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Apport de la biologie moléculaireet de l'odontologie
dans l'histoire de la médecine
G. Aboudharam, M. Drancourt et D. Raoult URMITE - UMR CNRS 6236 - IRD 198
Faculté d’odontologie Marseille
mardi 24 mai 2011
Odontologistes
AnthropologistesMicrobiologistes
Collaboration interdisciplinaire
mardi 24 mai 2011
La paléomicrobiologie est un domaine émergent consacrée à la détection, l’identification et la caractérisation des micro-organismes dans les vestiges archéologiques. Les données indiquent que l’hôte associé à l’ADN microbien peut survivre pendant près de 20.000 ans dans son environnement. De l’ADN bactérien conservé dans des échantillons de pergélisol a été daté de 400.000-600.000 ans.En plus des tissus mous congelés et momifiés, les os et la pulpe dentaire peuvent être aussi utilisés pour la recherche d'agents pathogènes microbiens. Différentes techniques, y compris la microscopie et l’immunodétection, peut être utilisé dans la paléomicrobiologie, mais la plupart des données ont été obtenues en utilisant la PCR basée sur les techniques moléculaires. Les infections causées par des bactéries, les virus et les parasites ont été diagnostiqués en utilisant des techniques paléo-microbiologiques. En outre, le typage moléculaire des agents pathogènes anciens pourraient aider à reconstruire l'épidémiologie des épidémies passées et pourrait alimenter les modèles actuels des infections émergentes, contribuant ainsi à l'élaboration de mesures préventives.
Paleomicrobiology: an alternative approach to track bacterial evolution
[Drancourt M, Raoult D. Nat Rev Microbiol. 2005
mardi 24 mai 2011
Limites des descriptions historiques
• Disponibilité des sources historiques• Traduction et interprétation des textes anciens
• Nosologie ancienne• Approche analogique
• Données présumées et démonstratives
mardi 24 mai 2011
5
La Peste d'AthènesSelon François PERRIER (dit Le Bourguignon)Réalisé au 17e siècleDijon ; musée des beaux-arts
La Peste d’Athènes (430) Thucydide Histoire II, XLVII, 4
๏Leptospirose et tularémie (Langmuir et al, 1985)
๏Grippe et Staphylocoque (Mercier, 1974)
๏Mélioidose (Warner, 1954)
๏Peste (Poole et Halladay, 1979)
๏Typhus (David, 2000)
mardi 24 mai 2011
5
La Peste d'AthènesSelon François PERRIER (dit Le Bourguignon)Réalisé au 17e siècleDijon ; musée des beaux-arts
La Peste d’Athènes (430) Thucydide Histoire II, XLVII, 4
๏Leptospirose et tularémie (Langmuir et al, 1985)
๏Grippe et Staphylocoque (Mercier, 1974)
๏Mélioidose (Warner, 1954)
๏Peste (Poole et Halladay, 1979)
๏Typhus (David, 2000)
DNA examination of ancient dental pulp incriminates typhoid fever as a probable cause of the Plague of Athens.Papagrigorakis MJ, Yapijakis C, Synodinos PN, Baziotopoulou-Valavani E.Int J Infect Dis. 2006 May;10(3):206-14. Epub 2006 Jan 1
mardi 24 mai 2011
Matériel humain et microorganismes anciens
Matériel environnemental
MateriauxInertes
Ectoparasites
Animaux Tissus fixés
Pulpe dentaire
Dents
Tissus momifiés
Tissus congelés
Os
Matériel humain
mardi 24 mai 2011
Techniques utilisées pour la détection des pathogènes anciens
Observation microscopique
Isolation and culture
Immunodétection et sérologie
Dectection baséesur la PCR et le séquençage de l’ADN
mardi 24 mai 2011
Microscopie
Bactéries
Bartonella bacilliformis Verruga pervana Xe siècle Allison MJ Am J Phys Antrop 1970, 41, 295
Virus
