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Journée ARL - Yverdon
Thérapie cellulaire en Neuroscience Essai clinique… Dr. Jean-François Brunet 21 mars 2013
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Principe de la thérapie cellulaire: Isoler les cellules souches/progénitrices. Produire les cellules in vitro. Remplacer les cellules déficientes dans un organe ou remplacer un tissu.
3
Cellules souches: Outil thérapeutique Deux possibilités:
- Protection - Régénération
Deux stratégies:
- Stimuler la génèse endogène - Apporter de nouvelles cellules
- De nombreuses voies à explorer
Origine des cellules souches Dès les premiers stades embryonnaires
Morula
Les cellules sont totipotentes
Les cellules souches embryonnaires
Blastula
Les cellules foetales
Cellules souches
dans les tissus adultes
Cellules souches stromales de la moelle osseuse
Cellules souches de la peau
Les cellules pluripotentes induites . iPS Cells
Mise en culture de cellules du donneur (Fibroblaste)
Transfection de gènes par rétrovirus
Gènes de pluripotence : - Oct-3/4, SOX2, c-Myc, and Klf4 - OCT4, SOX2, NANOG and LIN28
Sélection des cellules transfectées
Sélection des ES-like Cells (embryonic stem-like cells)
Système Nerveux Central (SNC) Le cerveau, la moelle épinière
En Neuroscience:
Capacité de régénérescence limitée
neurodégénérescence
régénérescence
Deierborg et al, Prog Neurobiol, 2008
D.E. Redmond The Neuroscientist 2002 J Bloch Neurosurgery Quarterly 2001
Greffe de tissus foetaux
• Via mini-pumps • Via ex vivo or in vivo gene therapy
! Capsules ! Virus
Libération de facteurs.
Où prendre les cellules?
- Cellules de Schwann - Cellules des glandes
surrénales - Fibroblastes
- Cellules épithéliales
Greffes autologues pour les lésions du système nerveux central
Transplantation autologue.
In vitro brain cells
Re-implantation 3. Cell labelling
4. Re-implantation
2. culture
1. Cortical biopsy
Lésion du cortex moteur!
In vitro brain cells
3. Cell labelling
4. Re-implantation
2. culture
1. Cortical biopsy
Brunet et al, Laboratory investigation, 2002 Cryobiology, 2003 Experimental Neurology, 2005 Cell transplantation, 2009
Modèle MPTP, Parkinson!
Culture de cellules cérébrales adultes
Dissection Cortex
Substance blanche Substance grise
Arsenijevic et al, Exp Neurol , 2001 Brunet et al, Lab invest. 2002 Brunet et al, Cryobiology, 2003
Dissociation mécanique
Fragmentation (≈ 1 mm3)
Primoculture Cryopréservation
A partir de biopsies corticales:
1 cm
Cellules cérébrales adultes in vitro (même résultats à partir d’une biopsie corticale chez l’homme ou le singe)
GFAP Vim
GFAP Vim
Des astrocytes entourant des cellules progénitrices neurales
1 cm
DCX GFAP
Modèle de lésion corticale: Macaca fascicularis
!
!
Etape 1 : Jour 0
Biopsie corticale (lobe préfrontal)
PKH67
Etape 3 : jour 35 ou 70
Marquage avec l’intercalant membranaire fluorescent
PKH67 ou PKH26
culture Etape 2 : jour 15 ou 30
Injection d’acide iboténique
(cortex moteur gauche)
PKH26
Etape 4 : 4-6 mois post-réimplantation
Ré-implantation Entre 250 000 et 300 000 cellules
90 jours post ré-implantation Pas de détection des cellules PKH67 (injectées en controlatérale) Les cellules PKH26 migrent jusqu ’à occuper toute la zone lésée…
8 m
m
Acide iboténique Implantation
1
1
2
2
3 3
A B
C
A : PHK26 MAP2 B : PKH 26 C : MAP 2
Brunet et al, Exp Neurol, 2005
Les cellules PKH26 expriment le marqueur neuronal MAP2…
��
�"./.�!"�!"3/7-%/7�)�*0"(("��
Après lésion
Récupération naturelle
Test de dexterité
Après ré-implantation
Kaeser M et al, Neurosurgery, 2010 http://www.unifr.ch/neuro/rouiller/ACCI/videos.htm
Double-plateau of recovery only observed in
re-implanted monkeys.
