Applications de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF en microbiologie

© Springer-Verlag France 2011 - DOI 10.1007/s11834-011-0056-6 - BIOTRIBUNE MAG - trimestriel octobre 2011 - Vol. 39

Dossier 35

Résumé : Depuis quelques années, la spectrométrie de massede type MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/IonizationTime-Of-Flight) se développe dans les laboratoires de microbio-logie clinique. Cette technologie permet l’identification rapide etprécise en routine des principaux micro-organismes isolés àpartir, soit de colonies obtenues en cultures, soit directementde certains prélèvements (hémocultures, urines). D’autres appli-cations sont en cours d’étude comme le typage des souches, larecherche de facteurs de virulence ou encore de marqueurs derésistance aux antimicrobiens. Mots clés : Identification bactérienne, MALDI-TOF-MS, routine,prélèvements cliniques, empreintes spectrales

MALDI-TOF mass spectrometry toolsfor bacterial identificationin clinical microbiology laboratory

Abstract: In the last few years, matrix assisted laser

desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-

TOF-MS) has been introduced in clinical laboratories for routine

identification. Initially used for research, MALDI-TOF-MS allows

rapid and accurate identification of the main microorganisms

isolated from clinical samples, by intact cell mass spectrometry

or directly from positive blood culture or urines. Other applica-

tions are being in processed as bacterial typing, research and

detection of antibiotic resistance or particularly virulent strains.

Keywords: Bacterial identification, MALDI-TOF-MS, routine iden-

tification, clinical samples, spectral patterns

IDENTIFICATION DES MICRO-ORGANISMESLa capacité d’identifier un micro-organisme et ainsi de pouvoir

le rattacher à un genre voire même à une espèce d’intérêt

clinique est essentiel à la prise en charge médicale des patients

et dépend d’une taxonomie bien établie ainsi que d’une nomen-

clature la plus stable possible. Reconnaître et identifier une

espèce permet, en connaissant son pouvoir pathogène, sa résis-

tance intrinsèque aux antibiotiques, d’une part de réaliser le

diagnostic microbiologique et d’autre part de proposer un

traitement adapté. Il est établi qu’en cas de sepsis, le retard au

diagnostic ainsi qu’une thérapeutique initiale non adaptée, sont

associés à une augmentation de la mortalité et de la morbidité

[1]. Il en résulte un besoin de « gagner du temps » par rapport

aux techniques d’identification usuelles conventionnelles afin

d’optimiser la prise en charge du patient.

Classiquement, l’identification des micro-organismes repose dans

un premier temps sur des tests d’orientation simples comme

l’aspect des colonies, les exigences de culture, la coloration de

Gram, la mobilité etc., qui permettent d’adapter dans un second

temps le choix les tests phénotypiques à réaliser. C’est en

confrontant ces premiers résultats aux principaux caractères bio-

chimiques (présence ou non d’enzymes, utilisation de certains

sucres etc...), ainsi qu’aux phénotypes de résistance aux anti-

microbiens que l’on obtient une identification fiable [2]. Les

systèmes d’identification de type galerie API, de par leur sim-

plicité d’utilisation et leur efficacité à identifier les principaux

germes isolés en pratique courante médicale, sont très largement

utilisés dans les laboratoires. La lecture automatisée de ces

galeries d’identification couplée à la réalisation d’antibiogramme

en milieu liquide a vu le développement de différents systèmes

commercialisés (Vitek® 2 BioMérieux, Phoenix® BD, Walk Away®

Siemens…). Tous ces systèmes nécessitent la culture du micro-

organisme, obtenue généralement en 24 h voire un peu plus

rapidement pour certains automates. Pour les micro-organismes

dits « fastidieux » dont la croissance est lente ou difficile ou

pour lesquels les tests phénotypiques classiquement utilisés ne

sont pas performants, l’identification par ces techniques usuelles

est impossible. L’identification par biologie moléculaire (amplifi-

cation puis séquençage des gènes codant pour les ARN 16S,

rpoB, sodA etc….) est alors une alternative [3, 4]. Ces techniques

nécessitent une certaine expertise et les délais de rendus ainsi

que les coûts sont augmentés. D’autres techniques comme l’uti-

lisation de puces à ADN (microarrays) ont été développées et

utilisées en microbiologie [5].

