La recherche dans la polychondrite atrophiantedes puces à protéines -19 patients atteints de PCA...

La recherche dans la polychondrite

atrophianteatrophiante

Dr Makoto MiyaraDépartement d'Immunologie: Immunochimie et AutoimmunitéCIMI INSERM UMR1135GH Pitié-Salpêtrière

Samedi 22 avril 2017

Biomarqueurs pour le diagnostic de la

polychondrite atrophiante

A. Anticorps

La recherche dans la polychondrite atrophiante

B. Cellules circulantes

A. Anticorps

Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante

Anticorps

• ANCA : anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles

Ann Rheum Dis. 1993 May;52(5):384-5.

Antineutrophil cytoplasmic antibodies in polychondritis.

Papo T, Piette JC, Le Thi Huong Du, Godeau P, Meyer O, Kahn MF, Bourgeois P.

Comment in

Relapsing polychondritis as a secondary phenomenon of primary systemic

vasculitis. [Ann Rheum Dis. 1993]vasculitis. [Ann Rheum Dis. 1993]

PMID: 8323388 [PubMed - indexed for MEDLINE] PMCID: PMC1005055 Free PMC

Article

Anticorps

• ANCA : anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles

• Vascularites:

• Granulomatose avec

polyangéite (de

Wegener)

• Polyangéite

microscopiquemicroscopique

Anticorps

• Manque de sensibilité

• Manque de spécificité

� Nécessité de nouveaux biomarqueurs

Anticorps

• Manque de sensibilité

• Manque de spécificité

� Nécessité de nouveaux biomarqueurs :thèse Chloé Couzin

Auto-anticorps

• HuProt

• Cambridge Protein

Array (Mike taussig)

• 20000 autoantigens

• S.Cerviciae

• Scanner à fluorescence

Puces à protéines

• Fiable

• Contrôle

• Myosites

• Cirrhose biliaire

primitive

• Lupus

� APPLICATIONS:

� Maladies auto-

immunes

� CANCERS

Anti-Streptavidine-AFAnti-humain IgG

Fonctionnement des puces

Anticorps

Anti-GSTAuto-Ac du sérum

Protéines

Hu Prot v2

Séries de manipulations

-Echantillons pour le contrôle de validité des puces

-Série 1 : 10 patients PCA + 1 IgIV

-Série 2 : 9 patients PCA + 7 sujets sains

Puces à protéines

Blocage

des puces

Sérum

des patients

anti-GST

biotynilé

GST : Glutathion-S-Transférase Auto-anticorps sérique anti-GST biotynilé IgG anti-humain Streptavidine

IgG anti-humain-

Alexa Fluor 546 et

Streptavidine-

Alexa Fluor 635

Zhu et al. 2001

Jeong et al. 2012

Scan par Tecan

Et analyse par la

logiciel ScanArray

express

Patients

-3 patients contrôles de la validité

des puces à protéines

-19 patients atteints de PCA

Deux types de contrôles

Recrutés dans les services de médecine interne

de l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière.

Patients

Deux types de contrôles

-1 lot d’IgIV Tegeline® LFB-issu d’un pool de

plasma de 20 000 donneurs

-7 Sujets sains Donneurs de sang de l’Etablissement

Français du Sang

IgIV : Immunoglobulines intraveineuse LFB : Laboratoire du Biofractionnement

IVIG PCA

Auto-anticorps

Etape 1 : Qualité de la manipulation Etape 2 : Validité diagnostique

1er Lupus érythémateux disséminé

Anticorps anti-protéine ribosomale P2

2nd Cirrhose biliaire primitive

Anticorps anti-pyruvate déshydrogénase

Contrôles de la qualité des HuProt™

Gradient de GST

A. 633 nm B. 532 nm

Anticorps anti-pyruvate déshydrogénase

3ème Syndrome anti-synthétases

Anticorps anti-histidyl-tRNA synthétase

Dans la PCA

Auto-anticorps décrits dans la littérature

Patients toutes séries confondues

Sujets sains

IS < 2

l’exp

ressio

it Sco

Healthy-6

Healthy-4

Healthy-1

PCA-19

PCA-15

PCA-18

PCA-16

PCA-12

PCA-17

PCA-11

Healthy-3

PCA-14

Healthy-2

Healthy-5

PCA-13

Healthy-7

PCA-10

r les cib

Filtra

r éca

rt inte

artile

s retiré

l’exp

ressio

it Sco

Healthy-6

Healthy-4

Healthy-1

PCA-19

PCA-15

PCA-18

PCA-16

PCA-12

PCA-17

PCA-11

Healthy-3

PCA-14

Healthy-2

Healthy-5

PCA-13

Healthy-7

PCA-10

lisatio

ser sé

IS > 2 n=17

≥ 2 patients n=677

HS > 2 n= 1566

Sélection des cibles protéiques

Filtre écart inter-quartile :

