Analyse de l'acrylamide par UPLC-MS/MS

DETERMINATION QUANTITATIVE DE LA TENEUR EN ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC-MS/MS

LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 1/15

Agence fédérale

pour la Sécurité

de la Chaîne alimentaire

Laboratoire de Liège

MET-LFSAL- 139

DETERMINATION QUANTITATIVE DE LA TENEUR EN ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC-

MS/MS

Version 02

Date d’application 2013-12-02

Rédaction par : Marie-Christine Offermanne (Expert technique)

Vérification par : Marianne Aubry (Quality Manager)

Autorisation de publication par : Fabian Etienne-Thewissen (Chef de section)

Gestion et localisation de la

version valide :

LFSAL : disque local M:\Qualité\ Méthode\LAB 23 I-MET LFSAL -139.doc

Destinataires : Membres du personnel de la section Phyto-Résidus.

Mots clefs : Acrylamide – UPLC-MS/MS – chromatographie



Aperçu des modifications

Révision

par/date*

Motif de la révision Partie du texte/portée de la révision

Offermanne

Marie-Christine

15/06/2013

Première version

Etienne-

Thewissen

Fabian

21/11/2013

Adaptation suite à l’audit

LFSAL 30-2013

Points : 2-5-8-10-11

* L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.



1 OBJECTIF .......................................................................................................................... 4

2 CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4

3 DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 5

4 DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................... 5

5 PRINCIPE ........................................................................................................................... 5

6 INDICATEURS DE PRESTATION ..................................................................................... 6

7 CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUE ............................................. 6

8 REACTIFS ET SOLUTIONS .............................................................................................. 6

8.1 RÉACTIFS ....................................................................................................................... 6 8.2 SOLUTIONS ..................................................................................................................... 7

9 EQUIPEMENTS ................................................................................................................. 8

10 METHODE .......................................................................................................................... 8

10.1 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS INCONNUS .............................................................. 8 10.2 PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON DOPÉ ....................................................................... 9 10.3 PRÉPARATION D’UN BLANC MÉTHODE .......................................................................... 9 10.4 PRÉPARATION D’UN ÉCHANTILLON DE CONTRÔLE ........................................................ 10 10.5 CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES ........................................................................ 10 10.6 SÉQUENCE D’INJECTION DES SOLUTIONS ................................................................... 11

11 CONTRÔLE DE LA QUALITÉ ......................................................................................... 11

11.1 CONTRÔLES DE PREMIÈRE LIGNE ............................................................................... 11 11.2 CONTRÔLES DE DEUXIÈME ET TROISIÈME LIGNE ......................................................... 12

12 CALCUL ET RAPPORTAGE ........................................................................................... 12

13 RÉFÉRENCES AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFÉRENTS .................................................................................................... 12

13.1 PROCÉDURES ........................................................................................................... 12 13.2 FORMULAIRES .......................................................................................................... 13 13.3 LISTES ..................................................................................................................... 13

14 ANNEXES ........................................................................................................................ 14



1 Objectif

La méthode décrit les procédures d'extraction, de purification et d'analyse de l'acrylamide

dans divers aliments : pain, frites, céréales et dérivés, café et épices et aliments pour bébés.

L'acrylamide est le nom usuel du 2-propénamide (amide acrylique) de formule brute

C3H5NO.

L’acrylamide peut se former notamment lors de la cuisson (friture, rôtissage..) à haute

température d’aliments riches en hydrate de carbone (amidon, sucres) et en protéines.

La formation de l'acrylamide semble fortement influencée par la température de cuisson, la

teneur en eau des aliments, ainsi que le « brunissage » (carbonisation) des produits.

Les aliments les plus concernés seraient d'abord les produits à base de céréales et de

pomme de terre (tels que les chips ou les frites), les pains et pâtisseries et généralement tous

les produits soumis à des températures élevées comme le café ou les amandes grillées. On

sait depuis quelques années que de l'acrylamide apparaît « spontanément » lors de la

cuisson de certains aliments à plus de 120 °C.

