Acclimatation à la nuit polaire puis au retour de la lumière chez la diatomée arctique Fragilariopsis cylindrus

Mémoire

Philippe-Israël Morin

Maîtrise en biologie Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Philippe-Israël Morin, 2017

Acclimatation à la nuit polaire puis au retour de la lumière chez la diatomée arctique Fragilariopsis cylindrus

Mémoire

Philippe-Israël Morin

Sousladirectionde:

MarcelBabin,directeurderecherche

iii

Résumé (Français) Durant l’hiver en Arctique, les algues de glace et le phytoplancton passent près de 6 mois à

l’obscurité totale avant que les conditions pour la croissance soient optimales au printemps.

Comment les algues polaires, composées principalement de diatomées, réussissent-elles à

survivre à d’aussi longues périodes d’obscurité et à croître dès le retour de la lumière?

Quels sont les mécanismes physiologiques impliqués? Les objectifs de l’étude présentée

visent à caractériser l’état cellulaire d’une diatomée arctique, Fragilariopsis cylindrus,

durant une période d’obscurité totale représentative de l’hiver polaire afin de mieux

comprendre les mécanismes qui permettent la survie à l’obscurité prolongée et au retour de

la lumière. Nous avons mesuré les mécanismes physiologiques impliqués en mesurant

plusieurs paramètres à des intervalles précis: les premiers jours, les premières semaines et

les trois premiers mois d’obscurité ainsi que les premières heures et les premiers jours des

retours à la lumière après 1,5 et 3 mois d’obscurité. Les paramètres mesurés comprenaient

le nombre et la taille des cellules, le carbone et l’azote particulaire, les lipides, la

composition en pigments, la flurorescence variable, les protéines photosynthétiques (D1,

RUBISCO), les paramètres photosynthétiques et le quenching non-photochimique (NPQ).

Quelques jours après la transition à l’obscurité, Fragilariopsis cylindrus s’est acclimatée à

un état stable qui s’est maintenu jusqu’au retour de la lumière. Cet état est caractérisé par

un nombre et une taille des cellules stables, une faible consommation des réserves

d’énergie, une faible diminution des pigments photosynthétiques et de très faibles capacités

photosynthétiques. Après 1,5 mois d’obscurité, la réexposition à la lumière a déclenché une

forte réponse du NPQ et un réassemblement de l’appareil photosynthétique, suivi d’une

reprise des activités métaboliques et de la croissance cellulaire. La réexposition après 3

mois s’est caractérisée par une reprise des activités beaucoup plus lente, probablement

causée par une mortalité plus importante.

iv

Résumé (Anglais) Polar winter in the Arctic can last as long as 6 months each year at high latitude. During

this period, no light is available for photoautotrophic growth. Nevertheless, when light

returns in spring, a sea-ice algae and phytoplankton bloom develops in the surface ocean

layers. Therefore, the following questions can be asked: How do photoautotrophic

communities (mainly diatoms) survive through winter darkness until light returns in spring?

What are the physiological mechanisms underlying such survival? Our goal was to

understand the acclimation processes at stake in both darkness and during the return to light

by closely looking at the changes in intra-cellular content and functional capacity of a polar

sea-ice diatom, Fragilariopsis cylindrus. We measured a set of parameters at specific time-

points: the first days and first weeks up to 3 months of darkness, and the first hours up to 6

days upon return to light. This set included cell number and cytometry, cellular carbon and

nitrogen quotas, lipid and pigment contents, fluorescence determinations, photosynthetic

proteins (D1, RUBISCO), photosynthetic parameters and non-photochemical quenching

(NPQ). A rather stable state was reached few days following transition to dark and was

maintained throughout until the return of light: stable cell size and number, low energy

reserve consumption, slow decrease of photosynthetic pigments and very low

photosynthetic capacities. Subsequent transition to light after 1.5 months induced strong

NPQ activity and reassembly/renewal of photosynthetic components, followed by

metabolic recovery and cell growth. Transition after 3 months showed a much slower

recovery and no cell growth, highlighting the increase of potential mortality with longer

periods of darkness.

v

Table des matières Résumé (Français)........................................................................................................iii

Résumé (Anglais)..........................................................................................................iv

Table des matières.........................................................................................................v

Listes des tableaux.......................................................................................................vii

Listes des figures........................................................................................................viii

Listes des abbréviations................................................................................................x

Listes des annexes........................................................................................................xii

Remerciements............................................................................................................xiii

Avant propos...............................................................................................................xiv

Chapitre 1. Introduction...............................................................................................11.1 Les diatomées en Arctique..................................................................................................11.2 Floraisons printanières.......................................................................................................11.3 Survivre à l’hiver polaire....................................................................................................3

1.3.1 Production de spores de résistance....................................................................................61.3.2 Nutrition hétérotrophe et métabolisme..............................................................................61.3.3 Régulation de la physiologie et des activités métaboliques...............................................81.3.4 Impact sur la photophysiologie.........................................................................................9

1.4 Retour de la lumière.........................................................................................................111.4.1 Photoprotection...............................................................................................................111.4.2 Reprise de la photophysiologie.......................................................................................12

Chapitre 2. Problématique..........................................................................................14

Chapitre 3. Objectifs et hypothèses de l’étude............................................................15

Chapitre 4. Développement.........................................................................................164.1 Introduction.....................................................................................................................174.2 Methods...........................................................................................................................19

4.2.1 Cell culturing...................................................................................................................194.2.2 Sampling design..............................................................................................................194.2.3 Cell number and volume.................................................................................................214.2.4 Carbon and nitrogen........................................................................................................214.2.5 Lipid droplets..................................................................................................................214.2.6 Pigments concentration...................................................................................................224.2.7 Photosynthetic proteins...................................................................................................224.2.8 Variable fluorescence......................................................................................................234.2.9 14C incubations................................................................................................................244.2.10 Statistical analysis.........................................................................................................26

4.3 Results & discussion.........................................................................................................284.3.1 Dark experiment..............................................................................................................28

4.3.1.1 Cell and reserves....................................................................................................................284.3.1.2 Photosynthetic apparatus dismantlement...............................................................................30

4.3.2 Light experiment.............................................................................................................36

vi

4.3.2.1 Photosensitivity and photosynthetic apparatus reassembly....................................................364.3.2.2 Metabolism recovery..............................................................................................................41

4.4 Conclusion.......................................................................................................................44

Chapitre 5. Conclusion................................................................................................45

6. Références................................................................................................................48

7. Annexes...................................................................................................................56

vii

Listes des tableaux

Tableau 1 Liste des expériences de survie à l’obscurité chez plusieurs espèces de diatomées. ............................................................................................................................... 4

viii

Listes des figures

Figure 1 (A) Schémas représentant le développement de la floraison printanière en Arctique selon le temps de l’année. ....................................................................................................... 2

Figure 2 Influence de la température sur la survie de différentes espèces à l’obscurité. ....... 5

Figure 3 Timeline of the sampling strategy for dark period and light return experiments. The vertical lines show the times of sampling, and the dashed arrow shows transfer of a fraction of the replicate cultures prior to light return #1 at 1.5 months following dark transition. .............................................................................................................................. 20

Figure 4.a) Biovolume (black, gray) and Cell number per mL (blue, skyblue) b) Cell volume (black, gray) and lipid droplets (blue, skyblue) c) POC (black, gray) and PON (blue, skyblue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ........................................................................ 29

Figure 5.a) Chlorophyll a (black, gray) and Fucoxanthin per cell (blue, skyblue) b) Diadinoxanthin (black, gray) and Diatoxanthin per cell (blue, skyblue) c) σPSII (black, gray) and PHP/NPHP (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ................................................................ 31

Figure 6.a) PsbA (black, gray) and RbcL (blue, skyblue) per cell b) initial slope of carbon fixation (α) (black, gray) and ΦM (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. .............................. 33

Figure 7.a) Carbon fixation maximum (Pmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ...... 34

Figure 8.a) Non-photochemical quenching maximum (NPQmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. ....................................................................................................... 35

Figure 9.a,b) NPQmax (black) and de-epoxidation state (DES) (blue) c,d) Diadinoxanthin (black) and Diatoxanthin (blue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. ....................................................................................................... 37

Figure 10.a,b) Chlorophyll a (black) and Fucoxanthin (blue) per cell b,c) σPSII (black,) and PHP/NPHP (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments.. ......................................................................................................................... 38

ix

Figure 11.a,b) PsbA (black) and RbcL (blue) per cell c,d) Pmax (black) and ΦM (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. .......................... 40

Figure 12.a,b) POC (black) and PON (blue) per cell c,d) Cell volume (black) and Lipid droplets (blue) e,f) Biovolume (black) and Cell number per mL (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. .................................................. 42

x

Listes des abbréviations POC Carbone organique particulaire PON Azote organique particulaire DOC Carbone organique dissous BODIPY 4,4-Difluoro-1,3,5,7-Tetramethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene LHCII Complexe antennaire de l’absorption de la lumière au photosystème II LHC Complexe antennaire de l’absorption de la lumière FCP Complexe protéique antennaire lié à la chlorophylle et la fucoxanthine PSII Photosystème II CP43-47 Protéines de l’antenne interne du photosystème II RCII Centre réactionnel du photosystème II Chl a Chlorophylle a Chl c Chlorophylle c Fuco Fucoxanthine DD Diadinoxanthine DT Diatoxanthine DES État de de-époxidation (DT/(DD+DT)) PHP Pigments photosynthétiques (Chl a + Chla c + Fuco) NPHP Pigments non-photosynthétiques (DD+DT) σPSII Section efficace d'absorption de la lumière du PSII [Å2 (quanta)-1] ΦM Rendemant photochimique maximale au PSII ΦPSII Rendement photochimique au PSII RLC Rapid light curve protocol

xi

ETRmax Taux maximal relatif du transport d’électron NPQ «Quenching» non-photochimique NPQmax «Quenching» non-photochimique maximal D1 Protéine du RCII PsbA Sous-unité de la D1 RUBISCO Ribulose-1,5-bisphophaste carboxylase/oxygénase (Enzyme responsable de

la fixation du carbone) RbcL Grande sous-unité de la RUBISCO Pchl Taux spécifique de fixation de carbone [mg C (mg chl a)-1 h-1] Pmax Taux maximal de fixation de carbone(mg C m-3 h-1) α Coefficient de l’activité photosynthétique ou pente initiale de la courbe P vs

E [mg C m-3 h-1 (µmol photons m-2 s-1)-1] EK Paramètre de saturation de la fixation de carbone (µmol photons m-2 s-1)

KE Éclairement auquel le taux de croissance sature (µmol photons m-2 s-1)

xii

Listes des annexes Annexe 1: Picture of Fragilariopsis cylindrus (Grunow) Krieger CCMP1102 (JGI)……..56 Annexe 2: Culture medium recipe (f/2 and L1)……………………………………………57 Annexe 3: Picture of the inside of the growth chamber with culture 1(left), culture 2(centerback) and culture 3(right) of Fragilariopsis cylindrus grown in 20L polycarbonate round vessels during light acclimation prior to dark transition…….....................................59 Annexe 4: Spectrum of the different light sources used during the experiment…………...60 Annexe 5: Picture of the culture 1(front), culture 2(middle) and culture 3(back) of Fragilariopsis cylindrus grown in 3L vessels during the Light1-2 experiment…………...61

xiii

Remerciements J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur Marcel Babin pour avoir supervisé mes travaux tout au long de ma maîtrise, pour m’avoir bien conseillé lors des différentes étapes de mon cheminement et pour m’avoir transmis les bonnes pratiques de la science. Merci aussi pour toutes les opportunités de collaborations, d’expéditions, de conférences et de réseautages auxquelles j’ai eu accès. Enfin, merci pour avoir contribué à ma formation professionnelle et au développement de mon sens critique et de ma notion sur la rigueur qu’il faut appliquer en recherche. Pour la mise en œuvre de mon expérience, je remercie particulièrement Flavienne Bruyant. J’ai pu appliqué les bonnes techniques dans le laboratoire dès le départ et éviter de recommencer mes expériences plusieurs fois. Merci aussi pour avoir participé très activement lors des périodes d’échantillonnage. Enfin, merci pour avoir pris le temps de répondre à mes nombreuses questions. Pour l’évaluation du mémoire ci-présent, j’aimerais remercier les membres du jury d’évaluation composé de Connie Lovejoy, Line Lapointe et Marcel Babin. Merci pour votre temps et pour vos commentaires constructifs. J’aimerais aussi remercier Johann Lavaud, Joannie Ferland, Marie-Hélène Forget, Thomas Lacour, Pierre-Luc Grondin, Jade Larivière, Natalie Donaher et Doug Campbell pour avoir participé activement lors de l’échantillonnage et/ou lors de la révision de mon manuscript. Merci aussi à Catherine Lalande, Thibaud Dezutter, Marie-Josée Martineau, Gabrièle Deslonchamps, Chris Eberlein, Alexandre Dubé pour leur aide lors de l’analyse d’échantillons. Merci à Joannie Beaupré, Manon Bélanger et Gabriel Khelifi pour leur aide lors de périodes d’échantillonnage. Merci à Nicolas Schiffrine pour son aide en laboratoire pour le partage d’équipements. Merci à José Lagunas-Morales et Guislain Bécu pour leur aide lors de la conception de l’éclairage pour mes expériences. Merci à Marc-André Lemay et à Philippe Massicote pour leur aide en programmation et en statistique. Merci à Julie Sansoulet et Debra Christiansen-Stowe pour leur support administratif. Finalement, merci à toute l’équipe de l’Université de Mount Allison pour m’avoir accueilli lors de ma visite en été 2016 pour l’analyse d’échantillons. Un merci spécial à Natalie et Daniel Donaher pour m’avoir hébergé lors cette visite. Pour terminer, j’aimerais remercier mes amis pour leur support en dehors de l’université. Merci aussi à mes parents pour leur aide tant sur plan moral que sur le plan financier. Finalement, merci pour tous vos encouragements qui furent très appréciés.

xiv

Avant propos La soumission de l’article inséré est prévue à l’été 2017 dans New Phytologist. L’étudiant Philippe-Israël Morin est le principal auteur du manuscript présenté. Il a contribué en majeure partie à toutes les étapes menant à la publication de l’article inséré. Les coauteurs listés ont participé activement lors l’acquisition de données et/ou lors de la révision du manuscript.

