ACADEMIE DE MONTPELLIER

UNIVERSITE MONTPELLIER II

-- SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC --

THESE

présentée à l'Université de Montpellier II-Sciences et Techniques duLanguedoc pour obtenir le diplôme de DOCTORAT

SPECIALITE : BIOLOGIE DES POPULATIONS ET DES ORGANISMES.

Formation Doctorale : Parasitologie

Ecole Doctorale : Biologie des Systèmes Intégrés, Agronomie, Environnement.

DETECTION ET IDENTIFICATION DES TRYPANOSOMES AFRICAINS

PAR LES TECHNIQUES D'HYBRIDATION MOLECULAIRE ET

D'AMPLIFICATION GENIQUE (PCR)

par

Alexis NZILA· MOUANDA

Soutenue le 7 décembre 1995 devant le jury composé de :

M. RAIBAUT André

M. VINCENDEAU Philippe

M. GORENFLOT André

M. OUAISSI Ali

M. LEMESRE Jean Loup

M. FREZIL Jean Louis

Professeur Montpellier II

Professeur Bordeaux II

Professeur Montpellier 1

Directeur de recherche

Chargé de Recherche

Directeurde Recherche

Examinateur

Rapporteur

Rapporteur

Rapporteur

Examinateur

Directeur deThèse

Remerciements

En tenninant de régider cette thèse, je pense, avant tout, aux docteurs J.L..Frézil, J.L. Lemesre et B. Oury, trois personnes qui m'ont pennis d'effectuer ce'travail de doctorat en Parasitologie·: .

- à J.L. Frézil, Directeur de recherche : je tiens à vous exprimer toute mareconnaissance. Vous m'avez accepté en DEA de Parasitologie et m'avez activementsoutenu pour réaliser ce travail de thèse sur la trypanosomiase. Vous n'avez cesséde m'étonner par la masse des connaissances que vous avez accumulées pendant prèsde deux déc~nnies sur le Congo. Votre travail sur l'Epidémiologie au Congo resteune référence. C'est ce qui m' a pennis d'entamer la présente étude sur de solidesbases d'épidémiologie. Veuillez trouver ici, Mr Frézil, ma très profonde gratitude.

- à J.L. Lemesre, Chargé de recherche: c'est vous, avec Mr Frézil, qui avezfait de moi un parasitologiste. Vous m'avez accepté en DEA et voulu que je fasseune thèse avec vous. Je suis très heureux d'avoir fait tout ce parcours avec vous.J'ai effectué mon stage de DEA et ma thèse dans de très bonnes conditi~ns à côté devous. Je vous dois tout ce que j'ai appris au travers de mon stage et je tiens à vousexprimer mes très sincères remerciements.

- à B. Oury, chargé de recherche: je suis arrivé de la faculté de Sciencesavec plein de notions fondamentales de biologie moléculaire. Vous m'avez apprisl'application de ces notions dans un cadre plus pratique qu'est la trypanosomiase.J'ai tout appris avec vous, votre expérience en biologie moléculaire m'a été d'unegrande importance pour la réalisation de ce travail. Je vous dois cette thèse. Ma très·profonde gratitude.

Mes remerciements et ma gratitude vont à :

- Monsieur le Professeur Raibaut, qui m'a fait l'honneur d'accepter laprésidence de ce jury. Veuillez touver ici l'expression de mes respectueuxremerciements.

- Monsieur le Professeur. Vincendeau, qui a très aimablement consenti à faireparti du jury dethèse en qualité de rapporteur. Je vous ai connu au début de mathèse, l'entente et surtout la collaboration entre votre laboratoire et celui de J.L.Lemesre a été parfaite. Je tiens ici à vous remercier de tout ce que vous nous avezapporté.

- Monsieur le Professeur GoreIiflot, qui a accepté de juger mon tra~ail en. faisant parti de mon jury. J'isuis très sensible et je vous en remercie.

- Docteur Ouaissi, Directeur de recherche, qui m'a fait ce grand honneurd'être rapporteur de la thèse. Je vous en remercie infiniment.

Toute ma reconnaissance va à :

- V. Carrière, Docteur en Biologie, qui a accepté de me consacrer du tempspour la rédaction de cette thèse. L'aide que vous m'avez apportée a été trèsprécieuse. Je ne peu.x avoir de substantifs pour qualifier ce que vous avez fait. Jetiens, en toute sincérité, à vous exprimer ma gratitude. Un grand merci à vous.

- P. Grébaut : nous avons commencé ce travail ensemble ici à Montpellier.Au Congo, vous l'avez poursuivi en effectuant les prélèvements des glossines. Et,nous l'avons terminé ensemble en analysant les échantillons. Vous avez été présenttout le long de ce travail et je vous associe donc à ce travail. Toute mareconnaIssance.

- D. Cuisance et M. Dia, de nous avoir permis d'effectuer ce travail sur lesmouches d'infection expérimentale. Je suis aussi reconnaissant à Mr. Cuisance pourl'aide bibliographique qu'il m' a apportée.

- Laboratoire International de Recherche sur les Maladies Animales (ILRAD)et l'Université de Bristol, de nous avoir fournis, à titre gracieux, les sondesgénomiques (sous forme plasmidiale) et quelques souches de trypanosomes deréférence.

Mes remerciements vont également à :

- C. Bellec, de m'avoir reçu au sein de l'UR "Maladies infectueuses etparasitaires"

- L. Penchenier, de nous avoir aidé sur l'étude de l'épidémiologie de la THAen Côte d'Ivoire et d'avoir, avec P. Grébaut, organisé les prélèvements deséchantillons de glossines du Congo.

- C. Laveissière, de nous avoir permis d'effectuer l'étude sur les glossines dela Côte d'Ivoire..

- F. Fournet, avec qui' j'ai manipulé pendant plusieurs semaines àMontpellier. Je n'oublie pas les précieuses informations que vous nous avezapportées sur la THA en Côte d'Ivoire.

- S. Nitechman, d'avoir initié dans notre laboratoire, la techniqued'hybridation moléculaire.

-' J.M. Reifenberg, pour l'éch~ge scientifique et très amical que j'ai eu aveclui.

- A tous mes collègues qui sont ou qui étaient dans le Laboratoire de Biologieparasitaire: je pense notamment à Denis Sérono, Nathalie Brajon, Isabelle LeMasson, Marie-Pierre Blanc, Marie-Pierre 2, Marie-Pierre 3, Estelle, Christelle...

Mes très sincères amitiés sont dirigées à :

- P. Kegne, J.B. Ouadreogo, F. Bibolet et G. Cunny, je n'oublierai lesdiscussions, fort intéressantes que nous avons eues. '

- S. Issa, pour l'entente cordiale et complice que j'ai eue avec lui.- A.L. Banùl, à travers elle, à mon ami Thierry Loscos. Trouvez ici mes très

sincères amitiés.- Mme Tchikaya, P. Makoundou, A. Kiooudou, L. Finot, à vous tous de

l'insectarium et de l'animalerie, mes très sincères amitiés.

Ma reconaisance va aussi à Sylvie Coudert et Christine Lecourant. Vous étieztoujours présentes pour m'aider à faire face aux tracasseries administratives. Jevous exprime mes remerciements.

Enfin, à tous les amis du deuxième étage et de tout le centre ORSTOM, àtous, mes amitiés.

SOMMAIRE

Page

Résumé 7

Summary 8

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 9

CHAPITRE TI : GENERALITES ET RAPPELS 14

1. TAXONOMIE 14

1.1. Sous-genre Trypanozoon 14

1.1.1. A propos de la classification 141.1.2. A propos des essais de caractérisation sub-spécifiquede T. brucei 16

1.2. Sous-genre Nannomonas. 18

1.2.1. A propos de la classification 181.2.2. A propos de la subdivision au sein de T. congolense 19

1.3. Sous-genre Duttonella 20

2. BIOLOGIE DU PARASITE 21

2.1. Morphologie et cycle évolutff 21

2.2. Structure du génome 23

2.2.1. Génome nucléaire 232.2.2. Génome kinétoplastique 24

2.3. Pouvoir pathogène et aspects cliniques des trypanosomiases 25

2.3.1. Trypanosomiase à T. b. gambiense 252.3.2. Trypanosomiase à T. b. rhodesiense 26

·3. EPIDEMIOLOGIE DE LA TRYPANOSOMIASE HUMAINEAFRICAINE (THA) AU CONGO ET EN COTE D'IVOIRE 28

3.1. Maladie au Congo 28

1

3.1.1. Historique dela THA 283.1.2. Situation actuelle et répartition des foyers 28

3.2. Maladie en Côte d'Ivoire 33

3.2.1. Historique de la maladie 333.2.2. Situation actuelle et description des foyers . 33

3.3. Dynamique de la THA au Congo et en Côte d'Ivoire 35

4. METHODES DE DETECTION ET D'IDENTIFICATIONDE TRYPANOSOMES 38

4.1. Dépistage de la trypanosomiase humaine 38

4.1.1. Signes cliniques 38 .4.1.2. Examens parasitologiques 38

4.1.2.1. Examen du sang 384.1.2.1.1. Méthodes directes 404.1.2.1.2. Méthodes de concentration 40

4.1.2.2. Examen du suc ganglionnaire 414.1.2.3. Examen du liquide céphalo-rachidien (LCR) 414.1.2.4. Examen de la moelle osseuse 41

4.1.3. Examens sérologiques 414.1.3.1. L'immunofluorescence indirecte (IFI) 414.1.3.2. La technique ELISA 424.1.3.3. L'hémagglutination indirecte (HAl) ·424.1.3.4. Test d'agglutination des trypanosomes sur carte (CATI) 43

4.2. Détection et identification chez l'animal 43

4.3. Détection et identification des parasites chez l'hôte invertébré 44

4.3.1. Sous-genre Duttonella (T. vivax) 444.3.2. Sous-genre Nannomonas (T. congolense et T. simiae) 464.3.3. Sous-genre Trypanozoon (T. b. brucei, T. b. gambienseetT.b.rhode~ense) 46

CHAPITRE III: MATERIEL ET METHODES 47

A. MATERIEL 47

1. LES SOUCHES PARASITAIRES 47

2. LES SONDES GENOMIQUES 50

2

3. LES AMORCES OLIGONUCLEOTIDES 52

4. LES MOUCHES D'INFECTION EXPERIMENTALE 53

4.1. Les glossines de mono·infection (T. b. brucei ou T.congolense) 53

4.2. Les· glossines d'infection mixte (T. b. brucei et T.congolense) 53

5. LES MOUCHES DE ZONES D'ENDEMIE 55

B. METHODES 56

1. PRODUCTION DES PARASITES 56

1.1. Multiplication in vivo 56

1.1.1. Production des fonnes sanguicoles 561.1.2. Séparation des trypanosomes des éléments figurés du sang surcolonne échangeuse d'anions 56

1.2. Culture in vitro 58

1.2.1. Adaptation des souches 581.2.2. Culture routinière et culture de masse 58

1.3. Conservation des souches de parasites 58

2. PURIFICATION DU MATERIEL GENOMIQUE PARASITAIRE 59

2.1. Lyse parasitaire 59

2.2. Elimination des protéines et des lipides 59

2.3. Elimination des ARN 59

2.4. Précipitation de l'ADN 59

2.5 Contrôle de la qualité de l'ADN 60

3. PRODUCTION DES SONDES GENOMIQUES 61

3.1. Transformation des bactéries 61

3.1.1. Milieu et Tampons 613.1.2. Protocole 62

3

3.2. Culture des bactéries transformées

3.3. Amplification des plasmides

3.4. Extraction des plasmides

3.4.1. Centrifugation des bactéries3.4.2. Lyse des bactéries3.4.3. Précipitation de l'ADN chromosomique3.4.4. Précipitation de l'ADN plasmidial3.4.5. Dégradation des ARN3.4.6. Extraction de l'ADN plasmidial3.4.7. Purification de l'ADN plasmidial

4. HYBRIDATION MOLECULAIRE

4.1. Kit chimique

. 4.1.1. Préparation des échantillons et dépôt sur membrane4.1.2. Marquage de la sonde4.1.3. Hybridation moléculaire

4.1.3.1. Préhybridation4.1.3.2. Hybridation

4.1.4. Lavages4.1.5. Génération du signal4.1.6. Révélation du signal

4.2. Kit enzymatique

4.2.1. Préparation des échantillons et dépôt sur membrane4.2.2. Marquage de la sonde4.2.3. Hybridation moléculaire

4.2.3.1. Préhybridation4.2.3.2. Hybridation

4.2.5. Lavages des membranes après hybridation4.2.6. Détection et révélation du duplex ADN-sonde

5. TECHNIQUES DE MIGRATION ELECTROPHORETIQUEET D'ELECTROELUTION

5.1. Electrophorèse sur gel d'agarose

5.2. Digestion enzymatique

5.3. Technique d'électroélution

6. REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR)

6.1. Principe de la technique

6.2. Traitement des échantillons avant la PCR

63

64

64

646465656565 .66

67

67

67·69696969697070

71

71717373737373

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75

75

77

78

78

80

6.2.1. Matérielgénomique purifié 816.2.2. Trypanosomes de culture et organes de glossines 81

CHAPITRE IV : RESULTATS 83

1. DETECTION DES T;RYPANOSOMES PAR LA TECHNIQUED'HYBRIDATION MOLECULAIRE 83

1.1. Introduction 83

1.2. Optimisation des techniques de marquage froid 84

1.2.1. Optimisation du kit de marquage chimique 851.2.2. Optimisation du kit de marquage enzymatique 88

1.3. Etude de la sensibilité et de la spécificité sur le matérielgénomique purifié . 91

.1.4. Evaluation du test d'hybridation sur des trypanosomes deculture et sur des organes de glossines 96

1.4.1. Etude de la sensibilité sur des parasites de culture 971.4.1.1. Préparation des échantillons 971.4.1.2. Résultats 99

1.4.2. Tests sur les organes de glossines d'infection expérimentale ·1001.4.2.1. Préparation des échantillons 1001.4.2.2. Résultats 103

2. DETECTION ET IDENTIFICATION DES TRYPANOSOMES PARAMPLIFICATION GENIQUE (PCR) 107

2.1. Optimisation des conditions d'amplification 107

2.1.1. Recherche des températures optimales d'hybridation des amorces 1072.1.2. Défmition du temps des différentes étapes de la réaction de la PCR 1072.1.3. Concentration de MgCl2 et quantité d'enzyme (Taq polymérase) 1082.1.4. Protocole d'amplification génique 109

2.2. Sensibilité et spécificité de détection sur l'ADN purifié 109

2.3. Optimisation du traitement des échantillons 112

2.3.1. Traitement au CsTFA pour la conservation du matériel génomique 1122.3.2. Traitement à la RNAse 1132.3.3. Protocole de traitement d'échantillon 113

2.4. Etude de la sensibilité de détection sur les échantillons traités 113

2.4.1. Sur les trypanosomes de culture. . 1132.4.2. Sur les trypanosomes mélangés aux organes des glossines 1142.4.3. Evaluation du protocole de conservation du matériel génomique 114

5

2.5. Test sur les glossines d'infection expérimentale 114

2.5.1. Glossines infestées par T. b. brucei (Eatro 1125) 1172.5.2. Glo~sines infestées par T. congolense "Savane" (Eatro 325) 1212.5.3. Glossines d'infection mixte: T. b. brucei (Eatro 1125) etT.congolense "Savane" (Eatro 325) 121

2.6. Test sur les glossines de terrain 124

2.6.1. Echantillons· du Congo 1242.6.2. Echantillons de la Côte d'ivoire . 127 .

CHAPITRE V : DISCUSSION 135

CHAPITRE VI : CONCLUSION ET PERSPECTIVES 155

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 158

ANNEXES 172

Annexe 1 172Annexe 2 173Annexe 3 174Annexe 4 175Annexe 5 177Annexe 6 178Annexe 7 179Ann~e8 1WAnnexe 9 181Annexe 10 182Annexe Il 183Annexe 12. 184Annexe 13 185

6

RésuméChez l'hôte invertébré, les méthodes parasitologiques visant à détecter et à identifier les

trypanosomes africains sur examen microscopique, après dissection des organes de glossines

impliqués dans le cycle de développement du parasite, ne permettent pas de révéler les faibles

parasitémies souvent renco~trées, ce qui leur confère une fiabilité limitée.

Seules les méthodes basée sur l'hybridation moléculaire et/ou l'amplification génique.

(PCR) peuvent aujourd'hui concilier la spécificité indispensable à une identification de certitude

et la sensibilité nécessaire à une détection des parasitémies infrasmicroscopiques.

Le but de ce travail a été d'évaluer ces techniques de détection moléculaires et de les

concilier avec une méthode de traitement des échantillons permettant de conserver l'ADN à

température ambiante. En effet, la difficulté de m~intenir une chaîne de froid du lieu de

prélèvement au laboratoire d'analyse représente la principale contrainte rencontrée sur le terrain.

Face au manque de sensibilité des techniques d'hybridation moléculaire utilisant des sondes

génomiques non radioactives, égale ou légèrement supérieure aux techniques parasitologiques

classiquement utilisées, une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) a été développée avec

les couples d'amorces spécifiques de Trypanosoma brucei s.l., de T. congolense "Galerie

forestière" et de T. congolense "Savane".

Les tests de conservation du matériel génomique dans les échantillons a permis de

vérifier l'aptitude du trifluoroacétate de césium (CsTFA) à protéger l'ADN à température

ambiante. Préalablement testée sur de l'ADN purifié, la technique de la PCR s'est révélée

sensible et spécifique. Elle a donc été évaluée sur des glossines (Glossina morsistans morsitans

et Glossina juscipes juscipes) d'infection expérimentale (mono infection à T. b. brucei et

infection mixte à T. b. brucei et à T. congolense). Près de 50 % de G. m. morsitans et moins

de 3 % de G. f. juscipes sont trouvées porteuses de parasites selon l'analyse microscopique.

La technique de la PCR a permis la mise en évidence de l'infestation de plus de 90% de G. m.

morsitans et d'environ de 70 % de G. f. juscipes. L'intestin s'est révélé être l'organe le plus

infesté des glossines. La technique a été ensuite appliquée sur des glossines (Glossinapalpalis

palpalis) provenant de zones d'endémie (Congo et Côte d'Ivoire). L'analyse parasitologiqu~

montre des taux d'infection de 2,15 % et 21,42 % respectivement au Congo et en Côte

d'Ivoire. L'amplification génique en chaîne réalisée avec les amorces spécifiques de T. brucei

s.l., de T. congolense "Savane" et T. congolense "Galerie forestière" détecte l'infestation de

17,20% des mouches du Congo et 57,14 % des glossines de Côte d'Ivoire.

Ces résultats démontrent clairement la sous-estimation des taux d'infection des

glossines tant dans les conditions de laboratoire que dans les conditions de terrain obtenues par

les méthodes classiques de détection et d'identification de trypanosomes chez la glossine. Par

conséquent, les données épidémiologiques obtenues dans les différentes zones d'endémie sont

à reconsidérer.

Mots-clé: trypanosomes africains, glossines, sondes génomiques, hybridation moléculaire,

PeR, conservation des échantillons, implications épidémiologiques.

7

Summary

In invertebrate host, parasitological methods to detect and identify african trypanosomes

are based on the microscopic observation after the dissection of the tsetse fly organs involved in

the developpemental cycle of the parasite. They don't allow to detect the low parasitemia often

met and so they have a limited reliability.

Only methods based on ~olecular hybrid~zationand/orgenic amplification (PCR) can

.today conciliate the specificity obligatory 10 an unquestionable idendification andthe sensibility

needed to detect inframicroscopic parasitemia

The purpose of this work was to evaluate the techniques of molecular detection and to

adapte them with a treatment method of the samples in order 10 keep DNA at room temperature.

Indeed, the difficulty to maintain a chain of cold from the sampling place 10 the analysis

. laboratory is the main constraint found in Africa.

To face up the lack of sensitibility of molecular hybridization, using non radioacti've

labelling probes, which is equal or lighly best than classical used parasitologial techniques,

PCR has been developed with couples of primers specific of Trypanosoma brucei s.l., T.

congolense "Riverine forest" and T. congolense "Savannah".

Conservation tests made on genomic material showed that trifluoroacetate of cesium

(CsTFA) Was able to protect sample DNA at room temperature.

First evaluated on purified DNA, PCR techniques proved sensitive and specific. The

techniques was carried out on tsetse flies Glossina morsistans morsitans and Glossina juscipes

fuscïpes infected experimentally by T. b. brucei alone or with both T. b. brucei et T.

congolense. Nearly 50 % of G. m. morsitans and less than 3 % of G. f. juscipes were found

as carriers of parasites according to microscopic analyses. The PCR technic allowed to put in

evidence more than 90 % of G. m. morsitans and nearly 70 % of G. f. fuscipes infected. The

gut were the most infected organ.

The technique was applied to tsetse flies (Glossina palpalis palpalis) from endemic

zones (Congo and Ivory Coast). Parasitological examination showed an infection rate of 2,15

% and 21,42 % respectively from Congo and Ivory Coast. The PCR technique, realised with

couples of primers specific of Trypanosoma brucei s.l., T. congolense "Riverine forest" and

T. congolense "Savannah", detected parasites in 17,20 % of the flies from Congo and 57,14

% of the flies from Ivory Coast.

These results show clearly the underestimation of the infection prevalence of the tsetse .

flies. Consequently, the epidemiological data obtained in different endemic zones must he

reconsidered.

Key-word : african trypanosome, glossina, genomic probes, molecular hybridization, PCR,

sample protection, epidemiological implication

8

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION

Parmi les espèces de trypanosomes sévissant en Afrique, Trypanosoma. brùcei brucei (Plimmer et Bradford, 1899) et Trypanosoma congolense(Broden, 1904) appartenant respectivement aux sous-genres Trypanozoon etNannomonas sont d'une grande importance vétérinaire, de· par leur pouvoirpathogène pour de nombreux animaux domestiques. Deux autres sous-espèces,T. brucei gambiense (Dutton, 1902) et T. brucei rodhesiense (Stephens etFantham, 1910) sont responsables de la maladie du sommeil chez l'homme.

Une lutte efficace contre ces parasitoses passe avant tout par la détectionet l'ièlentification précises des agents infectieux aussi bien chez .l'hôtemammifère que chezl'insecte vecteur. Actuellement, chez l'hôte vertébré, lesméthodes de détection et d'identification des trypanosomes reposent surl'utilisation de tests parasitologiques et sérologiques.

Les analyses parasitologiques consistent à mettre en évidence destrypanosomes dans différents liquides biologiques (sang, moelle osseuse, liquidecéphalo-rachidien). Les méthodes directes de détection des parasites (examen àl'état frais, frottis mince, goutte épaisse) sont extrêmement peu sensibles.Malgré l'utilisation de techniques dites de "concentrations parasitaires" tellesque la centrifugation en tube hématocrite ou la filtration sur colonneéchangeuse d'anions, la mise en évidence des parasites s'avère difficile de parles faibles parasitémies généralement rencontrées chez les malades, surtout chezceux affectés par une parasitose chronique (comme c'est souvent le cas pour T.b. gambiense) et les- parasitémies fluctuantes, conséquence du phénomène de lavariation antigénique.' C'est pourquoi, les analyses parasitologiques, même sielles sont répétées dans le temps et utilisent les techniques de concentrationparasitaire, manquent de sensibilité et sous-estiment largement les prévalencesde la maladie aussi bien chez l'homme que chez l'animal (Murray et al., 1977;Frézil et al., 1983; Lemesre et al., 1988; Noireau et al., 1988).

Les tests sérologiques qui visent à détecter les anticorps circulants anti~

trypanosomes sont beaucoup plus sensibles que les examens parasitologiques.Cependant, ces tests sont très peu utilisés pour la détection des parasites chezl'animal à cause de leur manque de spécificité, et donc de leur incapacité à

9

détecter les infections mixtes ~t multiples. En effet, les antigènes utilisés dansces tests sont. présents chez différentes espèces de trypanosomes. Parconséquent,. la détection de ces ~nticorps ne permet pas une caractéris~tion desparasites au niveau spécifique (Van Meirvenne et al., 1977; Mehlitz, 1986;Nantulya, 1990; Noireau et al., 1991). Toutefois, chez l'homme, seulescirculent les sous-espè~es T. b..gambiense ou T. b. rhodesiense, ces· techniquesse sont révélées être des outils de choix· dans le dépistage de la maladie .du

... sommeil. Mais, elles ne peuvent être considérées comme des épreuves de. . .

certitude. En effet, les anticorps peuvent persister pendant plusieurs mois aprèsla guérison du malade et leur détection ne permet donc pas de différencierfacilement une infection active d'une infection révolue (Frézil et al., 1978;Luckins et al., 1978; 1979; Paquet et al., 1992). En outre, les antigènes utilisésétant mal définis, il est difficile de normaliser ces tests en termes de sensibilitéet de spécificité (Nantulya, 1990).

L'utilisation d'anticorps monoclonaux, dans uné technique ELISA, pourla détection et l'identification des antigènes parasitaires circulants, a· été décritepar Nantulya (1987). Ce test présente l'avantage, par rapport aux testssérologiques précédemment cités, de permettre l'identification destrypanosomes au niveau spécifique (T. vivax, T. congolense et T. brucei). Enoutre, une antigénémie positive signe l'existence d'une infection active. Ce testaété utilisé pour la détection des trypanosomes chez l'homme (Nantulya, 1989;Nantulya et al., 1992; Odiit et al., 1991). li est en cours d'évaluation chezl'animal (Nantulya et al.; 1989 a,b,c; Masaké & Nantulya, 1991; Kanwe et al.,1992; Cavaleyra, 1992). Au travers de ces études d'évaluation, il ressort que lesphases précoces des infections, aussi bien chez l'homme que· chez l'animal, sontsouvent accompagnées d'une antigénémie négative. En effet, étant donné que cetest repose sur la détection des antigènes parasitaires, le système immunitaire del'hôte doit détruire un nombre suffisant de parasites pour que l'antigénémiedevienne positive dans la circulation. Par conséquent, dans les phases trèsprécoces des infections, les antigènes de trypanosomes ne peuvent être mis enévidence.

Chez l'insecte vecteur, les techniques parasitologiques classiquementutilisées so~t longues et fastidieuses. Elles visent à détecter la présence destrypanosomes, par examen microscopique,. après dissection des différent~·

organes impliqués dans le cycle évolutif des parasites. En effet, lestrypanosomes présentent un type de développement particulier chez la glossineselon le sous-genre auquel ils appartiennent. Le cycle des parasites du· sous-

10

genre Duttonella se limite dans la trompe (labre et hypopharynx); celui dusous-genre Nannomonas s'étend à l'intestin moyen; celui du sous-genreTrypanozoon .se développe dans les glandes salivaires, en plus des organesprécités. Cependant, 'ce type de classification est remise en question par desétudes de plus en plus nombreuses qui montrent des localisations destrypanosomes différentes de celles décrites précédemment (Mshelbwala, 1972;Otieilo et al.,.1976; Otieno, 1983; Kaddu ~t Mutinga, 1980 a,b, 1983; Ladikpo& Seureau, 1988; Mollo & Gray, 1989; Nyéko et al., 1990)~ Le manque de.sensibilité de· ces techniques combiné aux faibles parasitémies souventrencontrées chez la glossine ne permettent pas toujours de révéler l'infection, cequi leur confère une fiabilité limitée. De plus, il n'est pas possible d'identifieravec certitude l'espèce de trypanosome à leur stade procyclique, en effet, aucuncritère morphologique ne permet de les disèriminer (Godfrey, 1966). Enfin, lesinfections mixtes ou multiples, dont la fréquence semble élevée, sont totalementoccultées par les méthodes classiques de détermination de parasites en fonctionde leur .localisation dans les organes de l'insecte. En plus, la glossine peuthéberger plusieurs espèces de trypanosome dont les pouvoirs pathogènes sonttrès différents.

Actuellement, la caractérisation spécifique. et sub-spécifique destrypanosomes qui circulent chez la mouche et chez l'hôte vertébré passenécessairement par leur isolement et leur multiplication in vitro ou in vivo envue d'une analyse isoenzymologique ou par hybridation moléculaire de l'ADN.Cette étape de culture compromet fortement la mise en évidence d'infectionsmixtes ou multiples du fait de la sélection des souches et élimine les stocks noncultivables (Dukes et al., 1991). Par conséquent, cette approche représente unobstacle non négligeable pour la conduite des études épidémiologiques sur leterrain.

Tous ces constats soulignent. la nécessité de développer de nouvellesméthodes d'investigation et not~ent,·de disposer d'outils plus performantsappliqués à la détection et à l'identification des trypanosomes qui circulent chezl'hôte mammifère et chez l'insecte vecteur. Seules les méthodes basées surl'hybridation moléculaire et/ou l'amplification d'ADN par PCR peuventaujourd'hui concilier la sensibilité nécessaire à· une détection de faiblesparasitémies et la spécificité indispensable à une identification de certitude destrypanosomes.

Des sondes correspondantes aux séquences répétées d'ADN spécifiques.d'espèces ont été décrites et utilisées en hybridation moléculaire pour la

1 1

détection et l'identification çles trypanosomes africains principalement chezl'insecte vecteur. Les premières études sur l'identification des trypanosomes ontété réalisées par Massamba & Williams en 1984. Kukla et al. (1987), Ole­MoiYoi (1987) et Gibson et al. (1988) ont évalué cette technique d'hybridationmoléculaire sur les organes de mouches expérimentalement infestées par T.

. congolense, T. brucei et par T. vivax. Les premiers essais de èette technique surles·glossines provenant de zones d'endémie ont été décrits par McNamarra et a.l.(1989), McNamarra & Snow. (1991) en Gambie,. Majiwa & .Otieno· (1990) auKenya et' Nyéko et al. (1990) en Ouganda. De bonnes spécificités et sensibilitésont été obtenues. La limite de détection de ces techniques, d'une façon généraleest de 100 à 250 parasites. Toutes ces études ont été réalisées avec des sondesmarquées au phosphore 32 (marquage radioactif).

Nous avons donc cherché à développer une technique d'hybridationmoléculaire utilisant le marquage non radioactif des différentes sondes étudiées.La démarche a consisté à évaluer la technique sur du matériel génomiquepurifié à partir de parasites de référence, sur des parasites cultivés in vitro etmélangés aux organes de glossines saines (proboscis, glandes salivaires etintestin) et enfin sur des organes de glossines d'infection expérimentale. Unedes particularités de ce travail réside dans le fait que nous avons constammenttenu compte des contraintes liées à l'environnement de travail dans les pays envoie de développement, à savOIr la facilité de la mise en oeuvre des tests etsurtout, la conservation des échantillons biologiques (le matériel génomique desparasites) à température ambiante en absence de chaîne de froid. En effet, aprèsprélèvement des échantillons biologiques dans les zones d'endémie, une chaînede froid doit être maintenue du lieu dienquête jusqu'au laboratoire d'analyse.Dans la plupart des cas, ces laboratoires d'analyse sont éloignés des zones deprélèvement. L'objectif était donc de mettre au point une méthode detraitement des échantillons permettan~ de conserver l'ADN à températureambiante et de la concilier avec les techniques de détection moléculaire. Lafaible sensibilité de la technique d'hybridation moléculaire utilisant les sondesnon radioactives nous a amenés à nous orienter vers une technique encore plussensible : la technique de polymérisation en chaîne.

Moser et al. (1989) ont utilisé, pour la première fois, la technique de lapeR pour détecter et identifier les trypanosomes de T. congolense et T., bruceidans le sang de souris infestées expérimentalement. Masiga et al. (1992) ontdécrit des amorces permettant d'amplifier spécifiquement des' séquencesrépétées d'ADN des 2 sous-groupes de T. congolense, de T. simille et de T.

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vivax d'Afrique de l'l?st. Les premiers essais d'identification ont été réalisés s,urles organes de mouches expérimentalement infestées à la fois par T. vivax et T..congolense. Les résultats positifs de la parasitologie et ceux de la PCR ont ététrouvés corrélés. Enfin, des infections mixtes (T. congolense et T. vivax) ontété mises,en évidence par cette technique.

La démarche méthodologique utilisée dans l'application de la technique depolymérisation en chaîne a consisté, comme précédemment, à évaluer lasensibilité et la spécificité de la PCR sur du matériel de référence : ADNpurifié, parasites de culture purifiés, parasites de culture mélangés aux organesde mouches saines et enfin, les organes de glossines d'infection expérimentale.Les résultats encourageants (sensibilité, spécificité et pouvoir de conservation~e l'ADN) obtenus sur les échantillons de référence nous ont conduit à évaluercette technique sur les organes de glossines capturées en zones d'endémie'(Congo et Côte d'Ivoire). Ces deux pays se distinguent par les facièsépidémiologiques différents de la maladie du sommeil qu'ils présentent. AuCongo, les prévalences de la trypanosomiase humaine sont très élevées ets'opposent aux faibles taux d'infection chez les animaux alors qu'en Côted'Ivoire, la situation inverse y prévaut. Vu la sensibilité et la spécificité de laméthode de la PCR, la réalité épidémiologique prévalant dans ces zones devraitêtre mieux appréhendée. Par conséquent, une meilleure orientation etoptimisation des moyens de lutte permettraient de lutter plus efficacementcontre cette parasitose qui sévit avec grande acuité dans toute la zone sub-

.. sahélienne d'Afrique.

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CHAPITRE II : GENERALITES ET RAPPELS

CHAPITRE II : GENERALITES ET RAPPELS

1. TAXONOMIE

Les trypanosomes, agents responsables de la trypanosomiase africaine,ont été identifiés par Dutton en 1902. Ils appartiennent à la classe desZoomastigophora Calkins, 1909, à l'ordre des Kinetoplastida·Honigberg, 1963,à la famille des Trypanosomatidae Doflein, 1901 et au genre TrypanosomaGrüby, 1843.

La classification des Trypanosomatidae de mammifère a été établie parHoare (1972.) et revue par Lévine et al. (1980), en fonction de leur mode detransmission de l'invertébré vecteur à l'hôte vertébré (Figure 1). Il dis.tingueainsi deux sections : Siereoraria et Salivaria.

- La section Stereoraria est caractérisée par un mode de transmISSIon"postérograde". Les fonnes métacycliques infestantes se trouvent dans la partiepostérieure du tube digestif. L'infestation se fait après dépôt de fèces, pàrpénétration des trypanosomes dans la peau. Cette seçtion comprend 3 sous­genres : Megatrypanum, Herpetosoma et Sehizotrypanum.

- La section Salivaria est caractérisée par le mode de transmISSIOn"antérograde". Les parasites infestants 'sont dans la partie antérieure du tubedigestif. L'infestation de l'hôte vertébré se fait par piqûre de liinsecte. Cettesection est formée de 5 sous-genres: Duttonella, Nannomonas, Pyenomonas etTrypanozoon et Tejeraia.

Dans le cadre de notre étude, nous nous intéresserons aux sous-genresTrypanozoon, Nannomonas et Duttonella.

1.1. Sous-genre Trypanozoon

1.1.1. A propos de la classification

Il regroupe trois espèces :

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Crilhidia Lep/omonas Herpe/omonas Blas/ocrflhliJls 'phy/omonas Lelshmanla Endotrypanum

SOUS-REGNE

PHYLUM

SOUS·PHYLUM

CLASSE

. ORDRE

SOUS-ORDRE

FAMILLE

GENRE

r-- ------ ---------'r-- --- ----- ------ ----- .---,1 Herpetosoma· Megatrypanum Schlzotrypsnum' 1 1 Teler~/a Dul/onell~ Nsnnomonss Trypanozoon Pycnomonas.

1SOUS-GENRE

1 1 1 11 r. (H.) /ewisl r. (M.) thellerl T. (S.) cruzl lIT. (T.) rangell T. (o.) vlvax T. (N.) congolense T. (T.) equlperdum .T. (P.) suis l'I

r. (H.) muscull r. (M.) melophag/um T. (S.) dIon/sil lIT. (D.) uniforme T. (N.) slmlae T. (T.) evansl 1ESPECEr. (H.) mlcrotl T. (T.) brucel

1 1 1 l 11 1 1 11 1 1 T. (T.) b. brucel 1

A. Stercorar/a 8. Sallvar/a T. (T.) b. rhodeslense . SOUS·ESPECE1 1 1. T. (T.) b. gamblense 1L JL ~--- ~

Figure 1. Classification simplifiée des trypanosomes de mammifères (Hoare 1972' Lé . l. t ,vme eta _, 1980).

- Trypanosoma evansi, (Balbiani, 1888).

C'est un parasite d'Equidés et de Camélidés. TI est présent hors de la"zone glossines" et il est transmis mécaniquement par les tabanidés et lesstomoxes. Il n'existe donc pas d'évolution du parasite chez l'insecte vecteur. Lasurvie des trypanosomes à la surface des pièces buccales de l'insecte étant trèscourte; seul~ les insectes effectuant des repas sanguins fréquents sont capablesd'assurer latran'smission.

- Trypanosoma equiperdum (Doflein, 1901).

lt Responsable de dourine des Equidés,' T. equiperdum est transmis par voiesexuelle.

- Trypanosoma brucei (Dutton, 1902).

Elle se subdivise en 3 sous-espèces en fonction de leur distributiongéographique, leur pouvoir pathogène et la nature des vecteurs (glossines) quiles transmettent.

~!~ * T. b. brucei (Plimmer et Bradford, 1899): agent pathogèneresponsable de la "Nagana" chez l'animal, mais non pathogène chez l'homme.Cette maladie provoque des ravages dans les troupeaux domestiques etreprésente ainsi un grave handicap économique.

* T. ,b. rhodesiense (Stephens et Fantharn, 1910) : parasite provoquant lamaladie du sommeil en Afrique de l'Est, d'évolution aiguë. Elle est transmisepar des mouches du groupe morsitans, qui vivent dans les régions de savane(glossines savanicoles).

* T. b. gambiense (Dutton, 1902) : responsable de la maladie du sommeild'évolution chronique, sévit en Afrique de l'Ouest et en Mrique Centrale. Cetteparasitose est transmise par les' glossines du groupe palpalis dont l'habitat estessentiellement dans les galeries forestières bordant les rivières (glossinesripicoles).

1.1.2. A propos des essais de caractérisation sub-spécifiquede T. brucei '

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La sub-division classique de T. brucei en 3 sous-espèces selon ,descaractéristiques extrinsèques est actuellement très controversée. En effet,l'analyse de certains caractères intrinsèques (biologiques, biochimiques etgénétiques) menée su~ ces parasites ne permet guère une distinction aussi nettede ces 3 sous-espèces.

Contrairement à T. b. ,brucei et T.. b. rhodesiense, T. b. gambiense estréputé n'avoir qu'une faible virulence à l'égard des rongeurs de laboratoire(Gray, 1972; Frézil et al., 1979). Cependant, l'existence de nombreuses souchesde T. b. brucei présentant une très faible virulence chez des animaux de

, laboratoire exclut le comportement des trypanosomes chez l'animal commecritère fiable d'identification infraspécifique (Mehlitz, 1986).

Rickman & Robson (1970) ont mis au point le test d'infectivité chezl'animal après incubation des parasites en présence de sérum humain (BllT),pour identifier des populations de trypanosomes résistants (T. b. rhodesiense etT. b. gambiense) et sensibles (T. b. brucei ). Ce test présente un inconvénientdans la mesure où ces résultats sont parfois difficiles à interpréter. Le manquede reproductibilité des résultats selon les expériences ne peut en faire un test dechoix dans l'identification sub-spécifique (Geigy et al., 1975; Van Meirvenne etal., 1976; Rickman, 1977).

L'analyse des caractères biochimiques de T. brucei sL par la techniqued'électrophorèse des isoenzymes a permis de mieux comprendre la sous­spéciation au sein du taxon "brucei". En effet, l'association de certainsisoenzymes a pennis de définir deux groupes de T. b. gambiense : les groupes let II (Gibson et al., 1980). Le groupe l est homogène et rassemble 80 à 90% ~e

stocks de T. b. gambiense prélevés ~hez l'homme et, le groupe II est trèshétérogène, il comporte à la fois des stocks prélevés chez l'homme et chezl'animal (Gibson & Wellde, 1985; Scott et al., 1983; Zillman et al., 1984;Mehlitz, 1986; Truc, 1991; Mihok et al., 1990; Mathieu Daudet, 1992).Certains stocks de T. brucei provenant d'animaux présentent, toutefois, sur labase des études isoenzymatiques, un profil de type "groupe 1" (Scott et al.,'1983; Mehlitz, 1986; Richner et al., 1989; Truc, 1991). De plus, aucunedistinction nette entre T. b., brucei et T. b. rhodesiense n' a été clairementétablie à travers ces études.

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De la même façon, l'utilisation de la technique d'hybridation moléculaire. .

avec des sondes kinétoplastiques ou nucléaires sur le matériel génomique, aprèsfragmentation par des endonucléases de restriction et séparation parélectrophorèse de ce dernier (RFLP), a également mis en évidence l'existenced'un gro~pe majeur homogène de T~ b. gambiense représentatif de la plupartdes stocks prélevés chez l'homme et de certains stocks animaux (pays et al.,1981, 1983, 1984; Massamba & Williams, 1984; Paindavoine et al., 1986, 1989;

. Richner et al., 1989; Hide et al., 1990; Mathieu Daudet et al., 1994). De même,T. b. brucei et T. b. rhodesiensene. se sont pas révélés comme étant des entités'bien distinctes l'une de l'autre.

Cas de T. evansi

Des études de plus en plus nombreuses portant sur les analyses des'isoenzymes, de karyotypie moléculaire, de RFLP, d'hybridation moléculaireavec des sondes génomiques nucléaires (Gibson et al., 1980; Gibsonet al., 1985;Gibson & Borst, 1986; Gibson et al., .1988; Mathieu Daudet, 1991) montrentl'identité de cet espèce de trypanosome avec T. brucei. Ainsi, Mathieu Daudet(1991) propose de considérer T. evansi comme appartenant à l'espèce T.brucei tout en soulignant sa particularité épidémiologique (transmissionmécanique).

1.2. Sous-genre Nannomonas

1.2.1. A propos de la classification

Il regroupe deux espèces, non pathogènes pour l'homme: Trypanosomacongolense et T. simiae.

T. congolense (Broden, 1904) est probablement le trypanosome africainayant la plus grande incidence économique en Afrique car il affecte de trèsnombreuses espèces animales. Essentiellement pathogène chez les· ruIll;inants,cette espèce parasite aussi les Equidés et les Suidés. Des infections chez desCanidés et chez des Félidés ont aussi été décrites (Euzeby, 1989). L'anémiesévère rencontrée chez les animaux malades caractérise cette parasitose.

. T. simiae (Bruce, 1912) a été découvert pour la première fois chez lesinge. Ce trypanosome parasite essentiellement les Suidés et est très pathogènepour le porc. La virulence chez' le porc représente, en effet, un critère de

. .

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discrimination entre T. congolense et T. simiae. Cette espèce est très rarementrencontrée chez les Bovidés, les Equidés et les Félidés. Les rongeurs delaboratoire ne semblent pas être affectés (Euzeby, 1989).

1.2.2. A propos de la subdivision au sein de T. congolense

Les études de Young & Godfrey (1983), de Gashuma (1986), de.Gashuma .et al. (1988) et de Knowles et al. '(1988)'portant sur l'analyse.isoenzymologique de près de 140 stocks africains de T. congolense, ont mis enévidence l'existence de 3 groupes homogènes au sein de cette espèce. En effet,les zymodèmes obtenus se classaient en 3 sous-ensembles correspondant à deszones phytogéographiques bien distinctes:

- le type "Savane" : ce sont les trypanosomes rencontrés dans les zones desavane d'Afrique de l'Ouest et de l'Est (zones sèches);

- le type "Galerie forestière" : il regroupe les parasites des zones de forêtde. toute l'Afrique (zones humides);

'- le type" Kilifi" ou "côte kenyane" : initialement identifiés sur la côteOuest du Kenya (Kilifi), les trypanosomes de ce groupe ont aussi été décrits enOuganda (Nyeko et al., 1990).

Majiwa et al., (1985) et Gibson et al., (1988) ont décrit des séquencesrépétées d'ADN spécifiques de cha,cun de ces 3 sous-ensembles. Ces fragments

, .d'ADN sont utilisés, comme sondes génomiques en hybridation moléculaire(Kukla et al., 1987; McNamara et al., 1989; Nyéko et al., 1990; McNamara &Snow, 1991) et, les' oligonucléotides correspondant, dans la technique depolymérisation en chaîne (Masiga et al., 1992) pour la détection etl'identification de ces différents groupes de T. congolense.

