ANNEXE - Ministère de l'agriculture et de l'alimentation · La carte linéaire du fragment de restriction plasmidique PV-ZMGT32L est présentée en Figure 2. Figure 2 : Carte linéaire

Monsanto Agriculture France SAS Novembre 2006 p1

ANNEXE

Demande d’autorisation pour expérimentation au champ avec des plantes transgéniques.

Programme d’expérimentation annuel pour le développement de lignées et d’hybrides

de maïs transgéniques tolérants au glyphosate (matière active du ROUNDUP®),

2007 (NK 603)

DEMANDE DEPOSEE EN NOVEMBRE 2006 PAR MONSANTO AGRICULTURE FRANCE SAS

Monsanto Agriculture France SAS Novembre 2006 p

2

INTRODUCTION

Ces informations ont trait à la modification génétique de la plante : cartes des plasmides utilisés pour la transformation, études et descriptif des séquences réellement insérées dans le génome du maïs, etc…. De façon à établir une cohérence entre le dossier technique et ces études, la numérotation des chapitres et paragraphes est la même que celle respectée dans le dossier technique joint qui correspond à celle établie dans le cadre de la Directive 2001/18/EC : toutes les rubriques ne donnant pas lieu à un renvoi d’annexe ne sont pas reprises ce qui explique la discontinuité de la numérotation dans ce présent dossier. Enfin, il importe de préciser que ce document ne reprend qu’une partie des études actuellement disponibles sur la technologie ROUNDUP READY, lignée NK603 ; l’ensemble des données ayant été compilées dans le cadre du dossier de demande d’importation dans l’Union Européenne, partie C (dossier C/ES/00/01) conformément à la Directive Européenne 2001/18/EC. Ce dossier a reçu une opinion favorable de la part de l’Espagne qui en est l’Etat rapporteur en janvier 2003. Depuis lors, les 15 Etats Membres, dont les membres de la Commission du Génie Biomoléculaire en France ont eu l’occasion d’examiner ce dossier et d’émettre objections et questions : les réponses formulées par Monsanto ont été examinées par l’EFSA (Agence de Sécurité Alimentaire Européenne) (European Food Safety Authority) le 25 novembre 2003. L’EFSA a délivré deux opinions sur le maïs NK603 : l'une sur la mise sur le marché, l'importation et la transformation du maïs NK603, dans le cadre de la partie C de la Directive 2001/18/EC ; l'autre sur la sécurité des aliments dérivés de ce maïs, dans le cadre du règlement 258/97. L'Agence a conclut que le maïs NK603 est aussi sûr que le maïs conventionnel et qu'il est très improbable que sa mise sur le marché pour l'alimentation ou la transformation provoque un effet non désiré sur la santé humaine ou animale ou sur l'environnement.


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SOMMAIRE

INTRODUCTION..................................................................................................................................2 SOMMAIRE ..........................................................................................................................................3 C. Informations concernant la modification génétique. .............................................................. 4

2) Nature et source du vecteur utilisé...................................................................................... 4 3) Taille, origine des organismes donneurs et fonction recherchée de chaque fragment constitutif de la région envisagée pour l’insertion...................................................................... 6

D. Informations concernant la plante superieure génétiquement modifiee. ................................ 9 2) Informations sur les séquences réellement insérées ou délétées......................................... 9 3) Informations concernant l’expression de l’insert.............................................................. 27 4) Stabilité génétique de l’insert et stabilité phénotypique de la plante supérieure génétiquement modifiée............................................................................................................ 29

BIBLIOGRAPHIE...............................................................................................................................31


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C. INFORMATIONS CONCERNANT LA MODIFICATION GENETIQUE.

2) Nature et source du vecteur utilisé. Le vecteur plasmidique d’expression dans la plante, nommé PV-ZMGT32, a été développé par Monsanto Company, Saint Louis, Missouri (Etats Unis). La carte de ce plasmide vecteur est présentée en Figure 1. Ce plasmide contient deux cassettes adjacentes d’expression du gène dans la plante contenant chacune une unique copie du gène cp4 epsps.

Figure 1 : Carte du plasmide vecteur PV-ZMGT32.

Pour la transformation du maïs ROUNDUP READY NK603, seul un fragment (environ 6,7 kb) de ce plasmide vecteur isolé sur gel d’agarose après digestion par l’enzyme de restriction MluI a été utilisé.

4937

I 8388 I 149

PV-ZMGT329308 bp

P-ract1

ract1 intron

CTP2

CP4EPSPS

NOS 3'e35SZ HSP70

intronCTP2

CP4 EPSPS

NOS 3'

or

nptII

Nco I 1607

Sac I 1098

Eco RI 579Eco RV 169Mlu

Sac I 3210Eco RI 3212

EcoRV 4010Xba I 4232

Ml I 6856

Eco RI 6838Eco RV 6828

Eco RI 6562Sac I 6560

Nco I 4957

Sca I 4704

Nco

Restriction fragment

used in transformation

Xba I


5

Ce fragment, nommé PV-ZMGT32L, ne contient que les cassettes d’expression du gène cp4 epsps dans la plante; il ne contient pas le gène marqueur nptII, ni l’origine de réplication ‘ori’ présent donc dans la séquence backbone du plasmide d’environ 2,6 kb. La carte linéaire du fragment de restriction plasmidique PV-ZMGT32L est présentée en Figure 2.

Figure 2 : Carte linéaire du fragment plasmidique PV-ZMGT32L.

