Presentation Doubs Saprolegnia Parasitica

Clonalité de Saprolegnia parasitica, le parasite des poissons du Doubs

Christophe Paul, Lassaâd Belbahri

Contexte

Introduction

� Mortalité importante de poissons dans le bassin du Doubs� Touche les ombres et les truites� Taches blanches (mycoses)

� Confusion sur les causes de cette mortalité� Une saprolegniose est évoquée…

La saprolegniose ? Oui mais…

Introduction

� Saprolegnia spp. présent naturellement dans les cours d’eau� Généralement infection secondaire� Ne touche que des poissons affaiblis

� Pourquoi un taux de mortalité si élevé ???� Pourquoi maintenant ???

� Analyses préliminaires� Prélèvements sur un ombre malade� Mise en culture� «ADN Barcoding» (ITS)

Thierry Arnet

Saprolegnia parasitica s.l.

Introduction

� Oomycète du genre Saprolegnia

� Complexe S. diclina / S. parasitica / S. salmonis(Saprolegnia parasitica s.l.)

� Complexe d’espèces mal définies

� Certaines souches sont très virulentes: si le nb de spores est élevé (Hussein, 2002) :

� Taux de mortalité pour les truites arc-en-ciel (Salmo gairdneri) : 100%

� Taux de mortalité pour les truites brunes (Salmo trutta) : 90-100%

Les sites

Introduction

Le Doubs

� Franco-suisse� Sous-affluent du

Rhône

La Loue

� Résurgence et affluent du Doubs (fr)

2 rivières connectées

Dès 2009 :

Loue

Les sites

Introduction

Le Doubs

� Franco-suisse� Sous-affluent du

Rhône

La Loue

� Résurgence et affluent du Doubs (fr)

La Sorne

� Suisse� Sous-affluent du Rhin

DECONNECTEE DU DOUBS!!

2 rivières connectées

Dès 2009 :

En 2011 :Doubs

Sorne

Projet (OFEV)

Introduction

� Identification du pathogène (18S et ITS)

� Même pathogène pour tous les individus malades ? Espèces?� Liste des espèces sensibles: hôtes?

� Diversité génétique / clonalité (MLST)

� Pathogène résident vs Introduction� Origine du pathogène ?

MLST: MultiLocus Sequence Typing

Matériel et méthodes

� Analyse de la diversité génétique

� Caractérisation d’isolats (bactéries ou eucaryotes) par l’utilisation deséquences d’ADN de plusieurs gènes de ménage (housekeeping genes)

� Fragments internes de 450-500 pb pour chaque gène

� Pour chaque locus (gène), les différentes séquences déterminent des allèlesdistincts et pour chaque isolat les allèles des différents loci définissent unprofil allélique (sequence type)

MLST: MultiLocus Sequence Typing

Matériel et méthodes

MLST: MultiLocus Sequence Typing

Matériel et méthodes

� 2 gènes nucléaires� Beta tubuline� Facteur d’élongation 1 alpha

� 2 gènes mitochondriaux� NADH déshydrogénase sous-unité 1� Cytochrome C oxydase sous-unité 1

� 1 facteur de virulence� Protéase aspartique

Collection de souches

Matériel et méthodes

Nom code Identif Moléculaire Poisson Date prélèvement l ieu de prélèvement

DoubsblessuresD1 Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus 17.04.11. La roche plate (Chx-de-Fds)D2 Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus 17.04.11. La roche plate (Chx-de-Fds)D3 Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus 17.04.11. La roche plate (Chx-de-Fds)D4 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 26.09.11. Bonaparte (Chx-de-Fds)D5 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 26.09.11. Bonaparte (Chx-de-Fds)D6 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 12.05.11. Goumois

LoueP1 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 08.08.11. OrnansP2 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP3 Saprolegnia sp. Salmo trutta 25.11.11. OrnansP4 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP5 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP6 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP7 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP8 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP9 Saprolegnia parasitica Barbatula barbatula 25.11.11. Ornans

SorneT1 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT5 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT7 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT8 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT10 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. Delémont

baiting (Doubs)S1.2 Saprolegnia sp 01.06.11. La Goule (Le Noirmont)S2.2 Saprolegnia sp 01.06.11. Goumois

22 souches

2 types de prélèvements:

� Blessures des poissons malades

� «Baiting» (eau de la rivière)

3 hôtes:

� Ombres (Thymallus thymallus)

� Truites fario (Salmo trutta)

� Loche (Barbatula barbatula)

18S: Saprolegniales

Résultats & Discussion

Saprolegnia spp.

Saprolegnia spp.

Outgroup

18S: Saprolegniales

Résultats & Discussion

Isolats répartis en 2 groupes :

� S. parasitica:

19x blessure

� Saprolegnia sp.

1x blessure 2x éch. d’eau

Saprolegnia spp.

Saprolegnia spp.

Outgroup

18S: Saprolegniales

Résultats & Discussion

Isolats répartis en 2 groupes :

� S. parasitica:

19x blessure

� Saprolegnia sp.

1x blessure 2x éch. d’eau

Saprolegnia spp.

Saprolegnia spp.

Outgroup

� toutes les S. parasiticane correspondent pas à«notre» souche

� genre Saprolegniaparaphylétique

Bases de données fiables ???

