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Contrôles microbiologiques des produits pharmaceutiques et cosmétiques. cosmétiques. Législation. Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles. - PowerPoint PPT Presentation
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CONTRÔLES MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES
ET COSMÉTIQUES
COSMÉTIQUES
LégislationRèglement (CE) n°1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013)
• Elaboration d’un dossier d’information– Rapport sur la sécurité du produit cosmétique, personne responsable = pharmacien/médecin
• Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008)
• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus peu résistants.
• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des conservateurs afin de limiter cette prolifération.
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles
LégislationRèglement (CE) n°1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013)
• Elaboration d’un dossier d’information– Rapport sur la sécurité du produit cosmétique
• Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008)
• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus peu résistants.
• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des conservateurs afin de limiter cette prolifération.
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
Risque microbiologique2) Risque microbiologique• La norme ISO 29621:2010. Appréciation du risque microbiologique Les produits finis évalués à faible risque par cette norme ne nécessiteront pas la mise
en œuvre des normes microbiologiques relatives aux cosmétiques
Facteur physicochimique Limite Exemple
pH ≤ 3,0 Soins peeling (acide glycolique)
pH ≥ 10,0 Produits défrisants
Éthanol ou autre alcool ≥ 20 % Laques, toniques, parfums
Température de remplissage ≥ 65,0 °C Pommades pour les lèvres, rouges à lèvres, fards à joues
Activité de l'eau, aw ≤ 0,75a Pommades pour les lèvres, rouges à lèvres, fards à joues
Produits à base de solvants Vernis à ongles
Oxydants Colorants capillaires
Chlorhydrate d'aluminium ≥ 25 % Anti-transpirants
Exemples de produits à faible risque
Risque microbioogique• L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels
que :– l'altération potentielle des produits cosmétiques;– le caractère pathogène des micro-organismes;– le site d'application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc.);– la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans, etc.).
• recherche d'agents pathogènes pour la peau– Staphylococcus aureus,– Pseudomonas aeruginosa – Candida albicans
• recherche des indicateurs de contamination fécale pour détecter une défaillance de l'hygiène au cours du processus de fabrication.– Escherichia coli
Recherche
Formulation
Fabrication
Analyses microbiologiques
conditionnement
Principe actifsconservateurs
R&D
Fabrication en pilote
Echelle industrielle
Laboratoire de microbiologie
Effet inhibiteur des conservateurs
Sensibilité microbiologique (ISO 9621:2010) Challenge test (ISO 11930)Validation du neutralisant pour le dénombrement
Contrôle d’atmosphèreContrôle des surfacesContrôle de l’hygiène du personnelContrôle microbiologique du produit vrac
Contrôle du produit fini- dénombrement et détection de la FMA- dénombrement des levures /moisissures- détection des pathogènes
Contrôle des produits finisRéférentiels pour le contrôle
• Pharmacopée EU 8.0 (janvier 2014): (harmonisée) Cosmétique = médicament à usage cutané
– paragraphe 2 .6.12 : Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien
– paragraphe 2.6.13 : Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes spécifies
• Normes ISO– NF EN ISO 21 148 : généralités(2009)
– NF EN ISO 21 149 : dénombrement et détection de la flore mésophile aérobie (2009)
– NF EN ISO 16 212: dénombrement des levures moisissures (2011)
– NF EN ISO 22 718: détection Staphylococcus aureus (2009)
– NF EN ISO 21 717 : détection Pseudomonas aeruginosa (2009)
– NF EN ISO 21 148 : détection Escherichia coli (2009
– NF EN ISO18 416 : détection Candida albicans (2009)
– NF EN ISO18 415 : détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés (2011)
Préparation de la suspension mère :• le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum
entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min• La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml
du produit d’essai mélangé avec soin.
