Différenciation des cellules intestinales Cellules absorbantes Cellules sécrétrices stem cell...

Différenciation des cellules intestinales

Cellules absorbantes

Cellules sécrétrices

stem cell

-Math1

cellules de Paneth

cellules en gobelet

cellules endocrines

? ? ngn3

-Math1 +Math1

Matrice extracellulairep27

La voie Notch dans la différenciation intestinale

Signalisation Notch

• Notch: molécule transmembranaire

• 4 récepteurs (notch 1, …) et 5 ligands (delta 1-3 -4 ou jagged 1-2)

• Lorsque notch interagit avec son ligand):Clivage de la partie intracellulaire de notch (Notch IntraCellular Domain), translocation dans le noyau

• Activation de la transcription de gènes

• « interrupteur »

Notch et différenciation

• Notch est impliqué dans le devenir des cellules lors du développement

Chez l’adulte, permet le maintien de l’homeostasie

• Cibles de la signalisation Notch: Math-1, Hes-1, ngn3 qui sont impliqués dans la différenciation

• Surexpression de NICD (partie intracelllulaire de Notch) dans des souris transgéniques entraîne blocage de la différenciation des cellules sécrétrices.

• La signalisation notch est essentielle dans les cryptes pour maintenir l’état indifférencié et prolifératif des cellules progénitrices.

Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine

Fre et al.

Nature (2005) 435; 964-968

introduction

• Les signaux via Notch sont impliqués dans le développement de nombreux types cellulaires (cellules nerveuses, hématopoïétiques,…).

• La modulation de ces signaux peuvent donc affecter la différenciation, la prolifération, l’apoptose des cellules. Notch est un inhibiteur de la différenciation de nombreux types cellulaires

• math-1, ngn3 modulent la différenciation. Ces facteurs sont contrôlés par Notch

• Rôle du signal Notch dans la différenciation et la prolifération des cellules précurseur dans l’intestin

stratégie

• Création de souris transgéniques

• Expression d’une forme constitutivement active de Notch

• Utilisation du promoteur de la villine: la forme constitutivement active de la villine est présente dans toutes les cellules intestinales y compris dans les cellules souches.

Effet sur la différenciation(cellules en gobelet)

• Coloration au bleu cyan

• Cellules en gobelet

WT Notch actif

Effet sur la différenciation(cellules endocrine)

• Marquage de la chromogranine A(Marqueur général des cellules endocrines)

WT Notch actif

conclusion

• L’expression de Notch entraîne la déplétion de cellules en gobelet et des cellules enteroendocrines

Notch et cryptdine

wtNotch

L’expression constitutive de Notch inhibe l’expression de cryptdine et donc la différenciation des cellules de Paneth

Donc…

• L’expression de notch constitutivement active provoque la déplétion des cellules sécrétrices

• À rapprocher du résultat suivant:

la surexpression de NICD (partie intracelllulaire de Notch) dans des souris transgéniques entraîne blocage de la différenciation des cellules sécrétrices.

Notch et facteurs de transcription

wtNotch

L’expression constitutive de Notch entraîne: la surexpression de Hes-1, la sous-expression de Math-1 et de Ngn3

Notch et Hes-1localisation de Hes-1

• Notch augmente la concentration nucléaire de hes-1

wt

notch

Cellules sécrétrices

stem cell

cellules de Paneth

cellules en gobelet

? ? ngn3

+Math1-hes1

Notch

•La surexpression de notch entraîne la déplétion des cellules sécrétrices en modulant l’expression des facteurs de transcription.

Statut d’autres facteurs de transcription regulés par notch

• Hes5, Hey-1…

• Pas d’effet de notch sur ces facteurs

Effet de notch sur la prolifération

• Selon le contexte cellulaire, la signalisation Notch peut influencer la prolifération cellulaire.

• Qu’en est il dans l’intestin?

Ki67

wt Notch

Effet de notch sur la prolifération

Brdu (marquage 30’ sacrifice 24 heures après)

wt Notch

Conclusion

Notch augmente le nombre de cellules qui prolifèrent

(Expansion du compartiment de prolifération)

Pourquoi en Wt y a t’il des cellules Brdu + dans la villosité)?

Notch et morphologie

wt

Notch

Notch diminue le nombre de microvillosités au niveau du domaine apical

WT

Notch

Microvillosités moins uniformes et moins rigidesRessemble a des cellules immatures, faiblement différenciées

conclusions

• La signalisation Notch semble importante dans l’intestin et particulièrement dans les cryptes.

• Notch empêche la différenciation en modulant l’expression de Hes-1, ngn3,…

• Elle maintient l’état indifférencié et prolifératif des cellules des cryptes

• Interrelations avec d’autres voies ( voie wnt) voir TD2

Différenciation des cellules de Paneth

Cellules de Paneth

• Cellules sécrétrices (lysosyme, cryptdines, defensines)

• Cellules localisées dans les cryptes

• Elles achèvent leur différenciation lors de leur migration dans la base des cryptes.

De la cellule souche à la cellule de Paneth

Auto-renouvellementCellule souche

Spécification(secretion)

Tris(rester dans les cryptes)

Différenciation

MORT (autophagie)

Différenciation des cellules sécrétrices

Cellules absorbantes Cellules sécrétrices

stem cell

-Math1Hes1

+Math1Hes1

cellules de Paneth

cellules en gobelet

cellules endocrines

? ? ngn3

Hes-1-deficient mice show precocious differentiation of paneth cells in the small

intestine

Suzuki et al., 2005

Biochem Biophys Res Commun328 (2005) 348-352

introduction

• Hes-1, facteur de transcription (régulé par Notch)

• souris déficientes en Hes-1: différenciation excessive des cellules endocrines (pancréas)

Utilisation de souris KO pour Hes-1: étude du role de Hes-1 sur la différenciation des cellules de Paneth.