ITS: Saprolegnia spp.

Résultats & Discussion

Outgroup

Saprolegnia parasitica s.l.

ITS: Saprolegnia spp.

Résultats & Discussion

Isolats répartis en 2 groupes (=18S):

� Complexe S. parasitica s.l.

� Saprolegnia sp.

Outgroup

Saprolegnia parasitica s.l.

18S & ITS

Résultats & Discussion

� 2 populations distinctes de Saprolegnia sont présentes

� 19/20 prélèvements sur les blessures «donnent» Saprolegniaparasitica s.l. Souche virulente

� Pathogène indépendant des espèces de poissons

� Au moins 3 espèces sensibles de 2 familles différentes

� Manque de fiabilité des bases de données + phylogénie peu claire (confusion entre plusieurs espèces)

MLST: séq. concaténées

Résultats & Discussion

� Mêmes groupes qu’avec ITS et 18S

� Groupe 1: très faible variabilité génétique

� Une exception P6

� Groupe 1 correspond génétiquement à une souche du Japon

Outgroup

Groupe 1

Groupe 2

Groupe 1

MLST : profils alléliques

Résultats & Discussion

Groupe 1

� Seulement 4 types alléliques

� 16 souches sur 19 sont identiques

Beta tubulin

Elongation factor

Cytochrome C oxydase

NADH dehydrogenase

Type

D1 1 1 1 1 1

D2 1 1 1 1 1

D3 1 1 1 n/a 1

D4 1 1 1 1 1

D5 1 1 1 n/a 1

D6 1 1 1 n/a 1

P1 1 1 1 1 1

P2 1 1 1 1 1

P4 1 1 1 1 1

P5 1 1 1 1 1

P6 2 2 2 1 2

P7 1 1 1 2 3

P8 1 1 1 3 4

P9 1 1 1 1 1

T1 1 1 1 1 1

T5 1 1 1 1 1

T7 1 1 1 1 1

T8 1 1 1 1 1

T10 1 1 1 1 1

2 populations de Saprolegnia distinctes

Résultats & Discussion

� 1 souche résidente

� Saprolegnia sp.� Grande variabilité génétique� 1 seule isolation à partir de poisson malade� Isolée à partir d’eau de la rivière

� 1 souche pathogène

� Saprolegnia parasitica s.l.� Très faible variabilité génétique = population clonale� Uniquement isolée à partir de poissons malades� D’après MLST, correspond génétiquement à une souche du Japon…

MAIS…

� Pas possible d’établir clairement l’origine de la souche de S. parasitica s.l. du Doubs

� Trop peu de données disponibles

� Seulement 2/4 gènes séquencés pour la souche du Japon

� 4 gènes séquencés pour 1 seule souche de S. parasitica

� Pour les autres souches de S. parasitica, pas ou peu de données concernant les gènes utilisés

� Nécessité de commander les souches disponibles pour un séquençage avec nos primers

Résultats & Discussion

En plus…

Résultats & Discussion

� De nombreux sites sont «ambigus» (hétérozygote)

� 2 bases possibles pour un même site� Séquences différentes sur les 2 chromosomes

� Suggère une reproduction sexuée ou une hybridation

Conclusions

� Saprolegnia parasitica s.l. est toujours présente et active cette année (automne 2011) dans le Doubs et la Loue

� Au moins 3 espèces de poissons sensibles de 2 familles différentes

� S. parasitica s.l. s’est étendue à une rivière non connectée au Doubs

� La population clonale de S. parasitica s.l. suggère une introduction récente dans la région

Perspectives

� Echantillonnage à plus large échelle� Répartition / fréquence� Image plus précise des «génotypes agressifs»� Liste des hôtes possibles

� Déterminer l’origine de la souche pathogène

� Développement d’un test de détection à partir d’échantillons environnementaux (PCR spécifique)

� Séquençage du génome complet de la population clonale

� Eclaircissement de la phylogénie

� Identifier le(s) vecteur(s)

Un vecteur potentiel

Perspectives

� De nombreuses espèces d’écrevisse sont des hôtes potentiels pour les oomycètes

� Saprolegnia parasitica fait partie des parasites identifiés de certaines espècesd’écrevisses (Söderhäll et al., 1991)

� L’introduction d’écrevisses nord-américaines (Procambarus clarkii) en Europe a démontré être à l’origine de la propagation d’Aphanomyces astaci (Aquiloni et al., 2011)

� Découverte en 2005 d’une espèce d’écrevisse nord-américaine (Oronectes juvenilis)dans le Dessoubre , un affluent du Doubs (Chucholl & Daudey, 2008)

� Inquiétant de constater que l’introduction de cette écrevisse pourrait coïncider avec l’apparition de l’épidémie

Remerciements

� L’OFEV pour le financement du projet

� L’office de l’environnement du Jura

� Françoise Pozet, du laboratoire départemental d’analyses du Jura (fr)

� Thomas Wahli, du centre pour la médecine des poissons et des animaux sauvages de l'Université de Berne (FIWI)

� Thierry Arnet

� Edward Mitchell

� Enrique Lara

� Nicole Jeanneret

� Ludovic Roussel-Delif

� Thibaud Goetschi

� Et tous ceux que j’ai oublié…

Merci pour votre attention