Dans chacune des deux cassettes d’expression du gène dans la plante, le gène cp4 epsps est associé à des séquences de peptide de transfert vers le chloroplaste (CTP); ces séquences sont isolées de celles de l’EPSPS d’Arabidopsis thaliana : elles dirigent les protéines CP4 EPSPS vers le chloroplaste, site de biosynthèse des acides aminés aromatiques (Kishore et Shah, 1998). Les séquences CTPs sont typiquement séparées des protéines matures après transfert de la protéine vers le plastide. Dans la première cassette du gène, la séquence codante ctp2-cp4 epsps est sous le contrôle de l’extrémité 5’ de la séquence de l’actine 1 du riz (ract 1) contenant le promoteur et le premier intron (McElroy et al., 1990) introduit en amont de la séquence CTP. La seconde cassette contient la séquence ctp2-cp4 epsps sous le contrôle du promoteur (e35S) du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Kay et al., 1985 ; Odell et al., 1985) qui a une taille approximative de 0,6 kb. Situé entre le promoteur e35S et la séquence ctp2-cp4 epsps se trouve un intron de 0,8 kb du gène hsp 70 (‘heat shock protein’) du maïs présent pour augmenter les niveaux de transcription du gène (Rochester et al., 1986). Enfin, dans chacune de ces cassettes, la séquence cp4 epsps est associée à une séquence de 0,3 kb non transcrite 3’ de la nopaline synthase, NOS 3’, (Fraley et al., 1983) qui fournit le signal de polyadenylation des ARNm.

MluI 0

MluI 6707 EcoRV 20 SacI 3061

Eco RV 6679 SacI 949

EcoRV 3861 ScaI 4555 SacI 6411

P-ract1

ract1 intron

CTP2

CP4 EPSPS

NO

S 3’

e35S

ZmH

SP70

CTP2

CP4 EPSPS

NO

S 3’

Xba I 4788 XbaI 4083


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Le plasmide PV-ZMGT32 contient aussi une origine de réplication (ori) qui a permis sa réplication dans Escherichia coli (Vieira et Messing, 1987), ainsi que consécutivement une séquence codante pour l’enzyme néomycine phosphotransférase type II (nptII) ; cette enzyme confère la résistance aux antibiotiques aminoglycoside (c’est à dire kanamycine et néomycine) et a été utilisée pour la sélection des bactéries durant la construction du plasmide. La séquence codante pour le gène nptII était dérivée du transposon procaryotique Tn5 et est présent avec son propre promoteur bactérien. (Beck et al., 1982)

3) Taille, origine des organismes donneurs et fonction recherchée de chaque fragment constitutif de la région envisagée pour l’insertion. Tous les composants du plasmide vecteur PV-ZMGT32 et par voie de conséquence ceux du fragment PV-ZMGT32L utilisé dans la transformation sont parfaitement connus, et notamment le gène d’intérêt cp4 epsps. La taille, l’origine et la fonction de tous les composants génétiques du plasmide vecteur PV-ZMGT32 sont détaillées dans le Tableau 1.


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Tableau 1 : Résumé des éléments d’ADN constituant le plasmide vecteur PV-ZMGT32.

Elément génétique Origine Taille

(kb) Fonction

Eléments génétiques présents dans le fragment de restriction PV-ZMGT32L obtenu par digestion à l’aide de l’enzyme de restriction MluI, fragment utilisé pour la transformation: Cassette 1 du gène cp4 epsps P-ract1/ ract1 intron

Oryza sativa 1,4 Région 5’du gène de l’actine 1 du riz contenant le promoteur et le premier intron.

ctp 2 Arabidopsis thaliana

0,2 Séquence du peptide de transit, isolée d’ Arabidopsis thaliana, présents pour diriger la protéine CP4 EPSPS vers le chloroplaste, site de synthèse des acides aminés aromatiques.

cp4 epsps Agrobacterium sp. souche CP4

1,4 Gène de la 5 énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthétase (EPSPS) d’Agrobacterium sp. Souche CP4, qui confère la tolérance au glyphosate.

NOS 3’ Agrobacterium tumefaciens

0,3 Région 3’ non traduite du gène de la nopaline synthase qui termine la transcription et commande la polyadénylation de l’ARNm.

Cassette 2 du gène cp4 epsps e35S Cauliflower

mosaic virus 0,6 Promoteur du virus de la mosaïque (CaMV) du chou-fleur

Zmhsp70 Zea mays L. 0,8 Intron du gène hsp70 (heat-shock protein) du maïs présent pour stabiliser les niveaux de transcription du gène

ctp 2 Arabidopsis thaliana

0,2 Séquence du peptide de transit, isolée d’ Arabidopsis thaliana, présents pour diriger la protéine CP4 EPSPS vers le chloroplaste, site de synthèse des acides aminés aromatiques.

cp4 epsps Agrobacterium sp. strain CP4

1,4 Gène de la 5 énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthétase (EPSPS) d’Agrobacterium sp. Souche CP4, qui confère la tolérance au glyphosate.

NOS 3’ Agrobacterium tumefaciens

0,3 Région 3’ non traduite du gène de la nopaline synthase qui termine la transcription et commande la polyadénylation de l’ARNm.

Elément génétique Origine Taille

(kb) Fonction

Eléments génétiques présents dans la séquence ‘backbone’ du plasmide PV-ZMGT32 , mais non présents dans le fragment de restriction PV-ZGMT32L, obtenu par digestion à l’aide de l’enzyme de restriction MluI et utilisé pour la transformation: ori Escherichia coli 0,65 Origine de réplication qui permet sa réplication dans E.

coli. nptII Transposon Tn5 0,8 Séquence codante pour l’enzyme neomycine

phosphotransferase type II. Cette enzyme confère la résistance aux antibiotiques aminoglycoside et permet de sélectionner des bactéries qui contiennent le plasmide (Beck et al., 1982).


