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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Recherche de mutations récurrentes
Un gène – une mutation
Un gène-des mutations majoritaires
… de nombreux outils adaptés
Maladie de Huntington
Allèles anormauxAllèles anormaux(> 36 CAG )(> 36 CAG )
Allèles normauxAllèles normaux(( 30 CAG 30 CAG ))
Diagnostic Direct et analyse fonctionnelleSyndrome de retard mental lié à l ’X
• Le Gène :
– Gène FMR1, localisé en Xq27.3
– FMRP : RNA binding protéine
– Présence d ’une expansion d ’un motif trinucléotidique répété
« CGG » au niveau de l ’extrémité 5 ’non traduite du gène
(CGG)n(CGG)n
...Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine- Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine...
Diagnostic Direct Syndrome de retard mental lié à l ’X
• Southern Blot
BlotBlot
2,8 kb2,8 kbEcoRI+EagI normalEcoRI+EagI normal
5,2 kb5,2 kbEcoRI normalEcoRI normal
MutéMutéMéthyléMéthyléNINIPrémutéPrémutéNo MéthyléNo MéthyléNANA
Hom
me
norm
alH
omm
e no
rmal
Fem
me
norm
ale
Fem
me
norm
ale
Hom
me
prém
uté
Hom
me
prém
uté
Fem
me
prém
utée
Fem
me
prém
utée
Hom
me
mut
éH
omm
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Fem
me
mut
éeFe
mm
e m
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Hom
me
mos
aïqu
eH
omm
e m
osaï
que
Fem
me
mos
aïqu
eFe
mm
e m
osaï
que
Interprétation des profilsInterprétation des profils
M M
PM
FH
Diagnostic direct d ’une lésion de l ’ADN par PCR
Deux réactions permettent d ’amplifier simultanément à l ’aide de 18 couples d ’amorces spécifiques, 18 exons du gène de la dystrophine et les jonctions introns-exons correspondantes.
Elles permettent ainsi de diagnostiquer la délétion d ’un ou plusieurs de ces exons chez les malades atteints de myopathie de Duchenne/Becker.
45
48
19
17
5
8
12
44
4
Dystrophiemusculaire
deDuchenne
MW
MM MT TEXON
pm
3
43
50
13
6
47
60
52
Oligonucleotide Ligation Assay
CC ADN NormalADN Normal
Sonde communeSonde commune
FluorochromeFluorochromeAA
GG
GG
LigationLigationdénaturationdénaturation
OLA NormalOLA Normal
Oligonucleotide Ligation Assay
GG
AATT ADN MutéADN Muté
Sonde communeSonde commune
FluorochromeFluorochrome
AA
LigationLigationdénaturationdénaturation
OLA mutéOLA muté
OLAOLA
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Recherche de mutations inconnues
Techniques multiples de détection
PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X)
Siz
e m
arke
rU
ndig
este
dR
317X
Con
trol
PCR/HaeIIIPCR/HaeIII
Con
trol
s
nt 1
311
C
T
SSCPSSCP
Con
trol
s
nt 1
311
C
T
DGGEDGGE
HeterozygousCodon 317 CAG TAG
SequenceSequence
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
• Critères d’implication d’une variation nucléotidique dans un phénotype (pathologique)– évident (modification radicale de la protéine)
• Absence d’ARNm ou de protéine
• Perte de la fonction de la protéine in vitro ou dans un modèle (test fonctionnel)
• modification de l’ARNm
– Arguments probabilistes• Histoire familiale
– corrélations mode de transmission/ phénotype ; phénotype/génotype
• Arguments biologiques (éventuellement in sillico)– nature du changement d’acide aminé
– éloignement du consensus pour une séquence signal
– ...
• Comparaison en population– mutations comparables et leurs effets pathogènes
– conservation du résidu modifié dans une famille de gène (intraspécifique) ou une analyse phylogénétique (interspécifique)
– présence de la variation dans une population normale comparable
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Le Diagnostic Indirect
Ici
Marqueur 1
Marqueur 2
Marqueur 3
Marqueur 4
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Diagnostic Indirect (affection AD)
1°) Indicationsa) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Phénomène de recombinaison
m +1cM
3cM
m +
P=0,01
ou m +
P=0,03
ou m +
P=0,0003
ou
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Le consentement éclairé– Obligatoire
• doit porter sur des renseignements précis
• doit faire l’objet d’un document écrit
• doit être compris par le patient ou ses ayant-droits
– Les cas particuliers• enfants
– les titulaires de l’autorité parentale et éventuellement l’enfant lui même
• les majeurs incapacités– tuteur ou curateur
• les impossibilités– personne de confiance
déclarée
– famille
• L’attestation d’obtention du consentement.