Contrôle des produits finis
Produit miscible à l’eau Produit non miscible à l’eau
S = 1g produit de catégorie2S= 5g produit de catégorie 1
S (g ou mL) de produit
V mL de diluant-neutralisant
Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
V mL de diluant neutralisant + polysorbate 80
Dilution d= 1/10
Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit
Contrôle des produits finis
ConservateurComposés chimiques pouvant neutraliser
l'activité antimicrobienne des conservateursExemples de neutralisants adéquats et de liquides de rinçage [6] [7] (pour les
méthodes de filtration sur membrane)
Produits phénoliques: Lécithine Polysorbate 80, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
parabens, phénoxyéthanol, phényléthanol, etc.
Polysorbate 80 Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras, 7 g/l + lécithine, 20 g/l + polysorbate 80, 4 g/l.Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
Tensioactifs non ioniquesBouillon neutralisant D/Ea.
Anilides Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Ammoniums quaternaires Lécithine, saponine, polysorbate 80, dodécylsulfate de sodium Polysorbate 80, 30 g/l + dodécylsulfate de sodium, 4 g/l + lécithine, 3 g/l.
Tensioactifs cationiques Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Aldéhydes
Glycine, histidine
Lécithine, 3 g/l + polysorbate 80, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l.
Agents générateurs de formaldéhydePolysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l + L-cystéine, 1 g/l.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: polysorbate 80, 3 g/l + L-histidine, 0,5 g/l.
Oxydants Thiosulfate de sodiumThiosulfate de sodium, 5 g/l.Liquide de rinçage: thiosulfate de sodium, 3 g/l.
Isothiazolinones, imidazolesLécithine, saponine Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.Amines, sulfates, mercaptans, bisulfite de sodium, thioglycolate de sodium Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Biguanides Lécithine, saponine, polysorbate 80Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Sels métalliques (Cu, Zn, Hg) Bisulfite de sodium, L-cystéine Thioglycolate de sodium, 0,5 g/l ou 5 g/l.
Organo-mercuriels Composés sulfurés, acide thioglycolliqueL-cystéine, 0,8 g/l ou 1,5 g/l.Bouillon neutralisant D/Ea.Liquide de rinçage: thioglycolate de sodium, 0,5 g/l.
Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit• la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit
doit être vérifiée et validée• La validation est réalisée en contaminant le produit avec des
souches de référence et en effectuant le dénombrement contre un témoin sans produit.
– Staphylococcus aureus ATCC 6538– Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ou E.coli ATCC 8739– Candida albicans ATCC 10231
• L’écart entre le témoin et l’essai ne doit pas excéder 50% (0,3 log)
Contrôle des produits finis
Dénombrement et détection• En plus du dénombrement , un détection est également
réalisée dans un bouillon « d’enrichissement » incubé pendant 20H.
• Bouillon Eugon LT 100
Contrôle des produits finis
Peptone pancréatique de caséine 15 g
Peptonepapaïque de soja 5,0 gL-cystéine 0,7 gChlorure de sodium 4,0 gSulfite de sodium 0,2 gGlucose 5,5 gLécithine d’oeuf 1,0 gPolysorbate 80 5,0 gOctoxynol 9 1,0 g
Bouillon pour enrichissement : Bouillon Eugon LT 100
DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILESNorme ISO 21 149
S (g ou mL) de produit
V mL de diluant neutralisant
Dilution d= 1/10
S = 1g produit de catégorie2S= 5g produit de catégorie 1
1 mL en masse 0,1 ml en surface10 mL filtration
Géloses TSA
72 H ± 6H32,5 °C ± 2,5°C
Dénombrement
Réfrigérateur(détection des particules)
Validation du Dénombrement
V mL de diluant neutralisant
S (g ou mL) de produit
Dilution d= 1/10
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
