Chapitre 3: Nutrition bactérienne et Types trophiques

1. Besoins nutritionnels et types trophiques.

2. Conditions psycho-chimiques favorables.

3. Métabolisme bactérien.

Mme : BELKHIRI Farida (MCB)Microbiologie en 2019/2020

Définition• La nutrition: Pour survivre et se reproduire les

bactéries utilisent une quantité plus ou moins importante de substances minérales et organiquesdites substances alimentaires.

• Selon leur mode de vie les bactéries ont des exigences nutritives diverses mais toutes doivent trouver dans le milieu ou elles vivent. Ce milieu doit également les conférer toutes les conditions physico- chimiques favorables.

Une bactérie existe sous deux états principaux : (i) l'état végétatif avec une grande activité métabolique

permettant une croissance +/- rapide. (ii) l'état de repos caractérisé par une survie sans multiplication.

A- Besoins nutritionnels et types trophiques

• Le type trophique: (du verbe grec trophus, «action de

nourrir») spécifie la manière dont un organisme vivant constitue sa

propre matière organique.

• Pour synthétiser de la matière organique et se multiplier, les

bactéries exigent à coté de l’eau qui représente 75% de leur poids :

a- Source d’énergie

b- Source de carbone

d- Facteurs de croissance

e- Besoins élémentaires

• Selon la source d’énergie on définit 2 types trophiques : • Phototrophie = énergie lumineuse. Chimiotrophie = énergie chimique.

• Les bactéries photosynthétiques possèdent au lieu des chloroplastes des pigments dites

chlorophylines dispersés dans le cytoplasme sous forme de chromatrophes. Leur

photosynthèse se résume comme suit:

I.1. Les bactéries phototrophes: Chez les plantes la photosynthèse peut se résumé comme suit :

chez les bactéries le donneur des électrons n’est jamais d’H2O

I. Sources d’énergie

- la nature chimique du donneur d’électrons (2RH2), permet de distinguer 2 types trophiques : •Photolitotrophele: donneur des électrons minéral•Photoorganotrophe: le donneur des électrons organique

I.1.1. Photolitotrophes : utilisent le sulfure ou le H2 comme donneur des électrons.

I.1.2. Photo-organotrophes: utilisent une substance organique comme donneur des électrons.

I.2. Les bactéries chimiotrophes: La plupart des bactéries rencontrées dans la nature sontdépourvues de pigment chlorophyline et sont par conséquent incapables de faire laphotosynthèse, et leur énergie est élaborée par des réactions d’oxydoréduction.• L’ATP est produite lors de réactions de phosphorylation :Phosphorylation au niveau desubstrat et phosphorylation oxydative (chaine de transfert d’é)

I.2.1. Les chimiolithotrophes: si les composés (donneurs d’électrons) sont inorganiques comme H2S, H2, Fe2+ ou NH3. I.2.2. les chimioorganotrophes: Si les donneurs d’électron sont organiques.

II. Sources de carboneLe carbone est l’un des éléments les plus abondants de la bactérie. La plus simple source de carbone est l’anhydride carbonique ou CO2 qui peut être utilisé pour la synthèse de certains métabolites essentiels qui ferait intervenir une réaction de carboxylation.1. bactéries autotrophes: Le CO2 est la seule source de carbone. C’est le cas des bactéries

phototrophes et la plupart des bactéries chimiolithotrophes. 2. bactéries hétérotrophes: utilisent facultativement le CO2. elles dégradent une grande quantité de substances hydrocarbonées (alcool, acide acétique, acide lactique, polysaccharides, sucres divers).III. Source d’azote• La synthèse des protéines et des acides nucléiques nécessite des substances azotées. • L’azote représente 12% du poids sec des bactéries et 80% de l’air qu’on respire. • L'azote moléculaire (N2) est fixé par quelques bactéries vivant en symbiose avec des

légumineuses (bactéries fixatrices d’azote) ou des champignons ou par des bactéries jouant un rôle dans la fertilisation des sols.

• Pour la majorité des bactéries la source d'azote est constituée par d'autres composés inorganiques (ammoniaque, nitrites, nitrates) ou par des sources organiques (groupements amines des composés organiques).

