Les techniques de préparation des coupes pour

les microscopies optique et électronique

Histologie-Embryologie

Pr. Mariam Naciri

Université Mohammed V-Agdal Faculté des Sciences de Rabat Laboratoire de Zoologie et de Biologie générale

Visualisation in situ de substances chimiques

Autoradiographie Cyto-histochimie

- réaction chimique +/- spécifique dont le résultat est appréciable a l’observation microscopique sous forme d’un précipité coloré

- PAS (glycogène) ; noir Soudan (graisses) ; bleu de Prusse

Immuno-cyto-histochimie (immunofluroscence) Hybridation in situ

Visualisation in situ de substances chimiques

Immuno-cyto-histochimie (Immunofluorescence)

- Mettre en évidence et localiser à l’échelon tissulaire, cellulaire ou sub-cellulaire toutes sortes d’antigènes, révélés par leurs anticorps spécifiques

- Le complexe antigène-anticorps est révèle par l’adjonction de molécules

enzymatiques sur lesquelles on fait agir leur: *substrat spécifique (microscopie en lumière blanche) ou *de fluorochromes (microscopie en lumière ultra violette) ou *de corps opaques aux électrons (microscopie électronique)

Reaction immunocytochimique L'immunohistochimie (ou IHC) est une technique qui permet de mettre en évidence:

- des sites antigéniques sur des cellules grâce à des anticorps spécifiques

- une mise en évidence utilisant un procédé colorimétrique (on utilise généralement une enzyme : la peroxydase).

Principe d'une réaction immunohistochimique

Une immunoréaction est composée de trois éléments principaux : 1.La préparation (tissu, cellule, organite subcellulaire, virus ...) contenant l'antigène à

étudier ; 2.Un anticorps2 dirigé contre l'antigène recherché ; 3.Le système révélateur qui permet de visualiser l'immunoréaction.

Principe d'une réaction immunohistochimique

La qualité des résultats dépend de l'utilisation judicieuse de ces trois éléments (la préparation, Anticorps 2 , le système révélateur) a/ Les termes :

- immunohistologie et immunohistochimie (immunoréactions sur tissus) - immunocytologie et immunocytochimie (immunoréactions sur cellule) - immunocytologie est plutôt employé pour la cytométrie en flux - immunohistologie plutôt réservé aux immunomarquages sur tissus et coupes de tissus.

b/ L'anticorps dirigé contre l'antigène recherché est souvent appelé anticorps primaire : une immunoréaction est en effet la plupart du temps réalisée au moyen d'une cascade d'anticorps (anticorps primaire, secondaire, éventuellement tertiaire)

Quantification a l’échelon cellulaire ou tissulaire

Cytométrie par analyses d’images microscopiques Le microscope devient un instrument de mesure Les cellules sont caractérisées par un ensemble de paramètre dont on peut

mesurer les valeurs et qui représentent la morphologie, la couleur, la densitomètre…

Applications : - dosage in situ (ADN, récepteurs, antigènes) ; - identification des cellules (évolution possible vers l’automatisation de la

lecture cytologique)

.

Cytométrie en flux les cellules en suspension sont colorées par des fluorochromes, illuminées par un faisceau laser ; l’analyse des interactions entre cellules et faisceau permet de les caractériser et de les compter ;

on mesure: La quantité de substance fluorescente le dosage in situ des molécules sur lesquelles elles se sont fixées

Cytométrie en flux Les cellules sont dispersées dans du sérum physiologique et passent à travers un faisceau de lumière laser. La diminution de l’intensité du faisceau direct permet de mesure la masse cellulaire ou la masse de DNA. Les cellules qui émettent de la fluorescence sont reconnues par une cellule photoélectrique particulière. Enfin, on peut éventuellement séparer les cellules selon leur charge électrique : séparateur de cellules

Description sommaire d’un appareillage de cytométrie de flux.

Immunohistochimie

Intérêts

- Détection spécifique de protéines sur matériel cytologique ou sur coupes tissulaires - localisation (+/- quantification) d'une protéine dans une cellule ou un tissu

Accès des Ac à l'Ag : la fixation 1/ Fixation physique : congélation Tissu plongé dans un liquide refroidissant (iso pentane –130°C) Enrobage dans substance protectrice (OCT) Avantages : - maintien de la réactivité de l ’Ag (fixation idéale) - état proche du vivant - maintien en place des constituants solubles - préservation d’organites sensibles à la pression osmotique

Inconvénients : - peu pratique (Azote (N2) liquide) - moins bonne morphologie

- 2/ Fixation chimique : Les agents précipitants : Alcool éthylique, acétone Modification structure III aire des protéines : effet dénaturant Avantage : -Préserve l’antigénicité

Inconvénients : - Altérations morphologiques - Déshydratation simultanée

Accès des Ac à l'Ag : la fixation

Les agents pontants : Formol, liquides de Bouin

Immobilisation par des liens intra et intermoléculaires

Avantages : - Structures mieux préservées: bonne morphologie - Meilleure immobilisation des protéines Inconvénients : - Dénaturation + sévère des Ag - Masquage des Ag

Accès des Ac à l'Ag : Démasquage antigénique

1- Enzymatique -Trypsine 0,1% TA - Pronase 0,1% 37°C - Pepsine 0,4% 37°C 2-A la chaleur - tampon citrate four à micro-ondes - tampon EDTA - bain-marie ++ - étuve

Accès des Ac à l'Ag : Perméabilisation des membranes

Cellules entières Détergents non ioniques : - Triton 0,1% - Saponine 0,1-0,01%

Les anticorps Anticorps polyclonaux : Avantages : - plusieurs Ac contre un seul Ag - plus « sensible » - fixation moins critique - mise en oeuvre rapide Inconvénients : - spécificité moindre : reconnaît différents déterminants d ’un

même Ag - plus grande sensibilité à la qualité de la fixation

Révélateur

Fluorescence : principe absorption – émission

Fluorescence : Avantages : - protocoles rapides - grande sensibilité - colocalisations possibles - confocal Inconvénients : - montage aqueux : disparaît au cours du temps - sensibilité à la lumière : stockage à 4°C - extinction du signal sous UV - microscope spécialement équipé, chambre noire - marche mal en paraffine

Images des cellules du cancer du colon SW480

No plasma exposure No Accutase

1000 x

1000 x

a

c

b No plasma exposure Accutase treated

1000 x

1000 x

d Plasma exposure No Accutase

Plasma exposure Accutase treated

Images des cellules de l’os (osteoblastes) par SEM