2 Champ d’application

La méthode permet de quantifier l’acrylamide à des concentrations supérieures à 30 µg/kg

par UPLC-MS dans les matrices suivantes :

- Matrices sèches : biscuits, biscottes, café, pain, aliments pour bébés,…

- Matrices grasses : frites précuites, chips,…

La méthode permet de quantifier l’acrylamide à des concentrations supérieures à 30 µg/kg

(transition ion/ion la plus intense) pour le pain et les aliments pour nourrissons et enfants en

bas âge, et supérieures à 50 µg/kg pour les produits à base de pommes de terre, les autres

produits à base de céréales, le café et les autres produits par UPLC-MS dans les matrices

suivantes :

Acrylamide

http://fr.wikipedia.org/wiki/Amide

http://fr.wikipedia.org/wiki/Hydrate_de_carbone

http://fr.wikipedia.org/wiki/Amidon

http://fr.wikipedia.org/wiki/Sucre

http://fr.wikipedia.org/wiki/Prot%C3%A9ine

http://fr.wikipedia.org/wiki/Temp%C3%A9rature

http://fr.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9r%C3%A9ale

http://fr.wikipedia.org/wiki/Pomme_de_terre

http://fr.wikipedia.org/wiki/Caf%C3%A9

http://fr.wikipedia.org/wiki/Amande



- Matrices sèches : biscuits, biscottes, café, pain, aliments pour bébés,…

- Matrices grasses : frites précuites, chips,…

3 Documents légaux et normatifs

- Recommandation de la commission du 2 juin 2010 concernant la surveillance des

niveaux d'acrylamide dans les aliments (210 2010/307/UE)

- Recommandation de la commission des 10.1.2011 sur les niveaux d'acrylamide

dans les études alimentaires

4 Définitions et abréviations

S/N : Signal to Noise

MRM : Multiple Reaction Monitoring

UPLC : Ultra-high Performance Liquid Chromatography

MS : Mass Spectrometry

ES+ : electrospray positif

ml : millilitre

IP : ion précurseur

IQ : ion de quantification

IC : ion de confirmation

EC : énergie de collision

eV : électronvolt

SPE : solid phase extraction

SI : standard interne

Tpm : tours par minutes

ACN : acétonitrile

EtOH : éthanol

HAc : acide acétique

MeOH : méthanol

H2O : eau

5 Principe

Les échantillons sont préalablement homogénéisés. Suivent alors une extraction et une

purification, puis détection, identification et quantification à l’aide d’un UPLC-MS/MS en mode

MRM. La quantification est réalisée par étalonnage externe.



6 Indicateurs de prestation (données de validation de la méthode)

Répétabilité-Reproductibilié intra-laboratoire : Matrice sèche :

Concentration (µg/kg)

n x p Répétabilité : 2,8 x Sj(r) (µg/kg)

Reproductibilité : 2,8 x Sj(FI) (µg/kg)

CVr

(%)

CVr Max (%) – 2/3 CVHor

CVR (%)

CVR Max (%) – CVHor

82.3 3 x 6 6,4 17,5 2,7 15,5 8,1 23,3

Matrice grasse :

Concentration (µg/kg)

n x p Répétabilité : 2,8 x Sj(r) (µg/kg)

Reproductibilité : 2,8 x Sj(FI) (µg/kg)

CVr

(%)

CVr Max (%) – 2/3 CVHor

CVR (%)

CVR Max (%) – CVHor

296.0 3 x 6 18,9 57,7 2.2 12.8 7.3 19. 2

Incertitude de mesure

Matière sèche Matière grasse

19% 18%

7 Consignes de sécurité et mesures spécifique

Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et

dans le log book de l'appareil.

Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte.

L’influence de la lumière (du jour ou artificielle) n’est pas connue. Éviter d’y exposer

inutilement les réactifs et les solutions.

8 Réactifs et solutions

Réactifs : les standards analytiques et les solutions sont conservés selon les conditions reprises sur les certificats. Les solvants sont conservés à température ambiante.