• IV. Facteurs de croissance• Des substances organiques indispensables à la croissance bactérienne

que la bactérie est incapable de synthétiser. 1. Prototrophes: Les bactéries non exigeantes de facteurs de croissance. ex. E. coli est une bactérie n’exigeant aucun facteur de croissance, elle se multiplie sur milieu minimum.

• 2. Auxotrophes: Les bactéries exigeant des facteurs de croissance.

• Examples de facteurs de croissance:• acides aminés (synthèse des protéines): ex: Légionella pneumophilia• bases puriques et pyrimidiques (synthèse des acides nucléique): ex:

Haemophilus Influanzae. • Vitamines (coenzymes): ex :Neisseria gonorrhae.• besoins quantitatifs: de 10 µg (AA , bases) et de 1µg (vitamines). • Caractères communs: - actifs à concentration infime - étroitement

spécifiques.

Classe du besoin Nature du besoin Type trophique

Source d'énergie

Rayonnement lumineux Phototrophe

Oxydation de composés organiques ou inorganiques

Chimiotrophe

Donneur d'électronsMinéral Lithotrophe

Organique Organotrophe

Source de carboneComposé minéral Autotrophe

Composé organique Hétérotrophe

Facteurs de croissanceNon nécessaires Prototrophe

Nécessaires Auxotrophe

• IV. Besoins élémentairesBesoin en azote: Les protéines constituent 10 % du poids sec de

la bactérie. – fixation d’azote moléculaire « N2 » (Rhizobium). – fixation de nitrite « NO3 » (Nitrobacter). – source organique: groupements aminés des composés organiques (RNH2)

• Besoin en soufre: -Présent dans certains acides aminés sous forme de groupements thiols (-SH). -A partir de sulfates « SO4 ».

• Besoin en phosphore: composant des acides nucléiques et coenzymes de l’ATP. On le retrouve sous forme organique ou minéral (pyrophosphate ou phosphate)

• Oligoélément et minéraux: Constituant structuraux ou le plus souvent constituant d’enzyme et coenzyme: fer, magnésium calcium, cobalt, cuivre, manganèse …

B- Conditions psycho-chimiques favorables

• Il existe plusieurs classes de bactéries en fonction de leurs rapports avec l’oxygène.

• 1. Les bactéries aérobies strictes: ne se développent qu’en présence d’air. Leur source principale d’énergie est la respiration. L’oxygène moléculaire, ultime accepteur d’électron, est réduit en eau (Pseudomonas, Acinetobacter, Neisseria).

• 2. Les bactéries microaérophiles se développent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle d’oxygène est inférieure à celle de l’air (Campylobacter, Mycobacteriaceae).

• 3. Les bactéries aéro-anaérobies facultatives: se développent avec ou sans air. C’est le cas de la majorité des bactéries rencontrées en pathologie médicale : les entérobactéries (Escherichia, Salmonella), les streptocoques, les staphylocoques. L’énergie provient de l’oxydation des substrats et de la voie fermentaire.

• 4. Les bactéries anaérobies strictes: ne se développent qu’en absence totale ou presque d’oxygène qui est le plus souvent toxique. Ces bactéries doivent se cultiver sous atmosphère réductrice.

• La totalité de l’énergie est produite par fermentation.

I. Effet de l’oxygène

La toxicité de l’oxygène chez les anaérobies strictes s’explique par laproduction de radicaux superoxydes que les bactéries anaérobies nepeuvent pas détruire (absence de superoxyde dismutase) et/ou parl’absence d’une activité enzymatique à type de catalases et de peroxydases.

II. La température :• Les bactéries peuvent être classées selon leur température optimale de croissance en:• 1. Bactéries mésophiles: température de croissance proche de celle du corps humain (37°C)• 2. Bactéries thermophiles: températures de croissance comprises entre 45°C et 70°C• 3. Bactéries hyperthermophiles: températures de croissance supérieures à 80°C• 4. Bactéries psychrophiles: températures proches de 0°C (optimum à 10-15°C)• 5. Bactéries psychrotrophes: températures de croissance proches de 0°C avec optimum de

croissance proche des bactéries mésophiles

• Le pH (concentration en ion hydrogène [H+]) de l’environnement varie entre 0,5 (sols acides) et 10,5 (eaux alcalines des lacs).