Plus récemment, deux groupes de trypanosomes du sous-genreNannomonas différents de T. congolense ("Savane", "Galerie forestière" et"Kilifi") et de T. simiae ont été décrits. Il s'agit du groupe "Tsavo" (Majiwa etal., 1993) et du groupe "Godfreyi" (McNamara et al., 1994; Garside et al.,1994).

- Le groupe "Tsavo" : ces trypanosomes ont été identifiés chez Glossinapallidipes au Kenya. Les résultats des études génomiques portant sur

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l'hybridation moléculaire des kDNA (minicercles), des séquences répétéesnucléaires et de karyotypie moléculaire ont montré que ces trypanosomesforment un sous-groupe de T. congolense.

- Le groupe "Godfreyi" : isolés sur G. morsitans sub-morsitans enGambie (McNamara et al., 1989; McNamara & Snow, 1991), ces parasites ont

. reçu un statut d'espèce à part entière du sous-genre Nannomonas sur la based'études isoenzymologiques, d'hyhridation moléculaire avec des séquencesspécifiques d'ADN, de comportement chez l'animal et de morphométrie.

1.3. Sous-genre Dutonella

TI est représenté par une espèce type: Trypanosoma vivax (Zieman,1905). Cette espèce est de loin la plus importante, de par sa très largerépartition géographique. En effet, ces parasites sont présents dans toute l'aire. .

de répartition des glossines et aussi en dehors de cette zone (Amérique du Sud,Guyane et Antilles) où ils sont transmis mécaniquement par des stomoxes et destabanides. ils provoquent une parasitose sévère chez les ruminants.

Les études du pouvoir pathogène chez l'animal ont montré que lessouches de T. vivax d'Afrique de l'Ouest sont plu~ virulentes que cellesd'Afrique de l'Est (Euzeby, 1986). De la même façon, les analysesd'électrophorèse d'isoenzymes (Fasogbon et al., 1990), d'amplification desfragments d'ADN avec des oligonucléotides non spécifiques : RAPD (Diries etal., 1993 a) et d'hybridation moléculaire avec les ADN satellites (Kukla et al.,1987; Dicking & Gibson, 1989; Nyéko et al., 1990) ont montré ùoe différenceentre les parasites d'Afrique de l'Ouest (Nigéria) et d'Afrique de l'Est (Kenya);les souches prélevées en Ouganda présentant des caractéristiques intermédiaires.

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2. BIOLOGIE DU PARASITE

2.1. Morphologie et Cycle évolutif

Nous nous limitons dalls ce Chapitre à l'espèce T. brucei s.l.dans lamesure où elle présente le cycle biologique le plus complexe.

De forme allongée, en fuseau, de Il à 42 J..Ull de longueur et de 2 à 3 f.lmde largeur, les trypanosomes africains présentent un flagelle plus ou moinsdéveloppé délimitant avec le périplasme une membrane ondulante qui permet dedistinguer plusieurs stades de différenciation du parasite, aussi bien chez l'hôtevertébré que l'hôte invertébré (Figure 2).

Inoculés chez l'hôte vertébré, par la piqûre de l'insecte vecteur, lesparasites se multipl.ient d'abord dans le collagène dermique et passent ensuitedans la circulation générale par voie sanguine ou lymphatique avec un séjourplus ou moins prolongé dans les noeuds lymphatiques. Après cette périodelymphatico-sanguine plus ou moins longue, les trypanosomes finissent parenvahir le liquide céphalo-rachidien et les centres nerveux.

Chez l'hôte vertébré, sous effet de la variation antigénique, les formestrypomastigotes sanguicoles se présentent sous deux types morphologiquespnnclpaux:

* les formes grêles et allongées (type "slender"), présentantun flagelle libre, se multiplient activement et sont essentiellement présentespendant les pics parasitaires. Elles représentent la principale cible de la réponseimmunitaire à médiation humorale de l'hôte;

* les formes trapues et courtes (type "stumpy") sont moinsimmunogènes. Elles ne se divisent plus chez l'hôte vertébré et représentent desformes de préadaptation à l'hôte vecteur chez qui elles sont les seules à pouvoirse développer;

* à ces deux formes principales s'ajoutent toutes les formesintermédiaires.

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FORMES SANGUICOLES

GLANDES

SALIVAIRES

INTESTIN .CARDIA"CULTURE

, mélacycliQue

1

GLOSSINE

-

MAMMIFERE

L

(

L(..

f. 'nlerméd/arre (

-c

Figure 2. Cycle évolutif de Trypanoso,,!a brucei d'après Vickennan &Lucking (1969). La membrane cellulaire en trait épais indique la présence desantigènes variables de surface.

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Chez ·l'insecte vecteur qui se contamine lors d'un repas sanguin parpiqûre d'un mammifère infesté, les formes trapues se différencient en formesprocycliques dont la multiplication s'accompagne par une évolution vers laforme épimastigote. Ces dernières se caractérisent par la présence d'unkinétoplaste situé en a~ant du noyau (antéro-nucléaire), d'un réseau extensif de

. tubes mitochondriaux, d'une membrane ondulante. Après passage dans l'intestinet dans l'espace péritrophique, les parasites remontent dans les glandessalivaires et· se différenci~nt. en formes trypomastigotes.métacycliquesinfestantes, prêtes à être inoculées chez l'hôte définitif à l'occasion d'unnouveau repas sanguin. Ce stade trypomastigote se caractérise par un noyaucentral, un kinétoplaste situé près de l'extrémité postérieure et enfin, unmanteau de surface recouvrant la totalité du corps cellulaire (Figure 2).

2.2. Structure du génome

2.2.1. Génome nucléaire

L'organisation du génome des trypanosomes n'a pu être étudiée par desméthodes cytologiques nécessitant l'emploi de la microscopie photonique, depar l'absence de condensation des chromosomes pendant chaque cycle cellulaire(Vickerman & Preston, 1970). Cependant, cette difficulté a été surmontée parl'analyse électrophorétique en champs pulsé (P.P.G.E.) du matériel génomique(Van der Ploeg et al., 1984; Welles et al., 1987). Les chr·omosomes ainsiobservés se répartissent en 3 catégories :

- les minichromosomes, au nombre d'une centaine, dont la taille varieentre 50 et 150 kilo paires de bases (Kpb);

- les chromosomes intermédiaires, en plus faible nombre (20 à 50), d.etaille comprise entre 200 et 700 Kpb;

- enfin, les gros chromosomes, de taille supérieure.à 1000 Kpb, sont aunombre de 15 à 20.

.fA Le nombre p~.de chaque catégorie de chromosomes n'est pas précis.En effet, il peut varier considérablement d'une souche de parasite à une autreau sein d'une même espèce (Gibson & Borst, 1986).

Les expériences de cinétique de renaturation de l'ADN des trypanosomesont montré que la taille du génome d'une cellule hap~oïde est de 3,7 x 107 pb.Près de 12% des ADN sont formés de séquences hautement répétées, 20% de

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séquences moyenne~ent répétées et enfin 68% de séquences non répét~es

(Michels et al., 1991).Le caractère diploïde des trypanosomes a été mis en évidence par la

quantification de l'ADN et par l'analyse du polymorphisme des fragments derestrictio.~ (Borst et al., 1981; Gibson et al., 1985). Gottesdiener et al. (1990)ont décrit l'existence de' 7 paires de chromosomes homologues parmi les groschromosomes et ont estimé à6· x 107 pb la taille du génome nucléaire d'uneèellule dipl()ïde.

2.2.2. Génome kinétoplastique

L'ADN kinétoplastique des protozoaires correspond au génomemitochondrial des cellules eucaryotes (Fairlamb et al., 1978). Il est formé de 2types de molécules: les minicercles, en très grand nombre (5000 - 20000) etles'maxicercles en très faible nombre (10 -100). Ces deux types de molécules sontenchevêtrées .les unes dans les autres en formant le réseau d'ADNkinétoplastique (ADNk).

*Les minicercles

Estimés à environ 1 Kpb, les minicercles sont hautement variables au seind'une même espèce, voire au sein d'une même souche. Chez T. b. brucei parexemple, le nombre de classes de séquences différentes est es.timé entre 100 et300 pour une souche donnée de parasite (Stuart, 1979). Au niveau spécifique,ces minicercles sont formés d'une région conservée de 100 à 150 pb et d'unerégion variable de 850 à 900 pb (Chen & Donelson, 1980).

Une séquence de 12 nucléotides présente sur la région conservée esthautement préservée au sein de différentes espèces, voire même de différentsgenres (Kidane et al., 1984; Sugisaki & Ray, 1987). N'tambi & Englun (1985)montrèrent que cette séquence correspond, en fait, à l'origine de la réplicationdes minicercles appelée la "séquence universelle des minicerdes".

L'existence d'une ou de plusieurs séquences transcrites sur lesminicercles a été longtemps controversée (Simpson, 1987). Cependant, lestravàux de Pollard et al. (1990), Pollard & Hajduk (1991) et de Stuart (1991)démontrèrent clairement le rôle joué. par les minicercles, après transcription enARN, dans le phénomène "d'édition des ARN" des trypanosomes.

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* Les maxicercles

A l'exception de Trypanosoma evansi, tous les trypanosomes de la sectionSalivaria possèdent des maxicercles (Simpson, 1987). Ces derniers sont aunombre de 20 à 50 par trypanosome. Leur taille est en moyenne 20 foissupérieure· à celle des· minicercles (20 à 23 Kpb). Chez tous les"Kinetoplastidae", ces maxicercles sont fonnés d'une région conservée de 17

. ·Kpb et d'une région variable de 3 à 6 Kpb. . .

Les maxicercles portent les gènes codant pour les ARN ribosomiques desmitochondries. En plus, ils codent pour certaines protéines impliquées dans lesphénomènes d'oxydation mitochoildriale. L'ensemble de ces gènes sont portéspar la région conservée. Aucun transcrit de la région variable n'a été, jusquelà, mis en évidence.

2.3. Pouvoir pathogène et aspects cliniques destrypanosomiases humaines africaines

Le tableau clinique de la maladie du sommeil évolue suivant deuxschémas distincts:

* une forme chronique provoquée par T. b. gambiense qui secaractérise chez l'hôte par des vag~es successives de multiplication parasitaire,résultat de la variation antigénique. Après chaque vague, on observe une chutebrutale de la parasitémie due à la destruction de la plupart des trypanosomespar les. anticorps trypanolytiques. Une nouvelle population parasitaireprés~ntant un antigène de surface différent se multiplie alors et provoque uneautre vague de parasitémie jusqu'à élimination par le système immunitaire del'hôte et ainsi de suite.

* une fonne aiguë à T. b. rhodesiense au cours de laquelle lamultiplication intense des parasites, de type septicémique, èntraîne la mortrapide de l'hôte.

2.3.1. Trypanosomiase à T. b. gambiense

25

Faisant suite à la plqure infestante (provoquant parfois un chancred'inoculation), l'incubation dure de. quelques jours à plusieurs années, puiss'ensuit une évolution de la maladie en 2 périodes:

* première période (phase Pl).C'est la phase lymphatico-sanguine ou de généralisation qui peut durer plus de

"deux ans dans le type "gambien". A ce stade, la fièvre,- les adénopathies,l'hépatosplénomégalie et les signes cutanés témoignent de la dissémination destrypanosomes dans tout l'organisme.

* deuxième période (phase P2).C'est la phase de polarisation cérébrale ou la phase méningo-encéphalique

correspondant au passage des parasites dans le liquide céphalo-rachidien. Cettephase est car~ctérisée par un ensemble de troubles :

'- sensitifs (paresthésies, crampes musculaires, douleurs radiculaires ounévralgiques); .

- du sommeil (insomnie nocturne et somnolence diurne);- de l'appétit (boulimie mais le plus souvent anorexie);- du comportement : modification caractérielle (succession d'états

dépressifs et de phases d'excitation);- moteurs, qui se manifestent par des mouvem~nts anormaux, pseudo­

parkinsoniens avec perte de mouvements associés;- neuro-endocriniens (troubles de la régulation thermique et de la soif,

stérilité, impuissance et insuffisance thyroïdienne d'origine hypophysaire). Peuà peu la symptomatologie s'aggrave et cette phase difficile à traiter évolue versla phase tenninale où l'état général est alors compromis. Le malade s'acheminevers la mort par un état de coma avec une hypothennie sévère.

2..3.2. Trypanosomiase à T. b. rhodesiense "

Une pathologie évoquant une infection sévère s'installe rapidement à laphase de généralisation avec une altération rapide de l'état général. Le plussouvent, cette évolution ne "laisse pas le temps à une phase de polarisationcérébrale de s'installer.

Dans la trypanosomiase de type "gambien", la mort peut survenirplusieurs années après l'apparition des premiers symptômes; dans celleprovoquée par T. b. rhodesiense, la mort survient entre 6 et 8 semaines oumême plus tôt.

26

D'une manière général~, lorsqu'elle n'est pas traitée, la maladie dusommeil a une issue fatale.

27

3. EPIDEMIOLOGIE DE LA TRYPANOSOMIASE HUMAINEAFRICAINE (THA) AU CONGO, ET EN COTE D'IVOIRE

3.1. Maladie au Congo.

3.1.1. Historique de la THA

La première grande épidémie recensée a débuté en 1885 au confluent del'Oubangui et du fleuve Congo (Labusquière et al., 1971). Son extension dansles localités voisines provoqua des hécatombes et la destruction de villagesentiers. il est probable que la trypanosomiase humaine africaine (THA) a existébien avant cette date. Cependant, il est difficile d'en retr~uver les traces dans latradition orale car les maladies n'éta~ent pas dissociées des forces mystiques dela sorcellerie (Hagenbucher-Sacripant, 1982).

Les premières études des foyers de la THA au Congo furent réalisées parMaillot (1962). A cette époque, la quasi-totalité du pays était affectée par lamaladie. L'intervention très efficace des équipes mobiles, associant à la fois ledépistage actif, le traitement curatif et plus tardivement, la chimioprophylaxiepar la Lomidine®, avait permis d'enrayer la maladie dans pratiquement tous lesfoyers (Labusquière & Dutertre, 1966).

3.1.2. Situation actuelle et répartition géographique

De nos jours, la situation de la THA au Congo reste préoccupante, malgréles efforts acharnés des service~ des Grandes Endémies (services locaux de luttecontre les parasitoses) et de l'Institut Français de Recherche Scientifique pour leDéveloppement en Coopération (ORSTOM) pour lutter contre cette maladie.

La flambée épidémique de Loudima en 1968. a été le signe avant-coureurd'une recrudescence de la maladie dans tous les anciens foyers, Loudima étantlui- même un ancien foyer.

Actuellement, la THA se développe dans 3 foyers principaux couvrant deszones phytogéographiques différentes (Figure 3) :

28

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Figure 3. Localisation des principaux foyers de la trypanosomiase

humaine au Congo.(Source: Orstom Bmzzaville (J.R Malonga) in Frézil, 1983).

29

- les foyers de ~avane; ,- les foyers de forêt;- les foyers du fleuve Congo~

* Les foyers de savane: foyer du Niari et de la Bouenza.

De 1971 à 1980, 17. enquêtes épidémiologiques ont été réalisées dans cette. zone de savane. Au total, 896 cas de trypanosomiase ont été détectés sur 20438persoimes examinées.1.Jl prévalence de la maladie variait de 0,8 à 9,8% selon'les localités (Frézil, 1983).

La distribution des malades selon l'âge et le sexe montre que chez lesadultes, les hommes sont plus atteints que les femmes. Et, d'une façon générale,les jeunes sont moins touchés que les adultes.

Une tentative d'explication de cette répartition peut-être avancée autravers de l'étude de l'éthologie humaine et glossinienne. En effet, l'espèceGlossina palpalis palpalis, le vecteur par excellence de la THA dans ce foyerexiste en permanence, non seulement dans les galeries forestières bordant lesrivières ou traversant les villages, mais également à l'intérieur desagglomérations en liaison avec les animaux domestiques. Il est donccompréhensible que les femmes soient moins contaminées que les hommes :elles passent en effet la majeure partie de leur temps dans les plantations situéesen pleine savane, à l'abri des glossines, alors que ,leurs compagnons restent plusvolontiers dans les villages, donc sont plus exposés à la transmission (Frézil,1983).

Le faible taux d'infection des enfants peut s'expliquer par 3 raisons- les femmes, en général, sont accompagnées de leurs enfants dans les champs.Par conséquent, ils sont moins exposés aux piqûres glossiniennes; ,- les jeunes sont beaucoup plus actifs que les adultes, donc moins accessibles auxmouches;- enfin, les jeunes ont dans leur existence reçu moins de piqûres que les adultes.ils ont donc plus de chance de ne pas développer la maladie.

Parmi les foyers de savane recensés, nous en précisons un : le foyer deBoko-Songho. Situé au sud de l'axe de Brazzaville (la capitale du, Congo) etPointe-Noire, Boko-Songho est le principal foyer de la THA au Congo. C'estauss,i, de loin, la zone d'endémie la plus prospectée. En e~fet, depuis 1988, près

30

de 400 malades sont dépistés par an; Les enquêtes épidémiologiques de 1990,1991 et 1992 révèlent respectivement des prévalences de 4,6%, 4,2% et 4,6%.Dans certaines zones du foyer, des prévalences atteignant 10% ont étéconstatées.

* Les foyers de forêt: foyer de la Sangha.

. Mentioruié pour ·la première fois par les pasteuriens en 1909 (Martin et.al., 1909), le foyer de la Sangha, oÙ'la prévalence observée était de 13,3%, estresté actif jusqu'en 1925. Puis, l'endémicité a fortement baissé.

Depuis 1970, une recrudescence de la maladie a été constatée. De 1977 à1986, 75 cas ont été dépistés de façon passive, avec un accroissement significatifde l'incidence depuis 1981. Une enquête épidémiologique menée en 1987 dans 5villages précisait l'extension du foyer et son endémicité. Un taux d'infection .allant jusqu'à 8,4% a été observé dans les localités les plus touchées (Noireau etal., 1988 b).

Dans ce foyer, la transmission de la maladie se fait essentiellement àl'extérieur des villages. Les femmes et les enfants sont plus touchés que leshommes. Dans certaines localités, la prévalence masculine était nulle.

.Les hommes en activité, quand ils ne sont pas aux villages, chassent enforêt et pêchent durant la nuit. De ce fait, ils ne sont pas en contact avecl'espèce riveraine Glossina fuscipes fuscipes. Par contre, les femmes et lesenfants séjournent une partie ·de l'année dans les camps de pêche pour alimenterles hommes. Ils parcourent les rivières, longent les berges et sont donc encontact avec le vecteur..

* Les Foyers dufleuve Congo: le Foyer du Couloir et du Pool

** Foyer du Couloir

Le foyer du couloir est situé le long du fleuve Congo en descendant versle sud, dans les plateaux Batéké, dont l'altitude au voisinage du fleuve se situeentre 200 et 400 m.

Les villages, dans ce foyer, sont situés sur la berge du fleuve Congo. Lavégétation est très arbustive et la couverture boisée est discontinue.

3 1

Les enquêtes épidémiologiques menées de 1974 à 1980 ont montré uneprévalence de la maladie de 9,9% (Frézil, 1983).

Comme dans le foyer du Niari, les femmes sont moins touchées que leshommes et les jeunes sont d'autant plus infestés que leur âge est élevé. D'une

. façon générale, les villages sont localisés à l'embouchure d'un ruisseau ou d'unesource d'eau. L'intérieur ·des agglomérations est ombragé grâce à de nombreuxarbres fruitiers. Ces formations végétales constituent les ·gîtes de l'espèceriveraine Glossina fuscipes quanzensis. Elles ne sortent pratiquement pas desvillages entourés d'un côté, par la savane et de l'autre par le fleuve. Les lieuxde contamination par excellence sont les villages, particulièrement autour despoints d'eau. Du fait de leur sédentarité, les hommes sont donc plus exposés queles femmes. qui vont travailler dans les champs en zones de savane danslesquèlles les glossines riveraines sont absentes.

Le contrôle de la maladie dans ce foyer n'est pas facilité du fait de sasituation frontalière avec le Zaïre. En effet, ce foyer présente une extension auZaïre, le long de la rivière Kasaî, qui se jette dans le fleuve Congo au niveau deNgabé. .

** Foyer du Pool.

Centré autour de Brazzaville, le foyer du Pool présente le même type devégétation que le foyer du couloir.

Aucun cas n'y avait été notifié depuis vingt ans. Cependant unesoixantaine de malades ont été découverts lors d'une prospection en 1988 dans 3villages le long du chemin de fer (Force-Barge, 1991).

Dans ce foyer, coexistent les deux espèces G. p. palpalis et G. fquanzensis. La transmission de la maladie se fait essentiellement autour despoints d'eau fréquentés par les villageois.

32

3.2. Maladie en ,Côte d'Ivoire

3.2.1. Historique de la maladie

, Toute la régi0Il: de 'l'Afrique" de l'Ouest et particulièrement la Côted'Ivoire a été frappée par une pandémie de la THA pendant la première mO,itiédu siècle. La maladie a"' fortement baissé dans les années 60,. avec desprévalences ne dépassant pas les 1%. En 1977, une flambée épidémique de laparasitose a été constatée dans les régions de Bouafié, Daloa et Vavoua (centrede la Côte d'Ivoire). L'action des équipes de l'Organisation Commune et deCoopération de lutte Contre les Grandes Endémies (OCCGE) a permis dejuguler très efficacement la maladie.

3.2.2. Situation actuelle et description des foyers

*Foyers de savane

Depuis 1970, en Afrique de l'Ouest en général et en Côte d'Ivoire enparticulier, la trypanosomiase humaine ne sévit guère dans les zones de savane(la partie nord de la Côte d'Ivoire) du fait de la raréfaction des glossinesconsécutive à la sécheresse persistante.

* Foyers préforestiers

Dans ce pays (Figure 4), la maladie persiste dans les zones préforestières(le centre du pays) et pour une moindre part,. dans les zones de forêt (le sud dela Côte d'Ivoire).

La plus grande partie de la zone préforestière est constituée de forêts quel'homme a dégradées pour y développer les cultures de café et de cacao. Endéfrichant, l'homme a chassé les animaux sauvages, les confinant aux lambeauxde forêts résiduelles ainsi que les glossines zoophiles, notamment Glossinafusca.

Cette espèce Glossina fusca a été vite remplacée par Glossina palpalis, ,

(anthropophile et vectrice de T. b. gambiense) pour laquelle les champs decaféiers et de cacaoyers constituent un terrain de chasse de prédilection. En

33

LIBERIA

E::lQI]--

Zone de savane

Zone de forêl

Cours d'cau

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BURKINA-FASO

Zone Touchée par La THA

Villc

Capilalc d'Elal

o 50 100 Km"1::0==~'===i!

Rtalis.lion:~Y. BAMBARA-

Figure 4. Répartition géographique des principaux foyers de la trypanosomia~humaine en Côte d'Ivoire.(Source: Labomtoire des Sciences Humaines ct Sociales IPRJOCCGE 1995)

34

effet, cette, glossine chasse ,à vue, principalement le long des chemins, auxlimites entre la forêt et les plantations et se repose dans les zones boisées.

L'homme vit dans des campements situés autour des champs de caféiers etde cacaoyers. Ces campements sont de taille variable allant d'une personne à de

. .petits villages. Dans ces petits villages, les hommes vivent avec les animauxdomestiques, notamment les porcs. Dans ces. conditions, les glossines senourrissent préférentiellem~nt.sur les 'animaux domestiques.: ces animauxjouant le rôle d'écran entre l'homme et la glossine. Cependant, latrypanosomiase a concerné aussi les planteurs isolés, particulièrement exposésaux attaques de G. palpalis. Elle s'est propagée à l'occasion de leurs nombreuxdéplacements entre campements (Laveissièré & Hervouet, 1991).

3.3. Dynamique de la THA au Congo et en Côte d'Ivoire

Les caractéristiques épidémiologiques de la trypanosomiase à T. bruceis.l. en Afrique de l'Ouest (Côte d'Ivoire) sont très différentes de celles del'Mrique Centrale (Congo), en particulier en ce qui concerne les prévalences dela maladie chez l'homme et l'animal (Tableau 1).

En Côte d'Ivoire, les prévalences de l'endémie sommeilleuse, d'une façongénérale, ne dépassent pas 1%. Les animaux domestiques, notamment les porcs,sont fréquemment parasités. En effet, un taux d'infection proche de 75% estobservé, dont 58% d'entre eux par T. brucei s.l. (Mehltiz, 1986). La plupart deces stocks de T. brucei isolés sont trouvés très proches de T. b. gambiense surla base des études isoenzymatiques et de biologie moléculaire (Mehlitz, 1986).

Par contre au Cong~, comme ce~a a été déjà décrit précéderriment (cf.paragraphe 3.1 de ce chapitre), les prévalences humaines sont très élevées. Destaux d'infection dépassant les 10% sont constatés dans certains village.s (Frézil,1983;' Noireau et al., 1987). L'ensemble des enquêtes de dépistageparasitologique réalisées sur 1287 animaux domestiques ont mis en évidenceque seuls 0,5% d'entre-eux étaient porteurs de T. brucei s.l. (Noireau et al.,'1986 b). Les infections de type Nanomonnas atteignaient les 20%. Dans larégion de la Bouenza, la zone la plus touchée par la maladie au Congo, aucunanimal n'a été trouvé parasité par T. brucei s.l. '

La caractérisation génétique effectuée sur 5 des 7 stocks de T. brucei s.l.isolés au Congo, par électrophorèse d'isoenzymes et hybridation moléculaire de

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Tableau 1.. Comparaison des prévalences des trypanosomoses chez l'homme etl'animal en Côte d'Ivoire etau Congo. .

Pays Prévalence(Foyer) humaine Infection animale Références

(%) (%)

Trypanozoon Nannomonas

Côte d'Ivoire <1% 58,3%* 43,2% Peilchenier (1987)

(Daloa)

Congo 7% 0,5%** 16,9% Noireau (1986)

(Bouenza)

* La moitié présentait une infection mixte (Trypanozoon + Nannomonas). ** Uniquement détectés en infection mixte avec T. congolense."

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l'ADN a montré leur appartenance à la sous-espèce de T. b. gambiense (Scott etal., 1983; Paindavoine et al., 1986; Noireau et al., 1989; Truc, 1991).

Ces résultat's comparatifs laissent à penser qu'en Côte d'Ivoire, ilexisterait une importante circulation des parasites entre le porc et la glossine auniveau des villages, contrairement à ce qui se passerait au Congo, où l'hommeserait le principal réservoir. Les travaux de Mehlitz (1986) ont clairement

..démontré le rôlè de réservoir de la maladie joué 'par les' animaux domestiques, .notamment le porc, en Côte d'Ivoire. Cependant au Congo, il est postulé quel'homme lui-même serait le principal réservoir en période d'épidémies et que lerôle de l'animal et notamment du porc se bornerait à maintenir l'endémie à basbruit lors des périodes inter-épidémiques (Frézil, 1983; Noireau et al., 1986 b,1989).

37

4. METHODES DE DETECTION ET D'IDENTIFICATIONDES TRYPANOSOMES

4.1. Dépistage de la· trypanosomiase humaine

4.1.1. Signes cliniques

Les signes cliniques les plus évocateurs de la maladie du sommeil sont :les céphalées, la fièvre, les ganglions, les prurits, les crampes, les troubles dusommeil, la paresthésie, les troubles sexuels, les oedèmes, l'hétapo­splénomégalie, l'anorexie, l'hébétude, les réflexes cheiro-oraux, lestremblements et l'excitation.

. .Cependant, ces manifestations cliniques sont extrêmement variables et

non spécifiques et, nombreuses sont les maladies tropicales qui ont la mêmesymptomatologie. En outre, les formes observées sur le terrain sont le plussouvent pauci- voire asymptomatique (Frézil, 1983; Force-Barge, 1991).

Toutefois, l'analyse des examens cliniques réalis~s sur le terrain montrentque les troubles du sommeil et la présence des adénopathies, notammentcervicales, chez les sujets de plus de 30 ans ainsi que les oedèmes de la face chezles moins de 20 ans constituent des signes indicateurs intéressants de la maladiedu sommeil. Mais, ils ne concernent qu'une proportion très faible de malades(Frézil, 1983; Force-Barge,1991).

4.1.2. Examens parasitologiques

Selon une recorrimandation de l'OMS (OMS, 1986), le seul diagnostic decertitude pour les trypanosomoses africaines passe nécessairement par la miseen évidence du parasite dans un des milieux biologiques accessibles de l'hôte(sang, suc ganglionnaire, liquide céphalo-rachidien et moelle osseuse). LeTableau II résume les sensibilités des différentes méthodes classiquementutilisées.

4.1.2.1. Ex~en du sang

4.1.2.1.1. Méthodes directes

Tableau II. Sensibilité relative des méthodes de détection des trypanosomes.dans le sang (nombre de trypariosomes/ml). .

Méthodes Sensibilité Références(parasites/ml)

Frottis frais 104 OMS (1986)"

Etalement mincecoloré 8 x 103 Arbyn (1994)

Goutte épaisse 5 x 103 OMS (1986)

Centrifugation en tubecapillaire 5 x 102 OMS (1986)

Buffy coat 2,5 x 102 Arbyn (1994)

Minicolonne (MAEC) 102 OMS (1986)

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Les étalements de sang (état frais, frottis, goutte épaisse) permettent dedépister la présence des trypanosomes circulants. Cependant, ces méthodesmanquent évidemment de sensibilité car les charges parasitaires présentes dansle sang sont extrêmement variables et le plus souvent faibles. C'est pourquoi ilfaut recourir aux méthodes de concentration des parasites.

4.1.2.1.2. Méthodes de concentration.

Actuellement, la concentration différentielle en tube capillaire (CTC) etla filtration sur mini-colonne de DEAE cellulose sont les deux techniques deconcentration parasitaire les plus utilisées.

* La concentration différentielle en tube capillaire (CTC).

D'abord mis au point pour.la détection des trypanosomes aviaires(Bennet, 1962), ce test a été adapté au diagnostic de la trypanosomiase humaine(Woo, 1971) et à celui des trypanosomiases animales (Murray et al., 1977). Letest est simple et ne demande qu'une faible quantité de sang (75 JlI) prélevé aubout du doigt chez l'homme. La recherche des trypanosomes se fait, aprèscentrifugation, par examen microscopique direct de l'interface globules-plasma,à travers le tube capillaire. Mais pour augmenter le seuil de détection de laméthode, il semble préférable de prélever cette interface (Buffy coat) et del'examiner au microscope photonique, à l'état frais, entre lame et lamelle(Murray et al., 1977). Cette approche de Buffy coat a été optimisée par laTechnique du "QBC" : Quantification des parasites par Buffy Coat (Bailey &Smith, 1992).

* Filtration sur colonne de cellulose échangeuse d'anions (DEAE­cellulose)

Actuellement, c'est la technique la plus sensible (Lanham et al., 1970;Van Meirvenne et al., 1972). Elle repose sur l'élution sélective destrypanosomes qui, de même charge électrique que le support(diéthylaminoéthyl-cellulose), le traversent, contrairement aux éléments figurésdu sang qui restent adsorbés aux mailles de la colonne.

Toutefois, cette technique est réservée à la confirmation des cas· demaladie du sommeil chez l'homme. La miniméthbde de terrain, minicolonne

40

échangeuse ·d'anions (MAEC), dérivée de la méthode originale, est beaucoupplus rapide. Bien que moins efficace du fait de l'analyse d'un plus petit volumede sang, cette technique révèle une sensibilité 250 fois supérieure à celle del'examen direct (Lumsden et al., 1981)..

4.1.2.2. Examen du suc ganglionnaire

TI est conditionné par l'existence d'une adénopathie palpable, située le plussouvent à la base du cou (cervicale). Le suc est examiné en microscopiephotonique entre lame et lamelle et les. parasites sont repérés par leursmouvements.

4.1.2.3. Examen du liquide céphalo-rachidien (LCR).

Cet examen s'adresse aux sujets parasitologiquement confirmés ouprésentant une forte positivité aux examens sérologiques.

Les parasites peuvent être directement décelés pendant le comptage descellules du LCR sur une cellule de Nageotte. La technique de simple ou mieuxde double centrifugation du LCR donne d'excellents résultats (OMS, 1986).

4.1.2.4. Examen de la moelle osseuse

Lorsqu'il est impossible, en présence d'un cas. suspect, de mettre enévidence le parasite dans le sang, la lymphe ou le LCR, l'examen de la moelleosseuse sur frottis colorés peut alors être réalisé. Cependant, le prélèvement esttrop dangereux pour être utilisé sur le te.rraïn.

4.1.3. Examens sérologiques

4.1.3.1. L'immunofluorescence indirecte (IFI).

Introduite par Wery et al., (1970), cette technique est encore con.sidéréeaujourd'hui comme le test sérologique de référence (Wery et al., 1970; Frézil& Coulm, 1975).

41

Le principe d~ la technique repose- sur la formation d'un complexe _enfaisant réagir des anticorps spécificiques (réponse immunitaire de l'hôte) avecun substrat antigénique figuré constitué de trypanosomes exprimant ou non unsérotype bien défini. L'addition d'un sérum hétérologue antiglobuline humainemarqué _à la fluorescéine entraîne la formation d'un complexe fluorescentvisible sous microscope à lumière U.V. Cette méthode peut être effectuée àpartir du sang sec (sang total recueilli sur papier filtre), du sérum (test semi­quantitatif) .ou du· LCR.

4.1.3.2. La technique ELISA

Le principe de ce test (Vervoort et al., 1978), son utilisation et lescontraintes matérielles qui en découlent le rapprochent de l'IFI. Les anticorpsspécifiques présents dans le sang ou dans le sérum à tester sont mis en contact"avec les antigènes fixés sur des microplaques de polystyrène. L'action d'unconjugué anti-immunoglobuline couplé à un enzyme (peroxydase ouphosphatase alcaline) va permettre la révélation de la réaction par colorimétrieaprès l'addition d'un substrat chromogène correspondant.

La valeur des résultats dépend du choix des réactifs antigéniques(trypanosomes sanguicoles de variant antigénique non défini ou antigène purifiéd'un variant prédominant et ubiquiste de T. b. gambiense).

L'analyse. est réalisée sur sérum ou plasma. La lecture se fait parspectrométrie en mesurant la densité optique ou, le cas échéant, parappréciation visuelle.

4.1.3.3. L'hémagglutination indirecte (HAl)

Mis au point par Boné & Charlier, (1975), le test se pratique sur sérumou plasma mis en contact avec une suspension d'érythrocytes de moutonpréalablement stabilisés et sensibilisés avec un antigène soluble d~ T. b.gambiense. La présence d'anticorps spécifiques dans l'échantillon entraîne uneagglutination macroscopique des globules rouges visible à l'oeil nu.

Pour faciliter son utilisation sur le terrain, ce test a été commercialisésous forme d'un Kit de diagnostic ("Cellognost trypanosomiasis", BoehringerMannheim).-n se réalise sur des plaques de microtitration.

42

4.1.3.4. Test d'agglutination des trypanosomes sur carte(CATI) ,

Le réactif du test CATT (Magnus et al., 1978) est une suspensionlyophilisée de trypomastigotes sanguicoles fixés, stabilisés et colorés en bleu deCoomassie. ils appartiennent à des 'sérotypes bien défmis et sélectionnés (dontl'antigène ubiquiste Litat 1.3) afin d'obtenir une réactivité optimale. dans les

. 'différents foyers de la maladie du sommeil. Le test est èffectué sur une carte. .

plastifiée où sont mélangées unè goutte de sang (sérum ou plasma) et une gouttede réactif. Ce mélange est agité par un mouvement rotatoire pendant 5 mn. Enprésence d'anticorps spécifique's, les parasites forment des agglutinatsmacroscopiques colorés en bleu et'visibles à l'oeil nu.

La technique CATT a été conçue pour être utilisée par les équipesmobiles dans le dépistage de masse de la maladie du sommeil car il présentel'avantage d'être à lecture immédiate et est très facile à mettre en oeuvre. Enraison de sa simplicité, sa rapidité et de son efficacité, ce test est considéréco~e le mieux adapté au dépistage de masse de la maladie du sommeil (VanNieuwenhove & Dec1ercq, 1983; Lemesre et al., 1988, 1990). L'utilisation duCATI a été optimisée par son application aux échantillons de sang sec (Force­Barge, 1991). Au Congo, une évaluation à grande échelle de la valeurdiagnostique de différentes épreuves sérologiques a permis de montrer quel'HAl,. en raison de son excellente valeur prédictive positive, était le test le plusindiqué pour la confirmation en laboratoire des CATT positifs sur le sang total(Lemesre et al., 1988; Noireau e,t al., 1988 a). Moins sensible mais aussispécifique que le test sur le sang total, le CATI sur confettis offre la possibilitéd'une lecture retardée de l'échantillon prélevé sur le terrain.

, Quèlle que soit la valeur des tests sérologiques utilisés, il n'en demeurepas moins que la mise sous traitement d'un individu séropositif, chez qui letrypanosome n'a pu être mis en évidence, se heurte à des problèmes d'ordreéthique non encore résolus.

4.2. Détection et identification chez l'animal

Les techniques parasitologiques décrites précédemment sont aussi utiliséeschez l'animal, les trypanosomes n'étant mis en évidence, dans ce cas, que dans lesang. Les méthodes directes sont très faciles à mettre en oeuvre malS elles

43

. .manquent de sensibilité. Les techniques de concentration parasitaire (CTC etMAEC), plus lourdes, donnent là aussi de meilleurs résultats.

Les tests sérologiques, consistant à mettre en évidence des anticorps anti­trypanosomes chez l'animal ne sont quasiment pas utilisés à cause de leurmanque de spécificité. Les animaux sont fréquemment infectés par plusieurs

.espèces de trypanosomes. Nombreux sont les antigènes utilisés dans les analysessérologiques qui sont présents chez plusieurs espèces de trypanosomes.L'existence de ces parentés antigéniques rend la détection et -l'identification auniveau spécifique, voire même sub-générique des parasites difficilementréalisables (Mehlitz, 1986; Nantulya, 1990).

4.3. Détection et identification des parasites chez l'hôteinvertébré

Les techniques parasitologiques utilisées chez l'insecte vecteur visent àdétecter la présence des trypanosomes, sur examen microscopique, dans lesdifférents organes impliqués dans le cycle évolutif des parasites chez lamouche. En effet, comme nous l'avons dit, classiqu~ment les trypanosomesprésentent un cycle de développement particulier selon le sous-genre auquel ilsappartiennent (Figure 5).

4.3.1. Sous~genre Dutionella (T. vivax)

La totalité du cycle parasitaire se déroule dans le proboscis (labre ethypopharynx) et dure de 5 à 13 jours. Après un repas sanguin infectant, lestrypanosomes ayant pu se fixer sUr la paroi du labre se multiplient activementsous la forme épimastigote. Les autres qui ont été entraînés avec le sang dansl'intestin dégénèrent et meurent. Les formes épimastigotes se détachent de laparoi du labre et pénétrent dans l'hypopharynx où elles se transforment entrypomastigotes métacycliques infectants prêts à être inoculés chez l'hôtevertébré à l'occasion d'un nouveau repas sanguin.

Dans la conception actuelle, la méthode d'identification des parasites chezune glossine appartenant à ce.sous-genre repose sur la mise en évidence d'uneinfection qui se localise uniquement au niveau du proboscis. Cependant, leproboscis ne semble pas être le seul organe de la mouche dans lequel ces

44

Glandes salivaires

Labre

Membranepéritrophique

Intestin

A

B

c

Figure 5. Cycle de développement classique chez la glossine destrypanosomes africains appartenant aux sous-genres Duttonella(Trypanosoma vivax), (A); Nannomonas (T. congolense et T. simiae)(B) et Trypanozoon (T. brucei), (C) (Euzeby, 1986).

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parasites se· développent. En effet, Nyéko et al. (1990) a mis en évidence, avecdes sondes génomiques en technique d'hybridation moléculaire, la présence deT. vivax dans le proboscis et l'intestin des glossines. Moloo & Gray (1989) amontré que le cyle de T. vivax ne se limite pas dans la trompe. En effet, cestrypanosomes ont été observés dans la région oesophagienne des glossines.

.4.3.2. Sous-genre.Nannomonas (T. congolense et T. simiae)

Le cycle de ces trypanosomes s'effectue dans le proboscis et l'intestinmoyen de la glossine. La durée est très variable, en effet, elle est compriseentre 7 et 53 jours. Après ingestion du repas sanguin par la glossine, lesparasites traversent le proboscis et gagnent le jabot avant d'atteindre l'intestinmoyen dans l'espace endopéritrophique. Ils perdent leur manteau de surface etse multiplient intensément. Puis, ces formes envahissent l'espaceectopéritrophique. Les possibilités de passage de l'espace endopéritrophiquevers l'espace ectopéritrophique sont .controversées (Thevenaz, 1981; Ladikpo,1989). Les trypanosomes migrent ensuite jusqu'au proventricule, traversent denouveau la membrane péritrophique et gagnent l'oesophage, le labre où ilsdeviennent des formes épimastigotes. Le cycle se termine dans l'hypopharynxaprès leur transformation en trypomastigotes métacycliques infestants.

Il est admis qu'une glossine ayant le proboscis et l'intestin infestés porteune infection Nannomonas. Cependant, cette .infection ne peut être identifiée auniveau spécifique. En outre, les parasites de T. congolense ont été mis enévidence dans les cellules épithéliales de l'intestin des glossines et dans les replisde la membrane péritrophique (Kaddu et Mutinga, 1980 a,b, 1983; Ladikpo &Seureau, 1988). Ces localisations des trypanosomes ne peuvent être mises enévidence selon la technique classique d'identification parasitaire.

4.3.3. Sous-genre Trypanozoon (T. b. brucei, T. b.gambiense et T. b. rhodesiense).

En plus du proboscis et de l'intestin moyen, le cycle fait intervenirles glandes salivaires. La durée moyenne est de 29 jours. Ces trypanosomessuivent le même cheminement intestinal que les parasites de T. congolensejusqu'à l'hypopharynx. Ensuite, les épimastigotes remontent l'hypopharynx,atteignent les glandes salivaires où ils se transforment en trypomastigotes.métacycliques infectants.

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Selon la conception classique, une identification des trypanosomes,dusous-genre Trypanozoon est déduite si une·glossine est infestée dans les glandessalivaires. De cette façon, les infections immatures du proboscis et l'intestinmoyen ne peuvent êtr~ identifiées. En outre, de nombreuses études montrentdes localisations des trypanosomes différentes de celles décrites précédemment.En effet, Mshelbwala (1972), Otieno (1983) ont découvert les parasites deTrypanosoma· brucei dans le~cellules épithéliales et dans la couche basale del'intestin' moyen, se dirigeant vraisemblablement vers l'hémocoèle. De même,Otïeno et al. (1976) ont infesté des glossines en inoculant les trypanosomes deT. brucei dans l'hémocoèle..

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CHAPITRE III: MATERIEL ET METHODES

CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES

A. ·MATERIEL

1.. SOUCHES PARASITAIRES·

L'ensemble des stocks de parasites qui rentrent dans cette étudeproviennent de la cryothèque de l'Unité de Biologie Parasitaire du centreüRSTüM de Montpellier, de l'EMVT de Maison Alfort à Paris et du "TsetseResearch Laboratory" à Bristol (Angleterre). Ces stocks nous ont été fournissous la forme de stabilats procycliques ou trypomastigotes sanguicoles. Leursprincipales caractéristiques (nom de la référence, origine et date d'isolement)sont résumées dans le Tableau ill.

