Polymorphismes et diversité génétiqueMarqueurs génétiques: le génotypeL’haplotype La recombinaison méïotiqueLa liaison génétiqueCartographie physique et génétiqueNotions de génétique somatique : réarrangement, mutations Lois de Mendel-transmission autosomique dominante, récessive autosomique, liée à l’X-pathologie mitochondriale

Plan du cours 2005-2006 de génétique Pr F. SOUBRIER 6 H

Ouvrages consultables :Strachan : génétique moléculaire humaineThompson : génétiqueDelpech et Kaplan : Biol mol et medEtienne et ClauserFeingold et Fellous

Polymorphisme génétique

Toute variation de séquence génomique entraînant l’existence d’au moins 2 formes différentes de la séquence dans la population

Types de polymorphisme Substitution d'un nucléotide (SNP) Insertion/délétion Polymorphisme de répétition (VNTR, CA repeat…)

Exemples de Single Nucleotide Polymorphisms : SNP

Génération de la variabilité génétique

Mutation (substitution, addition /soustraction d'un ou plusieurs nucléotides)

… AAGTCGAT… … ATGCCT…

… AAGCCGAT… … ATGCTCCT…

RecombinaisonCrossing-over (échange de matériel génétique équilibré entre 2

portions homologues de chromosomes)

Chr paternel CCATCGA CCATGAC

X

Chr maternel AACAGAC AACACGA Conversion : se réalise dans un segment d’ADN double-hélice où

se forme un hétéroduplex. Réalise un transfert non réciproque d’information génétique car un allèle « convertit » l’autre. Peut résulter de la recombinaison entre séquences alléliques,

Conversion génique : transfert non réciproque d’information génétique entre 2 gènes ayant une homologie élevée

Diversité de séquence des gènes humains

Diversité nucléotidique : Nombre de différences, rapporté à la longueur de la séquence examinée, entre 2 séquences prises au hasard dans la population (ex: = 4 x 10-4, 1 différence en moyenne toutes les 2500 bp)

AGTCCTA…………..GGAAACTG…………TTTACGT….

AGTGCTA…………..GGTAACTG…………TTGACGT….

7500 bp

= 3/7500 = 1/2500

Diversité de séquence des gènes humains

_______________________________________________________________Nb Nb Pop Codant Syn Non Non

gènes SNPs syn codant_______________________________________________________________

Halushka (1999) 75 726 Européens 4.5 9.0 3.1 5.4

Africains 6.3 12.9 4.2 6.8

Cargill (1999) 106 560 Européens 5.6 9.8 3.7 4.9

Onishi (2000) 41 187 Japonais 2.4 1.2 1.2 4.3

Tiret (2001) 50 228 Européens 3.0 5.6 2.3 4.3___________________________________________________________________________

Mutations des séquences non codantes plus fréquentes que sur les séquences codantes

Dans séquences codantes :silencieuses plus fréquentes que non silencieuses

Notion de marqueurs en génétique : Le génotype

•Le marqueur génétique sert à repérer ou identifier un chromosome ou un allèle transmis

• Définissent le génotype (constitution génétique d’un individu) qui inclut les allèles d’un seul locus où de l’ensemble des locus, selon les cas

• Marqueurs génotypiques :

• variations identifiables et connues de la séquence du génome

• de localisation connue

• d’informativité connue

• codominants : les 2 allèles sont détectables chez les hétérozygotes

Marqueurs génétiques 2

• est caractérisé par des allèles correspondant à chaque variation possible de la séquence

• degré d’hétérozygotie d’un marqueur H=1 – (pi2)

• Fonction du nombre et de la fréquence de chacun des allèles

• Exemple : 3 allèles de fréquence 0,2 / 0,3 / 0,5

Hétérozygotie est de 1- (0,04+0,09 + 0,25) = 0,62

2 allèles de fréquence 0,2 / 0,8 : 1- (0,04 + 0,64)= 0,32

Un marqueur biallèlique ne pourra pas avoir une hétérozygotie supérieure à 0,5 qui sera atteinte en cas d’allèles de fréquence égale.

Les différentes types de marqueurs :

SNP : single nucleotide polymorphism

= substitution simple de nucleotide

VNTR = variable number of tandem repeats (nombre variable de répétitions en tandem) regroupent les ministallites et les microsatellites

Minisatellite : répétitions en tandem de motifs de 11 à 16 paires de base en moyenne, parfois plus longs.