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Il a été montré que le gène cp4 epsps présente la possibilité de conférer de hauts niveaux de résistance à l’inhibition du glyphosate, lorsqu’il est introduit dans les plantes (Padgette et al., 1993 ; OECD, 1999). Habituellement, le glyphosate se lie et bloque l’activité de son enzyme cible, l’EPSPS, une enzyme de la chaîne de biosynthèse des acides aminés aromatiques. Le gène cp4 epsps est issu d’Agrobacterium sp. souche CP4. Complètement séquencé, il code pour une protéine de 47,6 kDa constituant un polypeptide simple de 455 acides aminés (Padgette et al., 1996). En tant que tel, le gène cp4 epsps associé à son peptide de transfert CTP2 a une taille approximative de 1,6 kb. Cette protéine CP4 EPSPS est une des diverses EPSPSs que l’on trouve dans la nature (Schulz et al., 1985) : elle s’est avérée extrêmement tolérante à l’inhibition du glyphosate (Barry et al., 1992 ; Padgette et al, 1993 ; Padgette et al., 1996). Les cellules des plantes exprimant la protéine CP4 EPSPS sont tolérantes au glyphosate quand il est présent dans le milieu de culture, car l’activité enzymatique de l’EPSPS se poursuit et fournit les éléments nécessaires à la synthèse des acides aminés aromatiques. L’isolat bactérien, CP4, a été identifié par American Type Culture Collection dans une espèce d’Agrobactérium. Il n’y a pas de pathogénie connue, humaine ou animale, des espèces d’Agrobactérium ; le gène epsps n’est pas non plus le déterminant d’une pathogenèse des plantes due à Agrobactérium. Le CP4 et les enzymes EPSPS présentes naturellement dans le maïs sont fonctionnellement équivalents, excepté pour leur affinité au glyphosate. De part les deux cassettes insérées, le maïs NK603 exprime deux protéines CP4 EPSPS de tolérance au glyphosate presque identiques, la CP4 EPSPS et la CP4 EPSPS L214P. La CP4 EPSPS L214P est structurellement et fonctionnellement équivalente à la CP4 EPSPS ; seules, leurs séquences diffèrent d’un seul acide aminé. Ainsi, l’acide aminé situé en position 214 est une leucine dans la CP4 EPSPS et une proline dans la CP4 EPSPS L214P. Les protéines CP4 EPSPS produites dans le maïs NK603 sont virtuellement identiques à la CP4 EPSPS produite dans le soja ROUNDUP READY, le coton ROUNDUP READY et la betterave ROUNDUP READY. Le soja ROUNDUP READY a été autorisé sous la décision de la Commission du 3 Avril 1996 selon la Directive du Conseil 90/220/EEC (n° 96/281/EC).


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D. INFORMATIONS CONCERNANT LA PLANTE SUPERIEURE GENETIQUEMENT

MODIFIEE.

2) Informations sur les séquences réellement insérées ou délétées. Des analyses moléculaires (Southern Blot et analyse de polymérisation en chaîne (PCR) ont été réalisées pour caractériser l’ADN inséré dans le génome du maïs NK603. Les résultats de ces études sont présentés ci-après.

a) Taille et structure de l’insert et méthodes utilisées pour sa caractérisation, avec indication des parties de vecteur introduites dans la plante supérieure génétiquement modifiée ou de tout ADN vecteur ou étranger restant dans la plante supérieure génétiquement modifiée.

Détermination du nombre d’inserts dans le génome du maïs NK603.

Le nombre de site d’insertion ainsi que le nombre d’inserts de l’ADN transgénique dans le génome du maïs a été déterminé en utilisant la méthode d’analyse Southern Blot (Southern, 1975). Les ADN génomiques test (NK603) et de contrôle (B73 non transgénique) ont été digérés avec l’enzyme de restriction StuI . Cette enzyme n’est pas à même de couper à l’intérieur du fragment d’ADN utilisé pour la transformation ; en revanche, elle coupe à l’intérieur de l’ADN génomique de la plante. Par conséquent, dans le cas où il y aurait une seule insertion dans le génome du maïs, cette digestion doit générer un unique fragment contenant à la fois l’ADN inséré et l’ADN adjacent génomique de la plante issue du maïs NK603. L’ADN génomique non transgénique associé au plasmide PV-ZMGT32 a été digéré à la fois par StuI et ScaI. Puisque StuI n’est pas à même de couper à l’intérieur du plasmide PV-ZMGT32, une seconde enzyme de restriction ScaI était nécessaire pour linéariser le plasmide. PV-ZMGT32 a ainsi été linéarisé pour faciliter sa migration à travers le gel de sorte qu’il puisse servir de standard de taille précis. Les échantillons ont été sondés avec l’ADN plasmidique entier PV-ZMGT32 marqué au P32 (Figure 1), le plasmide source du fragment d’ADN linéaire utilisé pour la transformation. Les résultats de l’analyse Southern Blot sont détaillés dans la Figure 3.


10

Figure 3 : Analyse Southern Blot du maïs NK603 : détermination du nombre d’inserts.

10 microgrammes d’ADN génomique B73 et NK603 ont été extraits des tissus foliaires et digérés avec l’enzyme de restriction StuI. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé avec l’ADN de la lignée de contrôle B73 ont été digérés avec les enzymes de restriction StuI et ScaI. Les échantillons d’ADN ont été séparés sur gel par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et sondés avec le plasmide PV-ZMGT32 marqué au P32. La désignation des puits est la suivante : puits 1 : ADN de la lignée de contrôle B73 (migration longue) puits 2 : ADN de la lignée test NK603 (migration longue)

puits 3 : ADN de la lignée de contrôle B73 mélangé avec 14.5 pg du plasmide PV-ZMGT32 (migration courte)

puits 4 : ADN de la lignée de contrôle B73 mélangé avec 29 pg du plasmide PV-ZMGT32 (migration courte) puits 5 : ADN de la lignée test NK603 (migration courte)

Les flèches montrent la taille des marqueurs poids moléculaire sur gel taché d’éthidium bromide.

