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UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ANIMALE
Année : 2009-2010 Numéro : 55
Mémoire de diplôme de master II en Biologie Animale
Spécialité : Génétique Des Populations
Présenté et soutenu le 30 Novembre 2010
Par
Sidy Diakhaté
Né le 18-10-1984 à Dakar
Membres du jury :
Président : Pr Danamou Mounport Professeur titulaire, UCAD
Membres : Dr Farma Ndiaye Cissé Chercheur ISRA
Dr Dominique Masse Directeur de Recherche, IRD
Dr Yacine Badiane Ndour Chercheur ISRA
Dr Pape Mbacké Sembène Maître de Conférences, UCAD
AMELIORATION DES SOLS CULTIVES AVEC DE LA
BOUE DE STATIONS D’EPURATION DE PIKINE ET
CAMBERENE : IMPACT SUR LA DIVERSITE
BACTERIENNE DU SOL.
i
CE TRAVAIL EST DEDIE A :
MA MERE
ET
A
M ON FRERE
ii
RESUME
L’objectif de ce travail était de voir l’influence de l’apport de la boue activée et stabilisée sur
la structure génétique de la communauté bactérienne totale et nitrifiante (AOB) et la viabilité
des pathogènes (Salmonelles et vibrions) dans les sols amendés. Des échantillons de sol et de
boues ont été prélevés respectivement dans la zone des Niayes de Pikine et des stations
d’épuration de Pikine et Cambérène. Les sols ont été amendés à raison de 2 g de boues pour
100 g de sol puis incubés pendant 21 jours à 30°C. Les analyses microbiologiques ont été
effectuées à T0, T7, T14, T21 et T28 jours par la méthode présence-absence. Les analyses
moléculaires ont été faites par la technique de la PCR-DGGE à T0 et à 21 jours d’incubation.
Les résultats obtenus montrent une absence des bactéries pathogènes recherchée (Salmonella
spp et vibrio spp) dans les échantillons de sols témoins et amendés (0 UFC/25g). L’apport de
la boue a entrainé une modification de la structure génétique de la communauté bactérienne
totale avec une grande diversité dans les sols amendés avec de la boue stabilisée, cependant la
boue activée augmente la densité de certaines communautés bactériennes. Du fait la vitesse de
croissance assez lente des AOB la durée d’incubation de 21 jours ne nous a pas permis
d’observer des changements remarquables dans la structure génétique de cette communauté
nitrifiante.
Mot clés : Diversité bactérienne, Boue activée et stabilisée, PCR-DGGE, AOB, Pathogènes,
Niayes.
Abstract
The aim of this study was to see the influence of the contribution of activated sludge and
stabilized on the genetic structure of the total community and nitrifying (AOB) and the
viability of pathogens (Salmonella and vibrio) in amended soils. Samples of soil and sludge
were collected respectively in the Niayes Pikine and wastewater treatment plants and Pikine
Cambérène. The soils were amended with 2 g of sludge per 100 g soil and incubated for 21
days at 30 ° C. Microbiological analysis were performed at T0, T7, T14, T21 and T28 days by
the presence absence method. Molecular analyses were made by the technique of PCR-DGGE
at T0 and 21 days of incubation. The results show an absence of pathogenic bacteria sought
(Salmonella spp and Vibrio spp) in soil samples amended and witnesses (0 UFC/25g). The
contribution of the mud has caused a change in the genetic structure of the total bacterial
community with great diversity in soils amended with sludge stabilized; however, activated
sludge creates a density of certain bacterial communities. Because the growth rate slow
iii
enough for the AOB incubation period of 21 days does not allow us to observe remarkable
changes in the genetic structure of the nitrifying community.
Keywords: Microbial diversity, Activated and stabilized sludge, PCR-DGGE, AOB,
pathogens, Niayes.
i
Remerciements
Ce travail a été réalisé au Laboratoire d’Ecologie Microbienne des Sols et Agrosystèmes
Tropicaux (LEMSAT) qui est un labo commun IRD-ISRA-UCAD.
J’exprime ma profonde gratitude à Mme YACINE NDOUR BADIANE pour m’avoir
proposé ce sujet et de ne ménager aucun effort pour avoir mis à ma disposition tous les
moyens nécessaires à sa réalisation.
Je remercie Monsieur Dominique Masse directeur du LEMSAT pour les critiques et
suggestions apportées pour la réussite de ce travail. Mes sincères remerciements vont à
l’endroit de Monsieur Pape Mbacké Sembène pour ses enseignements, son ouverture, sa
disponibilité et ses conseils, mais aussi au Pr Danamou Mounport pour avoir accepté de juger
ce travail et pour ses enseignements de qualité en Génétiques des populations.
Mention spéciale à Madame Mariama Mbodj Gueye pour ses conseils, sa disponibilité et sa
précieuse contribution dans ma formation en biologie moléculaire et dans la réussite de mon
stage à l’ITA. Je tiens à remercier également, Dr Mame Farma Ndiaye CISSE, Maimouna
Mboup, Moussa Ndiénor, Komi Assigbetssé, Ndèye Hélène Diallo, Thierno Sow , Abdoulaye
Badiane Amadou Lamine DIENG ; Adja Basse et Cheikh Beye de l’ITA pour leur soutien et
leur encouragement. Mes remerciements vont à l’endroit de l’ensemble du personnel
technique du LEMSAT : Amadou DIOP dit Traoré, Lamine SAGNA, Moustapha Sané,
Mahécor Diouf, Omar FAYE, Mme Fatou GUEYE Saliou FAYE, Eli Diatta Blaise Mané
pour la joie et la bonne humeur permanente qui régnaient dans le labo.
J’en profite pour remercier chaleureusement tous les étudiants je veux nommer Amadou
Gueye Michel Norbert Kor Ndiémé Fall Sidy Tounkara Mbaye Diédhiou Isseu Ciss Ndéye
Ndague Niang.
Je ne saurai terminer cette partie sans avoir une pensée pieuse à l’égard de Feu Madame
Ngoné Keita du laboratoire de Microbiologie de l’ITA pour m’avoir accueilli mais aussi pour
le suivi quotidien des mes activités en Microbiologie que la terre lui soit légère.
Loin d’avoir cité tout le monde je souhaite que tous ceux, de près ou de loin qui ont ensoleillé
mes années universitaires trouvent ici ma reconnaissance pour leur gentillesse, leur
disponibilité, leur confiance et leur sourire.
ii
Sommaire
INTRODUCTION .................................................................................................................... 1
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................ 3
I.1Les différents types de boues .............................................................................................. 4
I.1.1.Les boues activées ............................................................................................................ 4
I.1.2.Les boues stabilisées ........................................................................................................ 6
I.2. Les éléments constitutifs des boues d’épuration ............................................................. 7
I.3.Teneur des boues en micro-organismes pathogènes ........................................................ 7
I.3.1 Les micro-organismes primaires d’origine fécale. ........................................................ 8
I.3.2 Les micro-organismes secondaires présents initialement ............................................ 8
I.4.Les agents pathogènes ........................................................................................................ 9
I.4.1. LES SALMONELLES ................................................................................................... 9
I.4.1.1.Caractères généraux ..................................................................................................... 9
I.4.1.2.Classification phylogénétique (Watson, 1989) ......................................................... 10
I.4.2. LES VIBRIONS ............................................................................................................ 10
I.4.2.1.Caractères généraux ................................................................................................... 10
I.4.2.2.Classification phylogénique ....................................................................................... 10
II.ETUDE DE L’INFLUENCE DES BOUES DE STATIONS D’EPURATION SUR LE
SOL .......................................................................................................................................... 10
II.1.La nitrification ................................................................................................................. 11
Figure 4 : Processus de la minéralisation et la nitrification de l’azote organique ........... 12
II.3. Les caractéristiques des Ammonia oxidizing bacteria (AOB) ................................... 12
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES ................................................................. 14
I.LE MATERIEL ................................................................................................................... 15
I.1.PRESENTATION DE LA ZONE D’ETUDE ................................................................ 15
I .2.LE MATERIEL BIOLOGIQUE .................................................................................... 15
I.2.1.Le sol ............................................................................................................................... 15
iii
I.2. 2. La boue de station d’épuration .................................................................................. 16
I.3. Incubation des sols amendés avec de la boue ................................................................ 17
II. Mesures analytiques .......................................................................................................... 17
II.1.Mesures du pH des échantillons .................................................................................... 17
II.2. Recherche des micro-organismes pathogènes ............................................................. 17
II.2.1. Recherche des Salmonelles ......................................................................................... 17
II.2.2. Recherche des bactéries du genre Vibrio .................................................................. 19
II.3.ANALYSE MOLECULAIRE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES : .......... 21
II.3.1. Extraction de l’ADN total des échantillons ............................................................... 21
II.3.1.1. Lyse physique des cellules bactériennes ................................................................. 21
II.3.1.2.Précipitation et purification ..................................................................................... 21
II.3.1.3.Quantification de l’ADN ........................................................................................... 22
II.3.2. Etude de la structure génétique de la communauté bactérienne totale ................. 22
II.3.2.1.Principe ...................................................................................................................... 22
II.3.2.1.1.LA PCR ................................................................................................................... 23
II.3.2.1.2.LA DGGE ............................................................................................................... 23
II.3.2.2.Méthodologie de PCR-DGGE .................................................................................. 24
II.3.2.2.1. Amplification de l’ADN par PCR ........................................................................ 24
II.3.2.2.2.Electrophorèses en gradient de dénaturation (DGGE) ...................................... 27
II.4. Analyse des gels DGGE ................................................................................................. 28
RESULTATS ET DISCUSSION .......................................................................................... 29
III.RESULTATS .................................................................................................................... 30
III.1.pH des sols amendés ...................................................................................................... 30
III.2.Analyse des pathogènes ................................................................................................. 31
III.3. STRUCTURE DE LA COMMUNAUTE BACTERIENNE TOTALE ................... 31
III.4. Structure des communautés bactériennes nitritantes (AOB) ................................... 34
IV. DISCUSSION GENERALE DES RESULTATS .......................................................... 36
iv
IV.1.Analyses des pathogènes ................................................................................................ 36
IV.2. Effet de l’amendement et de l’incubation sur la diversité bactérienne. .................. 37
IV.2. 1.Structure génétique de la communauté bactérienne totale .................................... 37
IV.4.Structure des communautés bactériennes nitritantes (AOB) .................................... 38
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 40
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................. 42
v
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNr : Acide désoxyribonucléique ribosomique
BET : Bromure d’éthidium
BSA : Bovine Serum Albumin
CO2 : Dioxyde de carbone
dNTP : Désoxyribonucléosides TriPhosphate
EDTA : Ethylène Diamine-Tetra-acétic Acid
g : Gramme
H : Heure
m2 Mètre carré
m : Mètre
mg Milligramme
mM : Millimolaire
min : Minute
MO : Matière Organique
N : Azote
NH3 : Ammoniac
NO3- : Ion nitrate
pb : paires de bases
PCR : Polymerase Chain Reaction
pH : Potentiel hydrogène
qsp : quantité suffisante pour
s : Seconde
TBE Tris borate EDTA
UV : Ultra-Violet
UFC : Unité formant colonie
STEP : Station d’Epuration
µm : Micromètre
µl : Microlitre
% : Pourcentage
°C : Degré Celsius
vi
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Listes des Figures
Figure1 : Schéma de fonctionnement d’une station d’épuration…………………………….4
Figure 2 : Processus de traitement des eaux usées urbaines…………………………………6
Figure 3 : Schéma d’un procédé à boues activées (Station d’épuration de Pikine)………….7
Figure 4 : Processus de la minéralisation et la nitrification de l’azote organique……………13
Figure 5 : Sites de prélèvements des échantillons…………………………………………...16
Figure 6 : la boue activée de Pikine dans un lit de séchage………………………………....17
Figure 7 : Schéma de la Procédure d’étude………………………………………………….18
Figure 8 : schéma montrant l’augmentation exponentielle de la quantité
d'ADN cible à chaque cycle de PCR…………………………………………………………24
Figure9 : description Schématique de la DGGE…………………………………………….25
Figure 10 : Structure génétique de la communauté bactérienne totale à Toj
et après 21 jours d’incubation T21jours…………………………………………………. 32
Figure 11 : Dendrogramme de similarité (UPGMA) obtenus à partir
du profil DGGE de la communauté bactérienne totale des sols amendés…………………….33
Figure 12: Structure génétique de la communauté nitrosante à
To j et après 21 jours d’incubation……………………………………………………………34
Figure 13 : Dendrogramme de similarité (UPGMA) obtenus à partir
des profils DGGE des AOB dans les sols amendés. ………………………………………..35
vii
Liste des Tableaux
TABLEAU I : Composition générale des boues d’épuration (Source ADEME) ……………8
TABLEAU II : Principaux agents pathogènes d'intérêt sanitaire pouvant
être retrouvés dans les boues résiduaires (sources EPA, 1992)………………………………..9
TABLEAU III : Interprétation de la galerie en sel …………………………………………..22
TABLEAU IV : Cycles thermiques d’amplification par PCR de la région
V3 du gène 16S de l’ADNr ………………………………………………………………….26
TABLEAU V: les différentes étapes du cycle thermique pour
l’amplification de l’ADNr 16S des bactéries totales………………………………………..28
TABLEAU VI : les différentes étapes du cycle thermique pour
l’amplification de l’ADNr 16S des bactéries totales…………………………………………28
TABLEAU VII : Valeurs des ph des sols avant et après apport de la boue………………….30
TABLEAU VII : Résultats de l’analyse des pathogènes …………………………………….31
viii
ANNEXES
Annexe 1 : préparation des solutions d’extraction d’ADN
Annexe 2 : Composition des solutions utilisées
Annexe 3 : protocole d’extraction de l’ADN total du sol
Annexe 4 : Protocole de la DGGE
1
INTRODUCTION
1
En Afrique et au Sénégal en particulier les activités agricoles urbaines et péri-urbaines se
développent pour répondre au besoin alimentaire croissant de la ville. Cependant la quantité
très importante de déchets produits par la population citadine constitue un problème qu’il
convient de gérer. L’agriculture peut être une réponse à ce défi environnemental à travers la
valorisation des produits organiques résiduaires issus du traitement de ces déchets. Dans la
région de Dakar, l’agriculture urbaine qui se développe dans un contexte de fort déficit
hydrique, de pauvreté des sols et de faible disponibilité des terres due à une forte urbanisation,
est pratiquée de façon intensive. Cette intensification consiste à utiliser beaucoup d’engrais ou
de produits résiduaires organiques très riches en matière organique pour augmenter leur
production. Les eaux usées directement recueillies ont été pendant longtemps utilisées sans
aucun traitement préalable par les maraîchers de la zone des Niayes. Actuellement l’utilisation
de la boue issue du traitement de ces eaux usées dans les stations d’épuration a mis fin à cette
pratique. Les boues issues du traitement des eaux usées sont constituées d'eau et de matières
sèches contenant des substances minérales et organiques (Dudowski, 2000). La matière
organique permet d’augmenter la fertilité des sols avec comme corollaire la possibilité de
maintenir une production agricole soutenue et durable. Ces matières organiques stimulent
l’activité biologique dans ces sols et augmentent la disponibilité en éléments fertilisants. Les
bactéries ont une importance considérable dans la dynamique des matières organiques des
sols et les cycles biogéochimiques. Ils interviennent dans les cycles du carbone ou de l’azote.
