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Opération Biopuces. Resp : Pr. J.R. Martin Site en cours de construction Version du 15/12/2003. Axes de recherche du groupe Biopuces. Fonctionnalisation & optimisation des supports Conception & réalisation de biopuces Puces à oligonucléotides Puces à protéines - PowerPoint PPT Presentation
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Opération BiopucesOpération Biopuces
Resp : Pr. J.R. MartinResp : Pr. J.R. Martin
Site en cours de constructionSite en cours de construction
Version du 15/12/2003Version du 15/12/2003
Axes de recherche du groupe BiopucesAxes de recherche du groupe Biopuces
Fonctionnalisation & optimisation des supports Fonctionnalisation & optimisation des supports Conception & réalisation de biopucesConception & réalisation de biopuces Puces à oligonucléotidesPuces à oligonucléotides Puces à protéinesPuces à protéines Mise en oeuvre des biopucesMise en oeuvre des biopuces Nouvelles méthodologiesNouvelles méthodologies
Fonctionnalisation & optimisation des supports Fonctionnalisation & optimisation des supports
Chimie de surface sur support verre ou Chimie de surface sur support verre ou silicium silicesilicium silice
Silanisation et fonctionnalisation pour :Silanisation et fonctionnalisation pour :
- Immobilisation des oligonucléotides- Immobilisation des oligonucléotides
- Synthèse in situ- Synthèse in situ Approche physicochimiqueApproche physicochimique Approche physiqueApproche physique
Conception, fabrication & mise en œuvre Conception, fabrication & mise en œuvre de biopucesde biopuces
Sélection de sondes par bioinformatiqueSélection de sondes par bioinformatique Développement des protocoles de matériel biologiqueDéveloppement des protocoles de matériel biologique Fabrication de puces de validation par synthèse in situFabrication de puces de validation par synthèse in situ Lecture dynamique de puces à ADNLecture dynamique de puces à ADN Deux applications :Deux applications :
• GénotypageGénotypage
• Expression de gènesExpression de gènes
Conception automatisée de séquences sondes pour le génotypage sur puce
Analyse d’image pour l’interprétation de biopuces de génotypage
Outils informatiques pour la conception, l’analyse et la validation expérimentale
de biopuces de génotypage
Puces à oligonucléotides (1/5)Puces à oligonucléotides (1/5)
Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de réactifs.réactifs.
Deux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitresDeux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitres
Deux procédés :Deux procédés :• Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solideImmobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide• Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solideSynthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide
Puces à oligonucléotides (2/5)Puces à oligonucléotides (2/5)Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiquesImmobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques
Dispositif expérimentalDispositif expérimental
½ Batterie avec 128 ½ Batterie avec 128 moyens de microprojectionmoyens de microprojection
Grande vitesse de Grande vitesse de fabrication (50 puces/h)fabrication (50 puces/h)
Absence de contaminationAbsence de contamination
Fabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masseFabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masse
Optimisation de la densité de greffage des sondes / processus d ’évaporation d’une goutte projetée : nano-mouillage
T ambiante : 22.5°C Humidité : 43%RH
Puces à oligonucléotides (3/5)Puces à oligonucléotides (3/5)Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiquesSynthèse in situ de sondes oligonucléotidiques
basse à moyenne intégrationbasse à moyenne intégration
Dispositif Dispositif expérimentalexpérimental
Chimie des Chimie des phosphoramiditesphosphoramidites
Projection des Projection des nucléotides (5nl)nucléotides (5nl)
Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires :Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires :conception de biopuces, mise au point de protocoles biologiquesconception de biopuces, mise au point de protocoles biologiques
Puces à oligonucléotides (4/5)Puces à oligonucléotides (4/5)Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des
phosphoramidites : adaptation du cycle de synthèsephosphoramidites : adaptation du cycle de synthèse
Couplage localisé par Couplage localisé par microprojection de la microprojection de la base et de l’activateurbase et de l’activateur
Autres réactions non Autres réactions non localisées par localisées par microfluidiquemicrofluidique
Réacteur anhydre et saturé en solvant Réacteur anhydre et saturé en solvant
Puces à oligonucléotides (5/5) :Puces à oligonucléotides (5/5) :synthèse in situ synthèse in situ haute intégrationhaute intégration
Dispositif expérimental en cours de développementDispositif expérimental en cours de développement
Chimie des phosphoramiditesChimie des phosphoramidites
Projection des nucléotides (3 picolitres)Projection des nucléotides (3 picolitres)
Biopuces pour la protéomique (1/2)Biopuces pour la protéomique (1/2)Fixation contrôlée de peptides Fixation contrôlée de peptides
