Apoptose/chimiorésistance

des cellules d’ostéosarcome

Les ostéosarcomes

• Tumeurs primitives osseuses- Ostéoblastes malins

• Localisées principalement dans les os longs

• Surviennent majoritairement dans la

deuxième décennie (moyenne à 16 ans),

2ème pic d’apparition après 65 ans

• Tumeurs hétérogènes constituées

d’un os pathologique, associées à

des lésions ostéolytiques

• Tumeurs résistantes :

70% des patients survivent sans évènement à 5 ans

•Associées à des métastases

Les ostéosarcomes: étiologie

Altérations des gènes contrôlant le cycle cellulaire

• p53

• pRB

• c-myc

• p16

Altérations de l’expression des gènes impliqués dans la

différenciation ostéoblastique

• Runx2

• Ostérix

• Signalisation induite par WNT

• Perte du contrôle du cycle cellulaire

• Déstabilisation du génome

Altérations de la

différenciation

Les ostéosarcomes : traitements

Protocole OS2006 : étude clinique de phase III

Chirurgie conservatrice

Chimiothérapie préopératoire et postopératoire (suivant l’âge)

Bisphosphonate : zolédronate

Anti métabolites

Méthotrexate

Agents intercalants

Transcription Réplication

doxorubicine, cisplatine

Agents Alkylants

Ifosfamide Etoposide (VP-16)

Inhibiteur TopoII

Les ostéosarcomes: résistance aux traitements

↑ Export des agents

cytotoxiques

transporteurs ABC

↑ Réparation de l’ADN

Altération de l’apoptose

Inactivation des agents cytotoxiques

agents cytotoxiques

↓ Import des agents cytotoxiques

Perturbation des points de contrôle du

cycle cellulaire

diminution de la réponse apoptotique

Bcl-2, Bax, survivine

Chk1

GST

NER, TLS

Signalisation WNT et développement des ostéosarcomes

b-catenin

b-catenin

APC

GSK3

AXIN

WIF-1

-Expression de LRP5 dans des tumeurs humaines corrèle

avec la présence de métastases et une survie réduite des

patients (Hoang et coll., Int J Cancer, 2004)

-L’inhibition de LRP5 par un dominant négatif (DN)

diminue la croissance tumorale et les métastases dans un

modèle de tumeurs chez la souris

(Guo et coll., Clin Orthop Relat Res, 2008)

-WIF-1 est inhibé par des modifications épigénétiques (Kansara et coll., J Clin Invest, 2010)

-Altérations fréquentes du gène Apc qui corrèle avec un

mauvais pronostic (Entz-Werlé et coll., Neoplasia, 2007)

-Les souris Apc1638N/+Twist-null/+ développent des

tumeurs de type ostéosarcome (Entz-Werlé et coll., Trans Onc, 2010)

Altérations de la b-caténine dans les ostéosarcomes ?

-Accumulation de la b-caténine dans le cytoplasme

ou dans les noyaux (Haydon et coll., Int J Cancer, 2002)

-Accumulation de la b-caténine à la membrane

-Inactivation de la voie Wnt (Cai et coll., J Pathol, 2009)

Signalisation Wnt et réponse à la chimiothérapie ????????

Activation de la voie Wnt/b-caténine/TCF dans des lignées

de cellules humaines dérivées d’ostéosarcome

Activité transcriptionnelle

des facteurs TCF

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Cellules

d’ostéosarcome

Cellules

ostéoblastiques WRE WRE WRE WRE WRE LUCIFERASE

Plasmide TOPFlash

Matrice

extracellulaire

Récepteur

Enzymes

Facteurs

de croissance Assemblage

Clivage

Intégrines

signalisation

-Prolifération

-Différenciation

-Adhésion/migration

-Dépôt de la matrice

Le syndécan-2

SYNDÉCAN-2

E F Y A

Activité

catalytique

de PKCd

PKCδ

APOPTOSE

E F Y A

JNK

JNK-P

Syndécan-2 et apoptose

Le SYNDECAN-2 module la

signalisation cellulaire pour

induire ou favoriser l’APOPTOSE ERK

PI3K

NFkB

Modrowski et coll., Bone, 2005

Orosco, A. et coll., J Cell Biochem, 2006.