• Les bactéries pathogènes ou liées à l’écosystème humain se développent le plus souvent dans des milieux neutres ou légèrement alcalins.

• On distingue :• 1. Les bactéries neutrophiles se développent dans des pH compris entre

5,5 et 8,5 avec un optimum voisin de 7.• 2. Les bactéries alcalophiles préfèrent les pH alcalins: cas de

Pseudomonas et Vibrio.• 3. Les bactéries acidophiles se multiplient mieux dans des milieux

acides : cas des Lactobacillus.

III. Effet du pH

IV. La pression osmotique • grâce à la paroi spécifique des procaryotes qui leur confère une rigidité et

une résistance aux chocs, les bactéries tolèrent des variations de concentrations ioniques.

• Certaines bactéries tolèrent des concentrations salines importantes ex. Enterococcus (6.5°/° Nacl) Staphylococcus aureus (7.5°/° Nacl).

•L’eau est disponible dans l’atmosphère ou dans le milieu de culture artificiel des bactéries. •L’activité de l’eau (Aw) est inversement proportionnelle à la pression osmotique d’un composé.•L’activité de l’eau est affectée par la présence plus ou moins importante de sels ou de sucres dissous dans l’eau.

V. Effet de l’eau libre

1. Présence de sels• 1. Les bactéries halophiles nécessitent du sel (Na Cl) pour leur croissance. La

concentration peut varier de 1 à 6% pour les faiblement halophiles jusque 15 à30% pour les bactéries halophiles extrêmes (Halobacterium). Dans ce cas, labactérie accumule des quantités importantes de potassium pour rester hypertoniquepar rapport à son environnement.

• 2. Les bactéries halotolérantes acceptent des concentrations modérées de sels mais non obligatoires pour leur croissance (Ex. : Staphylococcus aureus).

• 2. Présence de sucres• 1. Les bactéries osmophiles: nécessitent des sucres pour leur croissance.• 2. Les bactéries osmotolérantes: acceptent des concentrations modérées de sucres

mais non obligatoires pour leur croissance.• 3. Les bactéries xérophiles peuvent se multiplier en l’absence d’eau dans leur

environnement.

2- Métabolisme biochimiquebactérien

• 1. Définition• Des transformations chimiques (réactions de biosynthèse et de dégradation), qui

assurent l'élaboration des constituants bactériens et leur fonctionnement.• Il permet de définir des caractères d'identification biochimique qui représentent

des critères essentiels dans la classification (ou Taxonomie) bactérienne.

2. Métabolisme énergétiqueLe métabolisme énergétique d’une bactérie chimio-organotrophe= réactions REDOX avec libération d’énergie, partant d’un substrat organique. Ce composé organique peut être:• un hydrate de carbone ( surtout le glucose) source la plus importante d’énergie• un acide aminé• un acide gras• un alcane• une base purique ou pyrimidique

• Les réactions redox (Oxydo-réduction) productrices d’énergie sont intégrées dans 2 types de processus énergétiques:

La Fermentation et la Respiration

• 2.1. Voies du Métabolisme intermédiaire• Trois principales voies enzymatiques, à localisation cytoplasmique , qui

oxydent le glucose en acide pyruvique, (dite plaque tournante du métabolisme ):

• 1. La voie d’embden-Meyerhof ou voie des Hexoses-Diphosphates , voie

comparable à la voie de la glycolyse des êtres supérieurs (2 moles

d’ATP/mole de glucose).

• 2. La voie des Hexoses-Monophosphates ou voie des Pentoses-Phosphates

ou Shunt oxydatif ou cycle de Dickens-Horecker (1 mole d’ATP / mole de

glucose).

• 3. La voie du 2-céto-3-déoxy-gluconate ou voie d’Entner-Doudoroff (0

ATP).

• 2.2. La Respiration• Voies métaboliques au cours desquelles l’oxygène moléculaire ou des

composés oxygénés inorganiques ou ioniques jouent le rôle d’accepteur d’électrons et d’H2 dans les réactions redox.

• Ces voies sont liées à la membrane cytoplasmique de la bactérie.