sur support plan : sur support plan : • peptides synthétiques fixés par peptides synthétiques fixés par
couplage covalent orienté sur couplage covalent orienté sur support support
• Objectif : réalisation d’édifices Objectif : réalisation d’édifices dendrimériquesdendrimériques
Applications :Applications :• Reconnaissance de protéines pour Reconnaissance de protéines pour
diagnostic immunologiquediagnostic immunologique Programmes :Programmes :
• CNRS “Protéomique” ; Région RA CNRS “Protéomique” ; Région RA ”Méthodologies analytiques” ; ”Méthodologies analytiques” ;
Partenaires Partenaires • Rosatech, Université Lyon I (LBASB, Rosatech, Université Lyon I (LBASB,
LBCP), EFS, Protéine’XpertLBCP), EFS, Protéine’Xpert
Peptides fixés
solvant
Peptides non activés
Validation de la chimie de couplage
(fluorescence, IR)
Objectif : immobilisation de
dendrimères peptidiques
NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2
NH2
COOH
COOH
COOHCOOH
COOHCOOH
COOH
COOHCOOH
Support fonctionnalisé
Dendrimère
Peptides synthétiques
0.0E+00
1.0E+04
2.0E+04
3.0E+04
4.0E+04
Solvant Peptideactivé
peptide nonactivé
Type de dépôt
Fluo
resc
ence
-bg
Biopuces pour la protéomique (2/2) :Biopuces pour la protéomique (2/2) :
Synthèse Synthèse « in-situ »« in-situ » localisée d’oligopeptides localisée d’oligopeptides
Schéma de couplageSynthèse des Fmoc
AA -Fmoc Activateur(DCC)
Etape 1
Rinçage
Etape 2
Déprotection du Fmoc
Etape 3
Rinçage
Etape 4
N-alpha-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-Alanine
OO
nO
O
NH
2n
Principe: adapter le procédé de synthèse in situ de biopuces du LEOM à la
chimie des Fmoc
Nouvelles méthodologiesNouvelles méthodologies Optimisation de l’hybridation des biopuces : micromélange Optimisation de l’hybridation des biopuces : micromélange
& microfluidique, étude cinétique des interactions & microfluidique, étude cinétique des interactions cibles/sondes sur support solidecibles/sondes sur support solide
Lecture dynamique des puces à ADNLecture dynamique des puces à ADN
Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées
Etude du comportement de biomolécules sur support solideEtude du comportement de biomolécules sur support solide
BiocapteursBiocapteurs
Etude du comportement de Etude du comportement de biomolécules sur support solide biomolécules sur support solide
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250 300 350 400Temps (s)
Flu
ore
scen
ce r
ela
tive (
%)
Hybridation
séquences non complémentaires
modèle 1er ordre
Analyse cinétique de reconnaissance entre biomolécules
Détection de SNP sur support solide : discrimination de deux
cibles à un nucléotide prêt
fluor
esce
nce
Position X
Biocapteurs d’ADNBiocapteurs d’ADN
Cartographie d’impédance optoélectrochimique pour la
reconnaissance biomoléculaire
Principaux programmes de recherchePrincipaux programmes de recherche
20032003 Outils de conception et de fabrication de biopuces pour la protéomique, Programme de Recherche Région Rhône-Alpes, Thématique
Prioritaire : Sciences Analytiques Appliquées (2003/2005) Puces ADN : étalement de gouttes avec évaporation et mécanismes réactionnels, modélisation mathématique et numérique , PIR CNRS :
Microfluidique et Microsystèmes fluidiques (2003/2004) Micro-mélangeur à advection chaotique pour une hybridation optimisée des biopuces, FITT (2003/2004)
20022002 Puces à ADN pour le diagnostic génétique, Programme GENHOMME (2002/2004) Conception et Validation d’une biopuce à PNA pour la traçabilité génétique des agents pathogènes, développement de l’équipement
d’analyse associé, Programme MENRT (2002/2004) Autofluorescence & système moléculaire autofluorescent pour l'étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées,
ACI Nouvelles méthodologies analytiques et capteurs (2002/2004) Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (“Multiple Antigen Peptide”), Programme Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (“Multiple Antigen Peptide”), Programme
CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003)CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003) Micro-mélangeur à advection chaotique pour l’hybridation des biopuces, Bonus Qualité Recherche 2002 (2002/2003)
20012001 Machine de production de puces à ADN 256 sondes par microdéposition, Programme ANVAR de transfert de technologie (2001/2003) Réalisation d’une puce à ADN pour l’étude du transcriptome de Buchnera Aphidicola, Bonus Qualité Recherche 2001 (2001/2002)
Principaux programmes de recherchePrincipaux programmes de recherche
20002000 Projet ROSA2 (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme Puces à ADN du CNRS (2000-2002)Projet ROSA2 (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme Puces à ADN du CNRS (2000-2002)
19991999 Faisabilité d'un réacteur pour la fabrication de réseaux d'oligonucléotides par synthèse chimique parallèle localisée par microdéposition,
Programme CNRS MICROSYSTEMES (1999/2000)
19971997 Projet ROSA (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme GENOME du CNRS (1997-2000)Projet ROSA (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme GENOME du CNRS (1997-2000)
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