Analyse d'extraits complexes de plantes par TLC et HPLC

Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311

Analyse d'extraits complexes de plantes par TLC et HPLC comment détecter les différentes

familles de molécules naturelles

Emilie Destandau

ICOA, UMR 7311, Université d’Orléans

[email protected]

3éme Journée Thématique du CCOA


Métabolisme primaireIndispensable à la survie de la plante

Métabolisme végétal

Molécules majoritaires

Source d’énergieConstitutifs des parois cellulairesNécessaires à la croissance de la plante

E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA

Sucres

Saccharose

Valine

Triglycérides

Acides Gras

Acides Aminés

2


Métabolisme Secondaire ou SpécialiséNe participe pas directement au développement

de la plante

Métabolisme végétal

Molécules minoritaires

Molécules de défense face à un stress

d’attraction pour la pollinisation

Terpènes (odeur)

Polyphenols (couleur)

Alcaloides (goût)

a-pinene

piperine

cyanidine

3



Asiaticosidea-amyrin

b-carotène

Limonène

Caféine

Capsaïcine

Catéchine

Gallotannin

Anthraquinones

Acide gallique

Rutine

Chlorophylle

Métabolisme végétal Des centaines de molecules !

Propriétés physicochimiquesPolarité

SolubilitéVolatilité

Propriétés optiques

Concentrations

glucose

Cafestol


http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Caffeine_molecule.png

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Catechin_structure.svg

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Beta-penta-O-galloyl-glucose.svg


De la plante aux moléculesExtraction

5

Sélection des molécules

Technique d’extraction

MacérationExtraction assistée par micro-ondesExtraction assistée par ultra sonExtraction par fluide supecritiqueDistillation ….

Solvant d’extraction

EauEthanolAcétate d’EthylHeptane …..

Guide le choix de la méthode d’analyse et des modes de détection


Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311 6

La chromatographie sur Couche Mince Méthode générique permettant d’analyser tout type de molecule sans traitement d’échantillon

Séparation des composés

Détection des composés

Dépôt de l’échantillon

Spots Bands

Verticale Horizontal IsocratiqueGradient

Visible-UVRévélationScanner


https://www.google.fr/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwj79NimyJLTAhXCchQKHTO3BxYQjRwIBw&url=https://www.copybook.com/companies/camag/chromatography-products-gallery/automatic-tlc-sampler-01&bvm=bv.152174688,d.d24&psig=AFQjCNEs8HiG67GrXlgONIRRrwj1pLcsTw&ust=1491662044240475


Multi-détection pour s’assurer de voir tous les composés plaque de silice F254s : indicateur fluorescent

UV 254 nm

UV 366 nm

visible

Absorption des

composés dans

l’UV

Fluorescence des

composés excités à

366 nm

Détection directe

Absorption des

composés dans le

visible



Dispositif d’immersion automatique

Procédures de dérivation spécifiques ou génériques en fonction des analytes recherchés

Derivatizer

Appareillages de dérivation



Ninhydrine pour la dérivation des acides aminés et peptides

O

O

OH

OH

H

R

NH2

COOH

OH

N

O O

O

+

lmax=570 nm

e=20000

Détection indirecte

l = 570 nm

Révélation ninhydrine

Acides Aminés

Révélation naphtol + H2SO4

Sucres

Plaque Si60 Eluant ACN/H2OE. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA


Kaem-rut

Que-glc

ac. gal

eCat-gal

bois de taille

jeunes pousses

boutons précoces

boutons avant éclosion

fleurs

Neu (diphenylboric acid 2 amino ethyl ester) puis PEG (polyethylene glycol)

Polyphenols

fleurs

Couleur de fluorescence depend de la structure de la molécule


ac. galeCat-

gal

O-GlcQue-glc

O-Rut

Kaem-rut


composés lipidiques non polaires

Beta sitosterol

alpha tocophérol

acide linoléique

tripalmitinesqualène

stigmasterol

bth bté Bae1 Bae2 Fl1 Fl2 Feu1 Feu2 fruits

366 nm primuline

Visible liberman

α hédérine

stigmastérol

acide

linoléiquefarnésol

eugénol

lupéol

bt jp bp bae fl

stigmastérol

Acide linoléique

tocopherol

Vanilline sulfurique



N+

O-

O

N+

O-

O

N+

O-

O

N N

N+

O-

O

N+

O-

O

N+

O-

O

NH NAH+ + A.

