TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE. 2 Moyens de communication de la cellule avec...

TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

2

Moyens de communication de la cellule avec l'environnement

• Procaryotes– Tout passe par la membrane

plasmique

• Eucaryotes– Endocytose

• milieu extra cellulaire lysosomes digestion métabolites dans le cytosol

– Exocytose : voie sécrétoire• synthèse de nouvelles molécules

compartiments surface

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Fig 13-1• Les voies

endocytaire et sécrétoire– voie endocytaire– voie sécrétoire– voies de retour

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La lumière

• Espace compris à l'intérieur d'un compartiment limité par une membrane

• Topologiquement toutes équivalentes entre elles et avec l'espace extra cellulaire

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Rôle de la voie endo/exo-cytaire

• Modification des molécules qui seront sécrétées vers l'extérieur

• Connections (indirecte) de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique

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Topologie des membranes

• Les lumières sont équivalentes• Le transport se fait par vésicules

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Le cargo

• Molécule luminale ou membranaire qui est transportée par la vésicule

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Fig 13-2Fusion des feuillets bleus

Fusion des feuillets rouges

Transport vésiculaire• maintien de l'asymétrie de la membrane• pas de membrane à traverser pour les

molécules solubles

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Fig 13-3

Voie sécrétrice

Voie endocytaireRecirculationGolgi REEndos tardif Golgi

Endos précoce membrane

• Compartiments intracellulaires impliqués dans les voies endo/exo-cytaires

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Équilibre entre les compartiments

• Entrées = sorties• Pour les membranes et pour les

cargos • Un aller un retour• Sélectivité

– Des cargos transportés– Des destinations

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TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

I. Les mécanismes moléculaires du transport par membrane et le maintien de la diversité des compartiments

II. Transport à partir du réticulum endoplasmique à travers le Golgi

III. Transport du TGN vers les lysosomesIV. Transport de la membrane plasmique vers

l'intérieur de la cellule : endocytoseV. Transport du TGN vers l'extérieur de la

cellule : exocytose

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TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA CELLULAIRE

I - Les mécanismes moléculaires du transport membranaire et le maintien de la diversité des compartiments

• Phénomènes de bourgeonnement et fusion

• Maintien des différences entre les compartiments

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Problème

• Échange permanent entre les compartiments mélange des molécules tous les compartiments finiront pas être identiques

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La solution

• Marqueurs moléculaires exprimés à la surface cytosolique des membranes

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Méthodes d'approche

• Systèmes sans cellules• Protéines de fusion avec la GFP• Génétique

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Systèmes sans cellules

• Population donneuse– cellules mutantes qui n'ont pas N-acétylglucosamine transférase I– infectées par un virus (donc glycoprotéine virale présente)– pas de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine

• Golgi accepteur– possède N-acétylglucosamine transférase I (type sauvage)– non infecté par le virus donc pas de glycoprotéine virale

• Mélange des deux– présence de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine

• Il a fallu qu'il y ait transport

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Protéines de fusion avec la GFP

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Génétique• Protéines

thermosensibles codées par des mutants

• Phénomène de suppression multicopies

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Éléments d'approche

1. Les types de vésicules2. Assemblage du manteau (les

GTPases)3. Guidage du transport (les SNARE)4. Amarrage (protéines Rab)5. Fusion

20

Éléments d'approche

1. Les types de vésicules2. Assemblage du manteau (les

GTPases)3. Guidage du transport (les SNARE)4. Amarrage (protéines Rab)5. Fusion

21

1 - Les types de vésicules

• Vésicules recouvertes sur leur face cytosolique

• Bourgeonnement• Perte du manteau• Fusion des membranes

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Les deux rôles du manteau

• Concentration de protéines membranaires dans un patch qui formera la vésicule permet la sélection des molécules à transporter

• Moule la vésicule qui aura ainsi toujours à peu près la même taille

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Les trois types de manteau des vésicules recouvertes

• Clathrine• COPI• COPII

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Fig 13-4

• Les trois types de manteau des vésicules recouvertes

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Utilisation des différents manteaux dans le trafic

vésiculaire

• Clathrine : à partir du Golgi et à partir de la membrane plasmique– au moins trois types de vésicules à

clathrine

• COPI et COPII : à partir du RE et du Golgi

• Beaucoup d'autres

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Fig 13-5

• Utilisation des différents manteaux dans le traffic vésiculaire

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Éléments d'approche

1. Les types de vésicules2. Assemblage du manteau (les

GTPases)3. Guidage du transport (les SNARE)4. Amarrage (protéines Rab)5. Fusion

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2 - Assemblage du manteau

• a - Exemple : clathrine• Le plus étudié

• (b - COPI et COPII)