1 mL en masse 0,1 ml en surface10 mL filtration
à 103 UFC/mL(masse) à 104 UFC/mL ( surface)à 102 UFC/mL (filtration)
Témoin sans produit
1 mL
72 H ± 6H32,5 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
N T
Si inefficacité du neutralisant
DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILESNorme ISO 21 149
S (g ou mL) de produit
V mL de bouillon Eugon
Dilution d= 1/10
S = 1g produit de catégorie2S= 5g produit de catégorie 1
Gélose TSA
48H ± 6H32,5 °C ± 2,5°C
Détection Validation de la Détection
S (g ou mL) de produit
Dilution d= 1/10
Pseudomonas aeruginosa + Staphylococcus aureus
0,1 ml en surface
à 102UFC/mL
1 mL
48 H ± 6H32,5 °C ± 2,5°C
20 H minimum32,5 °C ± 2,5°C
V mL de bouillon Eugon
0,1 ml en surface
20 H minimum32,5 °C ± 2,5°C
20 à 24 H32,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse
Validation si 100 à 500 UFC/mL
Validation si présence de colonies caractéristiquesJaunes pour St.aureusVerdâtres pour Ps aeruginosa
Et absence de colonie sur le témoin
Témoin sans produit
DÉNOMBREMENT des levures et moisissuresNorme ISO 16 212
S (g ou mL) de produit
V mL de diluant neutralisant
Dilution d= 1/10
S = 1g produit de catégorie2S= 5g produit de catégorie 1
1 mL en masse 0,1 ml en surface10 mL filtration
Géloses SDASabouraud dextrose agar
3 à 5 jours25 °C ± 2,5°C
Dénombrement
Réfrigérateur(détection des particules)
Validation du Dénombrement
V mL de diluant neutralisant
S (g ou mL) de produit
Dilution d= 1/10
Candida albicans
1 mL en masse 0,1 ml en surface10 mL filtration
à 103 UFC/mL(masse) à 104 UFC/mL ( surface)à 102 UFC/mL (filtration)
Témoin sans produit
1 mL
3 à 5 jours25 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
N T
DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES
S (g ou mL) de produit
V mL de bouillon Eugon
Dilution d= 1/10
S = 1g produit de catégorie2S= 5g produit de catégorie 1
Gélose Cétrimide (ISO 21 150)
DétectionValidation de la Détection
S (g ou mL) de produit
Dilution d= 1/10
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
0,1 ml en surface
à 102UFC/mL
1 mL
48 H ± 6H32,5 °C ± 2,5°C
20 H minimum32,5 °C ± 2,5°C
V mL de bouillon Eugon
0,1 ml en surface
20 H minimum32,5 °C ± 2,5°C
20 à 24 H32,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse
Validation si 100 à 500 UFC/mL
Validation si présence de colonie caractéristiquesEt absence de colonie sur le témoin
Témoin sans produit
E.coli
Candida albicans
48H ± 6H32,5 °C ± 2,5°C
Gélose Baird parker (ISO 21 718)
Gélose Mac Conkey (ISO 21 148)
Gélose SDA (ISO 18 416)
Identification
DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES
Souche et norme
Ps. aeruginosa(ISO 21 150)
St aureus(ISO 21 718)
E.Coli(ISO 21 148)
C.Albicans(ISO 18 416)
Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA
Colonies caractéristiques
Pigment jaune-vert (pyocyanine),
fluorescent sous rayonnement UV
Colonies noires et brillantes, entourées d'un halo clair (de 2
mm à 5 mm)
Colonie rouge brique; peut être
entourée d'une zone de bile précipitée.
Colonies convexes et crémeuses, de couleur blanche à beige
Méthode d’identification*
GramTest enzymatique
Isolement sur « Pseudomonas P » (24 à 48 H à 32,5°C)
GramTest enzymatique
Test coagulase
GramTest enzymatique
Isolement sur EMB (24 à 48 H à 32,5°C)
GramTest de filamentation
Test de chlamydosporulation
Résultat Bacille Gram –Oxydase +
Colonies entourées d’une zone bleu-
verte (pyocyanine) ou rouge marron
(pyorubine)
Coque Gram+Catalase +Coagulase +
Bacille Gram –Oxydase –
Colonies bleu noir à reflet métallique
sur EMB
Cellules ovoïdes violettes
FilamentsChlamydospore
Blastospore
* Minimale : galerie biochimique ou autre méthode validée possible
Détection de micro-organismes spécifiés et non spécifiés
Enrichissement (Eugon)
Isolement (TSA)
Gram
Coque gram +
Catalase +
Kit d’identificationadapté
Staphylococcus aureus ?
