109
1 AIX-MARSEILLE UNIVERSITE FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESEDEDOCTORAT Présentéeetpubliquementsoutenuedevant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE Le lundi 2 juillet 2012, par AurélieRENVOISÉ Née le 13 Décembre 1982 à La Seyne sur Mer ApplicabilitédelaPCR«universelle»16Scomme outild’identificationetdedétectionbactérienneen laboratoirehospitalierdebactériologie. En vue d’obtention du grade de DOCTORAT d’AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ Spécialité: Maladies Infectieuses Composition du Jury: PrJean-LouisMEGE PrésidentduJury PrFlorenceDOUCET-POPULAIRE Rapporteur PrGuillaumeARLET Rapporteur PrVincentJARLIER Directeurdethèse DirecteurduLaboratoire ER5 (UPRES EA 1541) « recherche expérimentale, épidémiologique et moléculaire sur la résistance aux antibiotiques » (Directeur : Pr Vincent Jarlier). Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI). Cette structure est intégrée à l’IFR 113 « immunité – cancer - infection », Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière (Directeurs : Pr Brigitte Autran et Pr David Klatzmann)

Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

  • Upload
    buiminh

  • View
    216

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

1

AIX-MARSEILLE UNIVERSITEFACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

THESE DE DOCTORAT

Présentée et publiquement soutenue devant

LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE

Le lundi 2 juillet 2012, par

Aurélie RENVOISÉNée le 13 Décembre 1982 à La Seyne sur Mer

Applicabilité de la PCR « universelle » 16S commeoutil d’identification et de détection bactérienne en

laboratoire hospitalier de bactériologie.

En vue d’obtention du grade de DOCTORAT d’AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉSpécialité: Maladies Infectieuses

Composition du Jury:

Pr Jean-Louis MEGE Président du JuryPr Florence DOUCET-POPULAIRE RapporteurPr Guillaume ARLET RapporteurPr Vincent JARLIER Directeur de thèse

Directeur du Laboratoire

ER5 (UPRES EA 1541) « recherche expérimentale, épidémiologique et moléculaire surla résistance aux antibiotiques » (Directeur : Pr Vincent Jarlier). Faculté de médecine

Pitié-Salpêtrière, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI). Cette structure est intégréeà l’IFR 113 « immunité – cancer - infection », Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière

(Directeurs : Pr Brigitte Autran et Pr David Klatzmann)

Page 2: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

2

Avant propos:

Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la

spécialité Maladies Infectieuses et Microbiologie, à l’intérieur du Master des

Sciences de la Vie et de la Santé qui dépend de l’Ecole Doctorale des Sciences

de la Vie de Marseille.

Le candidat est amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui

comportent un format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un

meilleur rangement que les thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie

introduction et bibliographie est remplacée par une revue envoyée dans un

journal afin de permettre une évaluation extérieure de la qualité de la revue et de

permettre à l’étudiant de commencer le plus tôt possible une bibliographie

exhaustive sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur

article publié, accepté ou soumis associé d’un bref commentaire donnant le sens

général du travail. Cette forme de présentation a paru plus en adéquation avec

les exigences de la compétition internationale et permet de se concentrer sur des

travaux qui bénéficieront d’une diffusion internationale.

Professeur Didier RAOULT

Page 3: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

3

SOMMAIRE

Résumé 5

Abstract 7

Abréviations 9

Introduction 10

Le ribosome bactérien 10

L’ARNr 16S : définition, origines et utilisation 12

Définition d’une espèce bactérienne 21

Place de la PCR universelle 16S dans l’identification bactérienne 24

Place de la PCR universelle 16S dans la détection de bactéries à partir deprélèvements

27

Objectifs du travail personnel 30

1 - Identification de souches de diagnostic phénotypique impossible ou difficile parPCR universelle 16S.

Gordonia sputi bacteremia.Renvoise A, Harle J-R, Roux V, Raoult D. Commentaire 32

Emerg Infect Dis. 2009 Sep;15(9):1535-7. Article 34

Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman.Rebaudet S, Genot S, Renvoise A, Fournier P-E, Stein A. Commentaire 38

Emerg Infect Dis. 2009 Jun;15(6):985-7. Article 40

2 - Détection bactérienne dans les prélèvements humains par PCR universelle 16S.

Kytococcus schroeteri, a rare agent of endocarditis.Renvoise A, Roux V, Thuny F, Riberi A, Casalta JP. Commentaire 44

Int J Infect Dis. 2008 Mar;12(2):223-7. Article 46

Page 4: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

4

SOMMAIRE (suite)

3 - Description de nouvelles espèces pour des souches isolées de prélèvementsbiologiques humains grâce à la PCR universelle 16S.

Actinomyces massiliensis sp. nov., isolated from a patient blood culture.Renvoise A, Roux V, Raoult D. Commentaire 52

Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Mar;59(Pt 3):540-4. Article 53

Helcobacillus massiliensis gen. nov., sp. nov., a novel representative of the familyDermabacteraceae isolated from a patient with a cutaneous discharge.

Renvoise A, Aldrovandi N, Raoult D, Roux V. Commentaire 59

Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Sep;59(Pt 9):2346-51. Article 60

Actinomyces timonensis sp. nov., isolated from a patient osteo-articular sample.Renvoise A, Roux V, Raoult D. Commentaire 67

Int J Syst Evol Microbiol. 2010 Jul;60(Pt 7):1516-21. Article 69

Conclusions générales et perspectives

Conclusions générales 75

Limites générales de la PCR universelle 16S 76

Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil d’identification bactérienne 77

Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil de définition de nouvellesespèces bactériennes. Débats autour de la définition de nouvelles espèces.

81

Limites de la PCR universelle 16S comme outil de détection moléculaire à partirdes prélèvements biologiques

83

Conclusion 87

AnnexesAnnexe 1 88Annexe 2 90

Bibliographie 93

Remerciements 106

Page 5: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

5

RESUME

La PCR universelle ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S à l’aide

d’amorces universelles, a d’abord été développée pour des études phylogénétiques.

En effet ce gène est universellement retrouvé chez les bactéries et sa fonction est

conservée. Ainsi, il peut servir d’« horloge moléculaire » pour mesurer les

distances phylogénétiques entre les différentes espèces bactériennes. La PCR

universelle a ensuite été appliquée en microbiologie clinique dans deux domaines

distincts : la détection et l’identification bactériennes. Dans ce travail, nous avons

évalué l’applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil diagnostique dans

un centre hospitalier universitaire (hôpital la Timone, Marseille, France).

Tout d’abord, nous avons décrit comment la PCR universelle permet

l’identification de souches bactériennes mal identifiées par les techniques

phénotypiques conventionnelles. Puis, nous avons montré que la PCR universelle

peut être utilisée pour détecter l’ADN bactérien dans des prélèvements à culture

négative, soit parce que le patient a reçu une antibiothérapie préalable, soit parce

que le microorganisme responsable est de croissance difficile. Enfin, nous avons

montré que la PCR 16S utilisée pour l’identification permet de mettre en évidence

des souches susceptibles de représenter de nouvelles espèces et/ou de nouveaux

genres bactériens.

Page 6: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

6

Ainsi, la PCR universelle est applicable dans un laboratoire de bactériologie

de routine dans les trois objectifs ci-dessus. Elle permet une identification précise

des souches bactériennes et l’amélioration du diagnostic des infections associées à

des cultures négatives et, par là-même, l’amélioration de la prise en charge des

patients. La PCR universelle permet aussi d’étendre nos connaissances des

maladies infectieuses et de la phylogénie bactérienne. Bien que la PCR universelle

présente certaines limites (discutées dans ce travail), elle reste aujourd’hui le gold-

standard incontournable de l’identification et de la détection moléculaires dans les

laboratoires de bactériologie.

Mots clés: PCR universelle, 16S rRNA gene, diagnostic moléculaire,

identification, détection, taxonomie, nouvelles espèces

Page 7: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

7

ABSTRACT

Broad-range 16S rDNA PCR using universal primers was first

developed for phylogenetic purpose since 16S rRNA gene is found in every

bacterial species with a conserved function; consequently 16S rRNA gene can

be used as a molecular clock for assessing bacterial phylogeny. Broad-range

PCR was then applied to medical microbiological diagnosis in two distinct

fields: molecular detection and bacteria identification. In the present work, we

evaluated the applicability of broad-range PCR as a diagnostic tool in a

teaching hospital (Timone Hospital, Marseilles, France).

First, we showed that broad-range PCR allows identification of bacteria

obtained in culture but misidentified by conventional phenotypic methods.

Second, we showed that universal PCR permits bacterial detection in culture-

negative infection. Third, we exemplified that using broad-range PCR is a

valuable tool to identify new bacterial species and/or genera.

Consequently, universal PCR is applicable in routine laboratories in the

three above fields; it allows a more accurate identification of bacterial strains

and permits to diagnose culture-negative bacterial infections, thus improving

patient’s management. It also improves our knowledge of infectious diseases

together with bacterial diversity and phylogeny. Although universal PCR

Page 8: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

8

presents certain limitations (discussed in this work), it remains today the gold-

standard for molecular identification and detection in routine laboratories.

Keywords: broad-range PCR, 16S rRNA gene, molecular diagnosis,

identification, detection, taxonomy, new species.

Page 9: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

9

ABREVIATIONS

ADN…………………… acide désoxyribonucléiqueARN………………… acide ribonucléiqueARNr ou rRNA……… acide ribonucléique ribosomiqueARNr 16S ou 16S rRNA constituant ARN de la petite sous-unité

ribosomale du 30S des procaryotes16S rRNA gene ……… le gène codant les ARN ribosomaux 16SPCR ………………… réaction en chaîne par polymérase (de l'anglais

polymerase chain reaction)rpoB ………………… gène codant pour la sous-unité béta de l'ARNmaldi-tof ……………… matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-

flightS……………………… Le Svedberg, de symbole S, est une unité de

mesure du taux de sédimentation.

Page 10: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

10

INTRODUCTION

1. Le ribosome bactérien

Le ribosome est un complexe ribonucléoprotéique (c’est-à-dire composé

de protéines et d’ARN) ; il permet la synthèse des protéines en utilisant l’ARN

messager comme source d’information et les ARN de transfert associés aux

acides aminés comme substrats. Cette synthèse protéique, encore appelée

traduction est divisée en cinq phases principales : la liaison de l'ARN messager

au ribosome, l'initiation, l'élongation, la terminaison et le recyclage des sous

unités ribosomales. Chez les bactéries, le ribosome est composé d’une grande

sous-unité (50S) et d’une petite sous-unité (30S) (cf Figure 1 page 10).

Figure 1 : L’ARN ribosomique 16S : un constituant de la petite sous-unité ribosomale

des procaryotes.

Page 11: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

11

Au total, le ribosome fonctionnel (composé des deux sous-unités réunies)

a une masse moléculaire de 2,5-megadalton et un coefficient de sédimentation

de 70S (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). La petite sous-unité est composée

de l’ARN ribosomal 16S (cf Figure 1 page 10) (codé par un gène d’environ

1500 nucléotides) et d’environ 20 protéines ; elle permet la « lecture de l’ARN

messager ». La grande sous-unité est composée de l’ARN ribosomal 23S (codé

par un gène d’environ 2900 nucléotides), de l’ARN ribosomal 5S (codé par un

gène d’environ 120 nucléotides) et d’environ 30 protéines ; elle permet la

synthèse de la protéine correspondant à l’ARN messager « lu » par la petite

sous-unité. De plus, divers facteurs protéiques agissent sur le ribosome aux

différentes étapes de la traduction (Schmeing and Ramakrishnan, 2009).

Page 12: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

12

2. L’ARNr 16S : définition, origines et utilisation

L'ARN ribosomal (ARNr) 16S est le constituant ARN de la petite sous-

unité ribosomale du 30S des procaryotes (cf Figure 1 page 10). Le gène codant

pour cet ARNr est le « 16S rRNA gene » (Clarridge, III, 2004), présent dans

l’ensemble des espèces bactériennes en un nombre variable de copies (cf Figure

2 page 13) (Petti, 2007; Woese, 1987). Il est composé d’environ 1500

nucléotides et est constitué de sept régions conservées et de neuf régions

hypervariables (cf Figure 3 page 14) (Chakravorty et al. 2007). L’ensemble

permet donc théoriquement d’utiliser ce gène pour identifier et détecter toute

espèce bactérienne.

Page 13: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

13

Figure 2 : Structure secondaire de l’ARN ribosomique 16S d’Escherichia coli.Source : http://rna.ucsc.edu/rnacenter/ribosome_images.html

Page 14: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

14

Figure 3 : Représentation schématique du gène codant pour l’ARNr 16S. Les cerclesreprésentent les régions conservées utilisées pour le design d’amorces nécessaires à

l’amplification et au séquençage.Quelques exemples de choix d’amorces sont donnés.

Source : Petti, 2007

16S long réalisé au CHU la Timone (amorces fD1 et rP2) et amorcesde séquençage :

16S court réalisé au CHU la Timone(amorces 536F et rP2) et amorces deséquençage :

16S court commercialisé parMicroSeq 500 (amorces 5F et 531R)

Page 15: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

15

Dans les années 1980, il a été montré que les relations phylogéniques

entre les êtres vivants pouvaient être déterminées en comparant leurs séquences

nucléiques (Clarridge, III, 2004). Des travaux préliminaires ont pu montrer que

le 16S rRNA gene code pour un ARN ribosomal de fonction constante dans

l’évolution ; ce gène peut donc servir d’horloge moléculaire pour suivre les

changements dans l’évolution bactérienne. Les séquences du gène 16S ont ainsi

joué un rôle majeur dans l’étude de la phylogénie et de la taxonomie bactérienne

(Janda and Abbott, 2007; Olsen and Woese, 1993). Ce gène a d’abord été utilisé

à la fin des années 1980 par Carl Woese comme outil d’étude de l’évolution

bactérienne (Woese, 1987). En 1991, Weisburg et al. ont décrit des amorces

dites « universelles » permettant d’amplifier l’intégralité du gène codant pour

l’ARNr 16S de la plupart des bactéries (cf Figure 3 page 14) (Weisburg et al.

1991). Actuellement de multiples amorces universelles ont été décrites dans la

littérature. Il n’existe malheureusement aucune revue ni aucune base de données

qui répertorierait les dizaines d’amorces décrites depuis 20 ans. Dans le domaine

de la détection bactérienne, Sontakke et al. ont proposé en 2009 une synthèse

des diverses amorces utilisées (cf Tableau 2 page 19). De plus la nomenclature

des amorces reste non consensuelle ; souvent les auteurs nomment une amorce

avec un nombre faisant référence à la position de la première base sur l’ADNr

16S d’Escherichia coli, suivi de F ou R pour forward ou reverse. Mais cela n’est

pas toujours le cas, comme on peut noter pour les amorces fréquemment

utilisées fD1 et rP2 (décrites par Weisburg et al). Les amorces utilisées au

Page 16: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

16

laboratoire du CHU la Timone pendant la durée de ce travail ainsi que les

conditions de réaction sont données dans le Tableau 1 page 18.

Le terme de « PCR universelle » ou « PCR 16S » sera utilisé par abus de

langage dans les décennies suivantes pour nommer l’amplification du gène

codant pour l’ARNr 16S. Les termes de « 16S court » et « 16S long » feront

également leur apparition dans le langage courant des microbiologistes pour

faire référence à différentes longueur de séquences amplifiées (cf Figure 3 page

10 et Tableau 1 page 18). « 16S court » fait référence à l’amplification d’une

partie du gène codant pour l’ARNr 16S, le plus souvent les 500 premiers

nucléotides mais ce n’est pas toujours le cas (Petti, 2007). Pour la plupart des

souches, le pouvoir discriminant de ces courtes séquences semble suffisant pour

discriminer les espèces entre elles (Clarridge, III, 2004). Pour différentier

certains genres ou pour décrire une nouvelle espèce, l’amplification « 16S

long » reste nécessaire (Clarridge, III, 2004).

En partant de la caractéristique d’universalité dans le monde bactérien,

l’amplification suivie du séquençage du 16S rRNA gene a été utilisée pour

identifier des souches bactériennes mal identifiées par techniques

conventionnelles, mais également pour détecter l’ADN bactérien directement à

Page 17: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

17

partir des prélèvements (Petti, 2007). Ces applications, qui ont ouvert une

nouvelle voie dans la pratique de la microbiologie clinique, sont décrites ci-

dessous.

Page 18: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

18

Tableau 1 : Amorces et conditions de réaction utilisées au CHU la Timone

Amorces d'amplification pour le 16S long * (5' => 3')fD1 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGrP2 ACGGCTACCTTGTTACGACTTAmorces de séquençage pour le 16S long (5' => 3')

536F CAGCAGCCGCGGTAATAC536R GTATTACCGCGGCTGCTG800f ATTAGATACCCTGGTAG800r CTACCAGGGTATCTAAT1050f TGTCGTCAGCTCGTG1050r CACGAGCTGACGACA

Amorces d'amplification pour le 16S court † (5' => 3')536F CAGCAGCCGCGGTAATACrP2 ACGGCTACCTTGTTACGACTTAmorces de séquençage pour le 16S court (5' => 3')536F CAGCAGCCGCGGTAATAC800f ATTAGATACCCTGGTAG800r CTACCAGGGTATCTAAT1050f TGTCGTCAGCTCGTG

Conditions de réaction16S long 16S court

température durée température durée

95°C 5' ou 15' ‡ 95°C 5' ou 15'95°C 30'' 95°C 30''52°C 30'' 62°C 30''72°C 1'30'' 72°C 1'30''

40 cycles

4°C ∝ 4°C ∝

* utilisé pour l’identification et la détection jusqu’en 2005, puis à partir de 2005seulement pour l’identification.† utilisé pour la détection à partir de 2005.‡ en fonction de la polymérase utilisée.

Page 19: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

19

Tableau 2 : Résumé des différentes amorces utilisées pour la PCR 16S dans un contextede détection bactérienne à partir des prélèvements cliniques.

Source : Sontakke et al., 2009

Page 20: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

20

Page 21: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

21

3. Définition d’une espèce bactérienne

La définition du concept d’espèce bactérienne est un point délicat ; la

correspondance entre une souche et une espèce déjà décrite est basée sur une

similarité phénotypique et génétique (Gevers et al. 2005). Les méthodes

actuelles utilisées pour définir les espèces procaryotes ne permettent pas de

couvrir la diversité trouvée dans la nature et la taxonomie bactérienne est

influencée par les avancées dans la génétique des populations, l’écologie, la

génomique et par la facilité avec laquelle les données peuvent être obtenues

(Gevers et al. 2005).

Traditionnellement, une espèce bactérienne est définie à partir de

l’hybridation ADN-ADN, qui est une technique lourde, complexe, onéreuse et

de moins en moins utilisée (cf Figure 4 page 22) (Stackebrandt et al. 2002). Si

on se base sur la cinétique de réassociation ADN-ADN, la définition génétique

d’une espèce est quantifiable. Une espèce est alors définie génétiquement

comme le rassemblement de souches qui ont des relations ADN-ADN se

traduisant par (i) un pourcentage d’hybridation ADN-ADN � 70% et (ii) une

stabilité thermique des hybrides � 5°C (Janda and Abbott, 2007).

Page 22: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

22

Figure 4 : Principe de l’hybridation ADN-ADN entre deux espèces bactériennes. Plus lesespèces sont proches, moins de mésappariements surviennent pendant l’hybridation.

Source : “Understanding evolution”, université de Berkeley, Californie.http://evolution.berkeley.edu/evosite/history/genetsims2.shtml

Page 23: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

23

Le comité Stackebrandt a établi que toute description de nouvelle espèce

devait comporter une séquence complète du 16S rRNA gene (Stackebrandt et al.

2002). Toutefois, pour les pourcentages de similarité, il n’y a pas de valeur seuil

clairement établie au-delà de laquelle la communauté scientifique s’accorde

pour définir le rang d’espèce (Janda and Abbott, 2002; Janda and Abbott, 2007).

En effet, si une similarité proche (≥ 97%) entre deux séquences de 16S ne

permet pas systématiquement d’affirmer que deux souches appartiennent à la

même espèce, l’inverse est vrai : une similarité entre deux séquences de 16S

inférieure à 97% permet d’affirmer que les souches correspondantes

appartiennent à des espèces différentes (Drancourt et al. 2004; Gevers et al.

2005; Janda and Abbott, 2007). Lorsque les séquences des ARNr 16S des

souches présentent plus de 97% d'homologie, le comité Stackebrandt

recommande que l'étude des pourcentages d'hybridation ADN-ADN ainsi que la

stabilité thermique des hybrides demeurent la référence pour définir une

genomospecies bactérienne (Stackebrandt et al. 2002).

Page 24: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

24

4. Place de la PCR universelle 16S dans l’identification bactérienne

L’identification bactérienne se fait traditionnellement à partir des

caractères phénotypiques de la bactérie : coloration (de Gram par exemple),

morphologie, aptitude à croitre sur certains milieux de culture, caractères

biochimiques détectés par diverses techniques commerciales (galeries API,

systèmes Vitek, Phoenix, Biolog…). Toutefois certaines bactéries sont mal

identifiées phénotypiquement pour diverses raisons. En effet, certaines bactéries

expriment peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres espèces, une situation

de stress peut avoir altéré les caractères phénotypiques. Une identification basée

exclusivement sur des caractères phénotypiques peut donc mener à un résultat

erroné. Par ailleurs, les bactéries rares ne sont pas répertoriées dans les bases de

données des systèmes commercialisés et en conséquence, les techniques basées

sur les caractères phénotypiques ne permettront pas de les identifier. Enfin, pour

certaines bactéries à croissance difficile les caractères phénotypiques sont

difficiles à déceler ; la biologie moléculaire simplifie dans ce cas l’identification

(Petti et al. 2005). Dans ces situations, l’amplification et le séquençage du 16S

rRNA gene suivi de la comparaison de la séquence obtenue à des bases de

données ont démontré leur efficacité pour l’identification bactérienne. Il s’agit

d’une méthode universelle, précise et objective, dont la variabilité inter-

opérateur est limitée par rapport aux techniques conventionnelles (Petti, 2007).

Page 25: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

25

Deux études importantes ont mesuré la performance de la PCR 16S pour

l’identification des isolats cliniques non identifiés par méthode traditionnelle.

Kiratisin et al. ont rapporté que dans leur laboratoire 5% des isolats n’avaient

pas été identifiés par techniques conventionnelles, mais l’avaient été par la PCR

16S au niveau de l’espèce pour 74% d’entre elles, au niveau du genre pour 21%

autres, alors que les 5% restants n’avaient pas pu l’être malgré l’approche

moléculaire (Kiratisin et al. 2003). Les chiffres correspondant trouvés par

Mignard et al. ont rapporté que 83,1% des isolats étaient identifiés au niveau de

l’espèce, 15,8% au niveau du genre, et pas d’identification pour seulement 1%

(Mignard and Flandrois, 2006).

L’utilisation de la PCR 16S pour l’identification bactérienne en

laboratoire de routine a permis de découvrir de nouvelles espèces ou de

nouveaux genres bactériens. Avec la généralisation et la diffusion de l’outil

moléculaire, de nombreuses souches présentant un pourcentage de similarité

génétique inférieur à 97% ont été ainsi découvertes. La PCR universelle s’est

imposée comme un moyen de découverte de nouveaux taxons. Par exemple,

Drancourt et al. ont rapporté la découverte de 11 nouvelles espèces bactériennes

parmi 1404 isolats pour lesquels les techniques conventionnelles n’avaient pas

été contributives et analysées par PCR 16S (Drancourt et al. 2004). Dans ce

travail, des pourcentages de similarité supérieurs à 99% avaient été choisis pour

assimiler une souche à une espèce déjà décrite ; de 97 à 99% pour l’assimiler au

Page 26: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

26

niveau du genre ; et inférieurs à 97% pour décrire une nouvelle espèce. La PCR

16S est donc un outil majeur d’exploration de la diversité bactérienne

(Drancourt et al. 2004; Janda and Abbott, 2007).

Page 27: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

27

5. Place de la PCR universelle 16S dans la détection de bactéries à

partir de prélèvements

La PCR 16S a aussi été utilisée comme un outil de détection moléculaire

directement à partir de prélèvements cliniques. Il s’agit donc d’une méthode

alternative, indépendante de la culture pour la détection bactérienne (Petti,

2007). Rampini et al. ont montré dans une étude publiée en 2011 que la PCR

universelle avait permis d’identifier un agent pathogène dans 42,9% des

prélèvements négatifs en culture provenant de patients ayant une infection

documentée (Rampini et al. 2011). L’utilisation de la PCR 16S « diagnostique »

a notamment été proposée dans certains cadres nosologiques (Petti, 2007;

Sontakke et al. 2009) : dans les endocardites où la PCR universelle peut être

réalisée sur le sang total et les valves cardiaques (Fournier et al. 2010; Rovery

et al. 2005) ; dans les abcès cérébraux ou les méningites à culture négative (Al

Masalma et al. 2009; Sontakke et al. 2009) ; ou dans les infections ostéo-

articulaires (Fenollar et al. 2006). D’autres applications moins fréquentes ont

été proposées : infections du liquide amniotique, empyèmes, pleurésies,

neutropénies fébriles ou encore péricardites (Sontakke et al. 2009).

L’exemple des endocardites à hémocultures négatives illustre l’intérêt de

la PCR 16S pour la prise en charge diagnostique et thérapeutique des patients.

En effet pour les endocardites, la positivité des hémocultures fait partie des

Page 28: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

28

critères de Duke pour le diagnostic des endocardites infectieuses (Habib et al.

2009) ; mais dans 2,5 à 31% des cas, les hémocultures restent négatives

(Fournier et al. 2010). Depuis plus de 10 ans, l’apport de la PCR 16S réalisée

sur les valves cardiaques de patients opérés pour une endocardite infectieuse a

été largement décrit dans la littérature (Gauduchon et al. 2003; Goldenberger et

al. 1997; Greub et al. 2005; Lang et al. 2004; Podglajen et al. 2003;

Vondracek et al. 2011). Ces travaux ont montré que la PCR 16S présentait un

intérêt particulier dans les situations où les patients avaient reçu une

antibiothérapie préalable (Podglajen et al. 2003) ou lorsque l’endocardite

infectieuse était due à un agent fastidieux (Fournier et al. 2010). Cela permet

ainsi d’améliorer la prise en charge thérapeutique post-chirurgicale des patients

(Gauduchon et al. 2003; Lang et al. 2004; Podglajen et al. 2003).