8.1

Eau de qualité UPLC

Ethanol

Méthanol de qualité UPLC

Méthanol de qualité HPLC

Dichlorométhane

Acide Acétique

Acrylamide

Acrylamide-d3 (standard interne)

8.2 Solutions

8.2.1 Solutions d’Acrylamide

8.2.1.1 Solution stock (SS) d’Acrylamide à 1 mg/ml : 20 mg/ 20 ml d’éthanol

8.2.1.2 Solution fille A (SFA) d’Acrylamide à 5µg/ml : 100 µl SS/ 20 ml d’eau

8.2.1.3 Solution fille B (SFB) d’Acrylamide à 0,5 µg/ml : 1000 µl SFA/ 10 ml d’eau

8.2.1.4 Solution fille C (SFC) d’Acrylamide à 0,05 µg/ml : 100 µl SFA/ 10 ml d’eau

8.2.2 Solutions de Standard Interne (Acrylamide-d3)

8.2.2.1 Solution stock (SIS) d’Acrylamide-d3 à 1 mg/ml : 10 mg/ 10 ml d’éthanol

8.2.2.2 Solution fille A (SIA)d’Acrylamide-d3 à 10µg/ml : 100 µl SIS/ 10 ml d’eau

8.2.2.3 Solution fille B (SIB)d’Acrylamide-d3 à 0,5µg/ml : 1000 µl SIA/ 20 ml d’eau

8.2.3 Solutions d’étalonnage L1 à L5 6:

Niveau de calibration

Solution d’Acrylamide

(µl)

Solution d’Acrylamide-

d3 (µl)

Eau de qualité UPLC

(µl)

Concentration finale (ng/ml)

1 200 SFC 500 SIB 300 10

2 60 SFB 500 SIB 440 30

3 200 SFB 500 SIB 300 100

4 70 SFA 500 SIB 430 350

5 200 SFA 500 SIB 300 1000

6 300 SFA 500 SIB 200 1500

8.2.4. Solution d’acide acétique 0,1%



- pipeter 500 µl d’acide acétique dans une fiole jaugée de 500 ml

- amener au volume avec de l’eau pour LC-MS et homogénéiser.

9 Equipements

Tubes Falcon de 50 ml

Moulinette-mixer

Balance analytique

Trébuchet

Bain à ultrasons

Agitateur orbital

Centrifugeuse (5000 t/min)

Micropipettes et tips

Seringues et filtres acrodisk de 0,2µm

Tubes à essai en pyrex

Système sous-vide pour cartouches SPE

Vials

Cartouches SPE HLB Oasis 200 mg, 6 ml

Cartouches SPE Bond Elut- Accucat 200mg, 3 ml

Chaîne UPLC-MS équipée d’un détecteur de masse de type triple quadrupôle, d’une

colonne analytique permettant une résolution correcte de l’acrylamide. La colonne

Synergi 2.5µm Hydro-RP 100A 100x2,0mm est donnée à titre d’exemple.

10 Méthode

10.1 Préparation des échantillons inconnus

10.1.1 Préparation et extraction

Broyer et homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un mixer.

Dans un falcon de 50 ml, peser au trébuchet environ 1 g d’échantillon homogénéisé (0,5g

pour la matrice café), avec une précision de 0,01g.

Ajouter 500 µl de la solution SIB de standard interne.

Compléter le volume à 15 ml avec de l’eau de qualité UPLC.

Agiter vigoureusement et placer 15 minutes au bain à ultrasons.

Ajouter 2 ml de dichlorométhane.

Agiter vigoureusement et placer 20 minutes à l’agitateur orbital.

Centrifuger 15 minutes à 5000 t/min.

Filtrer le surnageant sur filtre acrodisk de 0,2µm



10.1.2 Purification sur cartouche SPE Oasis

Conditionnement : + 3,5 ml de méthanol de qualité HPLC + 3,5 ml d’eau de qualité UPLC

Echantillon : + 1,5 ml de surnageant

Lavage : + 0,5 ml d’eau de qualité UPLC

Elution : + 1,5 ml d’eau de qualité UPLC

Récolter la dernière fraction dans un tube à essai en verre.

Attention: la cartouche SPE ne peut pas aller à sec, sauf pour l’élution!

10.1.3 Purification sur cartouche SPE Accucat

Marquer un trait à 1 ml sur la cartouche

Conditionnement : + 2,5 ml de méthanol de qualité HPLC + 2,5 ml d’eau de qualité UPLC

Echantillon : + la totalité de l’éluat issu de la cartouche Oasis

Eliminer jusqu’au trait à 1 ml

Récolter le reste et transférer dans un vial

Attention: la cartouche SPE ne peut pas aller à sec pour le conditionnement!