Villena, J., et coll., Apoptosis, 2006.

K7M2 K7M2+SYND2

Syndécan-2 = suppresseur de tumeur

Cellules K7M2 sont dérivées d’un ostéosarcome spontané chez la souris BalB/c

Le syndécan-2 module la

réponse aux agents de

chimiothérapie

Apoptose

+Syndécan-2

Doxorubicine

siRNA Syndécan-2

Doxorubicine

Défaut de syndécan-2 dans les ostéosarcomes

Orosco et coll., Cancer Research, 2007

Cellules

Ostéoblastiques MG63 U2OS SaOS2 OHS4

Exp

res

sio

n R

ela

tive d

u

Syn

deca

n-2

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

*

PCR

Exp

res

sio

n

du

Syn

decan

-2

1

2

3

4

Tissus

Osseux sains

Tissus

Tumoraux

*

Immunohistochimie

* Indique P <0,05

Les facteurs TCF répriment l’expression de syndécan-2

Sites de liaison TCF/LEF

ChIP

5’UTR LUC

Activité promoteur syndécan-2

R L

U

ARNm syndécan-2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Ctl

*

siTCF

DD

CT

0

1

2

3

*

TCF Ctl

* Indique P <0,05

TCF

FZD

β-caténine

WNT

LRP5/6

Expression du Syndecan-2

Wnt/β-caténine/TCF réprime le syndécan-2

RLU

0

1

2

3

*

Activité Promoteur Syndécan-2

β-caténine

contrôle

*

Wnt3a * Indique P <0,05

Signalisation Wnt/β-caténine/TCF et chimiorésistance des ostéosarcomes

Sélection de cellules résistantes

Traitement 24h

Doxorubicine 50ng/mL

semaine 1

semaine 2

semaine 3

semaine 4

Traitement

Traitement

Traitement

Lignées cellulaires d’ostéosarcome

Viabilité

ng/ml doxorubicine 0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200

U2OS

U2OS Résistantes

U2OS

U2OS + Syndécan-2

U2OS résistantes

U2OS résistantes + Syndécan-2

Doxorubicine (ng/ml)

20

40

60

80

100

0 10 25 50 75

Via

bili

té

(% d

e c

ellu

les

con

trô

le)

La surexpression de syndécan-2 rétablit la sensibilité à la doxorubicine

La doxorubicine n’induit pas le syndécan-2 dans les cellules résistantes

8012 13301

12174 13549

Cellules

U2OS

Cellules

U2OS

résistantes

ARNm du Syndécan-2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Doxorubicine - + - + (50ng/ml)

