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ß-LACTAMASESA. Philippon

Université Paris V - CHU Cochin

Service de Bactériologie - 75014 PARIS

A- DEFINITION

Les ß-lactamases sont des enzymes d'inactivation desß-lactamines (principale famille d'antibiotiques classée selon lenoyau de base tel péname, oxapéname, pénème, céphéme,oxacéphème, azétidinone ......) par ouverture du cycle ß-lactame(structure de base des ß-lactamines).

L'inactivation varie selon la ß-lactamine en fonction desconstantes cinétiques de l'enzyme étudiée :


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. affinité appréciée par le Km ou Ki,

. hydrolyse par la vitesse, en généralVmax

Finalement cette inactivation est responsable de la perte variable de l'activité antibiotique, exprimée chez la bactérie parl'augmentation de la CMI.

Nombreux subtrats découverts

.................. mais également des enzymes avec divers phénotypesde résistance alors individualisés.

B - QUELQUES ETAPES DE LEUR HISTOIRE

- 1940, découverte industrielle : lots variables en activité


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benzylpénicilline exprimée en unités 0xford . En fait , E. coli etrésistance naturelle à la pénicilline G par une pénicillinase, quiest en fait une céphalosporinase.

L'existence de ces enzymes se réfère ensuite à diverses étapesmédicales :


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L'HISTOIRE DE CES ENZYMES EST MARQUEE PARL'INTRODUCTION DE "NOUVELLES MOLECULES"

UNE NOUVELLE ß-LACTAMINE SELECTIONNE SOUVENT DENOUVELLES ENZYMES

C - IDENTIFICATION

3 - 1 Premiers critères :

. Localisation:

Exocellulaire (Gram +) vs endocellulaire = périplasmique (Gram-).

Activité liée aux corps bactériens etdétection par un test chromogénique(Nitrocéfine)

. Paramètres cinétiques : Vmax (%), Km (µM), Ki


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(µM)........

Profil de substrat : pénicillinases(PASE), céphalosporinases (CASE),céfuroximase, ceftazidimase (CAZ)céfotaximase (CTX), carbapénémase,imipénémase (IMP)...................

QUELQUES EXEMPLES DE PASES

Si céphaloridine hydrolysée plus que pénicilline =céphalosporinase ou CASE

EXEMPLE DE LA FOX-3 (CASE )


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Profil d'inhibition : anticorps, EDTA, pCMB (inhibiteurs chimiques), oxacilline, cloxacilline, ..... (inhibiteurscompétitifs). Le concept d'inhibition apermis la découverte de l'acideclavulanique.

QUELQUES PROFILS AU SEIN DES PASES : TEM, SHV,OXA, PSE....

ACTIVITE COMPAREE DES INHIBITEURS VIS-A-VISD'ENZYME DE TYPE PASE OU CASE


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. Autres paramètres biochimiques:

Masse moléculaire (25.000 - 35.000)

pI (4,3-9.5)

. Déterminisme génétique

Localisation: chromosome (CASE), plasmide, transposon (PASE) ...... =Grande mobilité des gènes


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AUTRES ELEMENTS MOBILES:STRUCTURE D'UN INTEGRON

Régulation: Inductible - constitutive


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Argument de marketing :

Mon antibiotique n'induit pasla résistance peut vouloir direqu'il n'y a pas d'échecs detraitement.

Mon antibiotique n'induit pasla résistance devrait vouloirdire qu'il n'est pas un inducteur mais il peutsélectionner rapidement dansune population bactérienne (>

106-7) des mutants résistants.

Inductible : système de régulation complexe avec 4 gènes etimplication de précurseurs du peptidoglycane : ampC, ampR,

ampG et ampD

3 - 2 Autres critères : Séquences

. séquence peptidique du site enzymatique(1975-1985)


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. séquence du gène ßla

1/ Parmi les progrès les plus importants, citons le clonage et leséquençage de nombreuses ß-lactamases (> 220), d'où desétudes précises de phylogénèse, et donc finalement une meilleure approche de leur mécanisme d'action et enfin de laclassification.

Comparaison de séquences peptidiques de nouvelles CASESplasmidiques avec leurs motifs, isolées dans plusieurs pays

2/ Les progrès de l'analyse moléculaire en particulier au niveaude la détermination des séquences de l'ADN ont permis depréciser les différents mécanismes génétiques expliquantl'émergence de la résistance.