Long Run* Short Run* M 1 2 3 4 5 M

23.1 kb

9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb

0.6 kb

0.3 kb 0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb

9.4 kb

6.6 kb

2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb


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Comme on était en droit de l’attendre, l’ADN de contrôle seul (puits 1) ne donne lieu à aucune bande d’hybridation. L’ADN plasmidique, PV-ZMGT32, mélangé à l’ADN de contrôle (puits 3 et 4) conduit, comme attendu, à une bande située à environ 9,3 kb, ce qui correspond à la taille du plasmide entier PV-ZMGT32. L’ADN test du maïs NK603 (puits 2 et 5) produit une seule bande à environ 23 kb, non présente dans le puits de migration de la lignée de contrôle. Ce résultat suggère que le maïs NK603 ne contient qu’une seule insertion de l’ADN intégré, cette insertion étant localisée à l’intérieur du fragment de restriction StuI de 23 kb. Compte tenu de la taille du fragment de restriction StuI, il est possible que plus d’une bande d’hybridation soit localisée à l’intérieur de ce fragment. Cependant, d’autres données permettent de conclure à un seul insert. Ainsi, quand l’ADN génomique est digéré avec XbaI, une enzyme de restriction qui coupe une fois1 seulement à l’intérieur de la cassette de transformation, on obtient deux fragments de bordure après sondage avec PV-ZMGT32 (voir paragraphe D.2c). S’il y avait plus qu’un seul insert localisé à l’intérieur du fragment StuI de 23 kb, alors on s’attendrait logiquement à obtenir plus que deux fragments de bordures. Par conséquent, il a été conclu que le génome du maïs NK603 contient un unique insert situé à l’intérieur du fragment de restriction StuI de 23 kb.

1 Le fragment d’ADN linéaire utilisé pour la transformation contient deux sites XbaI (nucléotides 4083 et 4788, figure 1). Bien que sa présence ait été confirmée, le site XbaI situé à 4083 n’est pas coupé dans l’insert, probablement en raison de la modification du site (c’est à dire à travers une méthylation) ou parce qu’il est structurellement gêné (Whetsell et al., 2000)


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Intégrité des cassettes de gène insérées.

L’intégrité de l’insert a été déterminée en analysant les composants des deux cassettes de gène, à savoir les promoteurs, les régions codantes et les séquences de polyadénylation.

o l’intron P-ract1/ract1. Pour estimer l’intégrité de la séquence intron P-ract1/ract1, l’ADN test NK603, l’ADN de contrôle non transgénique B73, et l’ADN de contrôle non-transgénique mélangé au plasmide PV-ZMGT32 ont été digérés avec l’enzyme de restriction EcoRV, et ont été analysés selon la méthode du Southern Blot. Les échantillons ont été sondés à l’aide d’un mélange de la séquence entière de l’intron P-ract1/ract1 marquée avec du 32P-dCTP et un fragment de 175 paires de base dérivé de l’extrémité 5’ de l’intron P-ract1/ract1 marqué au 32P-dATP. Les résultats sont présentés en Figure 4. Logiquement, l’ADN de contrôle non-transgénique seul (puits 1) ne montre pas de signal d’hybridation. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé à l’ADN de contrôle non-transgénique (puits 3 et 4) produit une bande présagée d’environ 3,8 kb contenant la séquence de l’intron P-ract1/ract1 (Figure 1). L’ADN test NK603 (puits 2 et 5) produit aussi une bande d’environ 3,8 kb confirmant la présence de la séquence de l’intron P-ract1/ract1 dans l’ADN inséré. Une bande d’environ 0,2 kb a été détectée dans la ‘migration courte’ de l’ADN NK603 (puits 5) indiquant la présence d’un fragment additionnel contenant une séquence de l’ intron P-ract1/ract1. Cette bande d’environ 0.2 kb n’a pas été détectée dans le puits 2 parce qu’elle n’a pas été retenue sur le gel après la ‘migration longue’. Des expérimentations complémentaires qui avaient pour but de déterminer les séquences des extrémités de l’ADN inséré dans le maïs NK603 ont révélé qu’un fragment de 217 paires de bases contenant une portion de la région ‘enhancer’ du promoteur de l’actine du riz était présent en sens inverse à l’extrémité 3’ de la cassette de transformation et que ce petit fragment contient un site de EcoRV à une distance d’environ 20 bp de cette extrémité 3’ bordant la séquence génomique du maïs (Figure 5). Ces résultats confirment et expliquent les résultats de l’analyse Southern Blot. Ce fragment de 217 paires de bases inclut une séquence polylinker (50bp) et les premières 167 paires de base de la région ‘enhancer’ du promoteur de l’actine du riz, position 835 à 669 du début de la transcription comme défini par McElroy et al. (1990). Ni la TATA box, ni le site d’initiation transcriptionnelle n’est présent à l’intérieur de ce fragment, ce qui suggère que ce fragment ne doit pas avoir de fonction de type promoteur. Cela est supporté par le travail de Zhang et al (1991) et Wang et al. (1992) qui ont démontré clairement que les régions incluses de 835 à 669 n’ont pas de comportement de type promoteur. Par conséquent, il est très fortement improbable que le fragment de 217 paires de bases à l’extrémité 3’ de l’insert NK603 agisse en tant que promoteur.


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Figure 4 : Analyse Southern Blot du maïs NK603 : P-ract1/ract1 intron

10 microgrammes d’ADN génomique de contrôle B73 et d’ADN test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRV. Les échantillons d’ ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin hybridés avec un mélange de deux sondes : l’intron entier P-ract1/ract1 marqué avec le 32P-dCTP et un fragment de 175 paires de base de l’intron P-ract1/ract1 marqué avec le 32P-dATP . La désignation des puits est la suivante :

Puits 1: ADN de la lignée de controle B73 (Longue migration) 2: ADN de la lignée test NK603 (Longue migration) 3: ADN de la lignée de controle B73 mélangé à 14,5 pg de plasmide PV-

ZMGT32 (Migration courte) 4: ADN de la lignée de controle B73 mélangé à 29 pg de plasmide PV-ZMGT32

(Migration courte) 5: ADN de la lignée test NK603 (Migration courte)


Long Run Short Run M 1 2 3 4 5 M

23.1 kb

6.6 kb 4.4 kb

0.6 kb

0.3 kb 0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb 9.4 kb

6.6 kb 2.3 kb 2.0 kb 1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb


14

Mlu

I

Mlu I

Eco R

V

Sac I

Eco R

V

Sac I

Ec

o RV

Sca I

Sac I

P-ract1

ract1 intron

CTP2

CP4 EPSPS

NOS 3’

e35S

ZmHSP70

CTP2

CP4 EPSPS L214P

NOS 3’

Xba I

Xba I

A 2

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15

o Séquence ctp2-cp4 epsps

Pour évaluer l’intégrité de la séquence ctp2-cp4 epsps, l’ADN test NK603, l’ADN de contrôle non-transgénique et l’ADN de contrôle non transgénique mélangé avec l’ADN plasmidique PV-ZMGT32 ont été digérés avec EcoRV et analysés selon la méthode de Southern Blot. Les échantillons ont été sondés avec le fragment entier cp4-epsps. Les résultats sont présentés en Figure 6. L’ADN de contrôle non-transgénique seul (puits 1) n’a donné lieu à aucune bande d’hybridation, comme attendu. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé avec l’ADN de contrôle non transgénique (puits 3 et 4) et l’ADN test NK603 ont tous produits les bandes attendues d’environ 3,8 kb et 2,8 kb , correspondantes à la taille exacte des deux fragments générés par la digestion réalisée avec EcoRV, contenant chacun une séquence complète du cp4-epsps. Aucune bande d’hybridation non présagée n’a été détectée, établissant ainsi que le maïs NK603 ne contient aucune séquence additionnelle, détectable cp4-epsps, autres que celles présentes dans l’insert qui contient les deux cassettes de gène. La séquence des régions codantes cp4 epsps dans le maïs NK603 a été comparée avec la séquence du plasmide vecteur PV-ZMGT32 par analyse PCR. La séquence des régions codantes cp4 epsps de la première cassette est identique dans l’insert et dans le plasmide. Cependant, la comparaison des séquences d’ADN de l’insert et du plasmide révèle une modification de deux nucléotides dans la seconde des deux régions codantes pour la cp4 epsps : un nucléotide modifié est « silencieux » et l’autre résulte en la modification d’un seul acide aminé dans la protéine exprimée. Plus précisément, l’acide aminé, situé en position 214 est une leucine dans le plasmide et une proline dans l’insert de la plante. La protéine exprimée par la seconde cassette de l’insert a par conséquent été désignée CP4 EPSPS L214P, et la séquence codante correspondante est définie comme cp4 epsps l214p. Les deux modifications de nucléotide sont présentes dans le maïs NK603 depuis sa première transformation.


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Figure 6 : Analyse Southern Blot du maïs NK603 : ctp2-cp4 epsps

10 microgrammes d’ADN génomique de la lignée de contrôle B73 et de la lignée test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRV. Les échantillons d’ ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin sondés à l’aide du fragment entier de cp4 epsps marqué au 32P. La désignation des puits est la suivante :






23.1 kb

6.6 kb 4.4 kb

0.6 kb

0.3 kb

0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb 9.4 kb

6.6 kb 2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

2.3 kb

2.0 kb


17

o Promoteur e35S. Pour évaluer l’intégrité du promoteur e35S, l’ADN test NK603, l’ADN de contrôle non transgénique et l’ADN de contrôle non transgénique mélangé avec l’ADN plasmidique PV-ZMGT32 ont été digérés avec EcoRV et ont été analysés selon la méthode de Southern Blot. Les échantillons ont été sondés avec le fragment entier du promoteur e35S. Les résultats sont présentés en Figure 7. L’ADN de contrôle non transgénique seul (puits 1) n’a donné lieu à aucun signal d’hybridation, comme attendu. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé avec l’ADN de contrôle non transgénique (puits 3 et 4) et l’ADN test NK603 ont tous produits les bandes présagées d’environ 3,8 kb et 2,8 kb , correspondantes à la taille exacte des deux fragments générés par la digestion réalisée avec EcoRV, contenant chacun une portion de séquence e35S (Figure 1). Le fragment d’environ 2,8 kb représente une hybridation de la sonde à une petite partie (91 bp) du promoteur e35S séparé du reste du promoteur e35S par EcoRV : cela est d’ailleurs mis en évidence par un signal d’hybridation plus faible que celui de la bande d’environ 3,8 kb. Aucune bande non présagée n’a été détectée, établissant ainsi que le maïs NK603 ne contient pas de séquence additionnelle e35S détectable autre que celle contenue dans le fragment d’ADN inséré.


18

Figure 6 : Analyse Southern Blot du maïs NK603 : promoteur e35S

10 microgrammes d’ADN génomique de la lignée de contrôle B73 et de la lignée test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRV. Les échantillons d’ ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin sondés à l’aide du fragment e35S entier marqué au 32P. La désignation des puits est la suivante :






23.1 kb 9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb

0.6 kb

0.3 kb 0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb

9.4 kb

6.6 kb 2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb


19

o Séquence de polyadénylation NOS 3’. Pour évaluer l’intégrité de la séquence de polyadénylation NOS 3’, l’ADN test NK603, l’ADN de contrôle non-transgénique et l’ADN de contrôle non transgénique mélangé avec l’ADN plasmidique PV-ZMGT32 ont été digérés avec EcoRV et ont été analysés selon la méthode de Southern Blot. Les échantillons ont été sondés avec la séquence entière de polyadénylation NOS 3’. Les résultats sont présentés en Figure 7. L’ADN de contrôle non-transgénique seul (puits 1) n’a donné lieu à aucun signal d’hybridation comme attendu. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé avec l’ADN de contrôle non transgénique (puits 3 et 4) et l’ADN test NK603 (puits 2 et 5) montrent toutes les bandes présagées d’environ 3,8 kb et 2,8 kb, correspondantes à la taille exacte des deux fragments générés par la digestion réalisée avec EcoRV, contenant chacun une terminaison de transcription et la séquence de polyadénylation NOS 3’ (Figure 1). Aucune bande non présagée n’a été détectée, établissant ainsi que le maïs NK603 ne doit pas contenir de séquence additionnelle de polyadénylation NOS 3’ autres que celles incluses dans les deux cassettes du gène cp4 epsps insérées.