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Tableau III: Historique des souches de trypanosomes utilisées.Sont indiqués successivement sur ce tableau, les. noms des stocks, les codes OMS, les hôtes, les payset les années d'isolement, les esPèces ou les sous-espèces et enfin, les références bibliographiquesrelatives à leur caractérisation et identifiCation (1 : Leefkang et al., 1976; 2: Gibson et al., 1980; 3: Young & Godfrey, 1983; 4 : Gashumba, 1986; 5 : Paindavoine et al., 1986; 6 : Godfrey et al.,1987; 7 : Gashuma et al., 1988; 8 : Tait et al., 1989; 9 : Boid et al., 1989; 10 : Hide et al., 1990;

.11 : Fasobgon et al., 1990; 12: Truc, 1991; 13 : Mc Namara & Snow, 1991; 14 : Mathieu­Daudet, 1991; 15 : Dires et al., 1993 a et b; 16 : Garside et al., 1994; 17 : McNamara et al.,1994). T. b. g. =Trypanosoma brucei gambiense, T. b. b. =Trypanosoma brucei bruc~i, T. b. r. =Trypanosoma brucei rodhesiense, T~ c. (sav.) = Trypanosoma congolense (type Savane), T. c.(R.F.) = Trypanosoma congolense (type Galerie' forestière), T. c. (Kil.) = Trypanosomacongolense (type Kilifi), T. s. =Trypanosoma simiae, T. v. = Trypanosoma vivax, T. ev. =Trypanosoma evansi.

Noms Espèces ou Référencesdes Codes OMS Hôtes Pays Années Sous- bibliogra-

stocks espèces phiquesBlyamina

(clone) MHOM/SDI82IBivamina Homme SOUDAN 1982 T. b.l!:. 6, 14

058 (clone) MHOM/ZMl741058 Homme -ZAMBIE 1974 T. b. r. 2, 14

Eatroll25 MfRG/UG/66/EatroI125 _ Guib UGANDA 1966 T. b. b. 5,8,10,12,14

1-148 MBOI/NG/60/1-148 Vache NIGERIA 1960 T. c (sav.) 3,4,7,17

Eatro325 G?/UG/62/Eatro 325 Glossine UGANDA 1962 T. c.(sav.) 3,7

ANR3 G/GB/86/ANR 3 Glossine GAMBIE 1986 T. c .(R.F.) 13,16

- WG5 MCAP/KEISO/WG 5 Chèvre KENYA 1980 T. c. (Kil.) 3, 4, 7,16

BAN 7 G/GB/86/BAN 7 Glossine GAMBIE 1986 T. s. 13, 16

Y-486 MBOIING/731Y-486 Vache NIGERIA 1973 T. v. 11,15

Kassala MCAM/SD/77/Kassala Chamea~ SOUDAN 1977 T. ev. 9, 14

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2. LES SONDES GENOMIQUES

. .Les sondes ADN intégrées dans des plasmides ont été mises à notre

disposition par l'Université de Bristol et le Laboratoire International deRecherche sur .les Maladies Animales (ILRAD) sous la forme de plasmidesrecombinants (50 Jlg). .TI s'agit :

. pour Trypanosoma (N.) congolense de- pgNRE-372 (type Savane);- pgNIK-450 (type Kilifi);- DIL-350 (type Galerie forestière);

. pour T. (N.) simiae de pgNS-60ü;

.. pour le complexe brucei de pgDRl.

Ces sondes représentent des séquences répétées d'ADN nucléaire (ADNsatellite) des parasites. La méthodologie de leurs mises au point a consisté, aprèsdigestion de l'ADN par les enzymes de restriction et migrationélectrophoréti.que, soit à mettre en évidence une ou plusieurs séquences répétéesen comparant les intensités de fragments d'ADN après coloration au bromured'éthidium, les séquences d'ADN ayant des bandes très intenses correspondentaux séquences répétées du génome, soit à effectuer, après transfert surmembrane (Southem blot), une hybridation de l'ADN génomique entier decette même souche de trypanosome dans des conditions telles que seules lesséquences répétées d'ADN puissent s'hybrider.

Les fragments d'ADN correspondant aux séquences répétées sont isolés etinsérés dans des plasmides, ces derniers sont ensuite transfectés dans desbactéries (Eschericha coli). Les bactéries transformées sont ensuitesélectionnées par hybridation in situ (Grunstein et al., 1975). Les plasmidessont amplifiés, isolés et purifiés. Les caractéristiques de ces sondes sontrésumées dans le Tableau IV.

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Tableau N. Caractéristiques des sondes génomiques utilisées et références relativesà leur mise au point.

.Désignation Taille en Nature de Nombre dedes sondes Spécificité paire de l'élément copies Références

bases (pb) répété approximatif

pgNRE-372 T.congolense 372 en tandem 3000 Majiwà et al. (1985)"Savane" Gibson et aL (1988)

T.congolense Non Gibson et at (1988)nll..-350 "Galerie 350 dispersé détenniné .

forestière"

pgNIK-450 T. congolense 450 en tandem 4000 Majiwa et al. (1985)"Kilifi" Gibson et al. (1988)

PgNS-600 T. simiae 550 en tandem 1000 Majiwa & Webster (1987)Gibson et al. (1988)

PgDRl (ingui) T. brucei s.l. 5280 dispersé 500 Kimmel et al. (1987)

3. AMORCES OLIGONUCLEOTIQUES

Nous nous sommes limités à l'identification de deux types de T.congolense (type "Savane" et type· "Galerie forestière") et de T.brucei s.l. Denombreuses éttides mettent en évidence une répartition phytogéographique bi~n

distincte. des trypanosomes de 'T. congolense (cf. paragraphe '1.2. du chapitreGénéralité). Les deux zones de notre étude sont la Bouenza (Congo), qui est unfoyer de savane et Boblénou (Côte d'Ivoire), une zone préforestière. Ainsi,pour l'identification des parasites de T. concolense, seuls les oligonucléotidesspécifiques des groupes "Savane" et "Galerie forestière" ont été utilisés.

Les fragments amplifiés de T. congolense correspondent aux séquencesd'ADN répétées déjà décrites dans le chapitre Matériel. Les trypanosomesappartenant à l'espèce T. brucei ont été détectés et identifiés en amplifiantl'ADN satellite décrit par Sloof et al. (1983); ces amorces détectent aussi T.evansi. Les premiers travaux décrivant l'utilisation de ces oligonuléotides ontété réalisés par Moser et al. (1989) et Masiga et al. (1992).

il s'agit pour:

-T. congolense (type Savane) de :5' TCGAGCGAGAACGGGCACTTTGCGA 3' et 5' ATTAGGGACAAACAAATCCCGCACA 3'. (oligonucléotides "Sav");

- T. congolense (type Galerie forestière) de5'GGACACGCCAGAAGGTACTT 3' et 5' GTTCTCGCACCAAATCCAAC

3' (oligonucléotides "Gr'); .

- T. brucei de: 5' GAATATTAAACAATGCGCAG 3' et5' CCATTIATTAGCTTTGTTGC 3'. (oligonucléotides "Br").

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4. LES MOUCHES D'INFECTION EXPERIMENTALE

4.1. Les glossines de mono-infection (T. b. brucei ou T.congolen~e)

Les mouches étudiées· proviennent. de l'élevage de l'ORSTOM­EMVT/CIRAD de Montpellier. TI s'agit de Glossina fuscipes fuscipes Newstead,1910 et Glossina morsitans morsitans, Westood, 1850. Les glossines ont étéinfectées au stade ténéral (âgées de quelques heures à 24 h). En effet, à ce stade,elles sont plus susceptible à l'infection (Mitchelle et al., 1976). Les souches detrypanosomes de référence ayant servi à infecter les glossines sont Eatro 1125(T. b. brucei) et Eatro 325 (T. congolense "Savane").

Les mouches sont réparties à raison de 15 à 30 mouches par cage. Ellessont posées, pendant 10 mn, sur les oreilles d'un lapin ou sur le ventre d'un ratparasité. Le repas infectant n'a lieu qu'une fois. Les glossines n'ayant pas prisde repas sanguin sont éliminées. Les mouches gorgées sont maintenues pendanttoute l'expérience dans un insectarium selon des conditions décrites par Itard &Bauer, (1984) : température (25 0 C), humidité relative (60-85%) etphotopériode (12 h). Elles sont ensuite nourries 6 jours par semaine à raisond'un repas sanguin par jour. Au terme des durées des cycles des trypanosomesfixés à des périodes de 20 à 25 jours pour T.· congolense et de 40 à 45 jourspour T. brucei, les glossines ont été disséquées après un jeûne de 24 à 48 h.

4.2. Les glossines d'infection mixte

Les mouches sont tout d'abord infestées avec T. b. brucei puis avec T.congolense. Les protocoles d'infection sur lapins et de tri des glossines gorgéessont les mêmes que ceux décrits précédemment dans l'infection simple. Après lepremier repas infectant avec le premier parasite, les mouches sont mises à jeunpendant 48 h. Ensuite, elles prennent un second repas infectant avec ledeuxième parasite. Les mouches non gorgées sont éliminées. Seules les glossinesrepues à la fois lors du premier repas et du second repas infectant sont retenuesdans le cadre de notre étude.

L'infestation des glossines·a été effectuée par M.L. Dia, dans le cadred'un stage de Diplôme d'Etude Approfondie de Parasitologie (1993), sous la

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direction deD. Cuisance et de J.L. umesre. Cette étude visait à évaluer lacapacité vectorielle de l'espèce G.ffuscipes, dans les conditions de laboratoire,en comparaison avec celle d'une· glossine. de référence, G.. m. morsistans(Harley & Wilson, ·1968; Robert & Gray, 1972). Les intestins, glandessalivaires et proboscis des mouches ont été disséqués puis observés enmicroscopie (technique parasitologique). Une partie de ces· échantillons a étéanalysée pa~ la. technique· d'hybridation moléculaire utilisant les sondesradiomarquées. Dans le cadre de notre étude, nous avons utilisé une partie deglossines pour l'étude de l'hybridation moléculaire en marquage non radioactifet en technique de polymérisation en chaîne (PCR).

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5. LES MOUCHES DE ZONES D'ENDEMIE

La technique de PCR (cf. paragraphe 6 du chapitre Méthode) sur les.échantillons provenant de zone d'endémie sommeilleuse a été évaluée dans deuxfoyers de THA présentant deux faciès épidémiologiques différents : l'Afrique

. .

centrale (Congo) et l'Afrique. de l'Ouest (Côte d'Ivoire).Au Congo, les glossines ont été capturées et disséquées par P. Grébaut du

laboratoire d'Entomologie Médicale et de Parasitologie du centre ORSTOM deBrazzaville (Congo) et par les services des .Grandes Endémies (service de lutte

locale contre la Trypanosomiase). En Côte d'Ivoire, ce travail a été ·réalisé parC. Laveissière et F. Fournet de l'Institut Pierre Richet de l'OrganisationCommune et Coopération de lutte Contre les Grandes Endémies (OCCGE) àBouaké en Côte d'Ivoire.

Les échantillons du Congo proviennent d'un des plus importants foyers dela maladie du sommeil du pays : le foyer de Boko-Songho (Bouenza) et ceux dela Côte d'Ivoire proviennent de la zone de Boblénou (Sud de Bouaké). Lescaptures de glossines ont été effectuées à l'aide de pièges monoconiques de type"Vavoua" (Laveissière, 1988) suspendus par une ficelle à une branche d'arbre,et surmontés d'une cage de type "Roubaud", nécessaire pour avoir des glossinesà l'état frais. Les mouches ont été recueillies toutes les heures, regroupées entube à essai par lot de 4 ou 5 et placées dans un tissu humide pour les préserverdu dessèchement avant dissection.. .

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B. METHODES

l. .. PRODUCTION DES PARASITES

1.1. Multiplication in vivo

Après inoculation du sang parasité à de jeunes rats Wistar (typenorvegicus), les différents stocks de trypanosomes de référence ont été adaptéssur ces rongeurs par passages successifs conduisant à l'obtention d'un nombreimportant de trypanosomes.

1.1.1. Production des formes sanguicoles

Environ 1 à 1,5 ml de sang est inoculé par voie intrapéritonéale à des ratsWistar. Lorsque la parasitémie, suivie par un contrôle microscopique (Herbert& Lumsden, 1976), atteint environ 2 à 2,5 x 108 trypanosomes par ml de sang,le rat est endonni dans une cloche à chlorofonne. Le sang parasité (en moyenne10 à 15 ml) est prélevé dans la cage thoracique de l'animal après rupture del'aorte, à l'aide d'une. seringue de 20 ml préalablement héparinée. li est ensuitemélangé à + 4° C en présence d'anticoagulant (0,25 ml d'héparine par rat) à unvolume égal de tampon phosphate salin: PBS, p~ 8 (NaCl 44 mM, NaH2P04 3mM, Na2HP04 57 mM) contenant 1% de glucose PSG (pH 8).

1.1.2. Séparation des trypanosomes des éléments figurés dusang sur colonne échangeuse d'anions

A partir du sang de rats parasités, les trypanosomes sont séparés deséléments figurés du sang par le protocole préconisé par Lanham & Godfrey,(1970). La différence de charge en surface membranaire entre les parasites etles éléments figurés du sang permet de séparer les parasites sur colonne deDiéthylaminoéthyl cellulose (DEAE cellulose) en tampon PSG, pH 8.

La cellulose (DE 52, Whatman) est imbibée puis est équilibrée par lavageen tainpon phosphate PSG (pH 8). La solution sanguine est déposée sur 40 ml degel. Les trypanosomes sont élués dans le tampon PSG (pH 8) à 4°C et sontrécupérés par centrifugation à 1400 x i à 4° C penq.ant 10 Inn. Le culot

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parasitaire est soumis à trois lavages-en tampon PSG (pH 8) pour éliminer lesprotéines sériques contaminantes.

1.2.. Culture in vitro

1.2.1. Adaptation·des. souches.

.A partir des formes sanguicoles, les formes·procyCliques sont adaptées etcultivées in vitro par passages successifs à 28 oC dans les milieux CMEM etKIVI (Le Ray, 1975; Brun & Schonenberger, 1981). La formulation exacte deces milieux est détaillée en Annexe.

Lors de leur utilisation, les milieux sont additionnés de 20% de sérum deveau foetal préalablement décomplémenté (560 C pendant 30 mn). Un volumede 9,5 ml de sang parasité est prélevé en présence de 0,5 ml d'anticoagulantLiquoîde Roche® (Polyanéthol-sulfonate). Deux boîtes de culture contenantchacune 10 ml de milieu de culture sont ensemencées et incubées à 270 C. Unrepiquage hebdomadaire est réalisé à raison de 1 volume de primo-culturemélangé à 1 volume de milieu neuf. Une fois adaptés, les trypanosomes sontsystématiquement cultivés en milieu CMEM (cf. paragraphe 1.2.2. cî--après).

1.2.2. Culture continue et culture de masse.

.Les parasites sont maintenus en culture continue à 28 oC par deux

repiquages hebdomadaires qui cC?nsistent à ensemencer 0,5 ml de formesprocycliques de phase exponentielle dans 4,5 ml de milieu CMEM en flacon de25 cm2.

Les cultures massives sont effectuées dans des flacons de 150 cm2, aprèsun passage intermédiaire en boîtes de 75 cm2 (10 à 25 jours selon les souchesutilisées).

Les formes procycliques sont récoltées au début de- la phase stationnairede leur croissance par centrifugation de la culture à 1400 x g à 40 C pendant 20Inn. Le culot parasitaire est alors lavé deux fois par centrifug~tionen tamponphosphate salin PSG (pH 8).

1.3. Conservation des souches de parasites

Les trypanosomes sont conservés sous formes de stabilats selon deuxprotocoles :

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- par cryocongélation dans du glycérol.A deux volumes de sang parasité de rat, est additionné un volume de

tampon PSG contenant 22,5% (v/v) de glycérol.

- par cryocongélation dans du DMSO.A trois volumes de sang parasité est additionné un volume de solution de

sérum de veau foetal contenant 20% (v/v) de diméthylsulfoxide (DMSO).

Quelle que soit la technique utilisée, la congélation se fait de façonprogressive. L'échantillon est incubé 2 h à -200 C puis une nuit à -800 Cavantd'être plongé dans l'azote liquide (-1800 C) pour la cryoconservation.

Les stocks de parasites se conservent ainsi plusieurs années et peuvent êtreréactivés par passage sur rat ou en culture in vitro pour fournir à nouveau unepopulation homogène et abondante de trypanosomes.

58

2. PURIFICATION DU MATERIEL GENOMIQUEPARASITAIRE

2.1. Lyse des parasites

Les trypanosomes sont lysés dans du tampon Tris-HCI 100 mM p~, 8contenant 0,1 M NaCI, 10'mM EDTA et 1% SDS à raison de 100 mg de culotparasitaire par ml de tampon de lyse en agitant le tube doucement pendant 5mn. La lyse est poursuivie par digestion des protéines en présence de protéinaseK à une concentration de 100 J.lg/ml pendant 2 h à 370 C.

2.2. Elimination des protéines et des lipides

,Les protéines et les lipides sont éliminés par une succession d'extractionsau phénol et au chloroforme.

A 1 volume d,e la solution ADN est ajouté 1 V de phénol saturé avec duTE (Tris-HCI10 mM pH 8; EDTA 1 mM). Le tube est agité faiblement jusqu'àl'obtention d'une émulsion. Les deux phases sont séparées après centrifugation à15000 x g pendant 5 mn. La phase aqueuse est délicatement prélevée puissoumise de la même façon à deux extractions : IV phénol/chlorofonne (0,5 V :0,5 V); 1 V de chloroforme-alcool isoamylique (24 V de chlorofonne : 1 V del'alcool isoamylique);. Le surnageant recueilli est mélangé à 1 V d'éther etcentrifugé à 15000 x g pendant 1 min. La phase supérieure (éther et traces dechlorofonne) est éliminée. La phase inférieure (phase aqueuse) contientessentiellement les acides nucléiques.

2.3. Elimination des ARN

Les acides ribonucléiques sont dégradés en présence de 100 J.lg/ml deRNAse A ne contenant aucune trace de DNAse à 37 0 C pendant 1 h. Ensuite, laRNAse est éliminée par une seconde extraction au phénol/chlorofonne, selon leprotocole décrit ci-dessus.

2.4. Précipitation de l'ADN

Après avoir ajouté 0,3 M d'acétate de sodium pH 5,7 (1/10 V) et l'alcoolabsolu (2,5 V), le mélange est laissé à -80 0 C pendant 1 h. Le culot de

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centrifugation (15000 x g, 15 mn, 4° C) est lavé 3 fois à l'éthanol 70%. li estséché au "speed vac" et enfm resuspendu dans de l'eau stérile.

2.5 Contrôle de la quantité et de la qualité de l'ADN

L'ADN est dosé au· spectrophotomètre en utilisant la relation suivante : t. .

unité de densité optique (D.O) correspond à une concentration de 50 Jlg/mld'ADN bicaténaire à 260 nm de longueur d'onde.

Les rapports des D.O.26ü/D.O.28o et D.O.26ü/D.O.230 témoignent du degréde pureté de l'ADN et doivent être compris entre 1,8 et 2.

60

3. PRODUCTION DES SONDES GENOMIQUES

Les sondes sont .insérées dans des plasmides. L'obtention de ces sondes, passe par la transfection de bactéries, la culture en masse de ces bactéries,

l'amplification' du nombre de copies par cellule' et enfin l'extraction et ,lapurificat~on des plasmides.

3.1. Transformation des ba~téries

La technique de transformation a été initialement décrite par Hanahan(1983) et permet d'atteindre une haute efficacité de transformation de l'ordrede 109 cellules/Jlg d'ADN. Les plasmides mis à notre disposition ont ététransfectés dans la souche d'Eschericha coli (DH5a) selon le protocole modifiépar Hanahan (1985), ne nécessitant pas l'emploi du DMSO (Diméthylsulfoxide),agent toxique pour les cellules. TI a été adapté et optimisé par Oury (1989).

3.1.1. Milieu et Tampons

Le milieu de culture SOB est composé de 20 g/l de bactotryptone, 5 g/ld'extrait de levure, la mM de NaCI et 2,5 mM de KCl. Après ~voir ajusté le pHà 7,4, le milieu est autoclavé et les sels de MgCh et de MgS04 sont ajoutésstérilement, extemporanément, à u~e concentration finale de la mMrespectivement.

La culture en boîte de Pétri est faite dans le milieu SOB' contenant 1,5%d'agar (p/v). Les plasmides utilisés contiennent le gène de résistance àl'ampicilline. Ainsi, pour empêcher la croissance des bactéries non transfectées,l'ampicilline est ajoutée au milieu gélosé (lorsque la température est inférieureà 50° C) à une concentration de 50 Jlg/ml.

Deux tampons sont utilisés dans le protocole décrit plus bas :

-Tampon RF1 :

. RbCI (Chlorure de Rubidium)

. MnC12.4H20

61

100 mM50 mM

· Acétate de Potassium· CaC12.2H20

· Glycérol

30 mM10 mM

15% (P/V)

Le .. pH est ajusté à 5,8 avec de l'acide acétique 0,2 M. Le tampon eststérilisé par filtration sur membrane de 0,22 Jlm de porosité.

. .. -Tampon RF2 :

10 mM10 mM75 mM

15% (PN)

· MOPS (Acide 2-Morpholino-propanesulfonique)

· RbCI· CaC12.2H20

· Glycérol

Le pH est ajusté à 6,8 avec de la soude 0,1 N et le tampon est stérilisé parfiltration sur membrane de 0,22 Jlffi de porosité.

Chaque transfonnation est effectuée dans un tube en polypropylène de 13ml stérile (Greiner, Allemagne). Avant utilisation, il est impératif de rincerchaque tube et de les autoclaver (110° C; 20 mn). Ce rinçage permet d'éliminerles résidus toxiques pour les cellules qui diminuent de 10 fois l'efficacité de latransformation ou, dans certains cas, la rendent totalement inefficace.

3.1.2. Protocole

Cinquante millilitres de milieu SOB sont ensemencés avec 5 colonies de lasouche d'E.coli DH5a (1 colonie pour 10 ml de milieu), isolées sur agar àpartir de cryostabilat à-70° C. La culture est incubée à 37° C, sous agitation à50 x g.

La croissance cellulaire est suivie par la mesure de .la densité optique(D.O.) à 550 nm. Les bactéries doivent être en phase de croissancelogarithmique, dans un état physiologique défini, favorable à l'acquisition de lacompétence.

L'état de compétence est atteint lorsque la densité cellulaire est entre4.107 à 9.107 cellules/ml. Cette fourchette doit être respectée précisément et estcorrélée à une D.O. de l'ordre de 0,5 à une longueur d'onde de 550 nm.

62

La croissance bactérienne est arrêtée en incubant la culture dans la glacependant 10 mn. Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées à 0° C(tampons et tubes préalablement refroidis).

Après centrifugation à 750 x g, à 4° C pendant 10 mn, les cellules sontremises en suspension dans 1/3 de volume initial (soit 16,6 ml) de tampon RF1dans un tube à centrifuger de 50 ml. Les cellules sont irtcubées dans la glace

.pendant 15 mn.

Après une nouvelle centrifugation à 750 x g, à 4° C, les cellules sontremises en suspension dans 1/12,sème du volume initial (soit 4 ml) de tamponRF2. La suspension cellulaire est répartie en aliquotes de 200 III dans des tubesde 13 ml et les cellules sont incubées dans la glace pendant 15 mn.

Le plasmide à cloner est ajouté dans chaque tube sous un volumeinférieur à 20 JlI (10% vIv)~ Les suspensions cellulaires sont bienhomogénéisées et incubées pendant 15 mn dans la glace.

La transformation bactérienne est accomplie après un choc thermique à42° C dont la durée doit être étalonnée pour chaque type de tube. Pour les tubesde culture de 13 ml (Greiner), la durée optimale du choc thermique est de 2 mn45 s.

Les tubes sont aussitôt refroidis à 0° C, dans la glace fondante, avantd'ajouter 800 III de milieu SOB. Çhaque transformation est incubée à 37° C,sous agitation (50 x g) pendant 1 h, puis étalée sur "top agar" (0,75% d'agar aulieu de 1,5%). A 4 ml de "top agar" maintenu en surfusion à 45° C, sontmélangés 30 III d'ampicilline (50 mg/ml) et 100 III de cellules transformées.

Après homogénéisation, '''le top agar" est étalé sur une boîte de milieuagar SOB contenant de l' ampicilline.

Les boîtes sont incubées à 37° C et les colonies recombinantesapparaissent après 18 h d'incubation.

3.2. Culture des' bactéries transformées

63

La culture est initiée à partir d'un cryostat bactérien déposé sur lapériphérie d'une boîte de culture. Fondue, la goutte est étalée par épuisement destries. La boîte est incubée à l'envers pendant 24 h dans une étuve à 37° C.

Après isolement de colonies bactériennes sur. milieu SGB solide, unepréculture est ensemencée avec une colonie dans 10 ml de milieu de SGB.liquide et incubée à 37° C, sous agitation orbitale (52 x g) pendant une nuit~

Cent millilitres de milieu SGB sont ensemencés avec 0,4 ml depréculture. La croissance bactérienne est suivie par turbidimétrie et la phase logtardive est atteinte pour une valeur de densité optique de 0,6 à 550 nm delongueur d'onde. Deux litres de milieu SGB (4 x 500 ml) sont à leur tourensemencés avec les 100 ml de la culture intermédiaire. Cette culture massiveest incubée pendant 9 h à 37°C, sous agitation.

3.3. Amplification des plasmides

Le chloramphénicol, utilisé à une concentration de 170 Jlg/ml, bloque laréplication de l'ADN bactérien et par conséquent, la division cellulaire.Cependant, le plasmide dont la réplication est autonome continue à se répliquer.L'ADN plasmidial est amplifié en présence de chloramphénicol à 37° C et sousagitation pendant 16 h.

3.4. Extraction. des plasmides

L'extraction du plasmide est effectuée par la méthode de lyse alcaline(Maniatis et al., 1988) détaillée ci-dessous.

3.4.1. Centrifugation des bactéries

Les 21 de culture sont centrifugés dans des pots stériles en polysulfone de250 ml, à 4000 x g pendant 10 mn à 4°C. Les bactéries sont remises ensuspension dans 40 ml de tampon de lavage STE (Tris-HCl 10 mM pH 7,8;NaCl100 mM; Na2EDTA pH 8.1 mM).

3.4.2. Lyse <:les bactéries

64

Après centrifugation (4000 x g 'pendant 10 mn à 4° C), les bactéries sontremises en suspension dans 6 ml de tampon de lyse (Tris-HCI 25 mM pH 8;glucose 50 mM; Na2EDTA pH 8, 10 mM) contenant 100 ~g/ml de lysozyme, le

, ' .volume final étant ajusté à 10 ml avec ce même tampon. Les bactéries sont ainsilysées à température ambiante pendant 15 mn.

Vingt millilitres (2V) de solution alcaline (NaOH 0,2 N; SDS 1,%), " préparée extemporanémeri(sont ajoutés au lysat. Le tube est incubé dans la

glace pendant 10 mn.

3.4.3. Précipitation de l'ADN chromosomique

L'ADN chromosomique est précipité en ajoutant 15 ml (1,5 V) d'acétatede potassium 5 M pH 5,8 refroidi préalablement dans la glace. Le tube, aprèsagitation, est laissé pendant 10 mn dans la glace.

L'ADN chromosomique et les débris bactériens sont séparés de la phaseliquide' par centrifugation à 4600 x g pendant 20 mn à 4°C. Le surnageant,contenant essentiellement l'ADN plasmidial, est réparti dans 2 tubes àcentrifuger de 50 ml.

3.4.4. Précipitation de l'ADN plasmidial

L'ADN plasmidial est précipité en ajoutant 0,6 V d'isopropanol. Lasolution est laissée pendant 10 mn à température ambiante. Elle est ensuitecentrifugée à 12000 x g pendant 30 mn à température ambiante. Le culotobtenu est lavé 3 fois dans l'éthanol 70% (v/v) puis séché. Les acides nucléiquesprécipités sont resuspendus dans 3 ml d'eau stérile.

3.4.5. Dégradation des ARN

Cette hydrolyse se fait en présence de 100Jlg/ml de RNAse à 37° Cpendant 1h.

Les protéines présentes sont dégradées par 100 Jlg/ml de protéinase Kenprésence de 0,5% (p/v) de SDS à 37° C pendant 2 h.

3.4.6. Extraction de l'ADN plasmidial

65

Elle est effectuée par une série d'extractions (cf. paragraphe 2.2. de cechapitre) : 2 au phénol; 2 au phénol/chlorofonne; 3 au chlorofonne-alcoolisoamylique et 3 à l'éther. "

3.4.7. Purification de l'ADN plasmidial

L'ADN plasmidial est purifié par centrifugation à l'équilibre dans' ungradient de solùtion de chlorure de césium : CsCI (densité=1,55 g/ml)enprésence de 0,5 mg/ml de bromure d'éthidium, à 90000 x g' à une températurede 200 C pendant 16 h dans un rotor vertical 65 VTi.

L'ADN baètérien linéaire et l'ADN plasmidial sous forme circulairerelâché sédimentent à une densité plus faible que l'ADN plasmidialsuperenroulé. Le plasmide superenroulé fonne la bande inférieure et estprélevée sous la lumière ultraviolette (U.V), à l'aide d'une aiguille montée surune seringue de 1 ml.

Après dilution de la solution dans 4 à 5 V d'eau stérile, le bromured'éthidium est extrait au n-butanol saturé. Un volume de n-butanol est mélangéà un volume de solution d'ADN. Les deux phases sont séparées parcentrifugation à 12000 x g, pendant 5 mn, à température ambiante. La phaseorganique supérieure est éliminée et la phase aqueuse inférieure est à nouveauextraite. L'opération est répétée ainsi 5 ou 6 fois jusqu'à disparition de lacouleur rose du bromure d'éthidium dans la phase aqueuse.

Les traces de butanol sont éliminées par" 3 extractions à l'éther et lasolution d'ADN est dialysée contre du tampon TE pout supprimer le CsCl.

L'ADN est alors précipité à l'éthanol et" repris dans de l'eau stérile, doséet contrôlé au spectrophotomètre (cf. paragraphe 2 de ce chapitre). Saconcentration est ajustée à 1 Jlg/J..ll.

66

4. HYBRIDATION MOLECULAIRE

4.1. Kit de marquage chimique

Le kit de marquage utilisé est le kit direct ECL (Amersham, Angleterre).Le principe du marquage est exposé dans la Figure 6. TI consiste à couplerdirectement sur les nucléotides de la sonde une enzyme, la peroxydase qui a étéfixée de façon covalente à un composé de c~arge positive (nature inconnue, sousbrevet). Les molécules de peroxydase (chargées positivement) se fixent sur lesbrins d'ADN monocaténaire (chargés négativement) par une interaction de typeélectrostatique..Sous l'action de la glutaraldéhyde, ces liaisons électrostatiquesentre les molécules de la peroxydase et l'ADN se transforment en liaisonscovalentes. Après hybridation, la révélation se fait par une réactionenzymatique en présence d'un composé, le luminol, dont l'oxydation induitl'émission de lumière visible, détectée en autoradiographie.

La quantité de la sonde à marquer est fonction du volume de tampond'hybridation qui, lui même, dépend de la taille de la membrane. Soit, 0,25 mlde tampon/cm2 de membrane et 20 ng de sonde/ml de tampon.

Les différentes étapes de marquage de la sonde, d'hybridation, de lavageset de révélation sont effectuées selon le protocole établi par le fournisseur du

. .

kit.

4.1.1. Préparation des échantillons et dépôt sur membrane

La dénaturation des échantillons d'ADN et leur fixation sur la membrane(Hybond N+, Amersham) se font en milieu alcalin. L'ADN est dénaturé enprésence de NaOH 0,5 N pendant 20 mn à température ambiante.

Après incubation de la membrane pendant 15 mn dans une solution deNaOH 0,5 N, les solutions d'ADN sont déposées sous aspiration. La membrane

. est ensuite déposée sur du papier Whatman 3MM imbibé de NaOH 0,4 Npendant 20 mn pour fixer l'ADN puis, sur du papier Whatman 3MM ~bibé detampon 5 x SSC pendant 2 mn avant le séchage pour éliminer le NaOH.

67

Sonde ADN bicaténaire

Séparation des brins dlADNpar chauffage

Les simples brins d'ADNsont chargés négativement

Peroxydases(chargées positivement)

Fixation sur l'ADN sonde des

molécules de peroxydases defaçon électrostatique en .

présence de la glutaraldéhyde

Luminol 1

ADN cible Hybridationsuivie desmembrane

moléculairelavages de

Luminol2 02+H20

. Produit oxydé

Lumière

Impression du film(signal)

Génération et révélation dusignal

Figure 6 . Schéma simplifié du kit de marquage chimique

68

4.1.2. Marquage de la sonde

La sonde est dénaturée dans un volume de 10 III pendant 5 mn parchauffage à 95°C suivi d'un refroidissement dans la glace fondante. Aprèsfixation de 10 III de solution de peroxydase puis 10 III de glutaraldéhyde, lemilieu réactionnel est incubé à 37° C pendant·10 mn.

La sonde marquée peut être utilisée immédiatement ou conservée durant ... près de 2 moisdaris du glycérol50% à-20° C. ..

Pour vérifier le marquage, des quantités décroissantes de 10, 1 et 0,1 pgde sondes marquées sont directement déposées sur une membrane. Après dépôt,sous un volume de 2 à 5 Ill, la membrane est enveloppée d'un film plastique etconservée à 4°C à l'abri de la lumière jusqu'à la révélation.

4.1.3. Hybridation moléculaire

L'hybridation se déroule en 2 étapes selon le protocole préconisé par lefournisseur.

4.1.3.1. Préhybridation

Cette étape consiste à saturer les sites de fixation non spécifiques par unagent.bloquant présent dans le tampon d'hybridation.

La membrane est placée dans un tube en verre. Elle est incubée dans letampon d'hybridation fourni dans le kit (composition inconnue, sous brevet) àraison de 0,25 ml de tampon/cm2 de membrane pendant 45 mn à 42° C.

4.1.3.2. Hybridation

L'hybridation est effectuée dans le même tampon que la préhybridationdans lequel est ajouté la sonde marquée.

Pour éviter le contact direct de la sonde avec la membrane, 500 III detampon sont prélevés et mélangés avec la sonde dans un tube eppendorf puis, letout est remis dans le tube en verre d'hybridation à raison de 10 ng de sonde/mlde tampon à 42° C pendant 16 h.

4.1.4. Lavages

69

Les lavages de la membrane permettent, d'éliminer l'excédent de sondenon hybridée ainsi que les hybridations non spécifiques.

Le rapport volume des tampons de lavage en fonction de la surface de lamembrane est de 3 ml/cm2.

. , La membrane est d'abord immergée dans du tampon Urée (Urée' 6M;SDS 0,4%; 0,5 x SSC) pendant 20 Inn à 42° C, sous agitation. Ce lavage estrépété une fois. Ensuite~ la membrane est incubée dans un· tampon 2 x SSCpendant 5 rnn à température ambiante. Cette étape est renouvellée une fois.

4.1.5. Génération du signal

L'activité enzymatique (peroxydase) est détectée en présence de luminol..La membrane (face ADN vers le haut) est recouverte pendant 1~ de

luminol à raison de 125 J..Ll/cm2• Après séchage sur du papier Whatman 3MM,elle est enveloppée dans un film plastique et placée contre un filmd'autoradiographie, entre 2 écrans renforçateurs (amplificateurs de signaux)dans unè cassette autoradiographique. Le film est exposé à températureambiante pendant successivement 10, 30 et 60 rnn.

4.1.6. Révélation

Elle se fait dans un bain de révélateur Kodak LX 24 pendant 4 rnn. Lefilm est ensuite rincé dans. de l'eau permutée pendant 1 mn, avant d'êtreimmergé dans un bain de fixateur Kodak AL 4 pendant 8 mn. Après un rinçagedans l'eau permutée pendant 30 mn, il est mis à sécher à l'air.

70

4.2~ Kit de marquage enzymatique

Comme le montre la Figure 7, le principe du marquage indirect reposesur une méthode immun.oenzymatique. TI consiste à insérer dans le brin d'ADN,au cours sa synthèse, un analogue de la thymidine couplée à la fluorescéine..Ladétection des duplex ADN~sonde se~fait par l'mtermédiaire. d'un conjugué anti­fluorescéine couplé à la peroxydase~' Comme dans le marquage chimique (cf.paragraphe 4.1. de ce chapitre), l'activité enzymatique est détectée parautoradiographie en présence de luminol. .

Les différentes étapes de cette technique sont effectuées selon le protocoledécrit par le fournisseur (Amersham).

4.2.1. Préparation des échantillons et dépôt sur membrane.

L'ADN de l'échantillon est dénaturé par chauffage à 95° C pendant 5 mnsuivi d'une incubation dans la glace (5 mn). La membrane est imbibée pendant5 Inn dans le tampon 5 x SSC avant dépôt des échantillons sous aspiration.

Pour une membrane de type Hybond N+, une incubation dans un four à80° C pendant 2 h est recommandée pour parfaire la fixation de l'ADN, cettemembrane étant enveloppée dans du papier Whatman 3MM.

4.2.2. Marquage de la sonde.

Après chauffage à 95° C pendant 5 mn de 50 J.11 de solution d'ADN deconcentration minimale de 2 ng/f.ll, suivi d'un refroidissement dans la glacependant 5 mn, sont ajoutés dans cet ordre les composés suivants :

- Eau stérile .14 f.ll- Nucléotides (mélange) 10 f.ll (concentration inconnue, sous brevet)- Amorces (9 bases) 5 f.ll (concentration inconnue, sous brevet)- DNA dénaturé 20 f.ll (100 ng)- Enzyme (ADN polymérase) 1 f.ll (4 unités)

71

Sonde ADN bicaténaire

./"V

./"V

I.~.-T ~ mélanges /:::.éotideS dont~~ .- [JU. un marqué. à la fluoreséine

---=====--- Sonde marquée~-[j--[!j

~

~

Séparation des brinsd'ADN par chauffage

Synthèse d'un nouveaubrin d'ADN (brinmarqué à laFluorescéine) .

Séparation des brinsd'ADN par chauffa~e

suivie de l'hybridationavec l'ADN cible

1 1 1 1 1 1

~-T--T

[] []

ADN cible-sondemarquée

-

1 1

Anticorps anti­fluorescéine

1 1 1 1 1

Fixation de l'anticorpsanti·fluorescéine couplé àla péroxydase sur le brind'ADN marqué

T.llminol~

LuminoI2 ~o

< Produit oxydéLumière

Impression du film(signal)

Génération et révélation dusignal

Figure 7. Schéma simplifié du kit de marquage enzymatique

72

Le mélange est incubé.à 37° C pendant 1 h. La réaction est arrêtée enajoutant 2 III d'une solution d'EDTA à 0,5 M. La sonde ainsi préparée peut êtreconservée pendant 2 mois à-20° C.

4.2.3. Hybridation moléculaire

. .

Comme dans le kit .chimique, l'hybridation est. précédée d'unepréhybridation.

Le tampon d'hybridation est compos~ de 0,5% (plv) d'agent bloquant,0,1 % de SDS (plv), 5% de dextran sulfate (plv) et de 5 x SSC.

4.2.3.1. Préhybridation

La membrane est incubée dans le tampon d'hybridation à 60° C pendant45 mn, à raison de 0,25 ml de tampon/cm2 de membrane.

4.2.3.2. Hybridation

Après avoir séparé les deux brins d'ADN de la sonde par chauffage à 95°C pendant 5 mn, l'hybridation est réalisée selon le protocole déjà décrit dans leparagraphe 4.1.3.2. de ce chapitre. La quantité de sonde est 10 ng/ml de tampond'hybridation. .

4.2.5. Lavages des mèmbranes après hybridation

Après un rinçage rapide de la membrane dans du tampon 1 xSSC, 0,1 %SDS préchauffé à 60° C (6 ml/cm2), un p~emier lavage est réalisé avec·le mêmetampon à raison de 3 lnl de tampon/cm2 de membrane pendant 15 mn à 60° Csuivi d'un deuxième lavage en tampon 0,5 x SSC, 0,1 % SDS dans les mêmesconditions.

4.2.6. Détection et révélation du duplex ADN-sonde

La réaction antigène-anticorps est précédée d'une étape de saturat~on dessites non spécifiques avec l'agent bloquant fourni dans le kit. Cinq pour centd'agent bloquant (plv) sont dissous dans un tampon T~s (Tris-Hcl100 mM pH7,5; NaCI 150 mM ) sous agitation. La membrane est incubée dans ce mélange

73

pendant 60 mn à température· ambiante sous faible agitation dans un rapport ~e0,5 ml de tampon/cm2 de membrane.

Après rinçage dans le tampon Tris (6 ml/cm2), la membrane est incubéeen présen.ce d'un conjugué anti-fluorescéine à la dilution de 1/1000 dans letampon Tris contenant· 0,5% (p/v) d'albumine de sérum bovin (USA) àtempérature ambiante pendant 60 mn dans un rapport de 0,25 ml desolution/cm~ de membrane.

La membrane est lavée dans le tampon Tris contenant du Tween 100 à0,1 % (v/v) pendant 15 mn (3 ml de solution/cm2) afin d'éliminer l'excédent deconjugué et les fixations non spécifiques. Cette étape est répétée 3 fois.

Pour la génération du signal et la révélation, les membranes sont traitées·selon les protocoles déjà décrits dans le paragraphe 4.1. de ce chapitre.

74

s. TECHNIQUES DE MIGRATION ELECTROPHORETIQUEET D'ELECTROELUTION

S.l. Electrophorèse sur. gel d'agarose

Les prodùits de la réaction d'amplification génique (PCR) ou lesfragments d'ADN générés après coupure par une enzyme de restriction peuventêtre séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur gel d'agarose. Lechoix de la concentration en agarose est fait en fonction de la taille desfragments à analyser. TI existe en èffet, une relation linéaire entre le logarithmedu poids moléculaire et la distance de migration dans un gel de concentration

. donnée (Maniatis et al., 1992).

La migration électrophorétique est réalisée dans le tampon TAB (Tris­acétate 40 mM pH 8,5; EDTA 2 mM) en présence de bromure d'éthidium à 0,5flglml, sous un voltage constant de 50 Volts pendant 2 h (gel 6 cm x 10 cm) ou16 h (gel de 24 cm x12 cm).

Après électrophorèse, le gel est démoulé et observé sur untransilluminateur U.V. (À.= 354 nm). La taille des fragments est calculée parrappo~ à des standards de poids moléculaires.

5.2. Digesiionenzymatique

Toutes les sondes plasmidiales ont été linéarisées avec l'endonucléase derestriction EcoRI. La sonde plasmidiale DIL-350 (spécifique de T. congolensetype "Galerie forestière") a été excisée du plasmide par une double digestionavec les endonucléases EcoRI et Hindill. Les sites de coupure de ces enzymes derestriction sont :

lEcoRI 5' CC TNAGG 3'

·3' GGANT CC 5'

T

75

HindilIl

s' A AGCTT 3'3' TTCGA A 5'

T

45 - (x+y) III5 IIIx IIIYIII

, ,

li existe pour chaque enzyme de restriction, un tampon spécifique et unetempérature pour laquelle l'activité est maximale. Les tampons utilisés sontindiqués par le fournisseur (Boehringer Mannheim). Nous avons utilisé untampon optimal pour les deux enzymes.

La digestion enzymatique respecte les conditions suivantes :- 1 Ilg de plasmide est digéré par 1 unité d'enzyme;- l'enzyme doit être diluée au moins 10 fois dans le volume

réactionnel. .En effet, toutes les enzymes sont conservées dans un' tamponspécifique contenant 50% de glycérol. Si la concentration finale en glycéroldépasse 5%, l'enzyme peut être inhibée ou peut présenter une activité "étoile"en coupant l'ADN au niveau de sites qui ne lui sont pas spécifiques.

Simple digestion Oinéarisation des plasmides)

La digestion enzymatique est effectuée dans un volume minimun de, 50 IIIde la façon suivante: '

Eau distillée stérileTampon de la réaction (lOx)plasmideEnzyme « 5 Ill)

Les concentrations finales sont: Tris-Hel 50 mM, pH8; MgCh 10 mM;NaCl100 mM. Le milieu réactionnel est incubé à 370 C pendant 1 h 30 Inn.

Double digestion (excision dé la sonde)

Après la première digestion, 50 III de milieu réactionnel contenant ladeuxième enzyme de restriction sont préparés comme indiqué ci-dessus, exceptéque le plasmide (volume de x Ill) est remplacépar de l'eau stérile. Ce mélangeest additionné à la première solution de digestion puis incubé à 370 C pendant 1h 30 Inn.

La linéarisation des plasmides ou l'excision de sondes "inserts" sontcontrôlées par électrophorèse sur gel d'agarose. Les plasmides ainsi linéariséssont prêts à être utilisés pour l'hybridation moléculaire. Cependant, pour DIL­350, après électrophorèse sur gel, la bande d'agarose correspondant à la sondeexciséeest découpée au scalpel et électroéluée.

