1. Protéines - ?· Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de Médecine Pierre…

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    PCEM1

    1. Protines

    CAHIER D'EXERCICES de BIOCHIMIE

    2009-2010

    EDITE PAR LE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 2

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    CAHIER D'EXERCICES POUR PCEM1

    BIOCHIMIE

    I . P R O T E I N E S

    S O M M A I R E Page

    1. Techniques d'tude des protines . . . . . . . . 3

    2. Structure des protines . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3. Fonction des protines . . . . . . . . . . . . . . 12 4. Enzymologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 4.1 Gnralits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 4.2 Enzyme Michalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4.3 Enzyme Allostrique . . . . . . . . . . . . . . . . 17 5. Problmes de rvision . . . . . . . . . . . . . 17 6. Annales du concours : QCM et QROC . 21

    Image de couverture : Structure d'un cristal de BRCA2, une protine dficiente dans des formes hrditaires de cancer du sein (Science-13sep2002 : www.sciencemag.org)

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    1. TECHNIQUES DETUDE DES PROTEINES 1.1

    PM ( kDa )

    Ve ( ml )

    bleu dextran* 1000 80 urase 500 90 aldolase 150 115 srum albumine 65 150 ovalbumine 45 170 chymotrypsinogne 25 190

    En chromatographiant des protines de poids molculaires connus sur une colonne de gel filtration, on peut dterminer leur volume dlution (Ve) et tracer une courbe dtalonnage qui permet dvaluer le poids molculaire dune protine inconnue. Les donnes ci-contre sont utilises pour tracer la courbe dtalonnage ci-dessous. (* le bleu dextran est un polymre de haut PM) lysozyme 14 200

    Une protine X, chromatographie dans les mmes conditions exprimentales, est lue un volume dlution de 130 ml.

    a- Justifier lordre dlution des protines de PM connus. b- Evaluer le PM de la protine X. Cette protine X est ensuite analyse par lectrophorse SDS-PAGE, et on dtecte une seule bande correspondant un PM apparent de 25 kDa. Aprs traitement de la protine X par un excs de -mercaptothanol, la mme analyse par lectrophorse ne donne toujours quune seule bande 25 kDa.

    c- Sur quel principe est base la dtermination du PM apparent mesur par lectrophorse SDS-PAGE? En quoi diffre-t-il de la chromatographie par gel filtration ?

    d- Que peut-on dire des ponts disulfures de la protine X ? e- Proposer une structure schmatique pour la protine X

    1.2 a. Dans le but de collecter les protines du cytosol, un homognat cellulaire de cerveau de souris est soumis des centrifugations de vitesse croissante :

    - 1ere centrifugation : 1000g pendant 10 minutes. - 2me centrifugation : 20000g pendant 20 minutes. - 3me centrifugation : 80000g pendant 1 heure. - 4me centrifugation de 150000g pendant 3 heures. Parmi les diffrents culots et surnageants obtenus, indiquer celui qui ne contient que les protines du cytosol ?

    20 30 50 70 200 300 500 700

    Volume dlution

    PM (kDa)

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    b.Les protines sont extraites de cette fraction cytosolique et soumises une

    chromatographie daffinit qui permet de purifier une protine. - Une chromatographie de filtration sur gel de la protine purifie indique la prsence

    dune protine majoritaire dune masse molculaire denviron 100 000 daltons. - La protine purifie est ensuite analyse par lectrophorse SDS-PAGE. On dtecte deux

    bandes majoritaires de 75 000 et 25 000 daltons. - La mme analyse est ralise sur un deuxime chantillon de la fraction purifie

    pralablement traite par le -mercaptothanol. On dtecte alors deux bandes de 50 000 et 25 000 daltons.

