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Immunologie : principes et applicationsaux maladies neurologiques
Dr T. VINCENTLaboratoire d’Immunologie
Hôpital St ELOI - CHU Montpellier
MAI = rupture de tolérance
* Tolérance centrale (« élimination physique »)
délétion des clones auto-réactifs
* Tolérance périphérique (« élimination fonctionnelle »)
contrôle des clones auto-réactifs persistants
LT: thymusLB: moelle osseuse
anergieLymph Treg...
MAI = RI contre Ag du soi
MAI à médiation humorale: myasthénie, S. de Guillain Barré, Devic
MAI à médiation cellulaire: SEP
Réponse humorale: lymphocytes B / plasmocytes / auto-Ac
Réponse cellulaire: lymphocytes T effecteurs TH1 IFN
TH17 IL17
“quelles sont les maladies neurologiquespériphériques ou centrales
qui ont un immuno-marqueur qui sert au diagnostic et au suivi des patients”
Qu’est ce qu’un “bon” bio-marqueur ??Qu’est ce qu’un “bon” bio-marqueur ??
- sensible: capacité à dépister tous les patients
- spécifique: capacité à ne détecter que les patients
- précoce
- corrélé à la clinique: poussées - rémissions
Existe-t-il ??Existe-t-il ??
Où et comment le chercher ??Où et comment le chercher ??
- accessible
- facile à identifier
Quel paramètre cibler ??Quel paramètre cibler ??
- Tolérance centrale: évaluation de la fonction thymique
phénotypage lymphocytaire: LT naïfs (CD45RA+)
TREC (T cell Receptor Excision Circles) / PCR
- Tolérance périphérique: Treg CD4+CD25+Foxp3+
analyse quantitative: phénotypage lymphocytaire
analyse fonctionnelle: culture cellulaire
Quel paramètre cibler ??Quel paramètre cibler ??
- Réponse cellulaire: clones de LT auto-réactifs
phénotypage lymphocytaire: activation T (HLA-DR) ELISPOT tétramères dosage des cytokines effectrices (IFN, IL17...)
- Réponse humorale: Auto-Ac
Présents dans le sérum = accessibles techniques d’identification “simples”
souvent témoins de la maladie (onconeuronaux) parfois pathogènes (SGB, Devic)
Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??
dépistage
Immunofluorescence indirecte (IFI)Immunofluorescence indirecte (IFI)
avantages inconvénients
- Sensible
- Dépistage simultané deplusieurs Ac
- peu onéreux
- peu spécifique
- lecture parfois délicate
- opérateur dépendant
A
B
C
WM
GL
ML
MLWM
MLWM
NMO-IgG
Anti-endothelium
Marquage atypiquede la BHE
Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??
Identification +/- quantification
ELISAELISA
avantages inconvénients
- Quantitatif
- Sensible
- +/- spécifique
- Spécificité parfois moyenneEx: anti-gangliosides
- Où fixer le cut-off ?? Ex: anti-MAG
Exemple des neuropathies périphériquesAvec Ac anti-myéline / MAG
dépistage indentification
- Sensibilité: 73%- Spécifique: 96%
ELISA anti-MAGELISA anti-MAGIFI sur nerf sciatiqueIFI sur nerf sciatique
Cut-off à 1000 BTU- sensibilité: 95% - spécifique: 87%
Cut-off à 10 000 BTU- sensibilité: 62%- spécifique: 100%
Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??
Identification +/- quantification
Western blotWestern blot
avantages
- identifications multiples
inconvénients
- perte des épitopes conformationnels- lecture parfois délicate
40 kDa
30 kDa
50 kDa
60 kDa
WB EuroimmunExtrait de cervelet de primate
Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??
Identification +/- quantification
immunodotimmunodot
avantages
- conformation respectée- Sensible- Spécifique
inconvénients
- au mieux semi-quantitatif
Anti-GT1a ++Anti-GQ1b +++
IgG
IgM
Quelle(s) technique(s) utiliser ??Quelle(s) technique(s) utiliser ??
Identification +/- quantification
Test cellulaire (CBA)Test cellulaire (CBA)
avantages
- conformation native- Sensible- Spécifique- +/- quantitatif
inconvénients
- lourdeur (culture)- non standardisable
Lignée AQP4+
Lignée AQP4-
Bio-marqueurs:
beaucoup de candidatsmais peu d’élus...