, .

76

5.3. Technique d'électroélution

L'électroélution est effectu"ée dans un l'appareil Biotrap® (Schel~icher etSchull; Cera-Labo). Cet appareil présente deux parties: une chambre d'élurlonet un piège.

La bande d'agarose est placée dans la chambre d'élution recouverte detampon TAE. L'ADN est élué vers l'anode sous une tension de 60 volts etmigre..Toutes les macromolécules chargées de poids moléculaires supérieurs à5000 daltons (ou ADN de 8 pb) sont retenues dans le piège délimité par deuxmembranes alors que les ions les traversent. A la fin de l'élution, le piège estvidé avec une pipette Pasteur et rincé 2 fois avec du tampon TAE. Le bromured'éthidium est extrait au butanol (cf. paragraphe 3.4.7 de ce chapitre) et l'ADNest purifié après une extraction et une précipitation à l'éthanol (cf. paragraphe 2de ce chapitre).

77

6. REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR)

.. 6.1. Principe de la technique

. La PCR est basée sur la duplication de l'ADN double brin. Cette réactionse fait sur plusieUrs cycles comprenant chacun trois étapes comme le montre la:'Figure 8. .

La réaction commence par une dénaturation de l'ADN double brin à 95°C pendant 3 à 5 Inn. L'enzyme clé de la réaction, la Taq polymérase, une ADNpolymérase thermostable, est alors ajoutée. Puis, débutent les cycles. de la PCR.La première étape consiste en une nouvelle dénaturation de 1 mn à 95° C.

Au cours de la deuxième étape, un couple d'amorces (lesoligonudéotides) vont s'hybrider ·de façon très spécifique aux extrémités de laséquence ADN cible du fragment à amplifier. Cette réaction d'hybridation desamorces ("annealing") dure pendant 30 sec à 1 mn à une température dépendantde la taille et de la nature des bases constituant les amorces. Cette température(Tm) est comprise entre 40 et 70° C.

. La troisième étape fait agir la Taq polymérase entre 70 et 76° C enutilisant les 4 désoxynucléotides triphosphates (dATP, dTTP, dCTP et dGTP).L'ADN polymérase synthétise alors les brins complémentaires à partir desamorces (extension des amorces) pendant 30 sec à 1 ffiD, ce qui permet dedoubler l'ADN cible. Chaque cycle ainsi répété aboutit à la constitution d'unADN cible.multiplié exponentiellement par 2n (n étant le nombre de cycles).Une molécule d'ADN pourra ainsi être amplifiée de 107 à 1011 fois (Erlich,1989; Henry, 1991; Burell, 1993; Clavel et al., 1993)..

Le nombre total de cycles est compris entre 25 et 40. A partir de 35 à 40cycles, un effet plateau est observé. L'enzyme est épuisée, par conséquentl'amplification de l'ADN est peu efficace. A la fin de la PCR, les échantillonssont placés à 4°C avant analyse.

La température d'activité maximale de la Taq'polymérase et la nature dutampon réactionnel sont précisées par le fournisseur de l'enzyme. En fonctiondu tampon, du pH, de la concentration saline et de la nature de l'ADN, la Taqpolymérase progresse de 60 à 120 nucléotides par seconde. Dans la pratique, 30s à 1 mn sont suffisantes pour l'élongation d'un fragment d'ADN de moins de.1000 paires de bases par 1 à 2,5 unités de Taq polyrilérase (Clavel et al., 1993).

78

Cycle d'amplification d'ADN. .. Nouveau cycle d'amplification

• Il ..

-J\0

Amorces

ADN double brin

Séparation des brins 1. d'ADN par chauffage

entre 190et95°c

Hybridation desamorces entre40 et70 ° C

Synthèse des brins 1 Séparation des brinscomplémentaires d'ADN 1 d'ADNpar la Taq polymérase enprésence de dNTP entre

.70 et 76°C(Extension des amorces)

--...... ...

Q.) 90°C

a~

~ 70°COo!

~ 60°C~

30° C

1 min 30 5 à 1 min 30 5 à 2 min

Temps en minutes (min) ou en secondes (s)

Figure 8: Schéma représentant le principe général de l'amplification génique en chaîne (PCR).

Le tampon de l~ réaction est composé de Tris de 10 à 50 mM, pH 8 à ?;KCI 50 mM, et du MgC12. La gélatine ou l'albumine de sérum bovin, parfoisdu Triton X-100 sont ajoutés dans ce tampon. Le MgC12 est indispensable dansla réaction d'amplification. En effet, à faible concentration de MgC12, la Taqpolyménlse est très peu active et à forte concentration,. la réactiond'amplification manque de spécificité (Templeton, 1992). L'activitéenzymatique doit être évaluée à des concentrations comprises entre 1 et 5 mMde MgC12 p()ur chaque type de tampon de réaction et chaque condition de PCR.

Les amorces sont des oligonucléotides de synthèse de taille variable allantde 15 à 30 nucléotides. La composition en bases de chaque oligonucléotidepermet de calculer la température de fusion (Tm) approximative selon lesformules: Tm= 69,3 + 0,41 (G + C)% - 650/L (Maniatis et al., 1992); Tm= 2x (A+T) + 4 x (G+C) (Winnacker, 1987) : L représente le nombre total denucléotides; A, T, G et C sont respectivement le nombre de dATP, dTTP,dGTP et dCTP; TI existe aussi des algorithmes permettant de définir la Tm entenant compte de la séquence primaire et secondaire des amorces, desinteractions qu'elles peuvent présenter entre elles et la nature du. tamponréactionnel (Rychlik & Rhoads, 1989). Classiquement, la températured'hybridation des amorces est choisie de 1 à 10° C en dessous et au dessus de laTm. Cependant, il faut réaliser plusieurs essais pour obtenir une températured'hybridation optimale pour un couple d'amorces données (Clavel et al., 1993).

Les amorces sont utilisées en excès,. de 0,1 à 1 JlM. Les 4désoxyribonucléotides (dNTP) sont à une concentration de 50 à 200 JlM chacundans le milieu réactionnel. Ces quantités sont largement suffisantes pour obtenirdes amplifications des fragments' d'ADN Gusqu'à 2000 paires de bases) sanslimitation d'amorces et de dNTP (Erlich, 1989; Burell, 1993).

Les produits d'amplification sont visualisés dans un gel d'agarose (cf.paragraphe 5.1 de ce chapitre)

6.2. Traitement des échantillons avant la PCR

La réaction de polymérisation a été évaluée dans l'ordre sur le matérielparasitaire de référence : ADN purifiés de trypanosomes, trypanosomes de .culture puis sur différents organes disséqués à partir des glossines d'infectionexpé~enta1e ou naturelles.

80

6.2.1. Matériel génomique purifié

Les échantillons de référence d'ADN purifiés de trypanosomes, aprèsextraction et précipitation à l'éthanol, sont repris dans de l'eau stérile etconservés à-20 ou -80° C(cf. paragraphe 2 "de ce chapitre). Ces échantillonssont directement soumis aux ré~ctions d'amplification après une dilution dans

"de l'eau stérile.

6.2.2. Trypanosomes de culture et organes de glossines

Nous avons utilisé le protocole de conservation du matériel génomique,mis au point par Oury (1989). TI a été inspiré de la communication de Zolg en1987. La méthode consiste en la lyse des parasites ou des tissus dans lesquels setrouvent les parasites par l'action de lauroyl sarcosine 1 % (plv), EDTA 50mM, pH 8. L'ADN est protégé par l'ajout de la solution de trifluoroacétate decé~ium (CsTFA) à une concentration fmale de 0,6 M. Ce composé protège lematériel génomique en dénaturant les protéines cellulaires dont les DNAses(enzymes qui dégradent l'ADN).

Les parasites entiers provenant de culture in vitro sont centrifugés à 3000x g pepdant 10 mn à 4°C. lis sont ensuite resuspendus dans du tampon PBS, pH8. Après comptage sur la cellule de Thomas, des dilutions de trypanosomes sontréalisées dans 100 J11 de ~BS, pH 8."

Après dissection et examen microscopique des organes de glossines(proboscis, glandes salivaires et intestins), ceux-ci ont été mis dans 100 f.ll dePBS, pH 8.

Ces échantillons (parasites de culture et organes de glossines) ont étésoumis au traitement qui suit:

1. à 1 V de suspension parasitaire ou des organes d~ glossine (dansdu PBS) est ajouté 0,33 V de lauroyl sarcosine 1% (Plv); EDTA 50 mM, pH 8.Le mélange est laissé pendant 10 mn à température ambiante.

2. à ce mélange est ajouté 0,25 V de CsTFA 3M.

8 1

· .Les résidus protéidiques et le CsTFA sont éliminés par une extraction au

phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol (cf. paragraphe 2.2 et2.4 de ce chapitre). Le matériel génomique précipité est resuspendu dans 25 ~ou 2 x 25 /lI ou 3 x 25 /lI d'eau stérile selon que l'échantillon sera testé avec 1ou 2 ou les 3 couples d'amorces.

82

CHAPITRE IV : RESULTATS

RESULTATS

1. DETECTION DES TRYPANOSOMES PAR LATECHNIQUE D'HYBRIDATION· MOLECULAIRE

1.1. Introduction

Quelle que soit la méthode envisagée, l'approche qui a présidé à la miseau point des techniques, a été d'évaluer chaque paramètre sur l'ADN purifié àpartir de souches de référence, des parasites de culture, des mouche~ d'infectionexpérimentale et enfin des mouches récoltées lors d'enquêtes épidémiologiquessur le terrain.

Notre étude a été réalisée avec les sondes NRE-372, spécifique de T.congolense type "Savane"; DIL-350, spécifique de T. congolense type "Galerieforestière"; NIK-450 spécifique de T. congolense type "Kilifi"; DR1,spécifique de T. brucei s.l. et NS-600, spécifique de T. simiae..

Les ADN purifiés utilisés proviennent de souches de référence suivantes:1/148 (T. con·golense type "Savane"), ANR3 (T. congolense type "Galerieforestière"), WG 5 (T. congolense type "Kilifi"), Eatro 1125 (T. b. brucei ),Biyamina (T. b. gambiense ), BAN 7 (T. simiae ) et Y-486 (T. vivax). L'étuderéalisée sur .les parasites de culture a porté sur 1/148, Eatro 1125 et Biyamina.Enfin, les souches Eatro 325 (T. congolense type "Savane") et Eatro 1125 ontservi à l'infestation des glossines.

L'intérêt majeur d'utiliser une méthodologie reposant sur l'hybridationmoléculaire à l'aide de sonde génomique réside dans sa facilité de mise enoeuvre et son efficacité à détecter· des parasitémies inframicroscopiques.Rappelons que les quantités de parasites de l'ordre de 103 à 104 trypanosomesconstituent, de façon générale, la limite du pouvoir de détection de lamicroscopie photonique dans les organes des glossines : proboscis, glandessalivaires et intestin (Lloyd & Johnson, 1924).

Des quantités décroissantes d'ADN de 1000, 500, 100, 50, 10 et 1 pg ontété analysées dans cette étude; 1 picogramme d'ADN correspondant, en .

83

équivalent parasite, à la trypanosomes. La gamme utilisée s'échelonne donc de1()4 à la trypanosomes.

De la mêine façon, des quantités décroissantes de 1000, 500, 100, 50, laet 1 trypanosomes ont été déposées s'ur les membranes pour réaliser l'étude surles parasites de culture._

Une gamme d'ADN allant de 100 à 0,1 pg de la sonde qui sert àl'hybridation est déposée sur la même. membrane que celle contenant l~s

échantill~ns à détecter et,- sert donc de témoin positif dans la réactiond'hybridation moléculaire.

Les membranes ont été hybridées une seule fois, donc avec une seulesonde génomique.

1.2.. Optimisation des techniques de marquage froid

L'optimisation nécessaire à l'obtention à la fois d'une bonne spécificité etd'une grande sensibilité de détection a consisté d'une part à comparerdifférentes méthodes de marquage et de traitement d'échantillon, et d'autrepart, à optimiser et standardiser les conditions d'hybridation moléculaire.

Deux types de marquage froid par chimioluminescence ont étésélectionnés (cf. paragraphe 4 du chapitre Méthodes) : le marquage direct et lemarquage indirect. Le marquage direct est un procédé chimique très simple quiconsiste à coupler directement la peroxydase sur l'ADN; le marquage indirectrepose sur une méthode immunoenzyma~ique visant à détecter les duplex ADN­sonde marquée à la fluorescéine par l'intermédiaire' d'un conjugué anti­fluorescéine couplé à la peroxydase. Dans les deux cas, la révélation se fait parune réaction enzymatique en présence d'un composé, le °luminol, dontl'oxydation induit l'émission. de lumière v.isible détectée en autoradiographie decourte durée.

L'optimisation des conditions d'hybridation, par les deux types demarquage, a été réalisée avec Iii sonde NRE-372, spécifique de T. congolensetype "Savane" sur du matériel génomique purifié. Puis, ces conditionsd'hybridation ont été appliquées aux autres sondes génomiques.

L'amélioration de la sensibilité et de la spécificité de détection des deuxtechniques de marquage a été effectuée selon les suggestions énoncées par le~oumisseur des kits (Amersham). En effet, en fonction des résultats obtenus,

84

différents paramètre.s au cours de l'hyhridation moléculaire peuvent êt~e

modifiés. Nous présentons dans les Figures 9 et 10 les différentesméthodologies utilisées ainsi que l'ensemble des résultats obtenus.

1.2.1. Optimisation du kit de marquage chimique

Pour chaque hybridation moléculaire, 4 films d'autoradiographie mit étéexposés à différents temps : 10,· 30, 60 et 120 Inn. Le Tableau V résume lesrésultats obtenus en fonction des temps d'exposition des films. Un tempsd'exposition de 60 mn est celui qui concilie les meilleures sensibilités etspécificités de détection avec la présence de faibles bruits de fond. Ainsi, lesrésultats d'hybridation moléculaire que nous présentons dans ce travail portentsur un temps d'exposition des films de 60 mn.

Les hybridations et les lavages des·membranes ont été effectriés selon leprotocole décrit par le fournisseur, dans des tubes en verre en rotation dans un

four. Les conditions d'hybridation sont:

- préhybridation de 45 Inn à 42 oC à raison de 0,25 mlde tampon/cm2 de merrtbrane;

- hybridation avec la sonde à lOng/ml de tampond'hybridation à 42 oC pendant 16 h;

- deux lavages dans le t~pon : Urée 6 M; 0,4% SOS;0,5 x SSC pendant 20 Inn à 42 oC;

- enfin, Une incubation de la membrane dans le tampon2 x SSC pendant 5 mn à température ambiante.

L'utilisation de la sonde NRE-372 permet la détection de 100 pg d'ADNhomologue, l'équivalent de 1000 trypanosomes· (Figure Il A).

Ce très faible seuil de détection de l'ADN nous a amené à faire varier laconcentration de la sonde, la stringence du tampon de lavage en vued'augmenter la sensibilité du test. La Figure 9 donne les résultats comparatifsde l'hybridation de la sonde NRE-372 à 10,.20 et 40 ng/ml de tampond'hybridation avec une stringence de lavage de 0,5 SSC ou de 1 x SSC..

85

00

0\

Tableau V. Résultats d'hybridation moléculaire obtenus en fonction de différents temps d'exposition desfilms d'autoradiographie en marquage chimique et enzymatique.

Tempsd '·exposition Résultats

Sensibilité de Spécificité de Bruit de fonddétection détection des films

1er film 10mn . Très faible Bonne Inexistant

..30mn Faible Bonne Très faible2eme film

3ème film 60mn Bonne Bonne Faible

..120mn Bonne Mauvaise· Très élevé4eme film

Stringence du tamponde lavage

. Concentration dela sonde en ng/mlde tampon

10

0,5 x SSC<~(standard)

~ 1 xSSC

IRésultats obtenus

Sensibilité de 100pg------~ d'ADN homologue

------~ Manque de spécificité

~-40 -------1~ 0,5xSSC

(standard)-----~ Manque de spécificité

Figure 9. Résumé des différents essais d'optimisation des kits de marquage chimique. Les rectangles en fond grisreprésentent les conditions d'hybndation retenues pour l'étude des sondes génomiques.

Les conditions d'hybridation conciliant à la fois une bonne sensibilité etune excellente spécificité de détection sont celles où la concentration de la sondee.st de 20 ng/ml de tampon ~'hybridation, les autres paramètres. restantinchangés (protocole standard). Dans ces conditions, la sonde NRE-372 détecte,de façon reproductible, 100 pg d'ADN homologue avec une bonne spécificité(Figure Il A). . .

1.2.2. Optimisation du kit de marquage enzymatique

Les premiers essais d'hybridation ont été réalisés dans les conditionsstandard énoncées dans le protocole.

En résumé, ces conditions sont les suivantes :- préhybridation de 45 mn à 60 oC à raison de 0,25 ml de

tampon/cm2 de membrane;- hybridation avec la sonde à 10 ng/ml de tampon

d'hybridation à 60 oC pendant 16 h dans des tubes en v"erre;- un lavage dans le tampon 1 x SSC, 0,1 % SDS pendant 15

mn à 60 oC suivi d'un deuxième dans le tampon 0,5 x SSC, 0,1 % SDS dans lesmêmes conditions;

- incubation de la membrane pour la saturation des sites nonspécifiques dans du tampon Tris, NaCI (Tris-Hel 100 mM pH 7,5; NaCI 150mM ) + 5% d'agent bloquant pendant 60 mn à température ambiante;

- incubation de la membrane en présence du conjugué anti­fluorescéine à 1/1000 dans le tampon Tris, NaCI + 5% d'albumine de sérumbovin;

- 3 lavages dans le tampon Tris, NaCI contenant du Tween0,1% (p/v) pendant 15 mn.

Les résultats obtenus (avec la sonde NRE-372), dans ces conditionsd'hybridation, ont mis en évidence l'existence d'un important bruit de fond surles films d'autoradiographie. La lecture des signaux d'hybridation, dans laplupart de cas, était rendu impossible. Dans le but d'éliminer ces bruits de fond,nous avons fait varier certains paramètres au cours de l'hybridation : lastringence et le temps de lavage, la concentration de l'agent bloquant, la dilutiondu conjugué, et les conditions d'hybridation. Les résultats obtenus (persistancede bruit de fond) sont résumés dans la Figure .10.

La persistance du bruit de fond, quelques soient les conditionsexpérimentales utilisées nous ont conduit à abandonner l'hybridation dans des

88

Concentration de la sondeen ng/ml de tampond'hybridation

Paramètres d.'hybridation 1 Résulta~ obtenus

BruitS de fond très élevés

----4~. Bruits de fond 'très élevés

---I~~ Bruits de fond très élevés

-----l~. Bruits de fond très élevés .1/1000 (standard) à 1/2000

Utilisation de l'ADN du spenn~

,----t~. de saumon à 100, 250 et 500

ug/ml de tampon d'hybridation

,------l~. Paramètres standards

~-~.I de la stringence du 1 er tampon delavage et de la durée du lavage. De0,5 x SSC (standard) à 0,2 x SSC.~De 15 mu (standard) à 30 mn

// ~I du % d'agent bloquant. De 0,5%V-- (standard) à 0,6 et 0,75% dans le ~ Bruits de fond très élevés~ tamnnn CIe AAt.llrat.inn CIe ~ite~ ----1..

-----.~ de la dilution du conjugué. De

--~.1OHybridation dansdes tubes en verre'

00\0

--------l~. Paramètres standards_~~~~~~~~: ~ 10

FI::.s:::::::::.:~:::::·:.·:Y:::.::.'~:'.:::"·";:~'·'.b:~:::·::•..:..rt.:.. :.:.::.:.:o:.::::::.:::.. :.:.dn:::::.:.:..::::::a:.:••.·.:..:::.:..n.::.::.·~::••·:::•.·:l.::;::;:O".:>i.::.:•.:.::~.::n.·s:.:.:.::·~:;::.:~::.:.:::.:::~~.::::.'..::.h:·.::::·.fUl.::.•n:;:::.,:::::.·:::.o.:::·::.:S::.·::.••:.•:.:.•:.:.•.:.:.•:.l:.:.~.:tl:.:..:":.~..:.::.:..:.::r..:.:.:::::.::::.::.:..:..:$.::::..: ::.~: :.:..:.. :..:.:..:..:..:.:..:..:..:.!..:..:..:.•.:·.V ~ [~.m.·.l.~I---."~~ ~u :~t<" :u~~v. . ~v. ~ It&$tlig,s~:~_H&9~!:~::::::::::::::!::1

Sensibilité de 1 pg d'ADNhomologue

40 ------1~. Paramètres standards -----1~.. .Manque de spécificité

Figure 10. Résumé des différents protocoles en vue d'optimiser la réaction d'hybridation moléculaire en utilisant. le kit de marquage enzymatique. Les rectangles en fond gris représentent les conditions d'hybridation retenuespour l'étude des sondes génomiques.

Biayamina

BAN 7

11148ANR3WG5

Eatro 1125

10 ng/ml

~123456

Sonde NRE-372

20 ng/ml

~123456

40 ng/ml

~123456

Figure Il. Sensibilité de détection et spécificité obtenues en réactiond'hybridation moléculaire en fonction de la concentration de la sondeNRE-372, spécifique de T. congolense type "Savane" (10, 20 et 40 ng!ml de tampon d'hybridation) en marquage chimique (A) et enzymatique(B). 1/148 =T. congolense "Savane"; ANR3= Trypanosomacongolense "Galerie forestière"; WG5= T. congolense "Kilifi"; Eatro1125-T. b. brucei; Biyamina = T. b. gambiense. BAN 7 = T. simiae.Les témoins positifs correspondent à l'hybridation de la sonde sur elle­même. Les chiffres 1, 2, 3, 4, 5, 6 représentent respectivement lesquantités d'ADN de 1000, 500, 100, 50, 10 et 1 pg pour les ADN detrypanosomes et 100,50, 10, 1 et 0,1 pg pour les sondes génomiques.

90

tubes en verre, malgré de nombreux essais d'optimisation des paramètresd'hybridation. Des hybridations moléculaires à 10, 20 et 40 ng de sonde/ml detampon ont aussi été effectuées (Figure Il B). A 10 ng/ml de tampon, la sondedétecte très faiblement 10 pg d'ADN; à 40 ng de sonde/ml, NRE-372 s'hybridede façonhon spécifique avec l'ensemble des ADN hétérologues (ANR3, WG S,Eatro 112S, Biyamina, BAN 7 et .Y-486). Les meilleurs résultats ont étéobtenus avec 20 ng/ml de sonde, hybridés selon le protocole standard (Voir ci­dessus). Dans ces conditions, la sonde NRE-372 détecte 1 pg d'ADN homologue(correspond à 10 parasites) avec une bonne spécificité.

En résumé, les kits chimique et enzymatique ont été testés selon lesprotocoles standard, en utilisant des concentrations de sondes correspondantes à20 ng/ml de tampon d'hybridation.

. .

1.3. Etude de la sensibilité et de la spécificité sur lematériel génomique purifié

Le Tableau VI et les Figures 12 et 13 résument les résultats concernant lacomparaison des seuils de détection des ADN de trypanosomes de référence enmarquage chimique et en marquage enzymatique.

.. Marquage chimique

. Les sondes NRE-372 et NIK-4Sü présentent des réactions d'hybridationjusqu'à 100 pg d'ADN homologue; SOO pg d'ADN homologue ont été détectéspar les sondes DIL-350, DR1 et NS-600.

Marquage enzymatique

Une étude comparative de sensibilité et de spécificité de chaque 'sondesous la forme circulaire par rapport à la forme linéarisée avec l'enzyme derestriction EcoRI (cf. paragraphe 6.2. du chapitre Méthode) a été réalisée.Aucune différence n' a été observée entre les deux formes de sonde (circulaireou linéarisée). Nous avons préféré utiliser les formes linéarisées des sondescomme cela a été suggéré par le. fournisseur (Amersham). Ainsi, toutes les .sondes ont été digérées par l'enzyme EcoRI avant d'être utilisées en hybridationmoléculaire utilisant le marquage enzymatique.

91

La sonde DIL-350 a aussi été excisée du plasmide et, sa sensibilité a étécomparée à celle de la sonde dans le plasmide. Les seuils de détection de lasonde excisée et de la sonde sous forme plasmidiale ont été trouvés identiquesaussi bien dans le marquage chimique que dans le marquage enzymatique. Cette.étude de double digestion n'a été réalisée que sur la sonde DIL-350 car, nousne disposions pas des sites d'i~sertion dans les plasmides des autres sondes.génomiques...

Comme le montrent le Tableau VI et la Figure 12, le kit de marquageenzymatique présente des seuils de détection plus élevés que ceux obtenus avecle marquage chimique. En effet, "1 pg d'ADN (équivalent à 10 parasites) estdétecté par la sonde NRE-372. Dix picogrammes d'ADN homologue sont lalimite de détection observée avec les sondes NIK-450, DIL-350 et PgDRl. Lasonde NS-600 est capable de révéler 50 pg d'ADN homologue.

L'étude de la spécificité, dans les deux types de marquage (Figure 13), amontré que les sondes NRE-372, DIL-350, NIK-450, PgDR1, NS-600 neprésentent pas de réactions croisées avec les ADN hétérologues étudiés (1/148,ANR3~ WG 5, Eatro 1125 , Biyamina , BAN 7 et Y-486). Toutefois, à partir de1 ng d'ADN cible, les sondes NRE-372 et DIL-350 s'hybrident respectivementavec les ADN hétérologues de ANR3 (T. congolense "Galerie forestière") et de1/148 (T. congolense "Savane").

Les témoins positifs de manipulation correspondent à l'hybridation dechaque soride sur elle-même. En marquage enzymatique, 0,1 pg de sondereprésente le seuil de détection des sondes DIL-350, NIK-450, PgDR1, NRE­372. NS~600 permet la détection de 1 pg de sonde. Ces seuils de détection sont,d'une façon générale, 10 fois plus faibles en marquage chimique.

Ces deux sondes, NRE-372 et DIL-350 présentent des réaction croiséesrespectivement avec les ADN hétérologues de ANR3 (T. congolense "Galerieforestière") et de 1/148 (T. congolense "Savane"). Ces réactions croisées ne sontobservées qu'à partir de quantités d'ADN supérieures ou égales à 1000 pg(équivalent à 1()4), dans les conditions standard des protocoles d'hybridation. Lagrande homologie de séquence (prèsde 71 %) qui existe entre les sondes NRE­372 et DIL-350 (Masiga et al., 1992) permet d'expliquer ces réactions croisées.C'est pourquoi, nous parlerons, tout au long de ce rapport, de bonne spécificité

92

Tableau VI. Résultats·des études de sensibilité des sondes génomiques en hybridationmoléculaire en utilisant le marquage chimique et enzymatique. sur de l'ADN purifiéhomologue. Ces résultats sont exprimés en picogramme (pg) et en équivalent parasite.

Sondes génomiques utilisées

NRE·372 NIK-450 DIL·350 PgDRl NS-600·(T. congolense

(T. congolense .(T. congolense "Galerie (T. brucei s.1 ) (T. simîae)"Savane") "Kilifi") forestière")

Marquage lOOpg SOOpg SOOpg SOOpg SOOpg= = = = =chimique 103 parasites 5x103 parasites 5x103 parasites 5xl03 parasites 5x103 parasites

Marquage 1 pg lOpg lOpg lOpg SOpg= = = = =enzymatique 10 parasites. 102 parasites 102 parasites 102 parasites 5x102 parasites

Marquage Chimique

+Marquage enzymatique

~2 3 4 5 6 2 3 4 5 6

_ : ::.'.'~"J

NRE·372

DIL-350

NIK-450

-- -

1/148 (f. c. "Sav")

NRE-372

ANR3 (f. c. "Gf')

---. DIL-350

BAN 7 (T.s.)

DR1

NS-600

---. Eatro 1125 (r.b.b.)

~ Biyamina (r.b.g.)

-NS-600

DRl

Figure 12. Sensibilité de détection de l'ADN purifié de trypanosomes deréférence en hybridation moléculaire avec les sondes génomiqueshomologues en utilisant le marquage chimique et enzymatique. Lesabbréviations et les quantités d'ADN déposées (chiffres) correspondent àcelles décrites dans la Figure Il.

94

Sondes: NRE-372

~1 2 3 4 5 6

DIL-350

~1 2 3 4 5 6

NIK-450

~123456 1 2

DRl

~345 6

NS·600

~1 2 3 4 5 6

~~ WGS

t?lac=...~~)1u

Soodc

\0Ut

1/148

ANR3

Figure 13. Spécificité et sensibilité obtenues en réaction d'hybridation moléculaire avec les sondesgénomiques sur les ADN purifiés de trypanosomes de référence en marquage chimique et enmarquage enzymatique. Les quantités d'ADN et les abbréviations correspondent à celles décrites dansla figure 11. Sur chaque membrane, une hybridation de la sonde sur elle-même représente le témoinpositif.

de détection des sondes NRE-372 et de DIL-350 sur l'ensemble des ADN·hétérologues utilisés, bien qu'elles s'hybrident respectivement avec l'ADNhétérologue de ANR3 et 1/148 à des quantités d'ADN cible très élevées (1000pg).

Etant donné les faibles seuils de détection des ADN purifiés obtenus enmarquage chimique, l'étude .sur les parasites de culture et sur les différentsorganes ·de glossines saines ou infestées expérimentalement n'a été évaluée qu'enmarquage enzymatique.

1.4. Evaluation du test d'hybridation sur des trypano­somes de culture et sur des organes de glossines

Après avoir établi la sensibilité et la spécificité de détection des sondessur du matériel génomique purifié, nous nous sommes attaché à· évaluer latechnique d'hybridation moléculaire sur les parasites de culture avant depoursuivre l'étude sur les différents organes de glossines saines ou infestéesexpérimentalement. Pour ce faire, différents protocoles de traitementd'échantillons ont été mis en oeuvre. Le traitement des échantillons devant êtresimple et rapide pour permettre une utilisation rationnelle de la technique dedétection.

Une première approche a consisté à utiliser la technique d'hybridationmoléculaire ADN parasitaire/sonde ADN directement sur les échantillons nontraités. Nous avons donc exclu, de prime à bord, une extraction génomique àpartir de chaque échantillon selon les modalités classiques (extraction au phénolchloroforme) de façon à limiter au maximum les étapes de préparation et. àéviter les pertes possibles. d'ADN au .cours des extractions donc de rendreapplicable la technique à grande échelle.

Le dépôt d'un échantillon sur un appareil de filtration sous vide est limitépar la présence des débris cellulaires et de forte concentration en protéines quisont à l'origine du colmatage des membranes. Par conséquent, le traitement des.échantillons (organes de glossines) devrait éliminer les débris cellulaires et lesprotéines contaminantes. Et, cela devrait se faire de la façon la plus simple, laplus rapide et la moins fastidieuse possible. C'est de cette étape que dépendraitla fiabilité et les applications de la technique d'hybridation moléculaire enroutine.

96

A cet effet, nous nous sommes inspirés des protocoles portant sur' ladétection des parasites décrits par Zolg et al. (1988) et Oury (1989) sur lesplasmodiums et ceux, de Olé-MoyYoi (1987), de Gibson et al. (1988) et Kuklaet al. (1987) sur les trypanosomes.

Les différents protocoles utilisés sont résumés dans le Tableau VII.

1.4.1. Etude de la sensibilité sur des parasites de culture

Deux souches parasitaires de référence ont été testées : 1/148 (T.congolense type "Savane") et Eatro 1125 (T. b. brucei). Par conséquent, leshybridations moléculaires ont été réalisées avec les sondes NRE-372 et PgDR1.. Les échantillons ont été traités selon les protocoles (A), (B) et (C) décrits'dans le Tableau VII .

1.4.1.1. Préparation des échantillons'

- Méthode de type "Touch-blot" (Protocole A)

Elle a été décrite par Kukla et al. (1987) et Olé-Moy Yoi (1987). Elleconsiste à effectuer un dépôt direct des échantillons parasitaires sur membrane.

1. Les suspensions parasitaires (dans du PBS) sont directement déposéessur membrane. Puis, celle-ci est incubée sur du papier 3MM imbibé de 0,5 %SDS pendant 5 mn. .

2. La dénaturation est effectuée par une incubation de la membrane,pendant 15 mn à température ambiante, sur du papier 3 MM imbibé de lasolution NaOH 0,5 M; NaCl1,5 M.

3. La neutralisation est réalisée en incubant la membrane pendant 10 mnsur du papier 3 MM imbibé de Tris-Hcl1M pH 7,8; NaCI 3 M, à températureambiante. Cette opération est renouvellée une fois.

4. Enfin, la membrane est lavée avec la solution 4 x SSC pendant 5 Inn.

97

· Tableau VII. Résumé des différents protocoles de traitement deséchantillons (parasites de culture et organes de glossines) utilisés pourl'hybridation moléculaire en marquage enzymatique avec les sondesgénomiques de NRE-372 et DRl.

Protocoles Description des protocoles.Référencesbiblographi­

ques

Traite­ment

Méthode de type"Touch-blot"(Protocole A)

- Dépot direct de parasites sur membrane- Dénaturation de l'ADN sur membraneavec la solution NaOH 0,5 M; NaCl1,5 M- Neutralisation par du Tris-Hel lM pH7,8; NaC13 M.

Kukla el ai. (1987)Gibson el al. (1988)

des

trypano­somes

Méthode de lysedans du tampon

TEN(Protocole B)

Lyse des parasites dans du tampon TEN Kukla el ai. (1987)(Tris 50 mM pH 8,5; EDTA 0,25 mM; Gibsonelal. (1988)NaCl 0,75 M; SDS 0,5%).

de

cultureMéthode de lyse

par le lauroylsarcosine

(Protocole C)

- Lyse des parasites par du lauroyl Zolg el al. (1988)sarcosine 1%; EDTA 50 mM pH 8. Oury (1989)- Protection de l'ADN par du CsTFA 3M.

Kukla el ai. (1987)Gibson el al. (1988)

KuklaelaI. (1987)Gibson el al. (1988)

- Ecrasement du contenu de l'intestin surmembrane.- L~vage de la membrane avec 0,5 % SDS- Traitement comme le protocole (A)

- Protocole B + 3 séries de congélationdans l'azote liquide/décongélation à 37°C.- Centrifugation 15000 x g.- Prélèvement du surnageant

Méthode de"Touch blot"

(Protocole D)

Méthode de lysedans du tampon

TEN·(Protocole El

de

des

Traite­ment

organesPremière méthode - Protocole C + Centrifugation

de lyse par le 15000 x g. Zolg el al. (1988)lauroyl sarcosine - Prélèvement du surnageant. Oury (1989)

glossines ~(.:::..P..:..r..:..o=-=to:....:;c;.;:,o=-=le;."",,;;F~I)--+ -I- --1

Deuxièmeméthode de lysepar le lauroy1

sarcosine(Protocole G)

Protocole C + extraction au mélangesolvant (2,5V d'éthanol, 1V dechloroforme et 0,04 V d'alcoolisoamylique) : 1 V d'échantillon pour0,33 V de mélange solvant; centrifugation15000 x g. Prélèvement du surnageant.

Zolg el al. (1988)Oury (1989)

Troisièmeméthode de lysepar le lauroy1

sarcosine(Protocole H)

Protocole C + extraction classique:phénoVchloroforme puis chloroforme.Prélèvement du surnageant. .

Zolg el al. (1988)Oury (1989)

98

- Méthode de lyse dans du tampon TEN (protocole B)

C'est une méthode procédant par lyse cellulaire dans un tampon Tris-Hel. en présence de SDS dérivant de celle décrite par Kukla et al. (1987) et Gibsonet al. (1988).

1. Après lavage dans du PBS, les parasites sont lysés dans du tamponTEN. (Tris 50 mM pH 8,5; EDTA 0,25 mM; NaCI 0,75 M; SDS 0,5%) pendant10mn.

2. L'ADN parasitaire est dénaturé par chauffage à 95°C pendant 5 mnpuis stabiliséà 4°C dans la glace.

'3. Les échantillons sont déposés sur une melnbrane de nitrocellulose dans. .

un appareil de "dot-blbt" sous aspiration.

- Méthode de lyse par le lauroyl sarcosine (Protocole C)

C'est la méthode déjà décrite dans le paragraphe 6.2. du. chapitreMéthode. Elle procède par une lyse des trypanosomes dans la solution lauroylsarcosine et l'ADN est protégé par l'ajout d'une solution de trifluoroacétate decésium: CsTFA (Zolg et al., 1988; Oury, 1989).

1. A 1 V de suspension parasitaire (dans du PBS) est ajouté 0,33 V delauroyl sarcosine 1%; EDTA 50 mM, pH 8. Le mélange est laissé 10 mn àtempérature ambiante.

2. A ce mélange est ajouté 0,25 V de CsTFA 3M. La solution ainsiobtenue peut être gardée pendant plusieurs mois à température ambiante.

Les solutions parasitaires sont ensuite traitées comme dans le protocole(B) à partir de l'étape 2.

1.4.1.2. Résultats

. Comme le montrent le Tableau VITI (A) et la Figure 14, de bons résultatsont été obtenus avec les Protocoles (B) et (C). En effet, NRE-372 et PgDRldétectent respectivement 10 et 100 ·parasites homologues av~c une très bonne

99

reproductibilité. Aucune" réact~on croisée n'est constatée en présence de 103

trypanosom~s hétérologues.En revanche, l'application du Protocole (A) s'accompagne d'une nette

diminution de la sensibilité. En effet, en réaction homologue, NRE-372 nedétecte pas moins de 100 parasites etOR1 présente un seuil de détection de 500

" "

parasites. "

1.4.2. Test sur les organes de" glossine d'infectionexpérimentale

Nous avons effectué les hybridations moléculaires à partir des organes(proboscis, glandes salivaires et intestin) de mouches saines et infestéesexpérimentalement par les souches parasitaires Eatro 325 (T. congolense"Savane") ou Eatro 1125 (T. b. brucei).

1.4.2.1. Préparation des échantillons

Les protocoles de préparation des échantillons s'inspirent de ceux desparasites de culture. Nous avons introduit des étapes supplémentaires de lyseet/ou d'extraction au solvant des échantillons (Tableau VII).

- Méthode de "Touch blot" (Protocole 0)

1. Les contenus de l'intestin ou des glandes salivaires sont déposés surmembrane par écrasement (toucher ou imprégnation). Cette dernière estconservée à température ambiante jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.

2. Après une incubation sur du papier 3MM imbibé de 0,5 % SOSpendant 2 fois 5 mn, la membrane est traitée selon le Protocole (A), à partir del'étape 2. "

- Méthode de lyse dans du tampon TEN (protocole E)

Ce protocole est identique au protocole (B) à l'exception d'étapessupplémentaires consistant à faire une succession de congélations-décongélations"(3 séries de 5 mn) et une centrifugation à "15000 x g pendant 5 mn (pourconcentrer les débris cellulaire~), avant de séparer les brins d'ADN parchauffage à 95°C.

100

NRE-372

1 2 3 4 5 6

DRI

1 2 3 4 5 6

.... - --------.,11148 ~

NRE-372 ~

·'*1······:·..\•..... 1.:.

""

'1' .....-.-.-..' .' ..... . ..:~t- :,::::::::.. .:" .. ":,,: :~~i:: :t@::

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-. Eatrol125

-. DRI

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Al

11148 ~ ••• @ n

NRE-372 ~ '" .' ...

A2

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-. Eatrol125

-. DRI

BI B2

1/148 +-.-_NRE-372 ~ :'1::1:11111':1:1111111:1::1111111111'1:1111111:1111.11

Cl

•• $

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C2

~ Eatrol125

~ DRI

Figure 14. Seuil de détection des parasites de culture obtenu en hybridationmoléculaire avec les sondes génomiques NRE-372 et DR1 en marquageenzymatique. Les trypanosomes ont été traités par dépot direct ou "Touch­blot" (Al et A2), en utilisant du TEN (BI et B2) et du lauroyl sarcosine(Cl et C2). Les chiffres 1, 2,3,4,5 et 6 représentent respectivement 1000,500, 100, 50, 10 et 1 parasites. La gamme correspondant au témoin positif(sonde sur sonde) étant la même que celle décrite dans les figuresprécédentes.

101

­oN

Tableau VIII. Résultats de l'hybridation moléculaire des sondes génomiques NRE-372 et DR! sur lestrypanosomes de culture (A) et sur les organes de glossines saines ou d'infection expérimentale (B). Les résultatsdonnés dans (A) sont exprimés en nombre de trypanosomes détectés. .

A

Méthode de typeMéthode de lyse

Méthode de lyse par le lauroyl"Touch-blot" dans du tampon TEN sarcosine

(Protocole A) (Protocole B) (Protocole C)

NRE·372(T. congo/ense .

100 10 10"Savane")

DR! 500 100 100(T.bruceJ)

B

Méthode de "Touch Méthode de lyse1er méthode de lyse 2 émeméthode de lyse

3 ème méthode de lyse parpar le lauroyl par le lauroylblot" dans du tampon TEN sarcosine sarcosine lela~ylsarcosine

(Protocole D) .(Protocole E) (Protocole F) (Protocole G) (Protocole H)

NRE·372 Manque de Manque de Manque de Manque de Excellente spécificité(T. congo/ense"Savane") spécificité . spécifiCité spécificité spécificité Sensibilité très faible

DR! Manque de Manque de Manque de Manque de Excellente spécificité(T. brucel)spécificité spécificité spécificité spécificité Sensibilité très faible

- Première méthode de lyse pat le lauroyl sarcosine (Protocole F).

Il est similaire au protocole (C), avec une étape supplémentaire decentrifugation à 15000 x g pendant 5 mn pour éliminer les débris cellulairesavant dépôt des échantillons sur les filtres .

.~ Deuxième méthode de lyse par le lauroyl sarcosine (Protocole G)

C'est l'application in extenso du protocole décrit par Oury (1989). Pouréliminer les éléments contaminants (protéines, débris cellulaires), uneextraction dans un mélange solvant est effectuée.

1. Après avoir additionné le lauroyl sarcosine et le CsTFA, comme décrit'dans le Protocole C,à 1 V de solution contenant les parasites ou l'organe de lamouche, est ajouté 0,33. V de mélange solvant (2,5 V d'éthanol, 1 V dechloroforme et 0,04. V d'alcool isoamylique). Le tout est mélangé parretournement du tube plusieurs fois.

2. Le mélange est centrifugé à 15000 x g à température ambiantependant 5 fill.

3. Le surnageant est prélevé puis, déposé sur membrane dans l'appareil. de "dot-blot".

- Troisième méthode de lyse par le lauroyl sarcosine (Protocole ID.

Elle correspond à une modification du protocole (G). En effet, lemélange (parasites ou organe de mouche, lauroyl sarcosine et CsTFA) estsoumis à' deux extractions : une au phénol-chloroforme puis une auchloroforme (cf. paragraphe 2.2. du chapitre Méthode). Le traitementultérieur, après les extractions, est identique au protocole (0).

1.4.2.2. Résultats

Le Tableau VITI (B) résume l'ensemble des résultats obtenus. La mise enoeuvre des protocoles (D), (E), (F) et (G) a donné des résultats non concluants..En effet, les sondes NRE-372 et DRI se sont hybridées non spécifiquement avec

. les organes de glossines saines, notamment' l'intestin. L'é~de a été réalisée sur

103

les organes de 6 glossines (G. f fusdpes et G. m. morsitans) pour chaquesonde. Dans ces conditions, les réactions spécifiques d'hybridation moléculairedes organes. des glossines infestées expérimentalement ne pouvaient êtreréalisées.

En revanche, l'application du protocole·(H), dans lequel une extraction auphénol/chloroforme est réalisée, a· permis d'éliminer ces réactions non.spécifiques avec les organes des· glossines saines;· Ainsi,· l'évaluation du test demarquage enzymatique sur les glossines d'infection expérimentale a été réaliséeselon ce protocole.

. AU total, les différents organes de 10 glossines infestéesexpérimentalement par Eatro 325 et ceux de 10 autres glossines infestées par lasouche Eatro 1125 ont été analysés. Les résultats des analyses parasitologiquesétaient les suivantes : 1 mouche était fortement parasitée dans l'intestin parEatro 325 et 3 étaient porteuses de trypanosomes Eatro 1125, toujours dansl'intestin.