: répétitives, disséminées (à l’exception des chromosomes X et Y),

: hyperpolymorphes : hétérozygotie élevée

Exemples de Single Nucleotide Polymorphisms : SNP

VNTR : variable number of tandem repeat

Répétitions en tandem d’unité élémentaire

MicrosatelliteMononucléotideDinucléotideTri ou tetra nucléotide

Minisatellite12-15 nucléotide

Variation du nombre n de répétitionsMise en évidence

- Par PCR- Par hybridation avec sondes

Minisatellites : taille variable de la répétition

- Explorés par technique de southern

- sonde monolocus spécifique d’un VNTR donné

- sonde multilocus : séquence commune à différents minisatellites dans le génome : image complexe

- hétérozygotie supérieure à 90 %

Minisatellites associés à certaines maladies

- Diabète : minisatellite en 5’ du gène de l’insuline

- tr du comportement VNTR 48 bp du DRD4

Minisatellite : Hybridation avec une sonde multilocus

Les microsatellites

- Répétition de motifs de 1 à 4 nucléotides

- Le plus fréquent et le plus utilisé : dinucléotide (CA)/(GT) : réparti sur tout le génome, très informatif.

- méthode de génotypage : amplification et séquençage du produit de PCR

- Hétérozygosité souvent supérieure à 70%

- permet de rechercher l’instabilité des microsatellites dans les tumeurs : caractère acquis (somatique) dû à une anomalie du sytème de réparation des mésappariements de l’ADN

- Exemple BAT25, BAT26, BAT40 : mononucléotide

Perte d’allèlesMultiplexage

Séquence d’un microsatellite

Instabilité

SNP (RFLP)

VNTR (Minisat) Variable Number

of Tandem Repeats

STR (Microsat) Short Tandem Repeats

Polymorphisme

de substitution

de répétition

> 10 nucléotides

de répétition

1 à 5 nucléotides

Marqueur génétique

Biallélique

Multiallélique

Multiallélique

Informativité

+

+++

+++

Détection Southern PCR

(hybridation, RFLP)

PCR Southern

PCR uniquement

Empreinte Génétique

Profil génétique très spécifique d’un individu obtenu grace à une combinaison de marqueurs de type VNTR tres informatifs, principalement les minisatellites, ou en associant plusieurs microsatellites.

Intérêt en médecine légale

Nécessite de l’ADN en qualité et en quantité suffisante au moins pour l’amplification par PCR.

Définition de l’haplotype

Un haplotype est constitué par plusieurs génotypes , c’est à dire une succession d’allèles sur plusieurs marqueurs identifiés sur le même chromosome (en cis) et dont on connaît l’ordre

• Suppose de connaître la localisation précise de chaque marqueur

• Suppose de connaître la phase, c’est à dire le chromosome sur lequel se situe les allèles de chaque génotype

La détermination de l’ordre des marqueurs sur un haplotype se fait

• Par cartographie physique : placement des marqueurs au sein d’un segment de chromosome dont on connaît la séquence (depuis 2002)

• séquençage de grands fragments chevauchants et placement des marqueurs sur le chromosome

• Par cartographie génétique en examinant ces marqueurs dans plusieurs meïoses dans des études familiales

Les haplotypes ne sont pas toujours conservés d’une génération à l’autre. On peut observer dans la descendance :

- Les haplotypes parentaux

- Haplotypes recombinés dus à recombinaison méiotique

Fig. 1. Linkage of PHAII to the telomere of 12p in K22. (A) The structure of PHAII kindred K22. Affected, unaffected, and deceased individuals of unknown phenotype are shown as filled, unfilled, and shaded symbols, respectively. Genotypes at loci from the telomeric segment of chromosome 12p are shown in their chromosomal order with the telomere at the top; estimated genetic distances between adjacent loci (in cM) are shown. The boxed haplotype cosegregates with the disease. Two independent recombination events in affected individuals define the location of the disease gene to the most telomeric 2-cM segment. In addition, four loci within this segment demonstrate hemizygosity in affected kindred members; the inferred null alleles are denoted as "0." Genotypes that unambiguously demonstrate absence of transmission of an allele from affected parent to affected offspring are indicated by asterisks. (B) Multipoint lod score for linkage of PHAII to 12p in K22. The map of marker loci used in the multipoint analysis is shown at the top of the figure, and the 1000:1 support interval for the PHAIIC locus is indicated by the thick bar.

Exemples d’haplotypes

La méiose : triple finalité

Elle assure

- La transmission de l’information génétique d’une génération à la suivante

- La réduction du nombre de chromosomes de 2n (diploïde) à n (haploïde) . La reconstitution de 2n se fait lors de la fécondation

- Elle assure le brassage de l’information génétique qui aboutit à la diversité des individus de la même espèce

Le brassage de l’information génétique

Deux mécanismes lors de la première division méiotique

-Par le mécanisme de la ségrégation au hasard lors de l’anaphase de la 1ère division méiotique :

- n paires de Chr homologues : 2 n = le Nombre de combinaisons chromosomiques possibles par la répartition au hasard des chr.