Présence d’un micro-organisme non spécifié
Présence de Staphylococcus
aureus
Bacille G-
oxydase + oxydase -
Kit d’identificationadapté
Kit d’identificationadapté
Kit d’identificationadapté
Présence de Pseudomonas
aeruginosa
Présence de Escherichia
coli
Présence de Candida albicans
Pseudomonas aeruginosa ?
Escherichia coli?
Candida albicans?
Non
Non
Non
autre
Non
Levure
Non
Contrôle du produit fini Critères microbiologiques
• Règlement (CE) n°1223/2009,
• BPF (ISO 22 716)
• Lignes directrices du Comité Scientifique des Produits de Consommation
Catégorie de produit FMAT Germes pathogènes
catégorie 1* ≤102UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,5 g ou mL
catégorie 2 : ≤103UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,1g ou mL
* destinés aux enfants < 3 ans ou en contact avec les yeux et les muqueuses recommandation du SCCP
Il convient que les critères d'acceptation soient établis pour spécifier les exigences auxquelles doivent répondre les matières premières, les articles de conditionnement, les produits vrac et les produits finis.
Spécifications microbiologiques de la substance ou du mélange et du produit cosmétique. Une attention particulière est accordée aux produits cosmétiques utilisés sur le contour des yeux, sur les muqueuses en général, sur une peau lésée, chez les enfants de moins de trois ans, chez les personnes âgées et chez les personnes au système immunitaire fragilisé.
PR NF EN ISO 17516 (août 2013) Cosmétiques – Microbiologie – Limites microbiologiques
A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi :
– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc….
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)
Voie d’administration DGAT UFC/g ou /mL
DMLTUFC/g ou /mL
Micro-organismes spécifiésAbsence dans ( )
Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
Rectale 103 102
Buccale, GingivaleCutanée, Nasale, Auriculaire 102 101 Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)
Vaginale 102 101Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)Candida albicans (1g ou 1 mL)
Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif)Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)
Inhalation 102 101Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)
Préparation à base de MP naturelle ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 104 102
Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)Escherichia coli (1g ou 1 mL)Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
Aliments médicamenteux vétérinaire ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104
Escherichia coli (1g ou 1 mL)Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
Contrôle du produit fini Interprétation des résultats
BPF (ISO 22 716)
Produit finis, vrac, MP, article de conditionnement hors spécification
EnquêteRetraitement
Destruction du lot
Résultats conformes
Libération de lot
ANALYSESDossier de lot
Challenge testRisque microbiologiqueRèglement (CE) n°1223/2009 • Concernant la sensibilité microbiologique, on distingue trois catégories de
produits: – 1) les produits à faible risque microbiologique (par exemple, les produits dont la teneur
en alcool est > 20 %, les produits à base de solvants organiques, les produits à pH élevé/faible), pour lesquels il n’est pas nécessaire de soumettre le produit fini à un challenge test pour la conservation, ni à des contrôles microbiologiques. Une justification scientifique est toutefois requise;
– 2) les produits à usage unique et les produits qui ne peuvent être ouverts (par exemple, dont le conditionnement permet de doser le produit sans que celui-ci n’entre en contact avec l’air), pour lesquels seuls des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires. Une justification scientifique est toutefois requise;
– 3) tous les autres produits, pour lesquels un challenge test pour la conservation et des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires.
C) Challenge testou test d’efficacité de la conservation antimicrobienne • Etabli par la pharmacopée européenne ou pharmacopée US pour les médicaments et
les produits cosmétiques• NORME ISO 11930 : 2012
• Ce test consiste en la contamination artificielle du produit cosmétique avec différents micro-organismes en nombre connu et au suivi de l’évolution de ce nombre en fonction du temps.