Comparativement, la culture traditionnelle des valves cardiaques présente un

intérêt limité (Greub et al. 2005; Vondracek et al. 2011). D’autres travaux ont

également évalué l’intérêt de la PCR 16S réalisée sur sang total pour améliorer

la prise en charge diagnostique chez les patients non opérés et donc sans tissu

cardiaque analysable. Mais on retrouve une faible sensibilité de la PCR 16S sur

sang total pour le diagnostic étiologique des endocardites infectieuses (Fournier

et al. 2010). Enfin, il a été proposé que l’approche moléculaire soit intégrée aux

critères de Duke pour le diagnostic des endocardites infectieuses (Millar et al.

2001), mais cela n’a jamais été pris en compte (Habib et al. 2009).

Page 29: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

29

Théoriquement, le champ de la PCR 16S ne se limite pas aux infections

monomicrobiennes, car les techniques de clonage et de pyroséquençage

permettent d’identifier différents microorganismes à partir d’un même

prélèvement (Al Masalma et al. 2009; Armougom et al. 2009). Une telle

stratégie, longue et onéreuse, est toutefois difficilement applicable dans le cadre

de l’activité de routine d’un laboratoire. En pratique, la technique permet la

détection de certaines bactéries de croissance difficile (mycobactéries, bactéries

contenant des acides mycoliques, bactéries intra-cellulaires telles que Coxiella

burnetii, Bartonella spp., Ehrlichia spp., Anaplasma spp., Francisella

tularensis, Mycoplasma spp.) ou dont la détection par culture conventionnelle

est rendue impossible en raison d’un traitement antibiotique préalable (Rampini

et al. 2011). En revanche, la PCR universelle appliquée en parallèle de la mise

en culture de prélèvements, pour des patients infectés et n’ayant jamais reçu

d’antibiotiques ne semble pas contributive (Rampini et al. 2011).

Page 30: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

30

6. Objectifs du travail personnel

Dans le cadre de ce travail, nous avons voulu évaluer l’applicabilité de la

PCR 16S comme outil d’identification (articles 1, 2 et 3), de détection

moléculaire (article 3) et de découverte de nouvelles espèces (articles 4, 5 et 6)

au sein d’un laboratoire hospitalier de bactériologie. Les résultats de cette

évaluation sont rapportés ci-après.

Page 31: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

31

ARTICLE 1

Gordonia sputi bacteremia.

Renvoise A1, Harle J-R2, Roux V1, Raoult D1.

Emerg Infect Dis. 2009 Sep;15(9):1535-7.

1 URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France

2 Service de médecine interne, centre Hospitalier Universitaire La Conception, Marseille,France.

Contribution de AR: récueil des données clinico-biologiques, analyse des donnéesmoléculaires, travail bibliographique, écriture du manuscrit.

Page 32: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

32

Commentaire

Dans ce travail nous avons rapporté l’identification d’une souche

bactérienne d’origine clinique par séquençage du 16S rRNA gene, suivi de la

comparaison de la séquence de 1464 nucléotides obtenue sur la base de données

Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Nous avons pu ainsi décrire

une bactériémie à Gordonia sputi.

Ce travail souligne que les bacilles à Gram positif cultivés dans les

flacons d’hémocultures ne doivent pas être systématiquement considérés comme

des contaminants ; lorsque les critères cliniques et microbiologiques sont

compatibles avec l’imputabilité de tels microorganismes dans un tableau

infectieux, ils doivent bénéficier de techniques d’identification plus fines que les

techniques biochimiques classiques. En effet les profils biochimiques peuvent

conduire à des résultats erronés ; ainsi dans le cas des Gordonia spp. identifiées

par biologie moléculaire et rapportées dans la littérature, les souches avaient été

initialement identifiées comme Rhodococcus spp., Corynebacterium spp., ou

Nocardia spp. (Blanc et al. 2007; Blaschke et al. 2007; Lesens et al. 2000;

Sng et al. 2004). On sait que la PCR 16S permet une meilleure identification

des bacilles à Gram positif aérobies que les méthodes phénotypiques

conventionnelles. Bosshard et al. avaient rapporté que sur 136 souches cliniques

de bacilles à Gram positif mal identifiées par techniques conventionnelles

Page 33: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

33

(seulement 52,2% des souches avaient été identifiées au niveau du genre par

technique conventionnelle), la PCR 16S avait identifié 65,4% des souches au

niveau de l’espèce (définie par une similarité � 99%) et 31,6% supplémentaires

au niveau du genre (défini par une similarité entre 95 et 99%) (Bosshard et al.

2003). Enfin, une série rapportant l’identification moléculaire systématique

d’isolats non identifiés par techniques conventionnelles avait retrouvé que les

bacilles à Gram positif étaient surreprésentés parmi les isolats rarement décrits

en pathogénicité humaine (Drancourt et al. 2004).

La revue de la littérature réalisée à l’occasion de ce travail a permis de

montrer que les espèces du genre Gordonia spp. causent un large spectre de

pathologies humaines dont la connaissance a pu être développée grâce à l’apport

de la PCR universelle 16S (Blanc et al. 2007; Blaschke et al. 2007; Gil-Sande

et al. 2006; Iida et al. 2005; Jannat-Khah et al. 2009; Lesens et al. 2000; Sng

et al. 2004; Verma et al. 2006; Werno et al. 2005). Ce travail illustre donc

l’apport de l’identification bactérienne par PCR 16S dans la description de

maladies infectieuses, qu’on peut qualifier d’émergentes dans le sens où le

diagnostic microbiologique ne pouvait être réalisé avant l’ère moléculaire

(Drancourt et al. 2004).

Page 34: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�������

����������

����� ������� � �� ������� ��� ������ ����

����� ���� ������� ���� �������� ����

���������������� ���� �������� �

��!� "��� ��!��� #$��%&'���� ����

����������� ������ ��������� ���

���� ����(����)&� *�!� +����� �������� ���

����,� ��-����� � �*� ������ � ���� ��

������ ��� ����� �������� ���� ��� � ���

* �������.//01�/,232'4���56,��/��/�078�

�8���.//0�/9�//�

.� :;+� �� %��� �� � �<�= >� ?����

@�� ����������)�������6���������$!�

�� �* �+���!'������� ���+��

�������� ��!�"��� ��!���#$��%&'

���� ���� ���������� ���������� ���

�������� ������-���(�����������*��<+���

��� :!��(� � � � �+���� .//A1�

B4,A�.'..�

��3�� �� �+(�:)��>������$�� ������ ��>����

C���5��D����+� ���)��������E����������

����!���!������ ��� *�� E��������

������ ��)���!� �+�)����� @�!����

�� .//01B/,��94'4.�� �56,� �/���.47

))@�B/�2���94���4.�.//0

��2�� :�����$������+����)�� �����%��@�������

��� ��� $�� @�!�����-� ������� �*�!����

������ ������!��� ���������������!�����

��� -����� ���� ��� -�-���� ���!������� �*�

���������� ����� ������� �� ������ �

����� �*� �����(� F���E����������������

������� ��� ��� G���� )���!� �+� )�����

@�!������AAA123,.�3�'9�

��B�� @��������)�� �������C�� ������)�� %����

)�� @������� @�� C����� %�� �� ���� ���� ���

�(����� �*� ����!���� � ������ ������ �

����H�+����� ��!���$!��6�* �������

.//01�.,��2B'4�

��0�� �8;����� ��I�!����� �H��� ��� ��( ����

������?����=���( $��������D�!�������

�������� ��* ����� (�������@�J� �+���

�� ��!���� K����� ������� $!�� 6�* ��

����� .//41�2,�AB9'A�� �56,� �/�3./�7

���2�.�/4/2A2

��9�� ����!�� C5�� ��!��� >�� ���� ��� ��-����

)��)�+�� ��� $!�� � �*�@�J� ��B�

�(�� �������� ��!� +����� ��!���

���� ���� ���������� ����� ��� ��H����

�������K�����)�+�$!�������� �� ��

�+����� .//41B9,44�'0�� �56,� �/��/AA7

8!!�/�29B/A��

��4�� @����� ����������>��������� �������

����:�-������+� ���� ���� �� ����

����(���� �*� ������-�� ���F��� ��� �

� ������ � ����������� ������ �������

��� ����� ����(����),�������������

��� L���� ����M� $���!���� 6�* ���

.//A1�39,49�'4�

��A�� :�(� ��� ��+� ���)�� ������-��=� ��� ����

@D���� �+(�:���������������������!���

!������ E�������� ������ � ��� ����

��� �������� �� ����������� �������

@���� 6�* �� ����� .//0123,.A9'3/2�� �56,�

�/��/407B/B3A�

)����� *�� ������� ,� I-���� �*�*��

��+�� �� �� 6��������� ������� 39�� 344BB�

>�������:!��(1�!���,��*�*(N����

������������ ���������

������������ ��������������

��0A�(������!���H����*-�H�������

������=� �� �� ����� D������� ���

!���� ���� "������#��������� ����

��� ���� +���� ����� ��� �� �����

��� ��+� � ���� ������ 6� ���!+�

.//9� � ��� �-� � ��������� �*�

��(����� �� ��H�� ��E����.� ��

!�����(����!������������� ����

-���� ���� #@C@&� �� � ��� �*�

H�� � � ��� �-� 0 ��(� +*��

��� ��-!+ -����� ������� �� ��

�������� ��B (�� ���� ��� +��

������� �� ��� �������� $� ��� � �� ��

�����-!+���!�������������� ���

�������#��99�O��/% ���� (��7% H���

/�2A�O��/% ���(!������ �� ���7%&�

��� �� �-��� @�� ��- ������

�-��#�B��!�7%&������������H������

!���� H��� � ���!���( ����������

�*� �������� �� *+��� ������ (���

���1 �� ����� �* ��� *- !�����

�� ��� ����� *� ���� H�� G���

��������� ���� � �� ����� �� � ���

�� �� ��� ��( H�� ��� �� *�!�

� ������ -�� ��� *�! �� @C@��

:�!�������-� �����H� ��� ��� ���

+� +���� *�! �� @C@ ��!��� ���

!� �������!�H��� �����G��+(�+���

�!� �� ���� ����� )�6 @�(� �����

#+�� P���� � (��Q$����� ?�� &�

������������� �� #A2R���!�����(&�

��� ��� ����� ��� ��� ��� �� �� ���

�� ��� ��� �� � ����� ������� � ��

����-���� �� � ������ ��-������� B ��

3O7��(1� ���F��� ��� .//�!��.O7��(1�

��� ������ (� ����('���!��������

������� &�� ��� ����� ����� ��������

��� �� ���(!������ �� �� �����

���� �� �������� � ���&������ � �

�+������������(�H��� ��������*�

��H��

�� ����� �����G ������ �*� ���

������ H��� �*�!�� +(� �0�� ��)

�E�� �����>� �+������ �� ��202�+��

�E�� �� H�� �� H��� *����� ��� ��*�

�������������� � �������������

�������� ���� #:������ � ������

����J4/032&��>� �� ����� ����� ���

�� ��� ��� ���������������� �������

!��� ����� +(���� ���� + ���� ��

H��� �!!��� �!��!���� ���� ����

�� @C@��>� ���� ���� �� ����!������

+ ���� ��� ������!����� ���� +�����

��������!���F����*���!������������

+ ����*-����-���*�����!���

H��������!� �+���������

�������������� H���G��� ��

��� ��� � �%�� ��� ���������� ����

��� ������� *�! �����! �* ��������

H��� ���!���( ����� � *�! �����

��'��� ������������������ ��� �(

��������������� �����������*� ���

������������ ������ �������

����������� ������� ���������

��� ������ �������� �� ���� ����

+��-�����-�����!��+(������

!����H���������������������� ���

������� �����������������!��

���������������� ����AA9�������

����+�����������+�������������

����� � �� ���������"������������

��� ����( ������� .9 ����=��

�� ��1 ���( 9 ��- +� �� �+� ���

��!�� ������ �� �� � �����G��

+(�!�� ��������(����

������� ����� ������H����� �

��!� �*� ������ ��� ��!���� ##$�%&

��+�&�� ������� � ���� -�� ���� ���

* ������ ��� �!!��� �!��!���� ����

�!!��� �!���������������-�+��

������ @�������� ���� ������(�

��* ���������������������������������

����������-������(�� ������(�

��� �!!��� �!���������������� ��

� ������������������ ������� ����

+�������!������� �!�������������

*�!�����(��� �������� ���������

E������������#'&���� ��� ��� (��

� ��('��������������������������

��(� ���(� ##&� ���� *E����(� ���

@C@�� ##)*)+'� @����� !�-��� ����

���� ����������� ��� ��������� ��

�������� ������ � �������� � ������������� � ���� ��� ��� �� ������ �� !""�# ��$�

Page 35: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�������

������� �� ����� ��� � �� �����

�+&�� +��� ��� �!!�������� -����

*�� ������� ���� ���� �*� ��* ����� ���

�� ������������������ ����+' ��

������ ��� +� �!���� -��� ��������

������ ���������

� �+������ � ���������� �*����

����� ����� !����� ��*G ����� ����

�!� �����G��� ������������ � ��

�����G ������ �*� �������� ��� ������

������ �� �# '(+ ,' ��� ����� ���

������������ ���*'���������

���+&��6����G ���������������������

��� �������� ������������� �����

�0����)��E�� � �!��������

�� ����������� �� ��� ��� � �

�+����������� ���+����(������������

+�������!����(�����-���+�������

!� �������!���!����+���� ���+��

���!��(�����!� �+���������#+&����

-��������������������� �!+���������*�

��� ������� ���� �!�����( ������ ��� ��

�����+�� ����(� *�����������������

�������� � �*'� @�+���!� �� F���

�E�������� ��� �!+�������� H���� ���

�!�����( ����� ��������+�����#+'�

)���!� �+���� ���� ��� ���+����(� ���

� � ��� �� ���� �� ����������� ��

��� �� ��������� ����� �� ������(�

�� � ��(� �����G��� D�H-�� ���

������� -�� �!( ��� ��� �*��� ���� ���

���������������� �� ����� ��� ��

�-���������(���R��*�������� ��

������� ���� ��� ����� �+'����������

!���� ��*�� +� -������� �� �G�

�������������� ����

������� �������� ���������

+� ����H���� �!��� ������ ��� ��!���

�������!�����+��� ������������

�(�� ������G �������*�+� ������ ����

�� ��� ���������� �����*G ����� ���� ��(�

���*�������(� �����G�����������

������ ���������������� ��

�� ���� �����G ������ �*��������

����� +(� ������ �0�� ��) ��� ��

E�� � �!���������+������� ���

� ��=�����������!���������+ ����

���!��������!��� ��������*� ��

��������������� �������������� ����

H����!�� ��� �-� �� ����������� ����

��� ��� ���� �!���� ������� :�!�

������-�+� �����!�������*�������+�

�������� ��������� ������������� �

����� ���� ���� � ����� ���� � ��

!�� ��� �-� ��� ���� ������� +� ����

�����(� �����G��+(�!�� ����!���

��� ���� � ����� ����� ���������

������ �����

>������*������$�����(������*��

-���������$��������*����!���� ����

�����������������

���������� ������ �� ��� �������

�� �������������

% �&�� �'��������( )*����� �� �� +������

,��������� -���� .%� /�������� �� /�� ���

�� /� 012 ��� )*����� �� 3� 4���������

,�������� .5�6/� )����1

�7�( �"�$!"�������"��"8"�"$

����������

����� �����!��� ���������� �*� �� �H�������

��������*���������(�� ���*����������!��

� ���������������*���������H�������!��

��(����������������������:�� � �+�����

�A9�104,�B'.2�

��$9 �������� ������ � �������� � ������������� � ���� ��� ��� �� ������ �� !""�

+� ���#� ����: �#������ �������#���������#�������� ����;#

4������#��������# : �:����#

�������� ��� ��� ��� 4 ����� � ��+ ����� � 7�������� ��� /���������:#

������� ������� <��������#.4�41#.�1

�����������#.�1

��� ��� <��������.&���:������1#.�12 ��������#.4�41#.�12 ��������.4�41#.�1=

>��� ������ �#�?��#������#.�12#����� ���#

� ���� .�12���� ������ ���������#.�12

�:�����#�#�&�#&���#.�1

,����������# ����#� ���� .�12 ����#� ����#

.�1=

�� ����������� <��������.��@ ��������#� ��1

.�1

/� �����# ������ ���� .�1

������ �����#.����������� ���#

�& ��1#.�1

�������#�� ��#��������#.�1

����������� �������� �����������#.4�41#.�12= ��������

.4�41#.�1=

�� �������� <��������#.4�41#.�1

��� �0�����.�1

<���&���� .�1

�� ���� <��������#.4�41#.�1=2#�����������#

.4�41#.�12�������������.� ����:1#.�1

������� %��&�����. ��� ��� � ���������#����1#

.��1

;��+�#����#�����#�&����2#4�4�#������#���� � ��&�����#A�������#����#��� ����������# �����#��&������#������ B&��#������� ��� ��������� ���&#������� ������#�&� �����#�� ������ ��#������&�����#=��� ������������ ��������

Page 36: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�������

��.�� %����5��D���!����I����������D���

��� ���������8������� �� ������� �� ��

���� �� �!��� ���� ��� ������� �����

���������� ��� �� ���� ���� ���

�����-����� ������$!��6�* �������

.///10,34.'B�

��3�� C!�������H�� � �����=�CD�� �(�

�$������H����):����������:��� �� ����

����-� -��-� ��� ������� ��� ��������

���� �����������-����,� ��� ���� ����

-�H� �*� ������� �*� +�������!� ���

* ������ ����� +(� ������� ��� ��� �

@���� � �+����� .//0122,�A/B'4�� �56,�

�/���.47�@ �22�B��A/B��A/4�.//0

��2�� ���� %D�� ���� �D�� ���(� ���� ?��(�� ��

�����>��� ���� �D�� �� �!��� �����

�� �������� ���������� � � �� ���

H���� �E������� ������ �� @���� � ��

+����� .//212.,.49/'��� �56,� �/���.47

�@ �2.�0�.49/�.49��.//2

��B�� :�������� $�� ����5��� �� @�!���

@ ���?��$��+���$��)������%��:� S��

��%�!��� ���$������� ���!�������G ������

+(�������+�� �!� ���������*�+� �!���

�����+(������������ ����� �� ����

�����*�����������*�� ��� ��� (��������

�� @���� � �+����� .//0122,.02B'9�� �56,�

�/���.47�@ �//222�/0

��0�� ���� ���)�����������(�������@%�����

������������(���������@)���������������

�� ��,� !����� ��������� ��� ������ �

��������������������G��+(��0���+���!�

�����) ����E�� �����@����6�* �������

.//912B,243'0���56,��/��/407B.//�)

��9�� >���) ��)����������@��!+������

%����D �� ��� ������� ����+����

�+� ��� �����+(������������������� �

��� �!!��� �!������������� ��@���� ��

�+�����.//B123,3//A'�/���56,��/���.47

�@ �23�0�3//A�3/�/�.//*

��4�� 6������������� ���D�����(�!��)��I�=�H��

���@��+����D�� ����������������������

������ �� ���� ������� ���� � �� ���

H���� ������ �������� 6��� �� �(��� $-��� ��

�+����� .//B1BB,�49�'0�� �56,� �/��/AA7

�8��/�03.4.��

��A�� ���� � C�� ����� �� ������� )�� ��

+���� C�� �����(� $�� ������=���-��

+ �� ��� �������� ���,� �� ��*G �������

��������!������������M� ��@���� ��

�+����� .//912B,�/90'9�� �56,� �/���.47

�@ �/.3A2�/0

�/�� ����������������D���(�$���%�����)��

����H���� ):�� D�������� D��� ��H��

�!� �������� ���� ����� �� ����� ����

� �� ��������� ���� �� ��� ��� ����

��� ������� ��� !�� ��� �-� ����� ��

���� ������� ��* ������� �� @���� � ��

+����� .//A129,2AA'B/.�� �56,� �/���.47

�@ �/�B/2�/)

)����� *�� ������� ,�CP���E��������

%�+���������� �P������'C��������DT������

�� �����!����@����K ��0/./�� 6?�24�� .02�

�������������334B� �������@$�$J�/B��

?�� 1�!���,�-���A�N���!���� �!

������������������������������

���������������������������

��� ���� ����� 6���-����� �!�

!������+����� #6C6�&� ��� ���� ��� ����

������ �� ��� � ��� ����� ��� � ��

������H������!�(��!!����G �� (�

������ ���� ����� H���� �����!!���

���� ��F�!!���(�������� #�&�� 6C6��

�������� ������ 6�:� *�!� U��///�

+����� ������ ���� ����+����� ��������

-������ �!!��� ��!��� ����������

�� ���������F��=��-����)�

>���������*G � (��*� �!!�

���� ���������� �*� 6C6�� #B/�!�7!%

�*� �����(� ���G�� �!!������+����&�

����������!���+�(�� ���F��=��-����

��$�#������#,��'������ �������

� ��-��(����������-������F��=��-����

) #DB��&��6C6������������ #5 ����

�!1�5 �����!���C������)����������

?�+���!!�1� 6��������� :�*����� ���

������ �����&� ���� �!��������������

����+������#D6&����������������+�(���

D��������D3�.� ������� *�!�./� ���

2/��D�!���6!!������+�������D�2�/��

#D�+����E�������$������������

!� ��� ����D�+��������Q�����+�� �

�*�@����&����� ��H�D6� �������������

�-������F��=��-�����#�/�*����+�(��

D3�.�����V�/�*����+�(��D���&��)��

�� ����H����������� ������+�����

�������� �!����������� #D)&� �*� ��+�

�(��DB���#)7����+����7����7����

�����H��7���/�/2?7.//2&������(��*�

���6C6������������#D6�����V�/&�

D�!��� ��F��=�� ��+�(�� D����

����� ��� ��!� ���!������� #�)&�

��+�(�� #��!��� ��&� ��� ��+�(��

#*����� ����'�-����������������

H���� 6C6�� ����������H����� �

� ������ ����+����) � ��-��(��*���!���

���� �-���� ��F��=�� -����� +(� ������

�����!�����������+������#�6&�����(�

�#&���6�����H����G��������� ���

� ����*���������������������������-�

B/R��� ����� �!����H����������*�

���-���� ������

)�� 3 6C6� ��������� ����+����

�) � ��-��( �* ��!�� �� #�6 ����

�������� ��+�(�� D���� ���� .B4'

A40& ��� ��!�� �. #�6 ��� ��������

��+�(�� D3�.� ���� ��3/A'3�.92&�

$�=(!� � ��-��(� �*� �-���� ��� #9,�

��������1� ��4� W� �) X)7C����!7

���/30�7.//B� DB��Y&� H��� ����+�

����+(�����6C6������������#�6����

�����23'.3�&������G�����������

������� ����+�-�������*�������

�=��� ����+���� ������� ��!�� �� ���

��!��� ��!�� H�� �� ����� ����+��

�=(!� � ��-��(� �*� �-���� ��� *�!

��+�(��DB��� #* ''� -� ���� ������

6C6��������������������-����

��� �� ��+�(��DB�3�-���� ���H�� �

��� �, �$ ��� ��� ��� ���� #��,

-��� #0,�,� ��������1 0 �������

���� *�!� ��4� W� D) #)7C����!7

���/30�7/B� DB��&� W� �) #)7�� �7

:!��( �./9 D.�3& ��� �+�-��

���** ��#�6�����V�/&������3���+�

�(��+������ ��� �-���� ��F��=���)�

����� ����+���� ������� �) �� 6C6��

��������+��� �G �*������� � ��

������� ��!��� ��F��=�� -����� #���

!������������!����.&�

K�����D) �����)��-����!�����

.� ����!���� # .&� ��� �����(� ���

�-���6������ ���������*� ��*�

���-�������� ��!���� ��� �����������

������*�����+��(���������!�������

�������#$ ����$ �( +'�-���������

� ��-��(��*�6C6��������������������

�� �������� .� ������ ��-��

*�!���!��� ��F��=��-������*�D���

D.������D3���+�(���# �%%�$C$��

�6��$>:@�@�����&� ���� �����

��-�� *�!� )7D���� ����7�B07A9�

DB��� # �%%�$C$�%���:>:@�

@����������)7��������7����437.//2�

DB��� # �%%�$C$�����$>$@�

@�����&�+(�������$%6�) #.'�$�� �

+��(�����H����G��������� ����

����*��������������������������������

���� ��������(��*�/�B����2�2��!�������

������

������� ���H�� ������+��

-�������� �!���� 6C6�� �����������

�����+(� .����������-��*�!�

��**�����F��=��-�����#��������

44'.3�0�2&��)!�������3������������

D�!��� 6!!������+������ �D� 2�/��

6C6�����H�������������������������

�������� ������ � �������� � ������������� � ���� ��� ��� �� ������ �� !""�# ��$C

Page 37: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

37

ARTICLE 2

Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia inhomeless woman.

Rebaudet S2, Genot S2, Renvoise A1, Fournier P-E1, SteinA2.

Emerg Infect Dis. 2009 Jun;15(6):985-7.

1 URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France

2 Service de maladies infectieuses, centre Hospitalier Universitaire La Conception, Marseille,France.

Contribution de AR: recueil des données de biologie moléculaire et bactériologiques, analysedes données moléculaires, participation à l’écriture du manuscrit pour la partie biologique etau travail bibliographique.

Page 38: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

38

Commentaire

Ce deuxième travail rapporte l’identification d’une souche de bacille à

Gram négatif isolée d’une hémoculture pour laquelle aucune identification

phénotypique n’avait pu être obtenue. Seul le séquençage du 16S rRNA gene

avait permis l’identification d’une souche de Wohlfahrtiimonas chitiniclastica.