- Chez l’homme n=23 donc 223 = 8,4 x 106 types de gamètes différents

- Par la recombinaison génétique

- crossing-over impliquant la cassure des doubles hélices paternelles et maternelles sur des points homologues

Les recombinaisons méiotiques-Ont lieu lors de la prophase de la première division méiotique, au stade pachytène.

- Chaque paire de chr homologue est appariée

- Chaque chr est dupliqué et formé de 2 chromatides sœurs (chaque chromatide est formée d’une double hélice)

- Constituent une tétrade

- Recombinaison génétique : les 4 chromatides peuvent être impliquées dans les échanges

- Au stade diplotène, les chromatides non sœurs sont reliés par les chiasmas traduisant sur le plan cytogénétique le crossing-over

La recombinaison homologue – mécanismes généraux 1

Recombinaison générale : entre 2 régions homologues mais pas identiques

-Soit lors d’une cassure accidentielle de l’ADN

-Soit lors de la Méiose

Modèle de Holliday : cassure simple-brin symétrique

Pas forcément le bon modèle mais distingue les étapes :

- Molécules de DNA appariées

- Formations de brèche sur la séquence d’ADN

- Invasion du brin

- Ligation et migration de la jointure recombinante

- Résolution : recombinaison ou non recombinaison

Liaison Génétique 1

Si 2 marqueurs sur 2 chromosomes différents : transmission indépendante des allèles

Si 2 marqueurs proches sur le même chromosome allèles tendent à être transmis ensemble et non de façon indépendante : liaison génétique

Conséquences : les allèles de marqueurs situés sur des loci génétiquement liés auront tendance à être transmis dans la même combinaison que chez les parents : conservation des haplotypes parentaux

Méiose

réassortis

Liaison Génétique 2

Les échanges dus au crossing-over sont strictement réciproques

La fréquence de recombinaison dépend de la localisation relative des deux gènes sur le chromosome : plus l’intervalle qui sépare les 2 gènes est grand, plus grande est la probabilité pour qu’un crossing-over s’effectue dans cet intervalle.

La fréquence de recombinaisonest une mesure de la distance génétique entre les 2 gènes

L’unité génétique est le centimorgan cM

Liaison Génétique 3

Additivité des distances

Soit 3 gènes liés A, B, C. Par croisement on observe le bombre de recombinants entre les 3 gènes. On obtient les distances entre chaque couple de gènes : distance additive

La fréquence des remaniements sur l’intervalle total est égale à la somme des fréquences des remaniements sur les deux intervalles adjacents définis par les locus des 3 gènes

1 seul ordre possible

Limitation de l’additivité : les doubles crossing-over

Sous-estimation des distances car plusieurs crossing-over intéressent la même chromatide, d’autant plus grande que la distance est grande

La répulsion : 1 chiasma (crossing-over) éloigne la survenue du suivant

Recombinaisons haplotypiques

Crossing-over et double crossing-over

Notions de distance physique et de distance génétique II

Distance Génétique déduite des recombinaisons observées entre 2 marqueurs polymorphes : exprimée en Morgan

En supposant que dans un intervalle donné les recombinaisons sont indépendantes les unes des autres , il

existe une relation entre fréquence de recombinaison et

distance génétique , exprimée en cM :

1 cM ~1MB

Il est possible d’ordonner des locus expérimentalement par l’observation des haplotypes recombinants, car les combinaisons issues de 2 évènements de recombinaison sont plus rares que celles provenant d’un seul évènement

Taille du génome humain en distance génétique Chiasmas lors de la méiose chez le sujet masculin : 49 en moyenne aboutissant à 50% de recombinants

Longueur génétique totale : 2450 cM (plutot 2644cM)

Méioses femelles : plus de chiasmas : taille 4481 cM

En moyenne

- 1 cM équivaut à 1,13 Mb chez l’homme et 0,67 Mb chez la femme. Les 2 sexes confondus : 1cM=0,9 Mb.