2 protéines retirées / 17

Analyse de l’expression des Hit Scores

15 cibles protéiques permettent de ségréger les sujets sains et les patients

Trois combinaisons d’auto-anticorps

IS > 2 n=17

≥ 2 patients n=677

HS > 2 n= 1566

Sélection des cibles protéiques

Filtre écart inter-quartile :

2 protéines retirées / 17

15 cibles protéiques permettent de ségréger les sujets sains et les patients

Groupes de patients

Individus

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

PCA-19-11, healthy 2 et 3

Groupes de patients

Individus

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy 1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

Groupes de patients

Individus

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy 1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

Groupes de patients

Individus

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

Groupes de patients

IndividusPCA -11 -19

PCA-12 -13 -14 -

15-16 -17 -18p

47 [44-49] 47 [36-70] n.s.

7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.Durée moyenne d'évolution de la

Age moyen (années)

Patients PCA

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy 1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

PCA-19-11, healthy 2

7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.

37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.

Femme 1 2

Homme 1 5

Durée moyenne de conservation des

prélèvement (mois)

Durée moyenne d'évolution de la

maladie (années)

Groupes de patients

PCA-12 -13 -14 -

15-16 -17 -18p

47 [44-49] 47 [36-70] n.s.

Age moyen (années)

Patients PCA

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.

37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.

Femme 1 2

Homme 1 5

maladie (années)

Groupes de patients

PCA-12 -13 -14 -

15-16 -17 -18p

47 [44-49] 47 [36-70] n.s.

Age moyen (années)

Patients PCA

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy 1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.

37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.

Femme 1 2

Homme 1 5

maladie (années)

Groupes de patients

PCA-12 -13 -14 -

15-16 -17 -18p

47 [44-49] 47 [36-70] n.s.

Age moyen (années)

Patients PCA

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy 1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

PCA-19-11, healthy 2

7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.

37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.

Femme 1 2

Homme 1 5

maladie (années)

Groupes de patients

PCA-12 -13 -14 -

15-16 -17 -18p

47 [44-49] 47 [36-70] n.s.

Age moyen (années)

Patients PCA

Groupe 1

PCA-14,-15,-16,-18,-12,-

13,-17

Healthy 1, 4, 5, 6, 7

Groupe 2

7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.

37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.

Femme 1 2

Homme 1 5

maladie (années)