1

Chapitre 1. Introduction

1.1 Les diatomées en Arctique Les diatomées sont des eucaryotes unicellulaires et photosynthétiques qui dominent depuis

plus de 100 Ma la grande majorité des océans (Armbrust 2009, Bowler et al., 2010). Elles

forment le groupe de phytoplancton le plus diversifié et le plus abondant avec plus de 100

000 espèces et produisent à elles seules 40 % de la production primaire marine (Nelson et

al., 1995, Sarthou et al., 2005, Falkowski and Knoll 2007). Leur rôle est essentiel au sein

de la chaine alimentaire marine. En Arctique, les diatomées représentent le groupe de

phytoplancton et d’algues de glace le plus abondant durant la floraison printanière (Hsiao

1980, von Quillfeldt 2000, Poulin et al., 2011). Actrices majeures dans l’écosystème

arctique, elles font face aux conditions extrêmes de température, salinité et de lumière de

cet environnement. Les adaptations à ces conditions extrêmes chez les microorganismes et

chez les microalgues ont reçu une attention grandissante au cours des dernières années

(Morgan-Kiss et al., 2006, Casanueva et al., 2010, Lyon and Mock 2014, Lacour et al.,

2017), mais il reste encore beaucoup à découvrir sur les adaptions particulières des

diatomées polaires.

1.2 Floraisons printanières Aux pôles, quand le printemps approche et le jour s’allonge, la fonte de la banquise

annuelle débute et l’éclairement qui pénètre la colonne d’eau s’intensifie. La couche

superficielle de l’océan stratifiée par l’eau de fonte est alors riche en nutriments grâce au

mélange hivernal. Ces conditions permettent aux communautés phytoplanctoniques

d’entrer dans une période de croissance cruciale pour la production primaire et secondaire

en Arctique (Leu et al., 2011). Cette période de croissance est appelée la floraison

printanière. La production primaire atteint son maximum durant la floraison printanière et

elle fournit la majeure partie de la production annuelle en Arctique (Perrette et al., 2011).

Les premières à initier une croissance autotrophe au printemps après la nuit polaire sont les

« micro-algues de glace » (algues sympagiques) malgré les très faibles lumières qu’elles

reçoivent sous la banquise généralement couverte de neige (Mundy et al., 2005, Leu et al.,

2011, Wassmann 2011) (Fig. 1). Ces algues de glace peuvent contribuer jusqu’à 57% de la

2

production annuelle dans certaines régions de l’Arctique (Gosselin et al., 1997).

Néanmoins, les espèces pélagiques (phytoplancton) contribuent à la majeure partie de la

production primaire. Avant que les conditions pour la croissance soient optimales au

printemps, les algues de glace et le phytoplancton passent près de 6 mois à l’obscurité

presque totale.

Figure 1 (A) Schémas représentant le développement de la floraison printanière en Arctique selon le temps de l’année. La croissance des algues de glace débute à la mi-mai et est éventuellement remplacée par la floraison du phytoplancton lorsque la banquise se retire. Les mois de juin et juillet voient les communautés photoautotrophes (en vert) se développer jusqu’à ce que les nutriments s’appauvrissent. Les communautés hétérotrophes (en rouge) dominent la fin de l’été et l’automne. Les flèches indiquent le transport vertical de la matière organique. Cette figure est tirée de Wassmann (2011). Ces organismes sont des photoautotrophes, c’est-à-dire qu’ils utilisent l’énergie de la

lumière pour synthétiser du carbone organique par un processus biochimique complexe, la

photosynthèse. Les micro-algues peuvent être exposées régulièrement à des périodes

d’obscurité plus longues que la nuit. Par exemple, le mélange vertical peut être beaucoup

plus profond que la zone euphotique1(Marshall and Schott 1999). Le phytoplancton

emporté sous la zone euphotique peut passer une longue période à l’obscurité avant de

retourner à la surface. Privé de la photosynthèse, le phytoplancton doit acclimater son

métabolisme pour survivre. La survie à l’obscurité est fondamentale chez le phytoplancton

et elle l’est d’autant plus pour les espèces soumises à l’hiver polaire. En Arctique, leur

métabolisme doit forcément être compatible avec 6 mois d’obscurité, grâce à des

adaptations exclusives ou non aux espèces arctiques. Plus particulièrement, on s’intéressera

aux espèces de diatomées en raison de leur prépondérance en Arctique. 1 Profondeur dans la colonne d’eau à laquelle réside 1% de l’intensité lumineuse en surface (Babin et al., 1996).

3

1.3 Survivre à l’hiver polaire La survie des micro-algues à l’obscurité prolongée a été étudiée à de nombreuses reprises

au cours des dernières décennies. On a observé que la croissance reprenait dès le retour à la

lumière (Smayda and Mitchell.B 1974, Antia 1976, Palmisano and Sullivan 1983, Peters

1996, Peters and Thomas 1996, Zhang et al., 1998, Luder et al., 2002, Reeves et al., 2011,

Martin et al., 2012) (Tableau 1). La durée de la période d’obscurité qui fut imposée aux

micro-algues varie selon les expériences. La viabilité de certaines espèces s’est prolongée

jusqu’à 3 ans (Antia 1976). Peters and Thomas (1996) et Peters (1996) ont montré dans des

expériences séparées que les algues antarctiques semblent être mieux adaptées pour la

survie à de longue période d’obscurité que les algues tempérées. Ces résultats suggèrent

que les espèces polaires ont développé des adaptations qui leur permettent une meilleure

survie à l’obscurité que les espèces tempérées.

Cependant, la survie pourrait être dépendante de la température du milieu comme cela a été

observé chez la diatomée Skeletonema costatum (Smayda and Mitchell.B 1974) et plusieurs

autres espèces de diatomées (Peters 1996) (Fig. 2). La survie à l’obscurité chez la majorité

des espèces étudiées a diminué lorsque température d’incubation a augmenté. Dans le

contexte du réchauffement climatique, les espèces polaires seront vraisemblablement

confrontées à des températures moyennes plus élevées (Stroeve et al., 2007, Grebmeier

2012, McMinn and Martin 2013) et pourraient voir leur survie diminuer. Récemment, des

expériences menées au noir sur des diatomées polaires ont montré qu’elles tolèrent une

élévation de 6°C par rapport à la température ambiante de croissance, soit 4°C de plus que

les prédictions sur la hausse des températures de surface des océans d’ici la fin du 21e siècle

(Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012, McMinn and Martin 2013) (IPCC 2014).

Toutefois, ces résultats ont été obtenus à partir d’expériences à l’obscurité inférieures à 60

jours. Dans un contexte où la nuit polaire dure jusqu’à 6 mois et où les conditions physico-

chimiques (nutriments, salinité, dynamique du mélange vertical, lumière, température) des

couches superficielles de l’océan Arctique peuvent changer, il n’est pas simple de tirer des

conclusions claires sur la survie des diatomées polaires sans connaître l’impact synergique

de ces variables entre elles.

4

Tableau 1 Liste des expériences de survie à l’obscurité chez plusieurs espèces de diatomées. Toutes les espèces présentées ont repris la croissance au retour de la lumière. Tableau tiré de Wulff et al., (2008)

Species Temperature Dark exposure times (days) Reference

Achnanthes brevipes Agardh 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Achnanthes brevipes Agardh 2, 20°C 364 Antia 1976 Amphiprora paludosa Smith 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Amphiprora paludosa var. duplex Donkin 2, 20°C 189, 133 Antia 1976 Amphora coffeaeformis (Ag.) Kütz 7°C 28* Anderson 1975b Anaulus australis Drebes et Schulz 18°C (±2) 62* du Preez & Bate Araphid, pennate diatom ca 10 µm -2°C 310 (364)a Palmisano & Sullivan 1982 Asterionella japonica Cleve (Asterionellopsis glacialis (Castracane) Round) 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Bacteriastrum sp. 18°C 17* Jochem 1999 Bellerochea polymorpha Hargraves & Guillard (Minutocellus polymorphus (Hargraves & Guillard) Hasle, von Stosch & Syvertsen) 2, 10, 20°C 63, >140, 84 Antia 1976 Chaetoceros curvisetus Cleve 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Chaetoceros didymus Ehrenberg 15°C 90d* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Chaetoceros fragile Meunier -1.8°C 93* Bunt & Lee 1972 Chaetoceros gracilis Schütt 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Chaetoceros gracilis Schütt 2, 10, 20°C 112,>210*,133 Antia 1976 Cyclotella cryptica Reimann, Lewin & Guillard 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Cyclotella cryptica Reimann, Lewin & Guillard 2, 20°C 189,105 Antia 1976 Cyclotella nana Hustedt 20°C 49 Antia & Cheng 1970 Cylindrotheca fusiformis Reimann & Lewin 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Cylindrotheca fusiformis Reimann & Lewin 2, 20°C 364 Antia 1976 Ditylum brightwellii (West) Grunow 8, 15°C 35**,30 Peters 1996 Ditylum brightwellii (West) Grunow 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Fragilaria pinnata Ehrenberg (Staurosirella pinnata (Ehrenberg) D.M. Williams & Round) 2, 20°C 280, 364 Antia 1976 Fragilaria sublinearis van Heurck -1.8°C 93* Bunt & Lee 1972 Fragilariopsis kerguelensis (O'Meara) Hustedt 0°C (±1) 127 Peters & Thomas 1996 Lithodesmium undulatum Ehrenberg 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Melosira nummuloides Agardh 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Melosira nummuloides Agardh 2, 20°C 336, 105 Antia 1976 Navicula incerta Grunow ex Van Heurck 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Navicula incerta Grunow ex Van Heurck 2, 20°C 364 (1092)a, 364 wks Antia 1976 Nitzschia angularis Smith 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Nitzschia angularis var. affinis (Grunow) Grunow 2, 20°C 364 (1092)a, 364 Antia 1976 Nitzschia cylindrus (Grunow) Hasle, size 4 gm -2°C 155 (364)b Palmisano & Sullivan 1982 Nitzschia cylindrus (Grunow) Hasle, size 6 gm -2°C 155 (364)b Palmisano & Sullivan 1982 Nitzschia-like 18°C 17* Jochem 1999 Phaeodactylum tricornutum Bohlin 20°C 168* Antia & Cheng 1970 Phaeodactylum tricornutum Bohlin 2, 20°C 364, 364 Antia 1976

Phaeodactylum tricornutum Bohlin 5°C 93 Umebayashi 1972 cited in Anderson 1975b

Porosira pseudodenticulata (Hustedt) Jousé 0°C (±1) 272 Peters & Thomas 1996 Proboscia inermis (Castracane) Jordan & Ligowski 0°C (±1) 214 Peters & Thomas 1996 Rhizosolenia fragilissima Bergon (Dactyliosolen fragilissimus (Bergon) Hasle) 18°C 23* Ignatiades & Smayda Rhizosolenia setigera Brightwell 8°C 21 Peters 1996 Skeletonema costatum (Greville) Cleve 20°C 7 Antia & Cheng 1970 Skeletonema costatum (Greville) Cleve 2, 10, 20°C 168, 63, 28 wks Antia 1976 Skeletonema costatum (Greville) Cleve 15°C 49 Smayda & Mitchell-Innes 1974 Thalassiosira antarctica Comber 0°C (+1) 214 Peters & Thomas 1996 Thalassiosira fluviatilis Hustedt 20°C 56* Antia & Cheng 1970 Thalassiosira fluviatilis Hustedt 2, 20°C 140, 105 Antia 1976 Thalassiosira gravida Cleve 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974 Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal 2, 20°C 161, 105 Antia 1976 Thalassiosira punctigera (Castracane) Hasle 8°C 35** Peters 1996 Thalassiosira sp. 15°C 90* Smayda & Mitchell-Innes 1974

*Période maximale testée

**Nombre de cellules constant pendant 63 jours aViabilité jusqu’à 3 ans bCulture non-diluée laissée pendant 12 mois et dont la croissance a repris après une phase de latence de 3 à 6 mois

5

Figure 2 Influence de la température sur la survie de différentes espèces à l’obscurité. Figure reproduite de Peters (1996)

Alors que les premières études confirmant la survie des micro-algues à des périodes

d’obscurité prolongées n’ont pas offert d’explications sur les mécanismes physiologiques

impliqués, les expériences plus récentes les ont examiné de plus près à l’aide de techniques

de pointe maintenant plus accessibles. Les expériences de survie à l’obscurité prolongée

n’ont pas exclusivement traité de diatomées, mais les informations obtenues sur d’autres

groupes de micro-algues fournissent des pistes qui pourraient être pertinentes vis-à-vis de la

physiologie des diatomées.