La description de ce nouveau genre associé à cette nouvelle espèce avait été

publiée de façon concomitante au cas hospitalier décrit ici (Toth et al. 2008) (cf

Annexe 1 page 88). Ce travail souligne donc l’applicabilité de la PCR

universelle dans la description de maladies infectieuses émergentes, ici au sens

d’une pathologie humaine inconnue jusqu’alors. Il est à noter que, depuis, un

autre cas de sepsis associé à cette espèce a été décrit (Almuzara et al. 2011). Ce

travail se place dans la continuité d’une étude qui avait rapporté 16 isolats (sur

1404 identifiés par biologie moléculaire) correspondant à des espèces

bactériennes décrites, mais encore jamais associées à une pathogénicité humaine

(Drancourt et al. 2004).

Certains auteurs proposent que lorsque des souches inhabituelles sont

identifiées par biologie moléculaire, les laboratoires apportent des informations

additionnelles aux cliniciens pour les aider à replacer ces espèces rares dans un

cadre microbiologique plus familier (Petti, 2007). Ainsi, il est recommandé de

donner au clinicien le nom de l’espèce la plus proche, le pourcentage de

Page 39: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

39

similarité ainsi que la base de données sur laquelle la comparaison a été

effectuée (Clarridge, III, 2004). Dans le cas présent, nous avions répondu au

clinicien que pour la souche isolée chez son patient, nous obtenions un

pourcentage de similarité de 99,5% avec la souche E43 appartenant au genre

Ignatzchineria spp. (numéro d’accession Genbank AJ517825). Quelques jours

plus tard, la description de W. chitiniclastica a été publiée (Toth et al. 2008) et

on pourrait rendre aujourd’hui pour la même souche, un pourcentage de

similarité de 100% avec la souche H100 de l’espèce W. chitiniclastica (numéro

d’accession Genbank HQ407275).

Page 40: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�������

������������������� � �����������

��������������������� ��� ���������

����� ��� � ����� �� ��� �� ��� ����

���������������� ��� ����������� ��

�� � ������ ��������� ��� �� ������

������ ������� ������������ �����

� � � ����� �� !"# ����������

��� $���� � ��� � ���� �����

%$&'()�)�� ���� $&'(�)*+� %�+ ���

� ������ ���� ��� ,������ -..*��))(

����� ��� ���������� ��� ����� ���

���� ���!���������������������

������� �������������� !"

����� ������ � �� ���� ���/ ���

0����*)�����1� ��-� %�+��$������

������������� ������ !"# �����

��� 1�� ((- ��� �� �� ��� ���� ���

%������������ ����/������� �

������ ����/������������������/�

������ ��� ��+ �������� ��� ���

�������� �������� ������ ���� ��

��2����� 3 4 ��� ���� �� ���

!"#�

�� �� ������ ��� !"� ������ ����

������� ������ � ��� ����� " �/� �

������� ������ �������������� ��

���� �� ����� ���� !"� ����� � �5�

������/� ������� ��������� ����� ���

����� ����6����/������ �� ������

���������������������� ��7�����))8�

%�+������ ���9���������������������

� �� ������������� ����� ��������/�

���� �� � ���� ��� ���� ���� ��� ���

������������������%���������������

����������� �������� ���� ����� ���

���� ���� ��� ���� ��� ��� ���

�� ���� ��� !"� �� ���� ����$���

�� �+5� ��������������/��������������

�� ��� ������� ���������� ����� ��

������������������������� �������

�� ����9�����/�������� ���������

�������� � ����� ��������� ������ ��

������� �� ������ � �� ��� ���9�

������� ��� % �� � �� ����/� !"#

�����������������������������������

������ ��� ���+�� " �����/� ��� ������

����� ��� �� ��� ��� ��� � ��� ��� ���

���9�������� ���� ����������� ����

� �� ��� � �� ��� ��� ���� ������

������������ ����� ��� !"#�

:��������� ��/� !"�������� ��

����������$���� ��������������

� �� 6������ 3������������� ����

� �� ��������� ;���������������� ��

� ����� ����� !"/������ ����� ��������

� ����� ������ � ������� ���� ����

������������

<�������' � ��$�� /���������'����/�

� �� ��0���� /�����4����� � ��� � ����

�������������� �� ��� ���� �� ����

�� �� ���� ���� �� ����� ������� ���

4 # 6���� %������ ���� ��3�� ���)).�

)��=*-+�

�������� ������������������������

���������������������� ����������

����������������

��������������������

����������������������

!����"�������������

���#��������

#�����$%��������������

&�� ���������������

���&��������$�""�

������� ������� ��� ����� ��� �� ���� �� � �

�������� � �� ���������� ���������� �����

��������� ���� ����������� ��� ��������� !� ���

��� ��� � �������� ��� � �������� ��������� "#��

�$���� %� ��&� '�(��� ����)� ���� ��� ������ ���

������������� *�� ���������� +�'�� ��$�,�� �����

-���$$����� !������������ �. �������)���/����

���� �0��� /������� �0��� -������ ���� ��$���

1�� ��$���(������ !� � �������� ���������

2��$������ ���� �#�� � �� ��� !� .�� ������

+�������'��������. ���3���������1�)$���1��

+�����, !�� �������������$������������ ��4��

'�(���-��'�%%� �

�5���67�38769���6:7;�7<6:;=

$�'������

��(�� ������� >/� <� ������� 1�� �����

����� ������� � ����/� �� ������� ���

���� ����?���@��A��� ���5��))B�

����� �������>�� ����� ������������� ��

������ '����� :�����C ��� �))=5=A�)*2(D��

C>:A�()�()(=��(DB*�*)--%)=+B)D*.��

��*�� 3���� 1/� � ����� :/� 3���� � ��� �/�

1��� �� �� 1�� ����� ����� �����

��� ������� ��$���� ��������:�����C ���

�))D5()A(D=.2B�

��D�� 0����� #/� C ���� :/� ,��� ������ $��

����� ������������� �� ������ :�A�

����;��� # ���� ,��������� E/� �� ����

1��� ��� ���� ���� � ��� �������� ��

������ ���� � ����� ��� F �� $���� ��G��

"�#$���� ��%���&�����

��.�� 3����1/�C����� /�$ ����/�3���� � ���

�/� 3��� ��� 0/� #���� �/� �� ���� # ��� �����

�� ����� ����� ������� �� ������

�����:�����C ����))B5(*A8).2=�

��=�� 4�� ���;�''/�0��� ��6>/�,� �;����6/�

4��� �� 3�/�,����1�/� �����;��"/� �� ����

0�������� ���� �� ��� ��� ����� ������

���������� ����� ������������ ��

����� �� ���&� ���1����� �����1��7�

����0���!����(--B5.BA.(�28�

��B�� ,������� 1/� ,�H�������� 0�� 3�������

������ ��� ����� ������������� ��

����� �� $���� �A� �� ��� � ���� �����

�������� �����))85(*��� A�(88D.�

��8�� 3����1/�0���;���! /��� ������/�C�����

#6/� 3���� � ����/� 3 ��������� :/� ��

���� 1 ����� ��� ����� ����� ������

��� �� ����� ��6����/� 7���� �))8�� ����

���� �����))85(*��� A�(8-.��

1������ ��� ������������A� :��� � ����/�

?� ����� ���� ��� :���� ���� ���� 3��� ��

'�������(�)��*� ��" +�)�����"�#�� ����

$���� �5���� �A� ��I�� ����J�� �����

������������� ������������������� �

������� ����

��� ���� ����� :��0��� �))=/� ��

=)��������� ��������� ������ � �� ��

� �������������� ���������� �����

�������������������������� ���

��� ��� !��� ��/� 0��� ���/� "������

,��#-������ ��� .���� ������ ���� �� ��

���������� ���� ��� �� ��� ���� ��

������� �/���� ���������������������

��� ��/���������� ������������������

� ����������� �������������������

������ �����>���9�� �� ��/���������

������ �� ��� � �� ���� ������ � ��

����������������������� �� ��5���;�

������� ����� ���������� ������� ��

��������� �������� ���%*8K +���������

� �������� �9�� � ���� ��� ��� � ���

��� ����� ;������� ��� ���� ����!����

��)�-� �/%����� ��%��#0�� ��0����

��� ��� ������ ��� ��� �������� $�����

������ �� ������� ������ ������� ��

1(���� ��� �����������������>�???��������9����>�@����6:������;��A� ��877B B<:

Page 41: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�������

%)�DD� L()-�'+/� ����������� �� %�8�

L�()-�'+/������������������������

���� ��#0��0�� ���� 1����-�����

=�8���'+/� ���� �� ���� ��� ��� ��

������ ��� (8�����'��'����� ����� ���

���������� ����� ������������� ���

��� �� %(����+/� ���� �������������

���� �� ;����>�� ���� */� �������� � ���

��� ���� '���������� ���� �� �� ����

����� ����� ��� ��� �� ���� ��� ������

����/�������������������� ���� ���

���� ��������� ����� ��� ��� � ��� ���

������������������� ������� �/�

���������� ��������� ���� ��� ����

!�� �� ��%"+/��������� ���

:�� �����/� �� ������� ��� ������

����� �� ��� ��� ��� ��� �� ��� ����

�������� ��� ���� ������ ���� ��

���9 � �� �/� ��� �9���/� � ����

���� 0%��2�/0��� � 0��� ���

����� �����������9�;�����!���

���/�������� �������� ������ ��� ���

� ������ ���� �����������:�����

������������ ����� �9������������

���� � ���/� ���� ����� ��M�� ����/�

������� �/� ���� ����������� ��

����������������������������� ��

�����������&� ���(=��4?1 ��������

%�#0���� ��� ��3���0�-� �� %��)�

���������� ����%#4���������#�������

��� �� � ��� $���%������� �� ����� ��

�������� �������� ���� �� � � �� ��

��� ��� ��� �� ���� ����� 5�&� 1����

$���� ������ ��� ���� 17.(B8�.+�� ����

(=�� 4?1 ��������� ��� ���� ����

��� �� ��M�� �� �� ���� ����� ��� ��

6��$���� ����� ���� �&D8D**.�� ����

�� �� ���� ����� ��� �� ��� ������

����������������� �M&� N�����4 ���

�� ��� % �&45� <���� C��� ����

���0 ������ ���� 8B./� ��A�� �D8�

������� ���������� ��� ���9�

���O�� �� P ���I�����Q��� P �

��Q � P -=Q:�� � P .�+����������

����� �&4�3(=�

$& ����� ��������� �� �� �������

���0����� 67%������0������ �������

�������)����� ����%���0�2��$����

�������� ������� %�+�� 1������� ���

������� � ����� � ���������� ��� ���

������� �������������� ���/� � ������

������ ������������ �� �� ������� ���

��'��/� ������ ���� ��� ����� ����

� �� �� ������ ������ %(+/� �� ���

�������������������� �� �� �������

%)+�� $������� ��� �� ����� �� �����

�� � �/� �& ��'�� ���� ����� �� ���� ��

����������%����� ��� ��� ����� 2��� ��

�������������)��� ����������2������

� ���/���������������������� ������

�������� 2���1*+���������� ���

���� ���� � �������� �� �� ��� �����

��R������%�+��:���))B/��������� ���

���� ������� ��������M ����� ��

�& ��'���� ,���� �� ��� ��0���#��� ��

������������ ���� � �� ��������� ���

������� ����%(+�������������������

���������� ��� ��������� ���������

��������������%�/++��$������� ����

����&��'�� ������ �� ��������� ��

�� �� �� �� ���������� "������ ����

#����%����������������������������

� ������������ �� �����������/�����

��/����������%�+��������������� ���

������� ������������������������ ��

��� �������������� ����������������

������������ �� ��%++�

<������$&����� ��������� ����

��� �� ����� �� �� ��������� ������

���� ���������� "������ 1�������

���� �������������� ������$&����� ��

��������/���� ��� ���� ��� ��� ������

� ��� � �������������� ��M��������

��������&���������/������� ������

������ ��� ������ ��� �& ��'�� �����

�� �/� ���������� ���� ����� �� ����

� ������/���� ����� ������� ���

������ ���� ��������-0� ����#0�

����!�����/���������������������

����� ���� �� ������ 2���� 8�����

2��� ��� %������� �� ��������� ,��0���

���� �������� ���� ��� ��� �� ������

�������������� �������� ������� ��

������� �����/� �� �� � �� ��� ��

����������������� ������9���� ��/�

������������������ ������������

��� ����� ���� 1� ���� ����� ���$&

������ 2�����������������������

����������������� ������5�S()�������

��� � ���� �� �� �� ������� ����� �����

������ �� �����/� 1� �/� 0�����/�

�������������������������������� ��

������������ ����%",+�

1����� ��������� ������/� ���

����� ��� �� ���� ������5� �����

� ��� %-�������� ���� �� ���� ��+�

�������� ����� �����������������

���� � *� ���� ��� ���������� ��

��� ���A� ����� ����� % & !�� �� �+/�

�� ��� ��������%�&���������+/�����

����������� ����� ��� ����� % ���

��� ���� ���+� %"+�� 0� �� �� �������

������������ ���������� ������� ����

��� ������� ��� �� ��������� ����

��-���7��#0����%��������9���������

� ��������0����0 ������2����2�����

�����������������������������������

%�����������0������%�0#0������%��7

��������� �������� �� ���� ����

(���� �� �$��������

()�������&������

���)����$����� ���

������* �����!���������

�������� �(����

�������������� ���2C$�����. ���������������

��� �� ��$��� �� +���������� *�� ��� ���� '��

,����������-� ����������� !�� ��. ��D�����

'��0��������� +��������� ���� '� ������� ��E1��

*��� ������������

�5���67�38769���6:7;�7<7838

$�'������

��(�� $���� � 3/� �� ��1/� C����� !�/� 6��� ���

3/�$�� �����/�4��� ��70/��������������

� ��� ���� ���������� � ������� �� -*)�

��������� ������� ����0��� ������0�� �

� ��� %$�� ���+�� �)).58DA=(28�� C>:A�

()�()-B�)(����))))(.�*B*�)B.))�=�

����� C������0/�4�����C�� ���������������

����#0������������0���:��%��%������

������ ������������������� ��������

���� 7� � ��0 ��� ���� �)).5D*AD*((2.��

C>:A�()�((�8�7 0�D*�-�D*((�D*(.��)).

��*�� �����0/����������3/�$���� �1,/�,�� �

E/�,������1'/�0� �� �� �,��$���%������

�� �� ����� ��������� ����� ����/� ���� ����/�

�� ���� ������������� ��� �������

���� ����������� ������ %C ���A�

�������� ���+�� :�� 7� ���� ����� 0 ���

� ���� �))85.8A-B=28(�� C>:A� ()�()--�

H��)�=.*�D�)

��D�� �T���0/�$���� �1,/���;N���73/�� ������

$7/�0U �� �� �,��3�������������������

���� ���� ������ ����� .��� ��� ����

�� ���� �))(�� �� ��� ������ ����� �� ����

���� ��� �������������� �� ������� ��� ��

��� ���� ���� �� ��� .��� ��� ��'��

���� �� ���� �))(� � �� �� ������� ���

������ ������ ����� :�� 7� ���� ����� 0 �

��� ���� �))B5.BA(B-28)�� C>:A� ()�()--�

H��)�=D=8=�)

B<; 1(���� ��� �����������������>�???��������9����>�@����6:������;��A� ��877B

Page 42: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�������

��.�� �T���0/�"�����4/�0� �� �� �,/�0�����

:��� $��� ���� ��� ���� �� ���� ���

�������� �� ���������������������$����

�������� ������ %C ���A� �������� �

���+��1���#��!�����(--85D=A�(-2�-�

��=�� �T���0/�,������6/����������3/�,������

1'/��� ���&/�!��� ��1/�������.��� ��

����'�� ���������/���������/� �����������

���(�������������������������$���%�����

������ %C ���A��������� ���+��:��7�

���������0 ��� �����))(5.(AD)(2B�

��B�� 7�����3/���������C/�>����0������� $/�

$ �� �����76/�$������4���� �����������

��������������� ������� �������� � ��

� ��������<��� 4���� �))D5*8A.*-2D=��

C>:A�()�()(=�H�������))*�((�))(

��8�� 0�� ��0/�C�������7?/�0������ '/� ��

�����!/�6� �� /�0���H���1/�������!�����

���� ���� ��.��� �����'��& �����:��

����C ����))B5(*A=.B2-�

��-�� 4��� ��� '/� 7����3 ��� !/� ���� /�

E��� � � :/�0������ ��!/�7�����$ ����

���:���� ������.��� ��� ���������������

�����:�����C ����))B5(*A=.-2=(�

()�� ,������:/���� � ���1 �����������������

�� �� ������������ ������������������

7�C��������)).5*�AD.-2=*�

1������ ��� ������������A� 1������ �� �/�

&� N� ���� 4 ���� ��/� ?4��:4C� &04=�*=/�

&� ��� N� ��� ��� 0N� �����/� "������ ���

0���� ��/� �B� ����� 7���� 0��� �/� (**8.�

0��� ���� �C�V� ./� "����5� ��� �A� �������

�� �J�� ���������

�������� �������� ���

�������� ������ ������

������������ :�� ���7�����))8�

����� ������� ��� :���� ����C �����

��/�0� ����������%"+��������������

��� ������� ������/�������� � ��

�� ��� ���������������������������

��� ���� ���������/������ ���� ���

�� ������� �� �������/� ����� �����

��������� ���� ���� ���������������

��������� ��0����������� ��� �����

�������>����� � ������������� ������

����������9������ ��/��������<��

���� ����� ��� ����������������/&

�� � �� ��������� ��"����/������

0��������� ����� ������������� ��

� ���

>�� ����� ���� ���� .))� �����

�������� ���� ������� �����/� ����

����������� ��� �23��4�����&� �

��� �� !��� ��� �� (--B� � � �� ���

�������� ��� �9�������� �� ���� ��

�������� �����������/�����D))������

�������� ���� !:#� ������� �� �����

1������������������������ �����

�� �0��������� �� ����� �� ��� ���

���-� ����0�� �����2�����0��0��

%::"5� ��9������ :":5� � �0N ��9/�

0���� �M�� ��/� "����+� ���� �':�1

%3���� ����9��:�6�����:�05�$ �4��/�

!������/� 1/�&�1+��1�� ��������� �

������� ::"� ��� ��� ������ ��� �����

�� ����� ���� ����� ��� � ����������

���� ��� ��� �� �/������ ���� �� �

0��������� ����������� �� %:�+� 6�

��� ��� ������ ��������1��� ��������

��������������� �� �������(A�)�����

(A8)/���� ��������������� ���� �0����

������ ::"� ������� ���������� ���

�� ��� ������� ��� �� �0���������

::"������� ��� ��� ���� �������� ::"�

��� �/0������� 1 %%� 0���#0���� ;�

)�-8+� ���� ����������� �� ������� ���

�� ����� ������ ����������� ����

,����� 1��4� ��%���� ����� ������

0��%������%�������������1��4������

����������� ������������ ������

� �� � 2�����0��0�� ����� �������

�:����<�������������-�#0������������

�� �0��������� :�6�%S�))�:&��' ��

==�� ��� 0���4�� ��0�� ��--����� ���7

������ �������� ����� <������ ���

���S�))�����S*�)�������� ���������

#0��������-���������%����������-��

��������/� ����� �����%#+/���� � ��

���������������#0������������)��������

����������� �� ��� ����������������

<����� ���� ��� �� ��� � �� ��������

���(A8)/��� ��� ��� � �������������

������#�������������������������������

���-� �� ����0�� 2�����0��0�� ���

�������� ���������%�/(+��?����������

.))� �������� ���� �������������

������� ���� ��� ��� ��� /������

�� ��� ���������������������� �� ���

���(A8)��< � ������������� ������

������ ����������/�*�������� ���

���/������ �� ��� ��� �� �� �� ���

8)/�����(�������� ������� �����(=)��

�������������D�!:#� ��������� ����

����� ��� �������� �0��������� :�6�

%S�/)))�:&��'+/������� ���0��������

�� ������ �� ��� �� ����<�� ������

����� ���������/������ ���� �����

�9������ �� ������������� ���

����� ��� ������ ��� �9������ ���� ����

/������ ���� ��� ����� ��� � ��

0��������� ���� ��� �� ��� �� ���

�� ����������� �����������

������ �����/� ��� ���� �����

� ����������������� ����������

��� �������������� ���%"/)+/��� ���

������� ��� �������� �� �� �������

������� �� ��� ������ !�����/� ���

/������ ����������� � ����������

!:#� ��������� ���/��������������

��������� �� ��� ������ ��� ������ �

� �� �������������/��������������

� ���� ������ ��� ���� ��� � �� ��

���������� ���� ����/� �� ������

�� �� �������� ��� '����� �� ���� %�+��

!�����/���������� �������������

������ ����� �� ������ ���0&�� ���

��*����D��� ����� ���� �/������

��� S8)� ������ ������ ���������

� �� ����� ���������������� �����

��� ����� %������ �������%�0#0� ��

������ �� ������������������� ���

�� ��������� �������������" �����/�

���������������� ��� ������������ �

������ � �������������������� �����

����� �� ����� ��� �� ��������������

������ ���� �� ����� '���������� ����

���������������������� ���������

� ���������� ����������� ������ ��

�� �������#0���� ������ ��� ���

������������� ���������/������

C?1� ��������� ����

!��������$�����*&�����+�

���!�))���������

������� ������� ��� . �������D� '� ��� 6��

'� ���� *�� ��� �*�� '�,���E-� � ��F !�

� �� #�,����������D$����(� ���� ��� �G5� ���

��� H� ��*�� ����*������

�5���67�38769���6:7;�7<6I6I

1(���� ��� �����������������>�???��������9����>�@����6:������;��A� ��877B B<=

Page 43: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

43

ARTICLE 3

Kytococcus schroeteri, a rare agent of endocarditis.

Renvoise A1, Roux V1, Thuny F2, Riberi A3, Casalta JP1.

Int J Infect Dis. 2008 Mar;12(2):223-7.

1URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France

2 Service de cardiologie, centre Hospitalier Universitaire La Timone, Marseille, France.3 Service de chirurgie cardiaque, centre Hospitalier Universitaire La Timone, Marseille,

France.

Contribution de AR: récueil des données clinico-biologiques, analyse des données, travailbibliographique, écriture du manuscrit.

Page 44: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

44

Commentaire

Cet article illustre l’applicabilité de la PCR universelle comme outil de

détection moléculaire. Ce travail fait suite à une stratégie établie dans le

laboratoire de bactériologie du CHU la Timone (Marseille), où la détection

moléculaire est systématiquement réalisée pour les valves cardiaques de patients

atteints d’endocardite infectieuse sans documentation microbiologique (Fournier

et al. 2010). Cette détection moléculaire comprend, entre autres, la PCR 16S et

a permis dans ce cas de détecter puis d’identifier Kytococcus schroeteri comme

agent d’endocardite infectieuse sur une valve cardiaque restée négative en

culture. Cela souligne l’intérêt de la PCR universelle pour la détection

moléculaire de produits biologiques négatifs en culture, comme cela a pu être

montré pour les endocardites à hémoculture négatives sur le sang et les valves

cardiaques (Fournier et al. 2010), pour les infections ostéo-articulaires (Fenollar

et al. 2006) ou encore les infections neuro-méningées (Al Masalma et al.

2009).

Nous avons montré dans ce travail (a) la présence d’ADN de K. schroeteri

dans une bioprothèse valvulaire retirée pour endocardite à hémoculture négative

et (b) rétrospectivement qu’une souche de cocci à Gram positif isolée d’une

hémoculture quelques mois avant chez le même patient et identifiée alors

comme Micrococcus luteus (et donc considérée comme contaminant) était en

Page 45: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

45

fait aussi un K. schroeteri. Ainsi la PCR 16S peut dans certaines circonstances

permettre de rectifier une erreur d’identification et améliorer le diagnostic et la

prise en charge des patients (Petti et al. 2005), et permet une meilleure

connaissance des pathologies liées à des agents jusqu’alors considérés comme

contaminants ou pathogènes opportunistes (Schlaberg et al. 2012).

Depuis ce travail, la description de K. schroeteri comme pathogène

humain a été rapportée à diverses reprises dans différents cadres nosologiques

(Chan et al. 2012).

Page 46: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�� ������ �� ���� � ������� � ���� � ����� � ������ ��

�� ��� ��� ������������� �� ����� �� �! ���"�� ��� �� � ����

� �� #��$%��&'(#)��

#*� �������� +� ,��"� -� ����� � ������ ��� �� ����� �!

����� �������� �� ����� �� �� ���� ��������� ������ ����

#��.%��&$$�)(.�##� /��� �� ������ �- �� ,� � � ,/ ��� ��� - ��0�"��� ��

�� ��� ,����1� ������� �����"��� �� ���"�� �� �����!

������ "���� ����� '**2%���&'�()3�

#'� ,���1����� 4 ,�����5������! � ��0�����0"�� � 6��75���� � 4���� � � ��� , � 4�����"��� � � ������������� ��

1������� ���"������ !��������� �� "���� �� � ���� � ��

#��.%��&(#�)''�#2� ,���1����� 4 ��0�����0"�� � ,�����5������! � 6��75

���� � � ��� , � ���!��� �� � � ������������� �� ��� ���"�5

����� !��������� �� "���� �� � ���� � �� '***%��&$*�)#'�

#$� ������ �� ������ 8�� 4��� �! ������! �1��� ���� �����5��� ����"��� ��� ����1��" "���� � �� � � � #��9%���&

#2'.)��

#(� ������ � "����� 4� 4�!��"����� � ���� �������! ��� � �

����"��� �� ����"1�����! ����1��" "��� ��� ��5���5"�� ��� ����� � ��� ���� � �� '**$%��&'3#)9� '3.)��

#3� -��� �� :!��!� �� ��8�� � �� 4�������� �! ����;����

!���������� �� ����1��" "���� � �� � � � #��9%��&

9�')2�#9� 6� 6��� � 4���� � ����� +, ��� 8 ��"1��� 4 ������� 8

�� ��� 4 ���)������� �!����� �������� �� 1������ �����!