L’identification des micro-organismes par spectrométrie de masse

de type MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/

Ionization Time-Of-Flight) représente actuellement une révolution

technologique importante pour la microbiologie. Cette

Applications de la spectrométrie de massede type MALDI-TOF en microbiologie

E. Carbonnelle1,2, L. Raskine3

1 Hôpital Européen Georges Pompidou, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Service de microbiologie, 20, rue Leblanc, 75908 Paris Cedex 15.E-mail : [email protected] Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Faculté de médecine, Paris France.3 Groupe hospitalier St Louis, Lariboisière, F Widal, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Service de bactériologie-virologie,2, rue Ambroise Paré, 75475 Paris Cedex 10. E-mail : [email protected]

MISE AU POINT

��

Technologies innovantes en biologie clinique

Vol. 39 - trimestriel octobre 2011 - BIOTRIBUNE MAG - © Springer-Verlag France 2011 - DOI 10.1007/s11834-011-0056-6

Dossier36 Technologies innovantes en biologie clinique

technique permet d’obtenir en quelques secondes, un

spectre de masses moléculaires des différentes protéines pré-

sentes dans un échantillon (empreinte spectrale). En comparant

les emprein tes spectrales obtenues aux spectres spécifiques

des micro-organismes de référence inclus dans les banques de

données, il est alors possible d’obtenir en quelques minutes

une identification précise pour un coût d’utilisation inférieur aux

tests classiques. Nous ne développerons pas en détail dans

cette revue le principe ni l’historique de la spectrométrie de

masse. En revanche, nous insisterons sur les développements

en cours ainsi que sur les limitations et les difficultés rencontrées

en routine.

LE MALDI-TOF-MS EN MICROBIOLOGIE :UNE HISTOIRE RÉCENTEDepuis sa mise au point au début des années 1990, la spec-

trométrie de masse de type MALDI-TOF s’est développée dans

différents domaines de la recherche fondamentale. Grâce à une

ionisation douce, il est devenu possible de détecter de larges

fragments et/ou complexes protéiques, ouvrant ainsi de nouvelles

perspectives d’étude impossible jusqu’alors [6]. Rapide ment,

les microbiologistes se sont intéressés à cette technique et les

premières identifications bactériennes à partir de cellules

intactes, sans utilisation de protocoles complexes de préparation

des échantillons, ont été obtenus avec succès [7-9].

Depuis ces premiers travaux, l’ensemble des publications

concernant l’identification des bactéries mais aussi des cham-

pignons et des levures, permet d’affirmer que les empreintes

spectrales des principales espèces cultivables identifiées en

routine ont été obtenues. Seng et al. ont récemment publié une

revue exhaustive sur l’ensemble des micro-organismes identi-

fiables par cette approches [10].

L’identification par cette technique repose sur le fait que le

spectre obtenu varie d’un genre à l’autre, d’une espèce à l’autre

voire même d’une sous-espèce à l’autre, permettant ainsi de

discriminer les micro-organismes entre eux (figures 1 et 2).

La réalisation des banques de données doit donc sélectionner

parmi l’ensemble des pics, ceux qui sont spécifiques de la souche

de référence étudiée. En effet, parmi les peptides détectés, il a

été démontré que certains pics sont spécifiques du genre et de

l’espèce et qu’ils sont fréquemment retrouvés à condition que les

principaux critères culturaux soient maîtrisés et comparables d’une

acquisition à l’autre. Malgré l’efficacité de cette technique, le déve-

loppement et la généralisation de cette technique au sein des labo-

ratoires n’ont pas connu un succès immédiat. En effet, identifier

un nombre restreint d’espèces et si possible le plus éloignées taxo-

nomiquement parlant comme c’est le cas dans la plupart des pre-

mières études réalisées est une chose, une utilisation en routine

nécessitant des identifications « tous azimuth » d’espèce souvent

proches les unes des autres en est une autre. Le développement

des banques de données permettant l’identification en routine

repose donc sur les différents points évoqués. Plusieurs stratégies

existent actuellement, mais elles ont toutes pour objectifs de sélec-

tionner les pics spécifiques d’une espèce donnée. Emonet et al.

ont récemment publié une revue détaillant les principes des trois

Figure 2 : Empreintes spectrales obtenues à partir de colonies entièresde 5 staphylocoques d’espèces différentes.