10.2 Préparation de l’échantillon dopé de contrôle

A chaque séquence d’analyses, un échantillon de la série est dopé.

Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, et ajouter précisément

à la micropipette une certaine quantité d’une des solutions filles en acrylamide correspondante, en

même temps que la solution de standard interne.

Par exemple, pour un dopage à 100 µg/kg, ajouter 200 µl de la SFB en acrylamide à 0,5 µg/ml.

A chaque série d’analyse :

- Un échantillon pain est préparé suivant la procédure des échantillons inconnus.

- Contrôle basse concentration : le même échantillon est supplémenté en acrylamide

par l’ajout de 100 µl de la solution SFB et préparé selon la procédure des échantillons

inconnus.



- Contrôle haute concentration : le même échantillon est supplémenté en acrylamide par

l’ajout de 200 µl de la solution SFA et et préparé selon la procédure des échantillons

inconnus.

10.3 Préparation d’un blanc méthode

A chaque séquence d’analyses, un blanc méthode est réalisé.

Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, ajouter la solution

de standard interne, mais ne pas ajouter d’échantillon ni de solution de dopage dans le falcon

de 50 ml.

10.3 Préparation d’un échantillon de contrôle

Par série, et par type de matrice, un échantillon de contrôle est ajouté. Il s’agit d’un

échantillon de la série supplémenté à 50 µg/kg en acrylamide .

10.4 Conditions chromatographiques

10.4.1 Paramètres de l’UPLC :

Volume d’injection : 2 µl

Température de la colonne : 30°C

Température de l’autosampler : 10°C

Solvant de rinçage de la seringue et du piston : Eau (UPLC) (80%) – Méthanol (UPLC)

(20%)

Gradient d’élution :

Temps (min) Flow (ml/min) A : Eau UPLC B : Méthanol UPLC

D : Eau + 0,1% HAc

Initial 0.200 73.5 2.0 24.5

2.50 0.200 73.5 2.0 24.5

2.51 0.200 37.5 50.0 12.5

3.51 0.200 37.5 50.0 12.5

6.00 0.200 73.5 2.0 24.5

8.00 0.200 73.5 2.0 24.5

10.4.2 Paramètres du spectromètre de masse

Mode ESI.

Polarité : ES+

Température de la source : 150°C

Température de désolvatation : 650°C



Débit de gaz de désolvatation : 1000 l N2 / heure

Débit de gaz – cone : 150L/heure

Débit de gaz – collision : 0.2 ml/minute

Acquisition : MRM

- Acrylamide : m/z 72 > 55

- Acrylamide-d3 : m/z 75 > 58

10.5 Séquence d’injection des solutions

courbe d’étalonnage L1 à L5

blanc méthode

échantillons inconnus et types (max 8)

L1 et L4 (quality check)

échantillons inconnus et types (max 8)

L1 et L4 (quality check)

…

11 Contrôle de la qualité

11.1 Contrôles de première ligne

11.1.1 Identification des pics : l’analyse est réalisée en mode MRM (transition m/z : 72 > 55)

Identifier l’acrylamide dans la solution d’échantillon en comparant le temps de rétention avec

celui des solutions de contrôle (L1 et L4) l’encadrant. Les temps de rétention ne peuvent

différer de plus de 5 %.

Identifier l’acrylamide dans la solution d’échantillon en comparant le temps de rétention de

l’acrylamide et de l’acrylamide-d3. Les temps de rétention ne peuvent différer de plus de 0,05

minute.

11.1.2 Contrôle du blanc méthode

Le blanc méthode ne peut présenter de pic ayant un S/N >10 3 aux temps de rétention de

l’acrylamide ou de l’acrylamide-d3 (SI).

11.1.3 Contrôle de la droite d’étalonnage



La quantité trouvée pour les injections des niveaux d’étalonnage (QC : L1 et L4) ne peut

différer de plus de 10 % de la quantité théorique.

Pour chaque niveau d’étalonnage, le pourcentage de déviation entre la concentration

mesurée et la concentration théorique doit être inférieur à 10%

Le rejet d’un des points d’étalonnage est autorisé à condition que cela ne soit ni le

premier ni le dernier niveau.