��� ���"������ !��������� ��� "����!���5�������� ���������

������ � "���� �� � ���� � �� '***%��&3()��

#.� �����5���!�� 8 -��"�0�� + ,������ - <�=��0� �:� ,����5

�������� !�� �� ���"���� � ��1� �������! ��� "��!�������

�� "���� ���� �� �� !�� '**(%�&#9#*)#�#�� /���"� ��� 4���"�� �� �� ������ "���>)����� ��� "��

!�� �� � �� � � � #��3%���&#'$)3�

'*� <�������� : /��� �� /��� ,� ," ,- ����� ,� -�� �6 �� ���

8������ �! �����1 ���������� ���!� �� � � ������� �� "����1��!���� �� ���"������� �� ;��� ���" �������� �� 6����"���

1������� �� � ���� � �� '***%��&$.)3(�

'#� -��� ��� ����� ��������� �� !���� ��������� ���"������!��������� ��� � � ����"��� �� "���� ���� �� �� !��

'**2%��&#3'9).�

''� -��� �� ��� �? @���� <� ���� <� � ��A�� /� 8 ������ ��

�� ��� ���������� �� !� �!�����"������ ���� ����;���1��� B��!���� !"���������� �� ���������� �������� �� ������

����1��" "���� ���������" � ��� ������� '**2%&

23.)9*�'2� -��� �� ���� <� @���� <� /��� ,8 ���� <� � ���� 6- �� ���

� �"��0������� �! 1 �"��!��"��� �� ���������� ���5

����� �� ������ ����1��" "���� ���������" � ��� ��#

����� '**#%�&#.#)3�'$� -��� �� <���7��� /4 @���� <�� 4���"������5;��! ��";��5

���� � ��1��� ��� ����"1�����! "���� � � �$�� '**(%���&

#.#)(�

'(� ,�� CD /� �D +�� E/ ���� ED� ���;���� ��� �� F��� ��� �����& ��� ��8 !������"����� "�� �! ��� ��� !����"������ ��

;������� "������ �$� � !�$ ���" �������%��� #�.(%��&

(()��'3� �"�� �� �!��� 8 -�!! 88 :!��!� ���! �4 ��0 �< �� ���

� � ���� �� ����� ���� �� � � ������������� �� ���"������

!��������� �� ������ ������ ��������� '**#%��&$*�)#3�

'9� ���!� � ��1��� :@� 4���"������ !���������& ����� ��� �;��������"�� ��� ��� �"��G ��&���� ��� '**$%�&��)#*9�

'.� ������ �� 4�� ��������� !�1����! ���"������� ����������G ��&#

���� ��� '**3%���&�()#*$�

'�� ������ �� +��!�� 8+ ����"��� !����!��� �� � ��!��������+� <����� �8 �!������ ������ ������' �$���� �� ����#

����� �� ������� 6��� $�� ,�� D��0& �����)/���% #��9 � ��

�����

2*� ������� @ -����� 84 �������� � 6������H �4 8���� � � ������� ��8��� �! ������ �� ������ �� 1������ ��� �1��!�� � ���� �

�$��� '**2%���&$'�)2(�

��4� �����I

�� ����;�

���� ����� � ���������

���� �� ������� ���� ��

���������� ���� ��

I8�����1��!��� �� ��

������ ��� ���� ���;����J� �����"

K��4� �����L

����������� ����� �����" 8"���� ���� 8�!

2 �� '**9

!��&#*�#*#3M7��7�!�'**9�*3�*#(

���������� ������� � � � ����� �� ������ ������

�� ��1��� ����� � � ��� �� 1���� ���� ���� ��!���!����!�� �� ��������� ��� ���� ��

4 9*5���5��! "� ��� ;��1���� ���� ���� ��!"����! �� ����� /��1��� �� ��������� ����� �� ��15��";�� '**$ ��� ����� K2� �8L �!� � �! ���� �����! �������� ���� �������� /� �� �����! ��� ����"�����! ����"���� ��� ���� ���0�� �� ���� ��;�� �� ��������� ���� �� !����� ;��� � �� 1����!�

@� ��� '**( � �� !"����! �� ��"��� /��1��� ����������� ��� ��� �1���!� �� ����� �! � ������ �� !"��5���� �� � ��� ;���! ���� ����� �� ##�(2 � #*�M� K.*�.N1���"��1 ������� �����L �� �"����;�� ����� �� #2�# �M

!� � � ���� ������ ��!�"������� ��� �� '$ "" �� � � O��� ��� �! �� 85������� 1������ ����� �� .2 "�M�� �����5��1 ��� �� ���!����1 � � ���! $5"" ��������� ��� � ����� ;��1���� ���� ���� �! � ������������ ;�����K������ #L� 8�"1���! ��"���1 � ��"������ � ���! ��";���� ����;�� ����0� �! ;������ ���� �";����

4� ��!���!���� !�������� 0�� �� 1�����"�! � 1��5������� !�����;�!�# � � O��� ;���! ������� �� � � 0�� ��1�����"�! ����� ��� �� ������ ���� 4���;��M� �! ������

�����M#* 4����;��M� ;������ K�- -�������� �����"� �1�0��- P�4L� � � �1���"�� ����"� �� #* "� ��� �� ;������ � ������! �! � ��! ;���! �������� �� � � 0�� ���� ��������! ������� ���� 4���;��M� ;������ ��� '5 �������� ;�������"1���� ����! ;������ ���� ����;��! ��� ( !�� � 29 �8��!�� ���������� ���"��! "��������� ��� ;������ ����� �� � � "�!��"� ��� ;���! ������� ���� ��"51������� ������

8�����1��!���� ''2

Page 47: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

��;�������� ���� 1���! �� ;���! �� �! � ������ ��K���������� ���� �Q:����� �����L �! ����;��! ���;�5���� � 29 �8 ��� (N 8�'� � � "����������" �� �!����O�!� ��� ������ ���� ;� ;��� �"��� ����� ����� � � "���5����=�! 4�@ ��1 ����1 K���������� ����5�Q:����� �����L�� � ������ �� �����1��;�� �� ���"1�� ��5���"��=�������"���� ����"���� �! �����1���� �! �������� ���B����� �! ��������� � � �!����O�!� ������ ����!�!� ����"���� �! � � 1����� �� �"1������� �����!��� ���������� "��������� ' � ����� $ ���� ��� ��� ���0��! ����"���� 2 "�M0�M!� ���� !� ��� ��� ���0�� � �

������� �� � � �� �� ����� 1�����"�! �� � � ��!���!����!�������� 0�� ��"���! ��������

@� ��� '**( ��1���! 1 ����� ��"������ �! ��1���� ���!����1 � ������! � ����� �����O������ ����������" �! 1�1���� ���� ��0� � � ��������� !!��11���!� � � 1����� �� ��!"����! �� � � ��1��� �!� � ����� ;��1���� ���� ���� �� ��1���!� ����! ��������! ;������ ������� �� � � ���� ���� �������� /�����������"������ �� � � ��"���! ���� �� ���������� ��� � �!������� �� ���������� ��!���!���� � �� �� O����������� ���!�

''$ 8�����1��!����

���� � �������1 ��� �� ���!����1 � �� #'*� ���� � ����� � ������������ ;����� �! � ����� ;��1���� ���� ����������

4� R ��� �4 R ���� ����" �6 R ���� ����������

���� � � ���������� ���� �� ��1����������� �� � � ����� ��������� �! ������� ;����� �������! ���" #3� �-,4 ��F�����

��"1����� K#$2(5�� ���"���L� ���� ��F������ ���� �����! ����� � � "������F����� ����"��� 1����" 8�P��4� C K#�.L�

� ���������� �������� �1� ��� ������� �����! �1����� ���� !����"���! ;� ����� �:�4 ������� '�#� -������ "������ ����

!����"���! ��������� � � ���"1����� !�����;�! ;� <�"�� �! ���� ���! �� ��;���� !��!����" ����� � � ���� ;��57������

"�� �!� ,�";��� � ��!�� �� 1��1������� �� #** ��5�"1����� � � ��11��� � � ��1����� � ���� �� ���!���� �� �� ���� �� ���!

� � � �������1� �� *�*# ��������!� � ��� 1�� ��������!� 1��������

Page 48: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

8�����1��!���� ''(

�����

�+�1����!����������

����

��� �

���

���!���!����

������

S���������T

4��M���

6���

-������;���

���

������1���"���

�!�����

-������;���

���

������!;��������

����O���������"

���

�����;��������!�������

��1���

����"

���

�����"���

����"

���

������#S2T

GG

GG

�����

��1���

�"���

� ��������"

GG

������'S$T

2$M�

4�����

1���� ����

����

#*���0�

@""�!���

#3��-,4��F�������

6���"��������"����

�!���"1��

���'#!��

@"1����!

������2S(T

92M�

4�����

;��1���� ����

2����

@""�!���

#3��-,4��F�������

�!��������� �

������!��������

@�������������"����

K'�M!�L

�!����"����

K'$*"�M!�L

���2���0�

� ������"����

�!

���"1��

���2���0�

@"1����!

������$S3T

$�M�

�����1���� ����

����

#*����

@""�!���

#3��-,4��F�������

6���"����)����"����

� ��1������"����)

����"����

���3���0�

�������!;����"1��)

1������"����

���2���0�

@"1����!

������(

K1���������!�L

9*M�

4�����

;��1���� ����

'3"��� �

�"��� �

#3��-,4��F�������

@�������������"����

K2*"�M0�M!�L

�!

����"����

K2"�M0�M!�L

���3���0�

@"1����!

Page 49: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�� 1�����"�! #3� �-,4 "1��O����� �! ��F������� �������� ������� � � ��,4 ���� �8 -,4 �������� 0�� @@ K������L��� � � ��,4 ���� �8 ������"��� �� ���! �� ������ -,4���" � � ������ ������� 4"1��O����� �� 1�����"�! �1��������� !�����;�! ����� �-# �! �1' 1��"�� 1���' �8+1��!���� ���� 1���O�! ����� ����������� �8+ 1���� K�����51��� ���� ��" �����L �! ��F������� �������� ���������! ��� ����� -,4 ��F������� 0�� K���-�� ���"������� #�# ����� ��F������� 0��% �: ��������"� ������ 8��� 84P�4L� ��F����� 1��!���� ���� 1���O�! �! �������1 �������� 1�����"�! ��� � � 2#** ������� 4���=�� K411���!��������"� 8����;���� �����L� �� �;����! #$$(5;1��F������ � �� ��"1��! �� � � �����0 !�;�� �� ������! �� !����� � ���� ��� ��������!� 1������� ���" � � �� �

��� ���� � K�����0 �������� ��";�� ��������L������� �� � �� ������ ������ �� !���!�! �� �!������ � �

� ���� ������! ���" ;���! �������� �� ��� '**( � �� ! ;��� 1�������! ����� #3� �-,4 ��F�������� -,4 ���"� � ������! ����� �� �������! �! "1��O�! � !�����;�!;���� ,������ �8+ �������� ��"���! �������� ��;��5F������ ���" ;�� � � ������ ���" � � 1������� ;���!������� �! ���" � � ��1���! ��!�� ���� -,4� ���;����! �!������ #$$(5;1 ��������!� ��F������� � ����F������� !�1�����! �� �����0 ��!�� �������� ��";����������� � � 1����� �� �����! ��� ���������� ��5��"���� 2* "�M0�M!� ��� ��� ���0� �! ����"���� 2 "�M0�M!� ��� ��� ���0�� /� �"1����! �1�!��� � ��� ����������� �������� ���������! ;����� �������� � � ������ !��5����� �� ��!���!���� ����! ;� � ��� ���� �� @� �� � ���5���� !��O���� !������� ����� � � 1����� �� �����!��F�������� �� ��� !�������� ��1����� ���� ��"��� �������"1���� ����"���� ���� ���1����;�� ��� ��0 �� ���������"1��"� � � �"1���! ;�������� �! �� ���1 �� ������5�1�

�� � � ;��� �� ��� 0�����!�� � ��� �� ���� ���� 1�������������� ��1���� �� ��!���!���� ����! ;� � ��� ���� �2)3

K�;�� #L� @� � � O��� ��1��� �"��� � �� ������"2 � �������� ���� �;����! ���" ;���! �1���"��� �� 1�������� ��!���!���� ���������� 1����;�� !����� ����������@� � � �����! ��1���$ � ��� ���� � ��!���!���� !�����1�!�� 1����� 2 "��� � ���� � � ��!������ ��!�� ����������������� 1����1������ ����"������� @� � � � ��! �����1���( � � �� ��� !�����;�! ��;���� ��!���!���� � �!�����1�! 2 ���� ���� ������� � �� �� "��� ��0��� �� ��;��� ����! ;� �"�������� �1��!� @� � � ����� ���3

� � 1����� ��!������ ���� ��1���"��� #* ���� 1���� ��� � ������! ��������� �! 1�������! ��� ��;���� ������@� � � 1������ ��� ��!���!���� !�����1�! ��� �! ������ ���� ��!�� ������� �! 1�������! � ��;�������������� ,� ������ �� ����"������ �� ���!���� @�������� � "����������" �� ��� ����! �� ;���! ��������� � ��� �� ��������! �� �� 1 �����1����� �!����O�! �� ����

�� ��� ��� �� � ��� ;���! �������� �! �� �������� �����!5���! �� ;� ����"���� ����� � � ������ ���� ���� �����! ���� �� ��� ��� �� � ��� ;���! ���������

+������ 1�����"�! ����� 1 �����1�� �!����O����� �����"�� ���! ;� �����1����! ��� ������ �� �������� ���;�� "����5����� �������� �� �������� �� �!����O�! � �� �� � ������������� @� 11��� �"1����� �� �0� ������ �� ������� � ��� ��� ;� ����"����� � �� ;��� �"��� ����� �� �������8�""������=�! 1 �����1�� �!����O����� �����"� ��� �� � "�������=�! 4�@ ��1 ����1� �� ��;�� �� �!������ �

��� ���� �� -�O������ �!����O����� � ���! ;� 1�����"�!����� "������� ��� ��F����

� � ���"�� ����� ��� ������ � ;��� ��;!���!�! �������� �����& ��� �� ����� ������� ��������� �! �� ���

����� �������! ;� �������"��� ���� ��� �"����� K��� ��

��������� ������ ���!����� ���������� ����������� �������������!�� �������L �� � � ��;��!����� ����������9

K������ 'L� ��������� ��� ���� � �� ����� !��������! ��"51������� �����;������" ��������� !�����;�! �� '**' ������!���" �"� ;���!� @� 1������� � ��"51������� ������1��!�"������ ��������� ������ �� 1��� ����!� �! ���5������� ��������� @� �� ������51��"����! �������� ���;�� ���5 �"������ ���!��5������� ���5���1�����! �! ���5"������ @� ����� � 29 �8 �� 8���";� �� ��11��"����! ��� (N � ��1Q� ;���! ���� '$ �� ����;�����2 � � ����� ����������� ��� ��"��� ������� 4 ������ ���!� �� � �� ��;7���!�����;�! ������ ��"51������� ����� �����!��� ���������

������� �� ;�� ��� � ��� ���� � � ����"����� �� �"��0�� �! "�����. ��������� ��� ���� � � ���� ;���!�����;�! O�� ��"�� � �"� 1� ����& ���� �� ;�����5"�� 1���"���� �! ���� ��"�� �� ��!���!�����2)3

�� ��1��� ����� O�� ��� �� ��!���!���� �! �� ��� �� � ���� �� � �� ;������" � 1������� �"� 1� �����1���O���� � � ���� �� 1���� ���� ��!���!����� �� ����!��� ��� 1 ������� � � ��� ������ ��� ������! ���"������� �1���"��� "�� � �� ��� ;� ��������� ��� ��1�5����� �� � �� �� �������� �� ��������� @� ���������� � ���"����������"� � ���! ��� ;� �����"������ �����!���! �1�� �� � � ���"� B�� �� �"� �0�� �! "�����

���"��� � ���� ���& ,� ���B��� �� �������� �� !������

�� ����!��

#� +���� - 8��� � +�� �� / < � � ������ : +����� 8 �� ���

8�����;����� �� �����"��� ���������� ������� �� !������� ��

��������� ��!���!����� � ���� �����"��� '**(%�&('2.)$'�'� ����;��� �� ���� �� ��������� -4 ��� - � #3� ��;���"� -,4

"1��O����� ��� 1 ���������� ���!�� � �������� #��#%��&3�9)

9*2�2� ���0�� < �� �"�� � ��������;�� �� ���� � ���� /�

���0�;��!� : �� ��� ��������� ��� ���� � �1� ���� �����

��"51������� �����;������" ������! ���" �"� �������

������� ��� � ���� ���� �����"��� '**'%��&#3*�)#$�$� ���0�� < ��������;�� �!��� � / ������� � �� �"�� �

������ � �� ��� ����� ���� ���� ��!���!���� !�� �� ���������

��� ���� �� ��� �� �� !�� '**2%�&#$�2)(�

(� �� ���� 8 ����� ������ � 4���� � ������ �� ���������

��� ���� � ��!���!����� ��� �� �� !�� '**(%��&#9�).*�

3� ���� � ���7��;��� @ � 7��;� � �!��� + ��;���� @ ���� �

�� ��� :�!���!���� !�� �� ��������� ��� ���� �& ��� ��1����! ������ �� � � ���������� � ���� �����"��� '**3%&

##.9)��

9� ���0�;��!� : <�� 8 ���=!�0 � �� �"�� �� �����"��

!��������� �� � � ����� ��� ������& ��� �� ���� ���� ����� �

������� ���� ���� ��������� ���� ���� �� ������� ���� ����

�! ��� ������ 8� � #.9' ���� �"��!� ��� � ���� ��������

#��(%�&3.')�'�

.� �=�=��; @ <�=�"���0� E� ���������� �! ��";�� �� ;����� ���"� ���� ������ ��� �� ����� ������� ��������� �! �� ���

����� ����� �� �0�� �! "����� "�";���� �� �"��� �

!��( ��%��"��� '**'%��&39)9$��� �� ""�!� @ ���� �� � 8 ���0�� < ���0 ��7 < +�;��� - ���

:��� 8 �� ��� ��� ��������� ��� ���� � ;�����"�� 1���"���� �

�� �� '**(%��&:##)2�

''3 8�����1��!����

Page 50: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

4������ +�������

6�����F�� +���

��5��� 8���I

#�!� ���� � �� ��� �!������� ��$ %&�

���� � '��������� (��)� ����� � �� #� *������

+,% � -���� ��� �� .//&0 �� ������ ����1 0� � ����

����0 � ���

-� )��� �� �� ���������

���� � '��������� (��)� ����� � �� #� *������

�� ������� � ����

4�;���� +�;���

-� )��� �� ��� ��� �� ���2��

���� � '��������� (��)� ����� � �� #� *������

�� ������� � ����

I8�����1��!��� �� ���

����& U22 K*L$ $' .. 33 #�% ��& U22 K*L$ $' .. 3' *2

������ ��� ���� 7��51�������J��!�����

K �5�� 8���L

����������� ����� �����" 8"���� ���� 8�!

#3 41��� '**9

!��&#*�#*#3M7��7�!�'**9�*3�*##

���������� �� �� ��������� ��� ����� ����� �������

:1�����)��� ����� K:�6L ��������� ������ ����!��!� �!"��� ��""���� �� ���� � ��! ��! �! !���������� 8�""��������� 1����������� �����!� ���������� "�������������11�� ���1������ ���� ��������� !��� � �! ;!�"�����"1������# �� ��1��� ��� �� :�6 ��������� ��� ���"���������� ) ���� 1��������� ) �� � �� ������ ��� �1������

4� #.5���5��! ��"�� �� !"����! �� ��� ��1��� ��� $5!� ������ �� �� 5��!� ����� ���� � ��� ��"�����;!�"��� 1�� �! !������! 11������ /�� ������ 1 �������"������ ������! ��"1������ �� $*�* �8 ;���!1������� �� .2M'� ""/� "��!�� ��7����! 1 ���� �! ���5���� �"�� ;������ � �!!� ���5���!�� ������� ��"1 ��!���! �������=�! ;!�"��� ���!������ ��1������ � � ���� � �11�� F�!��� �� �! �1�������"� �;������ !�������! ���� � ��� ;���! ���� ����� �� #�� � #*�M� K33N;�! ������1 ��� 9N ���"���� ������1 ��� $N ��1�����"1 ������L �"����;�� �� ##�* �M!� 1������ ����� ��'2 � #*�M� 1��� ��";�� ��"� �� #(�' � ������! 1����� ��";�1����� ��"� �� .' � ����������� ���"��=�! ����K@,+L �� #�' O;������� �� .* "�M!� O;��� !���!���� 1��5!���� K�-�L �� �$* ��M"� -5!�"�� �� �'* ��M"� �1����"������������ �� #.# PM� ����� "������������ ��(9 PM� �0���� 1 ��1 ��� �� �9 PM� ���� ;�����;�� ��9�$ "�M!� "���� �� 3'* PM� K���"� ����& 3*)#.* PM�L�! ��1�� �� 3(� PM� K���"� ����& *)#3* PM�L� P�������!�� � � ;!�"�� � ���! � ��0����� �� � � ������� ���;�!5!�� ��� ��� ��� ���������� 8�"1���! ��"���1 � K8�L ��� � ;!�"�� �! 1����� ������! "�!���� ���;�!!�� ���� ��0����� 1���� ��������� B��! �!�"���� 1����� �! �1���1����"����� 4 �!���� �"���!������ ��! K/@-4L��� ������ !�! ��� ������� ���� � ������������ � � 1��5��"1���� !������� �� ��1��� � ��0 ��� ���� 1����������! !����"����! ���������� ��������� K-@8L� � � !��5�������� !������� �����!� �����"�� ���� ���������� �� 1��5"�� ;��� "���� !����!��� ��� � ��"1 �" ����"1 �;����� ���0�"�� ����! �������� �! ����� ����������� �0�� �! �"1����� ���;����� � ��1� ���������� ��

=�����" ����!"���� �! "���B����� �� �������!����� � � 1�����Q� ������ �� 1��������� ������� 8��������� �� 1�����1��� ;��� "���� �1������ �� 1�����"�!�! ������! 1�����1��� ��� !�� �"��1������ ��������� "��������� ����� K11����"���� #(NL ���"� ;��� ����1�1������ �! �� ���!���� �� ������"���� ��B""��������� !�� ���� ����"��� � � ����� ��;��!�! ��� �"1����5"��� �� ;!�"��� ������ ����! �������� ����� ������� �!;���"���� ������� ������� ���� �� �������� 6��� �1�����1��O��� K4 � 8L /@6 +,4 "����1�� ���� �! ����"����5����� �""������;���� � �! � ���� �� �������� � � !��5����� �� :�6 ��������� �� "!� ;� � � 1������� ������ �� :�6�""������;���� � �! � K684 ���� �1��! ������L �!�""���1 �����1��� �� � � ;��� "���� ��"1 ������K8-$& #'N 8-.& .$N 8-$M8-. ���� �� *�#$ ��� �������!��";��� �� 8-(95������� 8-. � ����� �! �"" !��� ������L ���������� ��� :�6 ���������� 4�� ���;������ ����!����������! ���� $ !�� �� ����"���� � � 1����� �����5���! ������������ ;� !� 9 ���� ��11������ ����"��� ���1����������

� � �������������� K�@L �����" �� ��� �� � � "��� ��"5"�� ���� �����"� ������! ;� :�6� ,��� ��"����� ���5��� �! ;!�"��� 1�� �� ���F������ ��1����! ��"1��"�1��;;�� ��B������ "��! �1����� �1��"���� �1����"�5��� �! ����� 1����������'

,��� ���� �� 1��"�� :�6 ��������� ��� 1��������� ��;��� ��1����! �� � � ��������� K�;�� #L� @� � ��� ���� � ������ �� �@ ��"1��"� �������! � � ����� #' !�� K����$)$' !��L ���� � � ����� �� ������ ������������� ��"1��"������" "���� ����� "���� �! ������� 1����������� ��� � �"1����� !�������� ����� ��� ���� 1���������� @"5���� ���!��� ��� � 8� �� ����������1 � �� � � ;!�"���� ;� ���! �� ���O�" !������� �� � �� �� 1�����"�! �������� �� ��� ����� ��B""���� � ���� �� � � 1��������"1��"��� �! ��11������ ����"��� �� ���! �������������� �� ���� �! � � ������ �����"�� �� ���� 1��������� ��� � ������� �� :�6 ��������� ���� ���!�2)�

���1����� ��� !�� �������� ������� 1����������� ���:�6 ���������� ������� � � 1�������!��� � ��0"��� ��0��� !���� !� �!����� �! � ��! �1�� B��! ���� ���" ���� 1����5������ �����!�� � � !�����1�! -@8 � �� �� ;� ����! ;���� �� 1��������� �� ����� :�6 ������� � ��!�� � � !

8�����1��!���� ''9

Page 51: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

51

ARTICLE 4

Actinomyces massiliensis sp. nov., isolated from a

patient blood culture.

Renvoise A, Roux V, Raoult D.

Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Mar;59(Pt 3):540-4.

URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France

Contribution de AR: réalisation des expérimentations, travail bibliographique, analyse desdonnées, écriture du manuscrit.

Page 52: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

52

Commentaire

Dans ce travail, nous avons démontré l’applicabilité de la PCR universelle

pour identifier une souche d’actinomycète isolée d’un prélèvement clinique. La

PCR 16S a d’abord identifié la souche 4401292 isolée d’une hémoculture

comme un membre du genre Actinomyces spp. Les pourcentages de similarité

obtenus par comparaison avec les séquences 16S des diverses espèces

d’Actinomyces décrites trouvaient des valeurs inférieures à 97%, seuil en-

dessous duquel on peut parler de nouvelle espèce bactérienne (Stackebrandt et

al. 2002). Nous avons pu ainsi décrire une nouvelle espèce bactérienne :

Actinomyces massiliensis sp. nov. La description a été basée sur des caractères

morphologiques et biochimiques, le profil des acides gras et une séquence de

1481 nucléotides du 16S rRNA gene.