U2OS

U2OS

Résistantes *

ΔΔ

CT

Expression du syndécan-2 dans des tumeurs humaines

avant Chimiothérapie après Chimiothérapie

FoxO3a module l’induction de syndécan-2 par la

Doxorubicine

* Indique P <0,05

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 *

ΔΔ

CT

ARNm du syndécan-2

FoxO3a

Vecteur vide

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 * *

0.0

ΔΔ

CT

ARNm du syndécan-2

Contrôle

Doxorubicine

Doxorubicine + siFOXO3a

ATCA Site de liaison pour FoxO3a muté

AACA Site de liaison pour FoxO3a

Région 5’ du syndécan-2

p-3.62-LUC

5’UTR LUC

Région 5’ du syndécan-2

p-3.62-LUC

5’UTR LUC

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

AACA ATCA *

*

R L

U

Activité de p-3,62-LUC

FoxO3a module l’induction de syndécan-2 par la

doxorubicine de façon indirecte

* Indique P <0,05

FoxO3a interagit avec β-caténine sous stress oxydatif

Essers et Coll, Science, 2005

Doxorubicine/FoxO3a interagit avec WNT/β-caténine/TCF

* Indique P< 0,05

0

20

40

60

80

100

% I

np

ut

Liaison de TCF4

au promoteur du syndécan-2

Doxorubicine - +

*

0.2

0.6

1.0

1.4

1.8

ΔΔ

CT

Expression du syndécan-2

Doxo

FoxO*

Wnt

b-cat

TCF

Doxorubicine - + + TCF - + - b-Cat* - - +

bcat TCF

Doxorubicine Wnt

Transcription du syndécan-2

bcat TCF

Doxorubicine Wnt

Transcription du syndécan-2

Cellules sensibles Cellules résistantes

Syndécan-2

Résumé

Syndécan-2 FoxO

TCF

FZD

β-caténine

WNT

LRP5/6

Expression du Syndecan-

2/ Réponse à la

doxorubicine?

DKK1

sFRP-1

PKF115-584

Effets des inhibiteurs Wnt sur la réponse à la doxorubicine

Effets des inhibiteurs de Wnt sur l’activité de la doxorubicine

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 *

*

U2OS U2OS résistantes

*

R L

U

(ce

llu

les

tra

ité

es

/ c

ell

ule

s

no

n-t

rait

ée

s)

0.0

Activité transcriptionelle des

facteurs FoxO

β-caténine est nécessaire à l’action de la Doxorubicine

FoxO3a β-caténine

Contrôle

Doxorubicine

Doxorubicine

+

sFRP1/ Dkk1

Doxorubicine

+

PKF 115-584

* Indique P <0,05

L’inhibition de l’activité TCF réduit la

viabilité cellulaire in vitro

Doxorubicine - + - + - + - +

Viabilité cellulaire (% des contrôles)

Cellules

sensibles

0

20

40

60

80

100

120

a a

b

Cellules

résistantes

+ PKF115 - - + + - - + +

b

b

H&E/Safran

Injection des

cellules

J-0 J-21

Doxorubicine

2 mg/Kg IV

J-28

Doxorubicine

2 mg/Kg IV

PBS

PKF 115-584

0,5mg/kg IP

Modèle d’ostéosarcomes in vivo

Sacrifice

J-35

K7M2

Vo

lum

e T

um

ora

l (

mm

3)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

p= 0.0012

p= 0.028

p= 0.07

L’inhibition de l’activité transcriptionnelle TCF augmente

l’effet de la doxorubicine in vivo

Sans

cellules K7M2

K7M2

Doxorubicine K7M2

Doxorubicine +

PKF 115-584

*

*

Conclusions

-Activation de la signalisation Wnt/b-caténine/TCF

Freine la réponse aux agents de chimiothérapie

-La b-caténine est impliquée dans l’inhibition et l’induction de la réponse cellulaire

Inhibition ciblée de l’activité des facteurs TCF = Nouvelle stratégie thérapeutique dans l’ostéosarcome ?

D’après Khosla, 2008

β-caténine : molécule clé du système Wnt

CSM

Ostéoprogéniteur

Pré-ostéoblaste

Ostéoblaste

Ostéocyte

Apoptose

Survie

Renouvellement

Engagement

Prolifération

+

+

+ +

+

+

+ -

Multifonctions de la signalisation Wnt/β-caténine dans

les cellules souches embryonnaires dépend de:

1- expression des effecteurs Wnt

2- recrutement de co-facteurs par la β-caténine

Différenciation

Minéralisation

de la matrice

b-caténine

Activités transcriptionnelles et épigénétiques de la b-caténine

Développement de petites molécules ciblant

spécifiquement une activité de la b-caténine

b-caténine

TCF

p300 CBP

Phénotype

Cellules Souche

Initiation

de la Différenciation

IQ-1

Renouvellement des

cellules souches

ICG-001

Apoptose

des cellules cancéreuses

PKF-115-584