20

Figure 7 : Analyse Southern blot du maïs NK603: séquence de polyadénylation NOS 3’

10 microgrammes d’ADN génomique de la lignée de contrôle B73 et de la lignée test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRV. Les échantillons d’ ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin sondés à l’aide du fragment entier de la séquence de polyadénylation NOS 3’marqué au 32P. La désignation des puits est la suivante :






9.4 kb 6.6 kb

4.4 kb

0.6 kb

0.3 kb 0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb

9.4 kb 6.6 kb

2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb

23.1 kb


21

o Séquence « backbone »

Pour évaluer la présence des séquences ‘backbone’, l’ADN test NK603, l’ADN de contrôle non-transgénique et l’ADN de contrôle non transgénique mélangé avec l’ADN plasmidique PV-ZMGT32 ont été digérés avec SacI et ont été analysés selon la méthode de Southern Blot. Les échantillons ont été sondés avec la séquence ‘backbone’ entière. Les résultats sont présentés en Figure 8. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé avec l’ADN de contrôle non transgénique (puits 3 et 4) ont donné lieu à une bande d’hybridation d’environ 3,8 kb, à savoir la taille présagée pour le fragment contenant les séquences ‘backbone’ (Figure 1). L’ADN de contrôle non-transgénique seul (puits 1) et l’ADN test NK603 (puits 2 et 5) ne présentent pas de signal d’hybridation. Ces résultats établissent que le maïs NK603 ne contient pas de fragments ‘backbone’ détectables du plasmide, dont les séquences codantes ori et nptII. Cela est cohérent, puisque le fragment d’ADN linéaire utilisé pour la transformation avait été ‘purifié’ de ces séquences ‘backbone’.


22

Figure 8 : Analyse Southern blot du maïs NK603: Séquence ‘backbone’

10 microgrammes d’ADN génomique de la lignée de contrôle B73 et de la lignée test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction SacI. Les échantillons d’ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin sondés à l’aide des séquences ‘backbone’ marquées au 32P correspondant aux régions codantes ori et nptII. La désignation des puits est la suivante :

Puits 1: ADN de la lignée de controle B73 (Migration longue) 2 : ADN de la lignée test NK603 (Migration longue) 3: ADN de la lignée de controle B73 mélangé à 14,5 pg de plasmide PV-




Migration longue Migration courte M 1 2 3 4 5 M

23.1 kb 9.4 kb 6.6 kb

0.6 kb

0.3 kb 0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb 9.4 kb

6.6 kb 2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb


23

Conclusion : Les analyses moléculaires du fragment inséré ont établit que les deux cassettes adjacentes, contenant chacune une unique copie du gène cp4 epsps, sont intactes. Comparé au plasmide, deux modifications de nucleotides ont eu lieu dans la seconde des deux régions codantes cp4 epsps. Une des modifications est « silencieuse », l’autre conduiT en la modification d’une leucine en proline à la position 214 dans la protéine CP4 EPSPS qui est exprimée par la deuxième cassette (Cette modification d’acide aminé est indiquée par le suffixe L214P). De plus, un fragment de 217 paires de base contenant une portion de la région ‘enhancer’ du promoteur de l’actine du riz est inversement lié à l’extrémité 3’ des cassettes du gène insérées. Le maïs NK603 ne contient pas de fragments ‘backbone’ d’origine du vecteur employé pour la modification génétique.

b) En cas de délétion, taille et fonction des régions supprimées. Ce paragraphe n’a pas lieu d’être renseigné car il ne s’applique pas dans le cas du maïs ROUNDUP READY NK603.

c) Nombre de copies de l’insert.

Détermination du nombre de copie de l’insert dans le génome du maïs NK603.

Le nombre de copies du fragment d’ADN utilisé pour la transformation et inséré à l’intérieur de l’unique site d’insertion a été déterminé. L’ADN test NK603, l’ADN de contrôle non transgénique et l’ADN de contrôle non transgénique mélangé avec l’ADN du plasmide PV-ZMGT32 ont été digérés avec l’enzyme de restriction XbaI et ont été analysés selon la méthode du Southern Blot. Les échantillons ont été sondés avec le plasmide PV-ZMGT32 marqué au 32P. Compte tenu que cette enzyme XbaI coupe en un unique endroit le fragment d’ADN linéaire, la digestion ne doit produire que deux fragments contenant à la fois l’ADN inséré et l’ADN génomique flanquant, si le maïs NK603 contient une seule copie du fragment d’ADN utilisé pour la transformation. Les résultats de l’analyse Southern Blot sont présentés Figure 9. Comme attendu, l’ADN de contrôle non transgénique seul (puits 1) ne donne lieu à aucune bande d’hybridation. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé à l’ADN de contrôle non transgénique (puits 3 et 4) produit une bande d’environ 9,3 kb, conforme aux attentes, qui correspond à la taille du plasmide entier PV-ZMGT32.


24

Enfin, l’ADN test NK603 (puits 2 et 5) produit deux bandes d’environ 9 et 5,8 kb. Par conséquent, la présence de seulement deux bandes d’hybridation établit que le maïs NK603 contient une seule copie de la cassette de transformation sur le locus d’intégration de l’ADN.