6

1.3.1 Production de spores de résistance

Plusieurs groupes de micro-algues peuvent produire des spores de résistance lorsque les

conditions environnementales deviennent instables. Chez les diatomées, la production de

spores de résistance avec une paroi de silice plus épaisse améliore la longévité. Ce type de

cellule au repos limite les échanges avec le milieu et réduit la respiration à un taux

négligeable (Hargraves and French 1983). Bien que la formation de spores de résistance est

souvent déclenchée suite à l’épuisement des nutriments, les changements de lumière et de

température pourraient aussi induire leur production chez les diatomées polaires (Doucette

and Fryxell 1983). En Antarctique, la production de ces spores chez les diatomées a été

documentée à plusieurs reprises dans la littérature (Hart 1942, Hoban et al., 1980, Doucette

and Fryxell 1983, Fryxell 1994). Néanmoins, la production de spores de résistance ne peut

pas expliquer à elle seule la survie à l’obscurité prolongée. Les expériences réalisées sur la

survie au noir n’ont généralement pas signalé la formation de ces spores. Les cellules

garderaient leur forme végétative et il semble qu’elles entreraient dans un état

physiologique de dormance (Peters and Thomas 1996). À l’opposé des spores de résistance,

les cellules végétatives en dormance reviennent à leur état actif en l’espace de quelques

heures (Anderson 1975, Sicko-Goad et al., 1986).

1.3.2 Nutrition hétérotrophe et métabolisme

L’hétérotrophie est un mode de nutrition par lequel les organismes utilisent le carbone

organique présent dans le milieu comme source d’énergie. Bien que les organismes

photosynthétiques puissent fabriquer leur propre carbone organique grâce à l’énergie de la

lumière, plusieurs d’entre eux sont capables d’utiliser en plus une variété de substrats

organiques, incluant acides aminés et acides gras, pour satisfaire leurs besoins en énergie et

en nutriments (Neilson and Lewin 1974). Ces organismes, dits mixotrophes, sont à la fois

photoautotrophe et hétérotrophe. Chez les diatomées, la nutrition hétérotrophe a été décrite

il y a longtemps déjà (Lewin 1953, Hellebust and Lewin 1977, Tuchman et al., 2006). Dans

l’expérience de White (1974), elle a permis à deux diatomées centriques tempérées de

survivre et de croître pendant 1 an à l’obscurité dans un milieu enrichi. Les diatomées

peuvent ainsi être caractérisées comme des photohétérotrophes, c’est-à-dire qu’elles

peuvent satisfaire leurs besoins nutritionnels grâce à des sources de carbone organique

autres que celui produit par la photosynthèse (Rivkin 1987, Tuchman et al., 2006). La

7

consommation de différentes sources d’acides aminés et de glucose a été observée chez des

diatomées antarctiques dans des conditions d’obscurité et de lumière (Rivkin 1987). La

survie des diatomées durant l’hiver polaire pourrait donc faire intervenir l’hétérotrophie.

Palmisano and Sullivan (1982) ont mesuré chez des diatomées de glace antarctiques une

augmentation de l’hétérotrophie lors d’une simulation expérimentale de la transition été-

hiver en Antarctique. En dépit des informations obtenues jusqu’à présent sur l’hétérotrophie

des diatomées, la survie des algues polaires durant la nuit polaire grâce à la nutrition

hétérotrophe reste incertaine (Popels and Hutchins 2002, McMinn and Martin 2013).

La publication des génomes de Thalassiosira pseudonana et Phaeodactylum tricornutum a

permis de comprendre davantage l’endosymbiose en série dans l’évolution des diatomées

(Armbrust et al., 2004, Bowler et al., 2008, Bowler et al., 2010). Plusieurs gènes de l’hôte

hétérotrophe seraient retenus et plusieurs autres seraient acquis de bactéries par transfert

horizontal. Ce mélange de gènes offrirait aux diatomées une panoplie de voies

métaboliques à l’origine de leur succès écologique dans un large éventail de conditions

environnementales. Par exemple, la voie complète du cycle de l’urée chez les diatomées

(absente chez les algues vertes) est vue comme un moyen de redistribuer le carbone et

l’azote inorganique dans la cellule lorsque les nutriments sont faibles (Allen et al., 2011,

Fernie et al., 2012). Il est possible que les diatomées polaires possèdent aussi plusieurs

transporteurs membranaires pour les plus grosses molécules organiques. La publication du

génome de Coccomyxa subellipsoidea, une algue verte polaire, révèle par ailleurs un

nombre plus élevé de transporteurs pour les acides aminés que chez les espèces tempérées

(Blanc et al., 2012). De plus, la publication récente du génome de la diatomée polaire

Fragilariopsis cylindrus révèle une différenciation allélique importante qui serait

avantageuse lors des fluctuations physico-chimiques extrêmes des océans polaires (Mock et

al., 2017). Ces différentes informations laissent à penser que les diatomées arctiques

possèderaient un métabolisme flexible et adapté qui leur permet d’optimiser l’incorporation

et l’assimilation des nutriments dans les conditions extrêmement variables de l’Arctique

(Lyon and Mock 2014).

8

1.3.3 Régulation de la physiologie et des activités métaboliques

La production de spores de résistance n’a pas été observée dans des expériences au noir

impliquant des diatomées polaires (Palmisano and Sullivan 1983, Peters and Thomas 1996)

et très peu dans les communautés échantillonnées en Arctique et subséquemment placées au

noir (Zhang et al., 1998). Néanmoins, toutes les espèces testées ont repris leur croissance

lors du retour à la lumière. Il est possible que les cellules placées à l’obscurité ajustent leur

métabolisme et entrent dans un état de « dormance » physiologique. Des mesures de

fluorescence par cytométrie en flux ont révélé chez trois chlorophytes une diminution

suivie d’une stabilisation de l’activité métabolique lors d’une courte période à l’obscurité

(10 jours). Les concentrations de carbone et d’azote organique particulaire par cellule

durant 80 jours d’obscurité sont restées stables chez trois diatomées antarctiques (Peters

and Thomas 1996). Ces résultats suggèrent que le métabolisme cellulaire a été réduit pour

ne pas épuiser rapidement les réserves énergétiques. Des conclusions similaires ont été

rapportées suite à une expérience au noir sur des diatomées tempérées et elles suggèrent

une réduction concomitante de la respiration cellulaire (Peters 1996).

Le stockage de composés organiques sous forme de lipides est fréquent chez les diatomées

et est proposé comme un moyen de survie à l’hiver polaire. Jusqu’à 80% du carbone

nouvellement fixé serait incorporé sous forme de lipides chez le phytoplancton antarctique

maintenu à faible température et à faible lumière (Smith and Morris 1980). L’accumulation

de lipides et de carbohydrates ainsi que leur utilisation subséquente ont été observées chez

des diatomées antarctiques lors d’une simulation de la transition lumière-obscurité

(Palmisano and Sullivan 1982). Toutefois, cette accumulation n’était peut-être pas

suffisante pour assurer les besoins énergétiques durant tout un hiver compte tenu de la

courte période expérimentale (30 jours). Néanmoins, le catabolisme des lipides et des

carbohydrates semble être important au début de la période d’obscurité. Chez F. cylindrus,

une expérience de 7 jours à l’obscurité a montré une augmentation de gènes transcrits

impliqués dans le métabolisme des sucres et des lipides (Mock et al., 2017). De plus,

Schaub et al., (2017) ont récemment mesuré une dégradation des ressources lipidiques plus

intense lors des deux premières semaines d’obscurité chez la diatomée benthique arctique

Navicula cf. perminuta. Cependant, lors d’expériences inférieures à 1 mois chez la

9

diatomée tempérée Skeletonema Costatum (Handa 1969) et chez la pelagophyceae

Aureococcus anophagefferens (Popels et al., 2007), une dégradation des carbohydrates et

des protéines préférentielle aux lipides a été observée. Ce patron d’utilisation des réserves

énergétiques a aussi été mesuré lors d’une expérience plus longue de 3 mois d’obscurité

chez la chlorophyceae Scenedesmus acuminatus (Dehning and Tilzer 1989). Les

observations accumulées jusqu’à présent suggèrent une utilisation des réserves énergétiques

plus importante au début de la période d’obscurité avec une variabilité interspécifique

dans le patron d’utilisation. Tous s’entendent sur une diminution du métabolisme et d’une

réduction dans le taux d’utilisation des réserves énergétiques avec le nombre de jours

passés à l’obscurité.

1.3.4 Impact sur la photophysiologie

L’appareil photosynthétique chez tous les photoautotrophes s’acclimate aux variations de

lumière qui surviennent dans l’environnement par différents processus de la

photoacclimatation. La photophysiologie s’ajuste selon la lumière disponible par des

changements dans la composition macromoléculaire de l’appareil: proportions relative des

pigments photoprotecteurs et photosynthétiques, des centres réactionnels des

photosystèmes I et II, des complexes de la chaîne de transport des électrons, et des enzymes

impliquées dans le cycle de Calvin (Falkowski and Laroche 1991, Demmig-Adams and

Adams 1992, Brown et al., 2008). Passant de 24 heures d’ensoleillement par jour en été à

l’obscurité totale en hiver et sous une bonne épaisseur de glace couverte de neige, on peut

s’attendre à ce qu’un stress survienne au niveau de l’appareil photosynthétique.

Généralement, une diminution de la chlorophylle a chez différents groupes de

phytoplancton a été observée lors de longues périodes d’obscurité (Dehning and Tilzer

1989, Peters 1996, Baldisserotto et al., 2005a, Baldisserotto et al., 2005b, Ferroni et al.,

2007, Veuger and van Oevelen 2011). Des mesures de microspectrofluorimétrie et de

microscopie électronique en transmission chez Koliella antartica et Xanthonema sp. (une

algue verte et une xanthophyceae de neige) ont aussi révélé des changements rapides dans

l’appareil photosynthétique dès les premiers jours d’obscurité (Baldisserotto et al., 2005a,

Baldisserotto et al., 2005b, Ferroni et al., 2007). Les chloroplastes sont devenus moins

nombreux au centre des cellules et ont montré des signes de dégradation. Les rapports de

fluorescence mesurés pour RCII/CP43-47 et LHCII/PSII (indiquent respectivement le degré

10

d’association au cœur du photosystème II et le degré d’assemblage entre l’antenne externe

et le photosystème II) ont changé durant la période d’obscurité. Le cœur du photosystème II

s’est dégradé plus rapidement, alors que l’association du complexe antennaire LHCII avec

le photosystème II est restée plus stable. Cette stabilité du LHCII pourrait être bénéfique au

retour de la lumière après l’hiver polaire (Ferroni et al., 2007). Cependant, chez la

chlorophyte Chlamydomonas raudensis isolée en Antarctique, le complexe antennaire

LHCII serait dissocié du photosystème II durant l’hiver selon le modèle suggéré par

Morgan-Kiss et al., (2006). Toutefois, la conservation du complexe pigments-protéines

LHCII a été proposée comme une caractéristique qui facilite la réassociation avec le

photosystème II dès le retour de la lumière. Malgré ces conclusions, les informations

présentées ici ne sont pas issues d’expériences conduites chez des diatomées (bien que

Xanthonema sp. soit plus proche des diatomées que des algues vertes) (Adl et al., 2005).