Ce travail souligne que l’utilisation de la PCR 16S dans un laboratoire de

bactériologie permet d’améliorer la connaissance de la diversité bactérienne et

des pathogènes émergents (Drancourt et al. 2004).

Page 53: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

��������� ������� ��� ����� ����� ���� ������ ��� ������

����� ��� ������ ������ ������ �� ��� ������ ����

��������� ����

��� ������ ����

������������������

����������� �� ������ �������� ��������� !�"#���� �� �� $���� %&�' ()� *+,* %&�'-.�� ./�01 +*0 ��� '���-2����� �,,13 )�������� %���� 43 /����

������������� ����������������� �� � ������ ��������� ��� ����� ���� !��� ���

����� "�� �� ���� ����!���# � �!� ������ �� ����!���� ������ �!�� ����� �

��������# � ������� � �������� �� � �� ������� ������� �� �!� ����� ����������

$!#�������� �#��� ��� �� �%& �'() ���� ��*����� ��������� �!� � �!� �!�

�������� � ���� ����# �� ��������� ������ ��+��, �%& �'() ���� ��*�����

�������#�� ��������� ������ ��+��,�� ��������� ������� ��+��,�� ��������� ����������

��-�-,� � ��������� ������ �����,�� �!� ��� ������ ���# �� � ��� ��. / ����

� ��% / �� 0� �!� ���� �� �!����#��� � � �!#�������� ���������� �!� ���� �������

��������� ������� ��� ���� �� ������� 1 �!� �#�� ����� �� �������� ���&2' $�.�

���2� +-+�����

��� ����� ��������� ������ � ����������� ����� �� �������� � ���� �� ������ ��� �������������� ������� ��� �� � � �� ��� ��� ���������� � ��� � � �� �� � ��������� �� ��� ���������� ��� � ��� �� �� �� ��� � ����� ��� ��� � ����� � ���� �� ����� � ����� � ������������� � ��������� ��� �� �� � � � �� ���� ������� �� ��� � ���� � ��� ��� �� �� ������ � ����� �� �� ���� �� ������� ������� ��� �� ���������� � �� ��� �� ������� � �� �� ���� ���������������� �� � ��������� ���� � ��� ����� ��������� ����� ������ �� � ���� � � �� ���� �� � ��� � �� �!""#$� % �� ������ � ��� � �������� ������ �� �������� � ��� ����� ��������� � �� ���� ������������� %���� � �� � #&&'( � �� � � �� � !"")$� ��� � ���������� ����� ��� �� ���� �� �������� �� ������ � ��� � �� � !""#$� ������� ������ � ��� ���� �� ���� ��� ������ � ������ �� �� ��� ��� � *�������� � ��� ��� � ������ �� �� � �� � !""#( +� �� � !"",( ���� !""'$� % �� ���� ��������� ������� �� ���� �������� � ������ �� ��� ��� � ������� ��� ��� ��� � ������ �� �� � �� � !"", � ��!""'( -� � �� � !"".$� �� ��� �� ���� �� � �� ��� �������� � ��� ����� �� ������� ��� ����� / 0� ���!""!$�

�� ��� ������ �� ������� ���� ������ ������� � �������� ��������� �� � � ��� ��� ������ � ���������������� �� � � �� ��� ��� ��� � ��� � �����

��������� �� ����� �������� �� �� ������

- ,1��� ���� � � � � ������ � ���� � � 2�������!"", �� � �������� �� ��������� ��� ����� ����������� ����� �,1�' ��$� � ���� � ����� �� ��������� ������� ���� ��� �* �� �� ����� ������ �� �*� � ��� ������ ���� ���� ��� ��� �� �������� ���� ���� � � �� ������ � ���� � � -��� !"")� # ���������� ����� �� �������� ��������� ��� � � ��������� �� � � � ��� �� � �� 3�� �������� ��� ���������� ��� ����������� � � � ����� �� ���� ���� � � ��� ��� ����� ��� ��� , � ����* 4��� ��# �� ! � �����* �� � ��# �� #" � ��� ������� ������ 5�� ��� 3�� �������� ���� ��������� � ���� ��� � ���� ������ �� � � ����� ������ � � �� ��� �))"#!&!�$� 6������� ������ ��� � � ������� � �� �� ��� ����� ������ ��� � �� ��� �� #.� �78- ���� ��5����� ��� ������� � ))"#!&!� � � ������� � ��������� ��� � �������� ����������

-������ � ����������� � � ��������� ������ ���� ����� � ��� ���� � �� 9 �� ��� �� �� ����������� ��9��$� ������� ��� 8 �� � ������� ������ � 9 �� ��� �� �� ��� �8��9�$� ��� � ))"#!&!�

� � ���������� � ������� �� �*����� ������ ��� ������� ������� �� ����� ����������� �*��������� ���� ��� �� ���������:���� ����* 4���

���� �� ����� � ��������� � � ��%�;���*$ ��������� �� ����� ���� �� ����� ���� )1 � � �������� ��� ����� �� � ������ ����� ���� ������ �,< �� � '= ��������� � �� ����� � � ������ � ����������� � �� � '= �>! �� � � ���� ����� ������ ��������� �� � ���� ��� ��� �� ����

$�� 5���678)��7���9 �������� ����� :�� ��� �*' ��&� ���������� �: ��������� ������� 004�+�+$ �� 8/331,*;�

����������� ������� �� �������� ��� ������������ ������������ <+44�= +�� 304 300 304 �4��4��7�>��4�44�34,-4

304 44�34, � +44� .()' ������ �� ���� �������

Page 54: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�?8� � � �� �� �?8� � ��� �� ��%�;���*$� ������������� ��� ���� � ��� ��� � � ��� � �������������� ����� �!'� ,"� ,<� )) �� '" ��$ � � ������ ����>����� ����� � � �� ��� � ,< ��� ��� �������������� ," �� ,< ��� ��� ��� � � � � ���� �� ������ � ��� ����� �� � '= �>!� ��� � ���� �������� ������� ��� �4� �� ���� ��������� � ����� ������������� �� �� ������ ������� �������� ����� �������� � '= ��������� � � �� !) �� - � ���� ��������� � � �����*�� � '= ��:�$ ���� � ������� ������ �� ������ ����$ �� � �� �� # � � �������� ����� � ���� � ��� � �� ������ �� �� ��� ���#= ��:�$ ������������ ��� � ����� ���� �* ���� � %�� �� !.12 �6����$ ������� ������� � ���� ��� ��� �� � ." @� ��� ��� ���� "�'A#�< �� ��� �� "�,'A"�<) �� ����

� � � �� ������ � ��������� �� � �2 ��� � � � �� ���� � ��%�;���*$� � � ��� ���� >*� �� ������ �� ��� �� ������ ��� ����� � ������� ���� ������ ��� ����������������������� ��� ��%�;���*$� � � ��� ����

��� ������ ��� � � ��� -6� 0B%� -6� 7 �� �2 ,! - �� -6� '" �� ������ ������ ��� -6� '"��3:?����� � �� ��� �%�;���*$� ���� ���� � �� � ����4���� ������ � �������� � ��� ��� � ������ � ���� ��� ������C� ����������

6������� �� � �������� ���� ��� ��� ��� ���� ���������� ������� ��6 #"<.,&�� ��������� ������ ��6#",!'&�� � ������� ��6 #"')#1�� ��������� ��������� ��6 #",#!1�� ��������� ����� ��6 #",#)<� ����������� ������ ��6 #".'"<�� ���� ���� ��� ��������� ��� ��� ������ ���� #.� �78- ���� ��5������ ������� ���� �� � ������� �� �� �� ��������� � � ��� #�7������ � ���� ����� �� ��� ���� ��� � �� ���� � ��������� ���������

6��� � �� �� ������� �� � ������ � � ��� ��� ����� ���� �� �� ������ ��� ��������� ���� �� ��������� %��� � ������� �� ������ �%�2�$� ���� D� � ��� ��� ���� �#1 E #�&� �)#�!=$� �#. E "�,)�"=$� �#1 E " �#"�&=$ �� �* � �#1 E " ���� �� #1 E !�.�&� �#"�&=$� ��� ������ ��� � �#. E " ���#1 E #�&� � � ��� � � ��� � ��� �� ������ � ���������� ��� ��� ������� � ��� ����� ����������������� ��� �������� � �* � �#1 E !�.�&� ���#1 E " �#"�&=$ � � �� � ������� � �� �� �� �� ��� !$�

� ������ ����� ��������

3 ���� � 28- � � �*�� ���� �� ���� % �8- 6��� 9�28- �� �� � ��� �7���$ ��� % �8- 6��� 9����������� � �������� �� ��� � ��� ������� 6�7 ������ �� � ��� #.� �78- ���� � � �������� �� ���� ��������� � ����� � � �2# �� ��! �+������ � �� � #&&#$�6�7 ������� ���� ������ �� ���� %��������� 6�7�%�����$ �� ��5������ �� ���� ���� � ���� �� ������ 28- ��5������ � �3�2�� ����� �� �������5������ �#�# 7� �� 7� ����( 6? 3�������$ ������

� ��� � ��� ������C� ���������� ��5������ ����������� ������ �� ������������ � � �������� ��� ,#,"������ -� ��4�� �-����� 3�������$� ��� �� �����5������ ���� ��� ��� ��� ��5������ ������� ����3 � �� ���� ��� 39-�� ���� � ������ ��� 8�3�������� ���� ��5������ ���� ����� �� ���� ��� ���������5����� ������� ���� � �9F��-9GH �#�1$� 6������������ ������ ��� ������ ��� ��� ������ ���� ��������� ������ %?�- ����� )�" �� ��� � �� � !""<$� 2�� ���� ����� ���� ��������� ������ ��� �������� ��������� �� I��� �#&1"$ �� ���� ���� � �� �� �� ������� � ���� ��� ��������D��� ����� �� �� /8�� #&1<$� ��� � *����� ����� ������ � � ������ � ���� ���������� � ����� - ����� � � ���������� � � ���� ���� �� ��� �� �������� ���� � ���� #"" � ����� ����� ��� �����$ � � �������� ������� �� ��� �� ���� � ��� ����� �� ���� ��� ���������� ��� ���� �� �� � � ��� � �� ��� ��� �� ������� ������������� � ���� ������� ��� �� � �� �� �� � ������ � ��� ����� ���������� �� ��������� ��� � ������� �� � ������ �J�� #$ �� ����� ���� ������E � �������� � ���������� �� � ������� 6������ �� ��� ����������� #.� �78- ���� ��5������ ���� ��������� �� ����8-9��8 � ��� 6�:�?8? ���� �� � � �� ��������������$���� ���� ������� ��� � ))"#!&!� �� � �������2�% .1))�� � ������ ��6 #",!'&�� � ������� ��F�)."&"�� � ���������� 3<#� �� � ������ 7#1#.'� ����&'�#� &'�!� &'�!� &,�, �� &#�)=� ������������ -�� � ������ ���� �� �&<=� ������� �� � ��� � ))"#!&!� ������� ���� ������ ��� � ��� ��� � �� � !""!$ � ��� ���������������

3 ��� � ��� ������� �������� ���� �� ����� ��� � ����������� ������� ��� ��� �� ��� ���� � ���������� ))"#!&!� � ��� ���� ��� ��

� �������� �� ��������� ������� ��� ����

��������� ������� �� ������������ 9� � ��� �D�������� � % ��� � ��� �� ���� �� 7� � � ���� % ������� ����� ��� ���� ��� � � � �� ���$�

����� �� � ����� �� �������� ��� ��� ��� �� � ��� � � ��� �� *� ������ ���� >��� � ����� ����� �,< ��� -���� )1 � ����� � ��������� � �� ���� ������� �� ������ ��� ��� �� "�'A#�< �� � ������ �� "�,'A"�<) �� � � ������ � ���� ��� �� ���������������� 3� ���� -6� 0B%� ������ ��� �� ��� � ��� ��� �� ��� ��� � ���� �� �� �������� �� ������ �� ��������� -� ��� ����� � ��� ����� �� ��)$� ����� ���� �� ��1$� �� �� ��#)$� ������ ��� �� ��� �������������������� �� ����� � ��� � ������-��3������������� ��� ��� � ���� ��� ���������� ��� ��������� ��� �� ������������� ��� ��� ��� ���� �� ��������� �� ������ �� �� ��������� 3� ���� -6� '"�� ����� ���� � ���� �� ��� � !) �� �� �������� ��� 2�� � ����� 2�������� 2��������� � ������ ����� ������ �� ���� ���� -���� � ���� �� ��� �)1 �� �� � ������� ��� 2�*����� ����4���� ��� ���

��������� ������� �#� ��

���#?77�>�����>���������� 30�

Page 55: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

���� �� 3�������� ����� �� ������� ����� �� �!�� ��� #

� * E #� � ������� ))"#!&!�( !� � ������� ��6 #"<.,&�( ,� � ������ ��6 #",!'&�( )� � ������� ��6

#"')#1�( '� � �������� ��6 #",#!1�( .� � ����� ��6 #",#)<�( <� � ������ ��6 #".'"<�� +�� +� ��

������ -�� ������� ������� ���� �� � ���� !) �( ��� ��� �� ����� �������� ������ � )1 � ��

� ���������$� -6� 0B% �� -6� ,! -8- ������� ���� �� � ���� ) �� -�� � * ���� ����� �� ����� ��� �� ��

�� ����� � ,< ���

���� � � � � �

� �� ����� ���� �����

������� � � � � � � ��$ �

9�-� ���� � � � � � � �

2�7��� � �+�$ � � � � � �

2�H���� � ��$ � � � � � �

2�� � ���� � � � � � � �

2������� � � � � ��$ � � �

2�J������ � � � � � � �

2�% ���� � �+�$ � � � � ��$ � �

����� � � � ��$ � � ��$ � �

2�% ���� � � � ��$ � � � �

%��������2�������� ���� � � � � � � � ��$

��-���������� ��� � � � � � � ��$ �

-���� �� � � � � � � �

-����� � � � � � ��$ � �

-������ � � � � � � �

� ��� � � � +� � � �

������� � � � � � � �

9 ���� � � � � � � �

%����� � � � � � � �

���� ��� � � � � � � �

%���4��� � ��$ � � � � � �

7 ����� � � � � �+�$ � � �

�� ��� � � � � � � �

������� � � � ��$ � � � �

��� ��� � ��$ � � � �+�$ � � �

2�9�*�� � ��$ � � ��$ � � � �

9�J���� � � � � � � �

6� ���� '� ������� �� � � � � �+�$ � � �

��� ����

?���� �� ��)$ � � +� � � � �

@ ��� ��� �� �� � � � � � � �

��� � ���� �� � � � � � � �

��� � ���� �� � � � � � � �

�������� �� � � � � � � �

�������� �� � � � � � � �

��� �� ����

-����� ������ �� � � � � � � �

��� � ���� �� � +� � � � � �

�������� �� � � � � � � �

��-� ���� �� � � � � � � �

���������� �� � � � � � � �

�� ������������� ��� �� � � � � � � �

������ ��� �� �� � � � � � � �

��� ��� ��� �� �� � � � � � � �

7 ����� ������� �� � � � � � � �

����� ������� � � � � � � �

�� ������ �� ������ �� �� ����

30+ ����������� ������� �� �������� ��� ������������ ������������ +�

Page 56: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

���� �� $!#�������� ���� �� �������������� ��

�!� ����� ��������� ������� ���� �%& �'()

���� ��*����� ��������� ��-+. �� ���������

(������ � �� �� �� ����������� �� ���

��������� �!� ������� �!� ������# �!� �1

���� �+�, �� �� ���� � ����������� ����

���� � ��� � �!� ��������� "�� ����

������� � �!��� ��� ������� � ���������

���� �� �����

���� � � � � �

����� ��!"��

-���� �������� � � � � � � �

'= �>! � � � +� � � �

%�� ������ �������� � +� +� +� � � �

-� ���� �������� � � � � � � �

!' �� � � +� � � � +�

," �� +� � +� � � � �

)) �� � � � � � � �

���� �� 5!����� ���# �� ������������ �,� �� �!� ���� ��������� ����� � ���� �������

82� 8� ��������� 2 � �� � ������� �� ��� ��� ������� �����( � � �� � ������� �� ��� � �� � �� �!"", $(

� � �� � ���������� �� � ������ �� ��� -� � �� �!"".$( � � �� � ������� �� ��� � �� � �� �!"",�$�

#�� ��� $� � % ��& �� $�' � ��()� "�� $�' � % "������ $�' � ��)� $�' � %

� ������� ,)�" #"�& )#�! #"�&

� ������� )) 82 ,< #)

� ���������� ,)�.) 82 !'�,, #'�&#

� ������� !& 82 !. ##

� ������ ,1�& 82 ,,�) !�'

��������� ������� �#� ��

���#?77�>�����>���������� 30,

Page 57: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�� 2���*��� -���� � ���� �� ��� � )1 �� �� �������� �� �� ��� 2����� �� 2�� ����� -�� ��� ������� ��� �������� ��������� 2� � ����� 9� � ����� 9�*����� 2� ����� ������ ��2�*����� �����9������� 9��� ����� ������� ����� 2�� ����� 2������� ������ ��2�� ����� ����� ������ ��2��������� ����� �� ���������� ���� ���� ��� ������ ����������� ��� ��� � ���� �������� ������� ����� � �������� ���� �������� *����� �������� 2�� � ���� 2������� 9������� 2� � ���� 9� � ���� �� ���� ����� ��� ��� ���� !� ������� �� � �� ���� '� ������� ��� 3����� -6� 7 �� �2 ,! -� ��� ������ ����� ���� �����E ��� � ���� ��� �������� ��� ������� � ��� ���� ����� ��� �� ��� ������ � ��� ��� �� �� �� ������ ��� ��� ��� % ���� ������� �� �� ������ ��� �� �� ������ �� ������ ��� ��� ��� ����� ���� ��� ���E ��� ��� ����� ������ ��� ��� � ���� ��� ��� � ���� �� .������� ��� �������� ��� �� � ���� ��� ���������� ��� �� ������������� ��� ��� � ����� ������� ��� ���� �� �� ��� ��*�� ��� ������� ��� ���� �������� � �������� � ��� ����� ��� �� ��� ������ ������ ��� �� ���������� �� �� ��� �� ��� � ��� ��� �� ��� ������ ��� �� ��� ��� ��� ��� �� ��� ���� ��� ���� �� �� ��� �� �� �� ����� ��� �� ��� ��� � ��� �� ����� ��� � ����4�� �� ��� �������� � �#! E "� �#) E "� �#. E #�&���#. E #�<�� �#. E "� �* � �#1 E !�.�&� �� �#1 E " ������#1 E #�&� �� �#1 E "�

��� ���� ��� �� ���� � � �� ��� ��� ��� � ���� ����� � ))"#!&!� ����F7 6#1����F� ','!!�$�

������ � � ���

+� �� �� ����� � 3��� �� � �� �� �� 8�� � -���� �� ������ ������ � ���� ��� � �������� ������� �� � ?�����J ���� �F������� � �K������ ������$ �� ��� ������ � � ��� �������� ������

� � � �

��� ��� ���� � ����� � ������� ��������� ���������� ��� ������ ��� ��� � ���� ������ ��� � ��� ���� ��������� � !"),A!")1�

���������� �� ��� ��� ������ �� ������� ������� ������� � ���� ���������� ������E ��������� ������ �� ��� �� ����� �� ��� ���������� � ���� ��������� �%� ,))!A,))1�

����� ��� ��� �!� "� #�� !$ %� � &� �$������ '� �� ����(��

������� �� � ���� � �� ��� � ��������� ������ �� ������#.� ���� � 28- �������� � ����� � ���� ��������� �)�,'''A,'.!�

����� ��� ������%� )� ��� �$!%��� #� ��� ������%� ��� *��%��� ��

�$������ '� �� ����+��� ��������� ������� ��� ���� ��� ��� ����� � ������� ��� � ��� ���� ��������� �� #'#'A#'#1�

����� ��� ������%� )� ��� &�,%��� "� ��� *��%��� �� �$������ '� ��

����+ �� ��������� ������� ��� ���� �� ��� ��� ��� � ������� � ��� ���� ��������� �� #))'A#))1�

����� ��� ������%� )� ��� &�,%��� "� ��� *��%��� �� �$������ '� ��

����-�� ��������� ������ ��� ���� ��� ��� � ���� � ���������� � ��� ���� ��������� � )!<A),#�

.�/$��� )� �(01��� - ����� ����� �� ���� ��� ������ �� � ���� � �� ���������� ������ ��� � ��� ������ � ����������5������� � ��� ���� �� ###A#!"�

)������ "� ��� 2���%� &� � )������ �� )� �(00-�� ?� �� �� � -6� -���2?8� �� 7 ��2 -8- �� ������� �� ������ �� � ��������������� ��� ���� � ��������� � ���� ��������� ��� ,!&A,,"�

��!�$� 3� 3��� )� �(014�� ��� ��������D��� �����E �������� �� ������������ ���������� ��������� ���� ���� �� )".A)!'�

��!���� �� )�� ��5����� 3�� ����� ��� ����%��� "�� ��$%�/��%6�/���

�� .������� �� ����7�� ?� �� �� � ��� ������ � ���� ��������� ������ �� � ��������� �� ��� ������ ��� ��� �������� ���� ��������� ��� )#1A)!"�

��5����� 3�� .������� ��� $//����� "�� .������� )�

��$%�/��%6�/��� �� ����(�� 6������� ������ �� � ���������� �� ��� ��� ������ �� ��� ��� ��� � ������� � ������������� �)� ,&''A,&.#�

���� 8� ����-�� 6�7�� ��� � ������ �� � ���� �������������� ��� <&A&#�

!�95� ����!� ��� *������5%��� 2�� :����!;� :� )�� :��/��!� "� �� ���

.�</=>��� "�� )������ )� �� ��� 3�%/�� �� #�%%����6)���� #��

,���%� �� �!��� �$!���% ������� 7���� � ��� �� ��� ��������� ��� ����� �� �� � ��� ������ ������ � � �������� ��� ���� ���� ��������� �� #"),A#")<�

��/$��� .�� �$���;� ��� 3��� )� .$/��� � ����4�� %?�-)E ������ ������� �� ������� � ���� �%?�-$ ���� �� ����� )�"� ��� �������� ��� #'&.A#'&&�

2��% $��� 2� :�� '���%� � )�� "����!���� �� �� &���� �� �� �(00(�� #.����� � 28- ����� �� �� ���������� ������ � �������� ����.&<A<",�

2��� "� ��� 3�� .� �� &�� &�$� � .� "�� 8�=� .� ��� *$��� �� )� 8�� &�$���

.� 2�� ��/� �� )� 2�� �$�� �� &� 8$��� .� 8� ����+�� F��������� � ���%����5 '"" #.� ���� � 28-�� ��� � ���� � ������ �������� �� ������ �� � ���� ��� ����� �� � ���� � �� ��� ��� ������ ������ � ������� � ���� ��������� ��� #&&.A!""#�

�� ������ �� ������ �� �� ����

300 ����������� ������� �� �������� ��� ������������ ������������ +�

Page 58: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

58

ARTICLE 5

Helcobacillus massiliensis gen. nov., sp. nov., a novel

representative of the family Dermabacteraceae

isolated from a patient with a cutaneous discharge.

Renvoise A, Aldrovandi N, Raoult D, Roux V.

Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Sep;59(Pt 9):2346-51.

URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France

Contribution de AR: réalisation des expérimentations, travail bibliographique, analyse desdonnées, écriture du manuscrit.

Page 59: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

59

Commentaire

Dans ce travail, nous avons isolé au cours de notre activité de routine

hospitalière une souche de bacille à Gram positif cultivée à partir du

prélèvement cutané d’un erythrasma. Cette souche avait été mal identifiée sur

ses caractères biochimiques par galerie API Coryne (bioMérieux), et avait donc

été soumise à identification moléculaire. La séquence 16S de 1337 nucléotides

avait trouvé une similarité de 95,1% avec celle de l’espèce Dermabacter

hominis, ce qui faisait de la souche 6401990 une candidate pour une nouvelle

espèce (Stackebrandt et al. 2002). Cependant certaines caractéristiques

phénotypiques différaient de celles communes au genre Dermabacter spp., et la

souche a donc été classifiée dans un nouveau genre.

La PCR 16S permet donc d’élargir notre connaissance du monde

bactérien aussi bien au niveau des espèces que des genres (Schlaberg et al.

2012).