    Que peut-on dduire de ces donnes quant la structure de la protine purifie ? 1.3 Expliquer et commenter ces affirmations. a. La solubilit minimale dune protine est atteinte son point isolectrique (pHi). b. Pour une valeur de pH suprieure son pHi, une protine porte toujours une

    charge ngative et pour une valeur de pH infrieure son pHi, une protine porte toujours une charge positive.

    c. Lajout dune quantit importante de sulfate dammonium entrane la prcipitation de nombreuses protines.

    1.4 Une solution contenant de lalbumine (pHi= 4,6), de la -lactoglobuline (pHi = 5,2) et du

    chymotrypsinogne (pHi= 9,5) est charge sur une colonne de DEAE cellulose pH 5,4. (Le DEAE est une molcule charge positivement)

    La colonne est lue par un gradient de NaCl de concentration croissante. Proposer un ordre dlution de la colonne pour ces protines.

    1.5 Soit une protine (A) oligomrique dun poids molculaire (PM) de 240 000 Daltons. Sa

    structure quaternaire est tudie par la dtermination des poids molculaires lissue de divers traitements:

    a. Traitement par le -mercaptothanol 0,1M : donne uniquement des structures protiques dun PM de 120 000 Da.

    b. Traitement par lure 4M : donne uniquement des structures protiques dun PM de 80 000 Da.

    c. Traitement par le -mercaptothanol 0,1M et lure 4M : donne uniquement des structures protiques dun PM de 40 000 Da.

    Quels sont les effets de ces diffrents traitements ? Ces rsultats ont-ils t obtenus par gel-filtration ou SDS-PAGE ? Proposer un volume dlution en gel filtration sur la colonne de lexercice 1.1 de

    la protine (A) dans un tampon 0.1M -mercaptothanol. Proposer un schma de migration de la protine (A) en SDS-PAGE. Quelle est la structure quaternaire de cette protine ?

    1.6 Influence du pH sur la conformation dun peptide. Le squelette peptidique est flexible. Il se replie de manire adquate pour associer les rsidus chargs par des liaisons ioniques (dans cet exemple). Ce peptide possde des conformations variables en fonction du pH. A laide des valeurs de pKa des acides amins donnes ci-dessous, attribuer aux pH suivants : pH 2, pH 5,5 pH 7, pH 11 et pH 13 une des conformations proposes pour le peptide tudi.

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    B

    C

    D

    E

    A

    1.7 On se propose de purifier, partir de srum humain, la protine de transport plasmatique des hormones sexuelles, dnomme TEBG (testosterone estradiol binding globulin) ou encore SBP (sex steroid binding protein). La TEBG prsente la proprit de lier de faon non covalente et avec une forte affinit la testostrone et lestradiol. Cette proprit est mise profit pour suivre les diffrentes tapes de la purification de la TEBG : aprs incubation du srum avec de la testostrone radioactive qui joue le rle de traceur, on suit le complexe TEBG-testostrone radioactive en mesurant la radioactivit. Ces tapes sont rsumes ci-dessous :

    a. Traitement du srum par du sulfate dammonium 50% de saturation et centrifugation.

    a.1 Quel est lintrt de ce traitement ?

    a.2 La radioactivit est mesure dans le culot et dans le surnageant et on constate que seul le culot est radioactif : sur laquelle des fractions (culot ou surnageant) faut-il poursuivre la purification ?

    b. La fraction choisie en (a.2) est dialyse contre du tampon phosphate 20 mM, pH 6, NaCl 50 mM.

    Quel est lintrt de cette tape de dialyse ce stade de la purification ?

    c. La solution obtenue en (b) est chromatographie sur une rsine changeuse danions ; diverses protines, dont une fraction radioactive, sont lues par diminution progressive du pH jusqu 5.

    c.1 Sur quelle proprit des protines est base la chromatographie sur rsine changeuse dions ?

    c.2 Que peut-on dire du pHi de la TEBG ?

    d. La fraction radioactive isoles en (c) est dpose sur une colonne de chromatographie par gel filtration (Sephadex G100) et lue par un tampon phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7. Le profil dlution est reprsent sur le schma ci-dessous (DO = densit optique). La colonne de Sephadex G100 a t pralablement calibre avec 4 protines de masses molculaires connues dont les volumes dlution respectifs sont indiqus sur ce mme schma (flches).