Department of Neurology, University of Heidelberg, Germany
Journal of Neuroinflammation 2010, 7:21
= Anti-ARHGAP26
- Caucasienne
- Pas d’antécédents particuliers
- “rhume” bénin 2 semaines auparavant
- ataxie cérébelleuse inflammatoire sub-aiguë Ataxie + dysarthrie + diplopie
Patiente de 33 ans
IFI sur coupe de cervelet de souris
Marquage intense de la couche moléculaire + cell de Purkinje+ substance blanche
Sérum 1/ 6000 – LCR 1/2000
IFI sur coupe de cervelet de singe + LCR
Sans pré-adsorption pré-adsorption / IP3R1
pré-adsorption / ARHGAP26
Ataxie Cérébelleuse Auto-immune (ACA)avec présence d’IgG1 anti-ARHGAP26
Canadian Pediatric Demyelinating Study
IFI sur coupe de cervelet de singe (IL) + sérum
Cellules de Purkinje + couche moléculaire
IFI sur coupe de cervelet de singe (IL) + sérum
Cellule de Purkinje et ses dendrites
- Caucasien
- Pas d’antécédents particuliers
- clinique de type « ADEM-like »
- monophasique: asymptomatique depuis 2 ans
Garçon de 4 ans
Anti-aquaporine-4
Le bio-marqueurs parfait ??
NMO-IgGNMO-IgG
Sensitivity :Sensitivity : 73% 73%
Specificity :Specificity : 91% 91%
Absent in MS
Early diagnosis specific treatment
WM
GL
ML
IIF on primate cerebellum slides (1/100)IIF on primate cerebellum slides (1/100)(the Binding Site)(the Binding Site)
Lig
né
e A
QP
4-L
ign
ée
AQ
P4+
Test cellulaireTest cellulaireAquaporine-4Aquaporine-4
SensibleAQP4 spécifiquequantitatif
100 101 102 103 104
EGFP
MFI228.3
293-EGFP 293-AQP4/EGFP
100 101 102 103 104
EGFP
MFI1.73
AP
C
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
100 101 102 103 104
EGFP
MFI1.70
100 101 102 103 104
EGFP
MFI69.4
AP
C
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
100 101 102 103 104
EGFP
MFI1.68
100 101 102 103 104
EGFP
MFI4.7
AP
C
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
1/8001/3200
1/51200
Corrélation Corrélation
concentration sérique des anti-AQP4concentration sérique des anti-AQP4 / /
Activité de la maladieActivité de la maladie
Jarius S et al. Antibody to aquaporin-4 in the long-term course of
neuromyelitis optica. Brain 2008;131:3072-80.
Takahashi T et al. Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO: a study on antibody titre. Brain
2007;130:1235-43.
Maladie de DevicMaladie de Devic
Au diagnostic: - screening IFI
- identification / quantification rAQP4
Pour le suivi: Test quantitatif rAQP4
Waters P. et al., The International MS Journal 2008; 15: 99-105, p 4
Mc Keon et al. Arch Neurol. 2009 Sep;66(9):1134-8.
IFI-m RIPA CBA-IF CBA-FACS
Se (%) 47 33 39 30
Sp (%) 95 97 100 97
Antiaquaporin 4 antibodies detection by different techniques in neuromyelitis optica patients.
Fazio R. et al. Mult Scler. 2009 Oct; 15 (10) p1553-63
Titres NMO-IgG Mild # Severe
Pro
pidi
um io
dide
pos
itiv
e ce
lls
%
Corrélation Corrélation activité cytolytique / sévéritéactivité cytolytique / sévérité
Hinson SR, et al. Prediction of neuromyelitis optica attack severity by quantitation of
complement-mediated injury to aquaporin-4-expressing cells. Arch Neurol 2009;66:1164-7.
Corrélation Corrélation activité cytolytique / concentration sériqueactivité cytolytique / concentration sérique
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 100 200 300 400 500AQP4 (AU/ml)
Anti-AQP4 (UA/ml)
Ac
tivi
té c
yto
lyti
qu
e (U
A/m
l)
Absence de corrélation Absence de corrélation concentration sérique / évolutionconcentration sérique / évolution
An
ti-A
QP
4 (U
A/m
l)
rémission rechute
NMONMO
Au diagnostic: - screening IFI Sensibilité # 50-60 % spécificité > 90%
- identification / quantification rAQP4
Pour le suivi: rAQP4 concentration sérique ?? activité cytolytique ??
