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PHYSIOLOGIE DES CELLULES SANGUINES

Professeur David SMADJA

2- Hématopoïèseet cytokines hématopoïétiques

2020-2021

FACULTE DE PHARMACIE DE PARIS

1- Hématopoïèse1a- Définitions1b- Propriétés des cellules souches, progéniteurs et précurseurs hématopoïétiques1c- Tests fonctionnel pour l’étude l’hématopoïèse

2- Eléments de régulation- Niche hématopoïétique- Facteurs de croissance, cytokines- EPO / régulation hématopoïèse /oncogenèse

3- Utilisation cliniques des cytokines

Hématopoïèseet cytokines hématopoïétiques

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� L’hématopoïèse est l’ensemble des processus qui concourent à la production de cellules hématopoïétiques différenciées à partir des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques.

� Les processus sont l’auto renouvellement des cellules souches (CSH), la prolifération ou amplification cellulaire, la différenciation cellulaire, ainsi que la régulation de ces processus.

� Dans un organisme adulte, l’hématopoïèse siège dans la moelle osseuse.

� Le microenvironnement médullaire ou stroma participe à la régulation de l’hématopoïèse.

Quelques définitions…

Les Cellules Souches

Intestin Peau CerveauTissu

Hématopoïétique Muscle

EctodermeMésodermeEndoderme

Foie

TOTIPOTENTES

PLURIPOTENTES

MULTIPOTENTES

PROGÉNITEURS

¢ MATURES

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Un compartiment de progéniteurs� en cycle , grande capacité de prolifération

Un compartiment de cellules souches� le plus souvent hors cycle cellulaire

Un compartiment de précurseurs� en cycle, en phase de différenciation

Un modèle hiérarchique composé de trois compartiments

• Hématopoïèse = remplacement continu et régulé des cellules sanguines

– Continu: vie intra-utérine jusqu’à la mort

– Régulé: homéostasie à l’état de base et adaptation aux situations pathologiques

• Production de 1013 cellules jour (2 millions de GR / seconde)

• Cellules souches hématopoïétiques

• Moelle osseuse:– à partir du 4ème mois de la vie fœtale dans tous les os jusqu’à 5ans

– Puis os courts et plats (sternum, os iliaques…)

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Hématopoïèse normaleHématopoïèse normale

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Hématopoïèse normaleHématopoïèse normale

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Qu’’’’est ce qu’’’’une cellule souche hématopoïétique (CSH) ?

• Cellule multipotente capable de régénérer plusieurs populations cellulaires

• Chez l’’’’homme : présentes dans moelle osseuse et sang de cordon

• Faible % dans le sang circulant périphérique en l’’’’absence de stimulation (« mobilisation »)par des facteurs de croissance

Lin -CD34+CD38-cKit +CD133 +

CSH

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Propriétés des CSPropriétés des CS

1 - Quiescence : maintien hors du cycle cellulaire

2 - Production continue des cellules sanguines

- autorenouvellement : retour en G0 après mitose-multipotence : génération de toutes les lignées-expansion ou différenciation

Définition fonctionnelle :Reconstituer l’hématopoïèse d’un animal irradié

Tests fonctionnels pour l’étude de l’hématopoïèse

CSH humaines?

CSH

Cultures à long terme

Pro

génit

eurs

LTC-ICMy, Ly

Tests clonogéniques

CFC

PRECU

SEU

RS

Cellule

s en c

ours

de m

atu

rati

on

Caractéristiques phénotypiques

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1- Tests in vivo de transplantation xénogénique

SCID-RC3 - 4 mois

NOD-SCID

Irradiation sub-létale

(+ anti-CD122)

5 - 12 sem

2 sem

En pratique : identification des cellules souches humaines

Milieusemi-solide+ cytokines

2- Tests in vitro de culture

LTC-IC

Milieu+ sérum+ stroma

CFC

Tests clonogéniques

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Propriétés des progéniteursPropriétés des progéniteurs