Smallpox virus Variole XVIe siècle Fornaciari G. et al. Lancet 1986, ii, 625
Parasites
Pediculus capiOs Pédiculose Ier siècle Capasso L. et al. Lancet 1998, 351,992
Capilaria Capillariose -‐ 3000 ans Bouchet F. Lancet 1997, 349, 256
Isola2on and culture
Bacillus spp. 25-‐40 millions Cano RJ et al. Science 1995, 268,1060]
Bacillus anthracis Charbon 1917
Halotolerant bacterium 250 millions Vreeland RH et al. Nature 2000, 407, 897
Immunomarquage
Ricke4sia ricke4sie Rocky Mountain spoYed ferver 1901 [Dumler JS JAMA 1991, 265, 718]
Treponema pallidum Syphilis XVIe siècle [Fornaciari G. et al. Lancet 1989, ii,614]
Trypanosoma cruzi Maladie de Chagas XVIe siècle [Dumler JS JAMA 1992, 339, 128]
Molecular iden2fica2onMolecular iden2fica2on
Bactéries non idenOfiées 11 -‐ 425 millions Fish SA et al. Nautre 2002, 417, 132]
Mycobacterium tuberculosis Tuberculose Xe siècle [Baron H. et al. J. Archelo. Sci. 1996, 23]
idem idem idem Salo WL.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91,2091
Mycobacterium leprae Lèpre Xe siècle Rafin A. et al. Lancet 1994, 343, 1360]
Borrelia burgdorferi Maladie de Lyme VIIe siècle -‐ 1884 Matuschka FR. et al. J. Infect. Dis. 1996, 174,424
Enterobactéries -‐ 12 000 ans Rhodes AN. et al. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 651
Escherichia coli -‐ 300 ans Frickere EJ et al. LeY. Appli. Microbiol. 1997, 24, 351
Treponema pallidum XVIIIe siècle Kolman CK. Et al. J. Infect. Dis 1999, 180, 2060
Yersinia pes?s Peste 1590 / 1720 Drancourt M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12637
idem idem 1348 Raoult D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 23, 12800
Bartonella quintana Fièvre des tranchées 4000 ans J Infect Dis. 2005 Feb 15;191(4):607-‐11. Epub 2005 Jan 10
mardi 24 mai 2011
Limites des tissus osseux pour la détection par PCR
• Contamination par la flore tellurique
• Lavage de l’ADN cible par les sédiments
• Etape de décalcification
• Difficultés dues aux os
mardi 24 mai 2011
Prévention et contamination en paléomicrobiologie
Prélèvement Extraction de l’ADNPCR
Floreenvironnementale
Floremanu-portée
•Flore environnementale•Témoin positif•Précédents amplicons
Contaminationcroisée
Risques
Mesures préventives
•Port de gants•Nettoyage de la surface externe•Utilisation d’air filtré•Irradiation aux UV•Utilisation de la pulpe dentaire
•Pas de contrôle positif•Utilisation d’une pièce dédiée•Port de gants
•Utilisation d’un témoin négatif pour 3 échantillons•Séquençage de tous les amplicons
mardi 24 mai 2011
Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme
mardi 24 mai 2011
๏Vascularisation
๏Préservation
๏Conservation
๏Extraction de l’ADN simple
Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme
MJ Bottero IMEB Marseille
mardi 24 mai 2011
๏Vascularisation
๏Préservation
๏Conservation
๏Extraction de l’ADN simple
Takahashi 1985
Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme
MJ Bottero IMEB Marseille
mardi 24 mai 2011
Le modèle animal
Deux cobayes infectés par Rickettsia rickettsii par voie intrapéritonéale
Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme
Amplification du fragment Rr 190 70p / Rr 190 602n du gène ompA
mardi 24 mai 2011
______________________________________________________________________ Day 0 5 10 15 20 guinea pig name A B C D E F G H I J K L M N O ______________________________________________________________________
PCR Sod - - - - - - - - - - - - - + + PCR IS 1111 - - - - - - - - - + + - + + + Splenn culture - - - - - + + + + - - - - - - Blood culture - - - - - + + - - - - - - - -_ _____________________________________________________________________