Page 60: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

����������� �������� ���� ����� �� ����� ����� ������� ��� �� �� ����� ������������������� �� ���� ��� �� � �� ����� ��������

����� ��� ������ ������� �������� ������ ������ �� ��� ������ ����

�������������

��� ������ ����

������������������

����������� �� ������ ����� �� ! ������ �� "�#$���� �� �� %���� &��' ()� *+,* &��'-.�� ./�01 +*0 ��� '���-2����� �,,13 )�������� &���� 43 /����

������� ���� ���������������� ���� �� ��� ������� !� ���� �� ���� ���� �� �����

�������� ���� ��"#�� �� � ������� $����� � ���� �� ���� ����� ��� %������ �� &'�

( �� �� �#�� � � ���� ���� � �������) * � �+��+,!� � �������( * � ��-�(,! �� ����

��� * � ��-��,!� &������ ���� ���� �� ����� � .��� ����� ����� ���� ���� �������������

������ ������������� ���� ����� ��������� ���� ����������� �� ������ �����

����������� �� ������ �� ������������ ��� ���� ����� �� ���������������� ���� �� ��

������ �� ���������� ����� ������ �� ������� �� ���� ���� � �� ��� ���� ��"��� ��

���� �������� �� ��� ��� �� �� � ��� ������� �� �-��,� .�������� �� ������ "���

�� ��/ �012 ���� ��%����� ��������� ������ �)��, ������� � �� � ���������� �������

3� �� "��� �� ���� ��� � �� �������� �� ���������� � �� ������ � ��� � ���

������� � ����� ������ �� ��� ����� �� �� ����� ���������������� ��� ����� �� ���

����������� �������� ���� ����� �� ���� �� ������� �� �� � ��� �� ������� ��/40

.�( ��5. �����- ���4� )+-)� !�

��� ����� ���������������� �� � � �� ������� ���������� ������������� ����������� ���� ����� ������� �������� ��� ���� � ���� ��� ������ ������������ �� �� !!"#$ %�� ����� �� ���&�� ��� ������ ����������������� ��������� ��� � ������ �� ����� ���& ����������'����� �� �� ())*#$ +�&� ����� ���� �&���� �� !** ���� ����� �� � ����� ���& ��� ���� � ����������� ��������,��� - ������ � !**#$ ��� � ����� ���� � ������ �����&��� ���� �&� ����� �� �� ������� ��� ��� ������������ �� ��� �������$ .� !!/� �� �� � ����� ��� ���� ������&� 0 ��� ���&� 1 �������� ������� ���� ������ ����� ���& ����������� �+&��� �� �� !!/2 ��&��� �� �� !!/#$ 3� ��� �� � �� ���4��� ������5����� ���&� ��� � �� ��� ����� ���� �� ������ �� ������ �� ��� ���� � ������� 6������� ����� ����� ����� ���4���������5����� ���&� �")7 ���� � �������� �&� ��� ������� ���&��� �� ����� ���� ���& � ��� �&�� ��� ������������� ��������������$ ��� � ����� ���� � ���������� ������ � ����� ���� � ������� � � ��������� �&�����������$ .� ����� ��� � ��� ������&� �� &� ������ ����� �� ������� �� � �8����� �� �� !!*#����������� ���9��5�����9 �� �� ()) #� �������������� � �� ������ ���������� �:����� �� �� ()) # �������� � ��������� �;�� 8� �����&� �� �� ())(#�

������������ �� ���� � �� ������&�� �� ��������$ ��� ���& ����� ��������� �� ����� �� � ������ �� � � !**# ������ ���� ���&�� ( ������5�� ���� $ ��� ���� � ���������� ������������� ����� ������ ��������� ������������� ��������� ���������� ����� ��������� ����������� ��������� ��������������� ��� ����� ����������������������#� ��� � ������ ��������� �������������� ����� ��������� � ������������#� ��� ���� ��<&�������� ��������� ������������� ����� ��������� ����������������� ��� ����� ��������� ���������#� ���������� ��������� �������������# ��� �&���� ����������� ��������� �����#$ ����� ���������� �� �&����������� �� ��� ����� ������$ ��� ���& ��������� �� ������ ����� �� � '����� �� � �())*# ��� ���&�� ��� ���� ��������� �������� � ������ ���� ��������� ��� ��������� �� ������ ��5��� $

.� ��� ������� �� ��������� �� ��&����� ��� ������������ ����� �� ����� =/) !!)� ���� �� � ������ ���� ��&��� &�����& �� ����� �����$ > ��� � ������ ���?����� �������� �� � ����� �� ���� ��� � ���������� ��� � ����� ���& �� ��� ����� ����������������$

� 1*�������� ��� �� �������� �� �� ����� �� ���������())= ��� � ������� ������ ��� ����& � ���� �������������&����� �� ���� � ��� ��� ������ � ����� ����&�������� ��� �&� � �� ���$ �����&���� ��������� ��������� �� �����$ � �������� &� � ���������� �� & ����� �&� �&�� �� ������� �������� ��� ����������$�&���� �� �� ������5������ ��� ������� ��� ����� ��

2""���� ����* ��2 ������$������ ����5 ����-�$� ����-������$�-����� �����

%�� 6���7 �������� ����� 8�� ��� �*' ���� �� ������� �8����������� �������� ����� *04���4% �� 9(0::434�

��������� ������ �� �������� �� ���������� ���������� ;+44�< )�� +,0*!+,3� 635 �4��4��=�>��4�44,,��-4

+,0* 44,,�� � +44� .()' ������ � ���� ����

Page 61: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

������ ��$ ��� &�����& �� ����� ����� �� �� ��� ���&� ���������$ ��� � ����� �� ��� � ���������� � ��� ����������� ������������� & ��� ��� ������&��5���%. ����� ���� ����'�9���&?#� �&� ��� ��������������������� �������� &�����$ ��� �<&����� �������������������� �� ��������� � =� �:�� ���� �<&��������� �� ��� ����� =/) !!)� �� ��&�� �� �& ��� ����� ���������������� ����� �� � �� ����������� �������$��� ������� �� ��������� ������� � ���� ������������ " �� $ ��� ������ �� ����� �� <&���$

'.� ���� ���������� ������� �� ��� �� ����& ��������� ���� �� &������ & � �� �&� ���������� � ��������� �� �&� ���������� �� ������������� �&������� ��� ��������������� & ��������� �� ���� �� �������� �������$������ =/) !!)� �� ��&�� �� �� & ������� �� ���?��������������� ���������� ��?���� ��� ���������� ��������������� �� ���������$

�&���� ������ �� ���� ����� ���� ����'�9���&?# ������&���� ������ ��� ��� ����� ����� (/ � ��������&������ �� 0" ��$ ������ ��� �������� ������ ������ ��� �� 0" �� �� ���&���� ���� ���� 17 ���� �����$������ �� �� ��� ����� (/ � ��&������ �� 0" ��� �� ������ ��� �� ��� �� 17 �3(� ��� �� � �� �������� ���������������� ���� ����� ���� ���� ������ & ����@���� ����� ��� �@���� ������� ����'�9���&?#��� �������$ ������ �� ��������� ��������&�� �(1� 0)� 0"�// ��� 1) ��# �� �� ��� �� ���&���� ���� ��� (/ �$3����&� ������ �� �������� �� 0" ��� �&� �&����������� (1 ��� // ��$ ��� ����� �� ������ ��� �� � ������ �������������� ��� �� ��� ��� ��� �� 17 �3($ �������� �� �������� ���� ����� �� ���� ����� /* � ��&�������$ ��� ������� ���� ������������ ����� (/ � ��&�������� �&� ����� �������������� ����� /* � ��&������ ����� ��� ��� �� ���$ ��� �5� ��� &���� ��&�&�� �� ��� �������������� � ���� �� ��� ������� ���� ��$ ���� ���� ����� �� ������ � � ����� ��� (/ � �� 0" ��$ ����������� & ��� ��� �� ������?�� �� 17 ��A�# ��&����������� �� ��� ����� �&���� �����2 B��� ()) �� �� 2B6(%3/� ()) �� �� 2 ����� * � �� 2 ��(6%3/ $ "6(3�($ = � �� # ��� �� ��� � � �� ���� ��������&��� �� ����� ��� ��� �&���� ��� ������ ���� 7 ��A�# ��� �����&�� �� ���$ ��� ����� ���� �?������ �� � '�������(=*� �%����� # ������� ���� ��� �� �� ��������� ��������� =) �;$ ��� ��� ���� )$"4 �� ���� ��� )$/4)$" ������$

������ � ������ ���������� � ��� .� ���&� ������ � �� � �������'�9���&?# �� �� �����$ 3?��� � ������ �� � ��� �������� ��� ��� �� ��� ����� �� ���� ���� ��������������� ������������������������� ����'�9���&?# ��� �� ��������$

��� ��������� ��������� �%. CD'� �%. ����� ��� �%.1) �6 ���� ������� ���� �%. 1)�68A@ ����&�����'�9���&?# ���� & �� �� ��������5� ��� ������������������ �� ��� ����� ������� �� ��� ���&���&���E �� ��&���� � ��� ��&������ �� ��������� �� 0" �� ��� /�(/ ��� "( �� �� �������$ %������� �������� �� ����

������� �� ��� � �� � ������� ��>� 0(!!*� ���� �� ��� �� � � ������� ���� ���� =� �:�� ���� �<&��� ���� �������$ ��������� �� ����� ��� ��� ����� ������� $ ��� �� &�� �� ��� ����� �� � ��� ��� ��� �������� ����� �� ��� ���� �� ������� �����$

��� ��������� �������� �� �� ����� =/) !!)� ������ � ���������� & ��� ��� 8����� � ���$ 8������� �������� �������� �� 8>� �8����� >����� �� ������# ���������� �8�����# ��� (/ � �� 0" ��$ ��� �������� & ��� ����� �������� �� ������ �%A�� ���&������ ��&�� �8�����#��� ���&����� ���� �%( '�������� �8�����2 �� �&�����&�� � ��� ����� �&�� # � �� ����� � ������&���&���$ .�&������ �� ������ �&� �� 0= �� �� �������� ���� ����� ��� ( �$ ��� �� &�� �� ��� �� � �������� �� ��� ���� �� ������� �����$

���� � �� �� ������� <&����� � 6%F� ��� ����� ����� � ��������� ����� �F� ���� ������ �&� � ���.������������ ������ ��� �� 8���� �������� ��'C�8��&� ������ ������$ :� ������� ����<&����� �����?������ ���� )) �� ����5������� ��� �������� � �� ����� � ������� � !!)�� �#$ :� ������� ����<&����� ���� �������� ���� ����� ��������� �� � �����<&����� ��� &��<&����� # � �F� �� ���� ���� & ��� ��?���A�����&������������ �! G � �A�# � ������$ >; �� ���������� ���� ������� �� ����<&����� �� &��<&����� ���� ������� ���� ��� ����� ��� �&����� ���� �� �6%F� �� (=! ��$ ��� ��� �� ������� <&����� �� 'B�"$%���� ����� ���� �?������ ���� )) �� ����5������� ����������� & ��� � ���������A��������A)$07 �<&��& ������?�&�� � G ( G )$*� � ���$2 �������� ����� 8���� - ���� !1!#$ ��� �?������� ������ �� ������ ��������� ��� ������ ����� �������� � ������&������$ %���� ����� ������������ ���� ��� ��������� ��� � � ��H& ���� ������������A��������A)$07 �<&��& ���� ��?�&�� �� ������ �� G G )$! �� ���$#$ %���� ����� ���� �������� � �� ����� � ������� �� � �())"#$ ��� ����� ����� ��� ������� ��� �������������� ����� �������������� ��� ��������������������� ��� ������������� ��� &������������ �������� $ %���������� ��� ������������� �� ���&������� ��� ���� ������ �&� � ��������� ��� �����&�� ����� ��� ��� ������� '������� ������������� � ����'.�.#$ ��� ��H�� ���� ��� ���� ����� ��� 1 G )�0/$07#� ����� ��� " G ) � *$"7# ��� � ��� = G )� *$=7#$ '��� ��� ���� ���������� � �� ����� �B����� �� � � !!/# ��� ���� ��� �������$ ��� ��� �� ����� ����� �� ���������� � & ��� ��� 6%F� �������� '� ��� �� � � !*!#$ ��� ���&� ��� ����� =/) !!)� �� =*$=���7$

I���� ��� �� ����� =/) !!)� ���� ����� �� �/ ' 6��� )) ��� = �# ��� ��� ����� ��� �� &�H���� �� �F� �����&�� � ����� & ��� ��� ������ ��� �� :�&���� �� �� !11#$ ��� � ���� �� ������������� ��� ���%#���������� �� ������������������ ��� ���������#$+�� ���� � �� ��������� &��� � ��� ���� ����� �� ��)$1 ' 6(�3/ �( � �� )) ��#$ 6(�3/ �� �������������� �� ��� ������ �� I����� �� � � !*1# ��� ���

����������� �������� �� �� �$� ��

���$?==�>��� �>��������� +,0:

Page 62: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

&��� �� ��� ����� ��� ���� ���� �� � �F� �� ���&�� ������ ������� �� ��� ������ �� ������ - :����� � !"/#$ 6��� ���&�� �� ������ �� ���� � ��� �����&� � ���� ��&��$

8������� ��� �� �?������ & ��� ��� '���� %&�� F���� � ������� ��� ... �:���# ���� ��� '���� %&�� F��� ��&����� � �� ����� � ��� ���&���&���$

%�: ������������ �� ��� =� �:�� ���� �� ���������& ��� ��� &����� �� ������ ���� �� ��� ��( �I�� �&�� ���� !! #$ %�: ����&� ���� �&������ & ��� '&��������%�: �'��������# ��� �<&����� ������� ���� ������ �&�& ��� � ��� �<&����� ��� �8���� ���������� ���

��<&����� � $ :��� :������ 2 %@ ��� ��� #� �������� �� ��� ���&���&��� E �� ��&���� $ ��<&����� �����&� ���� �&������ ��� ����������� � �� ������������� ��� 0 0) ������ ����5�� �������� 8�� ��� #$ ����������� �<&��� ���� ������� ���� �<&��� ���� ����� �� ��� ���8��� ������ � � & ��� ��� 8F��� �����������&�� ��� ��8. �����$ ���� �<&��� ���� �������& ��� ��� �&��� �<&��� ��������� ������� �F>���FJK $*������ �� �� �� !!"#$ %��������� �������� ��� ������ �� ������� ���� ���� ���������� � & ��� '@��

��� ��� /$) ����&�� �� �� ())"#$ �� ���� ������ �������������� ��������� ��� � &������ �� ����� �B��&�� � !*)# ��� ���� & �� �� ��������� � ����������

����� �� 6����� �� �� � �������� � ��� �� �������� ������� �� � ������ �5.��)���

�� %� �����2 �� ��������2 I� ���� �� �����2 �%�� ����� �������������2 %�� ��� �������������2 %F� &�����������

��� �������� 2 �F� &����������� ��������2 %@� ��� �������������������2 %�� ��� �������������$

��������� �� ������� � �����������

� � � � � � � �

��� ����&���� ���� ��%. 1)�6#G

������ � � � I

@�������� � � � �

F�������� � � � � �

��:��� � � � � �

��K�� � � � � �

�������� � � � � �

.�� ���� � � � �

��'������� � � � �

'�����������&������ ��� � � � �

�������� I � � �

�� &��� � � � �

��F��� � � � � �

'������ � � � � �

:������ � � � � �

��������� � I � � �

@�5�� � � ��%. CD'#G

@ ���� � ���� � ��*# � �

F�&��� ���������� � � �

�������� ��� � � �

����&� ��� � � �

��'���� ��� � � �

�%. ����� ����G

:��&���� �� ������� � �

%��5������� � � �

%��������� ���������� � � �

�������� ��� ����� � I �

������� ����� � � �

K�� � ������������ � �

'������� ������������ � �

:��� � ������������ � �

%���������� �� ������� <&����� 'B�! 'B�"

��� ������ ����7# =( =*$=

%���� ����� �%�� %�� %F� �F �%�� %�� %@� %�� �F

+��� ��� �7#G

����� ��� " G ) /)4=) *$"

����� ��� 1 G ) 0401 0/$0

�� ������ �� ������

+,01 ��������� ������ �� �������� �� ���������� ���������� )�

Page 63: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

& ��� ��� �������&��H������ ������ ������& - ���� !*"#$��� ��?��&����� ���� ��������� �� �� � & �� �� ��������������� �������� ��� $ � ���� ���� ���� � ����� �������&� ���� �������� ��� � �� �� & ���� �� �� �� ))������� ��������� ���� # �� ��������� �� ���� ������ ��� ������� �� ��� ���� ��������$ ��� �& ������ �� ��� ���� ����� �� ��� ��� ���� ��� ��� ������ $ ������������� ���� � ����� ������ ���� �&� � ����� �& ������ ���� � ������� �+��$ #$ ��� ��������� ��������������� =� �:�� ���� �<&��� �� ���������� �& ��� F�F.�� ����$�$������$���A �������AF�F.��J����$����#$ ��� ���&� ������� ����� =/) !!)� ��� �������� �� !1$ 7$ ��� ���&� � �!"7 ����� � ��� ���� ������� ���&� �� ��������� ��� ���� �����#������������ �� �� ())(#� ��������� ���� �����=/) !!)� ������ �� � ����� ���� � �&� ��� ����������������� �������� �� ������� ���� ����� =/) !!)� ������ ������ �� ��� ���& �����������$

8� �� �� ��� �� &�� �� ����� ������ �� ����� � ��� �������������� ����������� ���$ ���$� �$ ���$ ��� ����� ����� ������&�$ ��� ��� ����� � =/) !!)�$

���� ���� �� ����������� ���� ����

���������� �6��$�$��$����& $ ��$ �$ ������ ��&��2 F$�� $ �$ ������� ���2 �$F$ �� $ �$ ����������� � �����&�� �� ��&�� #$

������� ������ ���� ������������� ����������� ������� $ @ ������� ������ �&� �� ��� ��� ���� ������&���� �������� �������� $ 3����&� ������ � ���������� 0" ��$ ������ ���� ����� ��� �?��� ����������$ ���� ����&�� ���� ��&� � ��� ��� ����� &��� $ �������� ���&��$ ����� ��� �� &��� ��� ��� ����� ��$ �������� ��<&�����$ �������� �� �����������&� ������� �����5������� � ��� ����&� ��� � ��� �������$ ��� �������<&����� � 'B�"$ %���������� ���&��� ���� ��� �������� ��� 1 G ) �0/$07#� ����� ��� " G ) � *$"7# ��� � ��� = G ) � *$=7#$ '��� ��� ��� �� ���$ %���� ����� ������ �������������� ����� �������������� ��� ��������������������� ��� ������������� ��� &������������������� ���� �������� ������� ...#$ ��� � ���� ��

��% � ��������$ ���� � �� ��������� &��� ������ ���� ���&�� �� ������ �� ���� � ��� ��� ��&� �$ ������ ������ �� ��� ������ ��� �� ��� ��� ���� � =*$=���7$ ��� ��� ���� � ���������� �����������$

���� ���� �� ����������� �������� � ����

���������� ����������� ��� $ �$��$��� � $ F$ �� $ ��H$����������� �� '� ����� ��� ��� :���� ���� ���'�� ������ ����� ��� ��� ����� �� � ������#$

���� ��� ������� ������� ������ ����� �����&���� ������������ ������������� ��� ���������� ��� $ ������ ���� �������� �?��� ����������$ @ ������� ������ �&� �� ������ ���� ������ &���� �������� �������� $ 3������������ �&� �� 0" ��$ ����� (/ � ������ �� ���� ���������� &���� ������ ��� &� �� �� ��������� ��������&���� ����� ��� ���$ ��� ��� ��� &�� )$"4 �� �������� ��� )$/4)$" �� �� �������� �� ���������� �������� ���� ��#$ > ��� �%. CD'� �������� �� �����������&� ������� � ��� ����&� ��� � ��� �������$�������� �� ��&��� ���������� �� ������ ���������� �� �������� ��� �� �������� ��� ����� �� � ���� � ��/#� � ���� ����� � ��*#� ���� � �� /#� ���� ���������� �� ��� ��� �������� ��� ��� ��� ����� �� ������������8.���� ���������� �� �������� ��� �� ����&&������ �� ����&� ���� �� ������� ��� � ��� ���&� ��� � ��� ��� �������$> ��� �%. 1)�6 ���� ����� �� ��&������ ���� �� /* ����� � ����&�� ���� F�������� �� ��?�� �� ����&� �� ����&�� �� ��� ����� ����������� ����� �� &�� � ����&���� �$ ����� �� ��&������ ���� �� "( �� ��� � ����&�� ��� ��� ��� ������� ������& � <&����# ���������� ������#� ���������� ��������&� �����������#� ������� � ������# ��� ����5��� � ������#$��� � ��� ����&�� ���� ��������� �� ������ �� F�?�� ������������� ����������?������� ���� �������� �� ������� �� F� ���� �� F������� �� �&������ �� ���������������������������� ���� ������������&������� ���� ��������� ���&���� �� &��� ����� ������� ������������� �� ������ �� ������� �� ��&���� ������� �� ������������ ?������ ��������� �� ���?� �� �������� �� ���&� �� F��&� �� ����������� F���������� ���� �&�

���� �� .�������� �� ��� �� ������� ���� ��

�� ����� ��������������� ��������

���������� �� ����������� �������� ����

��/ �012 ���� ��%����� ���������

��++( � ������ ! ����� �� �����"����

#������ �� ���� 1��"��� ����� �� ���

�� ���� �� ��� ��������� � ���� ��

������ ������ 2� ����7� � �� �� "�� � �

����� ����� � �� ����� � ���� ���

�" ���� �� �� �$������������ ����

�������������� ��������� �� ���� �

�� �� ����� 8�� ���� ������ ��� ������

�� ������ ��� ��� ����

����������� �������� �� �� �$� ��

���$?==�>��� �>��������� +,0�

Page 64: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

��&������ ���� �&� (�������&����� ��� ���� �&� 1�������&�����$ > ��� �%. ������ ��� ��������� �� � ����� �����G ����&� ��� �� ���&���� �� �������� ���5�������� �� �����������&� ������� �� ������� ����� � � ��&�� �� ?�� �� ��������� ����� � ��� &�� � ������������$��� ����� ��� ��������G �������� ��� �� ������������������� �� �������� ��� ����� �� ����&&������ �� �������� ��� �� ����&� ��� �� &��� �� ���� �� ���� � ��������� ������������$ ��� ����&�� & �� � �������� �&�� �������� ���� & ��� ��� 8����� � ������G ��?����� �����������&� ������ ����������������� ������ F�������� �� ����&�� �� �������� �� ������&�� �� ����� ����� ��������� �� ����������� ������� �������#� ����5��� �� 0��������&� �� ������ �� �� �������� &�� �� ������� �� �&���� �� ��?�� �� F����� ���� ��&����� ����� � ���� F������������� ���������� F��������� F������������ F�� ��������� F���&���� ���� F� ������ �������� ����� ��� ��� ��������$ ��� ��������� �����������G ������?����� ������?����� ������� ��&����������� ��������� ����������� ���&���� ������� �� F��&� �� �������&���� ���� ��������� �� ����&��� ������������ �� ���&�� �� ����� �� ������� �� ���������������� ���� ���������������� ���� ������������&� ����������������&� ���� ��������������� ���� �������� ����� �� �� ������� �� F������� �� ������ �������&�� ��� ���� �� �������� �� ?������ ���� ���� ������?�&������� ������?�&��� ���� ������?�&��� ���� ������?���������� ���� ��������&���� ���� ������������� ���� ��������� ������ ��� ����� � ���� ���������� F����� ���� &��� ��� ���������� � ������������ ���� ��&�� ���� &����� ���� &������� �������F���&���� ���� ����F���&���� ���� F������&���� ���� �&��� ���� (�0��&��������� (�����?������ ���� ��� ���� &������� ����� ��� 1��������� �������������� 1��������� ������ &������ 1��������� ����������&�� � =���� ������ ������&� � ���� ������ ����&�� � =���� ����� ��� �F��������� ��� �����$ >����5������� ��� ��������� � ��������G ����� /) ��� ����� *)$ ������ �� ������� <&����� � 'B�" ��� ����� ����� ��� ������ ��� �������������� ����� �������������� ��� ��������������������� ��� ������������� ��� &������������������� $ ��� ��H�� ���� ��� ��� ����� ��� 1 G )�0/$07#� ����� ��� " G ) � *$"7#� � ��� = G ) � *$=7#�� ��� / G ) �!7#� � * G �"� ��� � ��� 1 G ) �1$(7#$'��� ��� ��� �� ���$ ��� � ���� �� ��% � ��������$ ���� � �� ��������� &��� ��� ���� ���&�� �������� �� ���� � ��� ��� ��&� �$ ��� ��� ������ ����� ������ ��� � =*$=���7$

��� ��� ������ ���� �� � ������ ���� � �&���&�����& �� ����� ������ � =/) !!)� ����>:% "���.% )!/ *����>� 10*1!�#$

��������

������� �� ����� � ������� � ��������� �� ����������� � �

������� ��� � � !!"# �������� ����������� ������� �� � $ ���������

��� * 4 *0$

���$�� % & � �'��� ( ) � !*!# � ����� ������ �� ����� ������?������� ��� �&���������$ ��� � ������� �� ��� � ! 4! "$

������� ��� ���+�� ) � )����� � � !""# ����� ��������� ����������$ ���$� �$ ���$� � �������� ������&� ���� ��&��� ���� ������$��� � �� �������� � /14/*$

,����� &� ������� �� -.'..��� & %� ���������� � � ������� � �

� !!/# ��������� �� �� ��� ���&� 0 ��� ���&� 1 ��������������� � ������ ���� ������ ������ ��� � ������� �� ��� ���& ����������� � ��� !������� �� ((04 ((*$

&�0��12&����0 �� ) 3� 4���� )� &���50�� &� ������� �� ���0 �� ) 6 �

,����� & �788 # 8�������� � ����������� �������� � ������������$ � ��� !������� �� (01=4(01"$

&������ %� ����$��+���� � &� ������ � &� (�'���� 9 �� (������

9 %� ����� (� ���������� � � �������� � ) � !!/# :����������� ����������� �������� ������� ��� ������������ �����������&� 0 ��� ���&� 1� � � ��������� �&��� ��������$ � ��� !������� �� ! *4 !(($

)����� � � ������� � � � !""# ��?����� �&��� �� ��� �&���&�����& �������� �������G �� ������� �� ����������� ����������$ ���$� �$ ���$ "#! !������� $��� ��� 1 41=$

:������ � � !"8# � ����� ������ ��� � �������� ����&������ ���� �� �� � &� ���&���� ����&�� ���������� �&��� �� �&������� �<&��� $ � !� #�� ��� 4 ()$

:������ �� :��;;�����<�� 9 � � 9����'� , � � !!/# %��&������������� �$ ���$� �� &�& &�� �&���������� ��� ����� %��&������� ���� $ �� '�� !������� �� 01140=)$

������� �� -������� ,� ������'��� �� ����������� , �

=��<����� - �788"# ��������� �������� ���$ ���$� �$ ���$� ������ �����������&� � ������ ���� ��������� ��� ��������� �������� ��5��� $ ��� � �� #�� !������� �� (()=4(()!$

������� �� -��������<���� > � (������� ( � � !"!# %��� ���� &������ �� ��� ��� ������ �� ���?�����&��� ��� ���������������� ��<&�� ������������$ ��� � �� �������� �� 1!4 ="$

9�<���� �� ���$�� :� ?���� � � �����$��� 3 � �788 # %������������� � �� ������ ���������� �& �� � ����������� ������� � ���!������� �� 0/()40/( $

9�����<� 3 %� (���� %� ������� 9 , � ����� � � � !**# ����������� �� ��� � ���� �� ����������������� ��� �� ���������������� $ � '� ���� �� � /*//4/*/=$

������� � � ���� � � !"@# ��� �������&��H������ ������G � ��������� ��� ���� ��&���� ���������� ���� $ !� ��� #�� �� /)=4/(1$

����������<�� %� 9����'� , � � (��<29����'� � 3 � !!@# %���� ����� � ��� �������� �� �������� ���� '������������� �� � ���$��� � �� �������� �� /"!4/! $

����������<�� %� ,��<�������� (� &�����'� & �� &������� - � ��

:���;.��� -� ���<��� � )� ������ A� 9�������2����� 9�

�+��$�� ) � ����� ������� �7887# :����� �� ��� �& ��� ����������� ��� �������&����� �� ��� ���� ���������� �� ����������$ ��� � �� #�� !������� ��� )/04 )/"$

�������� ) 3 � 9������� & � � !@/# ���������� ������� ��������������� �� ������ ��������� � ��������� ������������$'�� !������� �� ((=4(0 $

������� :� ��<��'� )� ���� � � :����� � �788@# '@��/G '���&���@���&������ ������ ���� � �'@��# ������� ��� ��� /$)$ !� ���#�� ��� 1!=4 1!!$

����;���� ) �� &������ � )� -��+����� ,� )������$��� , �

�$$���� � & � !!@# ��� �F>���FJK ������ ��������G ���?���� �������� ��� �&������ �<&��� ��������� ����� � <&���� ���� � ���� $ ������ '��&� %�� ��� /*"=4/**($

�� ������ �� ������

+,34 ��������� ������ �� �������� �� ���������� ���������� )�

Page 65: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

���<���� � ) � !!8�# � ���������� �&� �� ��� ����� ���� ����� �������������� ������������� ���� �����& �&�� $ �� '��!������� � � (*4 0)$

���<���� � ) � !!8�# F���� ���� ����� �� ������������ �����������&� "#! !������� $��� ��� !!4()($

���<���� � )� ��������� )� �������� 9 � � :���$� � 9 �788@#

%������� ��������5����� ��� ��� �������� �� ���������� ������ $ .� !����&� ��� (����� ��& !������ !��������� � 0������ ��$ 00)40!0$ @����� � �$ �$ :���� �$ ,$ 8��������� ,$ �$8��5���� �$ '��5�&�� �$ '$ ������ - F$ :$ �����$ I� ������� ��G������� ����� ��� '���������$

=�� ����������� �� ����B��'� -� )�������� �� (������� & �

�����0�� � �7887# ������ � ��������� �&� �� '������ ��� ����� &� ���� ����� ��� ����������� ������� #�� � ��� !������� ��������� ��� /*=4/*"$

(������$� ( &� ������ � �� -��������� � � � 3���� � ) � !! # =����� ���� ��� ������������ ��� ���������� �&�$ � �������� � �=!"4")0$

(������ 9 �� 3��� -� ���$��� � 3� &������� ) � ,�C� � � !"*#

'���������� �� ��� ������� ������ ������ ��� ���� � �� �&���� ������ ����� ��&���� ��� ����� &��� � ������� �� ��������������� ��������� ���� ������ ��� ����������$ � ���������� �� )!4 ()$

����������� �������� �� �� �$� ��

���$?==�>��� �>��������� +,3�

Page 66: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

66

ARTICLE 6

Actinomyces timonensis sp. nov., isolated from apatient osteo-articular sample.