• L’énergie est produite par phosphorylation dite oxydative et libérée par paliers via une chaîne de transfert d’électrons;

• Le bilan énergétique est élevé.• Donc, la respiration se fait en 2 étapes :A. Le cycle tricarboxylique de Krebs , avec libération de CO2 par

oxydation couplée à la réduction de 3 NAD+ et de 1 FAD+ par tour de cycle .

B. La chaîne respiratoire avec coenzymes de déshydrogénases , Quinones et Cytochromes .

2.2.1. Le cycle de Krebs :•Chaque tour de cycle de Krebs génère 4 réactions de déshydrogénation donc un bilan énergétique de 12 ATP.

•Le Pyruvate est transformé en Acetyl~CoA par: décarboxylation oxydative

2-2-2- La chaîne respiratoire :• Chaîne cytochromique de transfert des électrons, • y sont associés des phosphorylations oxydatives.• Ses composants sont disposés de façon séquentielle en fonction de leur

potentiel redox;• Le mouvement des électrons ou des protons : se fait des constituants les

plus électronégatifs vers le constituant le plus électropositif (O2). Ces composants sont des enzymes associés à des groupements prosthétiques et qui agissent comme transporteurs d’électrons.

*Selon l’accepteur final d’électrons et d’H2 , on peut distinguer :1/ La respiration aérobie: l’accepteur final dans la réaction de réduction

est l’O2.2/ La respiration anaérobie: l’accepteur final est un composé inorganique

ou ionique (NO3- fumarate) et la réaction de réduction fait intervenir une Nitrate réductase.

• 2.3. La fermentation (vie sans air )• Oxydation biologique au cours de laquelle l’accepteur final d’H2 et

d’(é) est un composé organique. Ce composé peut être présent dans le milieu ou provenir de la dégradation d’un substrat oxydable .

• Les voies fermentaires se déroulent au sein du cytoplasme bactérien. • L’énergie est produite par Phosphorylation au niveau du substrat. • Le bilan énergétique est réduit.

La Fermentation du glucose

2.3.1. Fermentation Acides complexesC'est le type de fermentation le plus répandu chez les bactéries.Elle peut se présenter sous 2 formes possibles:- Fermentation Acide Mixte: caractéristique des Enterobactéries VP(-)- Fermentation butanédiolique : Les Enterobacteries VP(+), Listeria monocytogenes,

la plupart des Vibrio et Aeromonas

2.3.2. Fermentation lactique :On distingue 3 modèles:- Fermentation Homolactique : retrouvée chez les Streptocoques : ( gaz - , PH très

acide)- Fermentation Hétérolactique: retrouvée chez les Lactobacilles : (CO2+++, PH

acide).- Fermentation Aceto-lactique: retrouvée chez des bactéries du genre

Bifidobacterium : acide lactique + acide acétique.

2.3.3. Fermentation Alcoolique: C'est une fermentation retrouvée chez les champignons et les cellules végétales.

2.3.4. Fermentation Butyrique :Elle aboutit à l'Acetate , le Butyrate, H2 et CO2 et qui est retrouvée chez les

Clostridies dits Saccharolytiques.

Chapitre 4: La Croissance bactérienne

1. Méthodes de mesure de la croissance

2. Les différentes courbes de croissance

3. Classification des milieux de culture

Mme : BELKHIRI Farida (MCB)Microbiologie en 2019/2020

• I. Définition: • 1. La croissance bactérienne signifie le dédoublement à intervalle

régulier du temps de la masse bactérienne et du nombre de cellules d’une culture bactérienne.

• Une bactérie, donnant naissance par scissiparité , à 2 nouvelles bactéries identiques.

• 2. Temps de génération: Temps requis pour un dédoublement (division) ex. E. coli :TG= 20mn, M. tuberculosis : TG= 20 h

• 3. Taux de croissance: nombre de divisions par unité de temps.

II. Conséquences de la croissance bactérienne: • Au cours de la croissance, le milieu s’appauvrit en éléments

nutritifs disponibles et s’enrichit en produits du catabolisme, souvent toxiques.

• Des modifications touchent le pH, le potentiel Redox (oxydoréduction) , la pression osmotique …

I. Méthodes de mesure de la croissance

• I. Mesure du nombre : comptage total des cellules• 1. Numération de cellules vivantes et mortes : La méthode est pratiquée

pour: Les microbes (Bactéries, Levures et Spores de mycètes). • Le nombre de bactéries dans une suspension peut être déterminé

directement par comptage des cellules bactériennes sur une lame spéciale = Cellule de comptage (Thoma, hématimètre de Mallassez).