Figure 1 : Empreintes spectrales obtenues à partir de colonies entièresde 7 espèces bactériennes différentes, sans étape d’extraction(matrice : a-CHCA).

��


Dossier 37Technologies innovantes en biologie clinique

principales banques de données (MALDI Biotyper Bruker, SARAMIS

Anagnostec BioMérieux, ANDROMAS) permettant l’identification

par MALDI-TOF-MS [11]. L’identification du micro-organisme étudié

repose sur la comparaison du spectre obtenu à ceux de références

contenus dans la base de donnée. Comme pour les analyses des

séquences nucléotidiques par BLAST ou FASTA, la plus forte

concordance (« matches ») est retenue et les résultats sont rendus

avec un coefficient de similarité. Les progrès réalisés dans le

domaine de la génomique avec l’augmentation du nombre de

génomes séquencés disponibles ont permis d’identifier certains

pics au sein des empreintes spectrales. Il est maintenant établi

que la grande majorité des pics détectés entre 2 et 20 kDa corres -

pond aux protéines ribosomales et à des protéines des gènes de

ménage (« house keeping » gene) ce qui explique en partie le

caractère spécifique et constant des spectres par espèce malgré

les variations rencontrées lors de différentes acquisitions. Ces

données laissent envisager le développement de stratégies per-

mettant, au même titre que le MLST, de typer les bactéries et de

réaliser des comparaisons phylogénétiques. Parmi les autres pro-

téines identifiées, on retrouve des protéines de choc thermique

(cold shock proteins), des DNA binding proteins ou encore des

RNA chaperones [12-14]. Afin d’obtenir des identifications fiables,

il est important de maîtriser les différents paramètres expérimentaux

qui influencent la qualité des spectres. Les milieux de culture, la

concentration en NaCl, la nature des tampons utilisés influencent

la qualité des spectres. Une fois la majorité de ces paramètres

standardisés, la reproductibilité et la précision des identifications

sont parfaitement fiables au sein d’un laboratoire

et d’un laboratoire à l’autre [15, 16]. Ces données soulignent

l’importance lors de la réalisation des bases de données, d’avoir

à disposition un large panel d’espèces différentes représentatif

des principales espèces rencontrées en routine avec si possible

le plus grand nombre de souches d’une même espèce. Il est

ensuite nécessaire de faire varier pour chaque souche les condi-

tions expérimentales afin de prendre en compte les variations inhé-

rentes aux conditions expérimentales.

PRINCIPES DE L’UTILISATION DU MALDI-TOF-MSEN MICROBIOLOGIELe schéma général de l’identification par MALDI-TOF-MS est

illustré dans la figure 3 et un protocole détaillé des différentes

étapes peut être retrouvé dans la publication de Freiwald et al.

[17]. Les micro-organismes à identifier sont obtenus à partir des

colonies poussant sur des milieux de culture solides ou à partir

de cultures en milieu liquide. Cette approche simplifie au

maximum la préparation de l’échantillon à analyser, on parle

alors d’acquisition sur bactéries intactes. Cette méthode de pré-

paration de l’échantillon est simple et très rapide pouvant être

réalisé par du personnel non spécialisé en spectrométrie de

masse. Les bactéries sont déposées directement sur une plaque

métallique support (figure 3). Aucune étape complexe de puri-

fication de l’échantillon n’est nécessaire. L’obtention d’un spectre

de qualité dépend essentiellement de la quali té du dépôt

effectué. Peu de matériel est nécessaire pour obtenir une

empreinte spectrale de qualité et bien souvent les difficultés

d’identification rencontrées sont liées à de mauvais dépôts avec

excès de matériel déposé. Une fois l’échantillon séché sur la

plaque cible, il est recouvert par la matrice dont la nature est

adaptée au type d’analyse que l’on souhaite réaliser. Le rôle de

la matrice est d’absorber l’énergie provenant du laser ce qui

provoque la vaporisation de l’échantillon avec formation d’ions.

Ces ions de masse et de charge différentes sont soumis à un

champ électrique. Ils « volent » ensuite jusqu’à un détecteur

situé à l’extrémité du tube de vol et la distance parcourue en

un temps donné (« Time-Of-Flight ») est fonction du rapport de

leur masse sur la charge (m/z). Les informations essentielles

utilisées pour l’identification sont donc contenues dans une liste

de pics contenant les rapports m/z et les intensités relatives de

chaque pic, l’ensemble de ces données caractérisant l’empreinte

spectrale de l’échantillon.