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Fig 13-6

• Puits et vésicules recouverts de clathrine en congélation sublimation rapide

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Clathrine

• Une sous-unité de clathrine = – 3 grosses chaînes +– 3 petites chaînes

• Une sous-unité = un triskélion• Assemblage des triskélions en un panier

d'hexagones et pentagones• Triskélions peuvent s'assembler

spontanément en panier même sans membrane

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Fig 13-7

• Manteau de clathrine(C) Cryo-électro-microphotographie

(B) Deux triskélionschaînes lourdes en gris ou rouge

chaînes légères en jaune

(A) Ombrage au platine

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Manteau de clathrine

• Un manteau = 36 triskélions (sans la vésicule)

• 12 pentagones + 6 hexagones• Formation de deux coquilles

– externe– interne : domaines N-terminaux des

chaînes lourdes où se fixent les adaptines• Sur une vésicle : 12 pentagones +

beaucoup plus d'hexagones

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Adaptine

• Protéine de manteau à clathrine• Complexe multiprotéique• Lie la clathrine à la membrane• Piège les protéines transmembranaires

dont les récepteurs qui capturent les cargos solubles

• Au moins 4 types d'adaptine pour les différents récepteurs de cargo

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Fig 13-8

• Assemblage et désassemblage d'un manteau de clathrine– Les adaptines se lient à la clathrine et au

complexe cargo/cargo-r– Dynamine = GTPase

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Pincement de la membrane

• Dynamine + autres protéines• Fusion des feuillets non

cytosoliques (grâce à la dynamine)

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Fig 13-9

Rôle de la dynaminePuits à clathrine dans les

cellules nerveuses de drosophiles shibire ayant une mutation du gène de

la dynamine entraînant une paralysie. Anneau

correspondant à la dynamine mutée

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Perte du manteau

• La vésicule quitte la membrane• Le manteau de clathrine est perdu

immédiatement– intervention de chaperonne de la famille

des hsp70 (ATPase)– auxilline active l'ATPase

• La vésicule doit attendre d'être constituée pour que le manteau se retire

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Spécificité du manteau

• Mécanismes généraux identiques• Mais chaque membrane a ses

spécificités– membrane plasmique (riche en

cholestérol) : nécessité de beaucoup d'énergie

– autres membranes : existence de bourgeonnements

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b - Protéines autres que la clathrine

• CopI : 7 sous-unités protéiquesanalogies avec adaptine– Bourgeonnement à partir du Golgi

• CopII : 4 sous-unités protéiques– Bourgeonnement

à partir du RE

• (a – Clathrine)

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Toutes les vésicules ne sont pas sphériques

• Membranes contenant des protéines fluorescentes

• Long tubules qui émanent de endosomes et réseau trans-golgien (TGN)

• Ces tubules peuvent servir de transporteurs (grand rapport surface / volume)

• "une vésicule peut être tubulaire !"

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c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTPases monomériques, rappel

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c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins

(rappel)• GTP binding proteins

– 2 états• Actif avec liaison de GTP• Inactif avec liaison de GDP

– 2 types• Monomérique (= GTPases monomériques) les mieux connues• Trimérique (= GTPases trimériques = protéines G)

• Passage d'un état à l'autre par – GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP GTP– GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP GDP

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Fig 13-10

Formation d'une vésicule à COPII (RE)

Sar 1-GTP recrute COPII vers la membrane

= Sec12

GTPase monomériquerecruteuse de manteau

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GTP binding proteins (Rappel)

• Monomérique– GTPases

• GTPases de recrutement du manteau– Protéines ARF (ADP Ribosylation Factor)

» Assemblage COPI et clathrine au Golgi– Protéine Sar 1

» Assemblage COPII au réticulum endoplasmique– ?