Utilisation des souris juste après la naissance. A ce stade, il n’existe pas de cellules de Paneth dans les intestins de souris normales

Expression du lysosyme et des cryptdines dans les intestins murins

• RT-PCR semi quantitative

conclusion

• Lysosyme: augmentation des ARNm dans l’intestin des souris KO Hes1

• Idem pour les cryptidines -1, -4, -5

• Hes1 module négativement l’expression des marqueurs de cellules de Paneth

Expression de marqueurs in situHes1

• Hes-1: pas de Hes-1 dans les cellules Ko pour cette molécule.

Expression de marqueurs in situlysosyme

• Lysosyme positive cells

Villus intervillous

WT 0 0,03

Ko 0,8 0,49

WT Ko Hes1

Expression de marqueurs in situcryptdine-4

• cryptidine positive cells

Villus intervillous

WT 0 0,21

Ko 2,7 0,82

WT Ko Hes1

conclusions

• Cellules difficilement détectables dans les souris normales

• Augmentation de l’expression dans les souris hes1 KO

• Développement précoce de cellules de paneth dans les souris KO

• Hes1 a un effet inhibiteur sur la différenciation des cellules de Paneth

• Présence des cellules de Paneth dans les villosités: Hes1 jouerait un rôle dans la distribution des cellules (tri)

Microscopie electronique

WT

KO

• Souris KO Hes1: présence de cellules contenant de nombreux granules (cellules de Paneth)

Expression de Ki67

• Ki67: présence dans les cellules progénitrices capables de proliférer.

WT KO

Hes1KO: présence de cellules progénitrices dans la villosité.

Hes1 module la localisation des cellules progénitrices

• Les souris déficientes en Hes-1 possédent une différenciation précoce par rapport aux souris normales.

• Hes1 joue un role inhibiteur dans la différenciation des cellules de Paneth

Différenciation des cellules de PanethAutres voies impliquées…

EphB/ephrinB

• ephB(récepteurs)/ephrinB(ligands)• ephB: récepteurs à tyrosine kinase• Leur interactions implique des interactions cellule-cellule:

répulsion des cellules.• Variation d’expression des ephrines dans l’axe’ crypte/villosité

• Mutation d’une ephrinB

Marquage du lysosyme

WT EphB mutée

•EphB/ephrinB contrôle la localisation des cellules de Paneth.

Différenciation des cellules dePaneth

• Autres voies de signalisations impliquées…

Wnt

La voie Wnt

• En absence de voie wnt, la caténine est associée a un complexe: ubiquitinilation et dégradation

l’activation de la voie wnt inhibe le complexe, la caténine est stabilisée, transloquée dans le noyau. Interaction avec les facteurs de transcription TCF: transcription de gènes spécifiques.

Implication de la voie wnt dans l’intestin

• Dans les cellules qui prolifèrent, il y a accumulation de catenine nucléaire et de Tcf4: forte signalisation wnt

• L’activation de la voie wnt entraîne la formation d’adénomes

Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts

• Van Es et al. Nature cell biology (2005) 7. 381-386

• Utilisation d’embryon de souris TCF-

• Analyse de l’expression des marqueurs de cellules de Paneth

Localisation de TCF4 et de caténinedans l’intestin normal

Tcf 4 catenin

conclusion

• Les noyaux des cellules de Paneth contiennent une accumulation de -catenine et de Tcf-4: la voie wnt est sans doute impliquée.

Hybridation in situ

• WT: si les cellules de Paneth ne sont pas morphologiquement observables dans les embryons, certaines cellules expriment des cryptdines

• Ko TCF: pas d’expression de cryptdines

WT WT

conclusion

• Souris normales: expression de cryptdines

• Souris Tcf4-: perte d’expression des cryptdines

• Tcf4 participe à la différenciation des cellules de Paneth

La voie Wnt

• Différents récepteurs Frizzled:

• Frizzled 5 et frizzled 6 sont fortement exprimés dans l’intestin normal.

• fz6: dans toutes les cellules épithéliales sauf les cellules de Paneth

• Et fz5?

Localisation de frizzled 5

embryon adulte

• Frizzled 5 est localisée uniquement dans les cellules de Paneth

• Activation de la voie wnt via activation de Fz5?

• Souris mutantes pour Fz5…

Localisation du lysosyme

Les cellules de Paneth sont distribuées de façon aléatoire le long de l’axe crypte-villosité si Fz5 mutée.

Fz5 participe à la localisation des cellules de Paneth.

WT Ko FZ5

Et l’EphB/ephrineB?Souris FZ5-

• Les cellules de Paneth mal positionnées n’expriment pas ephB…Qui est un gène cible de Tcf4

• Fz5 activerait la voie wnt , qui activerait l’expression de eph B qui permet le positionnement des cellules de Paneth dans les cryptes.

-catenine

Souris Fz5-

• La -catenine nucléaire est absente des cellules de Paneth mal positionnées

• Fz5 activerait la voie wnt , la beta catenine transloque dans le noyau et interagit avec Tcf4. Cela activerait l’expression de eph B qui permet le positionnement des cellules de Paneth dans les cryptes.

Frizzled 5

Expression de Eph BPositionnement Des cellules dePaneth dans les cryptes