Les matrices les plus courantes pour ce type d’analyse sont l’acide

2,5-dihydroxybenzoïque (acide gentisique ou DHB), l’acide

trans-3,5-diméthyloxy-4-hydroxycinnamique (acide sinapinique ou

SA) et l’acide a-cyano-4-hydroxy-cinnamique (a-CHCA). Elles

permettent entre autre l’analyse de substrats peptidiques, glyco-

peptidiques et lipidiques. Actuellement, le dépôt en « goutte

épaisse » utilisant l’a-CHCA sur l’échantillon sec est largement

utilisé pour les identifications de routine. En effet, la cristallisation

obtenue est homogène contrairement à la DHB, permettant une

utilisation automatique des acquisitions par le spectromètre avec

une excellente qualité de spectres. D’autres techniques de dépôt

existent : les préparations en « couches minces » pour lesquelles

l’échantillon est déposé sur une couche de matrice préalablement

déposée sur la plaque cible pour former de larges films minces

polycristallins, les préparations en « sandwich » où l’échantillon

est déposé su r un film de matrice avant d’être lui-même recouvert

par une dernière couche de matrice. Après évaporation des

solvants, la matrice co-cristallise avec l’échantillon et l’ensemble

peut être analysé. Des protocoles plus complexes ont été proposés

afin d’augmenter la qualité des empreintes spectrales mais dans

la grande majorité des cas, ils ne sont pas nécessaires pour une

utilisation de routine [18]. En revanche, pour certains micro-orga-

nismes comme les levures ou les mycobactéries, certains auteurs

préconisent de réaliser auparavant une étape d’extraction [19].

APPLICATIONS PRATIQUES EN MICROBIOLOGIELa spectrométrie devient un outil majeur en routine de microbio-

logie clinique pour essentiellement deux raisons, d’une part il est

maintenant possible de travailler directement sur des bactéries

cultivables intactes et d’autre part les bases de données permet-

tant de comparer les spectres de masses sont disponibles.

Dépôt des échantillons Acquisition des spectres Identification

Figure 3 : Schéma d’identification par MALDI-TOF à partir des colonies.



Cette méthode permet en quelques minutes, par une approche

technique simple et peu coûteuse (hors achat de l’appareil), d’ob-

tenir une identification précise et fiable et au final d’optimiser la

prise en charge des patients. Après un début plutôt « timide »

avec moins de 10 laboratoires équipés en France en 2009, le

MALDI-TOF-MS s’implante rapidement maintenant, aussi bien dans

les laboratoires hospitaliers que dans les laboratoires d’analyse

médicale. L’investissement initial, certes conséquent, la crainte de -

vant la fiabilité d’une technologie nouvelle dont nous n’avons pas

encore de recul, incitent à la réflexion. Néanmoins, l’installation de

cet automate au sein du laboratoire, la prise en main par le person -

nel médicale et technique, la conviviali té d’utilisation, le rende très

vite indispensable. Ce succès bien réel peut justifier les titres

souvent élogieux retrouvés dans certaines publications. Seng et al.

sont parmi les premiers à avoir utilisé cette technologie en routine

à partir des prélèvements cliniques [20]. Cette étude qui concerne

un nombre important de souches (1 660 souches réparties sur 45

genres), évalue la performance en terme d’identification, mais aussi

le délai pour le rendu des résultats et le coût en comparaison aux

techniques classiquement utilisée. L’ensemble des résultats est

résumé dans le tableau 1 ainsi que les principales publications

d’utilisation en routine [21-29]. Les identifications obtenues au genre

et à l’espèce varient de 95 % à 98 % et de 85 % à 95 % respec-

tivement. Ces excellents résultats ont été ob tenus aussi bien avec

le système Biotyper Bruker qu’avec SARAMIS Anagnostec

BioMérieux. Néanmoins, ils ne doivent pas masquer certaines dif-

ficultés rencontrées par l’ensemble des systèmes dont certaines

sont majeures (tableau 1) en particulier avec les bactéries à Gram

positif. La distinction entre les streptocoques du groupe mitis/oralis

et les Streptococcus pneumoniae est pratiquement impossible. Il

Auteurs Echantillons Id à l’espèce Id au genre Principales difficultés Commentaires

Seng et al., Routine Tous les prélèvements 83,8 % 95,0 % Propionobacterium acnes Dans cette étude, le MALDI-TOF est utilisé2009 [20] (n = 1 660) de routine Streptococcus pneumoniae première ligne pour l’identification.