» Assemblage clathrine à la membrane plasmique• Rab : amarrage des protéines de transport• Etc…

– Etc…

• Trimériques– Protéines G

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Formation of secretory vesicles in the biosynthetic pathway ReviewSylvie Urbé, Sharon A. Tooze and Francis A. Barr

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research Volume 1358, Issue 1 , 21 August 1997, Pages 6-22

Protéines de formation des vésicules recouvertes de COP I- et COP II

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GTPases de recrutement du manteau : les acteurs

• Membrane du RE• Sar 1 GDP (= GTPases de recrutement

du manteau) forte concentration, cytosolique, inactive

• GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor)

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GTPases de recrutement du manteau : la séquence

• Une vésicule à COPII est sur le point de bourgeonner (du RE)

• Une GEF spécifique (protéine de membrane du RE appelée Sec 12) se lie à la Sar 1 du cytosol

• et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP• La Sar 1 GTP libère une queue d'acide gras

lui permettant de se fixer dans la membrane du RE

• puis recrute des sous-unités de COPII• La membrane bourgeonne en incluant des

protéines membranaires sélectionnées

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Fig 13-10

Formation d'une vésicule à COPII

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Désassemblage du manteau

• GTPases de recrutement du manteau• Hydrolyse du GTP en GDP• La queue est exclue de la membrane désassemblage du manteau• C'est le temps qui finit par déclencher

l'hydrolyse

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Éléments d'approche

1. Les types de vésicules2. Assemblage du manteau (les

GTPases)3. Guidage du transport (les SNARE)4. Amarrage (protéines Rab)5. Fusion

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3 - Guidage du transport

• Reconnaissance vésicule de transport membrane cible

• Toutes les vésicules de transport ont des marqueurs de surface spécifiques de leur origine et de leur cargo

• Les membranes cible ont des récepteurs complémentaires

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Reconnaissance vésicule de transport membrane cible

1. SNAREs– Spécificité– Catalyseur de la fusion

2. Rabs (GTPases cible)– Amarrage initial– Fixation de la vésicule– En collaboration avec d'autres

protéines

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rab GTP-Binding Proteins

A large family of MONOMERIC GTP-BINDING PROTEINS that play a key role in cellular secretory and endocytic pathways

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Abréviations

• SNAREs : SNAP receptors• SNAPs : soluble NSF attachment

proteins• NSF : N-ethylmaleimide-sensitive-

fusion protein

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Fig 13-11

• Rôle des SNAREs dans le guidage des vésicules de transport

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SNAREs

• Au moins 20 espèces différentes• Protéines trans-membranaires• Marchent par deux :

– v- SNAREs (vesicle)– t- SNAREs (target = cible)

• Domaine hélicoïdal qui s'enroule l'un dans l'autre complexe trans–SNARE qui contribue à la fusion des membranes

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Complexe trans–SNARE• Toujours 4 hélices

– 3 formées par t-SNARE– 1 formée par v-SNARE

• Ici 3 protéines– v-SNARE 1 hélice (synaptobrévine)– t-SNARE 1 hélice (syntaxine)– t-SNARE 2 hélices (Snap25 : protéine périphérique)

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Fig 13-12

• Structure de SNAREs appariés dans les terminaisons nerveuses

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SNAREs nerveuses

• Cibles de neurotoxines– Tétanos– Botulisme

• Protéases qui entrent dans des neurones spécifiques, clivent les SNAREs et bloquent la transmission synaptique

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Désassemblage du complexe trans-SNARE

• Après fusion le complexe SNARE est stable dans la membrane

• Doit être désassemblé

• NSF (N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein)

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NSF

• Cycle entre les membranes et le cytosol• Catalyse le désassemblage• ATPase• Ressemble à une chaperone cytosolique qui

solubilise et aide à replier correctement les protéines dénaturées

• Déroule les hélices des SNAREs• en collaboration avec des protéines

adaptatrices

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Fig 13-13

• Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF une fois le cycle de fusion terminé– NSF + des protéines adaptatrices hydolyse ATP

+séparation des SNAREs– La dissociation régule quand et où les membranes

vont fusionner

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Éléments d'approche

1. Les types de vésicules2. Assemblage du manteau (les

GTPases)3. Guidage du transport (les SNARE)4. Amarrage (protéines Rab)5. Fusion

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4 – Amarrage

• Rôle important des protéines Rab dans la spécificité du transport vésiculaire

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Protéines Rab

• GTPases monomériques• Plus de 30 membres la plus grande sous-

famille de GTPases monomériques• Distribution caractéristique sur les

membranes cellulaires• Chaque organite a au moins une protéine

Rab sur sa face cytosolique• Facilitent et régulent

– Le taux d'amarrage des vésicules– et l'appariement des v- t- SNAREs

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Table 13-1

• Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab

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Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab

Rab1 RE et Golgi

Rab2 cis Golgi network

Rab3Avésicules synaptiques, granules sécrétoires

Rab4 endosomes pécoces

Rab5Amembrane plasmique, vésicules à manteau de clathrine

Rab5C early endosomes tardifs

Rab6 citernes médianes et du trans Golgi

Rab7 endosomes tardifs

Rab8 vésicules sécrétoires (basolateral)

