POLYMORPHISMES CARTE & LIAISON GÉNÉTIQUES Laurent VILLARD Inserm Unité 491 Faculté de...

POLYMORPHISMESPOLYMORPHISMESCARTE & LIAISON GÉNÉTIQUESCARTE & LIAISON GÉNÉTIQUES

Laurent VILLARDInserm Unité 491

Faculté de Médecine de La Timone

http://www.team3-u491.net

M1Génétique des Mammifères2006 - LUMINY

1

22POLYMORPHISMESPOLYMORPHISMES

A quelle condition peut-on étudier la transmission des caractères héréditaires ?

La transmission des caractères ne peut être étudiée que si ceux-ci sont POLYMORPHES.

L'ADN humain est polymorphe

Il existe environ 3.500.000 différences entre deux invidivus pris au hasard (0,1% de leur génome)

!

33POLYMORPHISMESPOLYMORPHISMES

Ces variations dans la séquence d'ADN n'ont pas de conséquence pathologiques.

Les polymorphismes sont le résultat de "mutations".

Mutation : changement permanent et transmissible dans le matériel génétique

Ceci implique que "mutation" n'est pas synonyme de "pathologie"

44POLYMORPHISMESPOLYMORPHISMES

Ces variations de séquence peuvent avoir lieu

dans les gènes hors des gènes

avec une conséquence sans conséquence

groupe sanguincouleur des yeux

sans conséquence

synonymes

55POLYMORPHISMESPOLYMORPHISMES

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

MICROSATELLITES

SNPSingle Nucleotide Polymorphisms

66LES TYPES DE POLYMORPHISMESLES TYPES DE POLYMORPHISMES

Restriction Fragment Length Polymorphism

Suite à la découverte des enzymes de restriction (1973), une technique d’hybridation de sondes marquées va être développée (Southern blot, 1975) pour repérer un fragment de restriction particulier dans un mélange complexe d’ADN.

En 1980, on découvre que certains fragments de restriction n’ont pas la même taille chez tous les individus…

Pourquoi ?

77LES RFLPLES RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

Site de coupure EcoRI GAATTCCTTAAG

Pas de coupure en cas GACTTCde modification du site CTGAAG

(il s’agit souvent du polymorphisme d’un seul nucléotide)

88LES RFLPLES RFLP

1 2 3 4éle

ctr

op

horè

se

Taille

des f

rag

men

ts d

e r

estr

icti

on

+

-

99LES RFLPLES RFLP

1 2 3 4éle

ctr

op

horè

se

+

-

Taille

des f

rag

men

ts d

e r

estr

icti

on

1010LES RFLPLES RFLP

ADN

PCR

DigestionEnzymatique

Électrophorèse

Site de restriction

Site variable

Amorce PCR

1,2 : Homozygotes

3 : Heterozygote

*

*

1 2 3

1111LES RFLPLES RFLP

Découverts en 1989, ce type de marqueurs polymorphe va petit à petit remplacer les RFLP.

Il s'agit de séquences d'ADN constituées de motifs répétés avec 2, 3 ou 4 nucléotides :

nnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnnn

nnnnnnGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTnnnnnnnn

nnnnnnATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGnnnnn

nb variable de répétitions

1212LES MICROSATELLITESLES MICROSATELLITES

nb variable de répétitions

nb variable de répétitions

Les microsatellites sont des marqueurs multi-alléliques

Allèle 1

…nnnnnnnnCACACACACACACACACAnnnnnnnnnnnn……nnnnnnnnCACACACACACACACACAnnnnnnnnnnnn…

Allèle 2

…nnnnnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnn……nnnnnnnnnCACACACACACACACACACACACACAnnnnnnn…

Allèle 3

…nnnnnnnnnnCACACACACACACACACACACAnnnnnnnn……nnnnnnnnnnCACACACACACACACACACACAnnnnnnnn…

9 répétitions (CA)

13 répétitions (CA)

11 répétitions (CA)

1313LES MICROSATELLITESLES MICROSATELLITES

Chromosome

(CA)n variable (locus polymorphe)

Fragments d’ADN amplifiés

ÉlectrophorèseGrands

Petits

1 2 3 4 5

CACACACACACA

6 allèles détectés

1414LES MICROSATELLITESLES MICROSATELLITES

Les marqueurs multi-alléliques sont plus intéressants pour les applications médicales ou légales que les marqueurs bi-alléliques.