Hématimètre de Mallassez: Volume du quadrillage total: 1µl . Dimensions d’une bande: L: 2.4 mm. L: 2 mm, H (ou profondeur): 0.2 mm; Constitué de: 100 rectangles d’égales surfaces.

Cellule de Nageotte : le quadrillage total constitué de : 40 bandes (Chaque bande a un volume de 1,25 microlitre) ; Dimensions d'une bande : L : 10mm, l : 0,25mm, H (ou profondeur) : 0,50 mm

• La cellule de Malassez: • Est une lame de verre

spéciale comportant 2 rigoles qui délimitent une surface plane.

• Au centre de cette surface plane est tracé un quadrillage délimitant 100 rectangles.

• Lorsque on place la lamelle, celle-ci est maintenue à une certaine distance du quadrillage, délimitant un volume de 0.01 mm3 = 1 µl

• Méthode• On dépose, entre hématimètre et lamelle, une goutte de l'échantillon (culture

bactérienne liquide), dilué ou non ;• On compte dans le quadrillage (volume précis: 1 µl) les éléments voulus (cellules

bactériennes) ;• On ramène le résultat obtenu en éléments par litre de la culture mère (ou dilution).• Si dilution n’oubliez pas de multiplier le nombre obtenu par le taux de dilution.

Comment?a. On limite le comptage dans 10 rectangles, et on totalise

le nombre de cellules présentes dans chaque rectangle c. Il est convenu de ne tenir compte que des cellules

positionnées sur les cotés droits et inferieurs des rectangles.

d. On fait ensuite la somme des cellules comptées et on divise ce nombre par 10 (nombre de rectangles comptés). On obtient ainsi le nombre de cellules par rectangle.

e. On multiplie le nombre obtenu par 100 pour connaitre le nombre de cellules par 1µl.

2. Dénombrement des bactéries cultivablesLa croissance bactérienne est révélée par:• L’apparition de colonie dite Unité Formant Colonie (UFC) si c’est milieu

solide. Ou par l’apparition de trouble si c’est un milieu liquide.• Donc on peut compter les colonies sur un milieu solide pour déterminer

le nombre des cellules initiales dans le volume ensemencée d’unesuspension bactérienne.

Méthode:1. Préparation des dilutions successives• Prenez 1 ml de la suspension bactérienne avec une pipette graduée, et transverser

le dans un tube contenant 9 ml d'eau physiologique. Vous venez de réaliser unedilution au 1/10. C'est à dire que si votre suspension pure contenait 10 000bactéries/ mL votre second tube en contient maintenant 1 000 / mL.

• Renouveler l'opération en changeant de pipette et en versant de nouveau 1 mLdans un nouveau tube d'eau physiologiqueet ainsi de suite jusqu'à ce que laconcentration en bactérie devienne relativement faible.

• Remarques : Les dilutions doivent être faites en milieu aseptique.Homogénéisez bien vos tubes entre chaque dilution.

• Annotez vos tubes : (1,2,3,....) ou 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-5,10-6, 10-n

Méthode

• 2. Ensemencement • a. Ensemencement en masse :• Prenez la dernière pipette utilisée lors de la dernière dilution (10-6), prélevez 1 ml

de dilution que vous répartirez en goutte au fond de la boite correspondante vide. Ajouter ensuite 15 ml de milieu solide en surfusion (environ 45°C).

• Attention: trop chaude, la gélose tue les bactéries. • b. Ensemencement par étalement :• Sans changer de pipette remontez à la dilution supérieure (10-5), prendre 0,1 ml,

répartir sur la gélose dans une boite de Pétri et étaler à l’aide d’un étaloire.• Attention: avant d’ensemencer, bien mélanger le tube de dilution.• 3. La membrane filtrante :• On verse les 10 ml de la dernière dilution (ex. 10-7) dans l’entonnoir de l’appareil

de filtration. Faire fonctionner l’appareil. Puis on ensemence le filtre (bactéries sur la face en haut, qui ne touche pas le milieu) sur le milieu gélosé.