• Le consentement éclairé
– Unicité de la recherche
– Autorisation du laboratoire
– Découvertes fortuites
– Incertitude sur le succès
– Durée des examens
– Conservation des échantillons
– Modalités de rendu diagnostique
– Caractère facultatif
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
– Abord du patient
– Lecture d’un compte rendu d’analyse moléculaire pour le praticien
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Rendu des résultats– par le médecin prescripteur du test
• qui est le seul destinatiare des résultats…
– Au cours d’une consultation appropriée
– Eventuel suivi
• Lecture d’un compte rendu de diagnostic moléculaire à l’usage du praticien– Notion de nomenclature internationale des mutations
Nomenclature des mutations
• Description au niveau nucléotidique– Base de description
• la séquence génomique : g.
• La séquence de l’ADNc : c.
– Les substitutions• g.11223G>A = substitution d’une guanosine par une adénosine en
position 11223 de la séquence
• c.542T>C (le nucléotide N° 1 est le premier nucléotide du codon d’initiation de la traduction (A de l’ATG))
• Cas des introns– c.641+2T>A ou IVSn+2T>A
– c.642-1G>T ou IVSn-1G>T
• Séquence de référence précisée.
– Les délétions et les insertions• « del » ou « ins »
• c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA
• Description au niveau protéique– p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X
– p.R40W ou p.Arg40Trp
• Description de mutation à effet plus complexe– Exemple mutations décalantes du cadre de lecture
• c.642_643insCfsX18
• p.Ala214AlafsX6
• Lecture du compte rendu– 1°) la technique employée
– 2°) le résultat brut• Présence d’une mutation [c.24C>T]+[=] dont l’impact protéique est
[p.Lys8Arg]+[=]
– 3°) le commentaire• La mutation p.Lys8Arg présente à l’état hétérozygote est décrite de
manière récurente dans la population européenne. Elle est responsable du phénotype du patient. Elle se transmet en dominance et, sa présence doit faire conseiller une consultation spécialisée de génétique pour informer le proposant des risques et engager une éventuelle enquête familiale.
• Précisions, questions et description des mutations complexes : – http://www. dmd.mutnomen.html
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Consentement de la femme enceinte
• Elle a eu et compris les informations suivantes– Mode de pratique du DPN
– Nature et limite des examens réalisés
– Risques liés au prélèvement
– Délai d’obtention des résultats
– Remise et explication des résultats
• Il n’y a en acun cas un engagement à la réalisation d’une interruprion de la grossesse si le fœtus est atteint de la maladie recherchée
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
CHORIOCENTESE et / ou PLACENTOCENTESE
• Date : - Choriocentèse: 10 - 14 SA
- Placento : 15 - 35 SA
• Villosités : annexes
• Risque : - F.C. 1 à 1,5 %
- erreur 1 %
• Intérêt : - gène ++++
- chs ++
- enzyme +++
Utérus
Embryon / Foetus
Chorion / Placenta
Pince
AMNIOCENTESE
• Date: 14 - 30 SA
• Cellules Amniotiques• Risque: - F.C. 0,5 %
- erreur 1/10000
• Intérêt: - gène ++
- chs ++++
- enzyme +++
- hormone ++++
aiguille
fœtus
utétus
CORDOCENTESE
• Date: 22 - 38 SA
• Sang Foetal• Risque: - F.C. 1 %
- erreur 1/1000
• Intérêt: - gène +
- chs +++
- enzyme ++
aiguille
Cordonombilical
utérus
fœtus
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• 4°) Prescription– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal– a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
– b) obtention du consentement éclairé
– c) prise en charge de la grossesse en cours
– d) rendu des résultats
– e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Diagnostic d’une “maladie d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic”
• Prise de décision multidisciplinaire – Néonatologiste
– Echographiste
– Obstétricien
– Généticien
• Organisé en Centre de Diagnostic Prénatal
• Références :
– Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN , AP READ, Flammarion Médecine-Sciences (2ème édition française 1998)
– Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale, 2004, MASSON
– Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale,
• http://college-genetique.igh.cnrs.fr/sommaire.html
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