I. ETUDE MORPHOLOGIQUE

BIOLOGIE CELLULAIRE

Pr TAHIRI JOUTI N.

UNIVERSITE HASSAN II CASABLANCA Faculté de Médecine et de Pharmacie

Année Universitaire 2014-2015

METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

LE NOYAU INTERPHASIQUE

LES CHROMOSOMES

LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES

METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

- La connaissance des cellules dépend des instruments dont nous disposons

- les progrès majeurs de la biologie cellulaire souvent arrivés après l’introduction de nouvelles techniques

Pour comprendre la biologie cellulaire, il est donc nécessaire de connaître ces méthodes

METHODES D’ETUDE MICROSCOPIQUES

- MICROSCOPIE OPTIQUE (MO)

- MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)

- Utilisé en médecine pour analyser des prélèvements tissulaires effectués chez le malade pour poser et/ou compléter un diagnostic donné.

- Il existe plusieurs types de prélèvements:

- cytologique: frottis, aspiration, liquides

- histologique: biopsie, pièce opératoire

en fonction de la nature du prélèvement

Microscopie Optique

Techniques Cytologiques Pour La Microscopie Optique (1)

1. Frottis

Utilisé pour des cellules libres, en

suspension:

- Sang

- Moelle osseuse

- Cellules de la muqueuse

vaginale (frottis vaginal)

1 2

3 4

Lame

Lamelle

Inclinaison de la lamelle (45°) contre la goutte de sang

Mettre la lamelle inclinée en contact de la goutte du sang

Le sang s’étale par capillarité Faire glisser la lamelle

entraînement du sang par capillarité frottis

Cytocentrifugeuse permet: - La concentration cellulaire et - L’étalement en monocouche

2. Cytocentrifugation

Techniques Cytologiques Pour La Microscopie Optique (2)

Technique : - Fixation par dessication

(séchage par agitation lame)

- Coloration panoptique (MGG)

* May Grünwald 3 min, * Eau tamponnée (pH 7) 1 min, * Giemsa 10 min, * Lavage eau courante)

- Séchage et observation au MO.

La Microscopie

Microscopie: - utilise un flux ondulatoire de particules ondulatoires: • non chargés: photons Microscopie photonique ou optique • chargés : électrons Microscopie électronique

- Ce flux traverse un système de lentilles qui permet d’observer une image agrandie.

Résolution : Distance minimale entre deux points voisins qui permet de les observer séparés.

Ou Microscope photonique

- utilise la lumière visible

(photons)

- résolution= 0.2μm - grossissement = 1000

Le Microscope Optique (1)

Le Microscope Optique (2)

Le Microscope Optique est constitué:

- d’une lampe à photons

- de trois lentilles en verre:

- Le Condenseur

- L’ Objectif

- L’ Oculaire

1. Oculaires 2. Glissière de réglage de l'écartement inter-pupillaire 3. Tube binoculaire 4. Potence 5. Tourelle porte-Objectif 6. Vernier de positionnement avec vis de déplacement bidirectionnel du chariot 7. Chariot de fixation et de positionnement de la lame porte-objet 8. Platine porte-objet 9. Vis macrométrique de mise au point 10. Vis micrométrique de mise au point 11. Vis de réglage de la hauteur du Condenseur 12. Pied

diamètre : 15µm

noyau: polylobé (3 ou 4 lobes)

Cytoplasmes : grains

azurophiles = Fines granulations

pourpres = granulations Ires =

grands lysosomes

Techniques Histologiques pour la Microscopie Optique (1)

Biopsie et coupe histologique

Technique utilisée pour les tissus

(foie, peau, muscle………) qui

nécessite la réalisation de coupes

minces avant l'observation au

microscope.

La biopsie:

prélèvement in vivo, d'un fragment

d'organe, dans le but de le

soumettre à un examen

histologique, le prélèvement

n'emportant pas la lésion dans sa

totalité.