• Les souches utilisées sont celles habituellement trouvées dans les produits cosmétiques et au niveau de l’épiderme : – Candida albicans – Aspergillus niger– Escherichia coli– Staphylococcus aureus– Pseudomonas aeruginosa
• La population microbienne pour chaque souche est évaluée après 2, 7, 14, 21 et 28 jours.
Aspergillus brasiliensis ATCC 16 404
7, 14 et 28 jours
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse
E.coli
Candida albicans
0,2 mL de N
Aspergillus brasiliensis
Challenge test
103 102 UFC/mL
Validation du neutralisant
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant
1 g de produit TémoinEssai Témoin inoculum
Gélose TSA ou SDA
1 ml en masse
Nvf Nvn Nv
Validation si Nv 100 , Nvn proche de Nv et Nvf 0,5 Nvn
20 g de produit
107 à 108 bactéries/mL106 à 107 mycètes/mL
N
N0 =N/100
Calcul de N
T0
7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse 48 à
72 H à 32,5 °C ± 2,5°C
T7
1 ml en masse 48 à
72 H à 32,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse 48 à
72 H à 32,5 °C ± 2,5°C
T14
T28
Nx
Nx
Nx
Jour résultat Réductionlogarithmique
Red log attendue interprétation
J0 1,6.105
J2 < 1 5 2 J7 < 1 5 3 J28 < 1 5 NI Conclusion Conservateur efficace sur Staphylococcus aureus
Exemple1 crème de soin + Staphylococcus aureus Exemple2 shampoing+ Candida albicansJour résultat Réduction
logarithmiqueRed log attendue interprétation
J0 2,3.105
J14 5.104 <1 2 J28 3.102 3 NI Conclusion Conservateur non efficace sur les mycètes
Taux de réduction logarithmique (Rx = lg N0– lg Nx) requisMicro-organismes Bactéries C. albicans A. brasiliensis
Temps de prélèvement T7 T14 T28 T7 T14 T28 T14 T28
Critères A ≥3 ≥3 et PA ≥3 et PA ≥1 ≥1 et PA ≥1 et PA ≥0 ≥1 et PA
Critères B Non réalisé ≥3 ≥3 et PA Non
réalisé ≥1 ≥1 et PA ≥0 ≥0 et PA
•critères A: la formulation est protégée contre la prolifération microbienne pouvant présenter un risque potentiel pour l’utilisateur et aucun autre facteur n’est pris en compte.•critères B: le niveau de protection est acceptable si l’analyse du risque démontre l’existence de facteurs de maîtrise non liés à la formulation indiquant que le risque microbiologique est acceptable pour le produit cosmétique.
Liens internet
Règlement 1223 : 2009http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2009:342:0059:0209:fr:PDF
DÉCISION D’EXÉCUTION DE LA COMMISSION du 25 novembre 2013 concernant les lignes directrices pour l’application de l’annexe I du règlement (CE) n°1223/2009 du Parlement européen et du Conseil relatif aux produits cosmétiques
• http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2013:315:0082:0105:FR:PDFCritères de qualité microbiologique d’un produit cosmétiquehttp://mon.univ-montp2.fr/claroline/backends/download.php?url=L0NyaXTocmVzX21pY3JvYmlvbG9naXF1ZXMucGRm&cidReset=true&cidReq=XLCH404Stabilité microbiologique Le contexte réglementaire et sociétal• http://www.cosmetic-valley.com/images/1-Contexte%20r%C3%A9glementaire%20et%20soci
%C3%A9tal%20-%20S%20Guyomard_1.pdfIntertekhttp://www.intertek-france.com/cosmetique/analyses/microbiologie/Normes ISO
PHARMACEUTIQUE
• Les produits pharmaceutiques sont analysés selon les directives – de la pharmacopée française et européenne pour les produits
destinés à l’exploitation dans la CE– des pays de vente comme les USA (USP) ou le Japon (JP) qui disposent
de leur propre pharmacopée. • Les pharmacopées distinguent deux types de produits :
– Les produits qui doivent être stériles : - Les préparations pour usage parentéral (introduction d’une substance dans
l’organisme par une autre voie que la voie digestive, exemple : Injection sous-cutanée, intraveineuse ou intra musculaire).