Rab9 endosomes tardifs, trans Golgi network

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Protéines Rab

• Comme les GTPases de recrutement du manteau elles cyclent entre la membrane et le cytosol

• Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2 états :– Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol– Actif avec liaison de GTP associé à une

membrane

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[c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins

(rappel)

• GTP binding proteins : 2 états– Actif avec liaison de GTP– Inactif avec liaison de GDP

• Passage d'un état à l'autre par – (GEFs): GDPGTP (monomérique = GTPase )– GTPase-Activating Proteins (GAPs) : GTPGDP

(trimérique = protéines G) Guanine-nucleotide-Exchange Factors]

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Fig 13-14

• Rôle des protéines Rab dans l'amarrage des protéines de transport

Sar1COPIIformation de la vésiculeRabSNARE amarrage de la vésicule

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Les effecteurs de Rab (1/2)

• Reconnaissance de Rab (Lié, GTP) par un Rab effecteur

• Gros complexe protéique• Très variable d'une protéine Rab à

une autre

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Les effecteurs de Rab (2/2)

• Parfois longues protéines filamenteuses qui limitent le mouvement des vésicules entre des citernes golgiennes adjacentes

• Se lient à Rab et empêchent l'hydrolyse prématurée du GTP

• D'autres sont des moteurs qui dirigent les vésicules vers leur destination

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Protéines Rab

• Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs

• Accélèrent le processus de reconnaissance des SNAREs entre elles

• Achèvent le verrouillage de la vésicule à sa cible par appariement des SNAREs

• prêt pour la fusion• Après la fusion, la protéine Rab hydrolyse

son GTP lié• et retourne dans le cytosol

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Éléments d'approche

1. Les types de vésicules2. Assemblage du manteau (les

GTPases)3. Guidage du transport (les SNARE)4. Amarrage (protéines Rab)5. Fusion

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5 – Fusion

• Distinguer amarrage de fusion• Fusion ne fait pas toujours suite à amarrage :

– eg : exocytose régulée

• Amarrage : les protéines des membranes interagissent et adhèrent

• Fusion : les couches lipidiques peuvent se joindre nécessité d'extrusion d'eau protéines de fusion pour résoudre le problème énergétique ( dynamine au cours du bourgeonnement des vésicules à clathrine)

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Fig 13-15

• Modèle de concentration des protéines SNAREs au cours de la fusion de membrane– Des liposomes (in vitro) v-SNAREs

+ des liposomes t-SNAREs fusion lente

– Intervention (dans la cellule) d'autres protéines• pour initier la fusion• ou pour retirer des protéines

inhibitrices

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Importance des phénomènes de fusion de membrane

• Transport vésiculaire• Fécondation (fusion oolemme

spermatozoïde)• Fusion des myoblastes• Maintien de l'identité des cellules• Maintien de l'identité des

compartiments intra-cellulaires• Mode d'entrée des virus à enveloppe

dans les cellules

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Analogie protéines de fusion virales SNAREs

• Human Immunodeficiency Virus (HIV)– Se lie aux récepteurs de la surface de la cellule– Les membranes de la cellule et du virus fusionnent– L'acide nucléique viral entre dans la cellule et s'y réplique

• Virus influenza– Entrée du virus dans la cellule par endocytose– Arrivée dans l'endosome– Activation d'une protéine de fusion de l'enveloppe virale– Fusion de la membrane virale et de la membrane

endosomale– L'acide nucléique viral entre dans le cytosol et s'y réplique

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Fig 13-16

• Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule

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Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule

• Liaison de HIV à la protéine CD4 à la surface des lymphocytes…

• …par l’intermédiaire de la protéine virale gp120 liée à la protéine de fusion de HIV

• Une 2ème protéine de surface de la cellule hôte qui sert normalement de récepteur aux chimiokines agit avec gp120

• Séparation de gp120 et de la protéine de fusion • Enfouissement de la partie hydrophobe de la protéine de

fusion dans la membrane• La protéine de fusion (trimère) se comporte transitoirement

comme une protéine de membrane dans deux membrane opposées

• Réarrangement spontané de la protéine de fusion qui se collabe en une structure compacte de 6 hélices

• Libération d’énergie rapprochement des membranes

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Résumé

• Les manteaux• GTPases (Sar1 et ARF)• GTPases (Rab)• SNAREs