La Biopsie

Techniques Histologiques pour la Microscopie Optique (2)

Prélèvement tissulaire

Différentes étapes techniques

Lame colorée interprétable au microscope

Techniques Histologiques

La Fixation (1)

- Définition : conservation du prélèvement dans un état aussi proche que possible de l’ETAT VIVANT

- Mécanismes :

- inhibition de l’autolyse cellulaire

- inhibition de la putréfaction

- ponts intermoléculaires entre les macromolécules

La Fixation (2)

Deux types de fixateurs:

- Fixateurs chimiques sont les plus utilisés ; ce sont des composés qui font précipiter ou coaguler les macromolécules ;

Fixateurs simples: Formol, alcool éthylique, acide acétique,

acide picrique,

Fixateurs composés: mélange de Bouin, mélange de Carnoy, etc.

- Fixateurs physiques les plus utilisés en médecine sont l’azote liquide (-196°C) et la neige carbonique (-60°C).

Principe: Congélation

Fixation formolée

« Circulation »

Inclusion

Microtomie et coloration

Réalisation d’une coupe histologique Après fixation chimique (Formol)

La Circulation (1)

- Nécessité de rigidité du tissu

But : permettre la microtomie et la réalisation de coupes minces

- Fixation durcit insuffisamment

Nécessité d’imprégnation du tissu

par une matière rigide

- milieux d’inclusion : pas d’affinité pour l’eau

Non miscibles à l’eau

- Milieu d’inclusion le plus utilisé : la paraffine (liquide à 56°C)

Il faut donc remplacer l’eau (fixateur en phase

aqueuse) par un solvant de la paraffine

permettre l’imprégnation à la paraffine

La Circulation (2)

Paraffine : pas d’affinité pour l’eau

Non miscible à l’eau

Prélèvement Imprégnation à

la paraffine

Ethanol Toluène

H2O

La Circulation (3)

La paraffine n’est pas miscible à l’eau,

l’inclusion doit donc être précédée par :

- une Déshydratation dans des bains d’alcools

à concentration croissante

suivie

- de bains de toluène.

Cassette pour prélèvement

- en plastique jetables pour tissus sont utilisées pour contenir et identifier les échantillons de tissus lors des procédures de traitement, d'inclusion et de sectionnement.

- Surface inclinée permettant l'identification d'échantillons dans toutes les étapes d'inclusion

La Circulation (4)

Définition : passage du prélèvement dans une série

de liquides intermédiaires

But : permettre l’imprégnation du prélèvement par la

paraffine liquide

L’Inclusion (1)

- Définition : enrobage du prélèvement dans un bloc de paraffine

- But : permettre la manipulation et la fixation du prélèvement au niveau du microtome

Station d’Enrobage

Moule d’Inclusion

L’Inclusion (2)

L’Inclusion (3)

L’Inclusion (4)

Microtomie et Coloration

- confection et étalement de coupes

tissulaires fines - Colorations histochimiques des coupes

lame colorée

Microtomie (1)

Les coupes

- doivent être très fines (3-4

µm) afin que la lumière

(photons) du microscope puisse

les traverser.

- sont réalisées par un

microtome équipé d’une lame

Microtomie (2)

Coupe au microtome

Microtomie (3)

Coupes au microtome

Coupes : (2-4µm)

Etalement des coupes sur la lame

Coupes

Porte-objet Bloc de paraffine + pièce Bloc de paraffine pièce

Lame

coupes

Microtomie et Etalement

Lame

Etalement des coupes (1)

Les coupes obtenues

sont étalées et collées

sur des lames en verre

à l’aide d’eau

gélatineuse ou

albumineuse sur une

platine chauffante

Etalement des coupes (2)

Etalement des coupes sur la lame

Collage et séchage des coupes

La Coloration (1)

Permet d’augmenter le contraste entre les structures cellulaires qui ont des indices de réfraction très voisins et sont donc translucides au MO.

Un colorant est une substance colorée qui transmet sa couleur ; on rencontre des :

- colorants acides : ex. : éosine colore le cytoplasme en rose

- colorants basiques : ex.: hématéine colore le noyau en bleu (autre: bleu de méthylène)

Coloration (2)

Il faut procéder à la réhydratation des coupes par un:

1/ déparaffinage des coupes par un solvant de la paraffine (toluène) ;

2/ passage dans ensuite des bains d’alcools à titre décroissant (100°, 95°, 70°) qui permettent le remplacement progressif de la paraffine par l’eau.