- Les préparations ophtalmiques.- Les pansements chirurgicaux et le matériel chirurgical.- Les autres préparations devant être stérile…
– Les produits non obligatoirement stériles :- Les matières premières- Les médicaments à usage non parentéral
A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
1 MICROORGANISMES RECHERCHÉS.
• La présence de micro-organismes peut Réduire l’efficacité des principes actifs Induire des problèmes de santé
• produits à faible risque de contamination :– Dénombrement de germe indicateur de la qualité globale :
– les germes totaux (DGAT : dénombrement des germes aérobies totaux)– les levures et moisissures (DMLT : dénombrement des moisissures et levures totales)
– Recherche des microorganismes spécifiques,pour quelques produits particuliers : E.coli , Salmonella , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.
• Leur recherche va dépendre : – la voie et le mode d’administration– La nature du produit et son aptitude à favoriser la croissance microbienne– Catégorie de patients visée (YOPI)– Etat du patient : Existence de blessures, lésions organiques, utilisation d’immunosuppresseurs.
– Des traitements ultérieurs de fabrication pour les matières premières
CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
2 TECHNIQUES • Préparation de l’échantillon avec
– un diluant avec neutralisant tamponné pour arrêter l’action des antimicrobiens présents (PA ou conservateur)
– un tensio-actif pour mélanger les produits de nature lipidique • Méthode de dénombrement
• Filtration• Dénombrement en milieu solide (produit non filtrable)
• Les milieux de culture recommandés par la pharmacopée sont :– Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja pour la
FMAT– Milieu Sabouraud glucosé gélosé + ATB pour les levures
moisissures
2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien ........................... 7282.6.13. Contrôle microbiologique des produits non stériles :recherche de microorganismes spécifies.............................. 202
CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
ANCIENS CRITÈRES. La limite prescrite dans la contamination microbienne dans des produits non
obligatoirement stériles est 102 micro-organismes par ml ou par gramme.
Limite maximale d'acceptation 5.102 micro-organismes par mL ou par gramme.• Si absence totale de développement, rendre < à 1 micro-organisme par ml ou par
gramme.• Si développement, choisir le résultat le plus défavorable.
– Si le résultat est > 102 micro-organismes par ml ou par gramme, réaliser une coloration de Gram.• si bacilles Gram +, faire une recherche de spores et pas d'identification.• si bacilles Gram-, faire une identification.• si coques Gram +, faire une identification.La conformité ou la non conformité du produit dépend du micro-organisme identifié et du traitement appliqué
au produit.
– Si le résultat est > 5.102 micro-organismes par ml ou par gramme, effectuer un deuxième essai sur le même échantillon et éventuellement un troisième essai sur un échantillon différent du même lot. • Si le deuxième essai est bon, rendre comme résultat: produit conforme; de même pour le troisième essai.• Si un des deux essais terminaux est non conforme, le produit est rejeté.
A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
3 CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi :
– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc….
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)
Voie d’administration DGAT UFC/g ou /mL
DMLTUFC/g ou /mL
Micro-organismes spécifiésAbsence dans ( )
Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
Rectale 103 102
Buccale, GingivaleCutanée, Nasale, Auriculaire 102 101 Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)
Vaginale 102 101Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)Candida albicans (1g ou 1 mL)
Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif)Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)
Inhalation 102 101Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)
Préparation à base de MP naturelle ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 104 102
Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)Escherichia coli (1g ou 1 mL)Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
Aliments médicamenteux vétérinaire ne pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104
Escherichia coli (1g ou 1 mL)Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES
– Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de vérifier– l’absence de tout microorganisme (FMAT, levures moisissures,
bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate) – L’absence de particules– mais aussi d’endotoxine.
– Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de grand volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de filtration.