Une réponse différente pourrait être observée chez une diatomée arctique.

Le taux de fixation maximale de carbone normalisé par la chlorophylle a (PChl) [mg C (mg

chl a)-1 h-1] diminue fortement chez plusieurs groupes de phytoplancton (Hellebust and

Terborgh 1967, Griffiths 1973, Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996, Popels

et al., 2007) et chez la diatomée arctique Chaetoceros neogracile (non-publié, Lacour et al.,

2017) lorsqu’ils sont placés à l’obscurité. Cette réponse suggère un démantèlement de

l’appareil photosynthétique plus important combiné avec une dégradation partielle de

l’antenne comme mentionné ci-haut. Une diminution concomitante de l’activité et de la

quantité de RUBISCO (enzyme responsable de fixation de carbone) serait à l’origine des

faibles valeurs de PChl mesurées après une longue période d’obscurité (Dehning and Tilzer

1989, Popels et al., 2007) (non-publié, Lacour et al., 2017). Lors d’expériences portant sur

des diatomées polaires, des communautés phytoplanctoniques arctiques et antarctiques et

des communautés d’algues de glace antarctiques (composées principalement de diatomées),

des modifications similaires sur les capacités photosynthétiques des cellules ont été

décrites. La diminution des valeurs du rendement photochimique du PSII [unité relative]

(ΦPSII), du coefficient d'efficacité́ photosynthétique [mg C m-3 h-1 (µmol photons m-2 s-1)-1]

(α), et du taux maximal du transport d’électron [unité relative] (ETRmax) a indiqué une

11

baisse progressive des performances photosynthétiques à l’obscurité (Luder et al., 2002,

Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012).

1.4 Retour de la lumière

1.4.1 Photoprotection

Au retour de la lumière après une longue période d’obscurité, les cellules photosynthétiques

encore viables doivent gérer les photons qui les atteignent. Elles doivent optimiser leur

propriétés d’absorption de la lumière et surtout éviter les dommages par d’éventuels

éclairements excessifs. Les algues de glace reçoivent des quantités de lumière qui

augmentent à mesure que le jour s’allonge et que la glace s’amincit. Lors de la débâcle, le

phytoplancton peut subir une augmentation plus brusque de l’éclairement. Particulièrement,

la fonte du manteau neigeux intervient souvent brusquement et s’accompagne de mares de

fonte et de chenaux. Différents processus de photoacclimatation permettent aux micro-

algues de s’ajuster à ces fluctuations plus ou moins rapides qui impactent la transmission de

lumière.

À faible lumière, le complexe antennaire change sa composition pigmentaire pour optimiser

l’absorption de lumière et le transfert de celle-ci au centre réactionnel du photosystème. À

forte lumière, le complexe antennaire se protège du surplus d’énergie et dissipe l’excès par

« quenching » non-photochimique [unités relatives] (NPQ) (MacIntyre et al., 2002). En

bref, le NPQ dissipe l’énergie lumineuse en trop avant qu’elle n’atteigne le centre

réactionnel du photosystème (Holt et al., 2004). Le rôle photoprotecteur des caroténoïdes

grâce au cycle des xantophylles fait partie du NPQ et ce mécanisme est bien connu chez les

plantes (Demmig-Adams and Adams 1996). Chez les diatomées, le cycle des xanthophylles

repose principalement sur l’inter-conversion de la diadinoxanthine et la diatoxanthine

(caroténoïdes), et constitue le mécanisme de première importance pour contrer l’excès de

lumière (Arsalane et al., 1994, Goss and Jakob 2010). La composition en protéines fait

aussi partie des changements structuraux du complexe antennaire. Les gènes FCP (protéine

liant la chlorophylle et la fucoxanthine) appartenant à la grande famille des LHC (complexe

antennaire d’absorption) codent pour des protéines qui forment différents complexes selon

les conditions de lumière (Wilhelm et al., 2014). Les différents complexes formés se lient à

12

la fucoxanthine, la chlorophylle a et c et à la diadinoxanthine ou diatoxanthine (Alberte et

al., 1981, Beer et al., 2006) Ces complexes sont impliqués dans le transfert d’énergie aux

photosystèmes ou dans la dissipation d’énergie (NPQ) selon leur composition pigmentaire.

Une étude portant sur l’expression du transcriptome chez Chaetoceros neogracile lorsque

transférée à forte lumière révèle une régulation positive et négative de différents gènes

FCPs (Park et al., 2010). Les gènes FCP phylogénétiquement associés à la grande famille

LHCx ont montré une régulation positive alors que ceux associés à la famille LHCf ont

montré une régulation négative. La famille LHCx regroupe les gènes qui codent pour les

protéines impliquées dans le NPQ alors que la famille LHCf code pour celles impliquées

dans l’absorption de la lumière (Wilhelm et al., 2014). La régulation positive de gènes qui

appartiennent à la famille des LHCx a aussi été mesurée dans d’autres études (Oeltjen et

al., 2002, Becker and Rhiel 2006, Beer et al., 2006) qui confirment leur rôle dans la

photoprotection. Récemment, le génome de Fragilariopsis cylindrus a révélé un nombre

supérieur de gènes de la famille des LHCx (FCP) en comparaison à deux autres génomes de

diatomées tempérées (T. pseudonana, P. tricornutum) (Mock et al., 2017). Le grand

nombre de gènes LHCx observés chez Fragilariopsis cylindrus suggère une adaptation

pour une meilleure capacité de photoprotection face aux stress de lumière qui sévissent en

milieu polaire. Cette hypothèse est appuyée par les résultats de Petrou et al., (2011) qui

présente Fragilariopsis cylindrus comme une espèce adaptée aux conditions de faibles

lumières (glace de mer), mais qui possède une grande capacité d’acclimatation à

l’augmentation rapide de lumière expliquée par les fortes valeurs de NPQ mesurées. Ces

résultats aident à comprendre pourquoi elle peut croître aussi bien dans la glace, dans l’eau

de fonte ou en milieu pélagique et qu’elle soit présente en abondance en Antarctique et en

Arctique (Gleitz et al., 1998, von Quillfeldt 2000). Une grande capacité à dissiper l’excès

de lumière semble être une caractéristique physiologique importante lors du retour de

lumière suite à une longue période d’obscurité (McMinn et al., 2010).

1.4.2 Reprise de la photophysiologie

Malgré les changements importants mesurés dans la photophysiologie lors du passage à

l’obscurité prolongée, les performances photosynthétiques (PChl, ETRmax, ΦPSII)

augmentent fortement en quelques jours après le retour de la lumière (Griffiths 1973, Luder

et al., 2002, Popels et al., 2007, Martin et al., 2012) (non-publié, Lacour et al., 2017). Des

13

expériences sur Chaetoceros neogracile après un mois d’obscurité ont évalué la capacité de

reprendre la croissance au retour de la lumière à différentes intensités (5 à 154 µmol

photons m-2 s-1) (non-publié, Lacour et al., 2017). Dans tous les cas, les algues ont entamé

une croissance exponentielle en moins de 48 heures grâce à une rapide acclimatation de la

photophysiologie. ETRmax et Ek (l’éclairement auquel le taux de transport d’électron sature)

ont augmenté dès les premières heures du retour à la lumière. La reprise de la

photophysiologie et de la croissance est plus importante pour les plus fortes intensités de

lumières (41 et 154 µmol photons m-2 s-1).

14

Chapitre 2. Problématique Notre compréhension des mécanismes fondamentaux qui permettent la survie des

diatomées à de longues période d’obscurité comme celles de l’hiver polaire en Arctique est

incomplète malgré les expériences déjà réalisées. Les adaptions des diatomées aux

conditions extrêmes de l’Arctique sont de plus en plus documentées (Lacour et al., 2017),

mais on ne sait pas encore dans quel état se trouvent les diatomées arctiques lorsqu’elles

traversent l’hiver polaire. Aussi, on ne connaît pas bien les processus impliqués lors de la

reprise de croissance au retour de la lumière. D’une part, les expériences d’obscurité

prolongée de plusieurs mois sur les diatomées polaires conduites à ce jour n’offrent pas

suffisamment d’explications sur l’état physiologique des cellules (Antia 1976, Palmisano

and Sullivan 1983, Peters and Thomas 1996, Zhang et al., 1998). D’autre part, les

expériences dans lesquelles on a mesuré certains paramètres physiologiques ne sont pas

suffisamment représentatives de la longueur de l’hiver polaire (Hellebust and Terborgh

1967, Griffiths 1973, Popels et al., 2007, Wulff et al., 2008, Reeves et al., 2011, Martin et

al., 2012, McMinn and Martin 2013, Nymark et al., 2013, Mock et al., 2017) (non-publié,

Lacour et al., 2017), ne traitent pas de diatomées (Dehning and Tilzer 1989, Baldisserotto

et al., 2005a, Baldisserotto et al., 2005b, Ferroni et al., 2007, Popels et al., 2007) ou

n’intègrent pas toutes les réponses physiologiques de la cellule (Veuger and van Oevelen

2011, Schaub et al., 2017).

Une étude qui identifiera les caractéristiques physiologiques et biochimiques des cellules à

l’obscurité chez une diatomée arctique et durant une période représentative de la longueur

de l’hiver polaire permettra de mieux comprendre la phénologie des communautés de

producteurs primaires en Arctique et leur survie durant de longues périodes d’obscurité. La

caractérisation plus complète des espèces phytoplanctoniques clés de l’Arctique aidera à

mieux prédire leur réponse face aux changements climatiques dans le contexte de la

floraison printanière.

15

Chapitre 3. Objectifs et hypothèses de l’étude L’étude comporte une expérience en laboratoire réalisée à l’aide de bioréacteurs placés

dans l’obscurité totale pour une durée qui est représentative de l’hiver polaire. Des mesures

physiologiques et biochimiques à des intervalles précis fournissent un suivi temporel de

l’état des cellules et des activités métaboliques durant la période de noirceur et lors de la

réexposition à la lumière. La diversité des mesures effectuées vise à combiner les

informations biochimiques et celles sur les capacités physiologiques.

Objectif 1 :

Caractériser l’état cellulaire d’une diatomée arctique durant une période d’obscurité totale

représentative de l’hiver polaire afin de comprendre les mécanismes de survie au noir.

Hypothèse 1 :

La cellule ralentit son métabolisme et démantèle partiellement l’appareil photosynthétique.

Objectif 2 :

Caractériser les processus impliqués dans la reprise de croissance d’une diatomée arctique

lorsque qu’elle est réexposée à la lumière suite à une longue période d’obscurité totale

représentative de l’hiver polaire.

Hypothèse 2 :

La cellule minimise les dommages grâce aux mécanismes de photoprotection et reprend

rapidement les activités photosynthétiques et métaboliques.

16

Chapitre 4. Développement Response of a sea-ice diatom, Fragilariopsis cylindrus, to simulated polar winter darkness and spring-like return to light Morin, Philippe-Israël1; Lacour, Thomas1 ; Grondin Pierre-Luc1; Bruyant, Flavienne1; Ferland, Joannie1; Forget, Marie-Hélène1; Donaher, Natalie2; Campbell, Douglas2 ; Lavaud Johann1 & Babin, Marcel1

1UMI Takuvik, Université Laval, Québec, QC, G1V 0A6, Canada (philippe-israel.morin.1@ulaval.ca; Thomas.Lacour@takuvik.ulaval.ca; pierre-luc.grondin.1@ulaval.ca; flavienne.bruyant@takuvik.ulaval.ca; Joannie.Ferland@takuvik.ulaval.ca; Marie-Helene.Forget@takuvik.ulaval.ca; Johann.Lavaud@takuvik.ulaval.ca; Marcel.Babin@takuvik.ulaval.ca) 2Mount Allison University, Sackville, NB, E4L 3M7, Canada (dcampbel@mta.ca; ndonaher@mta.ca)

17

4.1 Introduction Diatoms experience a wide range of environmental conditions across the oceans, some of

which being extremely stressful for the cells. Light spans the largest variations where

diatoms may temporarily experience high light exposure in the sunlit surface layer or

darkness due to ocean mixing or during the night. Diatoms may spend several weeks in

total darkness during deep ocean mixing events (Cullen and Lewis 1988, Marshall and

Schott 1999). Moreover, at high latitudes, darkness takes over for several months as a

consequence of sea-ice cover and low sun elevations. Such conditions are exclusive to polar

winter in the Arctic and Antarctic Oceans. Winter darkness under sea-ice can last as long as

6 months during which photoautotrophic organisms such as diatoms must survive. Since

their main energy source is from sunlight, one can wonder how diatoms satisfy their

metabolic needs when no light is available for such a long period of time.