Car

Les colorants sont en phase aqueuse

Coloration (3)

Coloration (4)

Coloration (5)

On distingue: - les colorations de base (Hématéine–Eosine, Trichrome

de Masson) - des colorations spéciales * Imprégnation argentique / fibres de réticuline

(Fibrose)

* Coloration de Perls /fer (Hémosidérose) * Coloration PAS (Périodic Acid Schiff) /glucides

Coloration Hématéine-Eosine ou H&E

Biopsie hépatique: L'hémosidérose est une surcharge anormale des organes (particulièrement du foie) par l'hémosidérine, qui est un pigment insoluble contenant de l'hydroxyde de fer.

Coloration de Perls

Tissu Hépatique: Les capillaires sinusoïdes sont entourés par un réseau de fibres réticuliniques, soulignées ici par une imprégnation argentique Coloration au nitrate d’argent

Montage (1)

La coupe tissulaire se retrouve « protégée »

entre lame et lamelle, collées l’une à l’autre à

l’aide d’un liquide/résine de montage = colle

Eukitt, Néo-Entellan

Mais ces colles ne sont pas miscibles à l’eau

Montage (2)

Après coloration:

* Déshydratation dans des bains croissants

d’alcool suivie

* par un passage dans des bains de toluène

Montage (3)

Periodic Acid Schiff: PAS

Trichrome de Masson

Coloration des structures contenant une haute proportion de glucides tels que le glycogène, les glycoprotéines et les protéoglycanes Utilisée pour la détection de certains troubles du stockage de glycogène dans les muscles striés

L'hémalun colore le noyau et les substances basophiles eu bleu-violet; le ponceau-fuchsine colore le cytoplasme en rouge-rosé et le vert lumière ou le bleu d'aniline colore les fibres conjonctives respectivement en vert ou bleu.

L’Examen Extemporané (1)

L'examen extemporané - consiste à réaliser une coupe histologique d’un prélèvement réalisé durant une intervention afin d'orienter au mieux l'acte chirurgical. - est indiqué pour : * un choix immédiat entre deux gestes thérapeutiques

chirurgicaux * Appréciation des limites ou de l'extension d'une

tumeur lors de son exérèse

Cet examen doit être réalisé dans des délais

réduits (moins d'une demi-heure) alors que la

technique histopathologique standard est de

l'ordre de 24 heures après fixation.

L’Examen Extemporané (2)

Technique

* Fixation par congélation permet:

– La fixation

– Le durcissement de l’échantillon tissulaire.

* Ceci permet d’éviter l’étape d’inclusion.

L’Examen Extemporané (3)

Les Microscopes Optiques Spéciaux (MOS)

Les MOS les plus utilisés en médecine sont

le microscope à fluorescence

le microscope à contraste de phase

Microscope à fluorescence (1)

Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications

qui portent sur la source lumineuse: UV au lieu de Visible

- Microscope à fluorescence: microscope classique avec une

lampe à vapeur de mercure sous pression.

- Certaines substances: Fluorochromes ont la propriété

d’émettre une lumière visible lorsqu’elles reçoivent un flux

de rayons ultra-violets.

- Le tissu peut émettre directement cette lumière ou bien

après avoir été imprégné de substances fluorochromes.

Microscope à fluorescence (2)

- Fluorescein IsoThioCyanate: FITC fluorescence verte, - Tetramethyl Rhodamine IsoThioCyanate: TRITC , fluorescence rouge - Colorant fluorochrome DAPI = Di Aminido Phenyl lndol se fixe spécifiquement sur l'ADN

Microscope à fluorescence (3)

1- il faut éclairer la coupe histologique pour exciter les molécules dont on veut obtenir la fluorescence.

2- Une molécule fluorescente ne pourra être excitée que par des radiations qu'elle peut absorber.

3- Après avoir absorbé la lumière d'excitation, les molécules fluorescentes se désexcitent en émettant des photons.

Microscope à fluorescence (4)

Un système d'illumination sur le tube, sous le bloc porte oculaire. Il comprend: - une lampe à vapeur de mercure entouré d'un miroir collecteur et d'une lentille collectrice pour récupérer un maximum la lumière d'excitation. - la lumière rencontre le filtre d'excitation. - un intervalle spectral étroit arrive sur le

miroir dichroïque qui le réfléchit vers le bas, sur la préparation.

- La lumière d'excitation éclaire la préparation par l'intermédiaire de l'objectif.

Microscope à fluorescence (5)

- Une partie des rayons diffusés et émis par fluorescence rentrent dans l'objectif et remontent dans le tube où ils rencontrent le miroir dichroïque qui laisse passer la lumière sous cette incidence.