Les 3 organes de chaque mouche (proboscis, glandes salivaires et intestin)ont été hybridés avec la sonde NRE-372 pour les glossines· infestéesexpérimentalement avec Eatro 325 et, avec la sonde DR1 pour celles infestéesavec Eatro 1125.

." Comme le montre la Figure 15, seul l'intestin de la mouche dont l'analyse

parasitologique s'était révélée f~rtement positive a présenté un signald'hybridation avec la sonde NRE-372. Toutefois, l'intensité de ce signal a ététrès faible comparativement à la forte parasitémie révélée par l'examenmicroscopique. Aueu"n organe de mouche négatif selon l'examenpara~itologiquen' a présenté de réaction d'hybridation moléculaire.

Les organes des 10 glossines infestées expérimentalement avec Eatro1125 n'ont présenté aucun signal d'hybridation moléculaire avec la sonde DR1,y compris les 3 intestins porteurs de parasites selon l'analyse parasitologique(résultats non montrés).

L'ensemble de ces résultats montrent la limite de la techniqued'hybridation moléculaire en marquage non radioactif. Cette technique nedétecte les parasites que dans les organes de mouches très infestées. Lesparasitémies inframicroscopiques ne pouvaient donc être mises en évidence. La

104

Il ••

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Mouches néga­tives en micros­copie

Mouches forte­ment positivesen microscopie

---. NRE·372

~~. M?uchessames

~ .

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GI

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.......

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GIp

Figure 15. Résultats d'hybridation moléculaire en marquageenzymatique de proboscis (P), d'intestin (1) et de glandes salivaires (Gl)de glossines saines, de glossines d'infection expérimentale, négatives oupositives en analyse parasitologique. Tous ces organes ont été traitésselon le protocole (H). L'hybridation de NRE-372 sur elle- mêmereprésente la gamme du témoin positif et les quantités d'ADN déposéescorrespondent à celles précisées dans les figures précédentes.

lOS

sensibilité de cette technique n'était donc pas suffisamment élevée pourenvisager son applicàtion en épidémiologie. Cette situation nous a donc orientésvers la technique d'amplification d'ADN pour chercher à atteindre lessensibilités requises.

106

2. DETECTION ET IDENTIFICATION DES TRYPANO­SOMES PAR AMPLIFICATION GENIQUE (PCR)

2.1. Optimisation· des conditions d'amplification

Face au manque de sensibilité "des techniques d'hybridation moléculaireutilisant les sondes non radioactives par rapport aux techniques classiquementutilisées, nous avons opté pour une autre méthode, la PCR. TI a fallu mettre aupoint les différentes conditions expérimentales de la technique de la PCR etsurtout la concilier avec une méthode de traitement d'échantillon qui, nonseulement devrait rester simple mais aussi permettre une bonne conservationdes échantillons de terrain en absence de chaîne de froid.

2.1.1. Recherche des températures optimales d'hybridationdes amorces

Comme il est décrit dans le paragraphe 6.1. du chapitre Méthodes, lestempératures théoriques d'hybridation des oligonucléotides sont données par desformules mathématiques. Cependant, elles doivent être déterminées de façonempir~que. C'est pourquoi, de nombreux essais d'amplification d'ADNhomologue et hétérologue de référence ont été effectués en faisant varier latempérature d'hybridation moléculaire des oligonucléotides de façon à atteindre. .

la sensibilite nécessaire "à une détection de faible parasitémie et une spécificiténécessaire à une identification de certitude.

"Pour les couples "Br" (spécifique de T. brucei) et "Gf' (T. congolensetype Galerie forestière), les valeurs théoriques de température d'hybridationdonnées par les formules mathématiques sont comprises entre 50 et 55 oC. Parconséquent, les essais d'amplification ont été effectués entre 50 et 65°C. Lesmeilleurs. résultats de sensibilité et de spécificité ont été obtenus à 60° C.

Le couple d'amorces "Sav" présente des valeurs" théoriques detempérature d'hybridation situées entre 60 et 65 oC. Les tests d'amplificationgénique réalisés entre 60 et 70 oC ont montré qu'à 67,5 oC, les oligonucléotides"Sav" présentent les meilleures sensibilité et spécificité de détection.

li ne nous a pas semblé utile de présenter l'ensemble de ces résultatsobtenus dans une démarche répétitive.

. 107

2.1.2. Défmition du temps des différentes étapes de laréaction de la PCR

Etant donné que les fragments d'ADN amplifiés sont de tailles inférieuresà 500 pb, nous avons fixé les temps d'hybridation et d'extension (élongation)

.des amorces à 1 mn, pour des raisons citées dans le paragraphe 6.1. du chapitreMéthodes.

Pour les trois couples d'amorces utilisés dans cette étude : "Br"(spécifique de T. brucei), "Gf' (spécifique T. congolense type Galerieforestière) et "Sav" (spécifique T. congolense type Savane), une augmentationde la durée des étapes d'hybridation des amorces à 1 mn 30 s ne modifie pas lesseuils de détection obtenus pour des durées de 1 mn.

De la même façon, le nombre de cycles a été fixé à 30. Des résultatsidentiques ont été obtenus lorsque les réactions d'amplification des amorces ontété effectuées pendant 35 et 40 cycles.

2.1.3. Concentration de MgCh et quantité d'enzyme (Taqpolymérase)

La concentration en MgC12 dans le milieu réactionnel standardd'amplification génique est de 1,5 mM et la quantité de la Taq polymérasesuggérée par le fournisseur. (Appligène) pour une réaction d'amplificationgénique est de 1,5 U. C'est dans ces conditions que nous avons détenniné lestempératures et les temps d'hybridation des amorces, et le nombre de cyclesd'amplification d'ADN.

Les essais des réaction de PCR effectués à des concentrations de 1; 2; 2,5;3 et 3,5 mM de MgC12 d'une part, et ceux portant sur les quantités de la Taqpolymérase (1; 2; 2,5 U) d'autre part n'ont pas permis d'améliorer les seuils dedétection des couples d'amorces utilisées. En effet, Les meilleurs seuils desensibilité ont été obtenus à une concentration de 1,5 mM en MgCh. De même,1,5 unités d'enzyme par échantillon s'est révélé être la quantité minimale de laTaq polymérase pour obtenir une bonne amplification.

2.1.4. Protocole d'amplification génique

108

Le tampon réactionnel (1 X) fourni avec la Taq polymérase par la société"Appligène" est composé comme suit: Tris HCI 10 mM, pH 9; KCI SO mM,~gCh 1,S mM; Triton X-100 0.,1 %(v/v); gélatine ou sérum albumin~ bovine(BSA) 0,2 mg/ml. La réaction est réalisée dans un appareil automatiqueTherrno-jet (Eurogentec) dans un volume réactionnel de SO Jll.

.Les concentrati~ns de chacun· des 4 désoxynucléotides triphosphates(dATP, dGTP, dCTP et dTTP)ont été' fixées à 200 JlM et celles des amorce~.à

1 JlM chacune... Comme résumé dans le Tableau IX, la réaction de la PCR est réalisée

selon le protocole qui suit: d'abord, une dénaturation de l'ADN est réaliséependant 3 mn à 94 oC (précycle). L'amplification commence après âvoir ajoutél'enzyme (1,S unité), par une séparation des brins d'ADN pendant 1 mn à 94°C.S'ensuit une hybridation des oligonucléotides avec les séquences spécifiquesd'ADN (annealing) pendant 1 mn à 60 oC pour les oligonucléotides spécifiquesde T.· brucei (Br) et ceux spécifiques de T.. congolense de type "Galerieforestière" (Gf) et à 67,S oC pour le couple d'amorces spécifiques de T.congolense type "Savane" (Sav). Enfin, le cycle se termine par une· élongation(synthèse du brin complémentaire) à 72°C pendant 1 mn. Ce cycle est ainsirépété 30 fois ..

Les échantillons sont mis à 4°C en attendant d'être analysés sur geld'agarose (cf. paragraphe S.l du chapitre Méthodes).

2.2. Sensibilité et spécificité de détection sur l'ADNpurifié

La mise au point de la technique de polymérisation en chaîne a consisté àévaluer la sensibilité et la spécificité de détection des amorces "Br", "Gr' et"Sav" sur les ADN de trypanosomes de référence appartenant aux espèces T.congolense type "Savane" (1/148), T. congolense type "Galerie forestière"(ANR3), T. congolense type "Kilifi" (WG S), T. simiae (BAN 7), T. b. brucei .(Eatro 112S), T. b. gambiense (Biyamina), T. b. rhodesiense (OS8 cl. A3), T.evansi (Kassala) et T. vivax. (Y-486).

La Figure 16 représente respective~ent les résultats relatifs à la·sensibilité et la spécificité des amorces "Br" (A), "Gr' (B) et "Sav" (C).

109

Tableau IX : Résumé des protocoles d'amplification genlque des amorcesspécifiques de T. brucei "Br", de T. congolense (Galerie forestière) "Gf' et de T.congolense" (Savane) "Sav". TC> et T représentent respectivement les températures etles temps des réactions.

Séparation Hybridation Elongation Nombre deAmorces des brins des amorces des cycles

d'ADN (annealing) amorces

T. brucei TO= 94°C TO= 60° C TO= 72° C"Br" T= 1 mn T= 1 mn" T= 1 mn 30

T. congolense(Galerie forestière) TO= 94°C TO= 60° C TO= 72° C 30

"Gr' T= 1 mn T= Imn T= 1 mnT. congolense

(Savane) TO= 94°C TO= 67,5° C TO= 72° C 30"Sav" T= 1 mn T= 1 mn T= 1 mn

110

"Br"

POl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13

"Gf"

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15

"Sav"

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

4?2pb -.369pb -.246pb -.

123 pb -.

A B c

Figure 16. Sensibilité de détection et spécificité de la réaction d'amplification en chaîne des couples d'amorces spécifiques deT. brucei (A), T. congolense "galerie forestière" (B) et T. congolense "Savane" (C) sur le matériel génomique purifié destrypanosomes de référence.(A) : Les pistes 1,2,3,4,5, et 6 représentent les quantités d'ADN de 1000, 100, 10, 1,0,1 et 0,01 pg de Eatro 1125 (T. b.brucel). Les réactions de spécificité sont réalisées avec 1000 pg de T. congolense "Savane", 11148 (7); T. congolense "galerieforestière", ANR3 (8); T. congolense "Kilifi", WG 5 (9); T. simiae, BAN 7 (10) et T. vivax, Y-482 (11). (12) étant le témoinsans matrice. La migration est suivie par le marqueur de poids moléculaire, Pm (123 pb DNA ladder, Gibco BRL, USA).•(B) : les pistes de 1 à 6 correspondent, comme dans la photo (A), aux quantités d'ADN de 1000 à 0,01 pg de ANR3" Lespistes 7,8, 9,10, Il, 12, 13 et 14 sont respectivement 1000 pg de 11148, WG 5, Eatro Il 25, Biyamina, 085 (clone),Kassala,BAN 7 et Y-482. Le pistes 14 est le témoin sans matrice.(C) : 1000 à 0,01 pg de I1148 sont déposés dans les pistes allant de 1 à 6. Les pistes 7 et 8 représentent les dépots de 1000 et100 pg de ANR3. Comme dans la photo (B), les pistes 9,10, Il, 12, 13, 14 et 15 sont respectivement 1000 pg de WG 5, EatroIl 25, Biyamina, 058cl. A3, Kassala, BAN 7 et Y-482. Le puits 15 est le témoin sans matrice.

Quelle que soient les .amorces utilisées, jusqu'à 0,1 pg d'ADN homologue, soitl'équivalent de 1 parasite, est détecté de façon reproductible après amplificationgénique et migration électrophorétique; les oligonucléotides "Sav" ne présententqu'un léger signal à 0,01 pg. Les formes monomériques des fragmentsamplifiés sont respectivement de 170 à 180 pb, de 310 à 320 pb et ,de 305 à 310pb pour les amorces "Br", "Gf' et "Sav". Comme l'indique clairement la figure16, les profils d'amplification, en plus des monomères, sont très souventaccompagnés des fonnes polymériques.

La Figure 16 (A) : piste de 1 à 6 illustre l'amplification par, les amorces"Br", de l'ADN homologue de Eatro 1125. Les mêmes résultats ont été trouvésavec les ADN homologues de Biyamina (T. b. gambiense), de 058 cl. A3 (T. b.

rhodesiense) et de Kassala (T. evansi).

Au delà de 1 ng d'ADN, soit l'équivalent de 104 parasites, d'une façongénérale, après· amplification et migration électrophorétique, nous observons"un smire" situé tout le long du gel. Ce smire matérialise un excès de substrat(matrice). La mise en évidence des profils spécifiques, dans ces conditions, nepeut être réalisée.

Les résultats de l'étude de la spécificité ne montrent aucune réactioncroisée des couples d'oligonucléotides avec les ADN hétérologues (1/148,ANR3, WG 5, Eatro 1125, Biyamina, BAN 7, 058 cl. A3, Kassala et Y-486 .Cependant, à partir de 1 ng d'ADN, les amorces "Sav" amplifient le matérielgénomique de ANR3 (T. congolense "Galerie forestière") : Figure 16 (C) piste10.

2.3. Optimisation du traitement des échantillons

2.3.1. Traitement au CsTFA pour la conservation du matérielgénomique

Comme il est décrit dans les paragraphes 6.2 du chapitre Méthodes et 1.4du chapitre Résultats, ce protocole, inspiré des travaux de Zolg et al. (1988) etOury (1989), consiste en une lyse des parasites ou des tissus dans lesquels setrouvent les parasites pendant 10 mn par une solution de lauroyl sarcosine 1 %(P/v),'EDTA 50 mM, pH 8 à raison d'un volume d'échantillon parasitaire pourun volume de la solution de lyse. L'ADN est ensuite protégé de l'action des

112

DNAses (enzymes qui dégradent 'l'ADN) par l'ajout d'une solution detrifluoroacétate de césium (CsTFA) à une concentration finale de Ot6 M.

2.3.2. Traitement à la RNAse

En vue d'essayer de comparer la sensibilité du dépistage parasitologiquepar rapport à celle de la tech~ique de la PCR sur différents organes des

'mouches, nous' avons' effectué une première étude de' spécificité des trois ,couples d'amorces sur les organes (proboscis, glandes salivaires et intestins) deprès de 20 glossines saines appartenant à différentes espèces (G.! fuscipes, G.m. morsitans, Glossina palpalis , gambiensis et Glossina tachinoides). Lesrésultats' des amplifications géniques obtenus ont montré l'existence d'un"smire" (traînée) sur le gel d'agarose dans toute la zone de poids moléculaireinférieure à 350 pb sur l'échantillon d'ADN d'intestin de toutes les mouchesanalysées. Ce "smire" empêche l'observation des amplicons spécifiques.

Ainsi t une étape de digestion à la RNAse a été ajoutée dans le traitementdes échantillons. Elle consiste en une incubation des échantillonst pendant 1 h à37, oC en présence de 100 Jlg/ml de RNAse, juste avant l'extraction etprécipitation à l'éthanol (cf. paragraphe 6.2 du chapitre Méthodes).

2.3.3. Protocole de traitement d'échantillon

~n résumét le protocole final de traitement des échantillons (parasites deculture, organes de glossines), se définit comme suit : à 1 V de solutionparasitaire ou d'organe de glossine ,(dans du PBS) est ajouté 0,33 V de lauroyl

, '

sarcosine 1% (plv); EDTA 50 mM, pH 8, puis, est ajouté 0,25 V de CsTFA3M. Une digestion à la RNAse est effectuée avant l'extraction au phénolchloroforme et précipitation à l'éthanol des échantillons (cf. paragraphe 6.2.2.du ~hapitre Méthodes). Après resuspension des ADN dans du tampon deréaction de la PCR ou dans de l'eau stérile, les échantillons sont soumis auxréactions d'amplification génique selon les protocoles de'base des différentesamorces décrits dans le paragraphe 2.1.4 de ce chapitre.

2.4. Etude de la sensibilité de détection sur leséchantillons traités

2.4.1. Sur les trypanosomes de culture

113

Les résultats des amplifications obtenus sur les parasites de culture sontreprésentés sur la Figure 17. Les 3 couples. d'oligonucléotides permettentclairement la détection de la parasites homologues. Un seul parasite peut êtredétecté par les amorces "Sav" (Figure 17 C).

2.4.2. Sur les trypanosomes mélangés aux organes desglossines

Enfin, l'étude de la sensibilité de détection des amorces· a été réalisée surdes parasites mélangés aux organes de mouches (intestins, glandes salivaires etproboscis). Les résultats sont montrés sur la Figure 18. Nous constatons quechaque couple d'oligonucléotides amplifie jusqu'à la parasites homologuescontenus dans les organes de glossines. Les profils d'amplification sontidentiques à .ceux obtenus sur les ADN et les parasites purifiés. Les amorces"Sav"'ne permettent pas la détection d'un parasite comme cela a été constaté surles parasites purifiés (Figure 18 C).

2.4.3. Evaluation du protocole de conservation du matérielgénomique

Deux lots de 104 parasites de Eatro 1125 de cul~re dans 1 ml de PBSont été préparés puis traité ou non avec du lauroyl sarcosine et du CSTFAcomme décrit dans le paragraphe 6.2.2. du chapitre Méthodes. Ces deux lots ontété laissés dans le laboratoire à la température ambiante. Huit mois après, leséchantillons ont été traités et soumis à la réaction de PCR avec les amorces "Br"comme décrit dans le paragraphe 2.1.4. de ce chapitre. Les amplifications nesont observées que sur le lot de parasites traités. Le seuil de détectioncorrespondant à celui obtenu sur les parasites amplifiés juste après culture invitro (la parasites).'

2.5. Tests sur les glossines d'infection expérimentale

L'évaluation de la technique de PCR a été effectuée sur les mouchesexpérimentalement infectées s.oit par T. b. brucei (Eatro 1125) soit par T.congolense "Savane" (Eatro 325) et en infection mixte avec les deux espèces detrypanosomes.

114

Pm 1234 5

492 pb --.369pb --.246pb --.

123pb --. ......

A

123 4 5

B

123 4 5

c

Figure 17. Sensibilité de détection par la PCR des amorces,spécifiques de T. brucei (A); T. congolense "Galerie forestière"(B) et T. congolense "Savane" (C) sur les trypanosomes entiersde culture. Les souches parasitaires utilisées sont Batro 1125(A), ANR3 (B) et 1/148 (C). Les pistes 1, 2,3 et 4 représententles quantités de parasites respectivement de 1000, 100, 10 et1. Et, la piste (5) est le témoin sans matrice. Enfin, la migrationest suivie par le marqueur de poids moléculaire Pm.

115

Pm 1234 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

492 pb369 pb

246 pb

123 pb

~ -~~492 pb -----.

~< 369 pb -----.246 pb -----.123 pb -----.

u492 pb

369 pb

246 pb

123 pb

Intestin GlandessaL Proboscls

Figure 18. Amplification génique des trypanosomes Eatro 1125 (T. b.brucei) par les amorces "Br" (A), de ANR3 (T. congolense type"Galerie forestière) par le couple d'oligonucléotides "Gf" (B) et de1/148 (T. congolense type "Savane") par les amorces "Sav" (C). Lesparasites étant mélangés aux organes de glossines saines (intestin,glandes salivaires et proboscis). Pm représente le marqueur de poidsmoléculaire et les pistes 1,2,3 et 4 correspondent aux quantités deparasites de 1000, 100, 10 et 1. Le témoin négatif est l'organe deglossine sans parasite (5).

116

2.5.1. Glo~sines infestées par T. b. brucei (Eatro 1125)

Au total, 187 glossines infestées par Eatro 1125 ont été analysées.

Quinze de ces glossines: G. m. morsitans (4 mâles et Il femelles)s'étaient révélées porteuses de trypanosomes après examen microscopique. Unetrès bonne corrélation des résultats positifs est observée entre l'analyseparasitologique et la technjque de la PCR. En effet, ces 15 glossines se sontrévélées positives en technique de la PCR. De la même façon, tous les organespositifs en analyse microscopique ont présenté des réactions d'amplificationgénique avec les amorces "Br". La Figure 19 compare les résultats

.parasitologiques à ceux de la PCR obtenus sur l'ensemble des organes de ces 15glossines.

Le Tableau X résume l'ensemble des résultats obtenus sur les 172glossines négatives selon la technique parasitologique. Près de 71 % d'entre ellesse sont révélées positives en technique de polymérisation en chaîne. Lesmouches de l'espèce G. m. morsitans sont plus infestées que celles de l'espèceG. f fuscipes (91,22% contre 60,86%); cette différence étant hautementsignificative (Xhi2=17,03; d.d.l=l; p<O,OOl). Tous les mâles de G. m.morsitans sont infestés contre 87,80% de femelles et, ces proportions chez G.f fuscipes sont de 80,85% pour les mâles et 47,05% pour les femelles.Toutefois, ces différences de taux d'infection en fonction du sexe ne sontstatistiquement significatives que chez G. f fuscipes (Xhï2=13,52; d.d.l=l;p<O,OOl). Certains résultats sont montrés en Annexe 5.

La Figure 20 présente les taux d'infection obtenus sur les organes deglossines négatives selon l'analyse parasitologique. L'intestin est l'organe le pl~s

infecté avec 75,43% de taux d'infection. chez G. m. morsitans et 45,21 % chezG. f. fuscipes. Le proboscis et les glandes salivaires ont présenté des tauxrespectivement de 40,35 et 35,08% chez G. m. morsitans. Chez G. f fuscipes,31,30% de glandes salivaires et 3,47% de proboscis sont porteurs de matérielgénomique de T. b. brucei.

117

100~=·~ao"Sil~

"'0

~ 60~s..o~ 40

§.-....~ 20=.-

i::s~ 0

Intestin Glandes salivaires Proboscis

Figure 19. Taux d'infection obtenus par la réaction de polymérisationen chaîne (peR) des organes des 15 G. m. morsita"ns infestéesexpérimentalement par T. b. brucei et porteuses de trypanosomesselon l'examen microscopique (Para).

118

Tableau X : Taux d'infection obtenus par la technique d'amplification géniqueen chaîne de G. m. morsitans (Gmm) et/ou G. f. fuscipes, mâles (M) etfemelles (F) infestées expérimentalement par T. b. brucei et présentant un·examen parasitologique négatif..

Glossines négatives Sexe et nombre Résultats peRen Parasitolofûe

M=16 16 (l00,00%)

G. m.m F=41 36 (87,80%)

Total =57 52 (91,22%)

M=47 38 (80,85%)

G.f.f F=68 32 (47,05%)

Total=115 70 (60,860/0)

M=63 54 (85,71 %)

G.m.m + G.r.r F=109 68 (62,38%)

Total=172 122 (70,93 %)

119

0+'----===

40

20

ProboscisGlandes salivairesIntestin

100

~ 80.ëij{Il

o"Si>~ 60~=~s..o~

"C,

=o.-.....~.5i::l~

Figure 20. Taux d'infection obtenus par la technique de polymérisation enchaîne des organes de G. m. morsitans (Gmm) et G. f fuscipes (Gft)infectées expérimentalement par T. b. brucei. Toutes ces glossines s'étaientrévélées négatives en analyse microscopique.

120

2.5.2. Gloss~es infèstées par T. congolense "Savane"(Eatro 325).,

Seules 7 glossines (G. m. morsitans femelles) infestées par T. congolense"Savane" ont pu être analysées. Ces 7 mouches se sont révélées négatives aprèsexamen parasitologique. En techniqUe de PCR; 4 glossines portant une infectionintestinale ont été mises en évidencè. Aucune infection du proboscis et ~~s

glandes salivaires n'a été observée (résultats non montrés)..

2.5.3. Glossines d'infection mixte: T. b. brucei (Eatro 1125)et T. congolense "Savane" (Eatro 325).

Cette étude a porté sur 91 glossines. Vingt-deux d'entre elles (20 G. m.morsitans et 2 G. f. fuscipes) avaient présenté des résultats positifs selonl'analyse parasitologique. Ces résultats se répartissent comme suit : 9 glossinesont présenté des parasites dans l'intestin seul; 1 glossine, dans l'intestin et lesglandes salivaires;. 8 mouches, dans l'intestin et le proboscis et enfin, 4glossines, dans l'intestin, les glandes salivaires et le proboscis.

Le Tableau XI (A) représente les résultats de réaction de polymérisationen chaîne obtenus sur ces 22 glossines portant des trypanosomes en examenmicroscopique. Vingt et une glossines ont présenté une réaction d'amplificationgénique avec au moins l'une des deux amorces utilisées ("Br" et/ou "Sav") soitun taux d'infection de 95,45%. Une glossine (G. m. morsitans) dont l'intestinétait parasité (examen microscopique) s'est révélée négative en amplificationgénique. Aucune glossine n'a présenté une mono infection à T. b. brucei,18,18% ont eu une mono infection à T. congolense et enfin, 77,27% ont étéporteuses d'infection mixte (Figure 21 A). A l'exception de l'intestin de laglossine décrite ci-dessus, tous les organes portant des parasites en examenmicroscopique ont présenté des réactions d'amplification génique avec au moinsl'un des deux couples d'amorces "Br" et/ou "Sav". La Figure 21 (B) décrit lestaux d'infection des organes des glossines en précisant le pourcentage de monoinfections (T. b. brucei et T. congolense) et celui d'infectons mixtes. Il enressort que les mono infections à T. congolense et les infections mixtes sont plusimportantes que les mono infections à T. brucei dans les 3 organes desglossines. La Figure 21 (C) compare les résultats des analyses parasitologiquesà ceux de la PCR obtenus sur les différents des organes de ces 22 glossines.

121

Tableau XI: Taux d'infection obtenus par la réaction de polymérisation en chaînedes glossines d'infection expérimentale: G. m. morsitans mâles et femelles(GmmM et GmmF) et G. f. fuscipes mâles et femelles (GffM et GffF): Cesglossines ont été infestées expérimentalement par T. brucei et T. congolense(infection m~xte). (A) et (D) représentent respectivement les résultats portant surles glossines positives et négatives après examen microscopique.

A

Nombre deglossines

Infection mixte Infectionpositives (+) Mono infection Mono infectionen Parasito. brucei" "congolense" Totale

.GmmM=14 0 2 (14,38%) Il (78,57%) 13 (92,85%)

GmmF=6 0 0 6 (100%) 6 (100%)

GmmM+F=20 0 2 (10%) 17 (85,00%) 19 (95,00%)

GffM=O 0 0 0 0

GffF=2 0 2(100%) 0 2 (100%)

GffM+F=2 0 2 (100%) 0 2 (100%)

B

Nombre deglossines Mono infection Mono infection Infection Mixte Infection

négatives en PCR "brucei" PCR "congolense" (PCR) TotaleParasito.

GmmM=ll 4 (36,36%) 2(9,09%) 5 (45,45%) 11 (100%)

GmmF=7 1 (14,28%) 0 5 (71,42%) 6 (85,71%)

GmmM+F=18 5 (27,77%) 2 (11,11%) 10 (50%) 17 (94,44%)

GffM=21 5 (23,80%) 8 (38,09%) 5 (23,80%) 18 (85,71%)

GffF=30 1 (3,33%) 17 (56,66%) 9 (30%) 27 (90%)

GffM+F=51 6 (11,76%) 25 (49,01%) 14 (27,45%) 45 (88,23%)

122

A

B

+ 100

S 80S~

~ 60

Ct:.g~ 40...(,J

~C 20~

"CS~ O-JL--..a~ill;ll;iœ:.........,..------.W~~<IZ........,....-~

"br" "cong" "br+cong" . Totale

C

70

Q,I

oc 60rc; 50~

S ~o~ ~oc'gj3oSoS~ ~o~.5 10~~ 0 .jL-<LLI..I.LIl==

Intestin

Para

~ 100C

~1. 80OC:l:lC:I:l~~c

"CS·Fii 6 0C:I:lco

0-~ ~40(,J~

~"CS~5 20"CS

~Intestin

Glandes salivaires

Glandes salivaires

Proboscis

Proboscis

Figure 21. Résultats d'amplification en chaîne obtenus des 22 glossines (20 G.

m. morsitans et 2 G. f fuscipes) infestées expérimentalement par T. brucei etT. congolense et porteuses de trypanosomes selon l'analyse parasitologique.

- Résultats portant sur les glossines entières (A) et sur les organes deglossines en précisant les différents types d'infection (B): "Br" ( les monoinfections de T. brucei), "Cong" (les mono infections de T. congolense) et"Br+Cong" (les infections mixtes de T. brucei + T.congolense).

- Résultats comparatifs des organes positifs par l'analyse parasitologique et parla réaction de la PŒ (C).

123

Près de 94 % de G. m. morsitans et 88% de G. f fuscipes négatives enanalyse microscopique se sont révélées porteuses de trypanosomes par latechnique de la PCR (Tableau XI B).

Chez G. m. morsitans, les prévalences des mono infections à T. brucei ouà T. congolense et d'infections mixtes sont respectivement de 27,77%, Il,11 %et 50,00%; chez G. f fuscipes, ces prop~rtions sont respectivement de Il,76%,49,05% et 27,45%.

Les mâles sont plus infectés chez G. m. morsitans (100% contre 85,71%)et les femelles sont plus infectées que les mâles chez G. f fuscipes (90,00%contre 85,71 %). Toutefois, ces différences de taux d'infection en fonction dusexe ne sont pas statistiquement significatives.

De même, la différence de prévalence d'infection totale de G..m..morsitans (94,44%) et de G.ffuscipes (88,23%) n'est pas significative.

La Figure 22 présente les résultats comparatifs des taux d'infection desorganes de G. m. morsitans et G. f fuscipes. Nous constatons que l'intestin estl'organe le plus infestés et, les taux d'infection des organes de G. m. morsitanssont toujours supérieurs aux organes correspondants de G. f. fuscipes. LaFigure 23 (A) et (B) précise les prévalences des types d'infection trouvées dansles organes des glossines. Nous constatons que les infections mixtes de T.congolense et T. brucei sont essentiellement présentes da.ns l'intestin desmouches. Les mono infections à T. b. brucei sont plus importantes chez G. m.morsitans et les mono infections à T. congolense sont plus fréquentes chez G.f fuscipes.

2.6. Test sur les glossines de terrain

L'ensemble des échantillons de terrain ont été analysés en techniqued'amplification génique avec les amorces "Br", "Gf' et "Sav".

2.6.1. Echantillons du Congo.

. Les 93 glossines (53 mâles et 40 femelles) provenant du Congoappartiennent toutes à l'espèce Glossina palpalis palpalis. L'analyseparasitologique réalisée sur le terrain a révélé deux mouches infestées. Lapremière était trouvée porteuse d'un trypanosome dans l'intestin moyen. La

. .

124

100

80

60

40

20

o-l''----->l===Intestin Glandes salivaires Proboscis

Figure 22. Taux d'infection obtenus par la réaction de l'amplificationgénique des organes de G. m. morsitans (Gmm) et G. f fuscipes (Gff)infestées expérimentalement par T. b. brucei et T. congolense "savane" etprésentant un résultat .négatif en analyse parasitologique.

125

Intestin

A

~ 60c:

·ëii~ 50Oïlrc

."t:S 40~c:c=~ 30Cl(1}Q,l

"t:S 20§;

~ 10~5"t:S~ O-!L-====

Intestin

B(1}Q,l

c: 50.~

Oïl 45~ 40

"t:S~ 35; 30CJ:l

S 25~ 20

"t:S

115 15::toi 1 0~.5 5"t:S O-!L-====~

Glandes salivaires

Glandes salivaires

Proboscis

Proboscis

Figure 23. Taux d'infection obtenus par la technique de la PCR surles organes de G. m. morsitans (A) et G. f fuscipes (B), infestéesexpérimentalement par T. b. brucei etT. congolense, négatives selonl'analyse parasitologique. "Br", "Cong" et "Br+Cong" représententrespectivement les mono infections de T. brucei, les mono infectionsde T. congolense et les infections mixtes de T. brucei + T.congolense.

126

seconde était très fortement parasitée dans l'intestin moyen et le proboscis,aucun parasite n' a été observé dans les glandes salivaires.

Le Tableau Xli résume les résultats parasitologiques obtenus comparés àceux de l'amplification génique. Seize pour cent représente le taux moyend'infe'ction des mouches obtenu avec .les amorces utilisées. Ces infections serépartissent comme suit: 5,37% de mono infections T. brucei s.l., 8,60% ,demono infections T. congolense et enfin, 2,15% d'infections mixtes. Lesglossines femelles sont plus infestées que les mâles (25,00% contre 9,43%);cette différence est significative avec Xhï2=4,08; d.d.! =1; p<0,05. L'Annexe 7montre quelques illustrations des profils d'amplification des organes deglossines.

Aucune amplification n'a été observée chez la glossine dont seul l'intestina été trouvé parasité en examen microscopique. Cependant,· celle dont leproboscis et l'intestin étaient trypanosomés a donné les résultats suivants enPCR : une infection à T. congolense (type "Galerie forestière") dans l'intestin etle proboscis et un infection à T. brucei s.l. dans les glandes salivaires.

Les Figures 24 (A) et (B) représentent les taux d'infection par organe del'ensemble des mouches utilisées. L'intestin est l'organe le plus infesté avec10,75% (3,22% d'infection à T. brucei s.l. et 7,52% d'infection à T.congolense) suivi des glandes salivaires avec 5,33% (3,22% et 2,15%respectivement d'infection de T. brucei s.l. et T. congolense) et enfin leproboscis avec 3,22% (1,07% d'infection T. brucei s.l. et 2,15% d'infection T.congolense). Aucun organe de glossine a été trouvé porteur d'une infectionmixte.

Sur les 10 mouches positives (par la PCR) en T. congolense, 9 (90%)portent les trypanosomes spécifiques du groupe "Savane" contre une seuleprésentant une infection de T. congolense "Galerie forestière". Aucune glossinen' a présenté une double infection du groupe "Savane" et "Galerie forestière".

2.6.2. Echantillons de la Côte d'ivoire.

L'analyse a été effectuée sur 70 mouches de l'espèce G. p. palpalis (30 .mâles et 40 femelles). En examen parasitologique, sur les 30 glossines mâles, 2infections intestinales ont été observées. Aucune mouche mâle ne portait destrypanosomes dans les glandes salivaires et dans le proboscis. Sur 40 mouches

127

.....N00

Tableau XII : Résultats des amplifications géniques avec les oligonucléotides "Br", "Gr' et "Sav" desglossines mâles (M) et femelles (F) provenant du Congo. .

Glossines Résultats Résultats d'amplification génique Résultatstotales Parasito (PCR) .

Parasito+PCR

Mono infection Mono infection infection Total"bruce;" "conJ!olense" mixte

M=53 0 2 (3,77%) 3 (5,66%) 0 5 (9,43%) 5 (9,43%)

F=40 2 (5,00%) 3 (7,50%) 5 (12,50%) 2 (5,00%) 10 (25,00%) Il (27,50%)

M+F=93 2 (2,15%) 5 (5,37%) 8 (8,60%) 2 (2,15%) .15(16,12 %) 16 (17,20%)

A

B

Intestin Glandes salivaires Proboscis

GI P

"Br" "Cong" "Br+Cong" Totale

Figure 24. Taux d'infection obtenus par la réaction de polymérisationen chaîne des organes de glossines (G. p. palpalis) du Congo. Legraphe (A) présente les résultats sur les organes de glossines mâles(M) et femelles (F). Le graphe (B) précise les différents typesd'infections dans l'intestin (J), glandes salivaires (GI) et proboscis (P).Ces types d'infection sont: les mono-infections de T. brucei (Mono"br"); les mono-infections de T. congolense (Mono "cong") et lesinfections mixtes de T. brucei +T. congolense (Mixte "br+cong").

129

femelles, 13 ont été trouvées porteuses de parasites dans l'intestin et 2 dans leproboscis. Les 2 infections du proboscis ont été accompagnées d'infectionsintestinales. Aucun trypanosome n'a été observé dans les glandes salivaires.

Au. total, 36 glossines se sont révélées porteuses d'infection par latechnique d'amplification en chaille soit, un taux de moyen de 51,42%, contre21,42% selon l'analyse microscopique. L'ensemble de ces résultats est rapportédans le Tableau XIll. Dix pour cent des glossines ont présenté une monoinfection à T. brucei s.l., 21,42% une mono infection à T. congolense et enfin, ,20,00% une infection mixte. Les glossines femelles sont plus trypanosomées queles mâles avec des prévalences d'infection de 60% contre 40%. Cette différenceétant statistiquement significative (Xhi2=2,75; d.d.l.=l; p<0,05). L'Annexe 8présente les gels d'amplification génique de quelques organes de glossines de laCôte d'Ivoire.

Parmi 15 glossines positives selon.rexamen microscopique, Il (73,33%)ont été trouvées infestées par T. brucei s.l. et/ou T. congolense en technique depolymérisation en chaîne. Quarante pour cent de ces mouches o~t eu uneinfection mixte. Les mono infections à T. brucei s.l. et à T. congolense sontrespectivement de 6,66% et 26,66% (Tableau XIV A). Toutes les infectionsmixtes ont été observées dans l'intestin. Aucune glande salivaire ne s'est révéléepositive. Un proboscis sur les deux positifs selon l'analyse parasitologique aprésenté une mono infection à T. congolense .

Près de 46% de glossines négatives en technique parasitologique ontprésenté au moins une réaction d'amplification positive avec l'un des 3 couplesd'oligonucléotides testés. Vingt pour cent, 10,90% et 14,54% représententrespectivement les taux de mono infection à T. congolense, de mono infection àT. brucei s.l. et d'infection mixte de ces mouches (Tableau XN B).

Les taux d'infection obtenus par organe de mouches sont résumés dans laFigure 25 (A) et (B). L'intestin, les glandes salivaires et le probos~is ontrespectivement présenté des taux d'infection de 44,28%, Il,42% et 14,28%.Ces taux d'infections dans les glandes salivaires et dans le proboscis serépartissent principalement entre les mono infection à T. brucei s.l. et à T.congolense. Les infections mixtes sont essentiellement observées dans lesintestins des glossines (17,14%). Eneffet, seule 1 seule glossine a présenté uneinfection mixte dans les glandes salivaires.

130

Tableau XIII : Résultats des analyses parasitologiques et celles de la polymérisation en chainedes glossines de la Côte d'Ivoire, G. p. palpalis mâles (M=30) et femelles (F=40).

Glossines Résultats Résultats d'amplification génique Résultatstotales Parasito. (PCR) Parasito.+PCR

Mono Mono infection Totalinfection infection mixte"brucei" "congolense"

M=30 2 (6,66%) 5 (16,66%) 5 (16,66%) 2 (6,66%) 12 (40,00%) 13 (43,33%)

F=40 13 (32,50%) 2 (5,00%) 10 (25,00%) 12 (30,00%) 24 (60,00%) 27 (67,50%)

M+F=70 15 (21,42%) 7 (10,00%) 15 (21,42%) 14 (20,00%) 36 (51,42%) 40 (57,14%)

Tableau XIV: Résultats des analyses en technique de polymérisation en chaîne desglossines mâles (M) et femelles (F) de la Côte d'Ivoire, positives (A) et négatives (B)après analyse microscopique.

A

Glossinespositives en Mono infection Mono infection Infections Infection totale

Parasito. "brucei" "congolense" mixtes (en PCR)

M=2 0(0,00%) 0(0,00%) 1 (50,00%) 1 (50,00%)

F= 13 . 1 (7,69%) 4 (30,76%) 5 (38,46%) 10 (76,69%)

M+F = 15 1 (6,66%) 4 (26,66%) 6 (40,00%) Il (73,33%)

B

Glossinesnégatives en Mono infection Mono· infection Infection mixte Infection totale

Parasito. "brucei" "congolense" (en PCR)

M=28 5 (17,85%) 5 (17,85%) 1 (3,57%) Il -(39,28%)

F=27 1 (3,70%)" ·6(22,22%) 7 (25,92%) 14 (51,85%)

M+F =55 6 (10,90%) Il (20,00%) 8 (14,54%) 25 (45,45%)

A

60

50

~

·â 40~

'-c:>'- 30=c.cc:>

F:= 20(j

~C

:..- 10"0

~

0

Intestin Glandes salivaires Proboscis

B

50

{I,lQ,I

40

"Br" "Cong" "Br+Cong" Totale

Figure 25. Résultats d'amplification génique des glossines de la Côte d'Ivoire.(A) : Taux d'infection des organes des. glossines mâles (M), femelles (F),mâles et femelles (M+F).(B): Différents types d'infection (mono infection de T. brucei: "Br"; monoinfection de T. congolense : '~cong" et infection mixte de T. brucei +T.congolense : Mixte "Br+Cong") obtenus en réaction de polymérisation enchaîne des glossines de la Côte d'Ivoire. (1), (Gl), (P) sont les abbréviationsrespectives de l'intestin, glandes salivaires et proboscis.

133

Sur les 29 glossines infestées par T. congolense, les taux de monoinfection des groupes "savane" et "Galerie forestière" sont respectivement de34,48% et 48,27%. Enfin, 17,24% portent une double infection de ces deuxgroupes de trypanosomes.

134

CHAPITRE V : DISCUSSION

DISCUSSION

Le~ méthodes de détection et d'identification des trypanosomes chez laglossine sont classiquement effectuées depuis près de 70 ans comme les avaientdécrites Llyod & Jonhson, (1924); elles reposent sur la mise en évidence destrypanosomes dans différents organes (intestin, glandes salivaires et proboscis)chez la glossine en utilisant la technique microscopique. Cette démarche manque 'notoirement de sensibilité. Ainsi, de nombreuses infections sont passées soussilence. Avec le développement de la biologie moléculaire, ont été mis au pointde nouveaux outils permettant la détection et l'identification spécifiques destrypanosomes : ce sont les sondes génomiques utilisées en hybridationmoléculaire et les oligonucléotides correspondants, en technique' de'polymérisation en chaîne. Notre étude porte sur l'évaluation des techniques demarquage non radioactif et l'application de la PCR sur les glossines d'infectionexpérimentale et naturelle.

Les sondes génomiques permettant de détecter les agents responsables denombreuses parasitoses tropicales ont été décrites depuis plus de 10 ans;l'ensemble de ces travaux ont été revus par Hill & Crampton (1994).

En ce qui concerne les trypanosomoses africaines, ces nouveaux outils dedétection ont été évalués en hybridation moléculaire par Kukla et al. (1987),Gibson et al. (1988), Nyéko et al. (1990), McNamarra et al. (1989), Majiwa &Otieno (1990), McNamarra &Snow (1991). Cependant ces travaux ont étéeffectués en marquage radioactif.

Le marquage radioactif consiste en l'incorporation d'un élémentradioactif dans un des deux brins d'ADN de la sonde. Ce type de marquagecomporte· un certain nombre de contraintes et d'inconvénients qui limitent sonutilisation aux laboratoires dûment équipés. Les produits radioactifs ne sontpas sans danger pour le manipulateur. La durée de vie de ces éléme~ts estrelativement courte. Par exemple, le phosphore 32, l'élément radioactif le pluscouramment utilisé pour le marquage des sondes, a une demi-vie de 14 jours.Enfin, le temps de révélation des autoradiographies est relativement long (12 à24 heures pour le phosphore 32). Par conséquent, ce type de marquage, par soncaractère contraignant, limite très considérablement son application en routinedans les pays en voie de développement.

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Devant l'impossibilité d'envisager le marquage des sondes au phosphore32, compte tenu des contraintes rencontrées sur le terrain, nous avons utilisé cesnouveaux outils de détection en hybridation moléculaire à l'aide de sondesgénomiques en marquage non radioactif (marquage froid). Deux types demarquage, commercialisés par "Amersham", ont été évalués et optimisés: lemarquage direct (kit chimique) et le marquage indirect (kit enzymatique).

A la suite' du développement des méthodes immunoenzymatiques alliantspécificité de reconnaissance (réaction anticorps-antigène) et visualisation dusignal par l'activité enzymatique (phosphatase alcaline et peroxydase), est néel'idée de marquer les sondes par des composants aptes à être reconnus par lesligands d'affinité tels que les anticorps. Ce marquage dit froid, parce qu'il necomporte pas d'éléments radioactifs, présente plusieurs intérêts évidents :

- il ne nécessite pas d'installations spéciales pour la manipulation et lestockage des produits;

- il est très simple et facile à mettre en oeuvre;- il est totalement sans danger pour le manipulateur étant donné qu'il ne

fait pas appel à des produits radioactifs, toxiques ou cancérigènes;- enfin, la durée de vie des éléments (les réactifs du kit) nécessaire au

marquage est relativement longue (6 à 12 mois).