Fréquence des recombinaisons entre 2 locus

fonction de la distance qui les sépare

A B

A Ba ba b

a b a ba b

A B

A Ba b

a b

a b

a ba b

A b

a B

Les 2 locus sont liés

10+8

77+88+10+8X100 ~9% distance génétique =9cM

Notions de distance physique et de distance génétique I

Distance physique mesurée par les méthodes physiques de mesure de taille de fragments d’ADN clonés dans des vecteurs :

• Méthodes d’analyse : Electrophorèse, southern, champ pulsé pour les fragments supérieurs à 50 kb

• Fragments clonés: hybrides d’irradiation, YAC, BAC, plasmides :

• Notion de contig : chevauchement de fragments clonés, première étape pour le séquençage d’un génome

Principe des contigs et des STS ancrés

Conséquences génomiques de la recombinaison méiotique

-Le brassage génétique : modification des assortiments d’allèles en cis

- La recombinaison entre allèles peut se traduire par leur modification par conversion génique au sein d’un hétéroduplex

- L’augmentation du nombre de copies de gènes répétés lors d’une recombinaison inégale

- L’élimination d’un gène défectueux dans les familles de gènes répétés.

- Evènements rares et pathologiques : lésions de l’ADN dues à la recombinaison : délétions, insertions, remaniements chromosomiques (changement dans la régulation, ou dans la structure)

Applications des outils de la génétique moléculaire I

Analyse de liaison génétique :

But : mettre en évidence une liaison génétique entre un marqueur génétique (de localisation connue) et le locus de la maladie (inconnu)

Type d’études : familiales

Marqueur : très informatif : microsatellite

Type d’analyse : analyse paramétrique avec modèle de la maladie

Liaison testée par méthode de vraisemblance : Lod-score : logarithme ratio vraisemblance hypothèse de liaison sur non liaison.

Principes de la recherche d’une liaison génétique entre un locus morbide autosomique dominant et 2 locus définis par

un SNP

Applications des outils de la génétique moléculaire II

Etudes d’association génétique

Comparaison de fréquence allélique pour un marqueur entre un groupe témoin et un groupe de cas

Non paramétrique (pas de modèle) : tests statistiques : chi2.

On teste le déséquilibre de liaison entre marqueur (connu) et allèle de susceptibilité (inconnu mais très proche)

Peu puissant

Nécessite de grands échantillons

Marqueurs utilisés : SNP

Etudes d’association : comparaison de 2 groupes

1 groupe témoin et 1 groupe patients atteints

Génétique somatique

Concerne les évènements génétiques postérieurs à la formation du zygote, donc restreints à une sous-population cellulaire de l’organisme

Exemples :

Modification artificielle du génome cellulaire par fusion : hybride somatique (outil de laboratoire)

Réarrangement des gènes des immunoglobulines

Mutation somatique : perte d’allèle, inactivation ou activation de gènes

Réarrangement des gènes des immunoglobulines

Système génétique devant permettre la synthèse d’au moins plusieurs millions de molécules différentes qui forment les immunoglobulines Partie constante (invariable), et une partie variable qui reconnaît l’antigène (épitope ou motif de l’antigène) Ig : parties constantes différentes et variables identiques : switch des IgM aux IgG Mémoire pour la réactivation de la synthèse d’immunoglobulines Un seul type d’anticorps par cellule : exclusion allèlique malgré 2 chromosomes

Gènes sur le chromosome 2 Nécessitent 1/Gène V (variable=300), 2/gène J (jonction=5), 3/ gène C (constant=1) Séquence leader devant chaque gène V codant pour le peptide signal permettant la secrétion La formation d’un gène kappa fonctionnel pendant la maturation du lymphocyte pre-B résulte d’une recombinaison entre l’extrêmité 3’ d’un gène V et un gène J: disparition de quelques centaines de Kb : réarrangement. Persistance d’un intron de 2 à 3 kb : épissé lors de la maturation du mRNA La recombinaison s’effectue grâce au complexe heptamère-nonamère par RAG-1 et RGA-2

Le modèle des chaînes légères kappa

Structure d’une immunoglobuline :

chaîne lourde et légère

Réarrangement somatique des gènes de chaîne légère d’immunoglobuline

Pathologie de l’ADN 1MACROLESIONS

Les recombinaisons entraînent Délétion ou Duplication de grande taille (100 bp à qq millions de bp)

- Lors d’une recombinaison homologue crossing-over méiotique inégal

- ou à un échange entre 2 chromatides sœurs

Favorisée par la présence de séquences répétées

- ou lors d’une recombinaison non homologue

Translocations entraînent des fusions en orientation directe ou inversée (cassure et déplacement d’un Chr vers un autre Chr)

Conversion génique : correction d’un brin de DNA par son partenaire dans un hétéroduplex non parfaitement complémentaire. Entre séquences alléliques ou consécutives

Conversion génique par correction d’hétéroduplex

Mismatch sur l’hétéroduplex

Recombinaison inégale

Contiguité de gènes très semblables : recombinaison inégale ou conversion génique