- Le filtre d'arrêt bloque enfin la

lumière diffusée et seule la lumière émise par fluorescence remonte pour former l'image.

Microscope à fluorescence (6)

FILTRE D’EXCITATION

FILTRE D’ARRET

Résolution = 0.1μm

La protéine cellulaire à mettre en évidence est révélée grâce à un anticorps - spécifique à cette protéine - couplé à un fluorochrome: fluorescéine, rhodamine ………

- La réaction antigène-anticorps sur coupe histologique est révélée par l’émission de la fluorescence

- La lecture de la lame se fait au microscope à fluorescence

Techniques d’Immunofluorescence (1)

Techniques d’Immunofluorescence (1)

- Couplage direct de l’Ac à un fluorochrome : méthode directe

- Application de l’Ac couplé au fluorochrome sur coupe histologique susceptible de contenir l’Ag spécifique

- Lavage éliminant les Ac fluorescents non fixés par l’Ag spécifique

- Observation au microscope à fluorescence

du complexe Ac-Ag rendu fluorescent

Techniques d’Immunofluorescence (1)

Estomac de souris Noyaux colorés au DAPI

Neurones

Neurones du cervelet

Le Microscope à Contraste de Phase (1)

- La diffraction est le comportement des ondes lumineuses lorsqu’elles rencontrent un objet

- l’onde est diffusée par les points de l'objet.

- La diffraction se manifeste par le fait qu'après la rencontre d’un objet, la densité de l'onde lumineuse n’est pas conservée

- La diffraction est le résultat de l’interférence des ondes diffusées par chaque point.

Le Microscope à Contraste de Phase (2)

- Le microscope à contraste de phase possède un système optique conçu pour exploiter les propriétés de diffraction des cellules vivantes.

- La lumière traversant les parties relativement denses ou épaisses de la cellule est retardée par rapport à celle qui traverse une région voisine plus mince.

Création des effets d’interférences produits par la recombinaison de ces

deux séries d’ondes

Images fortement contrastées

Le Microscope à Contraste de Phase (2)

Quand les ondes lumineuses traversent

un objet non coloré:

- leur amplitude est très peu changée

- leur phase est modifiée, ce qui crée des interférences.

Les effets de ces interférences sont

exploités pour créer une image

Le MCP est équipé d’objectifs spéciaux qui transforme les différences d'amplitude en différences de phase.

Le Microscope à Contraste de Phase (3)

La lame de phase a deux effets sur la composante de réflexion : elle atténue considérablement son intensité de manière à la ramener dans l'ordre de grandeur de l'intensité de la diffusion Un dispositif imageur fait converger les deux ondes au point image P'. L'intensité du point image est le résultat de l'interférence des deux ondes. - deux ondes sont en phase le

point est brillant. - deux ondes sont en opposition

de phase le point est sombre.

Les défauts responsables de la diffusion par diffraction apparaissent ainsi par contraste.

Le Microscope à Contraste de Phase (4)

Kératinocyte de la muqueuse buccale observé au microscope à lumière transmise. Seul le noyau est clairement observable

Kératinocyte de la muqueuse buccale observé au microscope à contraste de phase . Le noyau, ainsi que de nombreux constituants cytoplasmiques, probablement principalement des mitochondries, sont observables.

Le Microscope à Contraste de Phase (5)

Cellules épithéliales de Hamster en culture observées au microscope à contraste de phase

principal intérêt:

Augmenter l’agrandissement

Permettre l’observation

de l’ultrastructure

(organites) et des

reliefs cellulaires.

Résolution = 1 à 2 nm

Microscopie Electronique (ME)

Au lieu d’être éclairé, l’objet

est bombardé par un faisceau

d’électrons.

L’image mettra en évidence

les structures plus ou moins

opaques aux électrons.

Le condenseur, l’objectif et l’oculaire sont des bandes magnétiques

Microscope Electronique à Transmission (1)

Microscope Electronique à Transmission (2)

Un système de lentilles magnétiques permet de dévier ou focaliser le rayon d'électrons sur un échantillon "extrêmement fin".

L'image ou cliché de diffraction obtenue peut être vue sur un écran phosphorescent, enregistrée sur un film photographique ou bien détectée par un capteur CCD.