Renvoise A, Roux V, Raoult D.

Int J Syst Evol Microbiol. 2010 Jul;60(Pt 7):1516-21.

URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France

Contribution de AR: réalisation des expérimentations, travail bibliographique, analyse desdonnées, écriture du manuscrit.

Page 67: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

67

Commentaire

Dans ce travail, nous avons utilisé la PCR universelle pour identifier une

souche provenant d’un prélèvement de sacro-iléite. Dans ce cas, la comparaison

des 1360 nucléotides obtenus pour le gène 16S avait trouvé une similarité de

96,9% avec celle de l’espèce Actinomyces denticolens, ce qui faisait de notre

souche une nouvelle espèce si on considère le seuil de 97% proposé par le

comité Stackebrandt pour la ré-évaluation de la définition des espèces en

bactériologie (Stackebrandt et al. 2002).

La particularité de ce travail par rapport aux précédents réside d’abord

dans l’origine de la souche. En effet, nous avions reçu un prélèvement ostéo-

articulaire fait chez une enfant de 13 ans et pour lequel nous avions observé des

bacilles à Gram positif et à coloration acido-alcoolo résistante à l’examen

microscopique mais dont la culture était restée négative et pour laquelle la

détection moléculaire a aussi été négative. Le prélèvement avait par ailleurs été

mis en culture cellulaire (Gouriet et al. 2005), ce qui avait permis d’isoler la

souche ayant fait l’objet du travail.

La deuxième particularité est d’avoir pu intégrer à la description de cette

nouvelle souche des données protéiques. En effet le développement de la

spectrométrie de masse pour l’identification bactérienne a été concomitant à la

Page 68: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

68

réalisation de ce travail (Seng et al. 2009), ce qui a permis d’associer cette

nouvelle technologie pour décrire cette nouvelle espèce.

Page 69: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

��������� ������� ��� ����� ����� ���� ���� ����� ������������ ����

����� ��� ������ ������ ������ �� ��� ������ ����

��������� ����

��� ������ ����

�������������

����������� �� ������ ������������������ �!"���� �� �� #�$�� %&�'()�� *+� ,-.,(��/ -,0 ���'���(1����� �../2 +�������� %���� 32 4����

������������� ����������������� �� � ���� ����� ���� ���� ������������ ���� ������

�������� � !�� �� ���� ��������" � ��� ������ �� #�������� �"���� ���� ����� ��

��������" � ������� � ���� ������� �� ��� ����� ���������� $�"�������� �"��� #��

�� %&' �()* ���� ��+����� ���������� ����� ��� ��� #������� �� ����" ���� �� ���

�"�� ����� �� ��������� �������� ��&�� , %&' �()* ���� ��+����� �������" � *

��������� �� #�������� ����� ����� ��� ����� �������� �� ������� ���� � �������� ��

���#�� �� �������������� ���� �� ������� ���� � ��������� ����� �������� �� ������� ���

������ �� ������ � ��� �������� ��� �������� �� � ���� �"�� �� ���������� �� ��

�������� ��� �� ��� ������ ���� �����"���������� ���-����� � �"������ � �� ��

������� ��� �� ��� ������ ���� �������� .���/������� ���� ���������0����-���� ��������

����� .' ������� �"��� �������� ��� ����� �������� ���������� ���� �������� � ������

�#���� ��� ��� ������ ���� ���������� ����� ��" ���� ����� ��������� 1� ��� #��� ��

������"��� � � ��"�������� ���������� �� �� ������� ��� ���� ����� ���� #� �������

��������� ������� ��� ����2 ��� �"�� ����� �� ����� �������� ���'3( $45����3�

55��6� �

��� ����� ��������� ������ � ��� ��� ������������ ������ ������� ��� ����������� �� ���� ������ �� ����� �� ������ ��� �������� ���������� ������� � ������� � ��� ����� ��������� ������ ����� ��������� � ������ ��� ������� ������ ����� ��� ��� ������ ��� �������� ��� �������� ������������� � �� � ���� � !����� ������� ����� �������� !�� ������� ��������� ������ ������������� ����� ���"�� �� ��� ������� ��� ����������� ������� � �� � ���� � ��� ��������� ������� ����������������� ��� ������ ������� ���� ��� ������������� #������ � ���� � ����� ��� � ��$���������� ������� ��� ��� ��� ���� �������� � ������������ � ����������� ������� ��� ����� ���������� ��� ������ ��� ���� ������� � ���������������� ������� ������� ������ ������ �������� ����� � ���������� � ��������� �������%������� � �� � ���& � ��������� �������� ��� ����������� � ����� �� �������� ������ �'��(� � �� �)**+ �

!��� ������ ���� ���� �������� � ���������,���������� �������������� ���� �������� ����������-������ � �� � ���./ !���� � �� � )**0/ 1������� � �� ����0 � ��� ���� ��������� ��� ������� ����������!������� ��������� ���� ���� �������� � ������������� ��� ������ ��� ��2��� ����� � ��������������� �3��� � �� � ���)/ 4 � �� � ���5/ -��� ���0 ��� ���� ���� ������ ���� ���� �������� ��� ������ ����� ������ �6������ � �� � )***/ 3��� � �� � ���5�� �����0/ �� � �� � ���& � ��������� ����� � )&- �%7� ������8����� �������� ��� �������� �� ���� ��2������ �3���� ���� �

#� ��� ������ � ����� � � ���� ������ ������ ��� ������ ��� �������� ������ � ��������� #� ������ ���� ����� ��������� ��� � ������ ������� � ��� ��������� � ��������� �������� �*&�*9 )&- �%7� ������8����� ������� �

� )5 ���� �� ��� "�� �2����� � :������ ���+ �� ������� 3����� � !��������� '������ -�� ��� ������������ �������� ������� �� ��� ���� 0 ������ "��� �������� ���� ������� � ���� � ����� ����������� �� ���������� ���� ��� �������� ��� � �������� "��� "��������� �� ��������� ����������� �������� ��� ��������� "��� ���� � ����� �2������� ��� � �������"��� ��������� � ��� ���� ��� 6�% ���������������� �������� 7������������ � ����� ��� ������� ����������� � �� � ���0 "�� �������� �� ��� � ���

*##��������7 +���)(#54 +' $�����(�������� �����(�����"���6���7(���� ��$�(��(����8� +'�

#8� 9���:6;+��6���< �������� �$��� ��� �8� �,' ��&� ���������� �� ��������� ������� ����� =033�0-# �� ;*0/0..0�

� ��""��$����> ������ �8�?�� �8� ������� "8>�������� ���� ����"���������� �� �8� ���� ��������� ������� ���$ �,' ��&� ���������� ��$"������ �� �������� ?��8 �8� ���� ����� �� �8�� "�"���

����� ���� � ����� � �� ���� ��� �� ��������� �� ������������ @-3�3A &�� �2�,��2-� 819 �3��3��6�B��3�3�-��0(3

�2�, 3�-��0 � -3�3 )*+' ������ �� �� � ���� ��

Page 70: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

������� � �� ��������� � ���� ����� ��� ������� ����� +.��*.��� "�� ������ ��� ������� ��)&- �%7� ���� ��8������ �4������ � �� � )**) �� �������������� � ��� ����� ����������

��������� ����������� "�� ��������� ������� ���� ������ � ��� ������ ��� ;������� -��������#�������� ������� ��� 7����� ������� �� ������;������� -��������� -���� +.��*.�� "�� ���������� �������� �� ��2���� ��������� ���� ��������� ���� ���� ��� ������� ��� �������� � �������,���

<������� =7� "�� �2������� ���� ��� !��7� 6��� ;�=7� ����� (� ### �%��� "�� ��� !��7� 6��� ;����������� �� �������� �� ��� ������������� 6�%��������� � ��� )&- �%7� ���� "�� �������� ������� �������� ����� ��� �=) ��� ��� �4������ �� �� �)**) � 6�% ������� "��� ������ ���� !���-����� 6�%�!����� ��� ��8������ ������� "��� ������ �� ����� =7� ��8������ (� �<�=�� �������� �����-�8������ �)�) %���� %����� (�/ 6> �������� ������� � ��� ������������?� ���������� -�8������������� "��� ������ ��� ������������ "�� ��������"�� ��� 5)5� ������ �����,�� ������� <������� ���� ������ ��8������ "��� ������� "�� ��8������������� � ���<��( �� ���� ��� ������ <;�-� ��������� 7�<# ������� ���� ��8������ "��� ������ ���� ���������8����� �������� ������ �;@-��;AB �)�� �6��������� ���������� "�� ������ ������� ������ "������������ �� ���� !>�� ����� .�� ������� � �� � ���+ �=������ ������� "��� ��������� ���"�� ��� ������ ��� �������� �� 1���� �)*�� ��� "��� ���� � ��������� ��������� ���� ��� ������� $��� ����� �-���C 7�� )*�+ � ��� ��2��� ������� ������� "�� ������� � ���� ���������� �������� <������ ��������������� ������ "��� ������ �� � �������� ���� ������ )��� ������� ��������� ����� "�� �������� ���������� ��� ������� � ��� ����� ������� 6���������������� ����������� ���� �� ����� � � ������ � ���

����� ��������� ��� ��������� � ��� ���� ����� "�� ������� "�� ��� �" ������/ � ��������� "�� ��� ���� ������ � �������� �'�� )/ ��� ��� -������������ '�� -)��������� � #:->! D���� � )&- �%7� ���� ��8������������� �9 "��� ��������� �� ���� ��� >,��2������� ����� � �� � ���+ / �������� ���"��� �����+.��*.�� ��� ��� ���� ������ � � ��������� � ��������� �������� � �������� � ������� � ������ ��� � ���������� "��� *&�*� *5�+� *5�&� *��&� *��&� *��& ��� *��59������������� ����� ������ "��� ���" *+9� "��� � ������������� ��� �� ����� �� �������� � ������� ����������� ���� ����� +.��*.�� ������ � � ���� �������

�������� ������ "�� ��������� �� ��� #= ���� ������������ (� ��!�E���2 � D2���� ������ "�� ������� ��������� ��� ����� � ������� ���� ���������� "��������� � �������������� ��!�E���2 � ��� ����� ����� �������� �6# FG!� �6# %��� #=5�� ��� �6# 0��3����� ������ "�� �6# 0��3<H> ����� ��!�E���2 "��� ���� � ���������,� ��� �������� �������� � �������� ������� � ��� ������������?� ����������

6������� ������������� "��� ������� "�� ���� � � ������� �#6 )�+&5*�� � ������ �#6 )�5�0*�� � ��������#6 )�0.)��� � �������� �#6 )�5)���� � ����� �#6)�5).+�� � ������ �#6 )�&0�+�� � �������� �#6 )�5)�&��� ������� �#6 )�5)�+�� � ������ �#6 )�5)5��� � ������� �-@% 6)�� ��� � ������� �#6 )�&&.+��"��� "��� ��� ��� ������ ������� ������ � ����� � )&-�%7� ���� ��8����� �������� ������������ ����� ������������ � ������ ) ��� �� ������� � ������������� ��"�� ���� ����� +.��*.�� "�� ������ ��� ������� ��������� ������� ������������� ���� ��������������� ���� ����� ��� � �������� "���I ������ �������/� ������������ � ������������ � ���������� � ����� ���� ��� ������ ���������� �������/ ��� ��� ���������� = ������� = ������� � ���������������� ���� ��� ��������� ����,���� �������� ������� ��� = �������D���� ������� ��� ���� � ��� ������ ���������

���� �� $�"�������� ���� �� �������������� ��

��� ����� ��������� ������� ���� %&'

�()* ���� ��+����� ���������� �%4&� ��

������� � )��#��� � �� �� �� �����������

�� %��� ��������� ��� ������� ��� ������"

������ ����������� ������� ��3�

����6� �*.�6��4% �� ��� � ��� ����

����� ���� ����� � !�� ���% ������� �

������ ��� ������� � ��������� *� �/��� �

���� ��������� �� �� �������� �� ���������

��+������ �� ��#� � '���������" :���

'% ���#� �� 9;'<. 1���� � *������=� ����

��� #������� ���� �� ���� ��� ��������

�� �� ����� ��� �����#����>������ � �/�

������������" ����� ��

��������� ������� �"� ��

8��"C66�B����$B���������� �2�=

Page 71: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

!���2 ������� ����� �������H�,��� ��� � �����!- �!�;=# �D' !- ����� ������� "�� ������ ������ ��" ������� � ��� ��������� � ������� ������ �������� ����� ������ ������� � ����� �������� #� ���� �� ���� �� ����� ������� � ��� 8�������������� ��������� "��� ������� �!������� � �� � ����/-�#J��� � �� � ���� � <������ "��� ��"� � -�������� ���������������� "�� 15 ��!�E���2 �� �. � ��� "������"�� � �������� ������� -���� �������� ������� "��������� � ���� ��� � � ������ ����� ������ ����������� �� ������ )�0 �� ����2 ����� ���������� ������ � ��������2�������� ��� � 0�9 �8������������� ������� ��09 ����������� ��� ��� ���"�� ������� !�;=# �D' !- "�� �������� ���� ���������2 ## ���� ����������� �<��(�� =������ � ���

������� "��� ������� � ������ ����� � ���� ������������� ������ "�� �� (K� -������ "��� �������� �� ���� � &+0 ���� ����� � ���� ��� ��������� "���������� )0 ���� �� ����� +.��*.�� ��� ��� ������ ����������� 6�� �������� ��� ��������� ����� "��� ��� ����� ���� ��� ������������?� ����������� ��������������� "��� ������� -���� ������ �� ��� ������� ������ +.��*.�� "��� �������� ����� ��� "�� �����+.��*.��� ���� ������� ���� � ����������� � ����������� ��� � ��2��� ���� "�� ������ ���� ���������� ������� ������� ��������� ����� �'�� � �-���� +.��*.�� ��������� "�� ��� ���� ����� � � ������

-������ ����� � ����� ��� ���� ��!�E���2 "����������� "���� ���� �������� � ��� ���� ��� �� ���

��� �� *�� ��� ������ ���� ������ ��#������ #" ������ �� ��� ��������� ������� ����� �� ���� ��� "

-�����I )� � ������� +.��*.��/ �� � ������� ��@� 050���/ 5� � ������� �#6 )�+&5*�/ .� � ������ �#6 )�5�0*�/ 0� � ������� �#6

)�0.)��/ &� � �������� �#6 )�5)���/ +� � ����� �#6 )�5).+�/ �� � ������ �#6 )�&0�+�/ *� � �������� �#6 )�5)�&�/ )�� � ������ �#6

)�5)5��/ ))� � ������� �#6 )�&&.+�/ )�� � ������� �#6 )�5)�+�� �� 6����/ �� �������/ 4� "��(�� �����/ K� �������� ��� ������� "��

��������� ����� �. ��� .� �I "���� �� ������ � ����� ��� "�� ��(�� �� �. � ��� ������� ��� ���� �� .� �/ ��� "���� �" ������� ��� ����� ���

���� "�� ��(�� �� �. � ��� ��� ����� "�� ��(�� �� .� � ���� �. �H.� � �

��������� � � � � � � �

������� 4 H� � � � � � �H� � � 4 H� � �

; ������� � � � � � � � � � � � �

= %��� 4 H� �H 4 � � � � � � 4 H� � � �

= B���� � �H� � � � � � � � � � �

= ����� � � � � � � � � � � � �

= �������� � � � � � � � � � � � �H 4

= ������ � � � � �H� � � � � � � �

= '������ � � � � � � � � � � � �H 4

= !����� 4 H� �H 4 � � � �H� � � � � � �H 4

#���� � � � �H� � �H� � � � � � �

= !����� � � � �H� � � � � 4 H� � � �

!����� � = ������������ � � � � � � � �H� � � � �H�

� ��������������� � � � � � � �H� � � � � �

�������� � � � � � � � � � � � �

������ K � � � � �H� � � � � � �

������� � � � � � � � � � � � �

-���� � � � � 4 � � � � � � �

������� � � � � �H� � � � � �H 4 � �H�

!����� � � � � �H� � � � � � � �

= ;����� � � � � � � � � � � � �

!����� � � � � �H� � � � � � � �H 4

-����� � � � � � � � � � � � �

�������� � � � � � � � � �H� � � �H 4

!���,��� � �H� � � � � � � � � � �H 4

%������ � � � � �H 4 � � � � � � 4 H�

-����� � � � � � � � � � � � �

������� 4 H� � � � � � � � � � � �

������� � � � �H� � � � � � � � �

������� � �H� � � �H 4 � � � 4 H� � � �

= ;�2�� � �H� � �H� � � � � � � � �

; '���� � � � � � � � � � � � �

= ������ �H 4 � � � � � � � � � � �

6������ 0 (���������� � � � � �H 4 � � � � � � �

�� ������ �� ������ �� �� ����

�2�/ ����� ���� � ����� � �� ���� ��� �� ��������� �� ������������ &�

Page 72: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

����� .� � ������� �������� ��"�� ��� �������������� "��� ������ �� 5+ �� � 09 ����� ��� �������"�� "�� ������ � ��� �������� � ��� � 09 �D�� �������� ������� ��� ���������� ����������� "���"��� ������� ���� �>7��� ����� ��� �>7��� ��������!�E���2 � ������������ ��� ����� � ��� ����� � ��"�� �������� ������������ ��0� 5�� 5+� .. ��� 0� �� "������������/ ��"�� ������� ���"��� �0 ��� 5+ ��� ���

����� "�� ������� ��� ��� ���" ����� ���������������� ��� � 09 �D�� ��"�� � ��� �������� � ��"�� "��( ����� .� � �������� ��� ����� "�� � �������� ����� .� � �������� ��� �,� ��� ���������� ���� � ����� "��� ��������� �� ��������� ��������������� ����� "��� ��"� � ��������� �� ���� ��.� �� � �������� �������� "�� ��� �2�� � 09 ��H� �������������� � �������� ������ ���� �� �� ����� ) �

��� �� 8�������� ����� �*$9 ?@. ������� *$9 (�� 98 4�* ������ � ������ ��� ������ �� ������ �� ��� ��������� ������������ �� ���� ��� "

-�����I )� � ������� +.��*.��/ �� � ������� ��@� 050���/ 5� � ������� �#6 )�+&5*�/ .� � ������ �#6 )�5�0*�/ 0� � ������� �#6

)�0.)��/ &� � �������� �#6 )�5)���/ +� � ����� �#6 )�5).+�/ �� � ������ �#6 )�&0�+�/ *� � �������� �#6 )�5)�&�/ )�� � ������ �#6

)�5)5��/ ))� � ������� �#6 )�&&.+�/ )�� � ������� �#6 )�5)�+�� �� 6����/ �� �������/ 4� "��(�� �����/ K� �������� �6# FG! ��� %���

#= 5�� ����� "��� ��� ������ �� �� . ��

������������������� � � � � � � �

��� ����

��(���� ���������� � � � � � � � � � � � �

>������� ��. � � � 4 � � � � � � � 4

>������� ����� ��� � � � � � � � � � � � �

;����� ���������� � � � � � � � � � � � �

K���� ���������� � � � � � � � � � � � �

� ����������� � � �L �L �L � �L �L �L �L � �L

� ����������� � � � � � � � � � � �L �

� ��������� � � � � � �L �L � � � � �

� ��������� �L � � � � � � � � � � �L

� ������ � ������������ � � � � � � � �L � � � �

� !�������� � � � � � � � � � � � �

�� �! �" ���

������ ��������� � � � � � � � � � � � �

� ���������� � � � � � � � � � � � �

� ����������� � � � � � � � � � � � �

!����� ���������� K 4 � � � � � � � � � �

%������ ���������� K � � � � � � � � � � �

7����� ������� � � � � � � � � � � � �

������ ���������� � � � � � � � � � 4 4 �

6���� ���������� � � � � � � � � � � � �

;����� ������ ���������� � � � � � � � � � � � �

6����������� ���������� � � � � � � � � � � � �

6��������� ��� ���������� � � � � � � � � � � � �

������ ���������� � 4 � � � � � � � � � �

������ ���������� � � � � � � � � 4 � 4 4

������ ���������� � � � � � � � � � � � �

3������ ���������� � � � � � � � � � 4 � �

-���� ���������� � � � � � � � � � � � 4

��#$� ����� �$%!���$%� &$� '�$(���

����� 4 � � � � � � � � � � �

09 �D� � � � � 4 � � � � � � �

!��������� � � 4 4 4 � � � � � � �

������� � � � � � � � � � � � �

)�$(�� ���

�0 �� � � � 4 � � � 4 4 � � �

5� �� � 4 � 4 � � � � � � � �

5+ �� � � � � � � � � � � � �

.. �� � � � � � � � � � � � 4

L%������ "��� ������� "�� �6# FG! ������ ��� ����� "�� %��� #= 5�� ������

��������� ������� �"� ��

8��"C66�B����$B���������� �2��

Page 73: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�� �� ������������ "����� � ��� ���� ������ ��������� "�� )9 �"H� ������������ ���� -������ "����2����� � � !����� �&�= �6���� ������� ��� ���� �� �� ������� ������ � &� (K� %������ ��� ���� ���� ������ ���������

<���� � ������� �������� ����� ��� ���� ���������������� ��� ��� � ������ � ��������� ��� ���������� "�� ����� +.��*.�� �� ��� ���� ������

� �������� �� ��������� ������� �� ����

��������� ������� ������������ ;� ����� ��$� �������� �������� � �� ����� ����� ����� 3J���� �� ������� ��� ������ � !��������� '������ ��� "���� ������� ����� "�� ������ �

����� ��� �������� ���� ������ ������� ���� �������� ������� ��� 2���� �������� D����� ��"�� ����� ��5+ ��� ����� .� � ��"�� � ��� ����� ����� ������������ ��� �� ���� ��� �� �,�� �������� �� ��������������� � )��M5�� �� � ������ ��� ��5M��0 �� ��������� @��� �6# FG!� ������ ���������� ������ ���������� ��� ����� ����������� � ������������ � ����� ����� ��(���� ����������� �������� ��. � �������� ����� ��� ������ ��). � ������ ����������� ������� � �������������� ����������� ������� �- <# �������������� � ������������ � ������������ � ���������� � ������ � ������������� � ��������� ��� � �������� ���������� �� ��������� @��� �6# 0��3 ����� ����� �� ���������� � �. �� ��� � ������� ��� = ��������� = ������� = �������� ����� = ������� � ���������������� �������

����� ������� ������ ������� = ������� ������� ���������������� ����,��� ��� �������� ����� �� ������� ���� �. �� ��� � ������� "��(�� ��� �������� = �����= ������ ��� �������� ����� �� ������� ��� � .� ����� � ������� ��� �������� = ����� = ������ ���������� ��� ��� � ������� "��(�� ��� = ������� ���� �� ������� ��� ��������� = �������� ; ��������= 2����� ; 2����� ������ � = 2����������� ; ������ ; �������� ������� = ������ ������ � = ������������������� � = ������������� ��������� �������� ������������ 2����� �������� �������� = ��2��� = ��������= ������ ; ������ ; ������� ������� ��������� �� ����� � (���������� � ������� 0 (����������� ������. � �������� ��� ������� � ������� ��� ������������ .� � �������� ��� ������� � ������� ���= ����� ��� ������� @��� �6# %��� #=5��I ������� � ���������� ����� ����������� ������������ ����� ������ ������ ���������� ��� ������ ����������/������� �� � ���������� ������ ���������� ���������� ����������/ ��� ������� �� ������� ���������������� � ������������ � ����������� & ���������� ������������ � ����������� � ������������ � ������ � ������������� ������� ��� ������2������ � ���� ����� ������ �������� ���� �������� ��(���� ��� �������� ������ ����������� ������ ������ ��������������������� ��� ����������� ������ ����������� ����������������� ������ ����������� �������� ������� ������������� ��� ����� �����������

��� ���� ����� � +.��*.�� ���-@% 650����@� 00*��� �

������ ��� � ����� ������ ��� �������� �������

���� �� 8�� ����� ������� #" !91�@$<( ������� �������� �2 !��=�� 8������ ������� ��� �������" �� .*A89��1: ���

������ �� ����� �������� � �������������� �� ��� ����� ����������

�� ������ �� ������ �� �� ����

�2-3 ����� ���� � ����� � �� ���� ��� �� ��������� �� ������������ &�

Page 74: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

�����������

4� ��� �������� � <������ �������� ��� 7���� �������� ������ �������� ��������� � ������� ��������

�����

�������� �� ��� ���� �� ������� � � � � ������ � ������

���������I � ����� ���������� ���� ������ � ������� �������� ��� ��� � ����" � ��� ���������� ��� � ����� �� � 50�M5&��

��� �� ���� � � ��� � ! ����"� ��������� ���������� ��� ���������� ��� ������ ������ ��� � ��� ���� �������� �� ��.5M��.��

�#��� $� ���� $%&� $�� � '� (�)� �� (�)� �� (�)� ( � ��)� ' *

����+� >,��2�I � "�� ����� �� �� ��� ��������� ���(������ ����� � )&- ������ %7� ���� ��8������� ��� � ������� �������� �� ��0*M��&)�

���,�� �� ��� � �������-� �� ��� �� �� $ .� /// � � �� �� ( .