Face au manque de sensibilité observé sur les ADN purifiés de référenceet ma~gré une bonne spécificité, l'utilisation du kit de marquage chimique a étéabandonnée. En effet, les sondes génomiques NIK-450 (spécifique de T.congolense "Kilifi"), DIL-350 ,(spécifique de T. congolense. "Galerieforestière"), DR1 (spéCifique de T..brucei s.l.) et NS-600 (spécifique de T.simiae) ne détectent que 500 pg d'ADN soit l'équivalent de 5000 parasites;NRE-372 (spécifique de T. congolense "Savane") détectant 100 pg soit, 1000para~ites. De telles charges parasitaires sont détectables par la microscopieoptique. De plus, lorsque les parasites entiers purifiés ou rencontrés dans lesorganes des glossines infestées sont utilisés, les seuils de détection sontgénéralement plus faibles par rapport à ceux obtenus avec les ADN purifiés.Par conséquent, ce kit de marquage chimique ne présente pas d'intérêt évidenten terme de sensibilité de détection des trypanosomes par rapport à la techniqueclassique reposant sur la microscopie optique.

Par contre, l'utilisation du kit enzymatique révèle des résultats plusintéressants. Quelles que soient les sondes génomiques étudiées, le marquageindirect augmente nettement· la sensibilité de la méthode par rapport au

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marquage direct. En effet, 1, 10, 10, 10 et 50 pg d'ADN sont respèctivementdétectés par les sondes NRE-372, DIL-350, NIK-450, DR1 et NS-600.

Toutes les techniques de marquage enzymatique reposent sur deuxprincipes : le marquage direct et le marquage indirect. Dans le. marquagedirect, un enzyme est fixé à la sonde (phosphatase alcaline, peroxydase). Aprèshybridation moléculaire, l'enzyme transforme un substrat incolore et soluble enproduit coloré, ou émettant, de la lumière au lieu de l'hybridation, permettantainsi, sa visualisation rapide.

La détection indirecte utilise des molécules intermédiaires (anticorps,avidine) couplées à un enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase) et capables dereconnaître des motifs fixés sur la sonde (fluorescéine, ferritine, biotine,digoxigénine); la révélation se réalisant de la même façon que dans le marquageindirect.

.Dans le marquage indirect, le signal de détection est donc amplifié,puisque de nombreuses molécules d'enzyme peuvent être fixées sur unemolécule de ligand. Ainsi, les sensibilités de détection observées pour d'autresparasitoses sont, dans la plupart des cas, supérieures à celles obtenues enmarquage direct (Barker, 1987; Matthews & Kricka, 1988; Hill et al., 1991).Ces observations sont confirmées par les résultats que nous avons obtenus. Eneffet, la technique d'hybridation moléculaire utilisant le marquage, direct aprésenté des seuils de détection 5 à 50 plus faibles que celle utilisant lemarquage indirect.

En fonction du protocole utilisé, la sensibilité de la technique est trouvéevariable. Sur les parasites de culture 1/148 (T. congolense "Savane") et Eatro1125 (T. b. brucei), les sondes génomiques NRE-372 et DRI permettentrespectivement la détection de 1°et 100 parasites lorsque la lyse et ladénaturation des parasites sont réalisées avant le dépôt des échantillons sur lamembrane (Protocoles B et C). L'utilisation du Protocole (A), dans lequel lalyse des parasites et la dénaturation de leur matériel génomique se font aprèsdépôt sur la membrane ramène les limites de, détection à 50 parasites pourNRE-372 et à 500 trypanosomes pour DR1. Cette différence de sensibilité dedétection entre les protocoles (B) et (C) d'une part et le protocole (A) d'autrepart s'explique par une plus ou ,moins grande accessibilité de l'ADN. En effet,la lyse des parasites et la séparation des brins d'ADN étant meilleures dans lesprotocoles (B) et (C).

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En marquage· radioacti~, Kukla et al. (1987) ont obtenu des seuils desensibilité 2 à 10 fois plus élev~s sur les ADN purifiés selon les sondes utilisées.Seule la sonde NRE-372 présente une sensibilité en marquage froid équivalenteà celle obtenue avec la même sonde radiomarquée.

En utilisant le protocole de lyse avant dépôt sur membrane (Protocole B),en marquage radioactif, Gibson et al. (1988), ·avec la même souche 1/148, ontobtenu une sensibilité de 100 parasites ·avec la sonde NRE-372. . .

Une autre séquence répétée spécifique de T. brucei s./. représentant sonADN satellite a été décrite par Sloof et al. (1983). Dans leur étude de 1988,Gibson et coll. ont obtenu, pour cette sonde, un seuil de détection de 100 detrypanosomes, toujours en marquage radioactif.

En ce qui concerne la spécificité des réactions d'hybridation moléculaire,d'une manière générale, les sondes ne présentent pas de réactions nonspécifiques avec l'ensemble des ADN hétérologues, dans nos conditionsexpérimentales. Sauf, la sonde NRE-372 qui s'est hybridée avec l'ADNhétérologue de T. c.ongolense "Galerie forestière" et la sonde DIL-350 avecl'ADN de T. congolense "Savane". L'étude de la séquence primaire des sondesNRE-372 et DIL-350 a montré qu'elles présentent une homologie de près de71 % (Masiga et al., 1992). Cette haute homologie devrait expliquer lesréactions croisées que nous avons observées. Toutefois, ces réactions croisées nesont révélées, dans nos conditions d'hybridation, que pour des quantités d'ADNcible supérieures ou égales à 1 ng, soit 104 parasites. Une telle chargeparasitaire est facilement. détectable par examen microscopique. Par conséquent,en présence de parasitémies infrasmicroscopiques, les deux sondes génomiquesdevraient pennettre une identification nette des deux sous-groupes de T.congolense ("Savane" et "Galerie forestière").

Cependant, Gibson et al. (1988) n'ont pas observé de réactions nonspécifiques de ces deux sondes radiomarquées sur 105 parasites de 3 souches deT. congolense "Savane" dont 1/148 et 4 souches de T. congolense "Galerieforestière". En fait, les auteurs n'on.t pas effectué les études de sensibilité et despécificité dans les mêmes conditions expérimentales. En effet, dans un cas(étude de la sensibilité), les membranes ont été lavées dans un tampon destringence de 1 x SSC et dans le deuxième (étude de la spécificité), elles l'ontété à une stringence de D,lx SSC. Le seuil de détection ainsi observé, dans leursconditions d'hybridation, est de 100 trypanosomes. Nous pensons que desréactions croisées de NRE-372 et de DIL-350 auraient pu exister lors deslavages à de faibles stringences.

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L'un des intérêts de notre étude a été de mettre au point une ou plusieursméthodes très simples de traitement des échantillons en vue d'une détection etd'une identification rapide des, parasites dans le contexte d'infection' chez laglossine. Ainsi, nous avons testé différents protocoles, sur les parasites deculture en évaluant leurs sensibilités et spécificités puis, sur les organes deglossines dans lesquels les trypanosomes se développent.

La technique de Touch~blot (protocole D), consistant à ~aire des toucherssuccessifs par écrasement des intestins et des glandes salivaires, semblait'être lamieux adaptée pour traiter les échantillons dans les conditions de terrain. Enmarquage radioactif, ce protocole de traitement des échantillons très simple aété utilisé avec succès sur les intestins de glossines d'infection expérimentale(Kukla et al., 1987) et les intestins de mouche prélevés sur le terrain en Gambie(McNamara et al., 1989) pour détecter les trypanosomes chez 'la glossine.Enfin, William et al. (1988) ont appliqué la même technique sur les intestins dephlébotomes (agent vecteur de la .leishmaniose) d'infection naturelle pourmettre en évidence les leishmanies.

Une technique similaire, consistant à effectuer des dépôts d'insectesentiers ou de parties d'insectes (tête, abdomen) par écrasement sur membrane(technique de "Squash-blot") suivis d'hybridation moléculaire a été décrite pourla détection des espèces d'insectes du complexe Anopheles gambiae, vecteur dupaludisme (Hill et al., 1991) et de phlébotomes (Ready et al. 1988). Hill et al.(1992) ont obtenu des résultats intéressants en marquage non radioactif(marquage indirect à la phosphatase alcaline) pour la détection spécifique desanophèles du complexe Anopheles gambiae. De même, l'application del'hybridation in situ (technique très proche du Touch-blot et Squash-blot) a étéréalisée avec succès, en marquage non radioactif (marquage indirect à labiotine) pour la détection des leishmanies dans le, foie de souris infestéesexpérimentalement (Van Eys et al. 1987).

Les résultats que nous avons obtenus en appliquant le protocole de Il

Touch-blot" ont été décevants. En effet, les sondes NRE-372 et DRI se sonthybridées non spécifiquement avec les organes des glossines saines. De même,l'ajout d'une étape de centrifugation pour éliminer les débris cellulaires pouvantêtre à l'origine des réactions non spécifiques (Protocole E et F) ou l'adjonctiond'une extraction au mélange solvant éthanoVchloroforme (Protocole G) n'ontpas permis d'éliminer ces réactions non spécifiques. Il a fallu procéder à uneextraction au phénol/chloroforme classique (Protocole H) pour éliminer lesréactions non spécifiques existant entre les sondes (NRE-372, DR1) et les

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organes des glossines saines, notamment, les intestins. Cette étape d'extractionn'a donc pu être évitée pour alléger les manipulations.

Les résultats d'hybridation moléculaire des sondes sur les organes desglossines d'infection expérimentale se sont avérés décevants. La sonde DRI nepermet pas la détection des trypanosomes dans les organes positifs (3 intestins)selon l'analyse parasitologique et~ NRE-372 détecte très faiblement l'intestinfortement parasité (seul organe positif en examen microscopique) d'uneglossine. Aucune glossine .parmi les' 16 testées, négative. selon l'analyseparasitologique ne s'est révélée porteuse de trypanosomes en hybridationmoléculaire.

Ces résultats montrent que la technique de marquage enzymatique, dansnos conditions d'hybridation, ne peut être utilisée pour la détection destrypanosomes d.ans le contexte d'infection chez la glossine. En effet, les résultatsdes analyses parasitologiques des glossines n'ont guère été améliorés.

Cependant, les études effectuées sur les ADN purifiés ou sur les parasitesentiers de culture montrent que cette technique d'hybridation moléculaire peutêtre utilisée pour identifier de façon précise les trypanosomes purifiés (culturein vitro ou in vivo). Toutefois, cette étape de culture des parasites limite trèslargement les résultats du fait de la sélection des souches qui s'opère dans lesmilieux de culture (Dukes et al.,' 1991).

La technique de marquage enzymatique présente des résultats très proches(en termes de sensibilité et de spécificité) de ceux obtenus en marquageradioactif par Kukla et al. (1987) et Gibson et al. (1988) sur les ADN purifiéset sur les parasites de culture. De mêine, Lopez et al. (1988) ont obtenu desseuils de détection identiques avec les sondes génomiques permettant ladétection des leishmanies (parasites purifiés) pour le marquage radioactif et ~e

marquage non radioactif. Hill et al. (19~1) décrivent les mêmes résultats sur lesADN des anophèles du complexe Anopheles gambiae.

Par conséquent, cette approche peut être utilisée en complément desétudes des isoenzymes, de fragmentation par des endonucléases de restriction(RFLP), de karyotypie moléculaire pour la caractérisation des souches detrypanosomes après leur multiplication in vivo ou in vitro. Cette méthodologie'a été déjà utilisée pour la caractérisation des leishmanies (Van Eys et al., 1989,1991; Ghablib et al., 1992); des trypanosomes de T. brucei (Mathieu Daudet etal., 1994) et de Trypanosoma cruzi (Brénière et al., 1992). .

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Dans son étu~e comparative des techniques d'hybridation des son~es

nucléiques radioactives à celles utilisant les sondes non radioactives (sondesfroides), Traincart (1988) décrivait le phénomène de "bruit de fond" (réactionsnon spécifiques) comme étant l'un des principaux écueils de l'utilisation dessondes n.on radioactives. Ces réactions non spécifiques sont dues .soit à la sondemodifiée qui réagit de façon non spécifique avec les substances biologiquescontenues dans l'échantillon, soit aux éléments du système de révélation'(Traincart, .1988). Au travers de notre étude, ces réactions non spécifiquesétaient fréquemment rencontrées. Ces observations rejoignent celles de Barker .et al. (1986) sur la détection des leishmanies et de Hill et al. (1991) sur cellesdes anophèles.

Les réactions non spécifiques ont été principalement observées entechnique de marquage enzymatique. Grâce à l'optimisation des conditions'd'hybridation moléculaire, ces réactions non spécifiques ont pu être éliminées.Enfin, le kit enzymatique, comme tous les kits de marquage indirect, dans saconception et sa réalisation, est plus long à mettre en oeuvre; il y a plusieursétapes d'incubation dans dliférentes solutions d'hybridation. Par cons~quent, cekit requiert le strict respect des différentes étapes d'incubation pour avoir desrésultats reproductibles.

En résumé, moins dangereuse et plus facile à mettre en oeuvre que lemarquage radioactif, la technique de marquage non radioactif. présente une trèsfaible sensibilité de détection des parasites dans les organes des glossines. Parcontre elle révèle sur l'ADN purifié et les parasites isolés une sensibilitééquivalente à celle obtenue avec les sondes radiomarquées. La sensibilité de latechnique n'était donc pas suffisamment élevée pour envisager son applicationen épidémiologie. C'est pourquoi nous nous sommes orientés vers la techniqued'amplification d'ADN pour attei~dre les sensibilités requises de 1 à 10parasites.'

La technique de polymérisation en chaîne (PCR) constitue une tecpniqueremarquable dans le domaine de la parasitologie grâce à sa spécificité et sasensibilité. Elle consiste en l'amplification c'est-à-dire la fabrication d'un grandnombre d'exemplaires d'une partie de l'ADN du parasite. C'est cetteaugmentation de la quantité d'ADN qui pennet alors de déterminer la présencedu parasite. Elle présente cependant un inconvénient du fait de sa grandesensibilité: la moindre trace d'ADN peut être amplifié et gêner la mise enévi~ence de l'ADN spécifique.

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L'application de la PCR a pennis d'améliorer le pouvoir de détection etd'identification des trypanosomes africains. En effet, sur le matériel génomiquepurifié, de 0,01 à O,lpg d'ADN (l'équivalent de 0,1 à 1 parasite) et de 1 à 10parasites de culture mélangés à des organes de glossines saines sont détectés parla technique de la PCR. Sur l'ADN purifié des trypanosomes, Moser et al.(1989) et Masiga et al. (1992) ont obtenu des seuils de sensibilité similaires. Cesseuils de détection sont de 10 à 100 fois supérieurs au pouvoir de détection dessondes génomiques (Massamba '& Williams, 1984; Kukla et al., 1987; Gibson etal., 1988).

La sensibilité de détection' peut être améliorée par hybridation après"Southem blots" avec des sondes génomiques (Hennan et al., 1990; Masiga etal., 1992; Brenière et al., 1992; Avila et al., 1993). De cette façon, Masiga et al.(1992) ont décrit l'amplification d'un fg d'ADN (soit l'équivalent de 1/100 degénome parasitaire). Il est certain que la sensibilité de détection destrypanosomes chez la glossine peut être notablement augmentée par cetteméthode. Une autre méthode basée sur une double amplification avec deuxcouples d'oligonucléotides différents, "Nested PCR", permet d'améliorer lasensibilité de détection (Evander et al., 1992). Ainsi, d'excellents résultats ontété obtenus dans la détection du Plasmodium, agent responsable du paludisme(Snounou et al., 1993) dans le sang des sujets humains malades. Cependant, cesmétho.des sont plus lourdes à mettre en oeuvre et ne sont pas envisageables pourl'analyse de nombreux échantillons.

Les oligonucléotldes utilisés dans notre étude : "Br", "Gr' et "Sav"respectivement spécifiques de T. brucei s.l., T. congolense type Galerieforestière et T. congolense type Savane se sont avérés spécifiques (Stevens et al.199~). En effet, aucune réaction croisée des amorces n'est constatée avecl'ensemble des ADN hétérologues que nous avons étudiés. Toutefois, lesamorces "Sav" réagissent avec l'ADN hétérologue (1 ng) de T. congolense typeGalerie forestière. Comme décrit précédemment, la grande homologie desséquences répétées de T. congolense type Galerie forestière et ~avane expliqueces réactions croisées.

Moser et al. (1989), dans l'évaluation de la spécificité des amorces "Br"et "Sav", n'ont utilisé que 20 pg d'ADN cible (T. brucei et T. congolense). Dansleur étude, les températures d'hybridation des amorces étaient de 45°C pour"Br" et 55°C pour "Sav". Dans ces conditions, ces amorces devraient présenterdes réactions croisées avec des quantités de matrices élevées (plus de 20 pg). En

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effet, nous avons constaté que, jusqu'à 60°C de température "d'annealing", lesoligonucléotides "Sav" amplifiaient de façon non spécifique moins de 100 pgd'ADN de trypanosomes de T. brucei et de T. simiae. Tout en gardant une trèsbonne sensibilité, nous avons obtenu les meilleures spécificités à 67,SoC detempérature "d'annealing".

, L'étude de la spécificité sur les organes de glossines saines a mis enévidence l'existence d'amplification des amorces de T.. congolense type"Savane" décrites par Masiga et al., (1992) avec les intestins de mouches; cesamorces étaient composées de 20 nucléotides. Cette étude était effectuée à unetempérature "d'annealing" de 60°C. Des essais effectués à des températuresd'hybridation des amorces plus élevées afin d'éliminer ces réactions nonspécifiques ont été sans succès. En effet, à une température "d'annealing" de6SoC , le sel:lil de détection de la technique est passé de 1 parasite à 10 ou 50parasites bien que la spécificité fût bonne. Ces auteurs n'ont pas décritl'existence de ces réa'ctions croisées. L'absence d'organe de mouches témoins,notamment l'intestin, dans leur étude expliquerait peut-être le fait qu'ils n'ontpas observé ces amplifications non spécifiques. Leurs amorces découlent decelles décrites par Moser et al. (1989). La différence porte sur le nombre denucléotides; en effet, les amorces de Masiga et al., (1992) ont 5 nucléotides demoins que ceux de Moser et coll. Et, l'utilisation de c~s oligonuléotides "Sav"décrits par Moser et al. (1989) nous a permis d'avoir une meilleure sensibilitétout en gardant une bonne spécificité de la technique en utilisant unetempérature d'hybridation des amorces de 67,5°C.

Le couple d'amorces "Br" dérive de l'ADN satellite de 177 pb de T.brucei s.l. décrit par Sloof et al. (1983). Par électrophorèse en champs pulsé,Gibson et al. (1988) ont mis en évidence la similarité de l'ADN satellite de T.brucei et T. evansi. Nous avons, dans notre étude, constaté que lesoligonucléotides "Br" amplifiaient l'ADN de T. evansi avec un seuil desensibilité identique à celui obtenu sur l'ADN de T. brucei. Ces résultatsconfirment ceux obtenus au travers de nombreuses études effectuées sur lesbases de l'électrophorèse d'isoenzymes, du polymorphisme de fractions derestriction et de karyotypie moléculaire montrant le caractère très proche de T.brucei et de T. evansi (Gibso,n et al., 1980; Gibson et al., 1985; MathieuDaudet, 1991). Toutefois, Masiga & Gibson (1990) ont mis au point deuxsondes kinétoplastiques, .repré~entant des fragments d'ADN de minicercles de T.evansi qui ne reconnaissent pas l'espèce T. brucei s.l. TI faut, cependant, noterqu'en plus de l'incapacité de T. evansi à se développer cycliquement chez la

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glossine, ce parasite' est dépou.rvu de maxicercles et, les minicercles présententune hétérogénéité très limitée (l3orst & Hoeijmakers, 1979; Borst et al., 1987).Par conséquent,une distinction de T. brucei sOl. de T. evansi devrait se faire autravers de l'étude de l'ADN de niinicercles.

.L'inconvénient de l'utilisation 'de la PCR est le risque de contaminationpossible par des ADN autres que ceux à analyser, qui, du fait ~e la très gran~e

sensibilité de cette technique, peuvent entraîner de faux positifs, donc' la" surestimation des prévalences réelles. Le produit d'amplification "amplificatlt

est la principale source de contamination des échantillons. Ce phénomène decontamination limite l'utilisation de la PCR dans le diagnostic de routine si unensemble de précautions très rigoureuses ne sont pas prises. Deux protocolesont été mis au point pour éliminer la présence des "amplificats" avant uneamplification génique : le protocole chimique consistant à dénaturer"l'amplificat" aux rayons ultrat-violet après une fixation préalable au"psoralène" (Cimino et al., 1991; Jinno et al., 1991); la technique enzymatiqueprocédant par l'action de l'Uracil-N-glycosylase (U.N.G) .détruisant"l'amplificat" après fixation du nucléotide dUTP à la place du dTTP, cible del'enzyme (Thomton et al., 1992; Hartley & Raschtchain, 1993; Victor et al.,1993). Ces protocoles sont très lourds et contraignants à mettre en oeuvre pourl'analyse en routine de très nombreux échantillons.

Près de 4000 réactions de PCR ont été, au total, effectuées dans la cadrede notre étude. L'approche que nous avons utilisée pour éliminer lescontaminations par "amplificat" a consisté en une séparation physique etgéographique des différentes étapes dans la réalisation de la PCR. Cettedémarche a été adoptée, avec succès, par plusieurs équipes (Kwok & Higuchi,1989; Kicthin et al., 1990; Clavel et al., 1993). En effet, les extractions d'ADNsont faites dans une pièce, la réaction d'amplification dans une autre pièce etl'analyse par électrophorèse des produits d'amplification dans une troisièmepièce. L'ensemble des réactifs nécessaires pour la PCR (eau stérile, lesnucléotides, les tampons de réaction et les amorces) sont aliquotés et conservés àpart. Les cônes pour les pipettes et les tubes eppendorfs sont autoclavés. Lesjeux des pipettes doivent être réservés exclusivement pour la PCR. Aussi, nousavons introduit l'utilisation de la hotte à flux laminaire pour la préparation deséchantillons. Le respect très rigoureux de ces précautions nous a permisd'éliminer de façon très importante les contaminations.

Pour faciliter la mise en o.euvre de la PCR dans les laboratoires peuéquipés, il a fallu adapter cette technique à des applications plus particulières.

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Les faits les plus critiques résidaient dans le traitement et la conservation àtempérature ambiante des échantillons de terrain jusqu'à l'analyse enlaboratoire et dans la simplification de la méthode afin d'éviter les protocoleslongs et fastidieux classiquement utilisés pour extraire et purifier l'ADNgénomique, notamment les étapes nécessitant, une réfrigération et/ou unecongélation.

Le trifJ.uoroacétate de césium· (CsTFA), composé chaotropique quipermet de conserver le matériel génomique à température ambiante, s'avèrè·très utile dans les conditions de' travail sur le terrain. Ce traitement présentel'avantage d'être très facile à mettre en oeuvre. TI consiste, en effet, à ajouterles réactifs aux échantillons qui peuvent être conservés ainsi en état jusqu'à leuranalyse au laboratoire. Deux suspensions parasitaires provenant d'une culturedu stock Eatro 1125 ont été préparées (104 parasites/ml de PBS) et laissées àtempérature ambiante (25 à 30°C). L'une a été traitée avec du lauroyl sarcosineet du CsTFA. Huit mois après, seul l'échantillon parasitaire protégé par leCsTFA; a pu être amplifié avec une sensibilité équivalente à celle obtenue surles parasites provenant directement des cultures in vitro.

Au total 100 glossines ont été prélevées en Côte d'Ivoire. Soixante dixmouches ont été traitées normalement, les résultats d'amplification ont étéprésentés dans le paragraphe 2.6.2. du chapitre Résultats et discutés ci-dessus.Trente glossines dont 7 portant des parasites dans l'intestin selon l'analysemicroscopique n'ont pas été traités selon le protocole de conservation deséchantillons, faute de produits sur le terrain. Les organes de ces 30 échantillonsont été amplifiés avec les amorces spécifiques de T. brucei s.l. après être restésprès de deux mois à température ambiante. Aucun n'organe de ces glossines nes'est révélé positif.

L'ensemble de ces résultats montrent la fiabilité du protocole detraitement des échantillons.

Le CsTFA a été initialement proposé par Zolg et al. (1988) pour traiterdes échantillons analysés en hybridation moléculaire. Cette méthode appliquée àla détection de Plasmodium falciparum dans le sang humain, permet de révélerde faibles parasitémies de l'ordre de 50 hématies infectées/ml de sang aprèsconservation des échantillons à température ambiante durant 8 mois (Oury,1989). Dans notre cas, l'analyse par PCR d'échantillons conservés durant 8mois permet de détecter jusqu'à un parasite. La facilité de mise en oeuvre dutraitement des échantillons par le CsTFA, son faible coût et la sensibilité dedétection obtenue sur les organes de mouches rendent cette méthode adaptée autravail de terrain.

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La guanidine (compo~é dénaturant les protéines dont les DNAses),permettant aussi de conserver l'ADN à température ambiante, a donné desrésultats intéressants en PCR sur le sang des sujets atteints de la maladie deChagas (Avila et al., 1993).

La sensibilité de la PCR sur les différents organes ainsi traités demouches d'infection expérimentale a été évaluée en comparaison avec celleobtenue par examen microscopique.

L'étude de l'infection expérimentale des glossines G. m. morsitans et G.f. fuscipes a permis d'évaluer les potentialités vectorielles de G. f. fuscipes dansles conditions expérimentales en comparaison avec celle de G. m. morsitans, quiest l'espèce de référence dans la mesure où· elle s'infeste très facilement. Lesrésultats de l'analyse parasitologique ont montré une différence des tauxd'infection entre les deux espèces de glossines. En infection simple de T. b.brucei, 41,66% de G. m. morsitans et 0,86% de G. f. fuscipes se sont révéléesparasitées; en mono infection T. congolense, les prévalences observées ont étéde 54,83% pour G. m. morsitans et 4,34% pour G. f. fusCipes. Enfin, eninfection mixte (T. b. brucei et T. congolense), 50,64% et 1,94% ont été lestaux d'infection respectifs de G. m. morsitans et G. f. fuscipes (Dia, 1993).

Des résultats similaires ont été obtenus sur la capacité de G. m. morsitansà transmettre T. b. brucei (Makumyaravi et al., 1984). L'espèce G. m.morsitans s'infeste très facilement aussi bien dans la nature qu'en insectarium(Robert & Lyman, 1981; Nitchman & Jacquiet, 1990). De faibles tauxd'infection ont été aussi décrits chez G. f. fuscipes infestées expérimentalementavec T. congolense (Tchicaya, 1984; Jacquiet, 1989). Dans les zones d'endémieoù circule principalement G. f. fuscipes, .sont observées de fortes prévalences detrypanosomoses humaines et animales en opposition avec de très faibles tauxd'infection chez cette glossine (Dukes, 1936; Willet, 1964; Harley, 1966; VaJ:.lVegten, 1971; Leak et al., 1993; D'Amic~, 1993).

Notre étude met en évidence une forte proportion de glossines, ne portantpas de trypanosome selon l'analyse parasitologique mais parasitées selon latechnique de PCR. En effet, au total pour tout type d'infection confondu(simple ou mixte), près de 94% de G. m. morsitans et 70% de G. f. fuscipes,chez lesquelles aucun trypanosome n' a été détecté par l'analyse microscopique,ont présenté des résultats positifs en technique de PCR. Ces résultats tendent àremettre en cause la faible capacité de l'espèce G. f. fuscipes à pouvoirs'infester. Bien que moins parasitée que G. m. morsitans, G.f.fuscipes sembleêtre un bon vecteur de trypanosomes au regard des résultats de la PCR. Elledoit probablement avoir de faibles charges parasitaires, inframicroscopiques

146

que seule la PCR pe~et de mettre en évidence. Par conséquent, le rôle et "laplace qu'occupe G. f fuscipes dans la transmission de la maladie seraient àreconsidérer.

Ces premiers résultats encourageants nous ont autorisés à appliquer cettetechnique. sur les échantillons traités de mouches récoltées lors d'enquêtesépidémiologiques sur le terrain (au Congo et en Côte d'Ivoire). Ainsi, lesdifférents organes de glossines d'infection naturelle, dont nous discutons lesrésultats ci-liprès ont été traités. sur le lieu de prélèvement selon le protocole deconservation du matériel génomique. Elles sont restées à température ambiante(30 à 35 oC en moyenne) pendant 1 à 3 mois jusqu'à leur acheminement àMontpellier par colis postal normal.

Sur la base des analyses parasitologiques, seules 2 glossines parmi les 93récoltées au Congo ont été trouvées infestées. Chez la première mouche, un sèul "trypanosome a été observé dans l'intestin et chez la deuxième, l'intestin et leproboscis étaient parasités. Par rapport aux critères de détection etd'identification des trypanosomes classiquement utilisés, les "trypanosomes neseraient pas identifiés chez la première mouche et, l'espèce· T. congo'ense ouT.simiae serait présente chez la deuxième glossine. Donc, aucune infection à T.brucei n'aurait pu être mise en évidence. La technique de PCR révèle un tauxd'infection de 7,52% par T. brucei s.l. et de 10,75% par T. congolense.Cependant, aucune amplification, quelque soit l'organe analysé, n'a été observéechez la mouche chez qui l'analyse parasitologique avais mi~ en évidence la

. présence d'un trypanosome dans l'intestin. Chez la glossine dont la trompe etl'intestin ont été trouvés parasités suite aux examens microscopiques, les glandessalivaires ont présenté des signaux d'amplification spécifiques de T. brucei s.l. ;le proboscis et l'intestin étaient trouvés porteurs de T. congolense. Au total, surles 93 glossines analysées en PCR, deux d'entre elles ont été trouvées porteusesd'une infection mixte à T. brucei s.l. et T. congolense.

Le foyer de Boko-Songho est l'un des foyers les plus iinportants duCongo. Des prévalences très élevées de la maladie du sommeil sont rencontréeschez l'homme (10% dans certaines zones). Les animaux sont très faibl~ment

infestés par T. brucei s.l.; en effet, ces taux d'infection sont nettementinférieurs à 1 %. Il est postulé que l'homme est lui même le réservoir de lamaladie. Par conséquent, la transmission est de type Homme-Glossine-Hommeet le"rôle de l'animal serait très minime (Frézil, 1983; Noireau et al., 1986 b).Dans le foyer de Boko-Songho, les prévalences glossiniennes à T. brucei s.l. deprès de 8% déterminées par PCR montrent réellement la potentialité qu'ont lesglossines à transmettre la maladie chez l'homme, bien que nous ayons

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uniquement mis en évidence la présence de T. brucei s.l.. Cependant, sur la basedes études d'isoenzymes et de RFLP, toutes les souches de T. 'brucei s.l.prélevées chez les animaux au Congo sont très proches de T. b. gambiense; lasous-espèce T. b. brucei se révèle être absente au Congo (Scott et al., 1983;Noireau et al., 1989, Truc, 1991). Ainsi, nous pouvons avancer que les 8% deT. brucei s.l. observée chez les glossines seraient, en réalité, tous des T. b.gambiense. Par conséquent, ces infections glossiniennes pourraient expliquer les-très fortes prévalences de la THA observées au Congo.

En Côte d'Ivoire, 15 glossines sur 70, d'après la techniqueparasitologique, ont été positives. Deux mouches avaient des trypanosomes dansl'intestin et le proboscis, ce sont des infections typiques de Nannomonas. Treizeglossines avaient des trypanosomes dans l'intestin seul, ce qui correspond à desinfections immatures dont la caractérisation au niveau spécifique voire mêmesous-générique ne pouvait être avancée selon la technique microscopique.L'amplification génique met en évidence des taux d'infection de 30% et de41,42% respectivement pour T. brucei s.l. et T. congolense. Plus de la moitiéde~ mouches sont trouvées infestées par la technique de la PCR. Les 2glossines révélant une mono infection de type Nannomonas selon l'analyseparasitologique ont présenté des amplifications spécifiques de T. britcei s.l. etde T. congolense; Six glossines sur les 13 ayant des infections immatures ontprésenté des infections mixtes à T. brucei s.l. et à T. congolense par latechnique de la PCR. Enfin, près de 40% des glossines négatives en analysemicroscopique se sont révélées positives.

Ces taux d'infection glossini~ns très élevés suscitent quelques questionssur l'état de la maladie du sommeil dans la zone étudiée (Boblénou). Elle estsituée au sud de Bouaké (10 km) et à proprement parler, elle ne constitue pasun foyer de la trypanosomiase humaine puisqu'aucun cas de maladie n'y a étédécri.t (Laveissière, Fournet, corn. pers.). Cependant, aucune campagne dedépistage actif n' a été effectuée dans cette zone. Ces observations et le fort tauxd'infection glossinien de 30 % en T. brucei s.l. évalué par la technique de laPCR nous amènent à envisager deux cas de figure pouvant se produire danscette zone. Soit, la maladie y est totalement inexistante chez l'homme alors, les30 % T. brucei s.l. chez la glossine seraient des trypanosomes 'non pathogèneschez l'homme et, appartiendraient donc à la sous-espèce T. b. brucei. Lacirculation des parasites s'effectuerait; dans ce cas, entre l'animal et la glossine.Ceci pouvant être soutenu par le fait qu'en Afrique de l'ouest en général et enCôte d'Ivoire en particulier, la sous-espèce T. b. brucei est souvent rencontréechez les animaux domestiques et péridomestiques (Mehlitz, 1986). La deùxième

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hypothèse serait l'existence des T. b. gambiense dans cette zone, donc demalades pauci-asymptomatiques ou porteurs asymptomatiques qui ne peuventêtre détectés que par dépistage actif... Ce phénomène. de porteursasymptomatiques de la maladie du sommeil est très connu en trypanosomiasehumaine· africaine (revue par Frézil, 1983). Par conséquent, ces hautesprévalences glossiniennes de T. brucei s.l., bien qu'elles ne précisent pasl'existence de ~a sous-espèce T. b. gambiense, seule pathogène pour l'homme enAfrique du Centre et de.l'Ouest, reflètent une possible circulati.on de parasites'.entre l'homme et la glossine.

L'hypothèse la plus plausible serait la circulation des trypanosomes entrela glossine et les deux hôtes vertébrés (homme et animal) encore que nous neconnaissions pas les prévalences d'infection chez les hôtes vertébrés dans cettezone.

Les infections de type Nannomonas présentes chez. les animauxdomestiques, notamment les porcs, sont très souvent rencontrées dans·différentes zones d'endémie sommeilleuse, avec des taux atteignant environ 20% au Congo (Frézil, 1983; Noireau, 1986 a) et près de 50 % en Côte d'Ivoire(Penchenier, 1987) principalement sur la base des techniques parasitologiques.Ces fortes prévalences soulignent d'une part, la susceptibilité de ces animaux àêtre infestés par T. congolense et/ou T. simiae et d'autre part, la grandecirculation de ces parasites entre la glossine et l'animal. Les forts tauxd'infection, si on ne considère que les infections de T. congolense de typeSavane et de type Galerie forestière, des glossines du Congo (près de 10%) etde la Côte d'Ivoire (près de 40%) montrent l'existence d'une forte transmissionde parasites. entre la glossine et l'animal. Ceci est d'autant plus vrai que denombreuses études de comportement alimentaire des glossines mettent enévidence une préférence trophique très élevée de G. p. palpalis pour lesanimaux domestiques et notamment le porc aussi bien qu'au Congo (Frézil,1983; Gouteux et al., 1992; Noi.reau et al., 1986. b; Force-Barge, 1991) qu'enCôte d'Ivoire (Laveissière & Rervouet, 1991).

Environ 65 % d'infections des glossines à T. congolense observées àBoblénou sont de type "Galerie forestière". A Boko Songo, 90 % d'infection deT. congolense appartiennent au type "Savane".Ces résultats sont confonnes auxcaractéristiques phytogéographiques des zones étudiées. En effet, Boblénou etBoko Songo correspondent respectivement aux zones forestières et de savane:Ces observations sont en rapport avec celles de nombreux travaux, portant surl'analyse des isoenzymes et mettant en évidence une répartitionphytogéographique des trypanosomes de T. congolense en fonction des zones

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de "Savane", de "Galerie for~stière" et de "Kilifi" (Young & Godfrey, 1983;Gashuma, 1986; Gashuma et al, 1988; Knowles et al., 1988). Le type Kilifi,initialement décrit sur la côte kenyane, a été mis en évidence en Ougadan(Nyéko et al., 1990) et en République Centrafricaine (D'Arnico, 1993). Enfin,le groupe "Tsavo" a été récemment mis en évidence au Kenya (Majiwa et al.,1993). Il n' y a pas encore de données suffisantes pour établir sa répartitiongéographique.

Sur' la base des examens parasitologiques, les glossines mâles sonttrouvées, dans la plupart des cas, plus infestées que les femelles dans lesconditions de laboratoire (Maudlin et al., 1991). Nous avons obtenu desrésultats comparables sur les mouches G. m. morsitans et G. f., fuscipesinfestées expérimentalement (Dia, 1993). Cependant, dans les conditions deterrain, les femelles sont plus infestées que les mâles (Clarkes, 1965; VanVegten, 1971; Distelman et al., 1982; D'Amico, 1993). Sur la baseparasitologique, des résultats similaires ont été obtenus sur les' glossinesprélevées en Côte d'Ivoire. De même, les deux glossines du Congo portant destrypanosomes sont des femelles.

Les résultats obtenus en technique de polymérisation en chaîneconfirment les constatations faites sur la base des analyses parasitologiques. Eneffet, les mâles sont plus parasités chez les glossines infestéesexpérimentalement par T. brucei. En infection expérimentale mixte (T. bruceiet T. congolense), les différences observées ne sont pas statistiquementsignificatives; ceci étant dû au fait que ces glossines sont trouvées très parasitées(entre 85 et 100%). En ce qui concerne les glossines de terrain, les femellessont plus infestées que les mâles.

Dans son étude de 1971, Van Vegten avança deux hypothèses pourexpliquer les taux d'infection plus élevés des femelles: (i) un besoin alimentaireplus élevé chez les femelles qui entraîne des repas sanguins plus légers mais

. ,

répétés; (ii) la longévité plus importante des femelles.L'implication des hormones intervenant lors du cycle de reproduction

chez les femelles pourrait jouer un rôle dans la différentiation et lamultiplication parasitaire.

Cependant, aucune explication valable ne permet de rendre compte destaux d'infection plus élevés des glossines mâles dans les conditions delaboratoire.

Les amorces et les sondes génomiques utilisées jusque là ne permettentpas l'identification sub-spécifique des trypanosomes de l'espèce T.· brucei s.l.

150

Ainsi, une distinctio~ entre T. b. brucei '(pathogène chez l'animal) et T. ~.

gambiense (pathogène chez l'homme) ne peut être réalisée. Le statut réel destrypanosomes appartenant au "complexe brucei" a été longtemps controversé;de nombreux travaux portant sur la spéciation ou la sous-spéciation au sein deT. bruce( s.l. abondent dans la littérature (cf. paragraphe 1.1. du chapitre"Généralités et Rappels"). Le groupe l est homogène et rassemble 80 à 90% destocks de T. b. gambiense prélevés chez -l'homme et, le groupe II est trèshétérogène, _il comporte à la fois des stocks prélevés chez l'homme et chezl'animal (Gibson & Wellde, 1985; Scott et al., 1983; Zillman et al., 1984;Mehlitz, 1986; Truc, 1991; Mihok et al., 1990; Mathieu Daudet, 1991).Certains stocks de T. brucei provenant d'animaux présentent, toutefois, sur labase des études isoenzymatiques, un profil de type "groupe l'' (Scott et al.,1,983; Mehlitz, 1986; Richner et al., 1989; Truc, 1989).

Récemment, Bromigde et al., (1993) ont mis au point des'oligonucléotides permettant de détecter les trypanosomes appartenant au groupel de T. b. gambiense. Ces oligonucléotides correspondent à des -séquencesportées par les gènes de l'antigène variable de surface. Leur seuil de détectionsur de l'ADN purifié est de 10 pg soit l'équivalent de 100 parasites. Nous avonsobservé que le seuil de détection diminue d'un facteur de la entrel'amplification de l'ADN purifié et de l'ADN et celle des trypanosomescontenus dans les organes de glossines. Par conséquent, le pouvoir de détectionde ces amorces dans le contexte d'infection chez la glossine serait plutôt plusproche de 1000 trypanosomes. Ce seuil de détection est t,rop faible pour

-envisager l'utilisation de ces amorces dans la détection et l'identification destrypanosomes chez les glossines faiblement parasitées.

De façon surprenante, des infections à T. congolense ont été mises enévidence dans les glandes salivaires des mouches d'infection expérimentale etnaturelle. Classiquement, le cycle biologique de T. congolense se limite dansl'hypopharynx après un passage dans l'intestin moyen et le 'labre. Troishypothèses peuvent être avancées pour expliquer ce phénomène :

(i) les trypanosomes ne limitent pas leur développement dans de~ sitesclassiquement décrits en fonction du sous-genre auquel ils appartiennent. Eneffet, de nombreuses' études cytologiques montrent que des trypanosomessuivent d'autres voies que celles couramment décrites chez la glossine.Mshelbwala (1972) et Otieno (1983) ont mis en évidence Trypanosoma bruceidans les cellules épithéliales et dans la couche basale de l'intestin moyen desglossines. De plus, des infestations de glossines ont été effectuées en inoculantles trypanosomes de T. brucei dans'l'hémocoèle (Otieno et, al., 1976). Enfin, T.

151

congolense a été mis en évidence dans les cellules épithéliales de l'intestin desglossines et dans les replis de la membrane péritrophique (Kaddu et Mutinga,1980 a,b; 1983; Ladikpo & Seureau, 1988). D'Arnico (1993) a décrit laprésence de T. corigolense dans les glandes salivaires parasitologiquementpositive des deux glossines naturellement infestées. Ces résultats n'ont pas été.pris en compte par l'auteur dans la mesure où ces deux échantillons n'ont pasprésenté de réaction d'hybridation avec une sonde génomique ribosomialereconnaissant une séquence conservée de trypanosomes. Cependant, près de 30% des glossines portant des trypanosomes sur la base de l'analyseparasitologique n'ont pas réagi avec cette sonde dite "universelle". Ainsi, nousentendons nuancer le jugement de .l'auteur. Plus récemment, Gidudu (1995) amis en évidence la présence les trypanosomes de T. congolense dans les féces deglossines (G. m. morsitans et G. tachinoides) infestées expérimentalement. Cestrypanosomes étaient sous forme non infestante (procyclique) et étaient

. généralement trouvés morts. Ces observations sont en désaccord avec laconception classique selon laquelle, les trypanosomes de T. congolense gagnentle proboscis après un passage dans l'intestin moyen. En effet, leur présence dansles féces montrent que parfois, ils passent dans l'intestin postérieur avant d'êtreéjeèter dans les féces, comme c'est le cas des parasites de la section Stecoraria(T. cruzi); ces derniers étant sous forme infestante (trypomastogotemétacyclique).

Les résultats décrivant de nouvelles localisations des trypanosomes chez laglossine restent encore très fragmentaires. En effet, la plupart des études dedétection et d'identification des trypanosomes utilisant les techniques modernes

. d'hybridation moléculaire et de la PCR, se limitent aux organes classiquementreconnus comme étant des sites d'hébergement des trypanosomes (proboscis,intestins et glandes salivaires).

D'autres sites, moins classiques, ne sont donc pas à exclure. Ces sitesn'héb.ergeant pas nécessairement des parasites en voie de multiplication,devraient présenter des parasitémie très faibles. Vu la sensibilité de la techniquede PCR, ces très faibles parasitémies peuvent être révélées..

(ii) la contamination d'un organe par un autre n'est pas exclure. En effet,la dissection d'un intestin fortement parasité peut entraîner le passage destrypanosomes vers un organe non parasité. Ce pourrait être le cas des glandessalivaires trouvées contaminées par T. congolense. Cependant, nous avons pumettre en évidence, par la technique de la PCR, quelques cas où seules lesglandes salivaires se sont révélées parasitées par T. congolense.