Pas de corrélation clinico-biologique

RAB11FIP1

CCDC97

Lien fort

Lien moyen

Lien faible

Sélection des cibles pour le diagnostic

SH3BP2

HS1BP3

DTNBP1

Lien faible

Lien moyen

RAB11FIP1

CCDC97

Lien fort

Lien faible

4 cibles présentes /7

Sensibilité 78%

Spécificité 100%SH3BP2

HS1BP3

DTNBP1

Lien faible

Lien moyen

RAB11FIP1

CCDC97

Lien fort

Lien faible

3 cibles présentes/6

VPP 83%

VPN 80%SH3BP2

HS1BP3

DTNBP1

Lien faible

VPP : Valeur Prédictive Positive VPN : Valeur Prédictive Négative

LSP1 Membrane

cellulaire

MAGI1 Membrane

cellulaire

Expression patients > sujets sains

Description des deux combinaisons candidates

Feng et al. 2014

Hwang et al. 2015

ABI3Cytoplasmique

LSP1 Membrane

cellulaire

MAGI1 Membrane

cellulaire

ABI3Cytoplasmique

et nucléaire

Latini et al. 2011

ABI3Cytoplasmique

LSP1 Membrane

cellulaire

MAGI1 Membrane

cellulaire

ABI3Cytoplasmique

et nucléaire

DTNBP1 Cytoplasme

CCDC97 Cytoplasme

TXLNB Cytoplasme

Uniprot

Cytoplasmique

LSP1 Membrane

cellulaire

MAGI1 Membrane

cellulaire

ABI3Cytoplasmique

et nucléaire

DTNBP1 Cytoplasme

CCDC97 Cytoplasme

TXLNB Cytoplasme

RAB11FIP1Membrane du

réticulum

endoplasmique

Uniprot

ABI3Cytoplasmique

LSP1 Membrane

cellulaire

MAGI1 Membrane

cellulaire

ABI3Cytoplasmique

et nucléaire

DTNBP1 Cytoplasme

CCDC97 Cytoplasme

TXLNB Cytoplasme

RAB11FIP1Membrane du

réticulum

endoplasmique

Pas d’auto-anticorps

décrits dans la littérature

Auto-anticorps

décrits dans la littératureCAST Cytoplasme

UBA2Cytoplasmique et

nucléaire

Expression sujets sains > patients

UBA2 : Cible dans la

dermatomyosite auto-

immune

CAST : Cible dans la

polyarthrite rhumatoïde

Tarricone et al. 2012

Mimori et al. 1995

SH3BP2 Cytoplasme

Expression sujets sains > patients

CAST Cytoplasme

UBA2Cytoplasmique et

nucléaire

Pas d’auto-anticorps

décrits dans la littératureHS1BP3 Réticulum

endoplasmique

RDH16Réticulum

endoplasmique

SH3BP2 Cytoplasme

DAB1 Cytoplasme

Ueki et al. 2001

Uniprot

Combinaison plus exprimée chez les patients

- Protéines non liées avec les structures du cartilage

- Pour la première fois décrites dans la polychondrite chronique atrophiante

- Pas d’auto-anticorps connus contre ces protéines

Deux combinaisons d’auto-anticorps

Combinaison plus exprimée chez les sujets sains

- Présence d’auto-anticorps dans la population générale

- Auto-anticorps pour la première fois décrites chez des sujets sains

Identification pendant la phase de Training

Deux groupes

de protéines candidates

Conclusions / Perspectives

A confirmer par une phase de Test

avec une plus grande cohorte

en incluant : des patients avec d’autres maladies auto-immune

par une technique ELISA par exemple

Song et al. 2010

Identification pendant la phase de Training

Deux groupes

de protéines candidates

Conclusions / Perspectives

A confirmer par une phase de Test

avec une plus grande cohorte

en incluant : des patients avec d’autres maladies auto-immune

par une technique ELISA par exemple

Song et al. 2010

Conclusions

• Combinaison de cibles

• Vérifications

Auto-anticorps

• Vérifications

� 10 puces (financement Fondation Arthritis

Courtin)

� Recrutement de patients

• ELISA

• Tester les cibles identifiées par une autre technique : Genalyte

Auto-anticorps

A. Anticorps

in CD45+ in B cells

Switchés

Non switchés

Lymphocytes B: identification des sous-populations

in IgMD+ B cells in IgMD+CD27- B cells

Marginal-zone Bm2

Transitionnels

Naïfs

Projet CyTOF®

Cytométrie de masse

Cellules circulantes

Delphine Sterlin – Laetitia Claër

Réunion de labo 4 décembre 2015

Principe du CyTOF®

D’après Bendall et al, Trends in Immunology 2012

Principe du CyTOF®

CyTOF® vs cytométrie en flux

CyTOF® => Analyse multiparamétrique

6 Patients, 5 sujets sainsLymphocytes B

ViSNE CD19+ à partir des fichiers downsamplés

13 000 evts/ech

Iterations : 1000

Perplexity : 50

Lymphocytes B

HD001 HD002 HD003 HD004 HD005

tSNEHD001 HD002 HD003 HD004 HD005

PCA014 PCA011 PCA012 PCA019 PCA003 PCA009

Lymphocytes B

2,05% 1,13% 2,32% 3,31% 2,25%

0,13% 0,08% 0,71% 0,08% 0,01% 0,45%

HD001 HD002 HD003 HD004 HD005

0,13% 0,08% 0,71% 0,08% 0,01%

p = 0,008

Lymphocytes B transitionnels

CD38hi CD10+

Lymphocytes T CD4

ViSNE CD3+ à partir des fichiers downsamplés

100 000 evts/ech

Iterations : 2000

Perplexity : 30

ViSNE Lymphocytes T CD4+ à partir du Visne CD3+

36 101 evts/ech

Iterations : 2000

Perplexity : 30 Th17

FoxP3+FoxP3+

4) Lymphocytes T CD4

a – Th17

HD001 HD002 HD003 HD004 HD005

4) Lymphocytes T CD4

a – Th17

** p < 0,05

15,87%7,52%9,47%10,06%5,55%15,91%

3,06% 3,50% 2,25% 2,45% 3,11%

PCA014 PCA011

HD001 HD002 HD003

PCA012

HD004 HD005

PCA019 PCA003 PCA009

A suivre….

• Diagnostic/anticorps: panels d’anticorps

�A évaluer

• Cellules circulantes/ Cytof:

�mise au point de la technologie : OKmise au point de la technologie : OK

� Des différences dans les lymphocytes B et les TH17

• La suite?

– GWAS: analyse du génome

– Mécanisme de la maladie (lien SMD/PCA)

• Dr Alexis Mathian

• Pr Jean-Charles Piette

• Pr Guy Gorochov

• Pr Zahir Amoura• Pr Zahir Amoura

• Chloé Couzin

• Delphine Sterlin

• Laetitia Claër

La recherche dans la polychondrite atrophiantedes puces à protéines -19 patients atteints de PCA...

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