Capteur CCD

- Le capteur CCD est une mémoire analogique qui accumule des charges proportionnellement à son temps d’exposition.

- Les trois lettres CCD signifie Charged Coupled Device

en français DTC: “dispositif à transfert de charges” qui produit un signal vidéo à partir des charges accumulées dans les éléments du capteur.

Grille porte-objet

Tube sous vide

MET

MET

L’objet doit être préalablement:

* coupé en tranches ultrafines

* imprégné de sels de métaux lourds qui vont:

- se fixer différentiellement sur les différentes structures intracellulaires

- les rendre plus ou moins opaques aux électrons.

Préparations biologiques pour le MET : Coupe ultramince (1)

Fixation : double fixation au glutaraldéhyde puis au tétroxyde d’osmium Le glutaraldéhyde pontages covalents entre molécules protéiques Le tétroxyde d’osmium stabilisation des doubles couches lipidiques et des protéines mal ou non fixées par le glutaraldéhyde. Inclusion : fait intervenir des résines de synthèse, très dures et transparentes aux électrons (résines Epoxy, Araldite).

Préparations biologiques pour le MET : Coupe ultramince (2)

Ultramicrotomie : coupes ultraminces (50-80 nm) réalisées par l’ultramicrotome équipé d’un couteau en verre ou en diamant. Coupes recueillies sur des grilles métalliques.

Contrastage : Par des sels de métaux lourds (osmium, plomb, uranium) qui sont denses aux électrons.

Les structures cellulaires apparaissent plus ou moins denses (noir et blanc) sur un fond clair

Préparations biologiques pour le MET : Coupe ultramince (3)

Pour augmenter le contraste des constituants cellulaires, les coupes ultraminces sont trempées dans une solution de sels de métaux lourds (acétate d’uranyl et citrate de plomb)

Aspect Ultrastructural, MET

REG

Noyau

Aspect Ultrastructural, MET

Mitochondrie

Citernes de REG

Rappel:

En microscopie électronique à Transmission:

- l’objet ne peut être visible que si, après fixation, il est imprégné de substances contenant des atomes de métaux lourds opaques aux électrons.

- La fixation et les réactions ultérieures peuvent modifier notablement la structure de l'objet biologique.

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (1)

Le contraste négatif permet

d'assombrir le fond sans

colorer l'objet lui-même et

donc de le rendre visible sans

le modifier, par simple

contraste.

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (2)

Nucléocapside virus de la rougeole

Technique :

- Suspension dans une

solution opaque aux e- :

Acide Phosphotungstique

- dépôt d’une goutte de

cette suspension sur

une grille métallique

- séchage

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (3)

Immunoglobine G: IgG

Technique :

la substance opaque aux

e- se dépose autour de la

particule qui apparaîtra

claire sur un fond sombre

contraste inverse ou négatif

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (4)

Papillomavirus Humain

a) Particules virales, isolées d'une verrue, observées après coloration négative à l'acide phosphotungstique.

b) Virions observés dans le noyau d'un kératinocyte des couches superficielles de l'épithélium malpighien. Coloration par l'acétate d'uranyl et le citrate de plomb.

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (5)

- Permet l’observation des reliefs ou images cellulaires en 3 dimensions (3D).

Il est constitué :

-d’un microscope à faisceau électronique

- d’un détecteur d’e-

- d’un convertisseur d’ e-

- d’un moniteur (écran télé)

Microscope Electronique à Balayage (1)

- Le microscope

électronique à balayage

utilise un faisceau très

fin qui balaie point par

point la surface de

l'échantillon.

Microscope Electronique à Balayage (2)

Matériel biologique : cellules, bactéries et virus.

Ces structures sont: - fixées - déshydratées - recouvertes d’une mince

couche de métal (Or-Palladium, Platine) vaporisée sous vide.

Préparations biologiques pour le MEB

Microscope Electronique à Balayage (3)

- la surface métallisée de l’échantillon subit un balayage régulier par un faisceau d’électrons

- les surfaces en reliefs entraînent l’émission

d’électrons secondaires (points lumineux)

- Les dépressions sont sans émission d’électrons (points sombres)

- Les électrons émis sont collectés par un détecteur d’électrons puis convertis en image par un convertisseur d’électrons. L’image finale apparaît en 3 dimensions sur un écran de télévision.