Figure 9 : Analyse Southern blot du maïs NK603: détermination du nombre de copie

10 microgrammes d’ADN génomique de la lignée de contrôle B73 et de la lignée test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction XbaI. Les échantillons d’ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin sondés à l’aide du plasmide PV-ZMGT32 marqué au 32P. La désignation des puits est la suivante :


23.1 kb

9.4 kb 6.6 kb

0.6 kb

0.3 kb 0.2 kb

4.4 kb

23.1 kb

9.4 kb

6.6 kb

2.3 kb

1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb

23.1 kb

2.0 kb


25





d) Localisation de l’insert dans les cellules de la plante (intégré au chromosome, aux chloroplastes ou aux mitochondries, ou sous forme non intégrée), et méthodes utilisées pour sa détermination. Des analyses Southern Blot ont été conduites pour confirmer la localisation et la stabilité de l’ADN inséré dans le maïs NK603. L’ADN génomique extrait de tissus foliaires de la génération F1 (la descendance du back-cross R0) et de la cinquième génération de rétrocroisement (BC5F1) du maïs NK603 a été digéré avec EcoRV, transféré sur un filtre de nylon et sondé avec le fragment entier ctp2-cp4 epsps. Les résultats sont présentés en Figure10. L’ADN de contrôle non transgénique (puits 1) n’a montré aucune séquence d’hybridation. L’ADN plasmidique PV-ZMGT32 mélangé avec l’ADN de contrôle non transgénique (puits 2), l’ADN de la génération F1 du maïs NK603 (puits 3) et de la génération BC5F1 du maïs NK603 (puits 4) ont conduit aux bandes attendues de 3,8 et 2,8 kb, comportant chacune les séquences ctp2-cp4epsps. Aucune différence significative dans les motifs d’hybridation n’a été observée entre l’ADN extrait de la génération F1 et celui issu de la génération BC5F1 du maïs NK603. Cela démontre la stabilité de l’ADN inséré dans les échantillons par-delà 5 générations et est cohérent avec un unique site d’insertion dans l’ADN génomique du maïs ROUNDUP READY.


26

Figure 10 : Analyse Southern blot de la lignée NK603: stabilité de l’ADN inséré.

10 microgrammes d’ADN génomique de la lignée de contrôle B73 et de la lignée test NK603 extraits de tissus foliaires ont été digérés à l’aide de l’enzyme de restriction EcoRV. Les échantillons d’ ADN ont été séparés par électrophorèse, transférés sur un filtre de nylon et enfin sondés à l’aide du fragment entier ctp2-cp4 epsps marqué au 32P. La désignation des puits est la suivante :

Puits 1: ADN de la lignée de controle B73 2: ADN de la lignée de controle B73 mélangé à 29 pg de plasmide PV-ZMGT32 3: ADN de la lignée test NK603 (génération F1) 4: ADN de la lignée test NK603 (génération BC5F1)


23.1 kb

9.4 kb

6.6 kb

4.4 kb

0.6 kb0.3 kb

4.4 kb

23.1 kb

9.4 kb 6.6 kb

2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

2.3 kb 2.0 kb

1.4 kb

0.6 kb

0.3 kb

M 1 2 3 4 M


27

3) Informations concernant l’expression de l’insert.

a) Parties de la plante où l’insert est exprimé (par exemple, les racines, la tige, le pollen, etc…)

Les protéines CP4 EPSPS et CP4 EPSPS L214P, nouvellement introduites, sont présentes à de faibles concentrations dans les grains et le fourrage de maïs ROUNDUP READY NK603. Des études ont été conduites pour caractériser les protéines exprimées et déterminer leur niveau d’expression dans les composants d’alimentation humaine et animale. Ainsi, ces niveaux protéiques ont été estimés dans des échantillons de maïs fourrage et de grains collectés durant la campagne 1998 sur 6 sites au champ non répliqués et deux sites répliqués. Les niveaux d’expression des protéines CP4 EPSPS estimés dans le maïs fourrage et dans les échantillons de grains de maïs ROUNDUP READY NK603 sont résumés ci-dessous. A noter que les valeurs représentent la somme des protéines CP4 EPSPS et CP4 EPSPS L214P, puisque la méthode analytique ELISA reconnaît les deux protéines exprimées dans le maïs NK603.

Tableau 2 : Résumé des niveaux de protéines CP4 EPSPS + CP4 EPSPS L214P mesurés par la méthode ELISA dans des échantillons de plants de maïs NK603 (μg/g de poids frais)

SITES Paramètres Fourrage a,c

(μg/g fw)

Grain b,c

(μg/g fw)

Non répliqué moyenne

fourchette

SD

25.5

18.0 – 31.2

4.5

11.0

6.9 – 15.6

3.2

Répliqué moyenne

fourchette

SD

25.9

25.7 – 26.1

0.3

10.6

9.8 – 11.3

1.0

Tous les sites moyenne

fourchette

SD

25.6

18.0 – 31.2

3.8

10.6

6.9 – 15.6

2.6

DS = deviation standard aLOQ = 0.05 bLOQ = 0.09 cValeurs pour tous les échantillons contrôlés situés sous la limite de quantification de l’essai


28

• Les niveaux moyens de protéines CP4 EPSPS dans le maïs fourrage NK603 sont

comparables pour les sites non répliqués (25,5 μg/g de poids frais) et les sites répliqués (25,9 μg/g de poids frais). Comme on était en droit de l’attendre, les niveaux de protéines CP4 EPSPS dans le fourrage du maïs de contrôle se situent en dessous de la limite de quantification de l’essai (LOQ <0,05 μg/g de poids frais).

