Méthodes analytiques utilisées dans les

Méthodes analytiques utilisées dans les études de stabilité

Laurence Galanti MD, PhD CHU-UCL Namur

Laboratoire de chimie médicaleGroupe de recherche DSRG

laurence.galanti@uclouvain.be

2

v

Pharmacie hospitalière

Délivrance des médicaments

US

EfficacitéFiabilitéRapidité

DSRG Group depuis … 22 ans

Préparation centralisée

Connaissance de la stabilité

Matériel Compétences (personnel)

Laboratoire

3

Etude de stabilité

Stabilité microbiologique :

Preuve d’ambiance stérile, vérification de la

contamination (1x/6 mois)Cf USP 797

Stabilité physique : -Mesure du pH-Recherche visuelle sur fond blanc et noir de changement de couleur, d’opacités, de précipités-Recherche microscopique de précipités- Analyse spectrophotométrique

Stabilité chimique :Suivi de la concentration en fonction du temps selon- Type de conservation- Type de contenant- Type de préparation

Limite inférieure de confiance à 95 % de la droite de régression, estimée à partir de la

courbe de concentration en fonction du temps, supérieure à 90 % de la

concentration initiale (FDA)

4

Protocoles : Préparation des solutions thérapeutiques (5x perfusions, seringues, solutions orales, …)

Congélation des préparations (60 - 90 jours)

Décongélation : micro-ondes ou T° ambiante

Stockage T° étude + réalisation des aliquots :- 1ère semaine : tous les jours- 2e-4e semaine : 3x/sem- 2e-3e mois : 1x/sem

1 aliquot 1 aliquot

Analyse physique

Analyse chimique

(en triplicate)

Protocole 2

Sans congélation

Stockage T° étude + réalisation des aliquots :- 1ère semaine : tous les jours- 2e-4e semaine : 3x/sem- 2e-3e mois : 1x/sem

1 aliquot 1 aliquot

Analyse physique

Analyse chimique

(en triplicate)

Protocole 1

Avec congélation

Stockage T° étude + réalisation des aliquots :

- 1ère semaine : tous les jours- 2e-4e semaine : 3x/sem- 2e-3e mois : 1x/sem

1 aliquot 1 aliquot

Analyse physique

Congélation

Décongélation de tous les

aliquots en fin de test

1 aliquot

Congélation

Analyse chimique (en triplicate)

Back-up

Protocole 3

5

Botaniste russe

1906

Méthodes analytiques Méthodes chromatographiques = méthodes physico-chimiques de séparation →

Répartition des composants d’une solution entre 2 phases (stationnaire et mobile)

→ Chromatographie liquide haute pression (1965)

Théorie et pratique de la chromatographie de partage

(Archer J P Martin et Richard L M Synge, 1940)

↨Prix Nobel de Chimie (1952)

6

Principes de séparation

Adsorption, partage, échange d’ions,

exclusion stérique, affinité, …

Couplées- Spectrométrie de masse

7

Types de chromatographie

Nature de la phase mobile

Liquide

(Haute pression)

Gaz

Type de supports (phase stationnaire)

Sur couche

mince (planaire) :

silice, cellulose,

…

Sur colonne

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Types de

détecteurs

o UV-Visibleo Longueur d’onde fixe/variableo Barrette de diodes

Absorption de lumière

o Fluorescence Emission de fluorescence

o Electrochimie Propriétés oxydo-réductives

o RéfractométrieIndice de réfraction phase mobile/effluent

o ConductimétrieConductivité phase mobile/effluent

o …

*

*

*

Peu sensible, sensible à la T°, débit et pression,

mode isocratique

Sensibilité +++ à la T°

9

Détecteur UV-Visible / Barette diodes

UV-Visible Barette de diodes

Avantages Sensibilité

Peu sensibles aux ≠ T° et débit

Mode gradient

Utilisation et entretien « faciles »

Spécificité Spécificité +Spectre (tps, absorbance, λ)

Inconvénients Substances chromophores

Bande passante plus large

Utilisation plus complexe

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Détecteur fluorescence - électrochimique

Fluorescence Electrochimique

Avantages Sensibilité + Sensibilité ++

Spécificité + (fct des composés)

Peu sensibles aux ≠ T° et Débit

Mode gradient

Inconvénients Substances fluorescentes Modification de l’échantillon

Sensible O2 dissous (phase mobile) Sensible à la phase mobile (pH, O2 dissous)

Entretien constant des cellules

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Avantages Limitations

- Technique de référence éprouvée, bien maîtrisée

- Largement utilisée dans les domaines de recherche (industrie)

- En constante évolution (UPLC, couplage MS, …)

- Analyse quantitative précise et reproductible, haut pouvoir de séparation

- Possibilité d’analyse de ≠ types de composés ou d’échantillons

- Méthode flexible, personnalisable

- Nécessité d’un personnel qualifié, expertise

- Difficilement automatisable → nécessité de main d’œuvre

- Prétraitement des échantillons- Absence de détecteur universel

idéal- Encore relativement complexe

pour les dosages de laboratoire de routine

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Défis de la chromatographie

o ↑ la sensibilité (abaisser le seuil de détection )

o ↑la spécificité (coélution)

o ↓ le temps d’analyse (↑la vitesse de séparation)

o ↑ la précision

o ↓ Volume d’injection

o ↑ la fiabilité et la facilité d’utilisation

o ↓ les coûts (personnel, volume phase mobile, colonnes, ….)

o ….

