ magnétique)

- mise en rotation bille (coupure champ magnétique)

- changement de turbidité

-Sur semi-automates,

•Addition manuelle: plasma, réactif, réactif « déclenchant »

-Sur automates complets,

•Travail sur Tube primaire Sang centrifugé (Anticoagulant Citrate de Na+ 3,8%), tous les additions de réactifs sont automatisées

Allongement isolé TQ:

•Déficit VII

•Effet Inhibiteur : -thérapeutique: (présence héparine, en principe pas d’allongement sauf si [Héparine] importante),

début traitement Anti-Vitamine K

-pathologique: (Anticoagulants circulants) Ac anti-facteurs,

Ac anti-phospholipides

Allongement isolé TCA:

•Déficit PK, KHPM, XII, XI, IX, VIII

•Effet Inhibiteur:

-thérapeutique: héparine, et AVK

-pathologique: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides

Allongements associés TQ et TCA:

•Déficit facteur voie commune: X, V, II, I

•Dysfibrinogénémie

•Déficits combinés:Vexo + Vc, Vendo + Vc, Vexo + Vendo (+ Vc)

•Effets inhibiteurs: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides, Inhibiteurs polymérisation (PDF, anti-polymérase)

•Inhibiteurs thérapeutiques: héparine, AVK

Mesure du Temps de Thrombine (T T) Exploration de Fonctionnalité de la Fibrinoformation

Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’une quantité standardisée de thrombine diluée et de Ca2+

Plasma 200µl Préchauffage

2 min 37°c

Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop Chrono

TT

•N 22 sec

•Réalisé si TQ et TCA allongés

•Si TT allongé: investigations supplémentaires (PDF, D-Dimères, Fibrinogène « immunologique »)

Allongements TT (et TQ et TCA)

•Présence héparine

•Déficit fibrinogène

•Dysfibrinogénémie

•Inhibiteur Fibrinoformation: PDF, Anti-polymérase

Dosage chronométrique du Fibrinogène

-dosage indirect, car mesure d’un temps d’apparition de fibrine par transformation de la totalité du fibrinogène présent

-temps de coagulation à 37°C d’un plasma dilué, citraté, déplaquetté, en présence de thrombine concentrée, est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène

-dosage quantitatif et qualitatif

-besoin étalonnage

Fibrinogène g/L

Temps de coagulation en sec.

1,5 3 6

Plasma 200µl Préchauffage

2 min 37°c

Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop Chrono

Temps de coagulation

•N : 2 à 4 g/L

Dosage chronométrique isolé de facteur de la coagulation

-Plasmas réactifs déficients en un seul facteur

-Temps de coagulation d’un plasma déficitaire est fonction de la quantité du facteur apporté par le plasma à tester

-Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas normaux étalons

Dosage chronométrique facteur VIII

Dilution Plasma Patient 100µl

Préchauffage 3 min 37°c

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop ChronoPlasma déficitaire en VIII 100µl

CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl

Activateurs Facteurs contact

Temps de coagulation

•Etalonnage

Temps de coagulation en sec.

954515%VIII

N: 60-150%

Dosage chronométrique facteur VII

Dilution Plasma Patient 100µl

Préchauffage 2 min 37°c

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop ChronoPlasma déficitaire en VII 100µl

Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37°C 200µl

Temps de coagulation

•Etalonnage

Temps de coagulation en sec.

954515%VII•N: 70-130%

Dosage chromogénique isolé de facteur de la coagulation

-Dosage colorimétriques (ou amidolytiques)

-utilisation de substrats oligopeptidiques chromogènes: groupement paranitroaniline libère amine pNA par coupure enzymatique

-dosage d’activité enzymatique: concentration enzyme (facteur) est proportionnelle à la vitesse d’hydrolyse, mesurée par la variation absorbance à 405 nm (dosage pt final, 2 pts, cinétique…)

Dosage chromogénique facteur VIII

Dilution Plasma Patient 100µl

IXa + PL

4 min 37°C

X

4 min 37°C

Substrat CBS 48.03

CH30CO-D-Leu-Gly-Arg-pNA

3 min 37°CDO à 405 nm

DO 405 nm =[pNA]

25 50 100%VIII

200

Etalonnage

IXa + PL

X Xa

VIII

CBS 48.03

pNA

Épreuve de correction de l’allongement isolé du TCA

Plasma Patient 100µl

Plasma Témoin N 100µl

Activateurs 100µl

Préchauffage 3 min 37°c

CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl

Déclenchement Chronomètre

Caillot Fibrine

Stop Chrono

TCA

Calcul Indice de Rosner

(TCA Mélange – TCA Témoin N)

TCA Patientx100

•Indice <12 : TCA Patient corrigé par Témoin: Déficits Facteurs

•Indice >15: TCA Patient non corrigé par Témoin: Ac AntiCoagulants Circulants

TCA Patient-TCA Mélange

TCA Mélangex100% correction=

•% correction > 65 %: déficit facteur

•% correction < 50%: présence Ac anticoagulant circulant

Rapport=TCA Mélange

TCA Témoin N

•Rapport < 1,2 : déficit facteur

•Rapport > 1,2: présence Ac anticoagulant circulant