• 3. Incubation• Mettez à incuber à 37°C pendant 24 H.• 4. Dénombrement de la Flore mésophile • A la sortie de l'étuve, compter le nombre de colonies, ce qui nous donnera un

nombre obtenu à partir de la dilution. Pour avoir le nombre de bactéries dans la suspension pure il faut faire le calcul.

• On considère que les colonies sont dénombrables si leur nombre est compris entre 30 et 300. Au-dessus de 300, elles sont indénombrables, en dessous de 30 on considère qu'elles sont trop rares pour être dénombrées.

• 5. Calcul du nombre d’UFC/ml• La formule mathématique suivante peut être utilisée :• N = n x 1/V x 1/d ou UFC=N/(V*F)• Où N est le nombre des unités formant colonies (UFC) par ml de la suspension

pure• N est le nombre de colonies dénombrées dans les boites de Pétri• 1/V est l’inverse du volume d’inoculum utilisé (par exemple au cours de

l’ensemencement par étalement, on a utilisé 0,1 ml donc 1/V = 1/0,1 =10).• 1/d inverse de la dilution (par exemple au cours de l’ensemencement par

étalement, on a utilisé la dilution 10-5 donc 1/V = 1/10-5=105).

• 3. Approches optiques: • Il faut que la concentration en bactéries atteigne au moins 107/ml afin

que le milieu commence à apparaître trouble.• détermination visuelle de la turbidité: turbidimétrie -estimation d'une

concentration particulaire par l'évaluation (macroscopique, à l'oeil) d'un trouble et par comparaison avec une gamme étalon (ex: étalon de Mac Farland) -peu précise –donne un ordre de grandeur:

• Pas de trouble = moins de 107 bactéries/ml• Trouble léger = 107–108/ml• Trouble important = 108–109/ml• Trouble très important = plus de 109/ml (les cultures atteignent rarement

plus de 1010/ml)• Utilisation éventuelle d’une gamme standard de McFarland: • 0,5 Mc farland = 107–108UFC/ml -

• II. Mesure de la masse• 1. Méthode directe: détermination du poids sec des organismes:• culture/centrifugation/lavage/séchage à 100-110°C dans un four/pesées -e.g.

croissance des mycètes ou levure• méthode longue et peu sensible/précise, pas de distinction entre les vivantes et

les mortes.• 2. Mesure de l’activité (méthodes indirectes) • a-Mesure de la consommation de substrat• Le substrat peut être carboné, un nutriment azoté, de l'oxygène ou un facteur

spécifique de croissance. • b-Mesure de constituants cellulaires: le constituant idéal devrait être

ubiquiste, disparaître rapidement des cellules mortes, absent du milieu, constant.

• Exp.• Dosage de l’azote cellulaire (Kjeldal, Bradford)• Dosage par bioluminescence des nucléotides tels ATP, FAD, FMN (ex: ATP par

luciférase de luciole dépendante de l’ATP–on peut détecter 104bactéries/ml)• Mesure des produits d’excrétions (ex: CO2)• Mesure des variations physico-chimiques du milieu (ex: pH, potentiel redox,

conductivité/impédance, chaleur)

• L’ATP-métrie correspond à la réaction suivante. • ATP + luciférine + O2 ------>AMP + PPi + oxyluciférine + lumière • La quantité de lumière émise est inversement proportionnelle à la

croissance des bactéries. Elle peut être mesurée grâce à un luminométre. (1pgATP ≈ 1 000 bactéries).

II. Les différentes courbes de croissance

• Paramètres de la croissance• Ces paramètres sont appelés également constantes de la croissance. • 1-Le temps de génération= G • 2-Le taux de croissance = μ • La division cellulaire répond une progression exponentielle à temps

régulier. c-à-d: 01 cellule donne 02 cellules, qui donnent 04 cellules, puis 16, puis 32 et ainsi de suite.

• Le temps nécessaire au doublement du nombre de cellules est appelé temps de génération (G).

• Le temps de génération est spécifique à chaque espèce et il dépend des conditions environnementales.

• (G) est de 20 minutes pour Escherichia coli, de 1000 minutes pour Mycobacterium tuberculosis.