(iii) l'analyse parasitologique et la technique de la PCR ne décrivent pasle même phénomène. L'examen microscopique met en évidence les parasites

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vivants et leur mobilité facilite la détection. La technique de la PCR, dans saconception, détecte du matériel génomique de parasite. Rappelons qu'il suffitqu'un organe contienne au moins 10 parasites vivants ou en voie de lyse pourprésenter un résultat positif en PCR. Ce qui peut être les cas de T. vivax et deT. congolense quand ils migrent de l'hypopharynx où ils se multiplient vers lesglandes salivaires où ils ne peuvent survivre. Deplus, au cours d'une infectionchez ·la glossine et notamment au cours des infections intestinales de typeTrypanozoon et Nannomonas .présentant de fortes parasitémies, les. .

trypanosomes doivent très probablement gagner l'hémolymphe où ils nepeuvent survivre. Etant donné que les glandes salivaires des glossines baignentdans l'hémolymphe, l'ADN des parasites en voie de lyse se trouvant sur cesglandes salivaires, peut être prélevé lors de sa dissection et être mis en évidencepar la technique de la peRo

Trois couples d'amorces différents. ont été utilisés. Pour des raisonssurtout de sensibilité, èhaque couple d'oligonucléotides est amplifié séparément.Par conséquent, pour une glossine testée, 9 amplifications différentes sontréalisées. Au total, 630 PCR ont été faites sur les 70 glossines de la Côted'Ivoire et 837 sur les 93 du Congo. Nous devons rappeler que nous n'avonsrecherché que les infections de T. brucei s.l. et celles de T. congolense (typé"Savane" et "Galerie forestière) chez les glossines. Dans. ces zones d'Afrique, enplus de ces deux espèces de parasites, circulent T. vivax, T. simiae, T.congolense type "Kilifi" et "Tsavo", Typanosoma godfreyi et Trypanosomagrayi (parasite de crocodile, à transmission de type stercorariale, Hoare, 1972).

. En somme, pour une mouche, il aurait fallu 27 réactions d'amplificationgénique différentes; ce qui limite très largement une étude épidémiologique àtrès grande échelle. Nous avons, au travers de notre étude, mis en évidence deslocalisations des parasites dans de nouveaux sites chez la glossine. Toutes cesraisons nous amènent à proposer de réaliser le test de la PCR sur les glossinesentières. L'avantage' serait de pouvoir concentrer d'éventuel matérielgénomique, d'élargir l'échantillonage avec la possibilité d'évaluer plusieursamorces différentes.

La grande sensibilité et la spécificité de détection de la technique de laPCR devrait nous permettre <:le répondre à deux grandes questions : latransmission mécanique et l'étude du réservoir animal de la maladie en Afriquecentrale.

Depuis fort longtemps, le problème de la transmission mécanique destrypanosomes par des insectes comme les stomoxes et les tabanides est connu

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(Bouet & Roubaud, 1912; Bux~on, 1955; Hoare, 1972). C'est le cas de T. evansien Afrique et d'autres parties du monde (Hoare, 1972) et T. vivax enAmérique du Sud (Hoare, 1972; Desquesnes, ·1992; Gardiner, 1992). Dans lesconditions expérimentales, la trànsmission mécanique de T. congolense et T.brucei s.l. a été démontrée (Foil, 1989; Straif et al., 1990). Dans les conditionsde terrain, l'existence de la transmission mécanique de ces deux espèces estsimplement supputée pour expliquer certaines situations épidémiologiq~~s

(Wiesennhutter, 1976; Foil, 1989; D'Arnico, 1993). En effet, aucune étude n'aété effectuée, dans les conditions naturelles, pour évaluer l'importance de cephénomène. Ceci est essentiellement dû à l'extrême difficulté de mettre enévidence, par l'analyse microscopique, la présence des parasites dans lestrompes des insectes incriminés. Etant donné, la grande sensibilité de détectionde la technique de la PCR, la transmission mécanique pourra être estimée à sajuste valeur dans différents faciès épidémiologiques des trypanosomoses..

Les travaux de Mehlitz (1986) ont clairement montré l'existence duréservoir animal à T. b. gambiense en Afrique de l'Ouest. La lutte contre laTHA dans cette z<?ne d'Afrique tient compte de l'existence des animauxdomestiques ou péridomestiques pouvant héberger T. b. gambiense .

En Afrique Centrale, les animaux domestiques ou péridomestiques nesemblent pas jouer le rôle de réservoir de la maladie. En effet, les tauxd'infection à T. brucei s.l. chez des animaux sont inférieurs à 1 %, parconséquent , l'homme serait lui même le principal réservoir de la THA (Frézil,1983; Noireau et al., 1986 b, 1989). Ces constatations ont été faites sur la basedes analyses parasitologiques. Vu la sensibilité et la spécificité de la techniquede polymérisation en chaîne, les prévalences en T. brucei s.l. chez des animauxdevraient se révéler beaucoup plus importantes que celles observées parl'analyse parasitologique. Par conséquent, le rôle de l'animal dansl'épidémiologie de la maladie serait à reconsidérer dans cette zone d'Afrique.

De nombreuses études décrivent le pouvoir de la PCR à quantifier lesmicroorganismes infectieux chez leurs hôtes (peccoud, 1993). Chez la glossine,l'évaluation de la parasitémie, par la technique microscopique, des différentsorganes est très aléatoire. Ainsi, les charges réelles des parasites chez la glossinen'ont jamais été estimées. La technique de la PCR devrait offrir l'avantage depouvoir quantifier les parasitémies dans différents organes de glossines.

154

CHAPITRE VI : CONCLUSIONS ETPERSPECTIVES

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

TI Ya 30 ans environ, la Trypanosomiase humaine africaine faisait partie,à travers toute l'Afrique, des maladies que les différents services de santé ont sujuguler. Cependant, à partir des années 80, une recrudescence est constatée danstoute le'zone intertropicale.

La mouche tsétsé, vecteur de la maladie, en est le responsable principal,de par son pouvoir de transmission des trypanosomes chez l'hôte vertébré. La

. mise en évidence des trypanosomes s'effectue sur la base d'une analysemicroscopique; cette démarche manque de sensibilité. La précision desméthodes de détection et d'identification des parasites chez la glossine est d'unintérêt majeur dans l'étude des différents faciès épidémiologiques de la THA.

L'utilisation des sondes génomiques en marquage radioactif a donné debons résultats sur les échantillons d'infection expérimentale et naturelle. Nousmontrons, dans notre travail, que la technique de marquage non radioactif n'estpas utilisable pour la détection des trypanosomes chez la glossine, à cause de sonmanque de sensibilité.

Nous décrivons l'application de la technique d'amplification génique enchaîne sur les glossines de laboratoire et de terrain.

G. f fuscipes, dans les conditions de laboratoire, s'est révélée être un bonporteur de trypanosomes selon la technique de la PCR. Ces résultatscontredisent ceux obtenus sur la base des analyses parasitologiques dans lesconditions expérimentales et les conditions de terrain. Ainsi, son rôle dans denombreux contextes épidémiologiques est très certainement non évalué à ~a

juste valeur.

TI s'est toujours posé, dans les conditions de terrain, le problème de laconservation des échantillons. Dans ces pays très pauvres, il est très difficile demaintenir une chaîne de froid du lieu de prélèvement des échantillonsbiologiques au laboratoire d'analyse. La méthode, très simple, de traitement et.de conservation du matériel génomique que nous avons mise au point s'estrévélée d'une grande importance. En effet, les contraintes liées au trav~il sur leterrain (au Congo et la Côte d'Ivoire), ont ainsi pu être évitées. Et, l'utilisationde cette méthodologie, évaluée chez l'hôte invertébr~, peut être appliquée de lamême façon, sur les prélèvements des échantillons de sang (homme ou animal).

155

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Au Congo, de' 2,15 % en analyse parasitologique, le taux d'infection' deglossines est passé à 17,20%. En Côte d'Ivoire, les taux d'infection sont de21,42 % (technique microscopique) à 57,14% (technique de la PCR). Cesrésultats,montrent clairement la sous-estimation par l'analyse microscopique desprévalences des glossines.

Cette. technique, de par sa grande sensibilité de détection, a mis enévidence des pourcentages très élevés des glossines infestées dans les deux zones·d'endémie étudiées. li nous paraît prioritaire, à la lumière des résultats obtenus,d'orienter la lutte de la maladie du sommeil vers la réduction du nombre desglossines dans les zones concernées couplée, évidemment, à un dépistage actifsuivi de soins thérapeutiques des malades.

Différents types de luttes contre les glossines sont décrits dans lalittérature: la lutte biologique (utilisation des prédateurs), chimique (utilisationdes insecticides), génétique (avec des mâles stériles) et enfin, la lutte parpiégeage. De toutes ces méthpdes, le piégeage offre l'énorme avantage d'êtresimple et très peu onéreux. De nombreux pièges ont été mis au point pour lalutte contre les glossines (Cuisance, 1989). Le système de piègeage le plusefficace a été celui décrit par Challier & Laveissière (1973). Ce piège estactuellement le plus utilisé à travers toute l'Afrique. Dans de nombreux foyersde la THA, des réductions importantes et des éliminations d~s populations deglossines ont été observées, parfois en moins d'une année (Frézil, 1983;Laveissière & Hervouet, 1991; Force-Barge, 1991).

Très récemment, en Ouganda, sur une superficie de près de 3.000 km2, laTHA a été contrôlée grâce à l'utilisation du système de piègeage (Challier­Laveissière); ainsi, plus de 600000 personnes sont protégées (Lancien, 1993).

Les techniques de détection et d'identification de trypanosomes chez laglossine ont beaucoup progressé depuis près de 10 ans. Les analy.sessérologiques et parasitologiques, depuis fort longtemps, ont fait leur .preuvedans le diagnostic de la maladie chez l'homme. Les traitements thérapeutiquesefficaces sont disponibles de nos jours. li y a 12 ans Frézil (1983) écrivait" ilexiste déjà toutes la technologie nécessaire à l'élimination de la maladie dusonimeil". Aujourd'hui, avec le développement de la biologie moléculaire, latechnologie contre la THA est beaucoup plus performante. Cependant, force estde constater que la THA reste un véritable problème de santé publique dans denombreux pays d'Afrique.

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Nous avons réalisé cette étude en France, dans un pays développé.L'application de la technique de la PCR doit être placée dans le contexte despays du tiers monde. Le déclin économique sans précèdent, le manqued'organisation que connaissent ces pays expliquent la recrudescence de la THA.Vu le coût de la technique, nous ne pensons pas, dans le contexte actuel, que latechnique de la PCR puisse êt~e utilisée en routine en ·Afrique. Nous avons

.. estimé à près de 5 pp (franc français) le prix d'une réaCtion de polymérisationen chaîne. Un tel prix est rédhibitoire pour ces pays d'Afrique pour y envisagerl'utilisation de la technique de la PCR en routine. A titre comparatif, au Congo,par exemple, l'Etat consacre dans le domaine de santé, moins de 5 pp parhabitant par an. En Ouganda, une 'personne par an est protégée de la maladie dusommeil par piègeage des glossines avec 2,5 pp (Lancien, 1993).

Par conséquent, vu le coût la technique de la PCR, l'accent sera mis surla lutte contre les glossines dans des foyers actifs de la THA.

Cet outil de la PCR, par sa grande sensibilité et spécificité, devraitpermettre aux épidémiologistes de répondre aux nombreuses questions qui seposent sur le terrain, en Afrique: il s'agit de l'évaluation précise des foyers peuactifs ou résiduels, de la place qu'occupe la transmission mécanique, et la miseen évidence des reservoirs animaux de la THA.

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171

ANNEXES

ANNEXES

Annexe 1

Milieu de culture CMEM

MEM* 9,4 g

Cunnigham** 500 ml

HEPES 5,96 g

NaHC03 2,2 g

L-glutamine 0,292 g

L-proline ·0,012 g

pH (NaOH ou HCI) 7,2

q.s.p. IL

Le mileu est filtré sur une membrane de 0,22 JlIIl. Il est mis ensuite à testerpendant 48 h dans une étuve à 37°C. Avant son utilisation, 20% (v/v) de sérum deveau foetal (SVF)*** sont ajoutés.

* GmCOBRL réf. 072-01700** Milieu décrit par cunnigham, (1977). Il est préparé dans notre laboratoire

avec les produits fournis par SIGMA.*** Dutsher réf. 01-01501

172

Annexe 2

Milieu de culture KIVI

NaCI 8g

KCI 0,40 g

CaC12,2H20 0,25 g

MgS04,7H20 0,20 g

Na2HP04, 12 H20 0,15 g

KH2P04 0,06 g

NaHC03 1 g

Lactalbumine* 3g

Tryptose** 1 g

Biotine (0,002% v/v)*** 1 ml

Hb***** (BBB 2%) 150 ml

Penicilline 200.000 u

Streptomycine 200.000 u

pH (NaOH ou HCI) 7,2

q.s.p. IL

Comme le milieu CMEM, le KIVI est filtré, testé et supplémenté de 20% deSVP avant utilisation.

* SIGMA réf. L4896** SIGMA réf. T4532*** SIGMA réf. B4639**** DIFCO réf. 0136-02-5

173

ADNARNDMSODNaseEDTANa2ELISAfgggh1MmgmnmlmMngplvpbpgqspRNasesSDSTETrisVoCIII

Annexe 3

Abbréviations

Acide désoxyribonucléotideAcide ribonucléotideDiméthylsulfoxydeDésoxyribonucléaseEthylène diamine tétra acétate de sodiumEnzyme Linked Immunosorbent AssayFemtogrammeGrammeL'accelérationHeureLitreMolaireMilligrammeMinuteMillilitreMillimolaireNanogrammePoidsNolumePaire de basesPicogrammeQuantité suffisante pourRibonucléaseSecondeSodium dodécyl sulfateTris-Hel, EDTA .Tris (hydroxyméthyl) arninoéthaneVolumeDegré CelsusMicrolitre

174

Annexe 4

"Composition des différents tampons utilisés

1. PBS

NaCINaH2P04Na2HP04

pH

2. PSG

PBS + 1% (g/v) glucose

3. TEN

44 mM3mM

57 mM8

Tris ·100 mMNaCI 1,5 mMEDTA 0,5 mMpH (HCI) 8,5

4. SSC 00 x)

NaCI 150 mMCitrate de Trisodium 15mM

5. TE

Tris 10 mMEDTA ImM

pH (HCI) 8

6. STE

Tris " lQmMEDTA ImM

pH (HCI) 7,8

7. Tampon anticorps

Tris 100 mM;NaCI 150 mM"

pH (HCI) 7,5

175

8. TAE

Tris-acétateEDTA

pH (ac~acétique)

176

40 mM2mM ..

8,5

Annexe 5. Résultats d'amplification génique des organes de mouches infestées expérimentalement par T. b. brucei. Lesphotos A, B, et C représentent respectivement les amplifications des intestins, glandes salivaires et proboscis. Les pistes2 A et 9 A, 8 B et 10 C représentent les organes positifs selon la technique parasitologique, les autres ne portent pas deparasites selon la même technique. La piste 1 est le témoin positif (1 pg d'ADN de Eatro 1125). Les pistes 14 ( A et B) et

la 13 C représentent les témoins négatifs (organes des glossines saines :intestins, glandes salivaires et proboscis). Le Pmreprésente l'indicateur du poids moléculaire (123 pb DNA ladder, Gibco BRL, USA).

......-.]

-.]

492pb ---.369pb __246pb __

123 pb __

Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

A

Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

B

Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

c

Annexe 6. Résultats d'amplification génique après migration électrophorétique dans un gel d'agarose (1,5%) deproboscis (Pr), glandes salivaires (Gl) et Intestins (In) de mouches infestées expérimentalement par T. b. bruceiet T. congolense "Savane" (Infection mixte). Ainsi, les amplification ont été réalisées en présence des amorcesspécifiques de T. brucei (A) et T. congolense "Savane" (B). Les pistes 2 B (Pr), 5 B (Gl) et 12 B (In) représententles organes des glossines portant des parasites selon l'analyse microscopique, les autres étant négatifs par lamême technique. Le Pm et la piste 1 représentent respectivement l'indicateur de marqueur de poids moléculaire etle témoins positif (1 pg d'ADN de Eatro 1125 (T. brucei) pour A ou 1/148 (T. congolense) pour B.

Pm 1 :% J 4 5 6 7 8 9 10 11 11 13 14 15 Pm 1 :% J 4 5 6 7 8 9 10 11 11 13 14 15......-..l00 A

492 pb ----.369 pb ----.

246pb--'123 pb--.

Pm 1 :% J 4 5 6 7 8 9 10 11 11 13 14 15

GI

~ln

B

492pb----.369 pb --.

246 pb --.123 pb--.

Annexe 7. Photos de gel d'agarose 1,5% montrant les amplifications de proboscis (Pr), glandes salivaires (GI) etintestins (In) des glossines provenant du Congo avec les oligonucléotides spécifiques de T. brucei (A), de T.congolense "Galerie forestière" (B) et de T. congolense "Savane" (C). Les pistes 12 B (Pr) et 5 B (In) sont lesorganes positifs selon l'examen microscopique et les autres, sont négatifs selon la même technique. Les pistes Pm,1 et 16 représentent respectivement le marqueur de poids moléculaire, les témoins positifs et les témoins négatifs.Pour la photo B, le témoins positif est 1 pg de ANR3. Aucune glande salivaire ne s'est révélée positive entechnique de la PCR en présence des amorces spécifiques de T. congolense "Galerie forestière".

Pr GI In

• • •Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A

492pb --+369 pb --+246pb --+l:lj pD --+

B

492pb --..369 pb --..246 pb --.123 pb --.

Annexe 8. Photos montrant les amplifications de proboscis (Pr), glandes salivaires (01) et intestins (In) desglossines provenant de la Côte d'Ivoire avec les oligonucléotides spécifiques de T. brucei (A), de T. congolense"Galerie forestière" (B) et T. congolense "Savane" (C). Les pistes Il B (Pr), 13 A (In), 9 B et 12 B (In)représentent les organes positifs selon l'analyse microscopique, les autres sont négatifs par la même technique.Les pistes Pm, 1 et 16 représentent les mêmes abbréviations que celles décrites dans l'Annexe 7. Aucun proboscisn'a présenté une amplification avec les amorces spécifiques de T. brucei s.l.

.-.00o

Pr

Pm 1 23 4 56 7 89 10 11 12 13 14 15 16A

4?2pb

369 pb246 pb123 pb

Gl

Pm 1 23 4 56 7 8 9 10 Il 12 13 14 IS 16

In

Pm 1 23 4 56 7 89 10 Il 12 13 14 IS 16

B

492 pb -..369 pb ---.246 pb ---.123 pb ---.

c

4?2 pb -..369 pb ---.246 pb ---.123 pb ---.

Annexe 9. Sensibilité de détection de l'ADN purifié des trypanosomes deréférence en hybridation moléculaire avec les sondes génomiqueshomologues en utilisant le marquage enzymatique. 1/148 =T. congolense"Savane"; ANR3=Trypanosoma congolense "Galerie forestière"; BAN 7 = T.simiae; NRE-372, DIL-350, représentent respectivement les sondesgénomiques spécifiques de T. congolense "Savane", "Galerie forestière". NS·600 est la sonde génomique détectant spécifiquement T. simiae. Les témoinspositifs correspondent à l'hybridation de la sonde sur elle même. Les chiffres1,2, 3, 4, 5, 6 représentent respectivement les quantités d'ADN de 1000,500,100, 10, 50 et 1 pg de trypanosomes et 100, 50, 10, 1 et 0.1 pg pour lessondes génomiques.

• •-. NRE-372

-. 1/148 (T. c. "Sav")

654321

NRE-372

-. ANR3 (T. c. "Gf')DIL-350 •

ta e _ • • -. DIL-350

• • •e __ • •-. BAN 7 (T. 5.)

-. NS-600

181

Annexe 10. Photo du film montant la sensibilité de détection et spécificitéobtenues en réaction d'hybridation moléculaire en marquage enzymatiqueavec la sonde NIK-4540 spécifique de T. congolense "Kilifi. 1/148 =T.congolense "Savane"; ANR3= Trypanosoma congolense "Galerieforestière"; WG5= T. congolense "Kilifi"; Eatro 1125=T. b. brucei;Biyamina = T. b. gambiense. BAN 7 = T. simiae. Les témoins positifscorrespondent à l'hybridation de la sonde sur elle même. Les chiffres 1, 2, 3,4, 5, 6 représentent respectivement les quantités d'ADN de 1000, 500, 100,10, 50 et 1 pg de trypanosomes et 100, 50, 10, 1 et 0.1 pg pour les sondesgénomiques.

1

•

2 3

182

4 5 6

-. 1/148

-. ANR3

-. WG5

-. Eatro 1125

-. Biyamina

-. BAN7

-. NIK-450

Annexe 11. Photo illusrrant le sensibilité de détection et spécificité de la réactiond'amplification en chaîne des couples d'amorces spécifiques de T. brucei s.l. et T.congolense "Savane" (B) sur le matériel génomique purifié des trypanosomes deréférence.(A) : Les pistes 1, 2, 3,4,5, et 6 représentent les quantités d'ADN de 1000, 100, 10, 1, 0,1et 0,01 pg de Earro 1125 (T. b. brucei). Les réactions de spécificité sont réalisées avec1000 pg de T. congolense "Savane", 1/148 (7); T. congolense "galerie forestière", ANR3(8); T. congolense "Kilifi", WG 5 (9); T. simiae, BAN 7 (10) et T. vivax, Y-482 (11). Lapiste (12) étant le témoin sans matrice. La migration est suivie par le marqueur de poidsmoléculaire Pm (123 pb DNA ladder, Gibco BRL, USA).(B) : De 1000 à 0,01 pg de 1/148 sont déposés dans les pistes allant de 1 à 6. Les pistes 9et la représentent les dépots de 100 et 1000 pg de ANR3. Les pistes 7,8, 12, 13, 14, 15,16 sont respectivement 1000 pg de WG 5, Earro Il 25, Biyamina, 058 (clone), Kassala.,BAN 7 et Y-482. Le puits 17 est le témoin sans matrice.

PM 12345 6 7 8 9 10 11 12

A

492 pb

369 pb

246 pb

123 pb

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

B

492 pb ----...369 pb ----...246 pb ----...123 pb ----...

183

Annexe 12. Sensibilité de détection par la peR des amorces, spécifiques deT. congolense "Galerie forestière" sur les trypanosomes entiers de culture.La souche parasitaire utilisée est ANR3. Les pistes 1, 2, 3 et 4 représententles quantités de parasites respectivement de 1000, 100, 10 et 1. Et, la piste(5) est le témoin sans matrice. Enfin, la migration est suivie par le marqueurde poids moléculaire Pm.

PM 1 2 3 4 5

492 pb--..

369 pb--.­

246 pb~

123 ob~

184

Annexe 13. Photo présentant les résultats d'amplification génique des intestins

de mouches infestées expérimentalement par T. b. brucei. Les pistes 5.10. 12

et 14 représentent les intestins positifs selon la technique parasitologique. les

autres ne portent pas de parasites selon la même technique. La piste 1 est le

témoin positif (1 pg d'ADN de Eatro 1125). Les pistes 15 représentent le

témoin intestin négatif. Le Pm représente l'indicateur du poids moléculaire.

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13 14 15

492 pb -...369 pb-...246 pb-...123 pb-...

185

ARTICLES ET CONGRES

--_._-------- ._...---------Mixed populations of Trypanosoma brucciin wild Glossina palpalis palpalis

J. Ii. Stellcns, l,: MOlhicu-Daudé, J. J. Mcf\'(lmora l, E 1/. /I1izen l . .'\. N=i/(/~.'UMII CNllS/OHSl'Otv! lJ92(i: GénétiqUl~ Moilil:ulaim des l'arasiulS ('t des IlIs(~(·tl·s \·I!I·..·lII"s. ~fllllllll!IIi(:r. Fmlll'!::1 MRC Trypallosonliasis Ilescarch Group, Division ur Mulm:ular and Cl!lIular Billlllgy. [!ni\'('rsity ur Bristul. I.angrurcl. U":2 Départenll!nt SanU;. UltsTOM. 'Montlwllicr: Frant:t;

1 Abstract

1 -In-m-a-n-y-p-re-v-i-o-U-s-c-h-a-ra-c-t-e-n-'z-a-ti-o-n-s-t-u-d-ie-s

1

of Trypanozoon, isolates have been subpassagednumerous ti!l1es in laboratory rodents until a quantityof trypanosomes sufficient for analysis has heen ob­

i tained. In addition to the numerous·biochemiral effccts, of such a process on the parasite, it appears probable

that adaptation to an unnatural host may aise serve tofilter out less virulent populations from mixed infcc­tions, leading to an underestimate of the trUfJ level ofgenetic diversity. By the early cloning of trypt nosomesfrom susceptible captive flies infected from the primaryisolate - the midgut of a wild tsetse - the present studyprovides evidence of the range of genetically differentTrypanosoma brucei populations which may coexistwithin the midgut of individual tsetse flies in nature.The three primary isolates from 15e15e yielded one, fiveand nine genetically distinct populations. Cloned popu­lations were confmned as T. brucei using the poly­merase chain reaction, and were characterized bykaryotype analysis and multilocus isoenzyme electro­phoresis. These data allowed a limited assessment ofthe level of genetic variability in natural populations ofT. brucei.

Introduction

Despite several studiesof naturalJy occur­ring mixed infections of Trypanosoma (Trypanozoon)brucei in mammalian hosts (Scott, 1981; Mehlitz et al.,1982), studies of mixed populations of trypanosomes inwild caught tsetse flies have been less frequently reported(Letch, 1984; Godfrey et al., 1990; Majiwa and Otieno,1990). Given the importance of the tsetse fly as the prob­able site of genetic exchange in trypanosomes (Jenni etal., 1986), this represen15 a potentially serious gap in ourunderstanding of the diseâse, particularly when cOIJ.sider­ing genetic variability within Trypanozoon. Furthermore,in previous studies of genetic variation within natural in­fections of T. brucei from tsetse (Letch, J984; Godfrey etal., 1990), parasites were inoculated directly into labora­tory rodents; clones were then made from sampies taken

Accepted: 1 June 1994

Trop. Med. Parasitol. 45 (1994) 313-318© Georg 1bieme Verlag Stuttgart· New York

at intel"\'als of several days during the parasitaemic r.yde.Thus, certain populations which were less weil adapwdfor growth in experimental mice may already have Deenovergrown, and perhaps eliminated, by the time the !irslsamples were taken.

The present study addresses this problcl11by cloning and growing procyclic trypanosomes deri\'l:rlfrom susceptible laboratory flies infected from the pri­mary isolate - the midgut of a wild tse15e. The clonedpopulations were confirmed as T.brucei using the poly­merase chain reaction (PCR), and were characterized bykaryotype analysis and multilocus isoenzyme electro­phoresis (MLEE). These data allowed a limited assess­ment of the level of genetic variability occurring naturàllyin T. brucei. Results are discussed in relation to otherstudies on reproductive processes in field populations ofTrypanozoon (Tait, 1980; Gibson, 1990; Tibayrenc ct al..1990; Cibulskis, 1992; Stevens and Welburn, 1993).

Materials and methods

Trypanosome origins. The origins of the threcstocks and the 29 clones made from them are presented inTable 1. together with WHO codes and information on the threcstandard stocks.

Trypanosomes were isolated from Glossilla pal­palis palpalis caught in Challier traps in and around the villageof Kouassi-Perita. near Bouafié. central Côte d'Ivoire in June1989 (Mehlitz and Schares. personal communication); a detaileddescription of the area is provided by Mehlitz et al.. (1981).Parasites were isolated from tsetse midguts (Mehlit7. and Scharr5.personal communication) and transferred to supplcmclllcdCunningham's medium (Cunningham, 1977) as descriued byDukes et al. (1989); isolates were cryopreserved before despatchto Europe. Stabilates of the three primary isolates \Vere kindlycollected and provided by the research teams of Professor D.Mehlitz. Free University of Berlin and Dr. 1. Maudlin. TsetseResearch Laboratory ffRL), Bristol.

Procyclic cloning and growth in culture. Stabi­lates were thawed and washed by centrifugation in SM culturemedium (Cunningham. 1977). Trypanosomes were then l'esus­pended in 1.0 ml SM. half of which was removed to one well"ofa 24 weil culture plate. and incubated at 27'C in 5"10 COz en­riched air; the remainder was fed to laboratory G. morsitansmorsilans (TRL colony FX9) as described previously (McNamaraand Snow, 1991). Where trypanosomes failed to grow directlyfrom the primary isolate they were re-isolated into culture me­dium from the midguts oflaboratory Oies. To minimise the poten­tial loss of less virulent trypanosome strains from any mixedinfections. midgut cultures in thé ftrst stage of exponential

J. R. Stevens. F. Mathieu-Daudé. J. J. McNamara et al.314 Trop. Med Parasitol. 45 (1994)

Table 1 Isolate details.

WHO Code Short Code Host

GPAP/Cl/89/KP 13 KP 13 G.p.pa/pa/isGPAP/CI/89/KP 14 KI' 14 G.p.pa/pa/isGPAP/Cl/89/KP 33 KP 33 G.p.pa/pa/is

Standard stocks:GPAP/CI/821KP 2-2 cl. 38 KP 2 G.p.pa/palisMHOM/Cl178/TH 1-037 TH 1 ManMHOM/SD/821BIYAMINA cl. B BIYAMINA Man

Cloned populations

5 (N°s 1-5)9 (NOs 1-9)15 (NOs 1- 10, 12- 16)

