Approche pratique de la transgénèsealbumdamien.free.fr/images/transg%e9n%e8se%2010.06.pdf · 2007-01-08 · PCR quantitative ou PCR en temps réel: Elle présente tous les avantages

Approche pratique de la transgénèse : Recherche et analyse fine d’une modification

génétique dans le génome murin

Damien JEANTET octobre 2006

1) Plan / Introduction2) Extraction et Préparation d’ADN à partir de tissus3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènes

a) Southern-blotb) Dot-Blot ou Slot-Blotc) PCR

7) Détermination du nombre de copies du transgène8) Détermination du site d’insertion du transgène (PCR inverse)9) Détection et analyse de transgènes : mutation naturelle10) Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse additive11) Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse ciblée12) Analyse de l’expression du transgène13) Identification des individus homozygotes14) Conclusions

Approche pratique de la transgénèse :Recherche et analyse fine d’une modification génétique dans le génome murin

Damien JEANTET Octobre 2006

2) Extraction et Préparation d’ADN à partir de tissus

- Méthodes lyses classiques :1) Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS*, Protéinase K55°C Overnight

Purification (phénol/chloroforme) Précipitation (isopropanol)

2) KCl, Tris-HCl, MgCl2, Tween 20, Protéinase K55°C Overnight

Précipitation (isopropanol)

- Méthode lyse rapide (lyse alcaline) :

(NaOH, EDTA) solution basique 30min à 95°C(Tris-HCl) solution acide (vol à vol) pH final neutre pas de purification, pas de précipitation**

- Autres ou méthodes commerciales

Qualité ADN Quantité ADN

PUR Et [ ]

Utilisation

PUR Et [ ]

MélangeADN / PROT

Southern-BlotDot-blotPCR* (destruction taq)

Southern-BlotDot-blotPCR

PCRPas de Southern-Blot**Pas de Dot-blot**

PCR possible dans tous les cas d’extraction car besoin d’une très faible quantité d’ADN

3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènesa) Southern-blot (E.M. Southern en 1975)

Electrophorèse :+ -

Transfert gel / membrane :

Hybridation de la membrane avec une sonde Radioactive :

ADN génomique purifié+

Enzyme de restrictionchoisie

ADN digéré

Digestion :

Visualisation des sondes

Choix des enzymes et sondes important et déterminant.

Méthode à préférer :

- Détecter le transgène- Différencier homo/hétéro- Déterminer le nb de copies

Définition = détecter spécifiquement des fragments d'ADN transférés sur membrane par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope (sondes)



3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènesb) Dot-blot et slot-blot

- Principe donc très similaire au Southern-Blot- Besoin aussi de grandes quantités d’ADN purifié- ADN fixé sur une membrane par aspiration- Sondes radioactives (transgène ou transgène + vecteur) - Quantification par scintillation ou par autoradiographie et densitomètre

Besoin d’une gamme pour quantifier = déterminer nombre de copies

Besoin de témoins homo, WT et hétéro= déterminer le génotype

Définition = détecter et quantifier un fragment d'ADN donné sans digestion et séparation préalable sur gel d'électrophorèse par leur hybridation à des ADN complémentaires marqués par un radioisotope (sondes)



3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènesc) PCR (K. MULLIS et al en 1985)

Définition : amplifier des séquences d'ADN de manière spécifique et augmenter de manière considérable la quantité d'ADN dont on dispose initialement.

PCR = Polymerase Chain Réaction (Réaction en Chaîne par Polymérase)

La réalisation d’une PCR nécessite- de connaître la séquence des régions qui délimitent l'ADN à amplifier- des amorces oligonucléotidiques complémentaires délimitant l’ADN à amplifier- l’utilisation d’une ADN polymérase, d’amorce, et de dNTP.- Dépôt de l’ADN amplifié sur un gel d’agarose (électrophorèse)- Révélation de l’ADN par le BET sous UV (ou autre)

Limitations de la PCR pour le génotypage :

- besoin de connaître la séquence des régions qui délimitent l'ADN à amplifier- pb dans le cas d’insertion aléatoire- Faux positif dans le cas de recombinaison homologue

M



4) Détermination du nombre de copies du transgène (Southern-blot)

- Choisir une enzyme qui coupe une fois dans le transgène- Choisir une sonde à une des extrémités du transgène surtout pas au niveau du site de restriction

Les cas possibles :Une intégration unique: une seule bande de taille inconnue déterminée par le prochain site de restriction dans le génome.

Une intégration multiple (arrangement en Tandem) : une bande de taille attendue (ici 3,3kb) et une de taille inconnue.

Une intégration multiple tête bêche et/ou queue à queue : complication du profil de migration avec apparition de bandes supplémentaires.