Stenotrophomonas maltophiliaShigella sp.

Blondiaux et al., Routine Tous les prélèvements 72,9 % 87,0 % Streptococcus du groupe viridans2009 [21] (n = 362) de routine Shigella sp.

van Veen et al., Routine Tous les prélèvements 92,0 % 98,8 % Streptococcus pneumoniae2010 [22] (n = 980) de routine Bactéries anaérobies

Bizzini et al., Routine Tous les prélèvements 93,2 % 98,5 % Shigella sp. Une étape d’extraction permet d’augmenter2010 [23] (n = 1 371) de routine Staphylococcus sp. le % de résultats valides de 22,9 %.

Erreurs de taxonomie essentiellement.

Gravet et al., Routine Tous les prélèvements nd 98,8 % Corynebacterium sp. Dans cette étude, le MALDI-TOF est utilisé2010 [24] (n = 10 000) de routine Streptococcus sp. première ligne pour l’identification.

Bessède et al., Routine Tous les prélèvements 97,3 % 99,0 % Acinetobacter sp. Une étape d’extraction permet d’augmenter2010 [25] (n = 1 013) de routine Streptococcus pneumoniae le % d’identification à l’espèce de 14,7 %.

Nombre insuffisant de souches dansla banque de données pour certainesespèces.

Dauwalder et al., Routine Tous les prélèvements 94,4 % 98,5 % Streptocoques et entérocoques Analyse en routine du système2011 [26] (n = 323) de routine Anaérobies Axima/Saramis/SirWeb MALDI-TOF

Corynebactéries

Benagli et al., Routine Tous les prélèvements nd 98,0 % Etude de la sensibilité et de la spécificité2011 [27] (n = 1 019) de routine du MALDI-TOF. Sensibilité moindre pour

les espèces K. oxytoca et E. cloacae

Sogawa et al., Routine Tous les prélèvements 91,7 % 97,0 % Stenotrophomonas maltophilia Comparaison de trois MALDI-TOF2011 [28] (n = 468) de routine Absence d’identification avec de gamme différente (Bruker)

des souches muqueuses deK. pneumoniae, S. pneumoniae,P. aeruginosa

Neville et al., Routine Tous les prélèvements 85,0 % 96,0 % Streptococcus pneumoniae2011 [29] (n = 927) de routine Streptocoque groupe mitis/oralis

Tableau I : RÉSUMÉ DES PRINCIPALES ÉTUDES UTILISANT LE MALDI-TOF EN ROUTINE POUR L’IDENTIFICATION BACTÉRIENNE.

GN : Gram négatif. GP : Gram positif. nd : non disponible.



est alors recommandé de recourir à une technique conventionnelle

comme la recherche de la sensibilité à l’optochine. Cette recherche

peut être menée conjointement à la réalisation de l’antibiogramme,

ce qui permet de confirmer l’identification avec certitude en même

temps que la sensibilité de la souche aux antibiotiques. Ce point

parti culièrement délicat de l’identification des streptocoques du

groupe mitis/oralis n’est pas spécifique de l’identification par MALDI-

TOF-MS. En effet certaines techniques d’identification par PCR/

séquence peinent aussi à donner une identification fiable [30]. Par

contre, les streptocoques béta-hémolytiques comme S. pyogenes

(SGA), S. agalactiae (SGB), ou S. dysgalactiae ne présentent pas

de difficulté majeure d’identification comme le montre une étude

récente [31]. Les entérobactéries sont correctement identifiées dans

97 % à 99 % des cas. Mais il est impossible actuellement de dif-

férencier par cette technique Shigella sp. d’Escherichia coli.