Détection d’activitéActivité antioxydante : DPPH radical stable

violet jaune

https://www.camag.com



lampe à halogène ou à tungstènepour le visible (400 à 800 nm) lampe à deutérium pour le domaine UV (200 à 400 nm).

Analyse quantitative



Couplage HPTLC-API-MS

Désorption par un solvant adaptéSpot dirigé vers API (ESI, APCI)Ionisation des composésAcquisition du spectre de masse

Spot désorbé



m/z 449 [M]+ cn-3-gal

m/z 419[M]+ cn-3-ara

m/z 595 [M]+ cn-3-rut

Identification moléculairem/z 287 [A+]

m/z 287 [A+]

m/z 287 [A+]

Food Chemistry 146 (2014) 104–112



Echantillon

Matrice

Support

+

+

-

-

-

Laser

Désorption Désolvatation

H+

Transfert de proton

plaque aluminium dimension 5*7 cm

Couplage HPTLC-MS type MALDI



Analyse TLC-MALDI

Dépôts faits en double : Plaque de référence révélation des spotsPlaque Maldi avec dépôt de matrice



3

5

1

2

4

6

7

89

10

11

12

Quercetin+ Pentose

Kaempferolglucuronide

Kaempferol+ glucoseQuercetin +

pentose

KaempferolGalloide+hexose

Kaempferol+ pentose

593

599

461433

433

447

447

431

417

Kaempferol+ rhamnose

Quercetin+ rhamnose

Kaempferolrutinoside

18 flavonols caractérisés

285

285

285

285

301

301

301

Analyse TLC-MALDI de polyphenols

Phytochemical Analysis. (2018);1–8



La chromatographie en phase liquide

Chaine HPLC-UHPLC

Détecteur à barrette de diode DAD

Détecteur réfractomètre

Détecteur fluorimétrique

Détecteur électrochimique

Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière DEDL

Détecteur Corona

Détecteur spectrométrie de masse

Tous les composés (universel)Certains composés (spécifique)Sensibilité



Détecteur UV-vis à barrette de diodes(diode-array detector DAD)

Le chromatogramme 3DDifférents chromatogrammes observés à différentes λ

Spectre complet à chaque tR

Temps d’analyse

λ Heat map


A = e l C


Détecteur DAD

l = 280 nm

l = 520 nm

Différentes longueurs d’onde sélectionnées

pour observer les différents composés

Identification des

composés par les

spectres d’absorption

1

3

5

Separation and Purification Technology 100 (2012) 51–58



Extrait Flos primulae veris

E. de Rijke et al. / J. Chromatogr. A (2006)

RPLC–UV216 nm RPLC–FLU (ex, 330 nm; em, 440 nm)

Détecteur fluorimétrique


Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311 D. Zielińska et al., Analytica Chimica Acta (2008)

Extrait d’oignon

Détecteur Electrochimique500 mV

950 mV



Détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL)

Chambre de nébulisation: Séparation des gouttelettes (selon taille)

Tube d’évaporation

Nebuliseur

Sourcelumineuse

Lumière diffusée

Gaz auxilliaire(N2)


Molécules non volatiles


-250000

250000

750000

1250000

1750000

2250000

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Time (minutes)

Inte

nsity (

uA

)DEDL

sucr

es

terp

ène

s

-10000

40000

90000

140000

190000

240000

290000

340000

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Time (minutes)

Inte

nsity (

uA

)