Caractérisation de Coxiella burnetii dans les différents échantillons de cobaye
Modèle cobaye et Coxiella burnetii
Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme
mardi 24 mai 2011
Le charnier de la rue Leca (1994-opération LECA 210134602)
mardi 24 mai 2011
Le charnier de la rue Leca (1994-opération LECA 210134602)
mardi 24 mai 2011
mardi 24 mai 2011
M. Serre (1658-1733) Avenue Belsunce pendant la peste à Marseille(Musée du vieux Marseille)
mardi 24 mai 2011
Les dents anciennes
mardi 24 mai 2011
Les dents anciennes
mardi 24 mai 2011
•Le gène pla (plasminogen activator) Plasmide pPCP1 de Yersinia pestis•200 à 300 bp
Les cibles moléculaires
• La seconde cible moléculaire: detection d’un fragment du gène Rpob of 133 bp (YpED / YpER) de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
mardi 24 mai 2011
mardi 24 mai 2011
mardi 24 mai 2011
Les limites de la PCR avec l’ADN ancien
• Les contaminations de l’ADN
–Horizontale : ADN moderne
–Verticale: amplicons
• L’ADN est chimiquement altéré
• Fragmentation de l’ADN 100 - 300 bp
• Inhibiteurs de la PCR
mardi 24 mai 2011
La PCR suicide, une réponse à la question des contaminations
• Pas de témoin contrôle positif
• Les jeux d’amorces sont utilisés une seule fois dans le
même laboratoire
• Un nouveau jeu d’amorçes à chaque nouvel essai
• Possibilité d’accession à la séquence du génome
bactérien
mardi 24 mai 2011
Zones géographiques en Europe infectés par la peste. Progression notée en noir (d’après G. Christakosa,, R.A. Oleab,c, H.-L. Yua 2007)
La peste noire
mardi 24 mai 2011
Zones géographiques en Europe infectés par la peste. Progression notée en noir (d’après G. Christakosa,, R.A. Oleab,c, H.-L. Yua 2007)
La peste noire
mardi 24 mai 2011
La peste noire
mardi 24 mai 2011
Amplification du fragment: •Yp12D/Yp 11R (728-876) du gène pla•15/19 dents positives
Adultes TA1 and TA2
La peste noire
mardi 24 mai 2011
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
• Y. pestis comprend trois biotypes/genotypes: Antiqua, Medievalis, Orientalis
• Est-ce que chaque biotype est responsable d’une pandémie ?
•Deux génomes de Y. pestis disponibles
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
MST: Multiple Spacer Typing
(Intergenic spacers sequencing)
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
Antiqua
Medievalis
Orientalis
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
(Peste moderne)
18551800
Sens
(5-6th Century)Datation
Dreux Montpellier
(1348)
Première Pandémie(Peste Justinienne)
Seconde Pandémie(Peste noire)
541 767 1346
(12-14th Century)
Troisième pandémie
Charniers
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
Deltal pulp extraction
Dental school building A
•Les expériences ont été menées dans des laboratoires où Y. Pestis n’a jamais été introduite• « PCR Suicide »
Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis
mardi 24 mai 2011
174290 174320
18551800
Sens(5-6th century)(Datation)
1 2 3Individus
Cibles
moléculaire
- - -Yp1
+ + +Yp8
- + -Yp3
Dreux(12-14th century)
Montpellier(1348)
4 5 6 7 8
- + - ND ND
+ + + ND ND
+ ND - - +
#1
#2
Expériences
541 767 1346
ATAACGTTTTTCCCAAGTTTAATGGCTACAACGAGTC .........C....................G......