Les boues contiennent également des micro-organismes pathogènes dont les plus importants
sont les salmonelles dans le groupe des bactéries et qui sont à l’origine des gastro-entérites
(Sahlstrom et al., 2004). Ces microorganismes pathogènes peuvent contaminer les cultures
maraîchères, lors de l’usage des boues. D’où la nécessité, de rechercher la présence
éventuelle de ces bactéries dans ces boues issues de station d’épuration et de suivre leur
évolution dans les sols amendés avec ces produits résiduaires organiques. En fait, le sol
représente un important réservoir de germes avec environ 108-10
9 bactéries par gramme de
sol. Cependant, la majorité de ces bactéries ne sont encore ni identifiées ni caractérisées, car
elles demeurent récalcitrantes aux techniques de microbiologie classique par culture sur
milieu gélosé (Rappe & Giovannoni, 2003). Les nouvelles techniques de la biologie
moléculaire permettent de contourner cet obstacle (McHardy & Rigoutsos, 2007). Cette
technique consiste à extraire l’ADN à partir d’échantillons de sols (le métagénome), de
l’amplifier et de l’analyser pour caractériser la structure d’une communauté bactérienne
complexe (Ramette, 2009).
2
Ce mémoire se propose d’étudier l’impact de l’application de boues urbaines issues du
traitement des eaux usées sur les sols cultivés. Notre étude s’inscrit dans le contexte du projet
ISARD qui vise à promouvoir le recyclage des produits résiduaires organiques (PRO) pour
augmenter les productions agricoles via l’intensification des processus écologiques se
déroulant dans les sols tout en limitant les risques posés par ces pratiques.
L’objectif général de ce travail est d’étudier l’impact de l’amendement des sols cultivés avec
de la boue urbaine sur les communautés microbiennes du sol.
Il s’agira :
- d’étudier l’impact de ses boues sur la communauté microbienne totale des sols et sur
les communautés spécifiques des bactéries ammonium-Oxydantes (AOB) ;
- et de rechercher la présence des bactéries pathogènes dans ces boues, et de suivre leur
évolution dans les sols après incubation.
Les hypothèses suivantes ont soutenu nos recherches :
La réponse des communautés bactériennes du sol varie en fonction la qualité de la
boue apportée.
L’apport de la boue de stations d’épuration affecte la structure génétique des (AOB)
présentes dans le sol amendé
La résistance ou persistance des germes pathogènes dans les sols amendés dépend de
l’état de dégradation de la boue urbaine.
Ce mémoire est divisé en quatre parties :
- La première partie est consacrée à la synthèse des connaissances sur les boues
urbaines, les bactéries pathogènes et celles impliquées dans le processus de la
nitrification ;
- La deuxième partie décrit la zone d’étude, et met en évidence le matériel et les
méthodes d’analyse utilisées ;
- La troisième partie présente les résultats obtenus à l’issu de la recherche des bactéries
pathogènes d’une part et d’autre part ceux issus de l’analyse de la structure génétique
des communautés microbiennes étudiées.
- Et la quatrième partie dégage la conclusion et les perspectives de ce travail.
3
CHAPITRE I : SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
4
On appelle « boues d’épuration » les sédiments résiduaires issus du traitement des eaux usées.
Les boues d’épuration urbaines résultent du traitement des eaux usées domestiques qui
proviennent de l’activité des particuliers et éventuellement des rejets industriels dans les
réseaux des collectivités après avoir suivi un pré-traitement obligatoire (document de synthèse
Aprifel). Les eaux usées sont collectées puis acheminées vers les stations d’épuration où elles
sont traitées. En fin de traitement, à la sortie de la station, l’eau épurée est rejetée vers le
milieu naturel et il reste les boues résiduaires qui sont composées d’eau et de matières sèches
contenant des substances minérales et organiques (Dudowski 2000). Ainsi les boues issues du
traitement de ces eaux concentrent une charge qui est fonction de différents facteurs :
Le mode de traitement au niveau de la station d’épuration.
L’état de santé de la population reliée à ce réseau.
Les différentes structures reliées (hôpitaux, abattoirs…).
Figure1 : Schéma de fonctionnement d’une station d’épuration (source ADEME)
I.1.Les différents types de boues
Selon le type de traitement appliqué aux eaux usées, on distingue :
I.1.1.Les boues activées
Elles sont obtenues à partir des procédés biologiques à cultures libres les bactéries se
développent dans des bassins alimentés d’une part en eaux usées à traiter et d’autre part en
oxygène par des apports d’air. Les bactéries en suspension dans l’eau des bassins sont donc en
5
contact permanent avec les matières polluantes dont elles se nourrissent et avec l’oxygène
nécessaire à leur assimilation. Le traitement consiste à dégrader les impuretés grâce à une
biomasse épuratrice, à laquelle doit être fourni de l’oxygène nécessaire à son développement.
Figure 2 : Processus de traitement des eaux usées urbaines
La biomasse utilisée dans le traitement des eaux usées constitue un écosystème très simplifié,
ne faisant appel qu’à des micro-organismes. Elle est constituée d’êtres vivants de petite taille
inférieure au millimètre, microflore de bactéries et d’une microfaune d’animaux protozoaires
et métazoaires proches des vers, ces êtres s’y trouvent à de très fortes concentrations de
l’ordre de 1011
à 1012
par litre pour les bactéries et 106 à 10
8 par litre pour la microfaune. (Gaid
2008). Les principes de fonctionnement diffèrent suivant que l’objectif est de traiter le
carbone ou le carbone et l’azote et/ou le phosphore : en pratique, il s’agit de permettre la
sélection des espèces de bactéries capables soit de transformer le carbone en CO2, soit de
transformer l’azote en nitrates puis les nitrates en azote gaz (N2), soit de stocker le phosphore.
Dans tous les cas, la séparation de l’eau traitée et de la masse des bactéries (que l’on appelle
«boues») se fait dans un ouvrage spécifique appelé "clarificateur".
Pour conserver un stock constant et suffisant de bactéries dans le bassin de boues activées,
une grande partie des boues extraites du clarificateur est renvoyée dans le bassin.
Une petite partie de ces boues, correspondant à l’augmentation du stock pendant une période
donnée, est évacuée du circuit des bassins d’aération et dirigée vers les unités de traitement
des boues : cette fraction des boues constitue les « boues en excès ». (Figure 2)
Eaux
résiduaires
Eaux
purifiées
Biomasse
épuratrice
Biomasse
épuratrice
Oxygène
Biomasse
Gaz
résiduaires
6
Figure 3 : Schéma d’un procédé à boues activées (Station d’épuration de Pikine)
I.1.2.Les boues stabilisées
Les boues se présentent au départ sous forme liquide et avec une forte charge en matière
organique hautement fermentescible. Ces deux caractéristiques sont gênantes quelle que soit
la destination des boues et imposent la mise en place d’une filière de traitement, c’est-à-dire
une suite organisée de procédés qui agissent de façon complémentaire.
Le traitement de stabilisation biologique a pour objectif de réduire la fermentescibilité des
boues pour atténuer ou supprimer les mauvaises odeurs. Elle se fait soit par voie aérobie (en
présence d'oxygène) dans les bassins d'aération ou dans des bassins de stabilisation aérobie,
soit par voie anaérobie (absence d'oxygène) dans des digesteurs avec production d'un biogaz
riche en méthane. Dans le premier cas, on obtient des boues « aérobies » ou « stabilisées
aérobies », dans le second cas des boues « digérées », encore appelées « anaérobies » ou «
stabilisées anaérobies » (Cas de la station d’épuration de Cambérène).
La boue traitée devra donc présenter une ou plusieurs des propriétés suivantes :
Un état stabilisé objectivement apprécié par un critère lié à son aptitude à générer des
nuisances olfactives.
Un état hygiénisé mesuré par un niveau de contamination en germes types (Entérobactérie,
virus, salmonelles et œufs d’helminthes).
Oxygène
Eau CLARIFIEE Eau brute Bassin d’aération CLARIFICATEUR
Boues activées
recirculées
Boues en excès
Lits de séchage
7
Une texture solide permettant sa tenue en tas à 30°C sur un site ou un bout de champ. (Gaid ,
2008).
I.2. Les éléments constitutifs des boues d’épuration
Le tableau I indique le pourcentage des éléments fertilisants ainsi que le pourcentage de la
matière organique contenue dans les boues.
