ANALYSE DE L’EXPRESSION ANALYSE DE L’EXPRESSION

DE PROTEINES D’ADHESION DE PROTEINES D’ADHESION

D’OSTEOBLASTES ET DE FIBROBLASTES D’OSTEOBLASTES ET DE FIBROBLASTES

CULTIVES SUR DU NITI DE 2 RUGOSITES CULTIVES SUR DU NITI DE 2 RUGOSITES

DIFFERENTESDIFFERENTES

http://leibo.univ-lyon1.fr

C. WIRTH, C. LAGNEAU, A.M. FREYRIA, D. DECORET, P. EXBRAYAT, M. LISSAC

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Le contexte buccalLe contexte buccal

Matériaux

???

BiofilmTissus

Cellules épithéliales

Cellules fibroblastiques

Cellules ostéoblastiques

Matériaux métalliques

Céramiques

Polymères

S. mutans

Actinomyces

Lactobacillu

s

??? ???

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

NiTi poli-miroir(NiTi 2400)

NiTi rugueux(NiTi 400)

Matériaux implantaires :Matériaux implantaires :

Ticp, Ti6Al4V, NiTi ?

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Ra ≈ 0.07, ≈ 0.15 µm

Dans notre étude, 2 états de surface :

C. WIRTH, V. COMTE, C. LAGNEAU, P. EXBRAYAT, M.LISSAC, N. JAFFREZIC, L. PONSONNET. Nitinol surface roughness modulates in vitro cell response: a comparison between fibroblasts and osteoblasts. Materials Science and Engineering C 2005, 25 : 51-60.

Types cellulaires Types cellulaires étudiés: étudiés: Cellules ostéoblastiques de calvaria de rat

obtenues par digestion enzymatique

Cellules fibroblastiques de gencives humaines par technique des explants

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immunomarquage biochimie (SDS-PAGE, Western Blot) biologie moléculaire (extraction ARN, RT-PCR)

Techniques Techniques utilisées :utilisées :

• collagène de type I• fibronectine • ostéocalcine• ostéopontine • ostéonectine

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

noyau

substrat

membrane cellulaire

protéine adhésive de la MEC

intégrines

complexe d’adhérence

cytosquelette

Protéines étudiées :Protéines étudiées :

Protéines adhésives de la MEC

Protéines spécifiques des ostéoblastes

Réaction d’amplification en chaîne = Réaction d’amplification en chaîne = PCR PCR

5’

5’3’

3’

Séquence cible : ADN à amplifier

Amorces Taq Polymérase

Pol

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Premier cycle

Étape 1 : DÉNATURATION

: 95°C

: 45 s

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

5’ 3’

5’3’

5’ 3’

5’3’

: Tm

: 1 min

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Étape 2 : HYBRIDATION

5’ 3’

5’3’

Pol

Pol

: 72°C

: 1 min

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Étape 3 : POLYMÉRISATION

5’3’

5’ 3’

: 72°C

: 1 min

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Pol

Pol

Étape 3 : POLYMÉRISATION

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

1er cycle 2ème cycle 3ème cycle 4ème cycle

GAPDH(450pb)

Collagène de type I(352pb)

Fibronectine(442pb)

1000 pb

100

200

300400500ARN extraits de fibroblastes

humains cultivés sur du NiTi poli-miroir et rugueux

ARN extraits d’ostéoblastes de rat cultivés sur du

NiTi poli-miroir et rugueux

1000 pb

100

200300400500

GAPDH(393pb)

Collagène de type I(557pb)

Fibronectine

(351pb)

Résultats des électrophorèsesRésultats des électrophorèses22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Pas d’influence de la rugosité de surface sur la synthèse du collagène de type I et de la fibronectine par les ostéoblastes et les fibroblastes

400 2400 400 2400 400 2400

400 2400 400 2400 400 2400

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

ARN extraits d’ostéoblastes de rat cultivés sur du

NiTi poli-miroir et rugueux

OP(688pb)

ON(650pb)

OC(760pb)

1000 pb

100

200

300

400500

OP : ostéopontine ON : ostéonectineOC : ostéocalcine

L’expression de l’ostéocalcine est favorisée par un état de surface poli-miroir

Résultats des électrophorèsesRésultats des électrophorèses

400 2400 400 2400 400 2400

Intensité de la bande plus importante sur le NiTi poli-miroir que le NiTi rugueux

Conclusion & PerspectivesConclusion & Perspectives

Étude de la synthèse d’autres protéines comme des intégrines, des cytoxines, des facteurs de croissance, des marqueurs d’apoptose par biologie moléculaire

NiTi avec Ra=0.07µm bon compromis pour obtenir un comportement optimum des ostéoblastes et des fibroblastes