• De la même façon, les niveaux moyens de protéines CP4 EPSPS dans les grains de maïs

NK603 sont comparables pour les sites non répliqués (11,0 μg/g de poids frais) et les sites répliqués (10,6 μg/g de poids frais). Là encore, les niveaux de protéines CP4 EPSPS dans les grains de maïs de contrôle se situent, comme attendu, en-dessous de la limite de quantification de l’essai (<0,09 μg/g de poids frais).

Les protéines CP4 EPSPS introduites dans le maïs ROUNDUP READY NK603 s’expriment à des niveaux équivalents dans les plantes d’un même site ou dans celles situées sur des sites géographiquement dispersés. Ces faibles niveaux d’expression des protéines CP4 EPSPS sont suffisants pour conférer à la plante la tolérance au glyphosate, la matière active de l’herbicide ROUNDUP. Enfin, les protéines CP4 EPSPS s’expriment dans la plante entière puisqu’il a été montré que les promoteurs de l’actine du riz et du virus de la mosaïque du chou-fleur e35S, conduisent à une expression constitutive de la protéine encodée dans la plante génétiquement modifiée.


29

4) Stabilité génétique de l’insert et stabilité phénotypique de la plante supérieure génétiquement modifiée. Les données de ségrégation réalisées sur neuf générations de la descendance du maïs NK603 sont présentées dans le Tableau 3 et démontre la stabilité de l’ADN inséré au travers de 6 générations de rétrocroisement et trois générations d’autofécondation. Les données sont présentées pour :

- la génération BC01F1 (dérivée du croisement de RO avec la lignée parentale public B73),

- la génération BC1F1 (dérivée du croisement des plantes BC0F1 avec la lignée B73), - les générations BC2F1, BC3F1, BC4F1, BC5F1 - la génération BC2F2 (dérivée de l’autocroisement des plantes BC2F1 entre elles) - la génération BC2F3 (dérivée de l’autocroisement des plantes BC2F2 entre elles) - et la génération BC4F3.

L’analyse statistique de ces données de ségrégation a été faite au travers d’une analyse χ² (chi carré). Pour ce faire, la valeur du χ² a été calculée selon :

χ² = ∑ [(⎮ o –e ⎟ - 0,5)² / e ] où

o = les fréquences observées pour chaque classe e = les fréquences théoriques attendues pour chaque classe 0,5 = le facteur correcteur de Yates pour l’analyse χ² à un degré de liberté (df) (Little et Hills, 1978).

Les valeurs du χ² ainsi calculées ont été comparées aux données d’une table du χ² pour déterminer si les fréquences observées sont cohérentes avec les attentes pour un unique insert à p = 0,05 et / ou p = 0,01. Toutes les générations ont été ségrégées, comme attendu pour un unique site d’insertion, excepté pour la génération BC2F1. Le nombre plus élevé qu’attendu de plantes positives (c’est à dire contenant le gène cp4 epsps) dans la génération BC2F1 peut s’expliquer par une sélection des gamètes suite à de fortes doses de glyphosate appliquées sur la génération précédente, à savoir BC1F1. En effet, la sélection préférentielle pour les gamètes ‘positives’ a été documentée, lorsque des agents sélectifs tels que des herbicides sont appliqués (Sari-Gorla et al., 1994, Touraev et al., 1995).


30

Les résultats de l’analyse χ² de ségrégation sont cohérents avec un site actif unique d’insertion des cassettes de gènes cp4 epsps et cp4 epsps l214p dans l’ADN génomique du maïs ROUNDUP READY NK603, ségrégé selon une génétique mendélienne. La stabilité génétique de l’insert est démontrée au travers de 6 générations de rétrocroisement et de 3 générations d’autopollinisation. Ces résultats viennent ainsi conforter ceux obtenus au travers des analyses moléculaires précédemment décrites (cf paragraphe D.2.c)). En effet, elles ont permis de confirmer la stabilité génétique de l’ADN inséré dans le maïs NK603 : aucune différence significative dans les bandes de migration n’a été observée entre l’ADN extrait de la génération F1 et celui de la génération BC5F1 (cinq rétro-croisements) du maïs NK603, démontrant ainsi la stabilité de l’ADN inséré dans les échantillons sur cinq générations. Dans des études supplémentaires, la stabilité des séquences d’ADN introduit a été confirmée dans sept générations représentant cinq lignées différentes, dérivées de l’événement de transformation original (Hillyard et al., 2000).

Tableau 3 : Données de ségregation et analyse de la descendance du maïs NK603

Observé 1 Théorique 1 Generation Positive Negative Segregating Positive Negative Segregating ChiSq BC0F1 14 15 14.5 14.5 0.00ns

BC1F1 32 23 27.5 27.5 1.16ns

BC2F1 135 81 108.0 108.0 13.00*

*

BC2F2 86 26 84.0 28.0 0.12ns

BC2F3 9 16 24 12.3 12.3 24.5 2.02#

BC3F1 44 45 44.5 44.5 0.00ns

BC4F1 127 103 115.0 115.0 2.30ns

BC4F3 12 5 17 8.5 8.5 17.0 2.88#

BC5F1 26 35 30.5 30.5 1.05ns

1 Nombre de plantes positives ou négatives d’après l’application de glyphosate, excepté pour les générations BC2F3 et BC4F3 pour lesquels le nombre de plantes positives et homozygotes, négatives et homozygotes ou ségréguant a été donné d’après l’application de glyphosate.

ns non significatif à p = 0.05 (χ² = 3.84, 1 df). # non significatif à p = 0.05 (χ² = 5.99, 2 df). **significatif à p = 0.01 (χ² = 6.63, 1 df).


31

BIBLIOGRAPHIE

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ANNEXE - Ministère de l'agriculture et de l'alimentation · La carte linéaire du fragment de restriction plasmidique PV-ZMGT32L est présentée en Figure 2. Figure 2 : Carte linéaire