    AA pKa

    chane extrmit latrale terminale

    Asp 3,9

    Glu 4,1

    His 6,0

    Lys 10,5

    Arg 11,5

    C-terminal 4,2

    N-terminal 10,6

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    d.1 Sur quelle proprit des protines repose la filtration sur gel ? d.2 A quoi correspond la DO mesure 280 nm et que permet-elle de suivre ? d.3 Peut-on dire que la fraction radioactive isole en (c) et chromatographie ici tait

    trs pure ? d.4 Proposer une valeur de volume dlution pour la TEBG. d.5 En utilisant la grille semi-log ci-dessous, donner une estimation du poids molculaire

    de la TEBG.

    e. Une aliquote de la fraction radioactive obtenue en (d) est analyse par lectrophorse en gel de polyacrylamide en conditions non dnaturantes (absence de SDS), pH 7. Le gel ainsi obtenu est trait par le bleu de Coomassie (coloration spcifique des protines) puis scann dans un dtecteur de radioactivit, ce qui permet de voir quelle bande de llectrophorse est associe la radioactivit. Les rsultats sont schmatiss dans la figure ci-dessous, A. e-1 Sur quelle proprit est base llectrophorse utilise ici ? Quelle est la

    diffrence avec llectrophorse pratique en prsence de SDS ? e-2 Que peut-on dire de la puret de la fraction radioactive obtenue en (d)

    f. Compte tenu des proprits biologiques de liaison de la TEBG, proposer une technique de

    purification de cette protine.

    10 20 30 40 50 60 70 80 90

    DO 280 nm Radioactivit

    Ve (ml)

    94 kDA (10 ml)

    68 kDA (30 ml)

    43 kDA 60 ml)

    30 kDA (80ml)

    70

    50

    30

    20

    Ve (ml)

    PM (kDa)

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    g. On utilise la technique mentionne en (f) et on obtient une nouvelle fraction radioactive que lon analyse comme en (e) (figure ci-dessous, B) : que peut-on dire de cette dernire fraction obtenue, en terme de puret ?

    h. Sur la fraction purifie obtenue en (g) on tudie la structure quaternaire de la TEBG en utilisant la technique de filtration sur gel comme en (d), dans diffrentes conditions exprimentales :

    1- dpt dans des conditions natives. 2- dpt aprs traitement par lure 8M. 3- dpt aprs traitement par lure 8M et le mercaptothanol en excs.

    Les rsultats sont rsums dans la figure suivante.

    Proposer une interprtation de ces derniers rsultats

    2. STRUCTURE DES PROTEINES

    2.1 Citez le ou les acide(s) amin(s) correspondant chacune des proprits suivantes : a. sa chane latrale possde un atome de soufre, mais pas de groupement thiol. b. possde un groupement amin substitu c. sa chane latrale est aromatique et phosphorylable. d. joue un rle important dans le maintien de la structure des protines par la capacit de

    sa chane latrale tablir des liaisons covalentes rversibles par oxydorduction.. e. est capable de former des liaisons H par lintermdiaire de sa chane latrale. f. est capable de former des liaisons ioniques par lintermdiaire de sa chane latrale. g. possde une chane latrale fonction basique majoritairement non charge pH7. h. sa chane latrale contient une fonction amide.

    i. possde pH7 un trs fort excdent de charges (+).

    radioactivit

    dpt

    +

    Sen

    s de

    mig

    ratio

    n

    A

    Etape (e)

    radioactivit +

    B

    Etape (g)

    DO 280 nm

    Ve (ml)

    94 kDA (10 ml)

    68 kDA (30 ml)

    43 kDA (60 ml)

    10 20 30 40 50 60 70

    1 2

    3

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    2.2 Caractristiques des acides amins Quelle partie de la molcule d'un acide amin permet de le classer dans les acides amins

    polaires ou apolaires ? Dfinir les sries D et L pour les acides amins.