13

HPLC / UPLC

14

Système HPLC

Logiciel d’intégration Empower

(Waters)

Détecteur UV

Détecteur

barette de

diodes

Détecteur

électrochimique

Solvants

Sample

manager

Echantillonneur Colonne

Pompe

quaternaire

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Système UPLC

Détecteur

fluorescence

Détecteur

barette de

diodes

Solvants

Echantillonneur

Pompe

quaternaire

Colonne

Logiciel d’intégration

Empower

(Waters)

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Comparaison HPLC - UPLC

HPLC Diamètre particules phase stationnaire 3-10 µm

Pression 5000 psi

Volume échantillon plus grand

Flux (+) important

Température de colonne (-) élevée

Cellule de détection (+) grande

Temps de rétention plus long

UPLC↓ diamètre particules (1.75 à 1.8 µm)

↑ pression (>15000 psi)

↓ volume d’échantillon

↓ flux

↑ température de colonne

↓ cellule de détection

↓ temps de rétention

↑ vitesse d’analyse ↑ résolution↑ sensibilité

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UPLC :Volume : 5 µL

RT : 0.598 min

Run Time : 5 min

TR 0.598

HPLC :Volume : 50 µL

RT : 2.736 min

Run time : 10 min

Vitamine A

TR 2.736

De

HP

LC à

UP

LC

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Système UPLC-QDA

- Intégrer les données optiques et de masse de manière simultanée- Confirmer l’identification d’un composé- Quantifier des composés de faible concentration- Confirmer des composés sous forme de traces- Limiter les co-élutions- Détecter les molécules n’absorbant pas en UV

Détecteur de masseSéparation en phase gazeuse de molécules

chargées (ions) en fct de la m/z

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Planification d’un étude de stabilité

1. Choix de(s) molécule(s) à analyser : fonction de la demande des cliniciens1. Forme2. Type de contenant3. Conditions de stockage

2. Recherche bibliographique : méthodes de dosage, données de stabilité3. Mise au point de la méthode d’analyse :

1. Système de dosage, type de détecteur, colonne2. Phase mobile : ([tampon], pH, addition d’un composé organique (nature,

%)3. Conditions de travail : flux: (isocratique ou gradient), température, choix

des dilutions→ temps le plus court possible, séparation optimale des pics

4. Validation de la méthode : CV inter/entra-essais, linéarité, LOD, LOQ, test de dégradation

5. Préparation des médications et étude de la stabilité

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Test de dégradation

Objectif : Mettre en évidence

des pics de dégradation éventuels

→ Adapter les conditions d’analyse pour :

Séparer les pics de dégradation des pics de la substance active

Eviter tout contamination d’un échantillon sur le suivant

Test : pH neutre, basique et acide

avant et après chauffage à 100°C

AU

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Minutes 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

V A N C

O

AU

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Minutes 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

V A N C

O

1 : No heating _____ at natural pH(3.72), …….. at acidic pH(1.60) and _ _ _ _ at

alkaline pH (11.54).

2: Heating at 100°C for 30 minutes ______ at natural pH(3.72), …….. at

acidic pH(1.60) and _ _ _ _ _ at alkaline pH (11.54).

(1) (2)

21

DSRG Etudes :

- Type de contenant : pochettes,

seringues, sirop, collyre, …

- Type de conservation : frigo,

congélateur, T) ambiante, …

- Types de molécules : princeps,

générique, …

Antifongique :Voriconazole

Anti-inflammatoires, analgésiques, anesthésiants :

Lidocaïne, cocaine, procaine, kétamine, diclofenac, dexaméthasone, morphine, tramadol, kétorolac, levobupivacaine,

sufentanil,

Divers : Levofolinate, ésoméprazole,

alizapride, ondansetron, droperinol, metoclopramide, chlorazepate,

tromethamine, …

Antitumoraux : 5FU, doxorubicine

Antibiotiques/ antiviraux : Céfuroxime, vancomycine, teicoplanin,

céfépime, pipéracilline, tazobactam, ceftriaxone, ceftriaxone, témocilline,

acyclovir

Cardiologiques :Noradrénaline,

isosorbide, amiodarone

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Conclusions

o La chromatographie, en particulier liquide = méthode analytique en constante évolution (LC → HPLC → UPLC → …)

o Technique incontournable dans de nombreux domaines scientifiques, notamment dans le domaine pharmaceutique et médical

o Moyen d’identifier, de quantifier de nombreux composés de manière fiable

o Technique nécessitant une expertise (coût)

o Possibilité de couplage avec d’autres techniques d’analyse (spectrométrie de masse → amélioration de d’identification)

o Développement technologique pour une plus grande automatisation

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Bilan 1996 – 2018 (02/07) Publications nationales et internationales : 53 + 1 Posters : 83 + 1 Oral communications : 18 + 3 Prix et nominations : 5 Symposium : 3 + 1 Publications soumises : 4

Remerciements à toute l’équipe : • Pr Jean-Daniel Hecq• Mme Laura Soumoy• Pr Jacques Jamart• Mr Benoît Bihin• Mme Marie-Lise Colsoul• Mr Nicolas Goderniaux

Merci pour votre attention