Pourquoi ?

1515LES MICROSATELLITESLES MICROSATELLITES

Le pourcentage d'hétérozygotie dans la population générale sera plus important que celui des marqueurs bi-alléliques.

Locus bi-allélique : A1, A2 (n = 2)

3 génotypes possibles : A1A1, A1A2, A2A2

Fréquence des hétérozygotes = 1 - (n x f(A1) x f(A2))= 1 - (2 x 0,5 x 0,5) = 0,5

50% d'hétérozygotes au maximum

1616LES MICROSATELLITESLES MICROSATELLITES

Locus multi-allélique : A1, A2, A3, A4….. An (n allèles)

Nombre de génotypes homozygotes = n

Nombre de génotypes possibles = n x (n+1) / 2

Pour un marqueur à 8 allèles = 8 x (8+1) / 2 = 36 génotypes(avec seulement 8 génotypes homozygotes)

Fréquence des hétérozygotes = 1 - (8 x 0,125 x 0,125)= 0,875

87,5% d'hétérozygotes au maximum

1717LES MICROSATELLITESLES MICROSATELLITES

Single Nucleotide Polymorphisms

Allèle A

…AGCATAGCAGCAATCAGCGCAGCAGTCTCTCTTCGCAAGCA……TCGTATCGTCGTTAGTCGCGTCGTCAGAGAGAAGCGTTCGT…

Allèle B

…AGCATAGCAGCAATCAGCACAGCAGTCTCTCTTCGCAAGCA……TCGTATCGTCGTTAGTCGTGTCGTCAGAGAGAAGCGTTCGT…

1818LES SNPLES SNP

La base de données des SNP : dbSNP

Contenu au 29-09-2005

Espèce Nombre de SNP distincts

Homo sapiens 10 430 753

Canis familiaris 3 310 003

Gallus gallus 3 296 472

Mus musculus 1 833 763

Pan troglodytes 1 542 718

1919LES SNPLES SNP

Si un SNP modifie un site de restriction, il génère un RFLP.

Déterminer les allèles présents à un locus = GÉNOTYPER

Combien de génotypes possibles pour :

Un RFLP ?

Un microsatellite à n allèles ?

Un SNP ?

!

2020LES SNPLES SNP

Si un SNP modifie un site de restriction, il génère un RFLP.

Déterminer les allèles présents à un locus = GÉNOTYPER

Combien de génotypes possibles pour :

Un RFLP ? 3 (AA , AB , BB)

Un microsatellite à n allèles ? n x (n+1) / 2

Un SNP ? 3 (AA , AB , BB)

!

2020LES SNPLES SNP

Il existe deux types principaux de cartes :

- les cartes génétiquesles cartes génétiques

les distances sont exprimées en centimorgan (cM)

- les cartes physiquesles cartes physiques

les distances sont exprimées en paires de bases (pb)kilobases (kb) = 1000 pbMégabases (Mb) = 1000 kb

2121CARTOGRAPHIECARTOGRAPHIE

Elle est basée sur l’observation de la transmission des caractères héréditaires.

Les distances génétiques sont le reflet de la fréquence de recombinaison.

Pendant la méïose, les « crossing-over » provoquent l’échange de matériel génétique entre chromosomes homologues.

Plus deux gènes (deux marqueurs) sont proches, moins ils ont de chances d’être séparés par un crossing-over et plus la distance génétique entre eux sera petite.

A B C

A B

C

2222CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

Lorsque deux marqueurs sont suffisamment proches pour n’être séparés qu’une fois sur 100, on fixe la distance génétique qui les sépare à 1 centimorgan (1 cM).

Il s’agit d’une mesure équivalente à 1% de recombinaison.

Si deux marqueurs ne sont pas « liés » (i.e. s’ils sont situés sur deux chromosomes différents) ils seront séparés (en moyenne) une fois sur deux. La fréquence de recombinaison maximale est donc de 50% (0,5).

2323CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

L’étude des familles humaines permet de déterminer le

mode de transmission des caractères héréditaires

(pas forcément des maladies mais aussi de n’importe quel

segment d’ADN polymorphe).

2424CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

2525CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

Ces études permettent de déterminer les fréquences de

recombinaison entre ces caractères et donc de construire

une CARTE GÉNÉTIQUE sur laquelle ces caractères seront

positionnés les uns par rapport aux autres.