Les difficultés rencontrées pour l’identification des microorganismes

est variable d’une étude à l’autre (tableau 1). Ceci peut s’expliquer

par la qualité du dépôt qui peut être plus difficile à partir de cer-

taines colonies comme par exemple, les espèces muqueuses de

Pseudomonas aeruginosa, ou des colonies incrustées d’Eikenella

corrodens. Mais aussi, parce que certains genres bactériens pro-

duisent naturellement peu de pics (Nocardia sp., Propionibacterium

sp.). L’identification des mycobactéries est plus délicate, et l’ob-

tention de spectre de qualité correcte nécessite des protocoles

de préparation particuliers [32, 33]. Les résultats dépendent à la

fois des protocoles de préparations, mais aussi des méthodes de

comparaisons des spectres obtenues et de la qualité et du nombre

d’espèces représentées dans les bases de données [32, 33]. Une

seule étude a comparé les deux systèmes commercialisés (Bruker

Biotyper et Shimadzu/Anagnostec) pour une utilisation en routine

[58]. Ies résultats d’identification correcte à l’espèce sont de 93,6 %

et 88,3 % pour Bruker et Shimadzu respectivement.

Cette technologie peut être appliquée pour identifier les bactéries

directement à partir de certains échantillons cliniques. En particulier

le sang, inoculé dans les flacons d’hémocultures détectés positives

ou encore les urines. Les résultats des principales études sont

regroupés au sein du tableau 2 ainsi que les principales difficultés

rencontrées. Cette stratégie peut être particulièrement intéressante

pour la prise en charge précoce des patients septiques permettant

la mise en route plus rapide d’un traitement adapté. Pour les hémo-

cultures, les résultats sont obtenus après plusieurs étapes permet-

tant de séparer les globules rouges des globules blancs [34]. Les

temps de préparations sont variables selon les publications, moins

d’une demi heure pour les plus rapides. Les pourcentages

Auteurs Echantillons Id à l’espèce Id au genre Principales difficultés Commentaires

Prod’hom et al., Sang Hémocultures positives 77,8 % 78,7 % Streptococcus mitis group La présence d’une capsule peut en partie2010 [35] (n = 126) GN : 89,1 % GN : 89,1 % Staphylococcus sp. expliquer le plus faible taux d’identification

GP : 71,6 % GP : 72,9 % pour les bactéries : S. pneumoniae,H. influenzae, K. pneumoniae

La Scola et al., Sang Hémocultures positives 76,0 % 76,0 % Streptococcus sp.2009 [36] (n = 599) Echantillons polymicrobiens

Stevenson et al., Sang Hémocultures positives (179) 80,2 % 80,2 % Streptococcus du groupe mitis2009 [37] (n = 212) Flacons ensemencés (33) Propionobacterium acnes

Ferroni et al., Sang Hémocultures positives (388) 89,0 % 98,0 % Streptococcus pneumoniae En cas d’hémoculture polymicrobienne,2010 [38] (n = 685) Flacons ensemencés (312) Streptococcus du groupe mitis le germe prédominant est dans la plupart

des cas identifié. Méthode très rapide.

Christner et al., Sang Hémocultures positives 94,2 % 95,0 % Cocci Gram + Les difficultés d’identification résultent2010 [39] (n = 277) d’un nombre insuffisant de bactéries,

plus fréquent avec les Gram +

Ferreira et al., Sang Hémocultures positives 42,6 % 71,6 % Streptococcus mutans Pas de culture polymicrobienne2010 [40] (n = 300) GN : 83,3 % GN : 96,6 % Staphylococcus sp.

GP : 31,8 % GP : 65,7 % Staphylococcus aureus

Moussaoui et al., Sang Hémocultures positives 90,0 % nd Streptococcus mitis group2010 [41] (n = 532) GN : 91,1 % Staphylococcus sp.

GP : 89 %

Ferreira et al., Urine Urines positives 91,8 % 92,7 % Streptococcus sp. Meilleurs résultats avec > 105 CFU/mL2010 [44] (n = 220) GN : 93,6 % GN : 94,6 % Enterococcus sp. E. coli > 105 CFU/mL : 97,6 %

GP : 66,6 % GP : 66,6 % Raoultella sp. identifications correctes

Tableau II : RÉSUMÉ DES PRINCIPALES ÉTUDES UTILISANT LE MALDI-TOF POUR L’IDENTIFICATION BACTÉRIENNE DIRECTEMENT À PARTIR DES PRÉLÈVEMENTS.

GN : Gram négatif. GP : Gram positif. nd : non disponible.

��



d’identification correcte au genre varient de 72 % à 98 %

selon les auteurs et les principales difficultés rencontrées sont les

mêmes que pour l’identification directement à partir des colonies

(tableau 2) [35-41]. La qualité des milieux de cultures contenus

dans les flacons et particulièrement la présence de charbon, rende

l’identification plus difficile, en particulier celle des cocci à gram

positif, [42, 43]. L’identification directement à partir des prélève-

ments urinaires est également possible (tableau 2). De bons résul-

tats sont obtenus seulement avec des inoculum bactériens

supérieurs à 105 CFU/mL [44]. Dans le cas des prélèvements poly-

microbiens, les empreintes spectrales sont plus difficiles à inter-

préter et dans le meilleur des cas, le germe prédominant est

correctement identifié.

Afin d’améliorer les résultats, certains auteurs préconisent de

réaliser une étape d’extraction protéique lors de la préparation des

échantillons à analyser. Ceci peut se justifier pour certaines espèces

comme nous l’avons déjà signalé (mycobactéries, corynebactéries),

ou en cas de plus faible inoculum comme c’est parfois le cas avec

les hémocultures [25, 45, 46].

APPLICATIONS FUTURES : POSSIBILITÉS ET LIMITESUn certain nombre d’études suggère la possibilité à partir des

spectres d’obtenir d’autres informations notamment d’identifier des

facteurs de virulence ou encore des marqueurs de résistance aux

antibiotiques. Plusieurs études ont tenté de mettre en évidence

directement à partir des colonies la présence de la Leucocidine

de Panton-Valentine (PVL) chez Staphylococcus aureus. Les résul-

tats sont contradictoires et ne permettent pas de prédire la

présence de cette toxine. Il est nécessaire de tester des souches

d’origines différentes afin de s’affranchir d’un lien de clonalité entres

souches [47-49]. Devant la présence de pic pouvant faire évoquer

un facteur de virulence, il est important de chercher à l’identifier

afin de pouvoir l’incriminer avec certitude.

Certains auteurs se sont intéressés à identifier des pics permettant

de prédire avec 24 h d’avance sur l’antibiogramme classique, la

résistance à certains antibiotiques. Camara et al. ont ainsi pu dif-

férencier des souches d’E. coli sensibles à l’ampicilline de souches

résistantes sur la présence de pics spécifiques [50]. D’autres ont

cherché à différencier les souches de S. aureus sensible à la méti-

ci lline (SASM) des souches résistantes (SARM). Dans l’ensemble

de ces études, la présence d’un nombre important de faux positifs

et de faux négatifs ne permet pas une utilisation de ces résultats

en routine [51-55]. Récemment, une nouvelle approche a donné

des résultats intéressants. Il s’agit de mettre en évidence une

activité enzymatique à partir d’une culture bactérienne. L’activité

des carbapénémases a ainsi pu être mise en évidence en étudiant

la dégradation des carbapénèmes introduites dans une culture

bactérienne produisant cette enzyme. En étudiant les variations au

niveau des spectres engendrées par l’hydrolyse de l’antibiotique

(Méropénéme, Imipénéme ou encore Ertapénéme) et en suivant

l’apparition des produits de dégra dations, il a été possible de

mettre en évidence chez certaines entérobactéries (E. coli,

Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae,

Serratia marcescens) ou chez Pseudomonas aeruginosa, la

presence de carbapénémases (par exemple : VIM, IMP, KPC,

NDM1) [56, 57]. Ces résultats encou rageants devront êtres

confirmés et adaptés pour une utilisation en routine.

Cette nouvelle technique apporte un gain indéniable pour la micro-

biologie. Il est maintenant établi qu’un laboratoire peut réaliser

l’ensemble de ses identifications par spectrométrie de masse de

type MALDI-TOF, en tout cas aussi bien sinon mieux qu’avec les

méthodes dites conventionnelles. Il est clair que les banques de

données des fournisseurs devront être actualisées régulièrement

en fonction de l’évolution de la taxonomie. Mais ces banques de

données devront prendre en compte également non seulement les

souches de référence, issues de collections établies pour certaines

il y a plusieurs dizaines d’années, mais aussi les souches isolées

en clinique, plus récentes. L’implantation massive dans les labo-

ratoires des spectromètres de masses de type MALDI-TOF pour

l’identification des microorganismes témoigne à la fois de la qualité

des résultats obtenus, et de l’amélioration notable que cela apporte

pour le clinicien dans la prise en charge des patients. �

/+/ Références.

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Applications de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF en microbiologie