Pathologie de l’ADN 2LESIONS A L’ECHELLE NUCLEOTIDIQUE

Petites délétions : 1 à 10 paires de base

- dépurination

- dérapage réplicatif : polymorphisme des microsatellites

Substitutions

- Désamination d’une cytosine méthylée

: Cytosine en Uracile

- Erreur de réplication ou de réparation

DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS

. PONCTUELLES: - mutations silencieuses - mutations conservatrices - mutations faux sens

. AVEC DECALAGE DU CADRE DE LECTURE insertion ou délétion

. INSTABLES

A

C T

G

Transition

Transversion

AUG GCC UCU AAC CAU GGCMet Ala Ser Asn His Gly

AUG CUC UAAMet Leu STOP

Pathologie de l’ADN 3

Lésions intermédiaires

Délétion exonique : taille variable QQ dizaines à QQ centaines de paires de base

Expansions de triplets riches en GC : mutations dynamiques

mécanisme à l’origine de nombreuses maladies génétique

- X fragile, maladie de Steinert, Huntington,

- Expansion à partir d’une taille limite

Maladies liées à l’expansion d’une répétition de trinucléotides

Atrophie musculaire spinobulbaire (maladie de kennedy)

Synrome de l ’X fragile (FRAXA et FRAXE)

Dystrophie myotonique (maladie de Steinert)

Chorée de Huntington

Ataxie spinocerebelleuse de type I

Atrophie dentatorubrale et pallidoluysienne

Dystrophie myotonique de Steinert

Myopathie héréditaire de l ’adulte la plus fréquente : 1/8000

Signes musculaires, signes cardiaques, cataracte, calvitie

Expressivité variable + phénomène d’anticipation (aggravation de génération en génération)

Forme adulte et forme congénitale : hypotonie néonatale

98% des cas : Due à expansion de triplets (CTG)n dans région 3 ’ non traduite de DM protéine kinase

Taille normale : 5 à 35 CTG

50 à 100 : signes minimes

formes congénitales : > 500 répétitions

Autre gène : locus ZNF9 : expansion CCTG

Maladie de Steinert de type 1:

Expansion de CTG (de 38 à >100) dans région 3 ’ non traduite du dernier exon

Perturbation de l ’expression de DMWD et de SIX 5 (chromatine) : arrythmies et cataractes

Toxicité de RNA DMPK : Dystrophie Myotonique (liaison RNA-BP)

Perturbation du processing du messager DMPK

Conséquences des mutations sur le fonctionnement du gène- Délétion plus ou moins complète du gène

- Expression et régulation du gène

- Epissage du gène

- Altération de la phase de lecture : troncature par codon stop prématuré

- Codon stop, mutation du codon stop, codon initiateur

- Codon faux-sens : interaction, adressage, fonction catalytique, modification post-traductionnelle

Dominant

Gène surnuméraire

Gène toxique

Gène activé (oncogène, récepteur)

Gain de fonction Perte de fonction

Dominant

Haplo-insuffisance

Dominant négatif

Récessif

Perte de fonction

Grands types d’anomalies fonctionnelles des gènes

Maladies liées à l’expansion d’une répétition de trinucléotides

Atrophie musculaire spinobulbaire (maladie de kennedy)

Synrome de l ’X fragile (FRAXA et FRAXE)

Dystrophie myotonique (maladie de Steinert)

Chorée de Huntington

Ataxie spinocerebelleuse de type I

Atrophie dentatorubrale et pallidoluysienne

Dystrophie myotonique de Steinert

Myopathie héréditaire de l ’adulte la plus fréquente : 1/8000

Signes musculaires, signes cardiaques, cataracte, calvitie

Expressivité variable + phénomène d’anticipation (aggravation de génération en génération)

Forme adulte et forme congénitale : hypotonie néonatale

98% des cas : Due à expansion de triplets (CTG)n dans région 3 ’ non traduite de DM protéine kinase

Taille normale : 5 à 35 CTG

50 à 100 : signes minimes

formes congénitales : > 500 répétitions

Autre gène : locus ZNF9 : expansion CCTG

Minisatellite avec sonde P1 et coupure par enzyme de restriction et southern blot. Exemples de tumeurs traitées ou non par l’acide ocaidique.

RECHERCHE DE MUTATIONS

GèneRégions flanquantes 5'

Régions flanquantes 3'

-100 -70 -30 1

Modification quantitative de l'expression

ATG STOP

AATAAA

Faux-sens, Non sens, Isosémantique, Délétion, Insertion

Epissage: absence, sites 5' ou 3' alternatifs

Anomalie de l'initiation de la traduction

Protéine allongée

polyadénylation