• G = t/n (t : temps connu, n : nombre de division) • Ex. E.coli G = (60 mn /3) = 20 mn • Le taux de croissance bactérien est le nombre de divisions par unité de

temps : μ = n/t =1/G (n : nombre de division t : temps connu)•

1- Courbe de croissance en milieu non renouvelé (culture discontinue)

• Dans une culture discontinue ou la croissance n’est pas synchrone et ou les nutriments s’épuisent avec le temps, la croissance suit une courbe à 04 phases: La phase de latence, la phase de croissance exponentielle, la phase stationnaire et la phase de déclin.

• Pour obtenir cette courbe, on ensemence un milieu de culture favorable et on assure le suivi de la croissance bactérienne en réalisant des dénombrements bactériens à des intervalles de temps réguliers.

• I : Phase de latence• Le taux de croissance est nul.• La durée de cette phase dépend de plusieurs facteurs : • - l'importance de l'inoculum : les bactéries doivent d'abord détoxiquer le milieu

en le débarrassant des traces d'éléments toxiques qui contaminent, en général, les milieux de culture (métaux lourds par ex.). Plus l'inoculum est important, plus le temps nécessaire à la détoxification est court.

• - l'âge des bactéries : les "vieilles" bactéries, introduites dans un milieu neuf, doivent d'abord réparer tous les dommages subies ; elles doivent donc restaurer leur état physiologique normal avant de commencer à se multiplier. Donc, plus la culture ayant servi d'inoculum est vieille, plus la durée de cette phase est longue.

• - la composition du milieu : les bactéries doivent synthétiser les enzymes adaptées au nouveau milieu de culture. La diauxie illustre clairement cette adaptation.

• 2-Phase de croissance exponentielle • La vitesse de division est constante et maximum. • La majorité des bactéries sont dans un bon état physiologique et

se divisent de façon exponentielle. • Le temps de génération des bactéries pendant cette phase est le

plus court. • La presque totalité de la masse cellulaire est représentée par des

cellules viables (mortalité nulle).

• 3-Phase stationnaire : • Il y a une compensation entre les bactéries qui meurent, par autolyse,

et celles qui continuent à se multiplier. • Cette phase est déclenchée par l'épuisement du milieu, particulièrement

le facteur limitant, et l'accumulation de déchets toxiques (ex.: acides organiques) libérés dans le milieu par les bactéries.

• Un facteur limitant est un facteur indispensable à la croissance bactérienne qui s'épuise le premier dans le milieu.

• 4. Phase de déclin (μ < 0) • le nombre de bactéries viables diminue durant cette phase. Ceci est

dû à une lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes (autolyse).

• le taux de croissance maximum peut être déterminé graphiquement, durant la phase exponentielle de croissance, comme suit:

• Le taux de croissance est très variable selon les espèces et les conditions de culture.

II : Phase d'accélération pendant laquelle la vitesse de croissance augmente.IV : Phase de ralentissement (décélération) où μ diminue.

• Le phénomène de diauxie, est une croissance qui se traduit par une courbe biphasique.

• Cette croissance est observée lorsqu’on utilise un milieu synthétique contenant deux sources de carbone.

• ex: Dans un milieu contenant du glucose et du lactose, les bactéries vont utiliser en premier le glucose grâce à des enzymes constitutives.

• La dégradation du lactose est sous la dépendance d'enzymes inductibles dont l'induction est réprimée en présence de glucose. Lorsque le glucose est consommé, les bactéries utiliseront le lactose et initieront une nouvelle phase de croissance exponentielle après un temps de latence adaptatif.

2- Phénomène de diauxie (deux croissance en grec)

• Dans un milieu non renouvelé, la phase de déclin est vite atteinte. Cela crée des problèmes pour les bioindustries.

• Du point de vue économique, il est très important de prolonger la phase exponentielle plusieurs jours.

• La solution est de renouveler constamment le milieu de culture et en récupérant les produits du métabolisme et les déchets.

• Les croissances continues sont obtenues à l'aide de chemostat et d’autres équipent plus complexes. Le principe du chemostat repose sur le control indépendamment, du taux de croissance et de la production de biomasse. Cela est possible en jouant sur le taux de dilution et la concentration des nutriments. Le système est constamment agité et alimenté en air stérile.