Several studies in the past decades have contributed to the understanding of polar winter

darkness survival of microalgaes (including diatoms) (Smayda and Mitchell.B 1974, Antia

1976, Palmisano and Sullivan 1983, Peters 1996, Peters and Thomas 1996, Zhang et al.,

1998, Luder et al., 2002, Wulff et al., 2008, Reeves et al., 2011) (unpublished, Lacour et

al., 2017). In all experiments, cell growth recovered after the dark period. Strategies such as

spore production (Doucette and Fryxell 1983) and heterotrophy (Lewin 1953, White 1974,

Hellebust and Lewin 1977) may explain diatoms survival to prolonged darkness, but most

of the experiments so far have not recorded the presence of spores nor measured

heterotrophy. However, a physiological resting state that is characterized by a stabilized

metabolism and a low rate of energy reserve consumption may play a significant role

(Handa 1969, Palmisano and Sullivan 1982, Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas

1996, Jochem 1999, Popels et al., 2007, McMinn and Martin 2013, Schaub et al., 2017).

Recently, the Fragilariopsis cylindrus transcriptome response to darkness (7 days) was

investigated (Mock et al., 2017). Among the different abiotic stresses tested, darkness

triggered the largest transcriptome response involving approximately 60% of all genes with

most of them downregulated.

Despite the numerous studies reporting survival over long periods of darkness, only a few

18

have investigated the physiological mechanisms involved during the light return recovery

(Griffiths 1973, Luder et al., 2002, Popels et al., 2007, Reeves et al., 2011) (unpublished,

Lacour et al., 2017). In the latter studies, photosynthetic performances recovered but were

low after several weeks of darkness. However, longer periods of darkness could

compromise the recovery.

With the aforementioned literature, our study aimed to provide answers to the key question:

How do diatoms survive during such conditions of darkness and resume fast growth as

soon as light becomes available? What are the physiological mechanisms underlying such

survival? Because our understanding of dark survival strategies in diatoms is still limited

and nearly lacking for the processes involved upon the return of light, the objectives of this

study were to (i) understand the response of diatoms to both darkness and return of light,

(ii) to provide an extensive description of relevant physiological mechanisms over a

darkness period that mimics the polar winter and (iii) to highlight physiological

peculiarities that were not documented previously.

19

4.2 Methods

4.2.1 Cell culturing

Axenic cultures of Fragilariopsis cylindrus (National Center for Marine Algae and

Microbiota CCMP3323, Annexe 1), collected as CCMP1102 during the Islas Orcas cruise

in the Southern Ocean (64,08° S 48,7033 °W) were grown in semi-continuous cultures in

pre-filtered L1 medium (Guillard and Hargraves 1993) (Annexe 2). Cultures in triplicate

started in 50 mL borosilicate tubes and were subsequently transferred to larger borosilicate

vessels several times semi-continuously until a final transfer to 20-L polycarbonate round

vessels (Annexe 3). At this step, 5 L of each culture were transferred to the vessels and

addition of L1 media followed thereafter to increase culture volume while matching growth

rate so that the cell density remains constant (Wood et al., 2005). The illumination was

provided continuously with DURIS® E3 LED bands (GW JCLMS1.EC, 4000 K) at 30

µmol photon m-2 s-1 as measured with a QSL-100 quantum sensor (Biospherical

instruments, San Diego, CA, USA) placed in the centre of the vessel. This irradiance was

chosen based on the parameter KE, i.e. the irradiance at which the growth rate saturated for

our F. cylindrus strain. Each culture was gently mixed with a 12.5 cm magnetic stirrer and

bubbled with air filtered through a 0.3µm capsule filter (Carbon CAP, 6704-7500).

Temperature of the growth chamber was kept at 0°C for the whole experiment.

4.2.2 Sampling design

Sampling was made for the first time (-1 day and 0 day, light acclimated) once the cultures

had reached a steady state (MacIntyre and Cullen 2005), i.e when growth rate, cell diameter

and chlorophyll a (chl a) were constant and acclimated to the growth condition. Cultures

were considered acclimated when those parameters remained unchanged for a minimum of

10 cell generations. In order to avoid light limited growth, the cultures were kept optically

thin for the light acclimation period. Cell density ranged from 4×104 to 6×105 cell mL-1

during the exponential growth phase and was maintained around 5×105 cell mL-1 prior to

the dark transition. After the light acclimated sampling, the light system was immediately

switched off and each vessel was carefully covered with opaque material. Sampling in the

dark was made 24 hours following the transition to the dark and subsequent «dark»

samplings followed the timeline shown in Fig. 3.

20

The first “return to light” experiment (Light1) took place after 1.5 months (48 days) in the

dark and was conducted outside of the initial growth chamber. Culture volume was

carefully transferred to gently aerated 3-L vessels cooled with ethylene glycol at 0°C and

illuminated at 30 µmol photon m-2 s-1 with a slightly different light spectrum than that of the

light acclimation system (pre-acc)(Annexe 4). This second light system was provided by a

customized LED system (uncommercialized) encompassing 8 colours independently

variable in intensity. The light system surrounded the 3L vessel via 6 panels each equipped

with a LED system (Annexe 5). The cultures were sampled at specific times as shown on

Fig. 3 until no culture volume was left in the vessels. The second “return to light” (Light2)

took place after 3 months (90 days) in the dark.

Figure 3 Timeline of the sampling strategy for dark period and light return experiments. The vertical lines show the times of sampling, and the dashed arrow shows transfer of a fraction of the replicate cultures prior to light return #1 at 1.5 months following dark transition. In the first phase, cultures were acclimated to the light conditions for 52 days. Cultures were then transferred in complete darkness (grey arrow). In the third phase, dark acclimated subsamples were transferred to light after 1.5 months and 3 months.

For each sampling time-point, cultures aliquots were harvested to measure cell number,

biovolume, cellular organic carbon and nitrogen (POC & PON), lipid droplets, pigments,

quantum yields of charge separation in photosystem II (PSII), non-photochemical

quenching (NPQ), photosynthetic proteins (D1, RUBISCO) and carbon fixation rates.

However, not all variables were measured for every time-point. The NPQ was measured for

the light-return experiments and for several time-points during the dark period (2 weeks, 1

21

month, 1.5 months, 3 months). Carbon fixation rates were measured at all points except for

the third month of darkness. Lipid droplets were measured from 5 hours to 6 days

following both light return experiments and for every time-points during the dark period.

4.2.3 Cell number and volume

Cells were counted and sized using a Beckman Multisizer 4 Coulter Counter. Culture

aliquots were first diluted 50 times in Milli-Q water adjusted to 36 ‰, Sodium Chloride

(CAS: 7647-14-5, S7653, Sigma Aldrich). Three consecutive countings were

systematically achieved for each replicate. Total cell counts ranged from 5115 to 21090

depending on the volume diluted (either 200 or 500 µL) and the sampling time. Near all of

the cells (> 95%) ranged between 2.822 and 7.165 µm length with a peak at 3.809 to 4.245

µm (mean size) depending on the sampling time. The system was previously calibrated

using 10 µm latex beads (COULTER CC Size Standard L10, REF: 6602796, Beckman

Coulter) with an aperture diameter of 50 µm. The cell volume was computed using the

mean size as the length and assuming a cylindrical shape with an average diameter of 2 µm.

4.2.4 Carbon and nitrogen

For measuring the cellular content of organic carbon and nitrogen, three replicates were

harvested per algal culture. Aliquots of 20 mL were filtered onto glass-fiber filters (0.7µm,

25mm) pre-combusted at 500°C for 24 hours. Filters were then dried at 60°C for at least 12

hours and kept desiccated before elemental analysis with a CHN analyzer (2400 Series II

CHNS⁄ O; Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA).

4.2.5 Lipid droplets

Cells were assessed for their lipid droplets content using the molecular probe BODIPY®

505/515 (4,4-Difluoro-1,3,5,7-Tetramethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene, REF:D3921,

LOT:1740601, www.lifetechnologies.com) according to Brennan et al. (2012).

Fluorescence emitted from the BODIPY probes was measured using flow cytometry. The

first 2 months of the dark experiment (including Light1 experiment) were covered with a

dual laser excitation flow cytometer (Millipore Guava easycyte 8 HT, excitation at 488 nm,

emission measured at 525/30 nm). For the third month of dark experiment and the Light2

experiment, another flow cytometer was used (Milipore Guava easycyte HT BGV,

excitation at 488 nm, emission measured at 512/18 nm). A 500 µM BODIPY stock solution

22

was prepared by dissolving the dye in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) and was ~20

fold-diluted in DMSO for a working solution of 25.43 µM. To determine the optimal

BODIPY 505/515 concentration, a range of 17 final concentrations from 0.085 µM to 1.59

µM was assayed. The optimal concentration was of 0.33 µM and 1.32% DMSO, which was

4 µL of the working solution in 300 µL of culture. Samples in three technical replicates for

each culture were then incubated for 1 hour into a dark styrofoam box filled with ice in

order to keep the temperature as close as possible to the growth chamber (0°C). A 96-well

plate containing the samples was used for the fluorescence analysis. Samples were

quantified for their relative fluorescence emission with 2000-5000 cells per well. Each cell

population was analysed with R©. Technical replicates were averaged together for their

mean signal of fluorescence.

4.2.6 Pigments concentration

Samples for pigment analysis were filtered onto glass-fiber filters (GF/F) (0.7µm, 25mm,

Millipore). 10 mL of each culture was harvested. Filters were immediately flash-frozen in

liquid nitrogen and stored at -80°C until analysis. Pigment separation was performed with

high performance liquid chromatography (HPLC) according to Manuel et al. (2000). Prior

to HPLC analyses, pigments were extracted in 95% methanol and sonicated during 20

seconds three times. Samples were then centrifuged (4500 rpm) 15 minutes at 4°C and

filtered on polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes (0.2 µm). Data were analysed using

ChromQuest 5.0 software.

4.2.7 Photosynthetic proteins

For RbcL and PsbA quantitation, 30 mL of each culture was harvested onto GF/F. Filters

were flash-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Protein extractions were

performed using the FastPrep-24 and bead lysing “matrix D” (MP Biomedicals), using 3

cycles of 60 s at 6.5 m/s in 300 µL of 1X extraction buffer (Agrisera), then spun at 16 000 g

for 5 minutes. The supernatant was removed and spun for 2 additional minutes, then

prepared for electrophoresis based on equivalent nitrogen content using 1x sample buffer

(Invitrogen) and 50 mM DTT. Separation of proteins was done in a Bolt 4-12% Bis Tris

SDS-PAGE gel (Invitrogen). Each gel had a 4-point quantitation curve using RbcL

(www.agrisera.se).

23

Proteins were separated via electrophoresis at 200 V for 40 minutes then transferred to

polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes at 30 V for 60 minutes. Membranes were

blocked for 1 h in 2% w/v ECL blocking agent (GE Healthcare) dissolved in TBS-T (Tris,

20 mM; NaCl, 137 mM; Tween-20, 0.1%v/v), then incubated in 1:10 000 rabbit polyclonal

anti-RbcL antibody for 1 h (Agrisera) and finally in 1:10 000 goat anti-rabbit IgG HRP

conjugated antibody (Agrisera) for 1 h. Membranes were rinsed with TBS-T solution five

times after each antibody incubation. Chemiluminescent images were obtained using ECL

Ultra reagent (Lumigen, TMA-100) and a VersaDoc CCD imager (Bio-Rad). Band

densities for samples were determined against the standard curve using the ImageLab

software (v 4.0, Biorad).

4.2.8 Variable fluorescence

Variable in vivo chl a fluorescence was measured using a Fluorescence Induction and

Relaxation (FIRe) fluorometer (Satlantic, Halifax, NS, Canada) that applies a saturating,

single turnover flash (STF, 100µs) of blue light (455 nm, 60-nm bandwidth) to the

incubated sample. The FIRe generates a fluorescence induction curve (fluorescence

detected at 680 nm) that can be used to estimate the absorption cross-section (σPSII), the

minimum fluorescence (F0) and the maximum fluorescence of dark acclimated cells (FM)

with the FIReWORX algorithm (Pers. Comm. Audrey Barnett, www.sourceforge.net).

σPSII, F0 and FM were measured on culture subsamples shortly after volume harvest during

the dark experiment (already dark-acclimated) or dark-acclimation for 30 min during the

Light1 and Light2 experiments. We estimated the maximum quantum yield of PSII (ΦM) as

follow.