TABLEAU I : Composition générale des boues d’épuration (Source ADEME, 1999)
La disponibilité du phosphore, de l'azote, et du taux de matière organique des boues est
conditionnée par le procédé de traitement utilisé dans la station. Par leur composition, les
boues, une fois épandues, augmentent le rendement des cultures. Elles contiennent des
nutriments pour les cultures et servent d’amendement organique et calcique pour améliorer les
propriétés physiques et chimiques du sol. Des micro-organismes présents en grand nombre
dans le sol digèrent en partie les matières organiques apportées par les boues et les
transforment en éléments minéraux disponibles pour la plante. Une autre partie des matières
organiques est incorporée au sol et contribue à l'entretient d'une structure favorable au
développement des racines.
I.3.Teneur des boues en micro-organismes pathogènes
Les quantités des différents micro-organismes pathogènes dans les boues varient en fonction :
- de la nature des rejets recueillis par le réseau (domestiques, industriels,…)
Matières et indicateurs Quantité
MATIERE SECHE (MS) 2 à 95 % selon la siccité
MATIERE ORGANIQUE (MO) 50 à 70 % de la MS
TENEUR EN
MATIERE
MINERALE
Azote 3 à 9 % de la MS
Phosphore 4 à 6 % de la MS
Rapport
CARBONE/AZOTE
5 à 12
8
- de l’état sanitaire de la population raccordée,
- des traitements effectués sur les eaux et les boues.
Les boues d’épuration contiennent des micro-organismes vivants en provenance des eaux
usées et des processus de traitement.
Seule une infime partie d’entre eux présente un danger infectieux pour l’homme et les
animaux : ils sont dits pathogènes.
Les micro-organismes pathogènes sont de quatre types : les virus, les bactéries les parasites
les champignons.
I.3.1 Les micro-organismes primaires d’origine fécale.
Les rejets des eaux de vannes et pluviales dans le réseau sont la source d’une charge
microbienne et parasitaire dans les effluents urbains traités au niveau des stations d’épuration.
Ainsi les boues issues du traitement de ces eaux concentrent cette charge qui est fonction de
différents facteurs cités plus haut. Ces pathogènes présents dans ces boues sont susceptibles
de disparaitre au cours d’un traitement biologique thermique etc. ( ADEME, 1999)
I.3.2 Les micro-organismes secondaires présents initialement
Ils se développent surtout au cours du compostage. Ce sont des champignons et des bactéries
mésophiles et thermophiles qui jouent un rôle dans la dégradation de la matière organique lors
de la phase de maturation.
Tableau II : les micro-organismes pathogènes des boues stations d’épuration
Principaux agents pathogènes d'intérêt sanitaire
pouvant être retrouvés dans les boues résiduaires (sources ADEME, 1999)
Micro-organismes Pathologie
Bactéries
Salmonella sp Salmonellose (gastro-entérite)
Shigella sp Dysenterie bacillaire
Yersinia sp Gastro-entérite
Vibrio cholerae Choléra
Escherichia coli (souches pathogènes) Gastro-entérite
Pseudomonas aeruginosa Gastro-entérite, infections diverses
9
Virus Enteriques
Virus de l’hépatite A et E* Hépatite infectieuse
Rotavirus Gastro-entérite
Réovirus Infection respiratoire, gastro-entérite
Astrovirus Gastro-entérite
Protozoaires
Cryptosporidium sp Gastro-entérite
Giardia intestinalis Diarrhée
Entamoeba histolytica Dysenterie
Balantidium coli Diarrhée et dysenterie
Toxoplasma gondii Toxoplasmose
Helminthes
Ascaris lumbricoïdes Troubles gastro-intestinaux
Trichuris trichiura Diarrhée, douleurs abdominales
Toxocara sp Diarrhée, douleurs abdominales
Taenia sp Nervosité, insomnie, troubles digestifs
I.4.Les agents pathogènes
I.4.1. LES SALMONELLES
I.4.1.1.Caractères généraux
Les salmonelles sont des bactéries entériques en forme de bâtonnets, anaérobies facultatives, à
Gram négatif, mobiles pour la plupart avec des flagelles péritriches, qui produisent du sulfure
d’hydrogène. La nomenclature des salmonelles est particulièrement complexe. La notion
d’espèce est peu employée pour le genre Salmonella et on réfère plutôt au sérotype. Ce genre
contient plus de 2 000 sérotypes différents (Centre d’expertise en analyse environnementale
du Québec, 2007). Les salmonelles peuvent se trouver dans les sols et les eaux, et dans
plusieurs résidus. Le genre Salmonella contient plusieurs sérotypes pathogènes pour l’humain
et les animaux. Ils présentent un pourcentage en G+C de 50 à 53% (Bourgeois et al ; 1998).
10
I.4.1.2.Classification phylogénétique (Watson, 1989)
Domaine : Eubacteria
Phylum XII : Proteobacteria
Classe : Gammaproteobacteria
Ordre : Enterobacteriales
Famille : Enterobacteriaceae
I.4.2. LES VIBRIONS
I.4.2.1.Caractères généraux
Les bactéries du genre Vibrio appartiennent à la famille des Vibrionaceae. Ce sont de
petits bacilles, de formes fréquemment incurvées dites « en virgule », extrêmement mobiles.
L'espèce la plus connue du genre Vibrio est Vibrio cholerae : agent responsable du choléra. Il
y a une vingtaine d'espèces du genre Vibrio.
I.4.2.2.Classification phylogénique :
Domaine : Eubacteria
Phylum XII : Proteobacteria
Classe : Gammaproteobacteria
Ordre : Vibrionales
Famille : Vibrionaceae
II.ETUDE DE L’INFLUENCE DES BOUES DE STATIONS D’EPURATION SUR LE
SOL
Les boues d’épuration présentent un intérêt agronomique réel du fait de la présence de matière
organique, d’azote et de phosphore et d’un rapport carbone/azote favorable. Mais pour
valoriser des boues, il faut à la fois respecter l’environnement, rechercher le coût le plus faible
possible et la solution technique la plus satisfaisante. Les boues représentent un apport de
matière fertilisante très bon marché en comparaison avec les engrais chimiques (document de
synthèse comité Aprifel). Ce faible coût constitue un atout majeur de cette pratique. Les
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matières organiques sont utilisées dans les sols comme substrat énergétique par les micro-
organismes hétérotrophes contribuant ainsi à la minéralisation de ces matières (Parnaudeau ,
2005). La décomposition commence par une simplification moléculaire. Outre les molécules
carbonées intactes qui restent dans le sol, une partie du carbone organique est, en condition
aérobie, minéralisé sous forme de CO2. Parallèlement, une autre partie est transitoirement
incorporée dans la biomasse microbienne, qui fait l’objet elle aussi de biodégradation. Enfin,
une dernière fraction est progressivement stockée sous forme de matière organique stable.
L’azote associé au carbone dans les molécules organiques est quant à lui ammonifié sous
forme de NH4+ (minéralisation de l’azote organique), une fraction de cette forme minérale de
l’azote pouvant être assimilé par les micro-organismes pour leur croissance : il s’agit d’une
ré-organisation de l’azote minéral, appelée également immobilisation. Il est possible
cependant que l’environnement soit pauvre en azote minéral, ou que la matière organique ne
soit pas suffisamment riche en azote, pour permettre la croissance microbienne. Cette dernière
étant ainsi une contrainte, les besoins en énergie sont également limité, et par conséquent
limite la minéralisation du carbone organique (Recous et al., 1995). L’azote du sol présent
sous forme de NH4+ est ensuite nitrifié par des populations microbiennes spécifiques (les plus
connues étant Nitrosomonas et Nitrobacter). L’ammonium peut également être volatilisé vers
l’atmosphère sous forme de NH3. Enfin les nitrates produits peuvent être perdus par
lixiviation ou dénitrification suivant les conditions du milieu, ou absorbés par les cultures.
II.1.La nitrification
La nitrification est un processus principalement respiratoire et aérobie responsable de
l’oxydation de l’ammonium en nitrite (nitritation), puis du nitrite en nitrate (nitratation)
(Prosser, 1986). Ces deux étapes successives sont réalisées par deux types de bactéries
différentes :
Les bactéries nitreuses ou nitritantes ou nitrosantes (genres Nitrosococcus, Nitrosomonas,
Nitrospira, Nitrosovibrio).
Les bactéries nitriques ou nitratantes (genres Nitrobacter, Nitrospira, Nitrospina,
Nitrococcus).
Ainsi les bactéries impliquées dans le processus de nitrification sont taxonomiquement peu
diversifiées et regroupés dans la famille des Nitrobacteriaceae. Il s’agit des bactéries à Gram
négatif, de petite taille et présentant une mobilité variable. Parmi ces bactéries nous
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retrouvons les bactéries oxydant l’ammoniaque (AOB) qui jouent un rôle important dans la
transformation du NH3 en NO2-.
Figure 4 : Processus de la minéralisation et la nitrification de l’azote organique
II.3. Les caractéristiques des Ammonia oxidizing bacteria (AOB)
Le groupe des bactéries ammonium-oxydantes (AOB) réunit plusieurs genres, eux-mêmes
composés de plusieurs espèces. Dans ce groupe, Bock et al (1989) et Teske et al (1994) ont
défini les genres suivants Nitrosomonas (10 espèces), Nitrospira (5 espèces) Nitrosococcus (3
espèces) Nitrosolobus (2 espèces) et Nitrosovibrio (2 espèces) appartiennent à la sous-classe
des β Protéobactéries. Les AOB ont été proposés comme des organismes modèles en
écologie microbienne (Kowalchuk et Stephen, 2001) et sont souvent utilisés comme
indicateurs des perturbations de sol (Hastings et al., 1997 ; Stephen et al., 1999 ; Philips et al.,
2000 ; Chang et al., 2001 ; Oved et al., 2001 ; Nyberg et al., 2006). Horz et al (2004) ont
démontré que les communautés des AOB étaient modifiées par plusieurs changements
globaux tels que l’augmentation du CO2 atmosphérique, la température les dépôts d’azote etc.
Ces organismes sont uniques dans leur capacité à utiliser la conversion de l'ammoniac en
nitrites comme source d'énergie unique (Kowalchuk & Stephen ; 2001). Cette image a un peu
changé dans les dernières années, comme il a pu être démontré que l'oxydation d'ammoniac
peut être effectué non seulement par AOB, mais aussi par « AOA » (archaeae oxydant
l’ammoniaque) qui pourraient être détectés dans le sol (Leininger et al., 2006). Cependant, le
rôle de ce dernier groupe dans le cycle dynamique de l’azote n’est pas bien connu. L’étude de
la structure des AOB de la sous-classe des β-Proteobacteria revêt une importance capitale du
fait de leur rôle d’indicateur d’organismes mais aussi de leur importance dans le cycle de
l’azote. Le pH des sols est bien connu comme étant un facteur primordial dans la croissance et
l’activité des AOB dans ces écosystèmes (Prosser & Embley, 2002) cité par Enwall et al
(2007) et ces derniers ont montré dans leur étude que lors d’une diminution du pH,
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l’ammoniac s’ionise pour former l’ammonium et la variation observée dans le potentiel de
l’oxydation de l’ammoniac est susceptible d’être directement déterminé par le pH contrôlant
ainsi la disponibilité de l’ammoniac d’où son impact à la fois sur l’abondance et l’activité de
ces bactéries. Les bactéries nitrifiantes ont une croissance et une activité optimale pour un pH
compris entre 6,6 et 8 (Paul & Clack, 1989). Cependant dans la nature, ces bactéries peuvent
tolérer des gammes de pH plus larges, notamment des pH acides (Josserand & Bardin, 1981).
Le pH joue un rôle déterminant dans la préférence des micro-organismes pour une des formes
d’azote. Une baisse de pH favorise l’absorption de l’ammonium (Heller, 1969). Paul et Clark
(1989) ont montré qu’il existait une corrélation entre la production de nitrate et le pH. Le taux
de nitrification dans les sols cultivés diminue en dessous du pH 6 et devient négligeable en
dessous de pH 4,5. Aux pH élevés, l’oxydation de l’ammonium en nitrite puis en nitrate est
inhibée. Dans les eaux usées, la bactérie nitrosante la plus commune serait Nitrosomonas
(Watson et al., 1989 ; Wagner et al., 1995 ; Princic et al., 1998 ; Okabe et al., 1999). Sur les
30 % de bactéries nitrosantes des biofilms autotrophes (au lieu de 10 % pour les biofilms
hétérotrophes), 96 % sont des Nitrosomonas de trois genres différents (Nitrosomonas
europaea, Nitrosomonas eutropha et Nitrosomonas halophila), (Okabe et al., 1999 ).