Préparations biologiques pour le MEB

Microscope Electronique à Balayage (4)

Microscope Electronique à Balayage (5)

Globules Rouges

Chromosomes X et Y

METHODES D’ETUDE

- BIOCHIMIQUE

- DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

METHODES D’ETUDE BIOCHIMIQUE

• Sépare en fractions les différents organites de la cellule (noyau, mitochondries, etc.) en vue d’une étude biochimique. • Se déroule en quatre étapes :

- Dissociation - Isolement - Eclatement - Fractionnement cellulaire ou

subcellulaire

Fractionnement cellulaire par ultracentrifugation

- Consiste à dissocier les cellules d’un même tissu

- réalisée mécaniquement ou chimiquement.

Dissociation mécanique : dans un milieu isotonique à 0°C avec un broyeur cellulaire ou Potter.

Dissociation enzymatique : par des enzymes protéolytiques (trypsine ou collagénase) et des Chélateurs de calcium (EDTA : Ethylène Diamine Tétracétique Acide).

Broyeur de Potter

La Dissociation cellulaire

Sépare les différentes catégories cellulaires résultant de la dissociation cellulaire.

• Fait intervenir des anticorps fluorescents spécifiques à chaque catégorie cellulaire

• L’isolement des cellules couplées à l’anticorps marqué est réalisé par un appareil spécial pour le tri cellulaire, le cytofluorimètre ou cytomètre en flux.

Cytométrie en Flux: CMF

L’Isolement / Tri cellulaire (1)

Principe et but de la CMF:

Mesure (-métrie) des propriétés optiques de cellules (cyto-)

transportées par un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source

d’excitation lumineuse (souvent un laser)

Puis Tri Cellulaire

L’Isolement / Tri cellulaire (2)

Permet de recueillir le contenu de la cellule par l’une des techniques suivantes :

- Broyage mécanique au Potter

- Choc osmotique en milieu hypotonique (0,5% NaCl)

- Vibration ultrasonique

- Passage des cellules à travers un petit orifice.

Au terme de cette étape, un lysat (homogénat) avec les différents organites mélangés est obtenu.

L’Eclatement cellulaire

Les organites cellulaires sont séparés en plusieurs fractions contenant chacune un seul type d’organites

La séparation se base sur la forme, la taille et la densité des organites.

Deux procédés différents sont utilisés :

- ultracentrifugation différentielle

- ultracentrifugation en gradient de densité

Le Fractionnement cellulaire

Ultracentrifugation différentielle

- C’est une succession de centrifugations de plus en plus rapides et de plus en plus prolongées.

- On retire le culot à chaque étape et on recentrifuge le surnageant.

- L’ordre de sédimentation des organites est :

1. noyaux,

2. mitochondries,

3. lysosomes,

4. microsomes,

5. ribosomes,

6. ARN et cytosol

Ultracentrifugation en gradient de densité (1)

Ultracentrifugation :

- dans une solution (saccharose, chlorure de césium) présentant un gradient de concentration décroissant du bas vers le haut

- dans un tube à essai avec des graduations de concentrations réalisées artificiellement.

Les organites mélangés sont - introduits dans le tube gradué - centrifugés une seule fois en utilisant le temps et la vitesse les plus élevés.

chaque type d’organites se répartit - sous forme d’une bande séparée - dans la zone de gradient de densité voisine ou égale

à la sienne.

Ultracentrifugation en gradient de densité (2)

Coefficient de sédimentation

- unité de vitesse de sédimentation (VS) dans un champs centrifuge

- est exprimée en Svedberg (S) - propre à chaque organite cellulaire. Ex : Ribosome procaryote : 70 S ; Ribosome eucaryote : 80 S.

METHODES D’ETUDE DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

Technique permettant de maintenir des cellules vivantes hors de l’organisme (in vivo) dans des récipients de culture (in vitro) contenant des milieux nutritifs (pour la prolifération cellulaire) tout en respectant les conditions adéquates de stérilité, de température et de pH.

Kératinocytes en culture

Culture cellulaire (1)

Technique

*Prélèvement d’un fragment tissulaire vivant

*Digestion par une enzyme dissociant les cellules ; ex : trypsine, collagénase

*Numération cellulaire

*Addition d’un milieu de culture (106cellules/10ml)

*Repiquage des cellules

Culture cellulaire (2)

Milieux de culture

- liquides ou solides (gel)

- composition chimique de base : eau, sels minéraux, vitamines, acides aminés ou protéines, glucose, antibiotiques, sérum de veau fœtal (SVF) et facteurs de croissance.