𝛷! = !!!!

= !!!!!!!

(1)

We also measured variable in vivo chl a fluorescence using the Pulse Amplitude Modulated

technique with the PhytoPAM (Walz, Germany) instrument. Cells were dark-acclimated for

30 minutes when applicable (Light1 and Light2 experiments) and subsequently exposed to

the rapid light curve protocol (RLC). Subsamples were exposed to a 8 step-wise increasing

continuous irradiances (1, 1.8, 3.5, 7.1, 14, 28, 56, 111 µmol photons m-2 s-1) for 10 seconds

each. For measuring variable fluorescence, light saturation of the photosystems was

24

achieved with a strong actinic red flash (500 ms, >550 µmol photons m-2 s-1) at each

irradiance-step of the RLC protocol while a non-actinic modulated light source was used

for each incubation-irradiance. Both of the actinic and non-actinic light sources were

provided by the Measuring LED-Array-Cone (Phyto-ML). Although the instrument allows

excitation of fluorescence at four different wavelengths, actinic light was only provided by

the actinic LEDs peaking at 655 nm (Annexe 4). The non-photochemical quenching (NPQ)

was calculated for each irradiance-step as:

𝑁𝑃𝑄 = !!!!!!!!!

(2)

where FM and FM’ are the maximum fluorescence of dark and light (incubation-irradiance)

adapted cells respectively. The NPQmax was estimated from a least-square fit of the

following equation to the data (Serôdio and Lavaud 2011):

𝑁𝑃𝑄 (𝐸) = 𝑁𝑃𝑄!"# ⋅!!

!50!!!!

(3)

NPQmax is the maximum NPQ value reached during the light curve, E50 is the irradiance

at which 50% of NPQmax is reached and n is the Hill coefficient (the sigmoidicity of the

curve).

4.2.9 14C incubations

A 35-mL culture sample was first collected for each culture, and inoculated with inorganic 14C (NaH14CO3, 2 µCi mL-1). Then 1-mL aliquots of the inoculated culture sample were

dispensed into twenty-four 7-mL glass scintillation vials cooled in separate thermo-

regulated alveoli (0°C). The vials were exposed to 24 different light levels provided by

separate LEDs (LUXEON Rebel, Philips lumileds) from the bottom of each alveolus. The

PAR (µmol photon m-2 s-1) in each alveolus was measured before incubation with a

quantum sensor (Biospherical QSL-100) equipped with a 4π spherical collector . After 20

min of incubation, culture aliquots were fixed with 50 µL of buffered formalin then

acidified (250 µL of HCl 50%) and placed under the fume hood for 3 hours in order to

remove the excess inorganic carbon (JGOFS protocol, UNESCO 1994). Finally, 6 mL of

scintillation cocktail were added to each vial prior to counting in the liquid scintillation

counter (Perkin Elmer® Tri-Carb 2910TR). This step allowed determining the amount of

radiolabeled carbon assimilated by the cells from the number of disintegration per minute

(DPM).

25

To determine the total amount (total activity) of bicarbonate added, three 20-µL aliquots of

radioactive sample were added to 50 µL of an organic base (ethanolamine) and 6 mL of the

scintillation cocktail (Ecolume) into glass scintillation vials. The carbon fixation rate was

finally computed according to Parsons et al. (1984a)

𝑃 = (!!!!!) ⋅ !! ⋅ !

(4)

where P is the rate of carbon fixation [mg C m-3 h-1], R is the total activity (DPM), N is the

number of hours of incubation, RS is the sample count (DPM) corrected for quenching, RB

is the blank (or dark sample) count (DPM) corrected for quenching and W is the weight of

total carbon dioxide present [mg C m-3] calculated as:

𝑊 = 12 000 ⋅ 𝑇𝐶 (5) where 12 000 is the molar weight of carbon (mg) and TC is the total carbon dioxide

calculated according to Parsons et al. (1984b)

𝑇𝐶 = 0.96 [(𝑆‰ ⋅ 0.067 𝑚𝑒𝑞/𝐿)− 0.05] (6)where the formula [(S‰ · 0.067meq/L) – 0.05] is the carbonate alkalinity and 0.96 is the Ft

factor that is function of the salinity, the temperature and the pH in the media here at 36‰,

0°C and 8.1, respectively.

The relationship between the rate of carbon fixation (P) and irradiance (PAR) was fitted

according to Platt et al. (1980) to obtain the photosynthetic coefficients:

𝑃 = 𝑃! [1 – 𝑒𝑥𝑝(– !"#$!!

)]𝑒𝑥𝑝(– !!"#!!

)+ 𝑃! (7)

where PS is the maximum carbon fixation rate in absence of photoinhibition [mg C m-3 h-1],

α is the initial slope of the carbon fixation vs. irradiance curve [mg C m-3 h-1 (µmol photons

m-2 s-1)-1], PAR is the incubation irradiance (µmol photons m-2 s-1), β is the photoinhibition

coefficient [mg C m-3 h-1 (µmol photons m-2 s-1)-1] and P0 is the intercept of the curve [mg C

m-3 h-1]. The maximum carbon fixation rate at saturating irradiance was calculated as

follow.

𝑃𝑚𝑎𝑥 = 𝑃!(!

!!!)(

!!!!

)!! (8)

26

4.2.10 Statistical analysis

Statistical power of the experiment was limited to the three grown cultures assumed to be

identical to each other. Most of the studied parameters were measured once for each culture

at each harvest time, except for the carbon, nitrogen and lipid droplets content that

additionally had three technical replicates per culture. Time elapsed after the onset of a

condition (darkness or light return) and experiment types (pre-acc, Dark, Light1, Light2)

were the main factors explaining the parameter variances. To determine whether there was

a significant variation of the measured parameters during an experiment type, we compared

appropriate sampling days to the t0 (assumed to represent normal conditions) with a paired

t-test (n=3). Alternatively, we used a one-way ANOVA over several sampling days when a

culture replicate was lacking. An exponential decay function was fitted to the

photosynthetic parameters of the carbon fixation curves measured during the dark

experiment as follow:

𝑃(𝑡) = 𝑃0 𝑒𝑥𝑝(−𝑆・𝑡)+𝐾 (9)where P(t) is a given photosynthetic parameter value (Pmax, α, Ek) at time t (days after

dark transition), P0 is the initial value at t(0), S is the exponential decay constant and K is

the value of P (t→ ∞).

We also compared the Light1 and Light2 experiments for their physiological recovery over

time. Where linear regressions were applicable, we used ANCOVA to compare the slopes

between Light1 and Light2 experiments. The data of each culture were pooled together for

all sampling days. Linear regressions were not suitable for the Pmax and ΦM data. We used

the equation (9) to compare the Pmax and ΦM “recovery slope” in Light1 and Light2 as

follow:

𝑃(𝑡) = −𝑃0 𝑒𝑥𝑝(−𝑆・𝑡)+𝐾 (10)where P(t) here is Pmax or ΦM at time t (days after light transition) and S is the exponential

recovery slope constant. The variances of the Light1 and Light2 non-linear models were

used to simulate 5000 fits in order to compare the slopes (S) in a suitable manner. Then, a

paired t-test applied to the simulated slopes computed for Light1 and Light2 searched for

statistical differences. Statistical reports of t-tests are shown as follow in the results section:

Mean±SD (group 1) to Mean±SD (group 2); t(degrees of freedom) = t-value (* if p-value <

0.05 unless otherwise specified). In case of a one-way ANOVA, reports are as follow:

27

F(degrees of freedom between groups, degrees of freedom within groups) = F-value (* if p-

value < 0.05 unless otherwise specified). Slope significance reports of the fitted exponential

functions (Eq. 9,10) are shown as follow: S: t(degrees of freedom) = t-value (* if p-value <

0.05 unless otherwise specified).

28

4.3 Results & discussion

4.3.1 Dark experiment

Several physiological processes in a diatom species exposed to darkness were monitored

over a period of three months (90 days), which is significantly longer than in any

previously published experiments with detailed characterization that seldomly lasted more

than 1 month in darkness (Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996, Baldisserotto

et al., 2005a, Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012, Schaub et al., 2017). Our results are

consistent with their findings on common parameters.

4.3.1.1 Cell and reserves Cell number per mL (Fig. 4a) of the three cultures ranged from 4.76×105 to 6.53×105

before the transition to the dark, i.e. during the last two days of the acclimation period. It

increased during the first month of the dark period by 27.27±3.21% of the value measured

at t0 (5.93±0.66×105 to 7.53±0.66×105; t(2) = 62.62*), which is likely due to a final cell

division for a subset of the cell population as observed in previous experiments

(unpublished, Lacour et al., 2017). The biovolume (µm3) (cell volume x cell number)

increased by 23.70±3.95% (7.54±0.87×106 to 9.30±0.80×106; t(2) = 31.83*) which was

lower than the increase in cell number since the cell volume decreased by 2.82±0.64% as a

consequence of cell division (12.71±0.05 to 12.35±0.04; t(2) = -7.53*) (Fig. 4b). The cell

number and the biovolume then decreased until the third month to end up at values slightly

above the t0, but their decrease were not significant. Cellular carbon and nitrogen quotas

(µg/cell) decreased during the first month of darkness by 33.58±10.12% (5.40±0.23×10-6 to

3.58±0.50×10-6; t(2) = -5.57*) and 31.62±3.20% (9.92±0.28×10-7 to 6.78±0.23×10-7; t(2) =

-14.07*), respectively (Fig. 4c). Carbon quota then increased until the third month to values

slightly above the t0 (6.18±0.39×10-6; F(2,4) = 27.11*). Note that a culture (black dots) was

discarded of the analysis after 1 month of darkness as an outlier. The apparent increase until

the third month of cellular nitrogen was not significant.

A potential mechanism for long-term dark survival is to reduce metabolism and fine-tune

the utilization rate of stored energy products (Handa 1969, Palmisano and Sullivan 1982,

Dehning and Tilzer 1989, Jochem 1999, Popels et al., 2007, Schaub et al., 2017).

29

Figure 4.a) Biovolume (black, gray) and Cell number per mL (blue, skyblue) b) Cell volume (black, gray) and lipid droplets (blue, skyblue) c) POC (black, gray) and PON (blue, skyblue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2

s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Values from the light return experiments are shown in lighter colors. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars, except for the POC points after the first month of darkness. A POC replicate was discarded (black dots) of the mean and standard deviation calculations.

30

We observed a decrease in the cellular carbon and nitrogen content for the first month of

the dark period. However, this decrease was likely the consequence of cell division to a

smaller volume. Indeed, the carbon quotas per mL (data not shown) did not decrease

significantly during the first month. Furthermore, the lipid droplets signal probed with

BODIPY (RFU) was only 4.48±0.35% lower than the t0 value (641.44±13.04) after 1

month (Fig. 4b). It then slowly decreased to 13.15±2.46% lower than the t0 value after

three months of darkness (t(2) = -8.71*). Hence, this suggests very low metabolic rates and

low energy reserve consumption as a survival process in F.cylindrus. The increase of the

carbon quotas after 1 month was unexpected and remains unexplained. Note that similar

trends can be found in Figure 3 and 4 of Peters and Thomas (1996). If bacterial presence

were to account for this increase, sufficient amount of dissolved organic carbon (DOC)

would have had to be present in the culture medium to sustain heterotrophic growth (Rivkin

and Anderson 1997). We did not measure the DOC level in our experiment since the

cultures were axenically maintained and the fresh culture medium was free of DOC.

4.3.1.2 Photosynthetic apparatus dismantlement When cells are exposed to long period of darkness, it is obvious that the photosynthetic

machinery is not operating its main function of converting light to chemical energy. A

metabolic cost is associated with sustaining the molecular components of the

photosynthetic apparatus (Geider and Osborne 1989, Quigg and Beardall 2003). Based on

the assumption of a reduced metabolism, renewal of degraded photosynthetic components

should be limited. We measured degradation of the chlorophyll a (Chl a) and the main

photosynthetic accessory pigment fucoxanthin (Fuco) as in past experiments (Peters and

Thomas 1996, Baldisserotto et al., 2005a, Veuger and van Oevelen 2011). Chl a and Fuco

(µg/cell) decreased after three months of darkness by 40.45±9.86% (2.09±0.34×10-7 to

1.227±0.059×10-7; t(2) = -4.535*) and 47.02±7.50% (1.79±0.22×10-7 to 0.938±0.047×10-7;

t(2) = -6.178*), respectively (Fig. 5a). The non-photosynthetic pigments (µg/cell), which

include the photoprotective xanthophylls (NPHP: diadinoxanthin (DD) + diatoxanthin

(DT)) decreased by 19.63±7.60% (2.56±0.18×10-8 to 2.05±0.13×10-8; t(2) = -4.12, p-value

= 0.054). The NPHP pool decreased mainly as the DD form since DT immediately returned

to its epoxidized form (DD) after 1 day of darkness (Fig. 5b).