Pour être informatives, ces études doivent étudier beaucoup

de méïoses, donc de grandes familles.

Les SNPs ou microsatellites étant polymorphes, leur ségrégation peut être observée dans des familles :

p1 p2 m1 m2

8

4

2

7

5

3

8

10

8

7

8

10

2

4

5

10

2626CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

L'établissement et l’utilisation d'une carte génétique L'établissement et l’utilisation d'une carte génétique

permettentpermettent :

1. D'établir des points d'ancrage pour la carte physique

2. D'identifier la région (et le gène) responsable d'une

maladie monogénique donnée

3. D'étudier certaines particularités de la méiose, telle que

la variation de fréquence des recombinaisons :

en fonction du sexe

en fonction de la région du génome

2727CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

1987 - Première version (CRI, familles du CEPH)403 marqueurs (RFLP), résolution 10 cM

1992 - Seconde version (Généthon, familles du CEPH)814 marqueurs (microsatellites), résolution 4,4 cM

1992 - Troisième version (NIH, CEPH)1676 marqueurs (microsatellites + RFLP), résolution 3 cM

1994 - Quatrième version (Généthon)2066 marqueurs (microsatellites), résolution 2,9 cM

1996 - Cinquième version (Généthon)5264 marqueurs (microsatellites), résolution 1,6 cM

2828CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

Les cartes disponibles ont principalement été construites en utilisant 40 grandes familles, collectées par le Centre d’Etude du Polymorphisme Humain (CEPH, Paris).

3- observation des recombinaisons entre les marqueurs proches afin de confirmer leur ordre

2- calcul des fréquences de recombinaison entre les marqueurs

1- génotypage de tous les individus pour déterminer les allèles présents au marqueur étudié chez ces individus.

2929CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

3030CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

Carte génétique basse résolution du chromosome 1

Nomenclature des marqueurs :

D pour DNAN numéro du chromosomeS pour SequenceXXX numéro d’ordre

Pour le chromosome 1

D1S243D1S163 etc…

Pour le chromosome X

DXS441DXS1116 etc…

3131CARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUECARTOGRAPHIE GÉNÉTIQUE

LOD (Logarithm of the odds) SCORE (Z)

C’est une valeur déterminée dans le cadre d’une

ANALYSE DE LIAISON GENETIQUE

Il s'agit d'une mesure statistique. C'est le logarithme du rapport des probabilités entre l'hypothèse proposée (liaison génétique) et l'hypothèse contraire (pas de liaison).

Z = log10 LR LR = liaison / non liaison

!

3232ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

Si le lod score est supérieur à 3 (c'est-à-dire que la liaison

est mille fois plus probable que la non-liaison) on tranche,

en général, dans le cas des maladies monogéniques

autosomiques, en faveur de la liaison génétique.

3333ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

Les valeurs inférieures à -2 (100 chances pour 1 contre la liaison génétique) excluent une la liaison génétique.

Une valeur de lod score égale ou supérieure à 2 est acceptée comme étant significative pour le chromosome X.

0-2 +3

Non liaison LiaisonAjouter des familles…

Z

3434ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

I

II

III

A1/A2 A3/A4

A1/A3 A5/A6

A3/A6 A3/A6 A3/A5 A3/A5A1/A6 A1/A6

Recombinant

A1/A5

3535ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

Exemple : test de la liaison entre une pathologie et un marqueur microsatellite

1- Il faut fixer une fraction de recombinaison

= 5% signifie que le gène responsable et le marqueur

considéré resteront liés dans 95 % des méioses observées.

Une recombinaison sera observée dans 5% des méioses.

Cette valeur s’appelle (théta).

varie entre 0 (identité de position) et 0,5 (non liaison).

Si on suppose que le gène responsable et le marqueur sont

au même endroit, elle sera égale à 0.