UV 280 nm

ph

éno

liqu

es

RPLC- Pursuit varian XR-C18, Phase mobile gradient Eau/MeOH

Molécules non volatiles

Information sur la quantité

Détection basée sur le coefficient

d’extinction molaire A = elC

Complémentarité des détecteurs en HPLC

25

Nécessité d’associer les informations des 2 détecteurs

Industrial Crops and Products 49 (2013) 794– 804 )E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA

http://lowe.wangandmin.com/blog/wp-content/uploads/2008/03/pomme.jpg


Source d’ion

Volatilisation et IonisationESI, APCI, APPI…

Collecteur d’ion

Comptage des ions

Acquisition

Echantillon

Analyseur

Séparation des ionsQuad, Trap, Tof…

Méthode de Séparation

Spectre de masse

Couplage LC-MS

m/z

Ab

on

dan

ce r

ela

tive

%

Ion moléculaireIons

fragments

Adduits

Quelle source ? Polarité, taille Quel analyseur ? Précision, résolution, sensibilitéQuel mode d’ionisation ? positif, négatif Quel mode ? full scan, SIM, MS/MS, MRM



-Q1: 13.856 to 14.047 min from Sample 1 (neg ESI) of Mel Stds 100ppm.wiff (T... Max. 6.9e6 cps.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z, amu

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

5.0e6

6.0e6

6.9e6

Inte

ns

ity

, c

ps

609.0

300.5

271.0 645.5

Rutine M = 610 u

ESI-[M-H]-

[M-162-146-H]-

-Q1: 13.916 to 14.108 min from Sample 4 (neg APCI) of Mel Stds 100ppm.wiff (... Max. 4.9e6 cps.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z, amu

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

4.9e6

Inte

ns

ity

, c

ps

300.5

609.5

271.5

255.0

151.0 243.0 343.0283.5

APCI- [M-H]-[M-162-146-H]-

Fragments de génine RDA

+Q1: 13.916 to 14.108 min from Sample 3 (pos APCI) of Mel Stds 100ppm.wiff (... Max. 6.9e6 cps.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z, amu

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

5.0e6

6.0e6

6.9e6

Inte

ns

ity

, c

ps

303.0

611.5465.5

633.5449.0147.5 345.0285.5257.0229.5

APCI+

[M+H]+

[M-162+H]+

[M-146+H]+

[M+N

a] +

[M-162-146+H]+

301 162

146

Analyse LC-MS ESI vs APCI mode + vs -


+Q1: 13.856 to 14.047 min from Sample 2 (pos ESI) of Mel Stds 100ppm.wiff (T... Max. 4.4e6 cps.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z, amu

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.4e6

Inte

ns

ity

, c

ps

611.5

303.5

633.5

465.5

630.5449.5301.5 341.5

ESI+[M+H]+

[M+N

a] +

[M-162+H]+

[M-146+H]+

[M-162-146+H]+

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/09/Rutin_structure.svg


Recherche sélective de composés dérivésRecherche de dérivés de quercétine dans un extrait de pommes en ESI-

XIC of -Q1: 301.0 amu from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (Turb... Max. 2.9e6 cps.

10 12 14 16 18 20Time, min

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

2.9e6

Inte

ns

ity

, c

ps

Que




Recherche sélective de composés dérivésRecherche de dérivés de quercétine dans un extrait de pommes en ESI-

XIC of -Q1: 301.0 amu from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (Turb... Max. 2.9e6 cps.

10 12 14 16 18 20Time, min

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

2.9e6

Inte

ns

ity

, c

ps

Que

-Q1: 15.469 to 15.651 min from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (T... Max. 5.4e6 cps.

150 200 250 300 350 400 450m/z, amu

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

5.0e6

5.4e6

Inte

ns

ity

, c

ps

447.5

300.5

433.5271.5255.0

-146 u

Rhamnose


150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z, amu

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

Inte

ns

ity

, c

ps

463.5

300.5

609.5

531.5441.5271.0 485.5 577.5395.5255.0

Rut

-146 u -162 u

Rhamnose Glucose


150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z, amu

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

2.7e6In

ten

sit

y,

cp

s

433.5

300.5

271.5 501.5

-132 u

Xylose



150 200 250 300 350 400 450m/z, amu

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

Inte

ns

ity

, c

ps

433.5

300.5

271.5447.5255.0 385.0

-132 u

Xylose



RT: 0.00 - 18.00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Time (min)