Certains sont liés à la régulation de l'expression du gèneß-lactamase qui peut être multipliée des dizaines, voiredes centaines de fois tels que:

. répresseur modifié par mutation(ampD)(E. cloacae de phénotypehyperproducteur)

. mutation ponctuelle au niveau dugène promoteur (K. oxytocahyperproductrice)

. insertion d'une séquence IS(Bacteroides fragilis etcarbapénémase)


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D'autres à la modification du gène ß-lactamaselui-même, par mutation, comme pour les ß-lactamases àspectre élargi ou étendu (BSE ou BLSE), ou cellesd'apparition plus récente comme les enzymes TRI ou IRT(inhibitor resistant TEM).

3 - 2 Etude enzymatique actuelle :

La séquence étant connue, il est intéressant afin d'encomprendre le mode d'action de déterminer par diffraction auxrayons X, la structure, l'étape préalable étant une purificationvalidée par l'obtention de cristaux.


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D - NOMENCLATURE

Absence préjudiciable de règles de dénomination. Deuxdénominations sont officielles: PASE et CASE

Diverses dénominations ont été proposées pour désigner lemême type d'enzyme rendant confuse, la classification de ces enzymes.

L'exemple suivant illustre notre propos: TEM-101, TEM-10, CAZ-3,YOU-2 et CAZ-lo (low par opposition à high = CAZ-hi). Toutes ces enzymes sont en fait identiques.


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En l'absence de règles de nomenclature, celles faisant appel àl'activité enzymatique et à son expression dans la bactériepermettent au biologiste et au clinicien, de mémoriser un groupeou une classe de ß-lactamase ayant un intérêt médical tels:

ß-lactamases à large spectre (TEM)

ß-lactamases à spectre élargi ou étendu(BSE/BLSE)

ß-lactamases AmpC ou céphalosporinases,carbapénémases.......

E - CLASSIFICATION

Plusieurs classification ont été proposées (Ambler, Bush):

- L'une est basée sur la séquence peptidique du site enzymatiqueou sur la séquence totale du gène ßla (classification de Ambler).Celle-ci est stable et réflète la structure fondamentale del'enzyme.

Ainsi 4 classes (A, B, C, et D) ont été proposées (Classes A, C, D= sérine enzymes et classe B = zinc types).

Quelle complexité en fait !


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- La classification fonctionnelle de Bush, Jacoby, Medeiros de1988 réflète mieux le spectre exact des enzymes, prenant encompte le profil de substrat (pénicilline, carbénicilline,céphaloridine, C3G, imipénème),et celui d'inhibition . Mais un peusimpliste............

Une seule mutation ponctuelle peut changer le profild'inactivation et celui d'inhibition : Le groupe 2b se subdivise alors en 2be (BSE) ou 2br (IRT).


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F - ROLE

Le rôle des ß-lactamases dans la résistance reste prépondérant, en particulier chez les bactéries à Gram-négatif malgrél'existence des autres mécanismes de résistance auxß-lactamines

- naturelle (> 99% de l'espèce)

- acquise (variable)

Le rôle éventuel de l'association de plusieurs mécanismes estimportant à considérer :

résistance acquise à l'imipénème chez quelquessouches d' E. cloacae , K. pneumoniae

résistance naturelle à l'imipénème et autres ß-lactamineschez S. maltophilia.........

Compte tenu de leur diversité en termes d'inactivation au moins220 ß-lactamases ont été identifiées, leur rôle en termes despectre d'inactivation ou de phénotype de résistance est fortdifférent.

Quelques exemples :

1944 : S. aureus et pénicillinase

1955: résistance naturelle de bacilles à Gram-négatif(céphalosporinase ou CASE inductible)

1965: entérobactéries et ß-lactamases (bla) plasmidiques (TEM)

1983 : émergence de bla à spectre élargi ou étendu (BSE/BLSE)chez entérobactéries dont Klebsiella

1988: céphamycinases (CMY) = CASES plasmidiques

1990: mutants de TEM-1 moins sensibles aux inhibiteurs (TRI ouIRT).


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> 1990 : nouvelles BSE, CTX-M , CASES plasmidiques .............

2000: céphalosporinase à spectre élargi .....................................