Médicament à analyser
Germes retenus sur les filtres
Bouillon TSA
Bouillon Schaedler
Incubation 30° C en Aérobiose
Anaérobiose
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES
– Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de vérifier l’absence de tout microorganisme (FMAT, levures moisissures, bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate) mais aussi d’endotoxine.
– Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de grand volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de filtration.
– Afin de limiter encore le risque de contamination par l’environnement, l’appareil de filtration est manipulé sous des isolateurs : PSM de type III ou équipés d’un hémi scaphandre.
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES2) RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de substances
pyrogènes (susceptible de provoquer une augmentation de la température) dans les produits pharmaceutiques qui entrent en contact avec la circulation sanguine ou le système nerveux central.
Les pyrogènes sont soit- des micro-organismes responsables d’infections- des substances sécrétées par des micro-organismes persistant après la destruction de celui-ci ex : endotoxine
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES2 RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE . • L'essai permettant la détection des endotoxines
bactériennes est un essai in vitro réalisé à l'aide d'un réactif, le lysat d'amoebocytes de Limule (LAL), obtenu à partir des cellules circulantes de cet animal : le limule.
http://www.eprofeel.tv/v/102,charles-river-le-dosage-des-endotoxines.html
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES2- RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. • Lors de la mise en présence du LAL et
d’endotoxines, la formation de coaguline s’accompagne de l’apparition – d’un trouble (base de la méthode turbidimétrique)
• Leur agrégation conduit à la formation – d’un gel (technique par gélification)
• La protéine coagulogène peut être éliminée du réactif LAL et remplacée – par un substrat chromogène spécifique de la coagulase (méthodes chromogéniques)– Par un substrat fluorogene spécifique de la coagulase (méthode par fluorimétrie)
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES2- RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. Un petit volume de l'échantillon (10 pi) est combiné avec le Limulus Amebocyte
Lysate, et les endotoxines de l'échantillon déclenchent l'activité protéolytique du facteur C.
Lorsque le substrat chromogène est ajoutée, il est catalysé par la protéase activée. le clivage produit de la p-nitroalinine (pNA), de couleur jaune qui peut être quantifiée en mesurant l'absorbance à 405 nm (A405) et par l'extrapolation à l'encontre d'une courbe d’étalonnage.
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES2 DOSAGE DES PYROGÈNES « TOTAUX ».
C) CONTRÔLES QUALITÉ.• Afin de valider les contrôles sur les lots de fabrication, il est nécessaire de
vérifier la conformité :- des milieux- des diluants- des produits à examiner.
• Les tests réalisés sont :- des tests de stérilité des milieux et diluants:
ils permettent de contrôler leur non contamination lors de leur préparation et de leur conservation en les plaçant (milieu prêt à l’emploi donc conditionné en boite et non ensemencé) à l’étuve pendant le temps et à la température d’incubation utilisés habituellement.(voir TP)
- des tests de fertilité des milieux : - ils permettent de déterminer si le milieu a conservé les qualités nutritionnelles attendues au cours
de sa préparation ou de sa conservation.- On ensemence le milieu avec une suspension bactérienne de référence (ATCC) de concentration
connue de façon à retrouver environ 100 colonies sur le milieu.(voir TP)- L’absence de culture ou un résultat < 30 colonies traduit un problème de fertilité.
- des tests permettant de vérifier l’absence d’antimicrobien dans le produit examiné.- Il consiste à mettre en contact le produit avec les souches de référence et de comparer les résultats
obtenus avec un témoin réalisé sans produit.(voir TP)
• Nouveau règlement européen no 1907/2006 sur l’enregistrement, l’évaluation, l’autorisation et la restriction des produits chimiques
• Entré en vigueur au 1er juin 2007• Tout producteur d’une substance chimique doit fournir un
dossier contenant les informations physicochimiques, toxicologiques et écotoxicologiques la concernant
Liens internet
• Pyrogènes• http://
www.merckmillipore.fr/chemicals/pyrodetect-system/c_loysHfET05QAAAEyqpQqgLUh
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