Motor cortex lesion!
Singe non traité
Singe ré-implanté
Présence des cellules ré-implantées dans les structures corticales lésées et leur différenciation en neurones
Low$dose(MPTP((asymptoma2c(parkinsonian(model)(
High$dose(MPTP((symptoma2c(parkinsonian(model)(
4((individuals(
1.(Cor2cal(biopsy((prefrontal(right(lobe)(
Cell(culture(
MPTP treatment in Chlorocebus aethiops
Day(0(1.2mg/kg/12h(i.m(
Total(dose(3.6mg/kg!
Day(15(0.4mg/kg/12h(i.m(
Total(dose(1.2mg/kg(2.(MPTP(treatment(
!JF!Brunet,!DE!Redmond,!J!Bloch,!2009!in!press,!Cell!transplanta<on!
7((individuals(
Day(0( Day(40(
3.(Reimplanta2on(
Cell$labeling$with$viable$
fluorescent$dye$
PKH67(
Control(medium(
!JF!Brunet,!DE!Redmond,!J!Bloch,!2009!in!press,!Cell!transplanta<on!
4(with(viable(cells(
3(with(killed(cells((control)(
Day(35( Day(80(
Cell replacement in Chlorocebus aethiops
Low(dose(MPTP((asymptoma2c(parkinsonian(model)(
High(dose(MPTP((symptoma2c(parkinsonian(model)(
4.(Behavioral(assessment((
(5.(Necropsy((
Day(120$220(
4.(Necropsy((
3(months(aRer(reimplanta2on(
Map3D reconstruction Explora Nova 60 to 70% of cell survival
Ct N Ct MPTP Reimplanted
Ros
tral
sec
tion
Cau
dal s
ectio
n
!JF!Brunet,!DE!Redmond,!J!Bloch2009!in!press,!Cell!transplanta<on!
0!
1000!
2000!
3000!
4000!
5000!
6000!
7000!
Ct(N((n=2)(
Ct(MPTP((n=2)(
Reimplanted((n=4)!
Right SN!
Left SN!
p<!0.05! p<!0.01!
p<!0.05!
TH$posi2ve
neu
rone
s!
MPTP LD results
Normal
MPTP
MPTP reimplanted
Ct(N((n=2)(
Ct(MPTP((n=2)(
Reimplanted((n=4)(
TH In
tensity
in H
Cd!
0.00!0.50!1.00!1.50!2.00!2.50!3.00!3.50!
***!***!
*!**! Right HCd!
Left HCd!
�����%*/"*.%/4�
Step 1 : Day 0 High-Dose MPTP treatment
1.2mg/kg/12h i.m. Total dose 3.6mg/kg (symptomatic parkinsonian model)
Step 3 : Day 80 Reimplantation
Cell labeling with viable fluorescent
dye
HIGH DOSE MPTP Model!in 7 Chlorocebus aethiops (St Kitts green monkey)!
Cell culture
Step 4 : Behavioral assessment Step 5: Day 120-220 Necropsy
4 viable cells 3 controls, killed cells
Step 2 : Day 40 Cortical biopsy
(prefrontal right lobe)
Three others present no change or increase of their Parkinsonian score
Four monkeys present a significant decrease of their Parkinsonian score
MPTP: MPTP treatment
Re.: re-implantation
Necropsy
B: biopsy of prefrontal cortical cortex
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
MPTP Re. Necropsy -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25
Y135
P<0.0001
P<0.0001
B
PK sc
ore
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25 P<0.0001
NS
Y140
MPTP Re. Necropsy B
PK sc
ore
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25
Y172 P<0.02 P<0.0001
MPTP Re. Necropsy B
PK sc
ore
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25
Y181 P<0.0001
P<0.001
MPTP Re. Necropsy B
PK sc
ore
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25 P<0.0001
NS (+) worse P<0.0509
Y222
MPTP Re. Necropsy B
PK sc
ore
PK sc
ore
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25
Y234
P<0.0015 P<0.0001
MPTP Re. Necropsy B
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 -20 -60 -100 -80 -120 -40
0
25
50
75
100
125
-25
Y249
P<0.0001
Worse P<0.008
MPTP Re. Necropsy B
PK sc
ore
Perspectives : Limiter le nombre de cellules transplantées Contrôler le phénotype des cellules transplantées Utiliser les cellules souches en complément à d’autres approches (neuroprotection ou thérapie génique). L’important demeurant encore d’évaluer le réel impact thérapeutique de ces transplantations ou ces thérapies cellulaires.