Intégration en plusieurs sites: complication du profil de migration avec apparition de bandes supplémentaires. Southern blot sur descendance F1xWT (nb copies intégrées différents entre chaque individu donc profils différents).

3,3 kb

4,5 kb

4,5 kb

3,3 kb3,5 kb

2,5 kb

Détermination Précise du nombre de copies :- Comparaison des densités obtenues par Southern-blot pour une intégration unique versus les autres types d’intégration.- Estimation du nb de copies aussi avec un Dot-blot comparant une gamme d’ADN contenant un nombre de copies variables du transgène et ADN génomique





4) Détermination du nombre de copies du transgène (QPCR)PCR quantitative ou PCR en temps réel:

Elle présente tous les avantages d’une PCR avec la quantification du Blot

Technologie récente, rapide, précise et non ambiguë

Normalisation avec un gène de ménage (Prom CD8, Rantès, G3PDH, etc..)

utilisation de courbe étalon d’ADN dosé (détermination du nombre de copies)

GFP3/CD8Nbre de copies / aux 2 copies de LANG1

2,0

1,0

1,9

1,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

lang1 lang6 CAG-9F1 CAG-3F1

GFP3/CD8 nbre de copies / aux deux copies de LANG1

2,0 1,0 1,9 1,0

51,0

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

lang1 lang6 CAG-9F1 CAG-3F1 FG12-10

GFP3/CD8

Homo/hétéroNb de copie

Nombre de copie n’est pas toujours connu précisément mais on établie un rapport (2 fois plus donc homo)

Souris Lang : ko pour le gène Langérine (intégration d’un transgène avec GFP)Homo : 2 copie GFPHétéro : 1 copie GFP

5) Détermination du site d’insertion du transgène (PCR inverse)

1) Choix de deux oligos très proches, l'un sens, l'autre antisens situés de part et d'autre d'un site de restriction unique dans le transgène à 6 nucléotides (Ici, le site B).

3) Choix d’une enzyme dont le site comporte 4 nucléotides (Ici, le site A) qui coupe 1 fois dans le transgène et présent dans l’ADN génomique.

5) Digestion ADN génomique avec l'enzyme A.

7) Ligation dans des conditions qui circularisent les fragments de restriction

9) Digestion ADN circularisé avec l'enzyme B.

11) PCR classique avec les primers choisis (amplification d’une partie de l’ADN génomique flanquant le transgène)

13) Séquençage et Comparaison des séquences dans les bases de données

Définition = amplifier une séquence inconnue d’ADN génomique à partir d'une séquence adjacente connue (exemple transgène). Techniques utilisées: La restriction enzymatique et PCR ClassiqueUtilisation : insertion aléatoire



http://www.icampus.ucl.ac.be/ANIBIOL/document/anibiol/PCR/inversepcr/i-PCR-01.jpg

6) Détection et analyse de transgène : mutation naturelle

Phénotype Particulier qui apparaît au fil des croisements entre lignées sauvages

Phénotype qui traduit un Génotype particulier

Exemple :

* Souris SHIVERER : Screening des souris Homozygotes (myéline) par l’identification d’un phénotype nerveux spécifique (tremblements)

* Souris W/Wv : Screening des souris par l’identification de tache blanche dans le pelage

* Souris Ob : Souris anormalement Obèse découvertes dans un laboratoire américain dans les 50.



7) Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse additive

Les fondateurs transgéniques sont identifiés uniquement par Southern-Blot et Dot-Blot et QPCR (nb copies, nb sites d’insertion)

méthodes décrites précédemment

Utilisation possible de la PCR uniquement quand la lignée est bien établie et caractérisée (2-3 générations)

attention aux risques de contamination = la seule région amplifiable est situé dans le transgène (sauf le site d’insertion a été recherché)

Cas particulier : si fondateur mosaïque (intégration après stade 1 = pas transgène dans toutes les cellules) risque de sous estimer le nombre de copies intégrées.

détermination à réaliser plutôt sur la descendance.



8) Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse ciblée

Les fondateurs transgéniques sont identifiés par Southern-Blot, Dot-Blot et QPCR (nb copies, nb sites d’insertion) :

méthodes décrites précédemment

Association d’une sonde externe et interne pour le Southern-Blot : complète le profil (nouvelles bandes) confirme la recombinaison homologue détermination de l’homozygotie et hétérozygotie (décrit postérieurement)

Utilisation de la PCR est recommandée et possible rapidement (génération F1) : recombinaison homologue = ADN génomique flanquant parfaitement

connu risque de PCR de grande taille supérieure à 2 ou 3 Kb (dépends taille de la région d’homologie et du transgène) détermination simple de l’homozygotie et hétérozygotie (décrit postérieurement)



9) Analyse de l’expression du transgène

Le gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) qui émet une fluorescence verte sous UV et son variant l’EGFP (meilleure thermo stabilité et une fluorescence accrue).Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP ne nécessite ni fixation du tissu, ni substrat chromogène. Gène rapporteur adapté pour suivre l’expression d’un transgène dans des cellules vivantes ou dans la souris entière

Le gène LacZ codant pour la β-galactosidase, enzyme qui hydrolyse un substrat (X-Gal) en un produit coloré bleu.fixation préalable des tissus et ne peut donc pas être employé pour marquer des cellules vivantes.



La plus part des stratégies de transgènèse mis en place ont pour but de caractériser l’expression du transgène :

Soit directement en reconnaissant la protéine issue de l’expression du transgène par des techniques classiques comme le western-blot, l’ELISA ou l’imunohistochimie.

Soit indirectement - en reconnaissant des « tags reporters » associé aux protéines d’intérêt (protéine-GFP)- simplement en joignant un gène rapporteur (LacZ ou GFP) à la région codante d’un gène

d’interrêt grace à une séquence IRES.

10) Identification des individus homozygotes

Par dosage de la quantité de transgène:- Southern blot : sonde interne et externe au transgène- Dot-Blot ou slot Blot : comparaison avec intensité de bande de WT, +/- et -/-- PCR quantitative ou PCR en temps réel

Par quantification du produit du transgène ou du phénotype:-Avec LacZ ou GFP, la vitesse et l’intensité de coloration ou de fluorescence sert d’indicateur de l’homozygotie (à confirmer par la méthode du test de reproduction)- Détection du doublement de la quantité du produit du gène chez les homozygotes :Exemple : Expression de molécules à la surface des cellules du sang périphérique à l ’aide d’anticorps fluorescents, suivi de l’analyse par cytometrie en flux

M1 : 437Témoin:

Homozygote

M1

M1: intensité moyenne de fluorescenceM1 : 292

HétérozygoteM1 < témoin

M1

M1 : 442Homozygote

M1 =ou> témoin

M1

Lignée F5 :chaîne α et β du TCR

Anticorps anti Vβ11 = chaîne β du TCR



10) Identification des individus homozygotes (Suite)

Par hybridation in situ pendant l’interphase du noyau :Sondes biotinylées, détection enzymatiques ou fluorescentes

Par test de reproduction :PCR du transgène sur F1 (fondateur X WT) 100% des individus positif : fondateur homo sinon hétéro et/ou WT

Obligation de croiser un nombre élevé d’individus et sur plusieurs générations cher, perte de temps et possibilité d’erreur.

Par PCR si connaissance du site d’insertion du transgène :

+/+ +/- -/- M

100pb

200pb

GENE RAPPORTEUR

WT sens

Ko sens

WT antisensWild type

MutantWT sens

100pb

200pb

?

GENE RAPPORTEUR

WT sens

Ko sens


MutantWT sens

WT antisens

100pb

200pb ?

GENE RAPPORTEUR

WT sens

Ko sens


MutantWT sens

WT antisens

100pb

200pb

GENE RAPPORTEUR

WT sens

Ko sens


MutantWT sens

WT antisens

100pb

200pb



11) Conclusions

Southern Blot : technique ancienne mais qui a fait ces preuvesUtilisable dans tous les cas de figuresLongue et difficile à mettre en œuvreBesoin de radioactivitéeRecombinaison homologueNb de copiesSite d’intégrationHomo/hétéro

Dot blot : technique proche du Southern-blotPlus facile à mettre en œuvreScreening rapideBesoin de radioactivitéeHomo/hétéroNb de copies (si faible difficile à déterminer = mauvaise discrimination)

PCR : Technique Moderne et rapideFacile à mettre en œuvreOblige à connaître les séquences à amplifierPlus limitée pour la détermination des homo/hétéroDétermination du site d’intégration (iPCR)Cas particulier QPCR : nb copies et homo/hétéro par combinaison PCR et quantification

Expression du transgène :Facile à mettre en œuvre et rapideRésultats oui/non et/ou homo/hétéroTrès complémentaire des autres techniques



Préparation tampon de lyse alcalin

SOL AC finale vol solution

mère µlNaOH 0,5M (1000mg ds 50ml) 25 mM 500

0,2 mM 10H20 9490

qsp (ml) 10100 µl sol Ale doigt doit tremper (centri) 95°c 30minsecouer avec le doigt ou vortexer pour améliorer dissolution

SOL BC finale vol solution

mère µl40 mM 400

9600qsp (ml) 10

100µl sol B centrivortex conservation 4 °C

Tris HCL 1M pH 5H20

EDTA 200mM

solution mère

solution mère

ANNEXE : Lyse alcaline

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