174300 174310
Détection moléculaire de Y. pestis chez des victimes de la peste Justinienne et de la peste noire en France
Y. Pestis CO92 strain
individu #202
Première Pandémie Seconde Pandémie Troisième pandémie(Peste Justinienne) (Peste Justinienne) (Peste moderne)
mardi 24 mai 2011
mardi 24 mai 2011
Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux
mardi 24 mai 2011
Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux
mardi 24 mai 2011
Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux
mardi 24 mai 2011
Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux: le typhus
mardi 24 mai 2011
Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux: le typhus
mardi 24 mai 2011
Village de Douai ( 1710 – 1712 )
Détection de Rickettsia prowasekii
mardi 24 mai 2011
Pulpe dentaire collectée de 1.192 dents/ plusieurs individus de 12
charniers
ExtracOon de l’ADN avec les tubes MDx
Detec2on de 7 pathogènes par PCR en temps réel avec sonde TaqMan – Appareil 7900 HT
B.anthracis, B.recurren?s, B.quintana, R.prowazekii, S.Typhi, Y.pes?s, PoxvirusPulpe dentaire collectée de 55
dents/ 21 individus de Douai
ExtracOon de l’ADN phenol-‐chloroform-‐isoamyl
Detec2on de R. prowazekii 38 dents/ 19 individus PCR en temps réel emboîtée Gène: DNA
invertase Pin-‐like protein
Confirma2on de R. prowazekii 17 dents/ 9 individus « PCR suicide» Gène:Glutamine
amidotransferase like protein
Génotypage de R. prowazekii 15
dents/ 7 individus PCR en temps réel emboîtée rpmE-‐tRNAfMet
intergenic spacer
Séqu
ençage
Dents anciennes
Détection de Rickettsia prowasekii
mardi 24 mai 2011
Pulpe dentaire collectée de 1.192 dents/ plusieurs individus de 12
charniers
ExtracOon de l’ADN avec les tubes MDx
Detec2on de 7 pathogènes par PCR en temps réel avec sonde TaqMan – Appareil 7900 HT
B.anthracis, B.recurren?s, B.quintana, R.prowazekii, S.Typhi, Y.pes?s, PoxvirusPulpe dentaire collectée de 55
dents/ 21 individus de Douai
ExtracOon de l’ADN phenol-‐chloroform-‐isoamyl
Detec2on de R. prowazekii 38 dents/ 19 individus PCR en temps réel emboîtée Gène: DNA
invertase Pin-‐like protein
Confirma2on de R. prowazekii 17 dents/ 9 individus « PCR suicide» Gène:Glutamine
amidotransferase like protein
Génotypage de R. prowazekii 15
dents/ 7 individus PCR en temps réel emboîtée rpmE-‐tRNAfMet
intergenic spacer
Séqu
ençage
Dents anciennes
La détecOon moléculaire de R. prowazekii dans la pulpe dentaire a confirmé scienOfiquement l’épidémie de typhus suspectée à Douai au 18ème siècle (1710 – 1712)
C’est la plus ancienne détecOon de R. prowazekii
Détection de Rickettsia prowasekii
mardi 24 mai 2011
Dr. Michel SignoliDr. Armelle Gardeisen Pr. Jean-Pierre Bocquet-AppelPr. Luigi Fozzati Dr. Cyrille Le Forestier Dr. Dominique Castex Dr. Benoit Clavel Pr. Henri de LumleyPr. Eric CrubézyPr. Richard DonatPr. Olivier DutourDr. Raffaella BianucciDr. Rozenn ColleterDr. Sacha KackiDr. Philippe BlanchardDr. Bernard Davoust Merci pour votre attention
mardi 24 mai 2011
![Apport de la biologie moléculaire dans le diagnostic ...sahgeed.com/upload/2_ F. DJENNANE-HADIBI.pdf · Diagnostic moléculaire W^µ Æ ] [ E TRU Gram Culture Test de sensibilité](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/6070ebaca841c57978074701/apport-de-la-biologie-molculaire-dans-le-diagnostic-f-djennane-hadibipdf.jpg)