Nitrosospira multiformis a également été détectée au sein des boues autotrophes, mais leur
densité cellulaire ne représentait que la moitié de celle des Nitrosomonas (Okabe et al.,
2004).
14
CHAPITRE II : MATERIEL
& METHODES
15
I.LE MATERIEL
I.1.PRESENTATION DE LA ZONE D’ETUDE
Les stations d’épuration qui produisent les boues se situent dans les localités de Pikine et de
Cambérène dans la région de Dakar (figure 5).
Le sol est prélevé dans une parcelle non cultivée de la zone maraichère des Niayes dans la
localité de Pikine.
Figure 5 : Sites de prélèvements des échantillons
I .2.LE MATERIEL BIOLOGIQUE
I.2.1.Le sol
Les sols du Sénégal sont classés parmi les sols ferrugineux tropicaux (Dubois, 1948). Ces sols
sont typiques des zones soudano-sahéliennes ayant une saison pluvieuse de trois à quatre
mois avec une pluviométrie annuelle inférieure à un mètre et une saison sèche d’au moins huit
mois (Duchaufour, 1960).
Le sol étudié est un sol agricole de type Dior: appellation locale donnée aux sols ferrugineux
dont la texture est majoritairement sableuse, généralement très pauvres en matière organique
SITE D’ETUDE
16
avec un fort caractère filtrant vis-à-vis de l’eau (Ndao, 2008). Le sol que nous avons utilisé
pour notre expérimentation a été prélevé au niveau de l’horizon de surface (0 - 10 cm) d’une
parcelle non cultivée et n’ayant jamais été amendé avec de la boue de stations dans la zone
maraichère de Pikine. Sur cette parcelle d’environ 150 m2, 2 échantillons composites ont été
prélevés constitués de 6 sous-échantillonnages distants d’environ 2 m.
Le sol est séché à l’air, broyé et tamisé à 2 mm puis stocké à l’air ambiant pour la suite de
l’expérience.
I.2. 2. La boue de station d’épuration
Figure 6 : la boue activée de Pikine dans un lit de séchage
La station de Pikine ne produisant que des boues activées (le processus de digestion n’étant
pas encore mis en œuvre), nous avons prélevé des échantillons de boues activées sur la station
de Pikine, boues utilisées par les agriculteurs installées autour de la station, et des boues
stabilisées sur la station d’épuration des eaux usées de Cambérène. Dans chacune des
situations (2 stations), 3 lits de séchage (surface de 250 m²) ont été identifiés. Sur chacun de
ces lits, 6 échantillons distants d’environ 4 m sont prélevés et réunis en un seul échantillon
composite. Nous avons donc constitués 6 échantillons de boues : 3 boues activées provenant
de la station de Pikine et 3 boues stabilisées provenant de la station de Cambérène. Les boues,
dans un état avancés de séchage au moment du prélèvement, ont été broyées puis tamisées à
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250 µm. La poudre obtenue est conservée au frais à la température de 4°C jusqu’à son
utilisation.
I.3. Incubation des sols amendés avec de la boue
Les échantillons incubés dans des pots sont constitués d’un échantillon de sol de 200g
mélangé avec 4 g de boue. Chaque échantillon a été répété 3 fois. Des mesures sont effectuées
à 7 jours d’intervalles (T0j, T7j, T14,j T21j et T28j) pour les analyses microbiologiques et à
T0j et à T21 jours pour les analyses moléculaires (Figure 7). Ces analyses étant destructrices,
on a donc au départ un total de 45 échantillons incubés à l’étuve pendant 28 jours à 30°C.
Figure 7 : Schéma de la Procédure d’étude
II. Mesures analytiques
II.1.Mesures du pH des échantillons
La mesure du pH d’un sol permet de définir son état d’acidité ou d’alcalinité. Le pH a été
mesuré par le ratio 1 :2,5 (poids sur volume) avec de l’eau. Ainsi on détermine le pH de la
suspension formée à l’aide d’une électrode combinée à un pH-mètre Mettler Toledo 320.
Pour l’ensemble des analyses, 3 répétitions de mesures ont été réalisées.
II.2. Recherche des micro-organismes pathogènes
II.2.1. Recherche des Salmonelles
Recherche des
pathogènes.
(Salmonelles et Vibrio ) (T0
à T28j)
Structure génétique de la communauté
bactérienne totale (T0 et T21j)
Structure génétique
des AOB (T0 et T21j)
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La recherche des Salmonelles dans les échantillons environnementaux a été réalisée en
collaboration avec l’Institut de Technologies Alimentaires (ITA) et comprend plusieurs étapes
successives par référence à la norme (AFNOR NF V 08-052):
Pré-enrichissement non sélectif : 25g de notre échantillon sont pesés dans un sachet
Stomacher dans lequel on ajoute 225 ml d’eau peptonée tamponnée. Le mélange est
homogénéisé dans un appareil appelé Stomacher 400 Laboratory Blender puis l’ensemble est
incubé à 37° pendant 16 à 20 h.
Enrichissement dans deux milieux sélectifs liquides : A cet effet 0,1ml de la suspension
mère est placé dans 10 ml de bouillon Rappaport Vassiliadis et incubé à 42° pendant 18 à 24h.
Le Rappaport Vassiliadis est un milieu d’enrichissement sélectif pour les salmonelles.
Parallèlement 1ml de la même suspension mère est placé dans 10 ml de bouillon MKTTn
(Muller-Kaufmann TetraThionate novobiocine) encore appelé BKT (Bouillon Muller-
Kaufmann TetraThionate novobiocine) et le mélange est incubé à 37° pendant 18 à 24h.
Isolement sur milieu sélectif solide Hektoen: Avec une pipette Pasteur boutonnée, une
suspension du bouillon est ensemencée dans le milieu Hektoen en faisant des stries sous une
hotte à flux laminaire (TelSTAR AV -100). Les boites ensemencées sont ensuite incubées
pendant 24 à 48 h à 37°C à l’étuve. La lecture de ces boites permet d’identifier la présence ou
l’absence des salmonelles qui sont des colonies bleues avec ou sans centre noir (production de
H2S). Les colonies suspectes de salmonelles sont soumises trois tests dont les deux premiers
sont présomptifs et la dernière pour une confirmation car incluant les deux premiers tests :
Test Urée-Indole.
Ce test se fait sur milieu urée tryptophane, appelé improprement milieu Urée Indole. Le
milieu Urée Tryptophane est un milieu synthétique complexe qui fournit un ensemble de
résultats utiles à l'identification de nombreux germes bactériens, notamment parmi les
Enterobacteriaceae. Il permet de détecter une activité uréase, enzyme hydrolysant l’urée.
Cette activité est directement détectable par le suivi de l'alcalinisation. La coloration rouge
traduit une alcalinisation du milieu, suite à l'hydrolyse de l'urée et une formation de carbonate
d'ammonium. Si le milieu garde sa couleur initiale (jaune orangé), alors il n y a pas eu
d’alcalinisation.
Pratiquement, il s’agit de suspendre une ou deux colonies suspectes dans les tubes « Urée
indole » commercialisés, d’ajouter 0,3 ml d’eau physiologique et 2 à 3 gouttes d’huile de
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vaseline. Le mélange est vortexé puis incubé à 37°C à l’étuve, en présence d’un tube témoin.
Au bout de 24 heures, du réactif de Kovac’s est rajouté. Ce réactif contient du diméthyl-
amino-4-benzaldéhyde réagit avec l'indole, et forme un composé coloré en rouge (anneau à la
surface du milieu).
Les salmonelles sont Uréase négatif et Idole négatif.
Test présomptif (Kli-gler Hajna)
Ce test est basé sur la fermentation de glucose, du lactose, la production de gaz et de H2S. Il
est réalisé en ensemençant par des stries les colonies suspectes sur le milieu de Kligler Hajna
(voir la composition en annexe 1). Les tubes ensemencés sont incubés en présence d’un tube
témoin pendant 24 h à 37°C.
La production de glucose dans le fond du tube, du lactose ainsi que la présence de bulles d’air
peut être liée à la présence d’entérobactéries.
La recherche est complétée par l’utilisation de la galerie APIE 20 E.
Test galerie API 20E
Une colonie suspecte est déposée dans 5 ml d’eau physiologique puis homogénéisé à l’aide
du vortex. La suspension est introduite dans chaque tube et cupule de la galerie puis incubé
pendant 24h d’incubation. Les réactions produites pendant cette période se traduisent par des
virages colorés spontanés ou révélés par l’ajout de réactifs.
Les résultats sont interprétés à l’aide du tableau de lecture et du catalogue analytique ou d’un
logiciel d’identification.
II.2.2. Recherche des bactéries du genre Vibrio
La recherche des bactéries du genre Vibrio est effectuée à partir du protocole provisoire de
détection de Vibrio cholerae et Vibrio parahaemolyticus dans les produits de mer (Centre
Nationale de Références des Vibrions et du choléra, Unité du choléra et des Vibrions, Institut
Pasteur, Paris Mai 2003).
Les échantillons sont ouverts et pesés sous hotte (25 g). Les pesées sont mises dans un sachet
Stomacher dans lequel on ajoute 225 ml d’eau peptonée saline alcaline (EPSA). La solution
est homogénéisée dans un appareil le Stomacher (Warring Blender 400). Les sachets sont
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incubés pendant 18-24h à 43° dans l’étuve. C’est l’étape de l’enrichissement sélectif, car
favorable aux bactéries du genre Vibrio. Avec une pipette Pasteur boutonnée, la suspension
est ensemencée sur le milieu solide TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Saccharose) et incubée
pendant 24 à 48 h (la durée d’incubation dépend de la taille des colonies) à 37°C. Sur un
milieu TCBS les Vibrio cholerae se présentent sous formes de colonies jaunes, planes de
diamètre 2-3 mm tandis que les colonies à centre verts ou bleu-vert, lisses, bombées, bords
incolores et de diamètre variant entre 2et 3 mm sont des suspectées d’être des colonies de
Vibrio parahaemolyticus.
Ainsi la lecture de nos différentes boites de Pétri nous permet de repérer des colonies
présumées être des vibrions, ces dernières sont alors isolées sur de la GN (gélose nutritive) à 2
% de NaCl. Ces nouvelles boites sont incubées pendant 18 à 24 h à 37°. Les souches pures
ainsi obtenues sont soumises au test de l’oxydase ainsi que d’autres tests d’identification. Ce
test est essentiel pour orienter l'identification des bacilles à Gram -, le réactif utilisé est le
chlorhydrate ou l'oxalate de N-diméthyl paraphénylène diamine (PDA). Ce dernier est
imprégné dans un disque appelé disque oxydase. Ainsi une bactérie ayant cette enzyme
respiratoire donnerait en présence de ce disque une coloration bleue pourpre pouvant être
violette, au bout de 30 s par une réaction d’oxydo-réduction. Si la réaction est positive, on
passe à l’observation microscopique en recherchant la morphologie (formes incurvées) et la
mobilité (organismes très mobiles) des bactéries observées.
Les observations microscopiques sont suivies d’une incubation des colonies suspectes dans
une galerie de tubes d’eau peptonée alcaline contenant des concentrations croissantes de NaCl
(0, 3, 6, 8, 10%). Pour ce faire, une colonie suspecte est prélevée et déposée dans un tube
contenant une solution de Tryptone dépourvu de sel. Le mélange est vortexé et 0,1 ml de ce
mélange est déposé dans les différents tubes de la galerie. Les tubes alors sont incubés
pendant 18 à 24 h à 37 °C.