11.1.4 Suivi de l’échantillon de contrôle

Le rendement de l’échantillon de contrôle devra être compris dans l’intervalle 100 +/- l’incertitude

de mesure. Si ce critère n’est pas rencontré, la série d’analyse doit être recommencée.

11.2 Contrôles de deuxième et troisième ligne

Des contrôles deuxième et troisième ligne sont réalisés selon la procédure : « LAB 23 P 020

Gestion des contrôles qualité ».

12 Calcul et rapportage

Établir la droite d’étalonnage en rapportant les facteurs de réponse des pics des solutions

étalons par rapport aux concentrations correspondantes en µg/kg.

La droite d’étalonnage est du type y = ax + b

On peut déterminer la quantité d’analyte X (µg/kg) présent dans l’échantillon selon la

formule :

X = (y-b)

a x PE

La non-conformité du résultat est appréciée sur base des fiches techniques disponibles sur

Intranet.

13 Références aux procédures, instructions, documents, formulaires ou

listes y afférents

13.1 Procédures

LAB 23 P 020 Gestion des contrôles qualité

LAB 23 P 018 Création et suivi des cartes de contrôle qualité



13.2 Formulaires

LAB23 F543-PR-ACRYLAMIDE : Rapport d’exécution – Dosage de l’Acrylamide

13.3 Listes

néant



14 Annexes

Annexe 1 : Flowchart de la préparation des échantillons.

Blanc méthode:

Tube Falcon de 50 ml

Echantillon dopé:

Tube Falcon 50 ml + solution

fille en acrylamide + 1 g

échantillon (0,5 g si café)

Echantillon:

Tube Falcon 50 ml + 1 g

échantillon (0,5 g si café)

Echantillon de contrôle:

Tube Falcon 50 ml + 1 g échantillon type

15 minutes au bain ultra-sons

20 minutes à l’agitateur

Centrifuger 15 minutes à 5000 tpm

Récupérer le filtrat afin de le purifier sur colonne

Purification manuelle sur colonne SPE HLB Oasis 200mg/6ml

Conditionnement : + 3,5 ml méthanol de qualité UPLC

+ 3,5 ml H2O de qualité UPLC

Echantillon: + 1,5 ml extrait (surnageant)

Lavage: + 0,5ml LC-MS H2O

Elution: + 1,5ml LC-MS H2O

Récolter dans tube en verre

La colonne SPE ne peut pas aller à sec sauf pour l’élution !

transférer dans un vial pour LC-MS

+ 500 µl SFB en

acrylamide-d3 (SI) (=250 ng)

+ 2 ml dichlorométhane

Amener à 15ml avec eau qualité UPLC

Purification manuelle sur colonne SPE Bond-Elut AccuCAT 200mg/3ml

Marquer le trait 1 ml sur la cartouche

Conditionnement : + 2,5 ml méthanol

+ 2,5 ml H2O de qual. UPLC

Echantillon: + la totalité de l’extrait issu de la cartouche Oasis

Eliminer jusqu’au trait à 1 ml

Récolter dans un tube en verre

La colonne SPE ne peut pas aller à sec pour le conditionnement !



Annexe 2 : Flow chart : « Détermination de la teneur en acrylamide dans les aliments par LC/MS»

Ajouter 2 ml de dichloromethane

1g échantillon broyé + 250 ng SI + solution de dopage (si échantillon dopé) + amener à15ml avec eau de qualité UPLC

Placer 15 minutes au bain à ultra-sons

Placer 20 minutes à l’agitateur rotatif

Passer 1,5 ml du surnageant sur cartouches SPE

Centrifugation 15 minutes à 5000 t/min

http://images.google.be/imgres?imgurl=http://sartorius.centralcarolinascale.com/cp20toploader1.jpg&imgrefurl=http://sartorius.centralcarolinascale.com/CP-Balance.htm&usg=__O-xS8CwSeDiyWuP5nsuGoDIdBuY=&h=276&w=363&sz=26&hl=fr&start=5&um=1&itbs=1&tbnid=06DIymJYJrJegM:&tbnh=92&tbnw=121&prev=/images?q=sartorius+balance&um=1&hl=fr&tbs=isch:1

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