Supported by !FNRS (3100AO-103924 to JB, JFB & ER),!
Fondation LEENAARDS,!ZWAHLEN Funds!
Groupe de Recherche Neurochirurgicale Département des Neurosciences cliniques
J. Bloch, M.D J-F. Brunet, Ph.D
YALE UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE!
Department of Psychiatry and Neurosurgery
New Haven CT - USA
D.E. Redmond, M.D-Ph.D
UNIVERSITE!DE!FRIBOURG!
Institut de Physiologie Faculté de Médecine
Eric Rouiller, Ph.D Thierry wannier, Ph.D
Mélanie Kaeser, Ph.D Arnaud Baylon
Laurence Grollimund Catherine Pythoud
UNIVERSITE!DE!LAUSANNE!
33
Chaque promoteur d’essai clinique conserve son leadership académique dans sa spécialité.
Production cellulaire GMP
BUT(Du(laboratoire(au(pa2ent(
(Applica2ons(en(thérapie(cellulaire
34
Pertinence préclinique
Comité éthique institutionnel
Groupe d’essai clinique Cliniciens, Investigateurs Économistes Juristes
Swissmedic
Production GMP
Essai clinique Phase I
35
" Trois centres de Grands Brûles en Suisse
- Suisse Romande:
- Suisse Alémanique: " Un seul laboratoire de culture d’épidermes
- le laboratoire des greffes cutanées CPR8, CHUV
36
Déjà en clinique Soins aux Grands Brûlés:
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37
38
Le CPC doit répondre aux exigences des BPF Bonnes pratiques de fabrication.
« Écrire ce qui doit être fait, Faire ce qui est écrit, Écrire ce qui est fait ».
Implémentation d’un système qualité s’appuie sur la certification ISO 9001 de la direction du DL
Poursuite du projet pour l’installation à EPCR
Mise en place d’un système qualité:
39
Satis
fact
ion
clie
nts
Dem
ande
urs
GOUVERNANCE
Gestion des risques
Relations Interfaces Réglementation Gestion de
projets Revue de direction
Prestations
Transposition Production Contrôle
RESSOURCES ET SOUTIEN Gestion
documentaire
Infrastructures, équipements,
consommables Système d’information
Ressources humaines
Finances
Gestion des
déviations et
des non-conformités
Audits
Enquêtes
Structure GMP exigées par Swissmedic
40
Production
Service clinique
Chef de Production
Personnel production
Conseil scientifique
Unité des affaires juridiques
Swissmedic
Commission d’éthique
Responsable thérapie cellulaire
DL (PHA, …)
LOH (SPH, TCA, …)
Contrôle qualité
Responsable QC
Personnel QC
DCILM (STER, MPH,…)
CIT (CVS, GMAO,…)
Directeur CPC
DSI
CPC
Réseau de compétence CHUV en relation avec les activités CPC
Locaux CPC dans le futur… proche Locaux EPCR22 (Epalinges
Croisette 22):
41
42
Equipement principal: Le premier isolateur : betamodule .
Service ou Département Clinique
Comité d’Ethique
En(résumé(Applica2ons(en(thérapie(cellulaire
Responsable Thérapie cellulaire
Centre de Recherche
Clinique
Centre de Production Cellulaire
43
Merci Laurent WASELLE Fahd AZZABI
Isabelle SENECHAUD Juliette REDA Florence DUBUGNON
EPCR22
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