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Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines d’enveloppe F et HN, impliquées dans le mécanisme d’entrée cellulaire des virus parainfluenza humains et animaux. Jean-Christophe Le Bayon. VirPath CNRS FRE 3011 Dr Manuel Rosa-Calatrava Pr Bruno Lina. - PowerPoint PPT Presentation
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Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines d’enveloppe F et
HN, impliquées dans le mécanisme d’entrée cellulaire des virus parainfluenza
humains et animaux.
GRAND ORAL E2M2 – 29-30 JUIN 2009UCBL
VIRPATHCNRS FRE 3011
DR MANUEL ROSA-CALATRAVAPR BRUNO LINA
JEAN-CHRISTOPHE LE BAYON
ED 341 – E2M2
2
LES PARAINFLUENZA hPIV2 ET NDV
Famille : Paramyxoviridae Genre : Rubulavirus
Avulavirus
Terr
ier e
t al.
(200
8)
•Maladies respiratoires•Pas d’antiviraux•Virus enveloppé Ø 200nm •ARN négatif, simple brin
L’entrée dans la cellule est possible grâce aux GP F et HN
LA FUSION MEMBRANAIRE
F HN
Viral envelope
Cellular membrane
F1
HN
S
S
F2
C N
NC
Fusion peptide
Cytoplasmic tail
Extracellular domain
Transmembrane region
HR1
HR2
F
Taki
mot
o et
al.
(200
2)
3
4
OBJECTIFS M2
•Caractérisation fonctionnelle de mutants de F de hPIV2 (expression de surface et activité fusogénique)•Mutation observée sur des souches variantes cliniques de hPIV-2 ou transposées d’un variant de PIV-5Méthodes• Analyse bioinformatique de F hPIV2• Clonage des gènes F et HN et mutagénèse• Expression transitoire (cellules A549)• Cytométrie en flux et test de fusion intercellulaire
Rôle de ces mutations dans la fusion et dans l’interaction entre F et HN ?
5
T96A: favorise l’activation par HN
I24P: F “indépendante” de HN
K133E: interaction entre F et HN et augmentation de la fusion
I294A: favorise l’activation par HN
RÉSULTATS DE M2T
ête
Tig
e
I24PI294A
T96A
K133E
2 parties distinctes de la tête de F semblent être impliquées dans l’interaction F-HN
6
→ Caractérisation des interactions fonctionnelles entre F et HN
→ Mieux comprendre le mécanisme d’entrée dans la cellule des virus parainfluenza
→ Développement potentiel de nouvelles molécules anti-virales
OBJECTIFS DE LA THÈSE
PROJET DOCTORAL
7
Interactions fonctionnelles
Évaluation de l’activité
des GP mutantes
Études des interactions
F-HN
Organisation de surface et structure des
GP
Dr Manuel Rosa-Calatrava (CR1 - directeur de thèse)Dr JC Cortay (CR1)Gaëlle Cartet (technicienne)
Pr Bruno Lina (PUPH – directeur du laboratoire)
8
CARACTÉRISATION DE LA FUSION
Méthodes• Expression de GP mutantes (WB, FACS)
• Capacité fusogène des GP (Test de fusion intercellulaire luciférase, lipid-mixing)
• Comportement des mutants dans un contexte pseudo-viral ou viral (VLP et génétique inverse, collaboration avec Dr Dimitri Lavillette – INSERM U758-ENSL)
Résidus impliqués dans le rôle fusogène de F ?
9
ÉTUDE DES INTERACTIONS F/HN
Méthodes• Construction de mutants de déletion des GP
• Interactions entre F et HN (Cross-Linking, coimmunoprécipitation)
→ Domaines de F et HN impliqués dans l’interaction F et HN ?
→ Domaines de F et HN permettant la modulation de l’activité de F ?
10
ORGANISATION DE SURFACE ET STRUCTUREMéthodes• Observation et analyse des VLP et virus (MET,
cryoMET, collaboration avec Dr Daniel Thomas – Université Rennes I)
• Analyse in silico des mutations sur la structure des GP (collaboration avec Pr Gary Taylor, Dr Rupert Russell et Dr Olivier Terrier – Université de St Andrews, UK)
→ Corrélation entre l’organisation de surface, la structure et l’activité fonctionnelle des GP ?
PROJET DOCTORAL
11
Interactions fonctionnelles
Évaluation de l’activité
des GP mutantes
Études des interactions
F-HN
Organisation de surface et structure des
GP
Mécanismes d’entrée de PIV
et développement
d’antiviraux
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PROJET PROFESSIONNEL
Objectif doctoral• Élaborer et gérer un projet de recherche
Autres objectifs• Constitution d’un réseau professionnel• Doctorant conseil
Objectif post-doctoral• R&D laboratoire pharmaceutique• Activité de conseil
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