Sinon, on fixe une fraction de recombinaison : par exemple

5%

3636ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

2- Calcul de la probabilité de liaison

Probabilité de liaison (non recombinaison) entre gène et marqueur

Fraction de recombinaison de 5% = 0,95

Probabilité de liaison « au hasard » = 50% = 0,5

Rapport des probabilités (LR) avec les deux hypothèses = 0.95/0.5 = 1,9

donc un lod score Z = log10(LR) = 0,279 (pour un individu)

3737ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

Probabilité de non liaison (recombinaison) entre gène et marqueur

Fraction de recombinaison de 5% =0,05

probabilité de non liaison « au hasard » = 50% = 0,5

Rapport des probabilités de non liaison (LR) avec les deux hypothèses = 0.05/0.5 = 0,1

donc un lod score

Z = log10 (LR) = -1 (pour un individu)

3838ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

3- Calcul de la probabilité de non liaison

Dans cette famille avec 7 enfants (7 meioses) dont 1 recombinant :

(6 x 0.279) + (1 x (-1)) = Z = 0.674 pour = 0,05 au marqueur A3

3939ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

I

II

III

A1/A2 A3/A4

A1/A3 A5/A6

A3/A6 A3/A6 A3/A5 A3/A5A1/A6 A1/A6

Recombinant

A1/A5

En combinant plusieurs familles il devient possible d'établir

une éventuelle liaison entre le marqueur testé (connu, ici A)

et le gène non connu (responsable de la pathologie) mais qui

sera ainsi localisé si Z > 3.

Les individus recombinants font chuter le lod score =

beaucoup de gamètes recombinants indique que le gène et le

marqueur ont peu de chance d’être liés génétiquement…

(- l’infini à = 0)

4040ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

4141ANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUEANALYSE DE LIAISON GÉNÉTIQUE

Recombination fraction

Marker 0.00 0.01 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40D7S484 -Infinity 2.47 2.68 2.39 1.60 0.83 0.24D7S2449 9.02 8.79 7.86 6.70 4.44 2.39 0.75D7S510 4.43 4.30 3.75 3.06 1.84 0.89 0.24D7S691 5.49 5.32 4.64 3.79 2.18 0.93 0.24D7S667 6.49 6.37 5.79 5.01 3.43 1.90 0.58D7S519 2.37 2.51 2.68 2.56 1.93 1.12 0.32D7S422 -Infinity 2.01 2.68 2.59 1.87 1.04 0.29D7S506 -Infinity 0.77 2.23 2.33 1.71 0.92 0.26D7S2552 -Infinity -0.71 0.86 1.30 1.21 0.72 0.20D7S494 -Infinity -0.58 1.83 2.33 2.00 1.19 0.36D7S502 -Infinity -0.75 1.12 1.61 1.51 0.94 0.28

Le projet HapMap vise à comparer la séquence du génome de

différents individus pour identifier les régions où des variations

génétiques sont partagées.

Le projet est financé par les organismes publics de 6 pays.

L'objectif est de mettre à disposition des chercheurs

l'information qui leur permettra de mettre en évidence des

liens entre variations génétiques et susceptibilité à certaines

maladies.

4242LE PROJET HAPMAPLE PROJET HAPMAP

Populations étudiées :

Idaban (Nigéria) 30 trios (2 parents / 1 enfant)

Tokyo (Japon) 45 individus sans lien de parenté

Beijing (Chine) 45 individus sans lien de parenté

Américains (USA)originaires d'Europe del'Ouest et du Nord 30 trios (2 parents / 1 enfant)

4343LE PROJET HAPMAPLE PROJET HAPMAP

Le projet HapMap veut identifier le maximum de SNP dans le génome humain et établir leurs cartes de répartition dans différentes populations.

Cartographie de la diversité génétique de l'espèce humaine.

Le projet HapMap identifie les haplotypes courants dans 4 populations.Il définit des SNP "marqueurs" qui identifient un haplotype.

Ex : susceptibilité à l'hypertension ?

Quels sont les SNPs hérités en commun chez tous les patients hypertendus ?Le(s) facteur(s) de susceptibilité doivent se trouver proche.

On ne génotypera pas les 10,000,000 de SNP chez chaque individu. On connaît des associations préférentielles de marqueurs proches qui constituent des "haplotypes" de SNP, d'où le nom HapMap.

4444LE PROJET HAPMAPLE PROJET HAPMAP

Les données du projet HapMap permettent des études d'association à grande échelle pour différentes pathologies :

canceraccidents vasculaires cérébrauxmaladies du coeurdiabètehypertension…

A terme

traitements adaptés au profil génétique des individus("pharmacogénomique")

"variants" génétique associés à la longévité, à la résistance aux maladies ?

développement de nouvelles thérapies ?

4545LE PROJET HAPMAPLE PROJET HAPMAP