3- Courbe de croissance dans un milieu renouvelé (Cultures continues )

III. Classification des milieux de culture

• Milieu de culture: Un milieu de culture est composé d’un mélange desubstrats nutritifs (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres,etc), d’un système tampon pour éviter les variations importantes du pH,de sels minéraux et de vitamines. Il est possible d’ajouter d’autresfacteurs de croissance (sang, protéines, hémoglobine, vitamines).

• L’inoculum: Les bactéries introduites dans le milieu de culture.• Les micro-organismes qui s’y développent forment une culture.

1. Selon la consistance • Selon les analyses et les expériences à effectuer, on peut cultiver des bactéries sur:• a. Des milieux liquides: qu’on appelle bouillons de culture. • Dans un milieu liquide, les micro-organismes se développent sous forme d’un

trouble ou voile en suspension. • b. Des milieux solides: obtenus par l’ajoute de l’agar-agar (polysaccharides isolés

des algues) aux milieux liquides.• Sur un milieu solide, les bactéries se développe sous forme de colonies • Les milieux solides peuvent être préparés sur boite de Petri ou en tube (gélose

inclinée, gélose profonde). Selon la quantité d’agar rajoutée, on a des géloses solides (1,5%) et des géloses molles (0,75%).

• Il est déconseillé de dépasser 1,5% car cela pourrait inhiber la croissance de certaines bactéries à cause d’une forte pression osmotique.

• L’agar fond lorsqu’on la réchauffe à 100°C et se solidifie lorsqu’elle se refroidit (dès 40°C). Généralement, on prépare les boites de Petri avec une gélose stabilisée à 50°C.

2. Selon la composition chimique • 1- Les milieux synthétiques • De composition chimique bien définie, qualitativement et quantitativement. Ils sont

constitués chimiquement, de substances pures. Ils sont utilisés pour les bactéries autotrophes ou des tests bien précis.

• 2-Les milieux complexes ou empiriques • Très nutritifs de composition indéfinie. Utilisés pour la culture de nombreux

organismes. Se sont les plus appropriés. Employés pour la culture des chimiohétérotrophes.

• Ils sont constitués d’extrait de soja, de viande, de levure, digérés par des enzymes. Ils fournissent une source de carbone, d’azote, vitamines B. Leur composition varie d’un lot à l’autre.

• 3. Les milieux semi-synthétiques • Comme leur nom l’indique c’est un mélange de composés chimiques purs et de

substances naturelles empiriques. Exemple milieu de Chapman, qui est également sélectif pour les Staphylocoques. Peptone (10 g), Extrait de viande de boeuf (1 g) Chlorure de sodium (75 g), Mannitol (10 g), Rouge de phénol (0,025 g), Agar (15 g), Eau distillée (qsp 1 Litre). pH = 7,4.

• 1. Les milieux sélectifs • Ces milieux inhibent la croissance de la majorité des micro-organismes et stimulent celles des

bactéries qu’on cherche à isoler. On fait intervenir un pH acide, une concentration de sel élevée. • 2. Les milieux différentiels • Contiennent un indicateur (colorant) qui permet de différencier deux types bactériens qui

poussent sur le même milieu, mais ne dégradent pas tous les deux un substrat particulier. La gélose Hektoën, qui différencie la fermentation de 3 glucides (lactose, saccharose et salicine) ainsi que la production de sulfure d'hydrogène.

• Les milieux enrichis • Ils contiennent, outre les composants de base, des composants indispensables aux bactéries, que

celles-ci ne peuvent pas synthétiser. Ce sont des milieux utilisés pour l'obtention des bactéries dites exigeantes et auxotrophes. Par exemple : les milieux au sang frais.

• Les milieux d'identification • Utilisés dans la mise en évidence des caractères biochimiques des bactéries dans l'identification

différentielle. • Les milieux de conservation • Se sont des milieux pauvres au sein desquels les bactéries survivent dans un état de vie ralentie. • Conservation des souches pures • Les souches pures peuvent êtres conservée à température ambiantes en tube sur géloses

inclinées, par lyophilisation dans des ampoules scellées, ou par congélation en présence glycérol (40%). La congélation est la meilleure façon de procéder pour le long terme.

3. Selon l’utilisation