Travaux Pratiques ELISA Expérience pour rechercher une infection au VIH Démonstration de la...

Travaux Pratiques ELISA

Expérience pour rechercher

une infection au VIH

Démonstration de la présence d’anticorps anti-VIH dans le sang

Préparations par l’enseignant

• Tampon de lavage (900 ml)805 ml H2Odist. + 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Le tampon de lavage est nécessaire pour diluer la solution d'anticorps et pour laver les plaques de microtitrage.Le Tween 20 contient de la SAB pour bloquer la surface plastique libre.

1. Préparation des solutions tampons

• Tampon PBS (100 ml)

90 ml H2Odist. + 10 ml PBS (10x)

Le tampon PBS est nécessaire à la solubilisation des antigènes et des anticorps hydrophiles.

2. Réhydratation

• Ajouter 0,5 mL de tampon PBS dans le flacon d‘antigène et dans les flacons

des anticorps primaire et secondaire

Toutes ces solutions mères sont concentrées 50 fois !

Elles seront diluées juste avant la manipulation

• Ouvrir les flacons d‘antigène et d‘anticorps

• Fermer les flacons et agiter pendant environ 2 minutes (solutions mères)

!

3. Etiquetage

Etiqueter trois flacons en polyéthylene avec:

- antigène

- anticorps primaire

- anticorps secondaire

Ils accueilleront les solutions diluées juste avant la manipulation

Antigène

Préparationspar les élèves

8 équipes

Vue d‘ensemble des tubes

Couleur du tube

Etiquette Contenu Quantité

vert “AG“ antigène 800 µl

orange “sAB“ Anticorps secondaire 800 µl

marron “SUB“ substrat 800 µl

violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl

bleu “WB“ Tampon de lavage 120 µl

jaune - - - - Encore vide!

1. Preparation des échantillons P1 – P8

- Légender les 8 tubes jaunes avec le numéro de votre groupe

- Introduire 60 µL d’anticorps primaire (pAB, résultat positif du test)ou 60 µL de tampon de lavage (WB, résultat négatif du test) dans chacun des 8 tubes jaunes! Notez votre démarche

(P1 – P8 sont les échantillons de sérum)

- Distribuer 1 tube à chacune des 8 équipes

!

Vue d‘ensemble complète des tubes

Couleur du tube

Etiquette Contenu Quantité

vert “AG“ antigène 800 µl

orange “sAB“ Anticorps secondaire 800 µl

marron “SUB“ substrat 800 µl

violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl

bleu “WB“ Tampon de lavage 120 µl

jaune “P1 – P8” Sérum sanguin, éch. 1 à 8 60 µl chacun

2. Réalisation du test

2.1 Fixation de l’antigène sur la microplaque de titration

- Légender la microplaque selon l’image ci-dessous

- Introduire 50 µl de solution d’antigène (AG, tube vert) dans chacun des 12 puits

- Incuber pendant 5 minutes

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

Détection des anticorps Principes de base

• Les antigènes se fixent à la phase solide

2.2 Lavage des microplaques de titration

• Tapotez les microplaques sur un papier absorbant

• Introduire 250 µl de tampon de lavage dans chaque puits

Attention!Pendant le pipetage, ne pas renverser de solution de lavage dans les autres puits!

• Tapotez les microplaques sur un papier absorbant

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

Détection des anticorps Principes de base

• contrôle positif: introduire 50 µL d’anticorps primaire (pAB, tube violet) dans les 2 puits étiquetés “ + ”

2.3 Préparation des contrôles et des échantillons

• contrôle négatif: introduire 50 µL de tampon de lavage (WB, tube bleu) dans les 2 puits étiquetés “ - ”

pAb

WB

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

• Incuber 5 minutes

• échantillons 1 – 8: introduire 50 µL “d’échantillons de sérums à tester” P1 – P8 (tubes jaunes) dans les 8

puits etiquetés correspondant

Utiliser un nouveau cône de pipette pour chaque puit !

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

2.3 Préparation des contrôles et des échantillons

• Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

Détection des anticorps Principes de base

2.4 Lavage des microplaques (voir 2.2 )

vider + 250 µl WB vider

2.5 Ajout des anticorps secondaires

• Incuber 5 minutes

• Introduire 50 µL d’anticorps secondaire (sAB, tube orange) dans chacun des 12 puits

• Les anticorps secondaires (portant l‘enzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents

Détection des anticorps Principes de base

• Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

2.6 Lavage des microplaquesdeux fois(voir 2.2 )

vider + 250 µl WB vider

2.7 Ajout du substrat

• Incuber 5 minutes

• Introduire 50 µL de substrat (SUB, tube marron) dans chacun des 12 puits

• La preuve de l‘infection est faite par la coloration du puit

• Les anticorps secondaires (portant l‘enzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents

Détection des anticorps Principes de base

• Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes

• Les antigènes se fixent à la phase solide

• La surface plastique encore libre est bloquée

3. Résultats

Les échantillons positifs sont colorés en bleu, les échantillons négatifs restent incolores (Valider les contrôles).

Vérifiez vos résultats (P1 – P8) dans l’équipe!

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

exemple: