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Cours Spectrométrie de Masse
Cours ESBSOctobre 2005
Sarah SANGLIER
Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganiqueUMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)
CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg
Tel: 03 90 24 27 [email protected]
Introduction
Plan
Mercredi 12/10 : Les Bases de la Spectrométrie de Masse (Sarah Sanglier)
- Introduction à la spectrométrie de masse
- L’ionisation MALDI
- L’ionisation Electrospray
Vendredi 14/10 : Application à l’analyse protéomique (Alain Van Dorsselaer)
Définitions1- Présentation d’un spectre de masse2- Unité de mesure: le Dalton3- Masse moléculaire monoisotopique4- Masse moléculaire moyenne (ou chimique)
L’instrument : structure d’un appareil de spectrométrie de masse1-Structure d’un instrument : source et analyseur2- Rôle des champs l’électrostatiques3- Rôle et systèmes de génération du vide4- Présentation des principales sources
EI, FAB, MALDI, ESI5- Présentation des principaux analyseurs
Magnétique, quadrupôlaire, trappe d’ion, TOF, FT-ICR6- La MS-MS
Spectrométrie de masse :introduction générale
Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?
C’est une méthode de mesure des rapportsmasse-sur-charge (m/z)
de molécules individuelles et ioniséeset de leurs produits de fragmentations
1- La masse moléculaire d’un composé2- La masse des fragments de ce composé3- Une mesure de la quantité
m/z
Pic Moléculaire
Fragments
Nombre d’ions
Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?
Pic moléculaire et masse moléculaire : définition
La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans lespectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de lamolécule étudiée, sans qu’il y ait eu rupture d’une liaison.
La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d’une chargeélectrique.
La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire(formule brute) de l’ion moléculaire.
L’existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs picsmoléculaires.On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de picsmoléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire »)
La présence d’isotopes complique donc la définition, et la mesure du « picmoléculaire ».
1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420Da/e0
100
%
217.0
149.094.981.055.0
108.9148.0 203.0150.0 175.0
218.0
357.1
262.1219.0
232.0 315.1302.1
343.1
372.1
373.2 410.1 416.2
m/z 149
m/z 217
Cholestane
Pic moléculaire
Fragments
Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?
Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.
Masse monoisotopiquec’est la masse du premier pic du profil isotopique c’est-à-dire cellequi ne prend en compte que les masses des isotopes les plusstables (C12, H1, O16, S32, N14, …).
Masse chimique ou moyennec’est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant leprofil isotopique c’est-à-dire la masse qui prend en compte la massedes éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).
Quelle masse mesure-t-on ?
Pic monoisotopique
P P+1 P+2 P+3m/z m/z
Masse moyenne
Quelle masse mesure-t-on ?
Masse monoisotopique: dans le massifisotopique, on l’appelle le pic P
Les autres pics du massif isotopique sontappelés les pics P+1, P+2, P+3,….Il contiennent tous au moins 1 des isotopeslourds d’un éléments.
La résolution mesure l’aptitude d’un analyseur à séparer l’ion M de l’ion M+ΔM
Vallée à 10 %
M M + ΔM
ΔM
R = M/ΔM
De quoi dépend la nature de la masse mesurée ?
Pic monoisotopique
P P+1 P+2 P+3m/z m/z
Masse moyenne
Quelle masse mesure-t-on ?
La masse m s’exprime en Dalton (Da)
1 Da = 1/12 .12 . 10-3 kgmole-1 / N (N = 6, 022045 . 1023)
Et donc: 1 Da = 1,66 . 10-27 kg
Quelle sont les unités de mesure ?
C12 = 12,000000000C13 = 13,003354839H1 = 1,0078250H2 = 2,0141018O16 = 15,9949146S32 = 31,9720718N14 = 14,0030740Cl35 = 34,968852729Cl37 = 36,965902624
Un spectrométre de massemesure la masse de molécules isolées
Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes:
1- VolatiliserSéparer les molécules les unes des autres: on passe de l’état de matièrecondensée à un état gazeux.
2- IoniserTransformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionnegrâce à des champs électriques
3- Mesurer les rapports m/zLa masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse (m)/nb decharges (z)
Un spectromètre de masse est constitué de:
Source
obtention d ’ions enphase gazeuse
Interface
focalisation ettransmission des
ions
Analyseur
séparation des ionsen fonction de m/z
Un spectromètre de masse est donc constitué de deux parties :
1- La source d’ion : pour volatiliser et ioniserCes opérations peuvent se faire simultanément ou successivement selon le type de sourced’ions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu.
2- L’analyseur: pour mesurer m/zIl mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z)
C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen desions soit supérieur à la distance à parcourir dans l’appareil pour atteindre le détecteur.
CECI IMPLIQUE:
• Des champs électrostatiques très précis pour guider et déplacer les ionsdans l'appareil (lentilles électrostatiques, optique ionique)
• Un vide suffisant pour que les ions puissent se déplacer sans êtredétruits ou déviés par des molécules résiduelles (notion de libre parcoursmoyen)
Les unités de mesures des pressions sont nombreuses.
L’unité officielle est le pascal (Pa):1 pascal = 1 N/m2
On utilise également:
L’atmosphère 1 atm = 101 325 Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 barLe bar 1 bar = 105 Pa (=106 dyne/cm2)Le millibar 1 millibar = 10-3 bar = 102 PaLe Torr 1 Torr = 1mm HgLe Psi 1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm
Pour la plupart des spectromètres de masse, le vide est indiqué en millibar.
Les valeurs du vide dans l’analyseur sont en général:10-5 mbar : pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire)10-6 mbar : pour un analyseur quadripôlaire (1 mètre de long).10-7 mbar : pour un analyseur magnétique (2 à 3 mètres de long).10-7 mbar : pour un analyseur à temps de vol (2 à 3 mètres de long).10-9 mbar : pour un analyseur ICR (orbite circulaire).
Il existe de nombreux types de sources d’ions et chacun de ces types de sourcesrepose sur un principe physique différent.
Le principe physique qui permet de volatiliser et l’ioniser un type de composé est choisipar l’opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapesde volatilisation et d’ionisation se font successivement ou simultanément selon le typede source.
Les critères de choix principaux sont:
• la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser
• sa labilité chimique
• les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation
• la taille des molécules
• les quantités de produit disponibles
• le type d’introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique)
La source d’ions : son rôle est de volatiliser et d’ioniser
• De très nombreuses méthodes d’ionisation ont été inventées pour ioniser et volatiliserdes molécules de plus en plus fragiles, grandes et polaires.
• Les « ionisations dures » génèrent souvent des ions moléculaires, à nombre impaird’électrons, qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant d’avoir eu letemps de sortir de la source. Lorsque leur durée de vie est assez longue pour qu’il sortentde la source intacts, mais qu’ils se décomposent avant d’avoir complètement traversél’analyseur et d’arriver au détecteur, on les appelle ions métastables. Leurs fragmentspeuvent être analysés et donnent des informations de structures.
• Les « ionisations douces » génèrent des ions moléculaires à nombre pair d’électrons,qui sont relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverserl’analyseur, arriver jusqu’au détecteur, et donc être mesurés.
Les sources d’ions se classent ensources « dures » et en sources « douces »
1- La masse moléculaire d’un composé2- La masse des fragments de ce composé3- Une mesure de la quantité
Quelles informations peut apporterune source à ionisation dure ?
Pic Moléculaire
M/z
Fragments
Nombre d’ions
1- La masse moléculaire d’un composé2- Pas de fragmentation3- Une mesure de la quantité
Quelles informations peut apporterun soure à ionisation douce ?
Pic Moléculaire
M/z
Nombre d’ions
Les sources d’ions les plus courantes sont :
La source à plasma induit couplé (Induced coupled plasmas: ICP-MS) Très dure
La source à impact électronique (EI) Dure
La source à ionisation chimique (CI) Assez douce
La source à ionisation chimique par désorption (DCI) Assez douce
L’ionisation par thermospray (TSP) Assez douce
La désorption de champs (FD) Assez douce
L’ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides (LSIMS, FAB) Assez douce
La désorption par plasma (PD) Assez douce
La désorption laser (LD) Assez douce
L’ionisation chimique à pression atmosphérique (API ou APCI) Assez douce
La photoionisation (APPI) Assez douce
L’ionisation laser assistée par matrice (MALDI) Utilisées en Douce
L’électronébulisation (electrospray: ES ou ESI) PROTEOMIQUE Douce
L’analyseur : pour mesurer m/z
B: Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien)Q: Déflexion par un champ quadrupolaireIT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap)TOF: Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight)FT-ICR: Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier
Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers l’analyseur pardes champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou deplusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseurdépend de l’intensité du champ d’extraction
On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MSn) pour faire de la spectrométrie demasse à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaqueanalyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents.
Il existe différents types d’analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents,mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z.C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen desions soit supérieur à la distance à parcourir dans l’appareil pour atteindre le détecteur.
Les caractéristiques principales d'un analyseur sont :
• La résolution R• La gamme m/z qu'il peut analyser• La rapidité de balayage en m/z• La sensibilité• La vitesse avec laquelle les ions le traversent
Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de cescaractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaineslimites.Chaque type d'analyseur a son "point fort".
Caractéristiques des analyseurs
Analyseurs Résolution Gamme m/z
Quadripôle (Q) 2 000 8 000
Magnétique (EB) 20 000 20 000
Temps de vol (TOF) 20 000 500 000
Trappe ionique 5 000 6 000
Cyclotron à résonancedes ions (FT-ICR) 1 000 000 4 000
Spectromètres de masse commerciaux:De nombreux couples source /analyseur sont possibles
EI/CI
FAB
MALDI/LD
ES/APCI
Q
BE
TOF
IT
FT-ICR
Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle.On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions
Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/zOn purifie donc un ion présent dans un mélange d’ion qui peut être trèscomplexeL’ion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision.
Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments.C’est de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem)
Si on répète l’opération, on fait de la MS-MS-MS ou MS3
Certain appareils permettent de faire de la MS10
La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure
La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions:Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent
Principe de la MS/MS:étude d’ions fils
MS1 MS2Cellulede collision
DétecteurSource
Ions Ionparent Fragmentation
(CID)Ionsfils
SpectreMS/MS
Le premier analyseur ne balaye pas
Principe de fragmentation dans la chambre de collision(Collision Induced Dissociation : CID)
Cellule de collision
ΔVEc = Elab = ze ΔV Ecm = Elab mg / Mi + mg
Mi, z
mg
m1
m2
m3
Les analyseurs MSn
La MS-MS peut être réalisée par :
Deux quadrupôles Q-Q
Un quadrupôle et un analyseur à temps de vol Q-TOF
Deux analyseurs à temps de vol TOF-TOF
Un piège à ions (Ion Trapp) IT
Une résonnance cyclotronique d’ion à transformée de Fourrier FT-ICR
La MSn peut être réalisée par :
Un piège à ions (Ion Trapp) IT
Une résonnance cyclotronique d’ions à transformée de Fourrier FT ICR
Les énergies de la collision en MS/MS dépendent du type d’analyseur utilisé.
Collision haute énergie
en keV
EB/EB ou BEB
EB/Q
EB/TOF
TOF/TOF
TOF (PSD)
Collision basse énergie
en eV
Q-TOF
IT
FT-ICR
On peut obtenir des schémas de fragmentation différents selon les énergies utilisées
Nomenclature des fragments peptidiques
Fragments observés seulement en haute énergie
CH
Rn
CO NH CH
Rn+1
an bn cn
xn yn zn
NH COOH
dn, vn, wn dn+1, vn+1, wn+1
Fragments observés en haute et basse énergie
Bieman, Roepstorff, Fohlmann
300 600 900 1200
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
x104
Intens.
371.1
391.26
462.14
529.35543.37
577.29
618.22
622.86
681,33
720.30
778.42
756.82
809.97
864.96
887.36
1010.39
1076.29
1090.87
1223.54
Spectre ESI-MS d’un digeste trypsique (m/z=681)
MS/MS
ESI-IT-MS-MS de l’ion [M+2H]2+ à m/z=681
I/L
AG
E
K
D