31

Figure 5.a) Chlorophyll a (black, gray) and Fucoxanthin per cell (blue, skyblue) b) Diadinoxanthin (black, gray) and Diatoxanthin per cell (blue, skyblue) c) σPSII (black, gray) and PHP/NPHP (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Values from the light return experiments are shown in lighter colors. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars.

32

Thus, we measured a decrease of the photosynthetic (PHP: Chl a + Chl c +Fuco) to non-

photosynthetic pigments ratio by 30.73±4.59% (16.87±1.92 to 11.63±0.41; t(2) = -6.86*)

(Fig. 5c). As a consequence of this specific pigmental degradation, the effective absorption

cross-section (σPSII) decreased by 26.15±7.33% (514.76±47.80 to 377.82±5.16; t(2) = -

4.59*) (Fig. 5c) (Falkowski and Raven 2007).

Photosynthetic proteins (µg/cell) also decreased during the dark period, but they reached a

much lower level than the photosynthetic pigments after the second and the third month

(Fig. 6a). PsbA, a D1 protein sub-unit of the RCII, decreased by 85.01±4.83% of the t0

values (5.75±1.01×10-9 to 0.84±0.21×10-9; t(2) = -8.07*). This massive decrease is

indicative of a PSII core complex degradation as seen in other experiments with a green

chlorophyte and a snow xanthophycean algae (Baldisserotto et al., 2005a, Baldisserotto et

al., 2005b, Ferroni et al., 2007). The large subunit of RUBISCO (RbcL, the carbon fixation

enzyme) decreased similarly as PsbA by 71.34±12.48% (1.41±0.11×10-7 to 0.39±0.15×10-7;

t(2) = -6.79*) (Fig. 6a). Based on the photosynthetic proteins results, one would expect that

carbon fixation was largely dismantled in absence of those proteins (especially RbcL).

Indeed, the carbon fixation vs. irradiance curves showed a major decrease after 2 months of

the initial-slope (α, Fig. 6b) and the maximal rate of carbon fixation (Pmax, Eq.8, Fig. 7a,b)

by 91.790±0.013% (4.90±2.04×10-12 to 0.39±0.10×10-12; t(2) = -4.03, p-value = 0.056) and

97.560±0.018% (8.47±2.10×10-11 to 0.20±0.14×10-11; t(2) = -6.90*), respectively

(Hellebust and Terborgh 1967, Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996, Popels

et al., 2007) (unpublished, Lacour et al., 2017). Both parameters decreased exponentially to

minimal values during the first month of darkness and remained very low until the end of

the dark period (significance of the slope parameter (S): tPmax(15) = 4.85*, tα(15) = 2.70*).

Pmax per cell decreased faster relatively to the RbcL content, possibly because of an early

inactivation of the carbon fixation enzyme (Hellebust and Terborgh 1967, MacIntyre et al.,

1997). Pmax also decreased faster relative to α per cell, which lowered the light saturation

parameter Ek (Pmax/α). Hence, Ek decreased exponentially (S: tEk(15) = 2.35*, data not

shown). Thus, the susceptibility to photoinhibition increased as the cells aged in the

darkness. Non-photochemical quenching (NPQ, Eq.2) was triggered in the rapid light curve

(RLC) protocol as a consequence of impaired electron sink capacities such as the carbon

33

Figure 6.a) PsbA (black, gray) and RbcL (blue, skyblue) per cell b) initial slope of carbon fixation (α) (black, gray) and ΦM (blue, skyblue) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Values from the light return experiments are shown in lighter colors. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars, except for the PsbA Light1 points. A replicate was discarded (black dots) of the mean and standard deviation calculations.

34

Figure 7.a) Carbon fixation maximum (Pmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. b,c,d) Carbon fixation curves, of which Pmax is calculated, are shown for the dark period (Dark panel) and light experiments (Light1 and Light2 panels). Each curve is fitted on the three cultures data points together for each sampling time.

35

Figure 8.a) Non-photochemical quenching maximum (NPQmax) (black, gray) of Fragilariopsis cylindrus cultures kept in the dark at 0°C for 90 days and exposed to continuous light of 30 µmol photons m-2 s-1 after 48 days and 90 days of darkness for the light return experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. b,c,d) NPQ curves, of which NPQmax is calculated, are shown for the dark period (Dark panel) and light experiments (Light1 and Light2 panels). Each curve is fitted on the three cultures data points together for each sampling time.

36

fixation (Huner et al., 1998, Joliot and Alric 2013). NPQ did not show significant

variations with the number of days spent in the dark once Pmax and α have reached low

levels (Fig. 8a,b).

While the carbon fixation curve parameters decreased exponentially, the maximum

quantum yield of PSII (ΦM, Eq.1) showed no significant variation while a decrease is

commonly observed in darkness (Reeves et al., 2011, Martin et al., 2012)(unpublished,

Lacour et al., 2017) (Fig. 6b). To explain such a difference between the variation in ΦM and

the carbon fixation curve parameters, we suggest that the measured ΦM in our experiment

reflected the remaining viable cells whereas α and Pmax reflected the whole cell population

because they were normalized per total cell count (including the dead ones). Additionnally,

the single turnover flash applied to measure ΦM lasted 100µs whereas 14C incubations

lasted 20 minutes. Viable cells taken out of an extended period of darkness and exposed to 14C incubations likely have suffered more from impaired electron sink capacities than the

single turnover flash. Therefore, the large discrepancies between ΦM and the carbon

fixation curve parameters are likely due to the nature of their protocol and their

normalization.

4.3.2 Light experiment

The dark acclimated F.cylindrus cultures were exposed back to light after 48 days and 90

days and monitored for the same physiological parameters. Despite the limited

documentation on light return experiments found in the literature (Griffiths 1973, Popels et

al., 2007), light transition experiments provided relevant insight on how diatoms cope with

sudden high light shift (Anning et al., 2000, Nymark et al., 2009, Wu et al., 2011, Nymark

et al., 2013) which corroborate the results of our light experiments. Additionally, Lacour et

al. (2017, unpublished) measured similar physiological processes after 1 month of darkness

and we find consistent results with their study on Chaetoceros neogracile.

4.3.2.1 Photosensitivity and photosynthetic apparatus reassembly We showed that acclimated cells to darkness dismantled their photosynthetic apparatus

with high susceptibility to photoinhibition. To avoid photo-damages, diatoms mainly rely

on the NPQ mediated by the xanthophylls cycle as their mean for photoprotection (Goss

and Jakob 2010), especially for F.cylindrus (Petrou et al., 2011). Given the low

37

photosynthetic capacities reached during the dark period, a rapid NPQ response was

expected to occur in the early hours of the light return experiments to get rid of the

excessive light stress. For the Light1 experiment, the highest NPQmax (Eq.3) values were

measured after 2 hours of light exposure and decreased by 47.81±10.59% after 3 days to a

“relaxed-state” (0.51±0.03 to 0.27±0.04; t(2) = -4.39*) (Fig. 9a, Fig. 8c). The de-

epoxidation state (DES: DT/(DD+DT)) showed consistent variations supporting that the

measured NPQ was related to the action of DT (Lavaud et al., 2004, Lavaud and Goss

2014)(Fig. 9c).

Figure 9.a,b) NPQmax (black) and de-epoxidation state (DES) (blue) c,d) Diadinoxanthin (black) and Diatoxanthin (blue) per cell of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. In Light2, NPQmax began at the lowest level measured during the whole experiment and

increased by 260.00±55.99% within 1 day of light exposure (0.121±0.015 to 0.312±0.063;

t(2) = 5.513*) (Fig. 9b, Fig. 8d). It then remained at this level until the 6th day. DES in

38

Light2 was not consistent within the early hours of light exposure. Despite DT increased

within 30 minutes of light exposure (1.15±0.31 (Dark, 3 months) to 6.36±1.06×10-9; t(2) =

6.90*), NPQmax remained low (Fig. 9b,d). This particular inconsistency was also observed

in other experiments with Phaeodactylum tricornutum and F. cylindrus (Casper-Lindley

and Bjorkman 1998, Kropuenske et al., 2009). According to Kropuenske et al. (2009), 30

minutes of dark-acclimation prior to the NPQ measurements were not sufficient to achieve

complete re-epoxidation of the accumulated DT for the highly light-stressed samples. Thus,

the NPQmax was likely underestimated for the first 5 hours.

Figure 10.a,b) Chlorophyll a (black) and Fucoxanthin (blue) per cell b,c) σPSII (black,) and PHP/NPHP (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars.

Variations of the pigment composition were typical of a response to high light transition as

described by Anning et al. (2000) and Nymark et al. (2009) on the temperate diatoms

Skeletonema costatum and P. tricornutum. The simultaneous decrease of Chl a and Fuco

39

(Fig. 10a) and increase of DD (Fig. 9c) led to a decrease of the PHP/NPHP ratio until the

third day of Light1 (13.09±0.94 to 7.43±1.78; t(2) = -5.21*) (Fig. 10c). After 3 days,

photosynthetic pigments stopped decreasing and started to build up, although not

significantly, which stabilised the PHP/NPHP ratio until the 6th day of the experiment.

In Light2, we observed similar variations in Chl a and Fuco (Fig. 10b), but DD did not

increase as in Light1 (Fig. 9d). In both light experiments, PHP/NPHP decreased until the

6th day of light exposure to values 45.50±9.33% (Light1) and 54.05±8.36% (Light2) lower

than the t0 prior to dark transition. Thus, the pigment composition of the antennae shifted

gradually to a higher proportion of the xanthophyll carotenoids (DD+DT), typical of high

light acclimated cells (MacIntyre et al., 2002, Kropuenske et al., 2009). The effective

absorption cross-section (σPSII) showed similar variations as PHP/NPHP during the light

experiments (Fig. 10c,d), but was only 4.10±2.08% (Light1) and 22.62±11.90% (Light2)

lower than the dark transition t0 values after 6 days of light exposure. Hence, this suggests

σPSII was not only affected by the pigment composition during the light return experiments

(Falkowski and Raven 2007).

We observed an increase of the photosynthetic proteins PsbA and RbcL during the Light1

experiment (Fig. 11a). PsbA remained stable within the first 5 hours of light exposure,

consistent with the fast-induced photoprotection preventing a further degradation of PsbA

(Wu et al., 2011). It then increased linearly to 117.92±18.50% of the t0 values in 6 days

(1.690±0.098 to 6.28±0.39×10-9; F(5,6) = 17.57*), supporting a reassembly of the RCII to

the pre-acclimation state. A replicate was discarded of the analysis as an outlier because it

did not increase after 1 day (Fig. 6a, black dots). The RbcL increase was delayed relatively

to PsbA and was not as linear. RbcL was nearly undetectable within the first 5 hours, was

only 16.08±8.12% of the t0 values after 1 day of light exposure and increased to

254.72±25.45% in 6 days (0.23±0.12 to 3.58±0.25 x 10-7; t(2) = 31.068*) (Fig. 11a).

However, Pmax increased much faster and reached 74.20±14.48% of the t0 values within 1

day of light exposure (S: t(18) = 3.87*) (Fig. 11c,e) as also observed by Popels et al.

(2007). Note that the Pmax fitted values have additional time-points from the first and the

second month of darkness since much of the increase occurred within 30 minutes of Light1

exposure. The discrepancies with the photosynthetic proteins are possibly explained by an

40

Figure 11.a,b) PsbA (black) and RbcL (blue) per cell c,d) Pmax (black) and ΦM (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bars. e,f) Exponential fits (Eq.10) to the Pmax and ΦM data, including the time-points of the first and second month of darkness for the Light1 et Light2 experiment respectively.

41

adjustment of the D1 (PsbA) and Rubisco (RbcL) catalytic activities. Indeed, we would

expect the low content of Rubisco to operate at maximal activity within 1 day of light

exposure (MacIntyre et al., 1996, MacIntyre et al., 1997). ΦM also increased to

111.93±5.21% within 1 day of light exposure (S: t(12) = 4.93*) (Fig. 11c,e), supporting a

fast recovery of the photophysiology (Luder et al., 2002) (unpublished, Lacour et al.,

2017). Note that ΦM values from the 6th day were discarded of the fitting because they

added high variance on the slope parameter. Despite the slower increase of photosynthetic

proteins and the decrease of PHP/NPHP, the cells achieved efficient energy transfer from

the RCII to the carbon fixation within 1 day after Light1 experiment.