���� Production continue des cellules sanguines

- multipotence pour les plus immatures- prolifération - détermination : engagement dans la spécialisation

Progéniteurs multipotents : CFU-GEMMProgéniteurs bipotents : CFU-E-M (érythro et méga)Progéniteurs moniopotents : CFU-E (érythro)

Propriétés des précurseursPropriétés des précurseurs

���� Production des cellules sanguines matures

en réponse à un facteur de croissance

- Survie- Prolifération

- Différenciation

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2a- Interactions directe cellules stromales - CSH : contacts

2b- Médiateurs : cytokines, chimiokines …

2c- Facteurs de transcription

2- Régulateurs principaux2- Régulateurs principaux

REGULATION DES CSHREGULATION DES CSH

- Auto-renouvellement

- Quiescence

- Différenciation

Facteurs extrinsèques(Cytokines, adhésines)

Facteurs intrinsèques(Facteurs de transcription)

et

Propriétés Régulateurs

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2a- Interactions directes

cellules – cellules:

Niche des cellules souches

Niche des cellules souches (CS) = microenvironnement médullaire

Niche des cellules souches (CS) = microenvironnement médullaire

Notion de niche de CS auniveau de la zonetrabéculaire, supportéespar contacts cellulairesavec :

� Cellules stromales

� Ostéoblastes /ostéoclastes

� Cellules endothéliales

Kiel et al, Nature Immunology 2008

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Niche des cellules souches = microenvironnement médullaire

Niche des cellules souches = microenvironnement médullaire

• Niche procure aux CS les facteurs de communication intercellulaire permettant :– D’attirer les CS vers cet environnement (chimiokines)

– Adhésion à cet environnement (molécules d’adhésion)

– Survie, prolifération et différenciation des CS (facteurs de croissance)

– Contrôle de la mobilisation des CS vers circulation

- Il existe 2 niches distinctes dans la moelle osseuse� Niche Ostéoblastique: Ostéoblastes et autres CSM

� Niche vasculaire: moins bien définie ���� endothélium spécialisé dans prolifération, différenciation et mobilisation des CS.

Kiel et al, Nature Immunology 2008

Mobilisation des CS/Progéniteurs par Inhibition de la rétention dans la niche

Mobilisation des CS/Progéniteurs par Inhibition de la rétention dans la niche

CS Proteases:-MMPs (MMP2, MMP9)-Elastase des Neutrophiles-Cathepsines

Proteases:-MMPs (MMP2, MMP9)-Elastase des Neutrophiles-Cathepsines

CS

os

Stem cells-Stromal cells interactions

-cKit Rc /mKit ligand-CXCR4 / SDF-1-α4β1 integrins / VCAM1 ou fibronectine

eNOS des cellules stromales �NO dans la nicheeNOS des cellules stromales �NO dans la niche

Les CS vont se loger au contact des cellules des travées osseuses �principalement des ostéoblastes

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2b- cytokines hématopoïétiques2b- cytokines hématopoïétiques

Cytokines

• Glycoprotéines de 8 à 50 kDa

• Messagers de la communication cellulaire

• Propriétés des cytokines:

– Effet pléiotropique

– Cascade

– Redondance

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Mode de sécrétion des cytokines

– Endocrine: consommation à grande distance(EPO, rein)

– Paracrine: consommation à courte distance(stroma médullaire)

– Autocrine parfois: producteur = consommateur

(boucles de régulation)

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Familles des cytokines

• Interleukines: IL-1, …, IL-18

• Interférons: IFN α, β, γ• Colony stimulating factor:

GM/M/G-CSF

• Tumor necrosis factor: TNF, …

• Growth factor: VEGF, FGF, PDGF, …

• Chémokines: CXCL, CXC.. � Ex chemokine = SDF-1/CXCL12 et son Rc CXCR4

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Types de facteurs de croissance hématopoïétiques