    . A quelle srie appartiennent les acides amins constitutifs des protines chez lhomme ? 2.3 La liaison peptidique : Donner une dfinition et dcrire son mode de formation. Citer les trois principales caractristiques structurales d'une liaison peptidique. La mesure de la longueur de la liaison C-N entre deux acides amins est de 0,132 nm,

    donc intermdiaire entre une liaison simple C-N (0,149 nm) et une double liaison C=N (0,127 nm).

    Quelles indications ce rsultat donne-t-il sur certaines proprits de la liaison peptidique et sur les possibilits de rotation autour de cette liaison ?

    2.4 Soient les peptides suivants :

    ( 1 ) V a l - L e u - M e t - T y r - P h e - G l y - L e u - A l a - T r p - G l y ( 2 ) A l a - V a l - G l u - A l a - L e u - A r g - I l e - V a l - G l u - S e r

    a. Lequel de ces deux peptides prsente la plus forte probabilit dadopter une conformation en hlice ? b. Dans le peptide (2), lacide amin numro 6 est mut en proline :

    Quelles sont les consquences pour la structure du peptide? c. Quelles sont les consquences du traitement lure de ces deux peptides ? d. Pourquoi les protines transmembranaires ont-elles une proportion importante de

    structure en hlice ? e. Le peptide (2) possde des proprits amphiphiles. Pourquoi ?

    2.5 Dans une protine globulaire hydrosoluble, quels acides amins dans la liste suivante :

    mthionine, histidine, arginine, phnylalanine, valine, glutamine, acide glutamique, pensez vous trouver :

    a. la surface de la protine ? b. lintrieur de la protine ?

    2.6 Dcrire les liaisons labiles impliques dans la formation de l'hlice du type le plus souvent

    rencontr dans la structure secondaire des protines. Quels sont les traitements qui permettent la rupture de ces interactions ? Quel est leffet de ces traitements sur les feuillets ? Quelles peuvent tre les consquences de ces traitements sur les protines ?

    2.7 Le droulement d'une hlice s'accompagne d'une

    diminution de son pouvoir rotatoire. L'acide polyglutamique (Glu)n est en conformation d'hlice pH3. Quand le pH augmente, le pouvoir rotatoire diminue. De la mme faon la polylysine (Lys)n est hlicodale pH 10, mais son pouvoir rotatoire dcrot pH acide.

    Expliquez l'effet du pH sur la conformation de (Lys)n et (Glu)n.

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    2.8 On dispose de 3 tripeptides de squences connues : 1 : Leu-Asp-Leu 2 : Leu-Lys-Leu 3 : Asp-Leu-Lys.

    a- On dpose un mlange de ces 3 peptides sur un gel dlectrophorse pH 7 (sans SDS) et, aprs migration et rvlation, on observe le schma ci-dessus : Compte tenu de la polarit indique, quels peptides correspondent les taches notes a, b et c ?

    b- Le mme mlange est analys sur un gradient de pH 3-10. En utilisant une reprsentation similaire la question prcdente, indiquer la position relative de ces 3 peptides aprs migration, selon que le mlange est dpos aux extrmits droite ou gauche, ou bien au milieu du gel. (Prciser sur le schma les zones acide et basique ainsi que la polarit des lectrodes).

    2.9 Lhydrolyse totale dun octapeptide P8 permet didentifier les acides amines suivants :

    Ala , Asp , Arg , 2 Gly , Phe , Ser et Val Il est possible, par action dune aminopeptidase sur un peptide, didentifier lacide amin qui est en position N-terminale ; de mme, une carboxypeptidase permet didentif...

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