Les résultats de la galerie sont obtenus en comparant les tubes ensemencés avec les tubes
témoins d’une part, et d’autre part avec le tableau ci-dessous servant à l’interprétation de la
galerie. S’il y’a une concordance, l’on prépare un inoculum contenant les souches suspectes
que l’on dépose dans la galerie API 20 E puis incubé à 37°C pendant 24 h pour la
confirmation. Les résultats sont obtenus en utilisant le tableau de lecture et l’identification est
obtenue à l’aide du catalogue analytique.
21
Tableau III : Interprétation de la galerie en sel
Galerie en sel INTERPRETATION
0% 3% 6% 8% 10%
+ + +/- - - Vibrio cholerae
+/-* + + +/- +/- Vibrio parahaemolyticus
+/-* + +/- - - Vibrio vulnificus
+/-* + + + +/- Vibrio alginolyticus
* Lorsqu’elle existe la croissance est faible
II.3.ANALYSE MOLECULAIRE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES :
II.3.1. Extraction de l’ADN total des échantillons
La technique utilisée est dérivée de la méthode initialement développée Porteous et al. (1997)
mais modifiée pour être applicable à nos échantillons. Elle consiste en une lyse physique au
« bead better » des cellules, suivie d’une série de précipitation et de purification de l’ADN
(annexe 3). Cette méthode d’extraction directe permet d’obtenir des échantillons d’ADN les
plus représentatifs des compositions bactériennes initiales (Holben et al., 1988 ). Elle se fait
en plusieurs étapes.
II.3.1.1. Lyse physique des cellules bactériennes
Dans des tubes eppendorf de 2 ml contenant 0,5 g de sol homogénéisé tamisé à 200µm la lyse
des cellules est effectuée par agitation pendant 2 minutes au « bead better » à une vitesse de
25 tours/s (Reatsch) en présence de billes en verre et de 1 ml de tampon de lyse (0,25M NaCl,
EDTA 0,1M pH8). Cette agitation est alternée 2 fois avec une incubation à 65°C pendant 2
minutes au bain-marie. Après une centrifugation à 13 000g pendant 15 minutes à 4°C, le
surnageant est récupéré dans des tubes eppendorf de 1,5ml.
II.3.1.2.Précipitation et purification
L’ADN contenu dans le lysat cellulaire est précipité à -20°C pendant 2 heures en ajoutant
75µl d’une solution d’acétate de potassium 5M et 250µl de PEG (Poly Ethylène Glycol) 8000
à 40 %, puis récupéré par centrifugation pendant 15 minutes à 13000g à 4°C. Le culot obtenu
22
est purifié en complexant les composés humiques avec 600 µl d’une solution de CTAB (NaCl
1,4M; EDTA 0,1M; CTAB 2%) et une incubation à 68° pendant 15 minutes au bain-marie. Le
mélange est homogénéisé par retournement manuel toutes les 2 minutes jusqu’à la dissolution
complète du culot. Un volume de 600µl de chloroforme est ajouté pour la déprotéinisation, le
mélange est agité doucement et centrifugé à 13000g pendant 10 minutes à température
ambiante. Le surnageant contenant l’ADN est récupéré dans un nouveau tube eppendorf.
L’ADN est ensuite concentré par plusieurs phases de précipitation.
Une première étape est faite par l’ajout de 600 µl d’isopropanol suivie d’une incubation à -
20°C pendant 15 minutes, et d’une centrifugation à 13000g pendant 15 minutes à 4°C. Le
surnageant est jeté et une deuxième précipitation est effectuée avec 450µl d’acétate
d’Ammonium à 2,5M et 1ml d’éthanol 95%. Le mélange est de nouveau placé à -20°C
pendant 15 minutes et centrifugé à 13000g pendant 15 minutes à 4°C. Le culot est récupéré et
lavé avec 500µl d’éthanol à 70%, séché par évaporation sous vide, suspendu entre 10 et 50µl
d’eau ultra pure en fonction de la taille du culot d’ADN et conservé à -20°C.
II.3.1.3.Quantification de l’ADN
La quantification de la concentration d’ADN dans nos extraits a été effectuée à l’aide d’une
gamme étalon (annexe1). Sur un gel d’agarose à 2%, 5µl de chaque extrait ainsi que de la
gamme ont été déposés la migration se fait pendant 60 minutes à 100 volts. Le calcul des
concentrations de nos extraits d’ADN s’est fait avec le logiciel TotalLab TL120.
L’ADN ainsi extrait a servi aux études portant sur :
La structure de la communauté bactérienne totale du sol et du mélange sol- boue de stations
d’épuration grâce à la variabilité des séquences de la région V3 de l’ADN 16S).
La structure des AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria) appartenant à la sous classes des β
Protéobactéries.
II.3.2. Etude de la structure génétique de la communauté bactérienne totale
II.3.2.1.Principe
La structure de la communauté bactérienne totale a été étudiée par la méthode de la PCR-
DGGE (Polymerase Chain Reaction – Denaturating Gradient Gel Electrophoresis).
23
II.3.2.1.1.LA PCR
La PCR (Mullis & Faloona, 1987) est l'amplification in vitro d'une séquence connue d'ADN
double-brin (ADN matrice) par extension de deux amorces grâce à une ADN polymérase, en
présence de déoxynucléotides (dNTPs) et d'ions Mg2+
. Elle permet d’obtenir, à partir d'un
échantillon d’ADN plus ou moins complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un
fragment d'ADN spécifique et de longueur définie afin d’appliquer d’autres techniques de
biologie moléculaire (DGGE, clonage et séquençage…). Il s'agit de réaliser une succession de
réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en œuvre deux
amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3’ pointent l'une vers l'autre qui définissent
alors, en la bornant, la séquence à amplifier. (Figure 8)
Figure 8: schéma montrant l’augmentation exponentielle de la quantité d'ADN cible à chaque
cycle de PCR.
II.3.2.1.2.LA DGGE
La DGGE (Denaturating Gradient Gel Electrophoresis) est une technique d’empreinte
moléculaire visant à caractériser les communautés bactériennes via le polymorphisme de leur
ADN. Elle est basée sur une séparation des produits PCR sur un gel d’acrylamide à gradient
de dénaturation formé par des concentrations croissantes d’urée et de formamide. Les
séquences amplifiées sont séparées en fonction de leur point de fusion. Ce point de fusion
dépend de leur composition en cytosine et guanine (% G+C). Les séquences vont se dénaturer
et donc s’immobiliser sur le gel à différentes hauteurs. Pour éviter une dénaturation complète
une séquence composée de guanine et de cytosine (GC clamp) est ajoutée à la position 5’
24
d’une amorce de PCR. Ainsi en amplifiant par PCR un échantillon environnemental où
plusieurs espèces différentes sont présentes et en les soumettant à la DGGE nous obtenons un
profil électrophorétique avec plusieurs bandes. Cette technique donne ainsi une idée de la
structure de la communauté bactérienne selon le nombre de bandes observées sur le gel.
Planche 9: description Schématique de la DGGE
II.3.2.2.Méthodologie de PCR-DGGE
II.3.2.2.1. Amplification de l’ADN par PCR
Toutes les amplifications sont réalisées à l’aide du thermocycleur Gene AmpR PCR system
9700 (Applied, biosystem, Courtboeuf, France).
Etude de la structure génétique de la communauté bactérienne totale
La région la plus fréquemment amplifiée est celle codant pour l’ARN ribosomal 16S. La
principale caractéristique de l’ADN codant pour l’ARNr 16S est qu’il possède des régions très
polymorphes permettant de caractériser les espèces bactériennes d’où son utilisation pour les
études phylogénétiques. Cette région existe chez toutes les bactéries et elle présente des
séquences communes pouvant être utilisées comme initiatrices de l’amplification (amorces
spécifiques). Pour l’étude de la communauté bactérienne, nous avons ainsi utilisé un couple
d’amorces bactériennes universelles ciblant la région V3 de l’ADNr 16S et ces amorces
génèrent des amplicons d’environ 200 paires de bases.
25
Amorce 338f-GC (Ovreas et al., 1997) : 5’ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG
GCG GGG GCA CGG GGG G-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3’
Amorce 518r (Muyzer et al., 1993) : 5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG- 3’
L’ADN est amplifié par une PCR « Touchdown » où la température d’hybridation diminue
de 0,5°C de 65°C jusqu’à 55°C à chaque cycle avec 0,5µM final de chacune des amorces dans
un mélange lyophilisé de Taq Ready-To-Go (Amersham-Biosciences, US) (voir annexe 3). Le
mélange réactionnel composé de 25µl, est composé de :
Les amorces à une concentration finale de 10µM
L’ADN à 1ng.
0,5µl de BSA (Bovine Serum Albumine)
TaqReady- to-go (PuRe taqTM
Ready- to-go) (voir annexe 3)
Les cycles d’amplifications sont consignés dans le tableau suivant :
Tableau IV : Cycles thermiques d’amplification par PCR « Touchdown » de la région V3 du
gène 16S de l’ADNr
Nombre de cycles température temps
Dénaturation 94° 2 min
Dénaturation
Hybridation 20 Cycles
Elongation
94°
65°
72°
30 s
30 s
1 min
Dénaturation
Hybridation 10 Cycles
Elongation
94°
55°
72°
30 s
30 s
1 min
Fin de synthèse 72° 15 min
26
Etude de la structure génétique des AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria)
L’étude de la communauté bactérienne nitritante repose sur la méthode de la « nested PCR ».
Il s’agit d’une PCR en deux étapes successives, avec deux couples d’amorces différents, le
second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon. La première PCR a pour
but d’amplifier l’ADNr 16S total des bactéries en utilisant les couples d’amorces fd1 (5’-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) et rd1 (5’-AAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)
(Weisburg et al., 1991).
Le mélange réactionnel de 25µl est composé de :
Les amorces à une concentration finale de 10 µM
L’ADN à 1 ng
0,5µl de BSA (Bovine Serum Albumine)
TaqReady- to-go (PuRe taqTM
Ready- to-go) (annexe 3)
Cette PCR génère des fragments d’environ 1500 pb, ces derniers sont utilisés comme matrice
pour une seconde amplification avec un couple d’amorces spécifiques aux AOB. Il s’agit des
amorces CTO189f-GC (5’-clamp-GGAGRAAAGYAGGGGATCG-3’) et CTO654r (5’-
CTAGCYTTGTAGTTTCAAACG-3’) décrits par Kowalchuk et al. (1997). Cette dernière
amplification génère des fragments d’environ 465 pb.
Le mélange réactionnel de 25µl est composé de :
Les amorces à une concentration finale de 10 µM
L’ADN à 0,5 ng.
TaqReady- to-go (PuRe taqTM
Ready –to-go).
Les conditions d’amplification de l’ADN total sont composées de 35 cycles précédés d’une
dénaturation à 94°C pendant 5min. Chaque cycle comporte une phase de dénaturation (1min
à 94°C), une phase d’hybridation (45s à 57°C) et une phase d’élongation (1min 30s à 72°)
(Tableau V). Puis s’ajoute une phase supplémentaire d’élongation à 72°C pendant 15 min.
Pour l’amplification avec les couples spécifiques aux AOB, les conditions sont les mêmes
que précédemment sauf pour la température d’hybridation qui est de 55°C. (Tableau VI).
27
Tableau V: les différentes étapes du cycle thermique pour l’amplification de l’ADNr 16S
des bactéries totales.
NOMBRE DE CYCLES TEMPERATURE TEMPS
Dénaturation 94° 5 min
Dénaturation
Hybridation 35 Cycles
Elongation
94°
57°
72°
1min
45 s
1 min 30s
Fin de synthèse 72° 15 min
Tableau VI : les différentes étapes du cycle thermique pour l’amplification de l’ADNr
16S des bactéries totales.
NOMBRE DE CYCLES TEMPERATURE TEMPS
Dénaturation 94° 5 min
Dénaturation
Hybridation 35 Cycles
Elongation
94°
55°
72°
1min
45 s
1 min 30s
Fin de synthèse 72° 15 min
La taille des fragments (465 pb) est contrôlée en déposant 3µl de produit PCR avec 3µl de
bleu de charge dans les puits d’un gel d’agarose à 1%. La migration se fait à 100 volts
pendant 25 min. Le gel est ensuite coloré au BET pendant 20 minutes puis rincé dans de l’eau
pendant 10 minutes et il est photographié sous la table à UV.