Ex. de milieu de culture : MEM , RPMI 1640

Facteur de croissance

- petit peptide sécrété par un tissu pour stimuler la croissance, la multiplication et la différenciation de ses cellules et ou des cellules d’autres tissus

- non véhiculé par le sang et possède un récepteur spécifique au niveau des cellules de ce tissu ; ex. : EGF, NGF (Epidermal Growth Factor, Nerve Growth Factor).

Récipients de culture

- sont en verre ou en plastique (mono-usage).

- Exemples: les flacons, les boîtes de Pétri, les tubes à essai, les plaques de puits.

Microscope inversé

- La lumière arrive sur l’échantillon par le haut: la source de lumière est placée au-dessus de l’échantillon

- L’observation se fait par le dessus - les objectifs en dessous.

Cette configuration non-standard d’observation peut être adaptée à toutes les méthodes de microscopie (fluorescence, contraste de phase…).

Utilisation du microscope inversé

Ce microscope est utilisé pour l’observation de cellules en culture in vitro, mais peut l’être en général pour observer des objets épais ou situés sur le fond de boîtes de culture.

Conditions de culture

• Stérilité : maximum en utilisant une hotte à flux laminaire, des lampes à UV germicides.

• pH : 7 à 7, 4

•Température : + 37°C (étuve)

• Ambiance : 95 % d’air et 5 % de CO2 (étuve) qui permet le maintien du pH.

Comportement des cellules en culture (1)

Les cellules normales se divisent un certain nombre de fois puis meurent (50 à 100 fois pour les cellules de la peau) alors que les cellules cancéreuses sont immortelles in vitro; elles constituent des lignées cellulaires spéciales.

Ex de lignées cellulaires communes et immortelles in vitro : - souche Héla : cellules épithéliales du col de

l’utérus d’Henriette Lacks décédée en 1953. - souche KB : carcinome oral humain - souche MRC-5 : poumon fœtus humain.

Comportement des cellules en culture (2)

L’Inhibition de Contact : propriété des cellules normales in vitro et qui se manifeste par un arrêt de leurs divisions lorsqu’elles confluent (se touchent).

Marquage par les isotopes radioactifs (IR) Les IR sont des corps naturels qui - diffèrent légèrement par la masse de leurs noyaux - ont le même nombre d’électrons périphériques - sont instables - subissent des désintégrations et des émissions de particules

énergétiques ou radiations. Les IR sont des traceurs du métabolisme cellulaire. Ils permettent de suivre la synthèse d’une molécule donnée dans la cellule.

Permet la détection d’une molécule cellulaire précise après marquage soit par des isotopes radioactifs soit par des anticorps.

Marquage cellulaire (1)

Détection des IR

Compteur Geiger : les radiations des IR ionisent un gaz qui se trouve dans l’appareil. La détection se fait alors par des bip Sonores. Compteur à scintillation ou scintigraphe - permet la détection visuelle des radiations des IR qui ionisent un liquide scintillant dans l’appareil

- Il y a émission de petits éclairs lumineux.

- Autoradiographie ou autohistoradiographie : permet de détecter et de localiser les radiations des IR sur des coupes histologiques.

Marquage cellulaire (2)

Technique

- Injection de l’IR à l’animal ou addition aux cellules en culture

- Prélèvement à des intervalles variés (t0, t1, t2, ...) de cellules ayant intégrées les IR

- Fixation et préparation des cellules pour le MO ou pour le ME

- Application d’une émulsion photographique sur les coupes

- Maintien des coupes à l’obscurité pendant une durée (des jours ou des semaines) nécessaire à la désintégration des IR Observation des coupes au - MO ou

- ME (dépôts sombres sur les zones de la coupe présentant des IR).

Marquage cellulaire (3)

Explication : - L’émulsion photographique est composée de bromure d’argent (Br-, Ag+). - Les radiations émises par les IR réduisent les grains de bromure d’argent invisibles en grains d’argent visibles au niveau de la zone cellulaire d’où elles sont issues.

Marquage cellulaire (4)