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Cellules souches

Progéniteurs

Précurseurs

Cellules matures

FC de promotion

IL-6

FC de promotionSCF, IL-1, IL-4,

IL-6

Flt3 ligand

FC multipotentsIL-3, GM-CSF, Flt3 ligand

FC restreintsEPO, TPO, IL-5G-CSF,M-CSF

Facteurs de promotion et de survie cellulaire :

Stem cell factor (SCF) ou kit ligand

- viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes

- synergie avec d'autres cytokines : croissance des progéniteurs

immatures myéloïdes et érythroïdes (BFU-E)

- Interaction physiologique essentielle pour l'érythropoïèse du foie foetal

Flt-3 ligand :

- croissance des progéniteurs immatures myéloïdes et mégacaryocytaires

FACTEURS DE CROISSANCE HÉMATOPOIETIQUES

FACTEURS DE CROISSANCE HÉMATOPOIETIQUES

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Facteurs de prolifération et différenciation

non spécifiques de lignée : interleukine - 3 (IL-3)interleukine - 6 (IL-6)

spécifiques de lignée :

. lignée granulo-macrophagique : GM-CSF, G-CSF, M-CSF

. lignée éosinophile : IL-5

. lignée érythroïde : Epo

. lignée méga : Tpo

. lignée lymphocytaire :maturation : IL-2, IL-4,croissance : IL-7différenciation plasmocytaire : IL-6

Cytokines: effet pléiotropiques !!!

• Exemple: IL-6– facteur de compétence des cellules souches hématopoïétiques capable

d'induire les cellules souches en phase quiescente G0 vers la phase G1 du cycle cellulaire.

– différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules mégacaryocytaires capables de générer des plaquettes.

– différenciation des cellules B en cellules plasmocytaires, la prolifération des cellules plasmocytaires jeunes et leur différenciation en cellules plasmocytaires matures produisant les anticorps.

– différenciation de précurseurs cytotoxiques T en cellules cytotoxiques et effectrices.

– différenciation des cellules monocytaires en cellules ostéoclastiques capables de résorber l'os.

– cellules non hématopoïétiques:

» inducteur des protéines de phase aiguë de l'inflammation par les hépatocytes. C'est un facteur de prolifération des kératinocytes, un facteur de différenciation des cellules neuronales.

» prolifération des cellules mésangiales.

» principal facteur pyrogénique.28

15

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IL 6

Lympho T cytotoxiques

Résorption osseuse

Lympho T

KératinocytesLignées phéochromocytome

Cellules mésangialescellules rénales

Hépatocytes

CRPSAAFIBHémopexineHaptoglobineAlpha1 AT

Albumine

-

+

Cellules souches

plaquettes

Lympho TPlasmocytes

Cytokines: effet pléiotropiques !Exemple: Il-6

Cytokines: effet pléiotropiques !Exemple: Il-6

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Une même fonction biologique peut être exercée par plusieurs cytokines

� Exemple: IL-6– redondance de cytokines activation d’une même chaîne

transductrice et induction de son homodimérisation ou son hétérodimérisation avec d’autres chaînes transductrices.

– 5 cytokines ayant la même activité biologique que l'IL-6 :

– le ciliary neurotrophic factor ou CNTF

– leukemia inibitory factor ou LIF

– l'oncostatin M ou OSM

– l'interleukine-11 (IL-11)