II.3.2.2.2.Electrophorèses en gradient de dénaturation (DGGE)
Dans cette étude, 15 µl de produits PCR sont déposés sur un gel à 8% d’acrylamide-Bis
acrylamide [40% (37.5 :1)] constitué d’un gradient dénaturant compris entre 45% et 70%
28
(voir annexe 3) à une température de 60°. La migration a été réalisée avec le systeme « Ingeny
phorU » dans un tampon TAE 1X pendant 18 heures à 100V. A la fin de la migration, le gel
est coloré au BET pendant 20 minutes sous une légère agitation puis rincé à l’eau
déminéralisée pendant 10 min. l’acquisition des profils d’ADN s’est faite à l’ordinateur à
l’aide du logiciel Bio-Capt ( Vilbert Lourmat , France) puis analysé avec le logiciel Totallab
(TL 120 v 2006).
II.4. Analyse des gels DGGE
Pour l’analyse des profils DGGE, nous avons utilisé le logiciel TotalLab (TL120, version
2006 ; Digilab, Inc USA) pour tracer les dendrogrammes de similarités en calculant le
coefficient de Dice (intervalle de confiance de 0,05%) avec la méthode de l’algorithme
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Algorithm).
29
RESULTATS &
DISCUSSION
30
III.RESULTATS
III.1.pH des sols amendés
Le tableau ci-dessous donne les différentes valeurs du pH des sols témoin et amendés avec de
la boue de d’épuration.
Tableau VII : Valeurs des ph des sols avant et après apport de la boue
Nombre de jour
d’incubation
Traitements pH
T0
Témoin sol 7,45
Sol+boue activée 7,15
Sol + boue stabilisée 6,96
T21
Témoin sol 6,84
Sol+boue activée 6,27
Sol + boue stabilisée 6,10
L’apport de la boue a modifié la valeur du pH des sols. Cette modification va dans le sens
d’une diminution qui est d’autant plus grande lorsque la boue est stabilisée. Ces valeurs sont
comprises entre 6,10 et 7,45 donc optimales pour le développement des bactéries ammonium-
oxydantes.
31
III.2.Analyse des pathogènes
Les résultats issus de l’analyse des pathogènes sont consignés dans le tableau ci-dessous :
Tableau VIII : Résultats de la recherche des pathogènes
Micro-organismes
recherchés
Nombre de jour
d’incubation
Traitement des sols OBSERVATION
SALMONELLES
&
VIBRIONS
T0
Témoin sol 0 UFC/25g
Sol+boue activée
Sol + boue stabilisée
T21 jours
Témoin sol 0 UFC/25g
Sol+boue activée
Sol + boue stabilisée
La recherche des pathogènes qui portait sur deux types de bactéries : Salmonella spp et vibrio
spp n’a pas aboutit à des UFC (unité formant colonie) sur les 45 échantillons traités.
32
III.3. STRUCTURE DE LA COMMUNAUTE BACTERIENNE TOTALE
La figure ci-dessous représente la photo du gel obtenu après électrophorèse sur gel
d’acrylamide. L’analyse du profil DGGE des échantillons montre une nette différence liée
aux différents traitements, mais aussi en fonction du temps (figure 10)
Figure 10 : Structure génétique de la communauté bactérienne totale à To j et après 21 jours
d’incubation T21jours
T0 J T21J
M A B 1 B2 B3 C1 C2 C3 A’1 A’2 A’3 B’1 B’2 B’3 C’1 C’2 C’3
1
2
3
4
6
11
7
8 9
10
5
12
13
14
15
Gradient dénaturant
45%
70%
A’1=Sol témoin 1+ boue activée 1
A’2=Sol témoin 2+ boue activée 2
A’3=Sol témoin 3+ boue activée 3
B’1=Sol témoin 1+ boue activée 1
B’2=Sol témoin 2+ boue activée 2 à T21 jours
B’3=Sol témoin 3+ boue activée 3
C’1=Sol témoin 1+ boue stabilisée 1
C’2=Sol témoin 2+ boue stabilisée 2
C’3=Sol témoin 3+ boue stabilisée 3
M= Marqueur A= Sol témoin
B1=Sol témoin 1+ boue activée 1
B2=Sol témoin 2+ boue activée 2 B3=Sol témoin 3+ boue activée 3
C1=Sol témoin 1+bouestabilisée1 C2=Sol témoin 2+ boue stabilisée 2
C3=Sol témoin 3+ boue stabilisée à T0 jour
33
Figure 11 : Dendrogramme de similarité (UPGMA) obtenus à partir du profil DGGE de
la communauté bactérienne totale des sols amendés.
Une analyse basée sur le dendrogramme de similarité montre, d’une part que l’apport de la
boue stabilisée ou activée entraîne de profondes modifications de la structure de la
communauté bactérienne et d’autre part, ces modifications varient au cours du temps. En effet
nous distinguons deux grands clusters, le premier regroupant les sols à T0, et le second, les
sols incubés pendant 21j. Ces deux clusters ont 50% de différence. Au sein de chaque cluster,
les sols témoins se distinguent nettement des sols traités, avec environ 35% de différence. De
même, la communauté bactérienne des sols traités avec la boue stabilisée forme un cluster
montrant environ 5% de différence avec les sols traités avec de la boue activée.
Ces différences sont dues à l’augmentation du nombre de bandes dans les sols traités avec de
la boue activée et stabilisée par rapport aux sols témoin. A T0 certaines bandes (2 et 13) sont
spécifiques aux sols traités avec de la boue stabilisée. De même ces nouvelles bandes sont
essentiellement situées dans la partie haute et moyenne du gel, correspondant ainsi à une
communauté à faible pourcentage en bases G+C.
34
Au bout de 21 jours d’incubation, les nouvelles bandes qui apparaissent sont cette fois ci dans
la partie basse du gel correspondant à une communauté à haut pourcentage en bases G+C
(bandes 14 et 15). Par ailleurs, certaines bandes communes (4,6, 8 et 10) au sol témoin et aux
sols traités ont leur intensité qui augmente dans les sols traités aussi bien avec de la boue
activée qu’avec la boue stabilisée. Cependant, cette intensité apparaît plus forte dans les sols
mélangés avec de la boue activée. L’intensité des bandes même témoigne d’une augmentation
de la densité de la communauté représentée par ces bandes mais qui ne peut être mesuré à ce
niveau.
III.4. Structure des communautés bactériennes nitritantes (AOB)
L’analyse du dendrogramme de similarité montre deux clusters majeurs, l’un regroupant les
échantillons de sol amendé puis incubé pendant 21jours (T21j), l’autre correspondant aux
échantillons de sol amendé et non incubé (T0j) (figure 13). Ces deux clusters présentent 25%
de différence. Au sein de chaque cluster, les sols amendés avec de la boue se différencient des
sols témoins. Cette différence est toutefois plus marquée dans les échantillons de sols
amendés avec de la boue et incubés pendant 21jours. En effet on retrouve respectivement 10%
et 15% de différence entre le sol témoin et les sols mélangés avec de la boue activée ou
stabilisée.
Ces différences sont notamment dues à l’augmentation de l’intensité des bandes au bout de
21jours d’incubation. Par ailleurs, certaines bandes disparaissent (D et E) chez les
échantillons traités avec de la boue stabilisée à T21jours. (Figure 12)
On note la particularité de la communauté A qui est présente et dominante dans tous les
échantillons de sol et sol amendé.
35
Figue 12 : Structure génétique de la communauté nitritante à To j et après 21 jours
d’incubation T21jours
Figure 13: Dendrogramme de similarité (UPGMA) obtenus à partir des profils DGGE
des AOB dans les sols amendés. (Légende voir figure 4)
A
B
D
E
C
T0 j T21j
M A B1 B2 B3 C1 C2 C3 A’1 A’2 A’3 B’1 B’2 B’3 C’1 C’2 C’3
36
IV. DISCUSSION GENERALE DES RESULTATS
IV.1.Analyses des pathogènes
Nos analyses ont montré l’absence de Salmonelles et des bactéries du genre Vibrio dans les
sols amendés avec de la boue urbaine quelque soit son état dans le processus d’épuration.
Ceci peut s’expliquer par le traitement appliqué (bassins d’aération pour la boue activée et
digesteurs pour la boue stabilisée) aux boues solides et surtout avec la boue stabilisée dont le
passage de ces PRO dans les digesteurs peuvent limiter voir éliminer ces pathogènes. Ces
résultats viennent confirmer ceux d’autres auteurs (Robert et al., 1994 ; Zaleski et al., 2005)
qui ont montré également que le nombre des pathogènes diminuait quand les sols sont
amendés avec de la boue de station d’épuration. D’après ces auteurs, l’effet du traitement subi
par la boue a une action réelle sur les pathogènes dans la mesure où les boues hygiénisées
peuvent être épandues sans innocuité car n’étant plus considéré comme des déchets car ayant
des teneurs limités de certains pathogènes tel que les salmonelles les entérovirus et les œufs
d’helminthes. Par ailleurs, certains facteurs tels que la température et le taux de dessiccation
entrainent une diminution du nombre de salmonelles et des coliformes fécaux qui sont des
indicateurs des germes pathogènes. En outre la réduction de la densité des populations
bactériennes et virales est observée dans des conditions de sol sec (Samantamaria et al.,
2003). Une autre hypothèse quant à l’absence des salmonelles et Vibrio dans nos sols
amendés peut être expliqué par leur absence dans les eaux usées brutes. Cette hypothèse
aurait pu être confirmée ou pas si les mêmes analyses avaient été faites sur les eaux usées
brutes. De telles analyses nous auraient permis de voir l’impact réel du traitement des eaux
usées par les stations d’épuration sur les pathogènes.
Enfin, nous pouvons expliquer cette absence totale par un biais de la méthodologie qui passe
par la culture in vitro. Même si ces germes sont cultivables, la culture in vitro est une
technique qui présente des limites. Ainsi durant ces dernières années de nouvelles méthodes
de détection des salmonelles dans les échantillons environnementaux ont été mis au point
pour mieux affiner les recherches (CEAEQ, 2007).
Nous émettons cependant des réserves sur nos résultats. En effet, la non détection des ces
micro-organismes pathogènes dans les boues ne signifie pas une absence totale des
pathogènes car selon Sahlstrom et al (2004) les salmonelles sont fréquemment isolés dans les
boues brutes et les boues traitées et sont présentes dans les boues digérées en nombre
relativement faible.
37
IV.2. Effet de l’amendement et de l’incubation sur la diversité bactérienne.
IV.2. 1.Structure génétique de la communauté bactérienne totale
L’apport de boue stabilisée ou activée dans le sol a entraîné des changements au niveau de la
structure des communautés bactériennes, au bout de 21 jours tant au niveau de la diversité
bactérienne (richesse spécifique) que de la densité des communautés. Ces modifications
observées peuvent s’expliquer par la qualité de la matière apportée. En effet, plusieurs auteurs
ont montré que l’apport de produits résiduaires organiques induit tout d’abord une croissance
de la population des micro-organismes dont l’intensité et la durée dépendent de la nature du
substrat (Houot et al., 1998 ; Jedidi et al., 2004). La transformation de la matière organique
fait intervenir de manière temporelle un ensemble de micro-organismes. Lerch et al (1992)
montrent que dans les premières semaines, ce sont les sources de carbone telles que le
glucose, les acides aminés qui sont préférentiellement utilisées, puis le substrat prédominant
devient les protéines, ce que confirme également (Hattori et Mukaï, 1986).
Le pH peut aussi être un facteur qui a influencé la structure des communautés bactériennes
comme l’ont montré Enwall et al (2007). Cependant dans notre étude l’application des boues
à To comme à T21jours n’ont pas entraîné des variations significatives du pH et donc ce
paramètre n’a certainement pas eu une grande influence.
Nos résultats ont également montré, qu’au bout de 21 jours d’incubation, le degré de
modification de la communauté bactérienne était plus important en présence de boue
stabilisée par rapport à la boue activée, respectivement 30% et 25% de différence avec le sol
témoin. Ceci peut s’expliquer par la nature de la matière organique apportée, la boue activée
étant beaucoup plus riche en matière organique dégradable que la boue stabilisée.
Les deux bandes (14 et 15) situées à environ 60% du gradient de dénaturant pourraient être
des actinomycètes bactéries ayant un pourcentage élevé en G+C (Crawford et al., 1988 ;
MacCarthy 1987). La plupart d'entre elles se trouvent dans le sol et sont actifs dans la
décomposition des matières organiques matériaux dans le sol, y compris la lignine et d'autres
polymères récalcitrants, et peuvent dégrader les déchets agricoles et urbains (Crawford et
al.,1988 ; MacCarthy 1987). Cependant des apports répétés de boues peuvent entraîner une
augmentation de la biomasse microbienne des sols (abondance), mais il semblerait que cela
diminue la diversité fonctionnelle des populations (Anaya et al., 1999 ; Banerjee et al., 1997).
De telles modifications à court terme dans la composition des communautés bactériennes ne
38
sont pas observées par Crecchio et al (2001) dans les sols fertilisés avec des déchets urbains
compostés.
IV.4.Structure des communautés bactériennes nitritantes (AOB)
Nos résultats ont montré que le traitement n’a pas eu un grand impact sur la communauté
bactérienne nitrosante (AOB). En effet, les communautés bactériennes des sols à T0 et à T21
présentent plus de 80% de similitude. Ces résultats peuvent s’expliquer par la durée
d’incubation de nos sols. En effet, les AOB sont connus pour leur croissance lente, une
incubation plus longue peut être nécessaire pour observer des changements de structure de ces
communautés. Nos résultats sont ainsi en phase avec ceux de Avrahami et al (2003) qui ont
pu montrer qu’une incubation relativement courte d’un échantillon de sol à des concentrations
différentes en ammonium n’a pas influencé la structure des AOB. Des résultats similaires ont
également été obtenus par Mendum et al (1999) en étudiant la structure des AOB dans un sol
fertilisé et un sol non fertilisé sur une période de 6 semaines. De même Le Roux et al (2007)
n’ont observé des changements dans la structure génétique de cette communauté qu’au bout
de 5 mois suite à l’application de la technique du pâturage dans une prairie. Ce qui corrobore
nos résultats par rapport à la durée de l’incubation. Par contre, une étude à long terme réalisée
par Chu et al (2007) a démontré que la fertilisation azotée augmente le nombre de bandes
des profils DGGE, indiquant une diversité accrue de la communauté des AOB à
l’amendement azotée. La température d’incubation (30°C) n’a pas affecté la structure de cette
communauté. En effet Malchair et al (2009) ont montré qu’après 4 à 16 mois
d’expérimentation que l’augmentation de 3°C par rapport à la température ambiante n’a
entrainé aucun changement dans composition génétique de cette communauté bactérienne.
Nos analyses DGGE ont aussi montré une bande très intense présente dans tous nos
échantillons (bande A). Ceci a été obtenue également par Diallo et al (2005) avec cependant
une diminution de sont intensité après 140 jours d’incubation, confirmant par ailleurs l’effet
de la durée d’incubation sur la structure de ces communautés nitrosantes. La bande intense
pourrait être attribué à une communauté de bactérie appartenant aux bactéries du genre
Nitrosospira car étant le plus représenté dans le sol en général (Kowalchuk et al., 1997;
Kowalchuk et al., 1998; Stephen et al.,1998 ; Bruns et al.,1999 ;Mendum et al.,1999 ;
Kowalchuk et al., 2000 ; Hastings et al., 2000; Philips et al.,2000), et les sols acides en
particulier (Stephen et al., 1998 ; Laverman et al 2000) qui sont favorables au développement
39
de la souche nitrosospira. Un séquençage nous permettra de dire avec certitude les espèces qui
constituent cette communauté.
Une limite de nos analyses est constituée par l’aptitude des amorces CTO (CTO189f-GC et
CTO 654r). Elles ont été décrites par Kowalchuk et al (1997) et utilisées pour cibler les AOB
mais ont été remises en cause par les études de Cébron et al (2004) montrant leur faible
sensibilité spécificité. Ces auteurs sont plus favorables à l’utilisation des amorces qui ciblent
le gène amoA codant pour la sous-unité alpha de l’ammonium mono-oxygénase (AMO) qui
est l’enzyme clé de toutes les bactéries ammonium oxydantes aérobies (Stephen et al., 1999).
Toutefois, en comparant les amorces CTO et amoA, Nicolaisen et Ramsing (2002) n’ont
trouvé aucune différence significative entre ces deux types d’amorces.
Bien qu’elle soit adaptée à l’étude la structure des communautés bactériennes la technique de
la PCR-DGGE présente toutefois des limites telle que la taille des séquences à étudier
(Muyzer et al., 1996) elle ne tient pas compte des fragments supérieurs à plus 800 pb. Certains
auteurs estiment qu’ils existent un seuil de détection de l’espèce par rapport à l’abondance
totale de l’échantillon considéré dont la valeur de la densité de la population varie de 0,4 à 1,6
% (Muyzer et al.,1993 ; Casamayor et al., 2000).
40
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
L’ensemble des études que nous avons eu à mener dans le cadre de ce travail nous ont permis
de comparer la structure des communautés bactériennes totales, la structure des bactéries
ammonium-oxydantes (AOB), d’une part et d’autre part d’évaluer la présence de micro-
organismes pathogènes dans un sol amendé avec de la boue de station d’épuration . Il ressort
de ces expériences la forte sensibilité des micro-organismes et en particulier les bactéries à la
boue de stations d’épuration notamment la boue activée où l’on n’a noté une grande richesse
spécifique en termes de nombre de bande DGGE. Les résultats de l’analyse microbiologique
n’ont pas indiqué de présence de salmonelles ou de vibrions. Il apparaît donc que ce produit
résiduaire organique présente une certaine innocuité vis-à-vis de ces pathogènes et pourrait
être autorisé à une exploitation agricole.
A l’issue de cette étude plusieurs perspectives peuvent être envisageable notamment le
séquençage de la bande 4 de la communauté totale et la bande dominante (bande A) des
communautés nitrosantes. Il est également important de prolonger la durée de l’incubation à
plus ou moins long terme pour suivre l’évolution de la diversité des communautés
microbiennes. La nécessité de compléter l’étude sur les pathogènes par la recherche des
entérovirus et des œufs d’helminthes qui sont avec les salmonelles les indicateurs de la qualité
du traitement des boues dans la réduction des pathogènes et donc leur épandage sans
innocuité pour la santé publique et l’environnement.
41
Résumé : L’objectif de ce travail était d’évaluer l’influence de l’apport dans les sols de la
boue activée et stabilisée provenant de stations d’épuration des eaux usées sur la structure
génétique de la communauté bactérienne totale et nitrifiante (AOB), ainsi que sur la viabilité
des pathogènes de l’homme (Salmonelles et vibions). Des mélanges de sol prélevés dans la
zone des Niayes et de boues ont été incubés in vitro pendant 21 jours à 30°C. Les analyses
microbiologiques ont été effectuées à T0 T7 T14 T21 et T28 jours par la méthode présence
absence. Les analyses moléculaires ont été faites par la technique de la PCR-DGGE à T0 et à
21 jours d’incubation. Les résultats obtenus montrent une absence totale de bactéries
pathogènes recherchée (Salmonella spp et Vibrio spp) dans les échantillons de sols témoins et
amendés (0 UFC/25g) quelque soit la durée d’incubation. L’apport de la boue a entraîné une
modification de la structure génétique de la communauté bactérienne totale avec une
augmentation relative de la diversité dans les sols en présence de boue stabilisée ;
l’introduction de boue activée en revanche augmenterait la densité de certaines communautés
bactériennes. Concernant les bactéries nitrifiantes, l’effet de l’apport de boues est nettement
moins marqué ; la vitesse de croissance assez lente des AOB et la durée d’incubation trop
courte pourrait l’expliquer.
Mot clés : Diversité bactérienne, Boue activée, Boue stabilisée, PCR-DGGE, AOB,
Pathogènes, Niayes.
Abstract: The aim of this study was to assess the effect of the amendment on soils of
activated or stabilized biosolids on the genetic structure of the total and ammonium oxidizing
(AOB) bacterial community, and also on the viability of human pathogens as Salmonella or
vibions. Mixtures of soil from the Niayes fields and sludges collected in wastewater treatment
plants at Pikine and Cambérène were incubated for 21 days at 30 ° C. Microbial analysis were
performed at T0 T7 T14 T21 and T28 days by the presence absence method. Molecular
analyses were performed at T0 and 21 days of incubation by the PCR-DGGE technique. The
results showed the absence of pathogenic bacteria (Salmonella spp and Vibrio spp) whatever
the time of incubation or the sludge supply. The total bacterial community structure changed
when mud was supply. The diversity was greater in soils amended with stabilized sludge;
however, the activated sludge seemed to increase the density of some bacteria species. No
change was noticed on the AOB structure that would be due to the relative slow growth rate
of this bacteria and the insufficient short time of incubation to reveal an impact on AOB
communities structure. Keywords: Microbial diversity, Activated and stabilized sludge,
PCR-DGGE, AOB, soil pathogens, Niayes.
42
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I
Annexe1 : Composition des solutions
Le bouillon Rappaport Vassiliadis
Composition chimique en g/l
Peptone de Soja : 4,5
Chlorure de sodium : 7,200
Chlorure de magnésium : 13,58
Vert malachite : 0,036
Phosphate mono potassique : 1,260
Phosphate di potassique : 0,180
pH final : 5,2 ± 2
Préparation
Dissoudre 26,8d de poudre dans 1 l d’eau distillée ou d’eau physiologique. Faire bouillir si
nécessaire pour la dissolution. Repartir dans les tubes et stériliser à l’autoclave à 121° pendant
15mn.
Kli-Gler Hajna
Protéose peptone 20,0
Chlorure de sodium 5,0
Extrait de levure 3,0
Sulfate de fer 0,2
Thiosulfate de sodium 0,3
Lactose 10,0
Glucose 1,0
Rouge phénol 0,024
Agar 11,0
pH final 7,4± 0,2 à 25°
Preparation
Suspendre 53,5g dans 1l d’eau distillée. Chauffer jusqu’à dissolution complète répartir dans
les tubes et stériliser à l’autoclave à 121° pendant 15 mn
Bouillon Muller Kauffman
Composition chimique en g/l
Sels biliaires 4,78
II
Extrait de viande 4,30
Peptone de caséine 8,60
Chlorure de sodium 2,60
Carbonate de calcium 38,7
Sulfate de sodium anhydre 30,5 (*1)
pH final 8,0 ± 0,2 à 25°
(*1) Équivaut à 47,80 g/l de thiosulfate de sodium
Préparation
Dissoudre 22,4g dans 250 ml d’eau distillée stérilisée
Ajouter dans chaque tube :
20 ml de bouillon MKTTn
5g d’iodure de potassium
4g d’iode
10 ml de supplément sélectif au vert brillant et Novobiocine.
TCBS gélose
Composition chimique en g/l
Extrait de levure 5,0
Peptone 10,0
Citrate de sodium 10,0
Thiosulfate de sodium 10,0
Oxgall 8,0
Sucrose 20,0
Chlorure de sodium 10,0
Citrate de fer 1,0
Bleu de Thymol 0,04
Bleu de Bromothymol 0,04
Agar 15,0
pH final 8,4 ± 0,2 à 25°
Préparation
Suspendre 89,1g dans 1l d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète.