Un exemple évolutif : K. pneumoniae

AMX, amoxicilline TIC, ticarcilline; PIP, pipéracilline, FEP,céfépime

CF, céfalotine; AMC, Augmentin®, CAZ, ceftazidime; TZP,Tazocilline®

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1: R. naturelle parpénicillinase chromosomique(type SHV)

2 : + R. acquise avec bla largespectre (TEM-1/2)

3 : + R. acquise avec bla BSEou BLSE (TEM-3........SHV-3........)

4 : + R. acquise avec bla detype AmpC ou CASE

5 : + R. acquise avec bla de


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type AmpC à spectre élargi

6 : + R. acquise à l'imipénèmeavec bla de type CASE +imperméabilité

1 : R. naturelle par pénicillinase chromosomique (typeSHV)

Au même phénotype, par exemple "pénicillinase basniveau" comme chez K. pneumoniae ou K. oxytocacorrespond des enzymes différentes (cf analysecomparative de séquences peptidiques en 1 et 2) ou 3(C.diversus/koseri)

2 : R. acquise avec bla large spectre (TEM-1/2)

L'acquisition d'une ß-lactamase plasmidique de typeTEM est bien connue depuis 1964-65 pour de trèsnombreuses espèces dont E. coli (35-55% des souches en France) , H. influenzae (35-45% des souches en France)


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3 : R. acquise aux C3G avec bla BSE ou BLSE(TEM-3........SHV-3........)

Il s'agit d'une évolution moléculaire de la ß-lactamaseTEM après l'introduction en 1980 de ß-lactamines peuhydrolysables telles les C3G. La mutation entraine unemeilleure affinité (Km baissant). Selon la position de lamutation, l'expression phénotypique est différente.Lecture interprétative nécessaire, surtout K. pneumoniae.

Evolution moléculaire mondiale (mutation) suite àl'introduction de certaines ß-lactamines

L'évolution inverse (mutants de moindre affinité) a étéplutôt observée sur des souches de ville : E. coli avec enzymes TRI/IRT.

4 : R. acquise avec bla de type AmpC ou CASE

Il s'agit d'une "nouvelle" émergence de la résistance auxC3G et aux associations d'inhibiteurs tels Augmentin®,


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Timentin ®, Tazocilline® chez des entérobactéries nonnaturellement productrices de CASE telle K. pneumoniae, P. mirabilis ou encore Salmonella ou E. coli. Ce phénomène est mondial avce nombred'exemples liés à des transferts de malades d'un pays àl'autre.

Les enzymes viennent d'espèces donatrices telles E. cloacae (MIR-1, ACT-1) , C. freundii ( CMY-2/5, LAT-1/7,BIL-1)

M. morganii (DHA-1), ou encore H.alvei (ACC-1) ...........

5 : R. acquise avec bla de type AmpC à spectre élargi =résistance au céfépime (FEP)

Cet exemple est virtuel pour K. pneumoniae mais vientd'être rapportée chez un malade traité avec du céfépimeavec l'isolement d'une souche hyperproductrice de Case(E. cloacae)(Arlet G. Communication personnelle).

Le gène ß-lactamase a été cloné et son expression


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mesurée (CMI) après introduction dans une souche de E.coli.

Le gène a été séquencé et comparé aux séquencesdéposées dans les banques. La délétion observée de 6acides aminés entraine une modification de l'affinité quiest augmentée. Il s'agit d'une céphalosporinase àspectre élargi.

6 : R. acquise à l'imipénème avec bla de type AmpC +imperméabilité

L'hyperproduction de CASE associée à la perte d'uneporine (imperméabilité) peurt entrainer la résistanceacquise aux carbapénèmes comme celà a été rapportéen France en 1988 chez E. cloacae .

Chez K. pneumoniae aussi dans le cadre d'une épidémiedans un hôpital américain.


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G - CONCLUSION

La résistance est une fatalité , donc bien prescrire.

De plus nombreux cas d'importation

Mondalisation de la résistance

La résistance acquise aux ß-lactamines est encore en2001, en relation avec une ou plusieurs ß-lactamases,principal mécanisme d'adaptation des bactéries autraitement.

Leur diversité est étonnante ainsi que leur potentield'évolution (moléculaire).

Aussi leur détection est de plus en plus complexe ainsi que l'interprétation à donner.

La solution est de développer des sytèmes experts del'antibiogramme

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