Akman-Demir G. et al. J Neurol. 2010 Oct 17. [Epub ahead of print]
Pronostic: NMO-IgG+ EDSS = 5.1 2.2 (n=21)NMO-IgG- EDSS = 3.5 1.7 (n=14)
NMO-IgGNMO-IgG
Recurrent optic neuritis:Recurrent optic neuritis: 10% 10%
LETM:LETM: 25% 25%
Risk of relapses
Risk of NMO
« NMO-related« NMO-relatedDiseases »Diseases »
Valeur ajoutée d’unexamen biologique
De la bonne interprétation d’un résultat biologiqueDe la bonne interprétation d’un résultat biologique
D’après H.Delacour et al. Immuno-analyse et biologie spécialisée (2009) 24, 92-99
Probabilbité pré-test (%) Probabilbité post-test (%)
forte
faible
Très forte
moyenne
Très faible
(+)
(-)
(+)
(-)
interventionintervention
abstentionabstention
indécisionindécision
Seuil d’affirmationDe la maladie
Seuil d’exclusionDe la maladie
Préscription de Préscription de l’analyse biologiquel’analyse biologique
Communicating diagnostic accuracy
Question 1
• Sensitivity: 95%
• Specificity: 90%
• Pre-test probability: 2.5%
• Post-test probability ???
• 10%
• 20%
• 50%
• 80%
• 90%
Communicating diagnostic accuracy
Question 1
• Sensitivity: 95%
• Specificity: 90%
• Pre-test probability: 2.5%
• Post-test probability ???
• 10%
• 20%
• 50%
• 80%
• 90%
Communicating diagnostic accuracy
Question 1
• Sensitivity: 95%
• Specificity: 90%
• Pre-test probability: 2.5%
• Post-test probability ???
• 10%• 20% (9% of respondents)
• 50%
• 80%
• 90%
Tendance à surestimer la probabilité d’une maladie après un résultat biologique positif
Rapports de vraisemblance“likelihood ratios”
RV+ : probabilité d’avoir un test + si on est malade /probabilité d’avoir un test + si on n’est pas malade
= Se / (1 – Sp)
RV- : probabilité d’avoir un test - si on est malade /probabilité d’avoir un test - si on n’est pas malade
= (1 – Se) / Sp
Rapports de vraisemblance“likelihood ratios”
RV+ RV-Apport
diagnostique
>10
5-10
2-5
1-2
1
<0.1
0.1-0.2
0.2-0.5
0.5-1
1
Très fort
Fort
Modéré
Faible
Nul
Probabilité pré-test x RV = probabilité post-test
Nomogramme de FaganNomogramme de FaganH.Delacour et al. Immuno-analyse et biologie spécialisée (2009) 24, 92-99
Probabilbité pré-test (%) Probabilbité post-test (%)Rapport de
vraissemblance
99
990.1
0.1
RV-
RV+
Probabilité pré-test x RV = probabilité post-test
anti-GM1+, anti-MAG 1000-2000 U...
problème de certains positifs faibles
Mr Thierry L. (53 ans)
- HIV + - HCV + (1995)- infactus du myocarde (02/2011)- Kc du grêle + métastases hépatiques (2011)- diabète, maladie bipolaire...
- Juin 2011: syndrôme cérébelleux + déficit moteur membre inf GTDM et IRM # normaux
Recherche d’Ac onconeuronaux
IFI sur lame de cervelet de primate (1/100)IFI sur lame de cervelet de primate (1/100)
y = 0,0011x2 + 0,7621x + 3,1273
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 100 200 300 400 500 600 700
delta MFI
UA
/ml
100 101 102 103 104
EGFP
293.027
293-AQP4/GFP
EGFP100 101 102 103 104
EGFP
293.015
293-GFP
EGFP
An
ti-I
gG
-AP
C
Anti-AQP4 = 368 UA / ml
NMO paranéoplasique ?
NMO post-infectieuse ??
Faux positif ???
RV+ = sensibilité / (1 - spécificité)
= 49
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
Anti-AQP4
Probabilité pré-test
pro
bab
ilit
é p
ost-
test
CONCLUSIONS
* la vérité d’un jour n’est pas forcément celle du lendemain...* la vérité d’un jour n’est pas forcément celle du lendemain...
* toujours considérer le contexte clinique * toujours considérer le contexte clinique probabilité pré-test probabilité pré-test
Prescription ciblée
* attention de ne pas sur-estimer la valeur d’un résultat positif* attention de ne pas sur-estimer la valeur d’un résultat positif
Probabilité post-test = RV x probabilité pré-test
Quelle technique / sensibilité / spécificité / RV
* Attention aux performances diagnostique d’un test biologique* Attention aux performances diagnostique d’un test biologique
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