Ne pas autoclaver
Gélose HEKTOEN
III
Composition chimique en g/l
Protéose peptone 12,0
Lactose 12,0
Extrait de levure 3,0
Sels biliaires 9,0
Saccharose 12,0
Chlorure de sodium 5,0
Salicine 2,0
Thiosulfate de sodium 5,0
Citrate d’ammonium ferrique 1,5
Fuchsine acide 0,1
Bleu de Bromothymol 0,065
Agar 14
pH final 7,5 ± 0,2 à 25°
Préparation
Suspendre 75,5 g dans 1l d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète.
Ne pas autoclaver
GELOSE NUTRITIVE
Composition chimique en g/l :
Peptone 5,0
Extrait de viande 3,0
Agar 15,0
pH final 7,0 ± 0,2
Préparation :
Suspendre 23g dans 1l d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète,
stériliser à l’autoclave pendant 15 mn à 121°.
IV
Eau Peptonée Tamponnée
Composition chimique en g/l :
Tryptone 10,0
Chlorure de sodium 5,0
Phosphate disodique anhydre 3,5
Dihydrogénophasphate de potassium 1,5
pH final 7,0 ± 0,2 à 25°
Préparation
Suspendre 20,2 g dans 1l d’eau distillée. Chauffer jusqu’à dissolution totale. Repartir la
solution dans les tubes et stériliser à l’autoclave à 121° pendant 15 mn.
ANNEXE 2
Préparation des solutions d’extraction d’ADN
Tampon de lyse: 0.25M NaCl ; 0.1 M EDTA ; pH 8
Peser 1.461 g de NaCl (MM= 58.44) et ajouter 20 ml d’EDTA à pH 8 (ou peser 3.722g
d’EDTA et ajuster le pH à 8).
CTAB 2% Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide: 1.4M NaCl; 0.1 M EDTA ; 2% CTAB
Peser 8.18g de NaCl et 3.722 g d’EDTA, faire dissoudre dans de l’eau distillée.
Compléter à 100 ml avec de l’eau distillée. Filtrer à 0,2 µm. Ajouter 2g de CTAB. Autoclaver
Conserver à la température ambiante.
PEG 8000 à 40%
Peser 10 g de PEG (PolyEthylne Glycol). Ajouter environ 10 ml d’eau progressivement car le
volume augmente quand le CTAB se dissout. Compléter à 25 ml. Conserver à 4°C.
Acétate de potassium 5M :
Peser 49.07g de KAc (MM =98.14); faire dissoudre dans de l’eau distillée. Compléter à 100
ml. Filtrer à 0,2 µm. Conserver à 4°C.
Acétate d’ammonium 2,5M :
Peser 19.27g de NH4 Ac (MM=77.08), faire dissoudre dans de l’eau distillée. Compléter à
100 ml. Filtrer à 0.2 µm. Conserver à 4°C.
TE (Tris-EDTA) 1X :
Tris-HCl 10 M
V
EDTA 1 mM
Ajuster le pH à 8,5
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetique acide.
Autres solutions
Bleu de charge 10 X
Bleu de bromophénol 0,25% (p/v)
Glycérol 30%
EDTA 10 mM
H2O qsp
A utiliser au 1/10ème
Tampon TBE (Tris-borate) 10X
Tris-base 121 g
Na2EDTA, H2O 18,51 g
Acide borique 55g
H2O qsp 1 litre
Filter, stériliser à l’autoclave
BET (Bromure d’éthidium): Solution à 1 mg.l-1
Tampon TAE 50X
Tris-base 242.2g
Na2EDTA (pH8) 18.51g
Acide acétique glacial 57.1 ml
H2O qsp 1 litre
VI
Solutions pour gel 8% d’acrylamide/Bis-acrylamide 40%
ANNEXE 3: Procédure d’Extraction d’ADN
L’extraction de l’ADN total du sol est réalisée sur un échantillon d sol broyé et séché.
Lyse physique : 0,5g de sol est mis en présence de billes de zirconium stériles (0,1
mm) et 1 ml de tampon de lyse (NaCl 0,25 M et EDTA 0,1 M, pH8) filtré et stérilisé. On
alterne 2 fois 2 minutes de lyse physique à l’aide de l’agitateur beadbetter (25 tours/sec) et 2
minutes d’incubation au bain-marie à 65°C. L’échantillon est ensuite centrifugé 15 min à
13000 g à 4°C et l’on récupère le surnageant.
Précipitation: L’ADN est précipité avec l’acétate de potassium 5 M (75 µl) auquel on
ajoute 250 µl de PEG 8000 à 40%, qui permet d’alourdir l’ADN (les volumes indiqués sont
pour 600 µl de surnageant), pendant au moins 1 h à –20°C. L’échantillon est ensuite
centrifugé 15 minutes à 4°C à 13000 g.
Purification CTAB: On jette le surnageant et l’on ajoute au culot 600 µl de CTAB 2%
(1,4 M NaCl ;0,1 M EDTA; 2% CTAB). On laisse incuber à 65°C en mélangeant toutes les
deux (2) minutes jusqu’à ce que le culot soit entièrement dissout. Le CTAB fait précipiter les
polysaccharides.
Extraction: On ajoute 600 µl de chloroforme, après agitation du mélange, on sépare
les phases par centrifugation à 13 000g pendant 10 minutes et à température ambiante. Ainsi
on distingue une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucléiques en solution, une
phase organique au fond du tube et à l’interface un “gâteau” de protéines précipitées. On
recueille la phase aqueuse.
Précipitation: L’ADN est précipité par 600 µl d’isopropanol : on mélange et on laisse
incuber 15 min à -20°C. L’échantillon et ensuite centrifugé 15 min à 13 000g.
Réactifs Dénaturants
Dradients 45% 70%
acrylamide/bis 40% 20 ml 20 ml
TAE 50 X (ml) 2 ml 2 ml
Formamide (ml) 18 ml 18 ml
Urée (g) 18,9 g 29,4 g
Glycérol 2% 2 %
Qsp H2O 100 ml
VII
Pré-purification: On jette le surnageant, le culot est remis en suspension par 450 µl
d’acétate d’ammonium (2,5M), et on ajoute 1 ml d’éthanol absolue. On laisse précipiter à 15
min à –20°C puis on centrifuge (15 min à 13 000g).
Lavage: On ajoute 0,5 ml d’éthanol 70°C et l’on centrifuge à nouveau à 13 000g
pendant 5 min. On jette le surnageant et on évapore le culot sous vide.
Récupération de l’ADN: L’ADN extrait est resuspendu dans un volume variant entre
10 et 50 µl de tampon TE 1X suivant la taille du culot d’ADN. L’ADN est enfin conservé à –
20°C avant toute utilisation
Quantification de l’ADN.
Il s’agit de connaître la concentration en ADN dans chaque échantillon, afin de
déterminer la même quantité à apporter pour l’amplification par PCR.
Sur un gel d’agarose 2% on fait migrer 5 µl d’échantillon mélangés avec 3 µl de bleu de
charge ainsi 10 µl de chacun des gammes-étalons. Les gammes-étalons sont des ADN dont les
concentrations sont connues:
G1 : 6,25 ng d’ADN dans 10 µl
G2 : 12,5 ng d’ADN dans 10 µl
G3 : 25 ng d’ADN dans 10 µl
G4 : 50 ng d’ADN dans 10 µl
G5 : 100 ng d’ADN dans 10 µl
G6 : 200 ng d’ADN dans 10 µl
Aprés coloration au bromure d’éthidium (BET 1µg/ml), la concentration en ADN de nos
extraits est ensuite déterminée grâce au logiciel TotalLab.
Composition de la Taq ready-to-go pour un volume final de 25 µl
Taq DNA polymérase 2,5U
VIII
DNTP 200 µM
Tris-HCl 10 mM, pH 9
KCl 50 mM
MgCl2 1.5 mM
BSA
ANNEXE 4 : PREPARATION DGGE
Préparation du gel
- Mesurer 30 ml de « low » à l’éprouvette et le verser dans le tube Falcon « low »
- Mesurer 30 ml de « high » avec la même éprouvette et le verser dans le tube Falcon « high »
Mettre 500 μl de Bleu dans le « high » (c’est le low qui vient diluer le high)
- Mettre 60 μl de TEMED dans chaque tube
- Vérifier que le robinet de la pompe à gradient est fermé
- Mettre 120 μl d’APS dans le « low » (la polymérisation commence) et verser dans le
compartiment de gauche
- Ouvrir légèrement le robinet pour faire partir la bulle créée suite au versement du low
- Mettre 120 μl d’APS dans le « high » et verser dans le compartiment de droite
- Allumer la pompe et attendre que le ménisque du high soit légèrement sous celui du low
puis lentement ouvrir le robinet de communication
Coulage du gel
Le coulage du gel se fait à l’aide d’une aiguille de seringue fixée au bout d’un tuyau
- Laisser couler quelques gouttes, arrêter la pompe, placer l’aiguille au milieu entre les 2
plaques et remettre la pompe en marche.
- Surveiller pendant que le gradient se forme (durée ± 10 min) pour prévenir les éventuelle
fuites.
- Rincer les 2 tubes Falcon, laisser les autres solutions à portée de main dans la glace au cas
où il y aurait un problème.
- Une fois le gel coulé, chasser les bulles d’air en le soulevant puis en replaçant tout
doucement le peigne.
IX
- Laisser polymériser 1 heure
- Rincer la pompe abondamment et la démonter.
Préparation des échantillons à déposer
- Sortir les produits PCR (stockés à -20°C)
- Ajouter le bleu de charge spécial DGGE aux échantillons (15 μl pour 25 μl), afin de les
alourdir et de visualiser le front de migration.
- Conserver à 4°C avant de déposer.
Préparation de l’appareillage
- Desserrer les vis de l’appareil.
- Pousser fort l’espaceur vers le bas pour libérer l’espace et laisser passer le tampon qui devra
être en contact avec le gel.
- Resserrer doucement les vis sans écraser le gel
- Placer le support dans la cuve en l’inclinant pour chasser les bulles d’air sous le gel
- Placer l’électrode rouge à droite, la noire à gauche, mettre le bouton sur jaune « Low Voltage »
- Fixer le tuyau en silicone à la cuve
- Mettre le bouton rond de la pompe (sur le côté) sur la position « ouvert », attendre que la
cuve se remplisse et le remettre sur « fermé »
- Vérifier que le niveau de tampon est à « INGENY phorU2 »
- Retirer le peigne tout doucement
- Rincer les puits avec la pipette (P 100) afin d’éliminer les traces d’acrylamide (2 à 3fois)
- Remettre les puits droits avec le cône de la pipette.
Dépôt des échantillons
- Centrer les échantillons au milieu du gel pour éviter au maximum les effets de bord,
mélanger chaque échantillon avant de le déposer délicatement
- Déposer marqueurs de chaque côté et bleu de charge dans les puits des extrémités
- Placer le couvercle de la cuve, brancher les électrodes au générateur (position 3), mettre
«meter selector » sur 3 et le bouton vert 3 sur 100 Volts.
X
- Mettre le boulon sur rouge « High voltage HV »
- Au bout de 10 à 15 minutes, mettre la pompe en route.
Migration
18 heures à 100 Volts, température du TAE (1 X) 60°C.
Récupération du gel
- Éteindre l’appareil, le générateur, débrancher les électrodes et le tuyau en silicone
- Sortir l’appareil en le vidant
- Dévisser et sortir les plaques en soulevant par l’espaceur, les placer dans le bac BET rempli d’eau
- Enlever la petite plaque, puis l’espaceur
- Couper le côté du gel où l’on a commencé à déposer (en haut à droite)
- Faire des mouvements de vague pour détacher le gel, puis enlever la grande plaque
Coloration
- Placer très délicatement le gel dans un bac contenant du SYBR GREEN (1/20).
- Laisser colorer 30 minutes sous agitation
- Sortir le gel, le mettre dans l’eau et laisser sous agitation pendant 10 min
Prise de la photo du gel
- Sortir le gel et le placer sous la lampe UV
- Ouvrir le Logiciel BIOCAPT
- Mettre au point, cliquer sur « temps d’intégration » puis sur « arrêt acquisition » pour
prendre la photo, annoter la photo, enregistrer et imprimer.