In the Light2 experiment, PsbA and RbcL were nearly undetectable and the “recovery

slopes (S)” of Pmax and ΦM were significantly lower than in Light1 (14.43±3.73 to

0.27±0.25; tPmax(4999) = 268.13*) (6.04±1.22 to 0.46±0.15; tΦM(4999) = 319.77*) (Fig.

11b,d,f). Nevertheless, ΦM increased to 112.18±4.40% (S: t(15) = 2.95*) and Pmax

increased to 42.86±13.13% of the t0 values within 6 days (S: t(17) = 1.11, p-value > 0.05).

The recovery in Light2 was probably hindered by a larger dismantlement of the

photosynthetic apparatus and of the electron sink capacities. As in the dark experiment, the

variations of ΦM likely reflected the recovery of viable cells while Pmax reflected the

recovery of the whole cell population.

4.3.2.2 Metabolism recovery The data shown in the previous section indicate that the cells were photosynthetically

competent after 1 day of light return, at least in the Light1 experiment. This means that

organic carbon could be photosynthesized to support anabolism and ultimately cell growth.

Cellular carbon and nitrogen quotas increased significantly by 62.62±44.01% (4.34±0.24 to

7.05±1.52×10-6; F(5,6) = 4.40*) and 64.72±10.90% (0.89±0.12 to 1.47±0.29×10-6; t(2) =

5.72*) in 6 days for the Light1 experiment (Fig. 12a). The lipid droplets signal also

increased by 14.26±0.31% in 6 days (650.42±5.94 to 743.16±7.10; t(2) = 73.44*) (Fig.

12c). However, carbohydrates were probably the main carbon source synthesized that

accounted for the increase in POC (Myklestad 1974, Chauton et al., 2013). The cell volume

size increased by 9.32±1.02% in 6 days (12.13±0.05 to 13.26±0.08; t(2) = 16.26*) (Fig.

12c), which is consistent with the larger content in lipids, carbon and nitrogen. As expected,

42

Figure 12.a,b) POC (black) and PON (blue) per cell c,d) Cell volume (black) and Lipid droplets (blue) e,f) Biovolume (black) and Cell number per mL (blue) of Fragilariopsis cylindrus cultures for the Light1 and Light2 experiments. Each points is the mean of the three cultures with their standard deviation as the error bar. the cell population entered an exponential growth phase measured between 1 day and 6

days following exposure to light with a mean growth rate of 0.1455±0.0099 d-1 (Fig. 12e).

43

This was nearly two times lower than the mean growth rate measured during the

acclimation period (0.244±0.041 d-1), probably as a consequence of the larger grown cells

and of potential mortality. For the Light2 experiment, carbon content similarly increased as

in Light1 (ANCOVA, p-value > 0.05) while nitrogen, lipid droplets, cell volume and cell

number slopes were significantly lower than in Light1 (ANCOVA, p-value < 0.05) (Fig.

12b,d,e). In fact, cell growth could not be measured. Important mortality may have

compromised the population ability to reinitiate growth upon light exposure. The lag phase

was previously reported to increase with increasing dark period (Dehning and Tilzer 1989,

Peters and Thomas 1996). In three species of antarctic diatoms, the lag phase lasted 4 days

following 74 days in the dark (Peters and Thomas 1996). Perhaps F. cylindrus needed a

couple more days before entering an exponential growth phase during the Light2

experiment.

44

4.4 Conclusion Our study measured strong acclimation processes in F. cylindrus to both darkness and

return of light. A physiological resting state was reached a few days following transition to

dark and was maintained throughout until the return to light. This rather stable state was

characterized by low energy reserve consumption, slow decrease of photosynthetic

pigments and very low photosynthetic capacities. Subsequent transition to light after 1.5

months triggered fast photoprotection and renewal of photosynthetic components. Rapid

recovery of photophysiology occurred already within a few hours of return to light,

followed by subsequent cell growth after 1 day. The re-acclimated light state showed

similar characteristics to high light grown cells. The results from transition to light after 3

months highlighted the importance of a lag phase that increases in length with longer period

of darkness. Important mortality may have delayed the full recovery of the population to a

lag phase longer than 6 days.

Survival to long period of darkness is crucial to the polar algal communities and to the

phytoplankton experiencing deep ocean mixing events. The physiological mechanisms

underlying this survival may be more efficient in some species than others. Fragilariopsis

cylindrus is found in both Arctic and Antarctic Ocean and have evolved adaptive strategies

to thrive in these extreme habitats (Lyon and Mock 2014, Mock et al., 2017). The low rate

of energy comsuption and high photoprotective capacity involved in darkness survival may

be two physiological traits that allow F. cylindrus to outcompete other polar species that

have limited NPQ capacity or temperate species that burn energy reserve faster. Our

understanding of dark survival has now gained in completeness, yet it remains to be

investigated wether mortality is a major factor explaining the decreases and the delayed

recoveries of measured physiological and molecular parameters. Accurate measures of

mortality should be monitored in future studies as suggested by our results. Progressive

dark and light transitions, rather than sudden lights shift as in our experiment, should also

be tested and coupled with mortality measurements to determine if a particular light regime

compromise survival more than another one. Finally, the importance of heterotrophy should

be also clarified, because available DOC under sea-ice could improve survival to long

period of darkness.

45

Chapitre 5. Conclusion Notre étude a démontré une forte acclimatation chez Fragilariopsis cylindrus, une diatomée

arctique, lors du passage à l’obscurité et lors du retour de la lumière. Nous avons intégré

plusieurs descripteurs physiologiques et biochimiques sur une durée de 3 mois d’obscurité.

La transition à l’obscurité a déclenché une réponse typique de dormance physiologique qui

a été maintenue durant toute la période d’obscurité. Dans cet état de dormance, les cellules

ont peu varié en nombre et en taille. Le métabolisme a été réduit à un minimum puisque les

réserves énergétiques n’ont presque pas été consommées selon les mesures de carbone,

d’azote et de gouttelettes de lipides. Le complexe antennaire du photosystème II s’est

relativement bien conservé malgré la diminution importante des pigments

photosynthétiques. Les capacités photosynthétiques ont fortement diminué jusqu’à des

valeurs minimales couplées avec des diminutions concomitantes de la protéine D1 et de

l’enzyme RUBISCO en quantité et en activité. Les faibles capacités photosynthétiques

mesurées ont montré une vulnérabilité à la photoinhibition pouvant ainsi compromettre la

reprise de croissance lors du retour de la lumière.

Au premier retour à la lumière après 48 jours de noirceur, le NPQ développé via la

diatoxanthine a été fortement sollicité comme mécanisme de photoprotection dès les

premières heures. Ce mécanisme s’est ensuite relaxé simultanément avec une augmentation

rapide des activités photosynthétiques en moins de 24 heures. Jusqu’à ce jour, la

photoprotection n’avait jamais été aussi rigoureusement suivie et couplée avec autant de

mesures physiologiques et biochimiques lors d’expériences de retour à la lumière. Le

développement du NPQ avait toutefois fait l’objet d’expériences chez des diatomées

antarctiques et les résultats obtenues avaient suggéré l’importance de ce mécanisme dans la

reprise des activités photosynthétiques (McMinn et al., 2010). L’analyse des variations de

la composition en pigments a montré que les cellules se sont acclimatées d’une manière

similaire à une expérience de transition de faible à forte lumière. Finalement, une reprise de

la croissance s’est rapidement manifestée par l’augmentation du carbone, de l’azote, des

lipides, de la taille et du nombre de cellule après 24 heures et s’est poursuivie jusqu’au 6e

jour.

46

La mortalité des cellules ne semble pas avoir été un problème majeur pour le premier retour

à la lumière après 48 jours d’obscurité, mais les résultats du deuxième retour la lumière ont

montré que la viabilité de la population était compromise après 90 jours d’obscurité totale.

Bien que nous ne puissions pas confirmer cette progression de la mortalité grâce à des

mesures de viabilité, les écarts dans la vitesse de reprise des activités photosynthétiques et

de la croissance entre le premier et le deuxième retour à la lumière ont suggéré un effet

important de la mortalité. La phase de latence (temps écoulé avant la reprise de croissance)

est influencée par la mortalité et augmente avec la longueur de la période d’obscurité

(Dehning and Tilzer 1989, Peters and Thomas 1996). Un suivi de 6 jours n’a probablement

pas été suffisant pour observer une reprise de croissance lors du deuxième retour à la

lumière.

Les résultats obtenus suite à cette expérience confirment ceux des expériences passées et

répondent aux hypothèses énoncées. Ils fournissent une compréhension plus complète de

l’acclimatation à la nuit polaire puis au retour de la lumière chez les diatomées arctiques.

Les espèces qui composent les communautés polaires ont différentes niches écologiques

selon leurs particulartités physiologiques et leur capacité à s’acclimater (Petrou et al.,

2016). Les mécanismes qui permettent la survie à l’obscurité peuvent varier en efficacité

selon les conditions de croissance et selon l’espèce étudiée. Notre étude s’est concentrée sur

la réponse de F.cylindrus. Une réponse différente pourrait être attendue chez une diatomée

centrique comme la Chaetoceros socialis qui est observée plus tard que F. cylindrus dans la

succession des espèces de l’efflorescence printanière en Arctique (Booth et al., 2002).

Néanmoins, la prépondérance de F. cylindrus vis-à-vis d’autres espèces en Arctique et en

Antarctique est peut-être expliquée en partie par des caractéristiques physiologiques

compétitives de survie à l’obscurité, soit une très faible consommation des réserves

énergétiques et une forte capacité de NPQ (Petrou et al., 2011) au retour de la lumière.

.Des expériences futures pourront creuser davantage les secrets moléculaires qui

caractérisent la survie à l’obscurité. Elles pourront intégrer un point de vu axé davantage

sur la génétique qui est maintenant plus accessible (Mock et al., 2017). Toutefois, la

47

mortalité est un paramètre crucial qu’il faudra savoir mesurer avec précision et exactitude.

Aussi, les transitions de lumière en Arctique ne sont pas aussi abruptes que celles imposées

lors de notre expérience, notamment pour la transition vers l’obscurité. Une transition plus

graduelle de l’obscurité et de la lumière pourrait influencer la mortalité ainsi que la nature,

la vitesse et l’amplitude de l’acclimatation observée chez F. cylindrus. Finalement,

l’importance de l’hétérotrophie est une caractéristique qui devra être clarifiée dans de

futures expériences. Cette dernière pourrait améliorer considérablement la survie à de

longues périodes d’obscurité. Les conclusions tirées suite à cette étude et aux futures

recherches sur ce sujet fondamental contribueront à une meilleure description de la survie à

l’obscurité chez les communautés d’algues polaires et chez le phytoplancton soumis au

mélange vertical profond.

48

6. Références AdlSM,SimpsonAGB,FarmerMA,AndersenRA,AndersonOR,BartaJR,Bowser

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7. Annexes

Annexe 1: Picture of Fragilariopsis cylindrus (Grunow) Krieger CCMP1102 (JGI)

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Annexe 2: Culture medium recipe (f/2 and L1)

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Annexe 3: Picture of the inside of the growth chamber with culture 1(left), culture 2(centerback) and culture 3(right) of Fragilariopsis cylindrus grown in 20L polycarbonate round vessels during light acclimation prior to dark transition. The growth chamber’s front door equipped with LED bands provided illumination to all cultures. Culture 1 and 3 shaded the back of the chamber, but culture 2 was half-surrounded by a customized aluminum panel in order to reflect photons and increase light exposure. Yet, culture 2 received 29.5 µmol photon m-2 s-1 while culture 1 and 3 received 33.5 µmol photon m-2 s-1. Yellow numbers describe each culture vessel components: 1(air outflow), 2(air inflow), 3(media inflow), 4(media outflow), 5(magnetic stirrer).

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Annexe 4: Spectrum of the different light sources used during the experiments. The integer of each spectrum gives 30 µmol photons m-2 s-1.

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Annexe 5: Picture of the culture 1(front), culture 2(middle) and culture 3(back) of Fragilariopsis cylindrus grown in 3L vessels during the Light1-2 experiment. Illumination of ~30 µmol photon m-2 s-1 was provided by 3 out of 6 panels equipped with a customized LED system. Two bands of 10 LEDS each composed one LED panel. Each panel is made with a ½ inch thick acrylic mirror. Yellow numbers describe each culture vessel components: 1(cooling inflow), 2(cooling outflow), 3(air inflow), 4(light sensor), 5(temperature sensor), 6(sampling syringe). **The labeled LED system seen on this picture is turned off.