– cardiotrophine-1

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SCF, IL-1, IL-4, IL-6

31Proérythroblaste

CD15-CD15+

Cellules souches primitives

CFU-GEMM

BFU-E CFU-GM

CFU-Meg

CFU-Mast

CFU-E

Promyélocyte Promonocyte Promégacaryoblaste Mastocyte

GM-CSF

32Proérythroblaste

Cellules souches primitives

CFU-GEMM

BFU-E CFU-GM

CFU-Meg

CFU-Mast

CFU-E

Promyélocyte Promonocyte Promégacaryoblaste Mastocyte

CD15-CD15+

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IL-3

33Proérythroblaste

Cellules souches primitives

CFU-GEMM

BFU-E CFU-GM

CFU-Meg

CFU-Mast

CFU-E

Promyélocyte Promonocyte Promégacaryoblaste Mastocyte

CD15-CD15+

CSF-1 ou M-CSF G-CSF

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CD15+CD15-

Cellules souches primitives

CFU-GEMM

BFU-E CFU-GM

CFU-Meg

CFU-Mast

CFU-E CD15+CD15-

Cellules souches primitives

CFU-GEMM

BFU-E CFU-GM

CFU-Meg

CFU-Mast

CFU-E

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EPO et TPO

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TPOEPO

Proérythroblaste

Cellules souches primitives

CFU-GEMM

BFU-E CFU-GM

CFU-Meg

CFU-Mast

CFU-E

Promyélocyte Promonocyte Promégacaryoblaste Mastocyte

CD15-CD15+

- Glycoprotéine - Demi-vie : 4 à 7 h

- Production rénale à 90 % (cellules tubulaires)

Erythropoïétine

���� Rôle de HIF « hypoxia inducible factor » dans la synthèse EPO

VHL

VHL= protéine de Von Hippel-Lindau

Proline hydroxylase

O2

HIF-1α HIF-1α

Pro Pro Pro

OH OH

Dégradation par protéasome

Pro

HIF-1α

P

Stabilisation de HIF-1αααα, Fixation sur motif HREEt Activation de gènes régulés par PO2 dont EPO mais aussi VEGF …

P

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ReinPO2 / hypoxie tissulaire

GR Circulant

Erythropoïétine

Régulation de la production d’Erythropoïetine par l e rein

Cellule Souche

Lignée-Erythroblastique

Régulation de la production d’Epo

Domaine extracellulaire

Domaine intracellulaire

1 seul domaine TM (peut être absent)

Domaine cytokine

Partie intracellulaire sans activité catalytique propre

N

C

Structure générale des récepteurs de cytokines

Membrane cellulaire

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Récepteur de l’érythropoïétine

N-term

C-term

� cloné en 1989� chromosome 19 � 5 kb, 8 exons

� protéine 508 aa� 55 à 72-78 kDa� exons 7 et 8 du gène : partie

intracytoplasmique

D’Andrea et al, 1989

Epo

Mécanisme d ’activation de R-EPO

P

P

P

PP

P

PP

EpoEpo

JAK2

STAT5

Pi3-K

AKT

Anti-apoptoseCycle cellulaire

Prolifération

MAP-KAnti-apoptose

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Mutation V617F de Jak-2:

• Exon 12 de Jak2• Domaine pseudokinase JH2• Valine à la place d’une phénylalanine sur le codon 617• Conduit à

– Une activation constitituve de jak2– Insensibilité au FC (ex Epo)– Exacerbation de la myélopoïèse via altération mécanismes de

survie/différenciation/prolifération

• Thérapeutique ciblée en cours d’’’’évaluation

-Vitamine A (acide rétinoïque): lignée granuleuse

�cours numéro 3

- Vitamine B12/Folates: lignée érythroblastique (GR) � cours numéro 6

-Vitamine A (acide rétinoïque): lignée granuleuse

�cours numéro 3

- Vitamine B12/Folates: lignée érythroblastique (GR) � cours numéro 6

Facteurs de régulation: pas que des cytokines…

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• 1- Accélérer la reconstitution hématopoïétique in vivo

• 2- Mobilisation des précurseurs hématopoïétiques CD34 dans le sang P en vue d'une greffe hématopoïétique

• 3- Expansion des précurseurs hématopoïétiques in vitro

• 4- Correction d’anomalies génétiques par transfert de gènes dans les précurseurs hématopoïétiques

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3- Utilisation Clinique des Cytokines

• 1- Granulocyte-Colony stimulating factors (G-CSF)

• 2- SDF-1/CXCR4

• 3- Erythropoïétine

• 4- Thrombopoïétine

Utilisation Clinique des Cytokines

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