Reference

letch. 1984Mehliti et al., 1982Godfrey et al., 1987

1 234567"8-,'9.:'10::111213141516

~.(;

~~~:"J .,~~lJ.b".

:~~>,ÙMb

,!W''m:l(i~Mb

.~/

. ~~~:.

Fig.1 Molerular karyotypes of c16~~ trypanosom~populations ofisolate GPAP/Cl/89/KP 33; uncloned parental stock, lane ~; clones1- 14, lanes 3 - 16. Two karyotypes can be distinguished by the pres­ence or absence of chromosome bands in the megabase (a' and400 kb (b) regions of the gel. Marker shown in lane 1.

growth were diluted with fresh SM 10 give a trypanosome con­centration of 10L 104 mJ-l; clones were made by direct observa­tion of single parasites in a 0.5 ~ drop of medium in a weil of amicrotitre plate. Immediately after the presence of a single or­ganism had been confirmed by a second observer the weil wasDooded with 100 ~l of SM; the process was repeated until up to35 clones had been prepared. Plates were incubated at 27·C in5 % CO2 enriched air, and, if cloning was successful, the trypano­somes were subcultured into progressively larger volumes ofme­dium.

Thereafter, cultures were maintained at 106 try­panosomes ml· l , at 28·C for 6-10 days (Dukes et al., 1989). Oncea culture exceeded 2 x 109 trypanosomes in 120 -150 ml of me­dium, it was harvested (Gray et al., 1987). Finally, trypanosomeswere lysed, and centrifuged to separate the water solubleenzymes from the trypanosome debris. The supernatant contain­ing the enzymes was removed and stored as beads in liquidnitrogen (Gibson et al., 1980), while the solid material was re­tained for DNA extraction.

PCR primer analysis. Total trypanosome DNAwas prepared according to standard methods (Van der Ploeg etal., 1982). Oligonucleotide primers designed to anneal specificallyto the satellite DNA of a particular species (Moser et al., 1989;Masiga et al., 1992) were used to check that ail populations wereT. brucei. Populations were also checked with T. congolense(Savannah type) and T. simiae PCR primers; reaction conditionswere as described by Masiga et al. (1992).

Karyotype analysis. Trypanosomes grown inculture were lysed in situ in agarose blocks at a final concentra·tion of 2x109 ml-1 (Van der Ploeg et al., 1984). Chromosomesized fragements of DNA were size fractionated in a 1 % agarosegel using an LKB Pulsaphor system with a hexagonal electrodearray. The program used had five phases (900 s, 15 h; 300 s, 15h; 210 s, 10 h; 180 s, 10 h; 40 s, 10 h) and a running time of 60 hat 130 V. Gels were stained with ethidium bromide and photo­graphed by ultraviolet transillumination (Fig. 1).

Enzyme range. Electrophoresis was carried outon cellulose acetate plates (CAE) (Mathieu~Daudé, 1991; Ben Ab·derrazak et al., 1993). The following 15 enzyme systems wereexamined: EC 1.6.-.-, Diaphorase (DIA); EC1.1.1.10, Threoninedehydrogenase (TDH); EC1.1.1.37, malate dehydrogenase(MDH); EC 1.1.1.40, "malic" enzyme (ME); EC 1.1.1.42, isocitratedehydrogenase (ICD); EC 1.1.1.44, phsophogluconate dehydro­genase (6PGD); EC 1.1.1.49, Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PDH); EC 1.2.1.12, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydro­genase (GAPDH); EC 2.6.1.1, aspartate aminotransferase (ASAT);EC 2.7.5.1, phosphoglucomutase (PGM); EC 3.2.2.1. two nu­cleoside hydrolases using difl'erent substrates; the enzyme utiliz­ing inosine was coded NHI (previously labelled as NH; Gibson etal., 1980; Godfrey et al., 1990) and that utilizing deoxyinosine.NHD; EC 3.4.11.-. or .13.-, Leucine aminopeptidase (LAP); EC3.4.11.-. or .13.-. peptidase. substrate: L-Ieucyl-L-alanine (PEPB);

EC 5.3.1.9, glucose phosphate isomerase (GPO.

Numerical analysis. A simifarity matrix wasproduced according to Jaccard's method (1908) using a computerprogram (Stevens and Cibulskis, 1990). Simifarity values werecalculated using ail isoenzyme bands for each enzyme, betweeneach pair of populations; parental stocks were not included asthey were, by definition, composites of the cloned populationsunder study. A dendrogram was constructed by the unweightedpair-group method using arithmetic alJerages (UPGMA; Fig. 2).

Rcsults

CLoning of stocks

None of the cultures initiated directly fromthe primary isolates grew; only those stocks which weresuccessfully re-isolated from laboratory flies were cloned.Furthennore, despite standardized procedures and condi­tions, e. g. cultures in the same early growth stage, cloningefficiencies varied between 14 % (GPAP IC1I89/KP 14)and 48% (GPAP/C1I89/KP 33).

PCR primers

Analysis of parasite DNA with PCR primers(Moser et al., 1989; Masiga et al.. 1992) confirmed allstocks, both parental and cloned populations. as T. brucei,

7j·op. Mcd. Parasitol. 45 (1994) 315Mixed /'opulations oiT. brucei in wild G. palpalis palpalis

Controls, populations tested With the T. congolcnse(Savannah type) and T. simiae probes, were negative. Populetlon

, SIKIU.JlITY

100 ,~ '0 15 10 HZ ~__--"J__..--JI,---__,-!__--",__--'

Fig.2 Dendrogram construded by UPGMA from a Jaccard similantycoefficient matrix. C10ned populations are shown, together with thethree standard stocks (marked·) which equate to the recognised suo­species of T. brucei; KP 2, T. b. brucei; TH 1, T. b. rhodesiense; BIY­AMINA, T. b. gambiense; KP 2 and BIYAMINA are also c10ned stocks.The zymodeme (Z) into which a population is c1assified is shawn atthe end of each branch.

Genetic interpretation of most isoenzymeswas straightforward; however. ME and NHI produced twodistinct sets of band patterns, not easily explained as theproduct of a single 10cus.Consequently, ME and NHI wereinterpreted as two loci and the following nomenclaturewas adopted: MEA' MEB and NHIA. NHIB.

Numerical analysis

The degree of genetic variation presentWithin the cloned populations from the three originalsample isolates is shown in the dendrogram (Fig. 2); Ûlchigh degree of variation present in two of the isolates(GPAP/CII89/KP. 14 and GPAP/CII89/KP 33) is of par­ticular note. However all populations, clones and stand­ards, are greater Ûlan 78 % similar, though such a result

.-.----1

,---~1-----­1----------'2---------~

7

12 ]r----.14 TJ----:-­

D1611155

17 --------------,

Previous studies of enzyme polymorphismsin Trypanozoon show homozygous and heterozygous pat­terns typical of monomeric and dimeric enzymes in adiploid organism (Gibson et al., 1980;Tait, 1980; Stevensand Godfrey, 1992; Truc and Tibayrenc, 1993). Given Ûlattrypanosomes are diploid. practical aIlelic interpretationof isoenzyffie pattern followed the method described byFerguson (1980) and Ben Abderrazak et al. (1993). Singleband patterns were interpreted as homozygotes for allenzymes. Double and triple band patterns were inter­preted as heterozygotes. associated With monomeric anddimeric enzymes respectively; alleles were allocated onthe basis of the positions of the upper and lower bands ina pattern. Only consistently reproducible bands were in­cluded, and samples were rerun electrophoretically toelucidate the validity of weak shadow bands and poorlyseparated multiple patterns.

~P ]J cl. 5~P JJ cl.l~

~P JJ cl. 2~P JJ cl. ,KP JJ cl. 7KP J] cl. 4~P JJ cl.UKP JJ cl. 1.~P JJ cl. 1~P 14 cl. 2~P 14 cl. J~P 14 cl. 1~P JJ cl.1J~P JJ c1.14

·U 2~P JJ cl. ,~P JJ CI.IO~P 14 cl. 7~P 14 cl. 8~P 14 cl. 4U 14 cl. ,~P 14 cl. ,

e8IYAHlNA~P14cJ.5

.TH 1~P 1J .cl. 5~P JJ cl. J~P 1J cl. 1~P 1J cl. J~P IJ cl. 4~P 1J cl. 2~P JJ cl.16

lsoenzymes: interpretation

For four of Ûle fifteen enzyme systems, agenetic interpretation of isoenzyme patterns was notpossible; thus, the numerical analysis was phenetic. How­ever, an allelic interpretation of eleven enzymes. equatingto Ûlirteen loci, was possible, allowing analysis to bebased on a total of 17 putative loci. Such an interpretationalso permitted further investigation of the genetic rela­tionships between populations.

Molçcular karYOlype analysis

. The three uncloned populations, GPAP ICII1'\1)11-.:1' 1:-1, GPAJ>/CII89/KP 14 and GPAP/CII89/KP :-13.

· had distinct karyotypes. However. only KP 33. whichyieJded two distinct karyotypes, produced clones withdiITerent chromosome banding patterns (Fig. 1).

/soenzymes: zymodemes

The isoenzyme banding patterns obtainedwere coded according to Mathieu-Daùdé (1991) and Trucet al. (1991). Using the fifteen enzyme systems. inter­preted·as 17 loci (see interpretation), 17 zymodemes were

·recognised in the 35 populations analysed (Fig. 2), includ­ing the standard stocks. Sample populations, includingparental stocks. were classified in 15 zymodemes; clonedpopulations were classed in 14 zymodemes. Full details ofthese isoenzyme data are available on request from J. R.Stevens.

Due to the large number and selection ofenzyme systems examined in the current study. the directmatching of zymodemes with those described in previousstudies (Godfrey et al.. 1990; Stevens et al., 1992; Trucand Tibayrenc. 1993) was not possible. Indeed. as Tibay­renc and Ayala (1988) point out. delineation of zy­modernes is highly dependent upon the method!i used,and upon the range of isoenzyme markers under study.This was particularly true for comparisons made withearlier studies which used Ûlin-Iayer starch gel electro­phoresis (Gibson et al., 1980; Letch, 1984; Tait et al.,1984).

The following seven loci were invariant. and monomorphic for the 35 populations (including three

standard populations) studied: GPI, MEA, NHIA. NHIB,NHD, TDH, MDH. Among the 32 sample populations aneighth enzyme, IAP. was also invariant and monomor-

·phic. The parental population of KP 13 and aIl five clonedpopulations were enzymatically identical, and wereplaced in zymodeme 4. The nine cloned populations of KP14 were classified in five zymodemes; the parental stockwas classified in the saroe zymodeme (Z5) as two of it'scloned populations. The fûteen cloned populations of KP33 were classified in nine zymodemes, while the parentalstock was placed in a separate zymodeme (Z10); onecloned population was placed in Z4 with all populationsofKP 13.

316 Trop. Med. Parasitai. 45 (1994)

must be interpreted with regard to similarities bctweenthe standard stocks (Stevens and Godfrey, 1992).

Four populations from. KP 33 arc iso­ènzymieally identical to KP 2, whilc over hnlf of the popu­lations of Ki> 14 are 95 % similar: KI' 2 has umm unam:biguously c\assified as West African T. b. brucci in severalprevious studies (Letch, 1984; Kaukas ct al.; 1990:Mathieu-Daudé, 1991). This provides a strong· indicationthat the populations' of KP 14 and KP 33 may ue c\assifiedas T. b. brucei. strain group bouajlé.

The same populations which are 95 % sim­i1ar to the T. b. brucei standard, KP 2, arc also 92%similar to the T. b. gambiense standard, BIYAMINA. How­ever, the high level of isoenzymic similarity between T. b.brucei and T. b. gambiense has been weil documented andwill be considered further (see Discussion). Cloned popu­lations are. at maximum, only 85 % similar to the T. b.rhodesiense standard. THl.

AIl populations of KP 13 are isoenzymati­cally identical, and are also identical to a single population(Clone 3) of KP 33. This group of populations were amaximum of 84 % similar to the other stocks analysed.

Discussion

In previous characterization studies of Try­panozoon parasites (Gibson et al.. 1980; Tait et al., 1984;Godfrey et al., 1990; Stevens et al.• 1992; Truc and Tibay­renc, 1993), most stocks were isolated into rodents andthen subpassaged numerous times until a quanity of par­asites sufficient for characterization was obtained. Such aprocess may affect any number of characteristics of thetrypanosomes under study, e. g. adaption ta host (Fair­bairn, 1933; Dukes et al., 1989),antigenic type (Lumsdenand Herbert, 1975), and virulence (Gibson et al.• 1980).However. one of the most serious consequences of rodentsubpassage is the filtering out of less virulent populationsfrom mixed infections (Letch, 1984), which leads in tum,to an underestimate of the true level of genetic variation.

The present study provides evidence of therange of genetically different T. brucei populations whichmay coexist within the midgut of individual tsetse flies innature, the three primary isolates from tsetse yieldingone, five and nine genetically distinct populations whensubjected to extensive early c\oning. Moreover. this degreeof genetic variation was, in at least one instance. reflectedby the presence oftwo distinct trypanosome karyotypes inthe same Oy; such a variation in the structure of thegenome implies significant genetic dilferences. In the fewprevious studies addressing this problem, Letch (1984)found two genetically distirÏct populations of T. b. brucei ina single tsetse fly, while Godfrey et al. (1990) identifiedmixed populations in seven out of 73 isolates from tsetse.However, most were found by chance. with no deliberateattempt to identify and separate mixtures soon after theinitial isolation. Indeed, of more than 900 isolates charac­terized by isoenzymes (Godfrey et al.• 1990). only 26 weredescribed as mixed populations; of these. only two wereshown to contain mixtures of three populations. includingone from a tsetse.

J. R. Stevens. /.: Mnlhie/l-f)nlldé, J. J. McNamara (~t al.

Scott (1981) and Mchlitz et al. (1982) foundtwo isollnzymically distinct populations of T. brucei spp. ineach of two isolates from .village piJ.ts mmmined in CÎJwd'Ivoin'l. while Schutt and Mehlit'l. (1981) dcmonstrutedthe long-term coexistence of straÎns of 7: li. !mu:e; Hnd Tb. gambiense in an experinwlltnl piJ.t. nml tlll' JlnrtÏl'l1lardifficulty in detecting me preslmcu of <:mtail1 less virulul11populations. Majiwa and Olieno (1990) demonstratcd .tlll!presence of mixed infections in tsetsc nies using DNAprobes. while Moloo et al. (1982) and Gibson (1989) hav(!shown experimentally that tsetse infcctcd with T. bruce;spp. can aIso be infected with trypanosomes of o~her sub­genera and subspecies. However, no studies of mixcd in­fections with c\osely related strains have 50 far been un­dertaken. The current study indicates, therefore, that theoccurrence of mixed populations of T. brucei in individualtsetse flies may be more common in nature than pre­viousl) supposed, suggesting a need for further study ofthis as:,ect of the host-parasite interaction.

Such a result, together with evidence froma rangJ of previous studies. could have important con­sequences for genetic exchange (Tait, 1980) betwcenpopulations of trypanosomes in tsetse. The detection ofnine l'Jld five closely related, but distinct, populationswithin two of the three primary isolates suggests a degreeof varIation not easily explained without sorne form ofexchange of genetic material (Gibson, 1990), particularlywhen the importance of the tsetse fly as a potential site oftrypanosome gene exchange is considered (Jenni et al.,1986). However. as several researchers have indicated,the simple detection of genetic variants provides little in­dication of the underlying mechanisms in the absence ofquantitative data ITibayrenc et al.. 1990; Cibulskis. 1992).Furthermore. differences between the predominantly en­demie form of trypanosomiasis' found in this region ofWest Africa (Godfrey et al.• 1990) and the often epidemicform found in East Africa eg. Uganda (Stevens and Wel­bum, 1993). suggest that conclusions drawn from theseresults should be limited to trypanosomiasis in the west­ern area.

In a broader context. our findings for tsetseflies are in agreement with the results of several studieswhich suggest that naturally occurring mixed infectionswith more than one species of trypanosome are not un­common. In drug trials conducted by Unsworth andBirkett (1952). all untreated cattle had mixed infections atthe end of a 45 day trek south into the tsetse zone fromnorthern Nigeria, while Killick-Kendrick and Godfrey(1963) showed that more than 60% of infections inNigerian livestock were mixed.

The level of genetic variation within asampie can be quantified using a suitable index of diver­sity (Stoddart, 1983; Hoffmann, 1986). However, iliemethod of data collection employed in the c~rent study,i. e. the repeated sampling of the same primary isolate inorder to maximize the detection of genetic variants (re­peats of zymodem~s being sampled from the same popu­lation), invalidates the use of such measures. Thus whileindices may be calculated they will be of little value forthese data. However, the dendrogram (Fig. 2) does pro­vide a measure of the genetic variation observed.

Mixad Populations oIT. ilrucai ill lOild G. palpalis palpalis

Nine cloned populations from KP 14 andKP 33 were 92 % similar to tbe T. b. gambiensa standard.while others. including some populations from parentalstocks KP 14 and KP 33, were much less similar; ailcloned populations of KP 13 were only 84 % similar. Thus.despite the degree of separation. the placenlHnt or c10nlldpopulations in relation to standard stocks or 7: b. brucei.T. b. gambianse and T. b. rhodasianse appllarod logica\.although the placement of certain populations in relationto the T. b. gambiellsa standard highlights tl10 anomalieswhich may be cncountered when difTerentiating WestAfrican T. brucei spp. by isoenzymes (Godfrey etaI.. 1990;.Mathieu-Daudé. 1991; Stevens and Godfrey. .1992).Indeed. it may weil be that the degree of separation be­tween the cloned populations and the standard stocks is areflection of the enzyme range used. rather than an exactmeasure of the genetic separation of the parasite groups.

Whatever. the isolation of individual popu­lations from mixed infections by cloning and in vitro cul­ture. before the less virulent components are overgrown.appears to give a 'more accurate picture of the naturalgenetic variation present in Trypanozoon.

Acknowledgements

This study received fmancial support fro~ theMinistère Français des Affaires Etrangères, TDR WHO EPIAFGrant No. 910020 and 920172. EC "Science" Grant No.SCI*CT92-0761 and the Medical Redearch Council, UK. We thankM. TIbayrenc and D. G. Goqfrey for valuable comments on themanuscript.

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J. R. Steuens. F. Mathieu-Daudé. J. J. McNamara et al.

Dr. J. R. SteuensSchool of Bio\ogical ScicnccsUniversity of BristolWoodland Road

. Bristol. BS811.1GU.K.

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CORRELATION OF HIGH SERUM LEVELS OF TUMOR NECROSISFACTOR-a WITH DISEASE SEVERITY IN HUMAN AFRICAN

TRYPANOSOMIASIS

MARIE CLAIRE OKOMO-ASSOUMOU, SYLVIE DAULOUEDE. JEAN-LOUP LEMESRE.ALEXJS N'ZILA-MOUANDA, AND PHILIPPE VINCENDEAU

Lnl,ornw@ie Pnrn.dlolo8ie. Uni\'usil/de Oordenrr:r: Il. Dordf'nrrx. FmI/ce: Lnbornfolre de.'GrnJ/des Endemies Troplcnles. UnUe'de Diologle Pnmsilnlre ORSTOM••Mo/lfpetticr. Frallce

Absrract. The levels of tumor necro!;is factor-a (TNF-a) in sera from Trypcf,.losoma brllcd gambiellse-infectedpatients from the endemie region cf Boko Songho (Bouenza focus in Congo[wcre measured. An increase wasobserved in sera from.patients (geomelrie mean = 53.75 pg/ml, n =69) eompitred with control subjects from thesame endemic-area (6.72 pglml, n'= 31). The patients were classified as being in the early (blood Iymphotic) stageand late (meningo-encephnlitic) stnge of disease occ'ording to the presence of parasites and eeUs in eerebrospinolfJuid(CSF). An increase in TNP-Cl was notëd in late stage patients (68.42 pglm1, n ::Il 28) eompared witJt early stagepatients (43.68 pg/ml, n <:: 41). Those patients with fever, osthenia, and edema Qnd those with neurologic signs hadhigher levels of TNF-a (89.36 pg/ml, n = 26) than others (38.07 pg/mJ, n = 43). 'No differences in TNF-a levelswere seen when trypanosomes were detected in one location (blood.lymph nodes, or CSF) or two or three locations.These data show that the levels of TNF-/"l in serum of T. b. gal/lbiellse-infected patients were correlated wi!h disenseseverity (presence of s}gns of inflammation or presence of major neurologie signs) and indieate that TNF·(~ could beinvolved in sorne aspects of humnn Aftican U'ypanosomiasis physiopathology•

.,.Human African trypanosomiasis, or sleeping sickness. is

caused by Trypallosoma bl1lce/ gambiellse and T. b. r"ode­s;ellse. I•2 At Jeast 45 milJion people in Afriea are estimatedto be exposed to trypanosomiasis. In the e:lrly stage of thedisease (blood·lymphatic phase), the parasites invade theblood and the lymphatie system. The most common signsarc intennittent fever. headache, joint pa.in. edema, hepatos­plenomegaly, and Iymphndenopathies. The late (meningo­encephalitic phase) stage of the disease starts when U'ypano­;o:nes cross the bl00d brain btUTier, nt which lime, besidesnonspecifie symptomatology, vnrious neurologic signs are:loled. HypergammagJobulincmia, autoantibodie:;. inununecomplexes. and inununodcpression have olso bccn ob·scrved.J•• Cytokines May contri bute ta tIle nonspecific s}'mp­tOl11atology (fever) as weil as these imnlUnblogie abnomlal­

.itiës.u .Tumor necrosis factor-Cl (TNP-a) is involved in numel'ous

physiologie functions llnd lIas nIso been implicoted in thepathogenesis of septie sh(lCk nnd systcmie inflnrnmatory re·actions.J-l Increased TNF-Cl levels have been demonstratedin !he sera of patient!; with bncterial. viral, and pa.rnsitic in-

·.fections, such as malaria or leishmaniasis.... '2 In Iluman ma­laria, increased serum level! of TNF-a Ilave been cCllTelaledwith severity of disease.1I Alterations in lhe cytokine net­work during Aftic:1O ttypanosomiasis have not yet been es- .tab!ished although certain cliniënl manifestations suggest

.6uch modilications. In this study. wc evalualed the Jevel ofTNF-a in sera of patients with African trypanosomiasis andthe correlation oi these levels with the slage :\Od aClivilY ofthe tl iscase.

SUDJF.CTS, MATERlALS, AND MF.TIlOOS

SubJects. The study was eanied out in 69 Congolese suC·feling from sleeping sickness (female:male ratio::ll 1.3:1.4­72 years of age, me:!n ± SD age::' 31.4 ± 21.1) :md 31unlnfecled subjcets (femafe:maJe ratio c J:I, 3-68 years of:tge, nlean :!: SD age'" 29.3 ± 19.5) living in tIle cndemie

region of Boko Songho (Bouenza focus in Congo). Duringa tnass sereening for sleeping sickness, p:ttients with trypan­osomiasis were diagnosed on the basis of serologie and par·asitologic resultS.13 Ali patients analyzcd in mis study werescrologicnIly nnd parasitologically positive. Patients withuypanosomiasis infections and control subjects were aU par­asitologieally negative for mnIaria and filoriosis. No subjectpresented ony additional clinieal pnthology. Pregnant womenwere exeluded. Controts were nIt pa.rasitologicaUy and se·{lAogicolly negative for trypanosomes.

Serum sllmples. Ta minimize alterations of Mood eom­~onent'l :lnd to stnndardize samples. blood was corected be­tween 10:00 AM and noon and nIlowed to CIOl at room tem­perature for 2 hr. The serum was separated by centrifugation(600 X g for 10 min), frozen nt ;"'20°C. and storeti at -80oeulltil use.

Clinical nndfaboratory annlysis. SerologIe response:l\Vere detennined with the Testryp" Card Agglutination Test(ClOT) (Smith Kline RIT, Rixensard. Belgium) on whoJeblood ond samples rcacted positively in at leost one of thefollowing serologie tests: quantitative CAlT on serum. in·direct inununofluoreseence, and indirect hemagglutination(Cellognostot; Behring Institue, Marburg, Gcnnany). Plll'a·sites were round in one or more of the foIJowing biologiealfluids: blood. Iymph node aspirate, and, when required. incerebrospinal fluid (CSF) either by direct microscopie ex.­:unin:ttion or by· using mini anion-exchange r:olumns." Aquestionnaire on previous iIIness, and genel'Jl signs andsymptoms of infection was completed and a physical ex­aminalion for adenopathies and neurologie sigM was per­formed on each patient by a physlcian. The lnvolvement oflhe central nervous system (CNS) (Jate stage oC Afrienn try·pllnosomiasis) was based on CSF ana,lysis (presence of the·p:lrasite and eeU count).Dd~rmlnationo( TNF·a levels. The TNF-ex levcls were

.delermined for eaclf sample in dupliente using a sandwichr:ldio immunoassay (TNF-a IRMA; Medgenfx, Brussels.Delgium). Several mOnoclonalantibodies directed to distinct

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FIGURE 1. Levets or tum"r necrosls factor.alpha (TNP-alpha) lnsera of control subjects (Arricans Ilving ID an endem!: area. n :::z 31)and patients with human African trypanosomlasls (n = 69). Thedashed lines represent the geometclc means of each group.

ConiNI. l'.tienl.

Itarl1t1usc Lnlul~At

FIOURS 2. Levcls or tumor necrosls factor-alpha (TNF-alpha) lnearly (n ::::1 41) and Jate (n =28) stage patlenls with hum'J'1 AfclcanIrypnnosomiasis. The dashed lInes represent the geolOOtric means oreach group.

epitopes of TNF-a and bound to the bouomof tubes wereused as capture lIntibodfcli. Scru~ saJnples or standardamounts of TNF-a and JVI-IabeIed antl-TNP-a (trace antl­bodies) were added to each tube. Aner tho s:unples werewashed with phosphalc-buCfered saline, pH 7.4, containing0.5% Tween 20, counts were determined. Values of TNF-ain samples were obtained from Il curve obt:J.ined from stan­dards. This assay does not cross-react with TNF-13, interIeu­ki!l:t.(IkJ), n.-6 or interferon-y (IFN-'Y), and its sensitivityis 5 ng/mt) A ,,~f""e,, . StallSticat anàlJ'lls. Geometrie mean!, whlch were con­sidered more representative of each data group of TNF-alevels tha'l arithmetic means, and 95% confidence intervals(CIs) werc caJculated. The TNF-a levels were not norm:l1lydistributed. Comparison between groups were made using anonparametric test (Mann-Whitney U test). Tests of signili­canee were .two-tailed. Ail P values less than 0.05 were con­sldered significanL The arithmetie mean :!: slllndard devia­tion was used for mean ages of control and patient groups.

RESULTS

(ncresse ln TNF·a levels ln trypanosomlasls. Figure 16hows the levels of TNF-a i~ sera of control subjects and

patients. The geometrlc Mean of TNF-a in control subjeclswas 6.72 pglml (CI ::1 1.77-25.53). Signiflcantly hlgher lev­eb of TNF-a were observed in patients (53.7~ pglmJ, CI ::1

13.52-201.94; P < 0.0001). HJgh levels ofTNF-a were alsofound in the CSF of eight patients but could not be measuredin the others because of insufficient quantities.

Porty-one patients with four or less ceUs/mm' and no pat'­asites in the CSF were considered to bo early stage (bloodIymphatic phase) patients and 28 patients with more thanfour ceUs/mm' or with parasites in the CSF were consideredto be late stage (meningo-encepbalitic phase) patients. Corn­pared with the control group, significantly higher levels ofserum TNF-a were measured in the two patient groups. Anincrease in serum TNF-a Ievels (Figure 2) was observed inlate stage patients (68.42 pglml, CI ::1 36.19-238.34) corn-

. pared with carly stage patients (43.68 pg/mJ, CI ::1 22.11­165.82, P =- 0.025).

Levels or TNF-a and dlsease ac:tlvl~y.Patients were çlas­sified into four groups according to clinical signs and stageof infection (Figure 3). Patients in the first phase were di­vided into two groups according tQ the intensity of generaJsigns of inflammation (.('ever, asthenia, edema), indicating anactive period oC the disèÏlse. Patients with these clinicoJ signs(n ::1 14) bad higher levels of serum TNF-a than patientswith no or mild symptoms (n ::1 27). The diCference was

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TNF·Q AND HUMAN AFRJCAN TRYPANOSOMIASIS ;

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FlOURE 3. Levels or tûmor neerosls ractor-a1pha (TNP-alpha) inindividuais wlth human Afriean trypanos.omlasÎS ir. !.he early 6tagewilh no or mild symptoms (n .. 28) (flrst column), h the early 6tagewith elinieal signs (patent) (n "" 15) (second eolumn), in cho laIescage with mild symptorns (n a 16) (chird eolwnn), and ln the laIestage with major neurologie slgns (n - 12) (fourth column). Thedashed Unes represent the georRetrie rne&ns or eaerl group.

ooDt....l. . ..../ailll cU"laa! alll.";ol1alCl&l dlla.

FIaURS 4 Levels or tumor ncerosis factor-alpha (t'NF-a1pha) insera or control lIubjects (ACricans living ln an endemlc ares, n ::1

31), in patients wlth human ACrican trypanosomJasls with DO or mildelinlcal slgns (n a 43), ar.d ln patients wiih cUnleall:igns (n "" 26).The dashed lines represent the geometrie menns or "aeh group.

DISCUSSION

both blood and Iymph nodes and those wit11 parasites in theblood aJone.

significant: 82.72 pglml (CI"" 34.32-199.39) for the tirstgroup and 31.74 pglm' (CI a 11.06-90.95) for tlle lattergroup (P < 0.001). The dirference between the latter group

. ~nd control subjects was also significant (P < 0.(01).Patients in the late stage were divided into two groups

:Iccording to the presence or absence oC major neurologie The present study reports a marked elevation of TNF-asigns (sensory disturbanc;es, ataxia, convulsions, chorell, levels in patients with African trypanosomiasis and a cor-tremors, disturbed circadian rhythms, endocrine abnormali- relation between high leveIs of TNF-a and disease severity.tIes). Patients with major neurologie signs (n = 12) had The difference between TNF-a levels in the carly and latehigher leve!s oC TNP-a than tho'se in the millier late stage stages was less significant (P ... 0.025). The results of thisgroup (n = 16): 97.79 pglml (CI = 28.01-341.42) 'versus .._lit\!s:JY_Yl~o.m~.erned with TNP-a levels observed in onlyS2.34 pglml (CI ::1 19.52-140.32) (P < 0.006). -k- one focus (Bok~~ongho focus in Congo). However, we

Ali patients of the early or late stage oC the disease with . were aJso able to obtain the sera of two patients from Coteclinicat signs (n ... 26) had higher levels of TNF-a than the d'Ivoire. In the sera of these two patients. an increase in theother patients (n ::1 43): 89.36 pglm! (CI a 31.0~256.92 ) TNF-a level was also observed. This probably means thatversus 38.07 pglml (CI ::li 12.36-117.2) (P < 0.(01) (Figure trypanosomiasis induces an Increaso in TNP-cx levels and4). . that the phenomenon Is not limited to T. b. gamblense slratns .

ln the patients in whom parasites were observed in the from Congo. Studie~ In other focl would he necessary toblood, there was no correlation between TNP-CI concentra· .confirm this possibility. The search for endogenous med~a.

tion and parasitemia. Thero were no differences in TNP-a tors of cachexia in parasitic diseases Ied to the isolation oCr_nun ,,,,,,,,. "' ..,,,,, thn~_ rto : : , •••_,.. "r"~ :" .. _ _L .._.:_: r "ç ~,tf_ el'\'" ~J,h:t. 'n,...,.t_" ,.,:." trUf'\'!JInn.

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OKOMO-ASSOUMOU ANf) OTImltS

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somes." Peptide sequence analysis !'evenled that TNF-a <\ndcaeheelin are Ihe same molecule.'6

Tumor necrosis faclor-a' is known 10 induee feyer, ~sihe~nia', anemia, and hypertriglycerklemia, which are obser\'edin African trypanosomiasis. We observed Ihat high levels ofTNF·a are associaled wilh the presence of patent innam­malory signs in the early phase of trypanosomiasis and ofmajor neurologic signs in Ihe laIe phase. Beca\lse of the mo-

. bililY of the population and the Iimiled duration of our slay,we welc able 10 obtain senun samples 'after trenllllent fromonly lhlee patienlS, In thcse, a deerease in the TNF-a levcl\vas found one week after treatmell!. This is in agreementwilh Ihe association between increased serum TNF-a levelsand disease sevelÏly in other parasitic diseased. II, u In I~ish­

maniasis, an increased TNF·a levcl is a marker of c1isensenctivily and n rapid decrease in Ihe TNF·a levcl is observed:lfler effective therapy. In malaria. high levels of TNF-a areassociated with manifestations of severe malaria but nre notspecific 10 cerebral malatia. Moreover, a persislcntly in­creased serum TNF-a level probably contribules to the hy­perganunaglobulinemia observed in trypanosomiasis be­cause lhe l'ole of TNF-a on activation, proliferation, and dif-ferenliation of B lymphocytes has been shown. 17." ,.

Besides ils l'ole in the pathophysiology of Arrican trypan­osomiasis, TNF-a p:uticipales in the mechanisms leading totrypanosome e1iminntion: TNF·a ncts indirectly in a cascndeof evenlS leading to cell activntion or directly on parasilesthrough ilS cytotoxic propcrties.19 ln murine tnodels, mnc­rophage activation induced by IFN-'Y exerts a powerful nn­timicrobial effect on various microorganisms including try­panosomes. Tumor necrosis factor-a participates in IFN·'Y­medialed antimicrobial activity :::11d can act as nn autocrinefactor.2~24 In n recent study, initial control of parasitemia inT. b. brucei-infecled mÎCe was ~imjnished by injection ofanti·TNF-a antibodies."

The mechanism leading to enhanced produclion of TNF­cr is slill not underslood. In vitro, Leishlllollia allla..ollellsisare able to induce TNF-û production by human monocyte­derived macrophages.u MonocYles-macrophages are thellloSt pOlent TNF-a-producing cells. Trypanosomes can bethe direct stimulus for,TNF-a synthesis by macrophages orcan act indirectJy through olher cells. Recenlly. a factor re­leased by T. b. b",c~i that binds and activates CDS· Iym­phocyles has been found. This factor induces JFN-'Y secre­tion that is an activator of TNF-a proouction.26

The mechanisms leading to TNF-a production in trypnn­osomiasis deserve fUllher work. Mice chronicnlly infectedwith T. b. brLlc~i after treaUnent wilh subcurntive doses of atrypanocidal compound develop inIJammiltory lesions of theCNS. The presence of TNF-a RNA transcripts in the CNSof these mice suggest ulat TNF-a production plays a l'Ole inthese lesions.27 AIso, TNF-a and other cytokines contributeto the generation of somnogenic molecules such as IL·l.nJI is known .that anti-TNF-a antibodies cause nn improve­ment in septie shock patients.29 This. nlong with the higherlevels of TNF-a delecled in the sera of patients wilh severeAfrican trypanosomiasist are in favor of the l'ole of this cy­lokine in the generation of generalized inflammation andposslbly of the associaled neurologie signs.

funn~tique) for Ihe slnlislical analysis, and J. Sneed for help in thel'rep~mlion of this article.

Finnnci~1 soppon: This wor~ was supponed by gmnls from the ln·slitut N~lion~1 de la S~nte el de la Recherche Medic:lle (CRE920(10), Ihe Conseil Region:l1 d' Aquilalne, and Ihe TDRIWHO Spe·CÎ:l1 Program for Rese~rch and Training in Tropicnl Diseascs.

AUlhors' addresses: Marie Claire Okomo-Assoumou, Sylvie Onu­!ouetle,;lIld J'hilippe Vincentleau, Laboraloire de P3r3shologie, Uni·versit~t1e 80rdenult II, 146 rue Leo SaignaI. Bat 3A 3eme Elage,33076 Dordenult Cedex, Fmnce. Je:ln-Loup Lcmesrc ond AlexisN'Ziln-Moll:lndn, L~ooralolre des Grandes Endeltlles Tropicalcs,Unile de Biologie ~:lmsilalre ORSTOM. Monlpellier Cedex l,J'muee. -"-.

Reprint reSiuests: Phir~pe Vincendeau. Laboraloire de Pnrasitologie,UniversitJtde Dordeau:'t n. 146 rue Leo Salgnat, Baf3A 3eme Etage,33076 Dortlenult Cedex, J'rance.

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TNF·a AND HUMAN AFRICAN "ffiYPANOSOMIASIS

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Scientific report

Molecular biology tools in parasitology.Their use for identification, biosystematics

and population geneticsOutils de la biologie moléculaire en parasitologie

pour le diagnostic, la biosystématiqueet la génétique des populations

Molecular biology in parasitology 605

First, composite primers that containedM13mp18 sequence f1anked by the T gondiiprimer sequence used in the PCR amplifi­cation were synthesized. The primary PCRreaction withthe composite primers gener­ated a M13mp18 fragment with T gondiisequence incorporated at the ends. Approx­imately 5 molecules of this internai controlwere added to each amplification reaction.Because this control contains the sameprimer template sequences, it competeswith the T gondii gene for primer bindingand amplification. Thus a result was onlyconsidered negative if the T gondii gene didnot amplify but the control sequence did.This control allows monitoring of the sensi­tivity of the PCR reaction in each sampie.

Knowledge of technical problems of PCRleads to a better understanding of the dis­crepancies between previously publishedstudies (Noordhoek et al, 1993; Zaaijer etal, 1993). Future studies should include con­trol of contamination and evaluation of thepresence of inhibitors of the amplification.

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Oétection et identification des Trypano­somes africains par la peRo A N'zilaMouanda, BOury, F Fournet, C Cadoux, PGrébaut, M Dia, JL Lemesre (ORSTOM,UR Maladies infectieuses et parasitaires,BP 5045, 34032 Montpellier, France).

Parmi les espèces de Trypanosomes sévis­sant en Afrique, Trypanosoma brucei et T

congolense appartenant respectivementaux sous-genres Trypanozoon et Nanno- .

. monas sont d'une grande importance, parleur pouvoir pathogène pour de nombreuxanimaux domestiques. De plus, Tb gam-

.biense et Tb rodhesiense sont .respon-sables de la maladie du sommeil chezl'homme, les Mammifères domestiques etsauvages ayant un rôle de réservoir impor­tant chez le second. Enfin, T b brucei cir­cule exclusivement chez les animaux.

Actuellement, les différentes méthodesde détection et d'identification des trypano­somes africains aussi bien chez l'hôte ver­tébré (l'homme ou l'animal) que chez lesinsectes vecteurs (en particulier les glos­sines) manquent de sensibilité. Ainsi, denombreux malades échappent au dépistageet les taux d'infection des glossines sontcertainement sous-évalués. Par conséquent,les données épidémiologiques obtenueslors des enquêtes sur le terrain sont insuf­fisantes.

Nous avons développé là technique dedétection et d'identification des Trypano­somes africains (T bruceiet T congolense)après amplificaton génique, par la tech­nique d'amplification en chaine par poly­mérase (PCR), des séquences spécifiquesde "ADN satellite décrites par Sloof et al(1983). Les oligonucléotides utilisés ont ététestés par Moser et al (1989) et Masiga etal (1992).

L'originalité du travail repose sur la miseau point d'une méthode de traitement deséchantillons, facile à mettre en œuvre, quipermet leur conservation pendant plusieursmois et leur transport, à températureambiante (Oury, 1989). La contrainte demaintenir une chaine de froid du lieu de pré­lèvement au laboratoire est ainsi évitée.

Cette technique de PCR est reproduc­tible, spécifique et sensible. En effet, 0,1 à1 pg d'ADN (équivalent de 1 à 10 parasites),1 à 10 parasites de culture et, enfin, 10 à100 parasites mélangés à des intestins demouches ont pu être détectés.

606 Molecular biol.ogy in parasitology

Les organes (intestins, glandes salivaireset proboscis) de 187 glossines infestéesexpérimentalement par T brucei brucei ontété analysés. Une très bonne corrélationd~s résultats positifs a été observée entrel'analyse parasitologique (15 mouches) etla technique de la PCR. Cependant, 70,5%de mouches trouvées négatives à l'examenparasitologique se sont révélées positives enPCR. En somme, seules 29,5% desmouches parasitologiquement négativesaprès examen microscopique ont présentédes résultats négatifs en PCR.

" Ces premiers résultats démontrent unemeilleure sensibilité de cette technique parrapport aux méthodes parasitologiques clas­siquement utilisées. Cette technique devraitêtre d'une grande importance dans la com­préhension de la circulation des trypano­somes chez l'hôte vecteur dans les diffé­rents faciès épidémiologiques de latrypanosomiase africaine.

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Obtention d'anticorps monoclonaux vis­à-vis des espèces Trichinel/a spiralis etTrichinella T5 : leur utilisation commemarqueur d'espèce. P Boireau 1, JFFabien 1, M Vayssier 1, C Vallet 1, C Per­ret 1, C Soule 1, JF Vautherot 2 (1 CNEVA,laboratoire central de recherches vétéri-

naires, 22, rue Pierre-Curie, 94703 Mai­sons-Alfort ;2 INRA, Virologie et immuno­logie moléculaires, domaine de Vi/vert,78350 Jouy-en-Josas, France)

. Trichinella sp est un Nématode infectant lesMammifères et les Oiseaux (Soule et al,1991). Après l'absorption des larves L1encapsulées, le cycle intestinal est trèsrapide. Les larves L1 passent en quelquesheures aux stades l2, L3 et L4 avant de setransformer en adultes (Despommier, 1990).Ceux-ci sont vivipares et donner.t des petiteslarves dès le 4e jour après l'infection. Leslarves nouveau-nées "traversent la paroiintestinale avant d'aller s'encapsuler d~nsles muscles striés. Plusieurs espèces detrichine sont identifiées, parmi lesquellesl'espèce T5 responsable d'une épidémie detrichine chez l'homme en France (Soule;1992), et l'espèce T spiralis infectant plusfréquemment le porc domestique.

Nous avons obtenu des anticorps mono­clonaux (AcM) vis-à-vis de ces 2 espèces detrichine. Plus de 150 hybridomes positifs enimmunofluorescence ont été obtenus. leprotocole d'immunisation court ainsi quel'utilisation de la voie locale nous ont per­mis de sélectionner des AcM reconnaissantdifférents organes parasitaires. Les résul­tats présentés regroupent les anal~'Ses por­tant sur 40 de ces AcM. Cinq AcM ont réagiavec la seule espèce T5 constituant desmarqueurs d'espèce simples à utiliser.

Références

Despommier DO (1990) Trichinelfa spiralis: the wormthat would be virus. Parasitol TodayS, 193-196

Soulé C, Dupouy·Camel J, Ancelle T, Bouree P, Tou­ratier L (1991) La trichinellose, une zoonose en évo·lution. OIE·CNEVA, Paris

Soulé C (1992) Trichinellosis in France. Wiad Parazytol38,3-4

Détection, par peR, de larves de Trichi­nella spiralis dans le sang d'un chevalexpérimentalement infesté. C Soulé 1, JP

MU..S·,EUM ·D'HI·S·TOIRE·,.NATURELLE~.,,"" .~. '", _...:. :l~..":.. i. ..~..~~. I~':' .. _. -.. ' .-.: '.. .- .' ." '.. .':.. . . '.' .....

SYMPOSIUMOUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE

EN PARASITOLOGIE

pour

et

Organisé par:

-' La station de Pathologie Aviaire et deParasitologie de l'INRA de Tours,

- Le laboratoire de Parasitologie de laFaculté de Médecine de Tours,

- Le laboratoire de Biologie Animale del'Université d'Orléans.

----DETECTION ET IDENTIFICATION DES mYPANOSOMES AFRICAINS PAR LA

_TECHNIQUE DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR).

~'zila Mouanda, A., Oury, B., Cadoux, C., Grébaut, P., Nitcheman, S. et Lemesre, l.L.

ORSTOM, UR Maladies Infectieuses et Parasitaires. B.P. 5045, 34032 Montpellier.

Parmi les .espèces de trypanosomes sévissant en Afrique, Trypanosoma brucei et T.congolense appartenant respectivement aux sous-genres Trypanozoon et Nannomonas sontd'une grande imponance, de part leur pouvoir pathogène pour de nombreux animauxdomestiques. De plus, T. b. gambiense et T. b. rodhesiense sont responsables de la maladiedu sommeil chez l'homme, les mammifères domestiques et sauvages ayant un rôle deréservoir important chez le second. Enfin, T. b. brucei circule exclusivement chez lesanimaux.

Actuellement, les différentes méthodes de détection et d'identification des trypanosomes. africains aussi bien chez l'hôte vertébré (l'homme ou l'animal) que chez les insectes vecteurs

(en paniculier les glossines) manquent de sensibilité. Ainsi, de nombreux malades échappentau dépistage et les taux d'infection des glossines sont sous-évalués. Par conséquent, Lesdonnées épidémiologiques obtenues lors des enquêtes sur le terrain sont insuffisantes.

Dans le soucis de mieux comprendre la circulation -des trypanosomes dans différentsfaciès épidémiologiques, nous avons développé, la technique de détection et d'identificationdes trypanosomes africains par amplification génique ou PCR

L'originalité du travail repose sur la' mise au point d'une méthode de traitement deséchantillons, f2.cile à mettre eo:: oeuvre qui permet leur conservation pendant plusieurs mois etleur transport, à température ambiante. La contrainte de maintenir une chaîne de froid du lieude prélèvement au laboratoire est ainsi évitée. •

Cene technique de PCR est reproductible, spécifique et sensible. En effet, 0,1 pg d'ADN(équivalent à 1 parasite), 1 à 10 parasites de culture et enfin, 10 à 100 parasites mélangés àdes intestins de mouches ont pu être détectés.

Une évaluation a été faite sur 100 intestins de mouches infestées expérimentalement parT. brucei brucei. Une très bonne corrélation des résultats positifs est observée entre l'analyseparasitologique (examen microscopique après dissection) et la technique de la PCR.Cependant, près de 75% des intestins de mouches trouvés négatifs en examen parasitologiquese sont révélés positifs en PCR. En somme, seules 25% de mouches parasitologiquementnégatives après examen microscopique ont présenté des résultats négatifs en PCR.

Les premiers essais réalisés sur le sang parasité sont très prometteurs pour l'utilisation decette technique chez les sujets trypanosomés.

Ces premiers résultats tendent à montrer une meilleure sensibilité de cette technique parrapport amc méthodes parasitologiques classiquement utilisées.

A~plificati0!1 génique (PCR), l\:1éthode parasitologique? Trypariosomes africains, Glossines.. . .

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TURKISH SOCIETY FOR PARASITOLOG

FREE COMMUNICATIONSPOSTER SESSIONS

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1994

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1L~,-.:,

Eœtors in ChjeJM.Ali bZCEL

M.Ziya ALKAN

Volume 2

.Abstracts···~'-fi.

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ORGANIZED SY

POSTER SESSION

MOLEClIlAR AND CELL BIOLOGY

oerOBER 11,1994 TUESDAY

CHANNEL 2

Po 5 MOLECUlAR AND CELL B10LOGY OF TYRIPANASOMIDAE

---P- -S- -01'(7-0-)-'----'I-'--~~:w ~"ISSLIE LE~~I~~(:~;G1.unNINS)o . OF Vr.CTURS: SllllVI!Y OF TIIEIR

... . . CIIi\f(i\CTElUSTICS

AFRICAN TRYPANOSOMES DETECTION AND·IDEmlF1CA1l0N IN TSE-TSE FLtES BY USINGTHE POLYMERASECHAIN REACTION (PCR)

PoS.04(536)

~.iull!!!!.!~1.L- Il)I';a V. Uhlif J. Kilim K-II'• IIIMitllt..- .Ir l·al;l(,ilt,I(I~)'. '\c:ht.:nl)" tif S'Îl:lh:',,$ (If Ille l"/l'l'I. I(CllllhIIC.,1:Il'U!t\' uf Bi,II(I~~il,.·;11 SdCIIL'C:o'. lIJ::\I.·r\il)" ur Slluth Ullht"l;I:~'. (.I..,~c!

n.Ù"~'J;'\'iL"e.Cn: h l<Ci'Ubhl'•• In ... lllult: llr Zlllll\lS)';L'lIi\ cr~i1y llf

Rel:Cl~...lllll g. Hc:.!c: .... I'."rJ;. Gelnl:lll)'

CtJl1cl'ruin~ Ihe I1l11h-l'ul:lr "f:'ll'lnrS ur ICl..o~nilion ~elr/lll1n·~elr in\'cl,:ll1r.par:1ll.iIC ;nul \·cctur·s)'lnbiulIl intl·r:k:liolls Ihe I~clins (:I~a:;lolinins) inl:rIU(11)"l1Iph :11U.) III1'J1:Ulli"~ll~ ur ÎmpOIl;lHl c.JÎs~:I.~e \·CI,."IUrS l/\tc/c'S dt):."!'/;;

(;/",\\;11" (Ile 1r;""M('.~: T,;.,!w"" ;'{/i·.umt,\': /nl(/rs rir.:;IIIl.fl 1161\'e bcen !'luc.Jicc.J:Tu date. 'l nl\\d Ic-":Iin \\ilh:t himlin1! ~pcC'itil"Îry l'ur lh~ 11l::c.u~:lInim:,. 11\ alIIillglll hUlIllIgcn;,h.· llr Ihl: I1II1~ClUiIU It (Ie·}:.t"; h:l.~ been r\lunll. Anulhcr IWU'

"lIre:ollll~l·lin~. e",h or Iholll ho;1t or l'":y olle 511bunil 01 27 and/or 3U i.D~,

ha,el'ccn L1iMillcllhhed ill ~ lIIiLlgul extraCi of the I~l~e 0, G. r"cMIl";.Jc.'.11IIhe hll~ 1: ;uf;.\fllll. Ihe :I~~tUlillill~ in Ihc glll ,,1\11 helUol)',"!,h werc~,·lecleLl.The leclin-Iike aeaiL'il)' loc~li7.cLllnlhe gllllJr the hug """~ re"caleLltll he "n acliLil)' u;-lhelil"'I",lp:lechariLle hillLlin~ pfulein IU'S-DP). MiLlgUl.wall cdb:lfe re,poll'Oble rl.r" 5,lIlhe~i~or Ihe LPS-UP ...Ilh nllly one5lrllclural ~uhunil ur 2n ~ll~. 1I111ike lhe nlillpll LPS·[lP.ll:e helllol,lIl~h

"g~I"linin \\'i\h bimlillg ~pceificily fur D-gala'lo,," belong~ clearly lUlher.ulIIl)" or kl"till~. Lcclins i1IHJ/or lcctin·like 3CIÎ\'ilies in /nJ.i,,·s '·ÏL"illll.fhellll1l)'nI"h ~1IL1 nlilieUl wcre h!cllliricLl. The nllLlgut ~CCluliuin in the lick<e~lII~ 10 he ~ prnlein r"Clllr wilh binLlin!! prupcrlic~ (.f I.rs·lIl'. ThehClllol) J11l'h Ic\.·lill which i~ ~1)C\.·lnc.: rur sialic ncic.J i\11c.J ~umc vlhcof;ullinu,,"ug:lrs \\,,~ hl(';,li7CJ nul uni;, inlh-= cyluplO1smÎC mcmhr:lIle or 'llllhethrec tlpcs ur Ikk hCJllCK·ylc:\. hU\\·CO\'COf. ~urprbil1~l)' in lhe 11Icmhr'lnl:.';; urc.lll1l1dci '" weil. LeClill' (a!!~llllillil1~) il1"'!"eLl,,~ the ph)'siolncieal r.Clursuf inn~r ell\ ir';,HlII1l:nlllr IIl:miltoph3guus ,uthwltuUS lill~cI.1S. Heks) might bcill\l,h'cd iI1I101n(Jllis~il'lI of dr;,1. h:u:tcori:ll 'lnd (1luI07.0;'11 inrC\.·IÎUtll\ t1s~n\s.

L. ~. _PoS.03(~97)

H~STONE Hl IN TBYPANOSQMA CRUZ!'

Âslund L Carlsson L, Hanrik~son J, Bydilkltr M, Toro C.G", Nortel0' and Pdrersson U.Dept. 01 Med;cal Genalics. Biomedical Cellter, t30x 569. UppsalaUniversity, 5·751 2:S Uppsala, ~"Yla:le[1 and 'Oilpt. 01 Cell Eiologyanel Gene:ics, Uni...ersity of Chile, Santiago, Chile. .

The chromalin.of the parasit·: Iw.a!lQ32maWU Is less co;ld!!nseddurlng coll di\'isiçn compared to ol~ar eucaryotes, The chromalin Is

1

also mere sensllive la nucleases as compared wllh chromslins fromolher spacias. Pr~sence of histone Hl, essential fN packaJino 01

. nuclec~omes into higher-order slruc1ura. waslhareforQ ln qùesiion.HowevEr, compact helerochromalln Is present during the interphaseand rcce!'1lly a high mo!_lIity pretein from I.knW..was Identified in acid·urea gels which has been shown 10 cross·rDael wilh anliserum a;lainsthistone Hl, fAcreover, amino ncid sequer1ce 01 Iryptlc peptides Iromthe puri;ied prolein presents motifs similar 10 Hl histones Irom otherspec:es. ln order to determin~ the. primary structure ollhis protcin.we have Isclaled both genomlC and cONA c!..nes cncoding histonoH1·like proleins by using a dageneratc t'ligonucleotidecorrt~porlding 10 one of the jleplidos. Tha ganes encoding thesehistone Hl prolllins ware lound 10 belong It' a gene lamilyhelerogenous in sequence. Filleen 10 20 copies of lhe genesencoding the hislone Hl, p(olei~ were loulid 10 be orgar.ized in alandem array and Iocaloo in e cJuster on a single chl'Qmosoma wkh a

1size 01 2.2 Mbp. Il is unknown if ail diflerent gene copies areexpressed cor.comillanlly in the pdrasite. Ali Hl Iranscript9.howevar, were polyadenylaled unlike histone mRNAs froin moclother species.The protetn sequences daduced lrom the primary sequonces 01 thecONA clones corresponded 10 unusually small polypeptides (74-97amino acids). Tho proleins were very Iyslne·rlch and showed a highvariabilily ln amino 3cid sequence. These short polypeptides werelound 10 correspond 10 Ihe C'lerminaJ domaIn!: of other Hl histones·and lacked Ihe N·terminal and ~Iobular demains completely. Thaseunusual histone Hl proleins mlght Ihu9 conlrîlJule 10 the lessercordensation of the chromalin in I..cLuz.I. .

N'zi\a Mouanda A. OUI}' B. Fournet F. Cadoux C. Grébaut P,Dia M and Lemme J L:

Unilé de R-iologie Paruitaire (LEMV), ORSTO~'. B.I'. SO-IS.34032 Monlpellier eédex 1. ·Franec.

Among Ihe speeies of UYplnosomes whieh oeeur in Africa.TrypancsOI1IQ bruui and T. cOlIgohnse. memb:n respeelively of TrypanclDDIIand NannDtTlDNJS sub-spceies are highly pothogenie ror m:u1Y animlls. T. b.

gambiense and T. b. rodhesicnsc are the IgenlS of the human sleepingsiekncu. The role of the domeslic and wild lIIin,.1 <esen'oirs is very impol'wllfor the lUI one.

CurTenlly. the various melhods us~d 10 delcel and idenliry drieanlZ)'pooosomcs in vezlebrl.e hoslS u wellu in the woel veelor lack spceifieityond sel\$itivily. 50. numcrous p.aticnlS arc undeleeled and glossùlS infectionraIes are undczeslirnalCd. Coruequcntly. cpidemiolosiell c:bla are minimiza:!.

Wc repona:! hcre the optimiUlion of1 PCR lCeluùe rer Ille delcclionofT. b. brucci and T. cOlIgo/ense in \sc·lSe flics by largeling repelitive DNAusing primers delcrmina:l from salellile DNA sequences previously describcdby Moser el al. (19S9). An useful Ilellmenl or umples allowed theirpresczvation for several montlu Il ambianllemperllure before anllysis. ThedelCetion is speciu.spceifie and sCl\$itive.lndceJ. u leu u 0.1 pg of DNA (1equivalem paruile). 1 ID 10 Irelied parasites IIId 10 ID 50 eells in anifieiallyWeCled glossin orgaru wcre dcloelcd unequivocl1ly.

Organs (inleslin, ulivary gllnd and proboseis) from 187 mesexperimenlolty infoela:! with T. b. brucei were IIlllysed. Tse-lSe mes infeeledorgll\lô (15) revealed by microscopie examino:ion wcre III positive in PCR. Ineonlru\, 70.5% of negllive samples glve 1 positive ..sull by PCR. Al thewhole, only 29.5% ofsa:nples were neglti~e in both methods.

These dltl demOl\$IZlled the excellenl sensitivily of PCR methodeompared 10 the dusiell microscopie examinllion. This mcthodologiealapproleh eould he suilable in large,sclle ruIYeys for. beller understanding ofIrypanosonles çireultlion in various epidemiologiell racies. For example.severily of sleë'ping sickneu in «nllii driel eannol be explained by Iheillrc:<:lion rales_eneounlered in gtouins. Use or PCR mighl rcconsider thellansmiuion level ar.d the prentenee of the discose in thue endemie areas.

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MEASUREMENTS OF [CA2+h OFINDIVIDUAL HOST CELLS INFECTED

WITH TRYPANOSOMA CRUZl

NAKAJIMA-SHJMADA J. and AOKI T.**Depanment of Parasitology, Juntendo University School ofMedicine, Tokyo. Japan

Chagas' discase, caused by Trypanosoma cruzi, is of majorimportance in cardiac diseases in vast areas of Central andSouth America. To gain an insight into the cellular andbiochemical bases of the pathogenic processes, we haveIquantitativCly detennined the [Ca2+lï in individual nonnal hostce Ils and ceIls infected with T. cruzi, employing fura·2 as aCa2+·specific probc. Exponenriatly growing HeLa cells wereincubated for 2 days and then infected with T. cruzitrypomasrigores. Three to five days after the infection, the cellswere washed and incubated at 37~C for 45 min in 1~M fura-2·AM. The specimens were observed wirhin 15 min under amicroscope equippcd with an integral fluorimeter systemgencraring twO synchronized lighr beams of selccted

IwaVelengths. Two images of fluorescence of fura·2 excired at340 and 380 nm were acquired by the SIT camera and an imageprocessor of Hamamatsu Photonics ARUGUS·lOO. From theratio of fluorescence intensities obtained through the imageprocessor. the [Ca2+Ji was calculated. Control HeLa ceUs hadthe [Ca2+)j value of 115±9 nM. In contrast, a typical infectedHeLa cell exhibited a higher levcl of [Ca2+Ji in the cytoplasmthan in the nucleus, and 50 separate dctenninations gave an,average [Ca2+Ji value of 304±28 nM. Since the fluorescence offura·2 was not demonstrated in intracellular amastigotes, theamastigote-induced and elevared [Ca2+]i concentrations aredirecrly associated with the cytosolic [Ca2+]j of host cells. Forfunher understanding of mechJnisms of calcium homeostasis inIhe host cells infected with T. cmzi, the merhod developed inthis srudy is useful for monitoring [Ca2+)j in individual cells.