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

1007.28

0.53 7.354.53 10.446.91

15.321.73 16.428.16 8.932.13 10.52 14.260.68 4.78 11.894.23 6.163.53 12.59 17.35

10.44

10.32

8.4911.89

4.773.38 6.99 9.497.50 10.845.94 12.070.48

9.54

2.498.87

7.746.46 10.610.52 13.311.22 11.34

7.28

4.53 6.9115.320.49

1.73 16.428.16 8.932.1314.260.68 4.78 9.454.23 6.163.53 10.78 17.3513.3010.98

0.53 7.35

10.52

12.593.23 13.70 14.2212.22 16.395.272.20 10.055.93

NL: 6.51E1

TIC MS MO_190403211207

NL: 3.40E1

TIC F: - c ESI SRM ms2 679.278 [455.150-455.152, 517.207-517.209, 526.985-526.987] MS MO_190403211207

NL: 1.40E1


NL: 6.51E1


NL: 4.24E1

TIC F: - c ESI SRM ms2 979.187 [888.989-888.991] MS MO_190403211207

RT: 0.00 - 18.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Time (min)

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

1009.04

8.439.58

9.998.28 10.384.753.00 5.25 11.767.31 13.610.78 14.18 15.351.28 16.50

9.69

9.04

4.75

5.25 8.497.763.64 5.47 9.97 11.91 13.193.47 14.370.85 16.38

9.04

8.439.58

9.998.28 10.38 11.767.31 13.61 14.18 15.35 16.506.043.990.52 5.36

3.00 3.05

0.78 0.89 4.751.28 3.61 4.86 9.185.58 6.60 17.9014.379.32 11.15 13.38 16.12

0.53

8.592.88 3.78 7.794.851.65

NL: 2.34E5

TIC MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7

NL: 3.01E3

TIC F: - c ESI SRM ms2 679.278 [455.150-455.152, 517.207-517.209, 526.985-526.987] MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7

NL: 2.34E5


NL: 6.13E2


NL: 3.13E1

TIC F: - c ESI SRM ms2 979.187 [888.989-888.991] MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7

MRM 679→455

MRM 817→611

MRM 969→924

Recherche sélective de composés dérivés

Analyse quantitative


Full scan


Identification des composés UHPLC-HRMS

447.09447

227.03513

255.03027

284.03303

447.09323

0

1000

2000

3000

4000

5000

Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

200 250 300 350 400 450 m/z

447.09447

227.03513

255.03027

284.03303

447.09323

0

1000

2000

3000

4000

5000

Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

200 250 300 350 400 450 m/z

C21H19O11

Kaempférol glycoside ?Cohérent avec HPTLC et HPLC

447,09447

1ère analyseLC/MS – full scan

DataAnalysis

Chemspider212 propositions

2ème analyse LC-MS/MS

Ions fragments

-162 (hexose)

Ion précurseur

Proposition d’identification

structurale

31

Maxis Q-Tof



Fleur extrait EtOH/H2OUHPLC-ESI mode négatif

Tanins hydrolysables

Eléments de base

Tanins condensés Flavonoïdes

flavonols

Eléments de base


Environ 60 composes phénoliques

• Interprétation des spectres • Comparaison avec des bases de données• Injection de standards

Phytochemistry 99 (2014) 127–134


Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311Phytochemical Analysis (2015), (2017)

Time (min)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

6x10

Intens.

0 5 10 15 20 25 30

Fleurs Extrait AcOEtUHPLC-APPI-HRMS mode négatif

Dopant Acétone

triterpènes

acides gras glycolipides

sphingolipides

stérols

chlorophylles triglycérides

Environ 60 composés de familles différentes

polyphenols

33




Conclusion

triterpène

Anthraquinones

sucre

Flavonol

Acide gras

Gallotannin

Molécules dans tous leurs états

Détection dans tous ses états

Large choix de détecteur

Détecteur courant

Détecteur ‘universel’

Détecteur spécifique

Information sur la structure meme sans MS

Choix de détecteur plus restreint

Détecteurgénérique

Pas d’ Information sur la structure sans MS


http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Beta-penta-O-galloyl-glucose.svg


Remerciements

Partenaires INRA, CIRAD

CDHRC, Roseraie

André Eve

Thomas Ludivine Cristina Laetitia, Souhila Thibault, Sandrine, Cyril, Eric, Claire …..

Industriels LVMHAlban MullerRadouxCamag

Vous

E. Destandau SEP 2019

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Analyse d'extraits complexes de plantes par TLC et HPLC