�011+� ������ ������� � �������� �������� !��� ��������"� �� )�0M)0*�

��� ���� �� ������� � �� ��� ���� $ '� � ����� �� � � ������� �

����2� @�� � ����� ��� ���� ������� ����� �� ����� � ���������� ������ ��������I )5 ����� � �2�������� � !��� �������� ���.**5M0����

&���� 3 ������ ��������� M �������� ������� � ��������,��� ��� ������� ������ �� )M+�

&���� 3� 4��5��� � �� ���556� � � � ��� ���� / ����0�

#��������� � ������ ������ � ��������� ������ �� �������)&- ������ =7� �������� �������� � !��� �������� ��� 5000M50&��

&���� 3� ������6� � �� &��6��� � �� /� ���6� .� ���6��� . �

��� ���� / ����7�� ��������� ������� ��� ���� ��� � ����������� �������� ��� � ��� ���� �������� �� )0)0M)0)��

&���� 3� ������6� � �� ��86��� � �� ���6��� . � ��� ���� /

����75� ��������� ������� ��� ���� ������ ��� � ����� ������� � ��� ���� �������� �� )..0M)..��

&���� 3� ������6� � �� ��86��� � �� ���6��� . � ��� ���� /

����2� ��������� ������ ��� ���� ��� � ����� ������ ����������� � ��� ���� �������� � .�+M.5)�

(� ������ � �� �� �6��� �� �� ,����� 9� &���� 3 � (�: ��: ���� .

����2� >�,�����H�������� ������� � ��������� "�� �� ������ ���� (�� "�� �� ������� � ��"�� �������� ������������� � **M)���

(�)� �� � �01��� � ����� ����� �� �������� ��������� ������ ���� ���������� ������ ��������� ������ � ����������8������� � �� ���� �� )))M)���

����)���� �� ������ $� ���� � 4� (��,������ ;� ��))�� � � /�

/8��� �� ����� $� &���� �� *��6��� � � ��#� ���#� 6 ������

>������� � ����2 ������� ����� ������� �,��� ��� � ����� ���� ����������� � ������� � )&- �%7� ���� ��8�������� ������ ��������� � ����������� �������� � !��� ����������� )*.&M)*0.�

����� � � &� *� 6� � � � ����� � $ � �0112� >������� � �6# �� #=>7� ��� %��#= �7� ## ������� �� ��������� � ��������������� ��� ������ ��������� � !��� �������� ��� 5�*M55��

��6����� �� ��6�� � �� ���6��� .� � 6� �:)� (� � �,�� � �

������6� � � �0111� ��������� ������� ��� ���� ������ �������� ��� ����� ������ ��������� ��� � ��� #������� ��� )�+5M)�++�

���#6�#���� � 9�<��6� 3 � � 5���� � ����"� <�� ������������ ���������� ��� ����� $����� �� �.M�+�

������� 9 � 9��� � �01�+� ��� ������� $��� �����I � ��"����� �� ������������ ���������� ������ �� #��� ���� �� .�&M.�0�

�������� � �� �� ,����� 9� &���� 3� �� �6��� �� $��6�)��6%��)� � &

� (�: ��: ���� . ����=� >������� � ��� �������� ���� ������� ����������� � ��������� ��� ��� ������ ������� ������� � !��� �������� �� .)�M.���

��� � ' ����2� 6�% ����� �������� �� ������� �������������� � +*M*)�

��/>� �� � �� �����??� � �� $���6�#� &� ��#��)���� � � .6�# ��#� (

������ %��� ��������� � ��� ������� ������� ��������� ������������ ���� �� !�;=# �D' !-� %��� �������� ������� ��5+�M5+&�

4�)� �� (� �����@� $� 9��� � � (�)� � � ����+� !>��.I !�������>�������� ������� ������� �!>�� ���"��� ����� .��� �� #������� �� )0*&M)0**�

*��65� � * �� � �6� � �� �������� � � � � ����� � $ �0110� )&-������ =7� ��������� �� ���������� ������ � #������� ���&*+M+�5�

*��� � �� 9 � ( & �� ���� � ( �� '�<� ( 4� ��� � � � '� ���� �

( *� 4�)� � � *� A��� 4 � � '���� ( ' ����7� @��������� � ���!��-�8 0�� )&- ������ =7� ����� �������� ��������������� �� ��������� � �������� �������� �������� ������ "��������� �������� ������� � !��� �������� �� )**&M���)�

��������� ������� �"� ��

8��"C66�B����$B���������� �2-�

Page 75: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

75

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

Conclusions générales

Au total, l’utilisation de la PCR dite « universelle » par amplification du

16S rRNA gene a révolutionné l’identification et la détection bactérienne dans

les laboratoires de bactériologie. Comme nous l’avons illustré dans ce travail,

cette découverte scientifique a permis la description de maladies infectieuses

« émergentes » (articles 1, 2, 3), mais aussi l’expansion de la connaissance du

monde bactérien par la description de nouvelles espèces et de nouveaux genres

(article 4, 5, 6). Enfin la détection bactérienne moléculaire pourrait apporter une

amélioration de la prise en charge des patients, car elle peut permettre de poser

des diagnostics microbiologiques là où les techniques conventionnelles auraient

apporté un diagnostic plus lent voire n’auraient pu apporter le diagnostic (article

1). Cependant il faut préciser quelles sont les limites et les écueils de la PCR

« universelle » basée sur l’amplification et le séquençage de l’ARNr 16S.

Page 76: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

76

1. Limites générales de la PCR universelle 16S

L’outil moléculaire 16S a certaines limites. Celles-ci sont tout d’abord

d’ordre général : le coût reste élevé, bien qu’il ait pu être réduit depuis la

description de la technique (Kiratisin et al. 2003). Certains auteurs proposent

également de ne séquencer que partiellement le gène 16S (environ 500

nucléotides soit le tiers du gène dans sa partie 5’) afin de limiter le coût tout en

conservant une bonne valeur taxonomique (Clarridge, III, 2004; Schlaberg et al.

2012). L’apport de cette stratégie associée à l’utilisation d’un système

commercialisé (MicroSeq 500) a été rapporté dans la littérature ; la principale

limitation du « MicroSeq 500 16S ribosomal DNA-based bacterial identification

system » résiderait dans la qualité de la base de donnée qui lui est associée, base

qui serait constituée d’un nombre insuffisant de séquences (Woo et al. 2003).

Par ailleurs, la PCR 16S nécessite des techniciens formés à la biologie

moléculaire, mais également des microbiologistes formés à l’utilisation des

outils bioinformatiques de base ainsi qu’à l’interprétation des résultats

moléculaires (cf ci-dessous) (Altschul et al. 1990; Sontakke et al. 2009).

Enfin bien que des systèmes commerciaux tels que MicroSeq aient été

développés (Woo et al. 2003), l’absence d’évolution vers une automatisation de

Page 77: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

77

la technique est un facteur limitant pour sa généralisation. Toutefois avec le

développement des techniques de séquençage à haut débit, les étapes de la PCR

universelle 16S pourraient être incorporées dans un système robotisé (Woo et al.

2008).

2. Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil d’identification

bactérienne

La PCR 16S reste peu performante comme outil d’identification pour

certains genres au sein desquels les variations de séquences sont trop minimes

entre espèces pour permettre de les distinguer. C’est le cas par exemple pour :

Mycobacterium spp., les streptocoques (Streptococcus mitis, S. oralis et S.

pneumoniae), les entérobactéries (Escherichia coli et Shigella) ou encore

Bacillus spp. (Bacillus cereus et B. anthracis) (Janda and Abbott, 2007; Mignard

and Flandrois, 2006; Petti, 2007). Dans ces cas où les séquences de 16S varient

peu entre espèces, on ne peut distinguer les espèces proches. D’autres gènes ont

alors été proposés pour distinguer ces espèces ; par exemple le gène rpoB qui

code pour la sous-unité béta de l’ARN polymérase, est présent en une seule

copie dans les génomes bactériens et a démontré son utilité chez les

mycobactéries (Adekambi et al. 2009; Petti, 2007).

Page 78: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

78

Certains organismes ont plusieurs copies du 16S rRNA gene, qui peuvent

présenter des variations entre elles, ce qui a pour conséquence de générer des

séquences contenant des ambigüités (Petti, 2007). De plus un certain degré de

« microhétérogénéité » au sein des espèces a été rapporté, ce qui correspond à

des variations inférieures à 0,5% intra-espèces et aux différents génotypes des

sous-espèces (Clarridge, III, 2004). L’impact en routine hospitalière de ces

petites variations semblerait être minime (Mignard and Flandrois, 2006). Bien

sûr, si la souche soumise à identification 16S n’est pas pure, on obtient une

séquence avec des ambigüités. Si une séquence présente plus de 1% de positions

ambigües, le résultat peut être erroné (Mignard and Flandrois, 2006).

Par ailleurs, les bases de données auxquelles on compare la séquence de la

souche à identifier ont chacune leurs qualités et leurs défauts (Janda and Abbott,

2007; Kiratisin et al. 2003) et peuvent être « polluées » par des séquences peu

ou mal identifiées ce qui peut entraîner des erreurs d’interprétation (Mignard

and Flandrois, 2006; Woo et al. 2008). Par exemple, la qualité des séquences

déposées dans Genbank, base de données publique qui réunit un très grand

nombre de séquences, n’est pas contrôlée

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (cf Annexe 2 page 90). Beaucoup de

séquences proviennent de microorganismes nouveaux et inhabituels, isolés de

l’environnement ; on y retrouve aussi beaucoup de séquences provenant de

microorganismes n’ayant jamais été cultivés. A l’inverse, le nombre limité de

Page 79: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

79

séquences déposées dans certaines bases de données (telle que MicroSeq) peut

être un facteur limitant (Boudewijns et al. 2006). Enfin, l’évolution de la

taxonomie peut être source de discordances. Par exemple, certaines espèces ont

été définies avant l’ère du 16S et on peut trouver plus d’un genomovar au sein

d’une espèce (c’est le cas pour Acinetobacter spp., Enterobacter cloacae,

Pseudomonas stutzeri). Dans ces cas, les souches de référence ne reflètent pas

nécessairement la composition génomique de tous les membres de l’espèce

(Janda and Abbott, 2007). C’est pourquoi il faut toujours vérifier comment ont

été validées les séquences des espèces auxquelles correspond la séquence

étudiée. Il faut en particulier se méfier des séquences obtenues par des études

métagénomiques sans références taxonomiques (Schlaberg et al. 2012).

Les algorithmes bioinformatiques de calcul utilisés pour la comparaison

des séquences doivent être utilisés avec précaution et il convient de maitriser les

paramètres de l’outil utilisé pour ne pas générer des résultats erronés (cf Annexe

2 page 90). Par exemple, l’algorithme proposé pour utiliser la base de données

Genbank, appelé BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), fonctionne par

défaut sur des paramètres qui ne sont pas adaptés à toutes les applications

(Altschul et al. 1990). Une fois les résultats du calcul d’alignement obtenus, il

faut vérifier si la longueur de l’alignement est suffisante pour que le résultat soit

interprétable.

Page 80: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

80

Enfin, le problème majeur est que le seuil à partir duquel un pourcentage

de similarité permettrait d’assimiler la séquence étudiée à une espèce, voire à un

genre, n’est pas clairement établi. Plusieurs seuils ont été proposés. La plupart

des taxonomistes acceptent des seuils de 97% pour le genre et de 99% pour

l’espèce (Janda and Abbott, 2002; Petti, 2007). Cependant certains auteurs

suggèrent d’utiliser un seuil de 99,5% pour l’espèce (Woo et al. 2008). Il

apparaît impossible de déterminer un seuil unique pour l’ensemble du monde

bactérien (Schlaberg et al. 2012). Récemment des recommandations pour

l’interprétation ont été proposées par le CLSI (Clinical and Laboratory Standard

Institute), mais leur tarif prohibitif en limite la diffusion aux laboratoires de

routine (Petti et al. 2008).

Il faut noter que les pourcentages de similarité obtenus varient selon qu’on

utilise un « 16S court » ou un « 16S long », mais également selon le programme

utilisé et selon les paramètres utilisés pour un même programme (Clarridge, III,

2004). Il faut de plus garder à l’esprit que l’interprétation finale d’un résultat

d’identification bactérienne basé sur l’ARNr 16S, doit aussi, avec bon sens, tenir

compte des caractères phénotypiques (Woo et al. 2008).

Depuis quelques années un nouvel outil d’identification bactérienne à visé

« universelle » est mis à la disposition des microbiologistes (Mellmann et al.

2008). Il s’agit de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Page 81: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

81

(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight), qui a montré sa

capacité à identifier rapidement, à faible coût et de manière universelle les

souches cultivées dans un laboratoire de bactériologie (Bizzini and Greub, 2010;

Seng et al. 2009). La spectrométrie de masse permet de réduire le recours à la

biologie moléculaire. Cependant la biologie moléculaire reste le gold standard

pour l’identification bactérienne (Cherkaoui et al. 2010), ce qui a bien été

montré par un travail récent qui trouve que seulement 45,9% des souches

identifiées par PCR 16S auraient pu l’être par spectrométrie de masse MALDI-

TOF (Bizzini et al. 2011).

3. Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil de définition de

nouvelles espèces bactériennes. Débats autour de la définition de

nouvelles espèces.

Depuis les recommandations émises en 2002 par le comité Stackebrandt

pour la description de nouvelles espèces (Stackebrandt et al. 2002), il n’y a plus

eu de recommandations pour la définition taxonomique des nouvelles espèces.

Après avoir corrélé chez de nouvelles espèces décrites les pourcentages

d’hybridation ADN-ADN aux pourcentages de similarité, d’autres auteurs ont

proposé qu’une souche présentant un seuil de similarité inférieur à 99% avec

l’espèce la plus proche (et non plus 97%) soit une souche candidate pour une

Page 82: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

82

nouvelle espèce (Stackebrandt and Ebers, 2006), mais il n’y a pas de consensus

sur ce point. Si le 16S reste un outil de découverte majeur de nouvelles espèces,

sa place dans la description de ces nouveaux taxons est débattue. En effet les

auteurs s’accordent sur la nécessité d’inclure une séquence de 16S d’au moins

1500 nucléotides dans la description d’une nouvelle espèce (Stackebrandt et al.

2002), mais certains pensent que la description des nouvelles espèces et la

taxonomie bactérienne doivent se baser sur une séquence génomique complète

(Coenye et al. 2005).

Le nombre minimum de souches à étudier pour décrire une nouvelle

espèce reste débattu. Si certains proposent qu’un minimum de cinq souches

distinctes soient étudiées pour décrire une nouvelle espèce (Janda and Abbott,

2002), d’autres auteurs émettent des réserves sur cette règle. En effet, pour des

espèces émergentes encore très rares, il faudrait des années pour isoler cinq

souches distinctes, ce qui retarderait d’autant la description de ces nouvelles

espèces (Drancourt et al. 2004; Drancourt and Raoult, 2005).

Page 83: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

83

4. Limites de la PCR universelle 16S comme outil de détection

moléculaire à partir des prélèvements biologiques

L’utilisation de la PCR universelle 16S comme outil de détection

moléculaire présente également certaines limites, essentiellement liées au fait

que l’on ne peut l’utiliser que pour les prélèvements provenant de sites

normalement stériles et sièges d’infections monomicrobiennes (Petti, 2007).

Bien que les techniques de clonage et de pyroséquençage permettent d’utiliser

théoriquement la PCR 16S pour les prélèvements polymicrobiens (Al Masalma

et al. 2009; Armougom et al. 2009), une telle application n’a pas sa place en

pratique quotidienne au laboratoire.

Les contaminations lors des amplifications géniques sont fréquentes et

rendent l’interprétation des résultats délicate. Le problème des faux positifs peut

être limité par l’utilisation de réactifs « DNA free », de pipettes dédiées,

d’embouts de pipettes cotonnés, de trois pièces séparées dédiées à chaque étape

(préparation des mix réactionnels, extraction de l’ADN, amplification) et par

l’expertise d’un microbiologiste expérimenté. L’utilisation d’un témoin négatif

pour chaque étape du protocole est un élément indispensable pour dépister ces

faux positifs (Sontakke et al. 2009)

Page 84: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

84

La sensibilité de la PCR universelle 16S peut être insuffisante. Une équipe

a proposé pour améliorer la sensibilité de réaliser un « 16S court » en première

intention puis un « 16S long » en seconde intention dans les situations où il est

nécessaire d’obtenir une identification bactérienne plus discriminante (Jenkins et

al. 2012). Ce manque sensibilité du « 16S long » avait été observé au

laboratoire du CHU la Timone et a amené après 2005 (donc a posteriori de

l’article 1) au choix d’un nouveau système d’amorces amplifiant les 2/3 du 16S

dans sa partie 3’ (cf Figure 3 page 14 et Tableau 1 page 18). Des tests de

sensibilité entre différents jeux avaient retrouvé une meilleure sensibilité pour le

couple 536F/rP2 (Dr V. Roux, personal data). On mentionnait en introduction à

ce travail l’absence de liste exhaustive d’amorces existant pour la PCR 16S.

Parallèlement à cela, il existe peu de travaux évaluant la sensibilité et le

caractère « universel » de ces amorces. Cela concerne peu l’identification

bactérienne, mais le problème reste entier pour la détection bactérienne à partir

de prélèvements cliniques. De plus, les bases de données de séquences (telle que

ribosomal database project : http://rdp.cme.msu.edu/) sont régulièrement

incrémentées, et on constate que la diversité des séquences amplifiées par un jeu

d’amorces donné doit être réévaluée avec le temps (Baker et al. 2003; Frank et

al. 2008). Le choix des amorces est donc un élément essentiel à la qualité du

travail de détection bactérienne et des revues de référence font défaut sur ce

sujet.

Page 85: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

85

La sensibilité de l’amplification du 16S, comme pour celle de toute PCR

standard, est inférieure à celle de techniques récemment développées, telles que

la PCR en temps réel, la PCR-hybridation ou la loop-mediated isothermal

amplification (Mori and Notomi, 2009; Weile and Knabbe, 2009). Ces

techniques permettent de coupler détection bactérienne et identification, avec

une sensibilité améliorée, un risque de contamination diminué, un coût et une

rapidité ayant permis leur développement dans des structures diagnostiques de

type « point-of-care », dont l’objectif est de permettre la prise de décisions (une

hospitalisation, mise en isolement, traitement anti-infectieux) dans le temps de la

prise en charge initiale (Cohen-Bacrie et al. 2011). Cependant ces nouvelles

techniques reposent sur la désignation « à l’avance » des microorganismes

recherchés.

La détection moléculaire dans les cas atypiques et sans orientation

microbiologique préalable reste donc aujourd’hui l’apanage de la PCR

universelle 16S. Ainsi la PCR 16S a permis d’associer Bartonella henselae ou

Tropheryma whipplei à l’angiomatose bacillaire et la maladie de Whipple,

respectivement (Petti, 2007). L’association entre la détection d’une séquence

bactérienne et une maladie infectieuse était dans ce cas orientée par des données

histopathologiques. Quand ce n’est pas le cas, le lien de cause à effet entre la

détection d’un ADN bactérien dans un prélèvement humain et une maladie

Page 86: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

86

infectieuse peut être plus difficile à établir (Petti, 2007). Il a été montré pour les

endocardites infectieuses que l’ADN bactérien pouvait persister de manière

prolongée après traitement antibiotique, notamment pour Bartonella spp. et

Streptococcus spp. ce qui rend délicate l’interprétation des résultats moléculaires

(Rovery et al. 2005). A l’extrême, l’utilisation de la PCR en paléomicrobiologie

est la démonstration ultime de la persistance de l’ADN bactérien dans

l’organisme humain (Tran-Hung et al. 2007). Les faibles quantités de

prélèvements testés en biologie moléculaire, les inhibiteurs de PCR et

l’interférence entre l’ADN bactérien et l’ADN humain sont des éléments

limitant l’intérêt de la PCR universelle dans cette application (Petti, 2007).

La PCR 16S ne constitue plus aujourd’hui un outil diagnostique isolé,

mais rentre dans le cadre d’une stratégie diagnostique moléculaire plus globale.

Devant un cadre nosologique précis tel qu’une endocardite à hémocultures

négatives, une stratégie combinant des approches sérologiques, histologiques et

moléculaires a démontré son efficacité (Fournier et al. 2010). Dans ce cas, la

PCR 16S est réalisée parallèlement à diverses PCR en temps réel ciblées et à une

autre PCR standard ciblant les champignons. Il a été montré dans ce contexte

que la PCR 16S sur sang total manquait de sensibilité et que les PCR temps-réel

ciblées sur sang total sont d’un plus grand intérêt car plus sensibles ; a contrario

la PCR 16S sur valve cardiaque a une meilleure sensibilité et reste le test à

réaliser en première intention sur ce type d’échantillons (Fournier et al. 2010).

Page 87: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

87

5. Conclusion

Au total, nous avons montré au cours des travaux réunis dans ce document

que la PCR universelle 16S était applicable dans un laboratoire hospitalier de

bactériologie pour identifier des souches mal identifiées par techniques

conventionnelles, pour détecter l’ADN bactérien à partir de prélèvements

biologiques négatifs en culture, mais aussi pour mettre en évidence de nouvelles

espèces et de nouveaux genres bactériens à partir de souches cliniques. Bien que

la PCR 16S ait des limitations qui doivent faire réserver son usage à des

situations bien déterminées et doivent souvent être associées à d’autres

techniques moléculaires, elle est à l’heure actuelle une technique incontournable

pour le diagnostic bactériologique médical.

Page 88: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

88

Annexe 1 : Wohlfahrtiimonas chitiniclastica, une bactérie isolée du stade

larvaire 3 deWohlfahrtia magnifica.

(a) Wohlfahrtia magnifica est une mouche présente en Europe, en Asie et en

Afrique du Nord et qui est à l'origine de myiases décrites chez de nombreuses

espèces animales (bovins, camélidés, caprins, carnivores, équidés, oies, ovins,

porcins...) et plus rarement chez l'homme.

Le mot myase désigne l’ensemble des troubles provoqués par la présence dans

un corps humain ou animal de larves de diptères parasites des familles

Calliphoridae, Sarcophagidae, Cuterebridae,Muscidae.

Source : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ww/wohlfahrtiimonas.html

Page 89: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

89

(b) Myases humaines.

Sources : Wikipédia, the diptera site

Page 90: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

90

Annexe 2 : utiliser l’outil BLAST pour trouver des similarités de séquences

sur la base de données Genbank.

(a) page d’accueil BLASTn

1- savoir entrer une séquence appropriée etcorrigée

2- savoir choisir la bonne base de données

3- savoir choisir le bon programme

4- savoir modifier les paramètres par défauten fonction de la requête

Page 91: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

91

(b) résultats bruts ou « hit list » : chaque ligne contient

- le numéro d’accession de la séquence et son nom,

- la description associée à l’annotation de la séquence,

- le score qui est une mesure de la signification statistique de l’alignement ; plus

il est élevé, plus les séquences sont similaires,

- le pourcentage de couverture entre les deux séquences,

- la « E-value » ou « expectation value » qui donne la meilleure mesure de la

signification statistique de l’alignement, en estimant le nombre de fois où on

aurait pu obtenir un si bon alignement par le seul fruit du hasard ; plus cette

valeur est basse, plus les séquences sont similaires,

- le pourcentage de similarité arrondi à l’unité,

- et les liens vers d’éventuels génomes.

Page 92: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

92

(c) résultats détaillés, ie alignements, séquence par séquence ; ils sont rendus par

le serveur sous la « hit-list »

Plusieurs informations sont fournies :

- le numéro d’accession, le nom et la longueur de la séquence « subject » ; on

peut en avoir plusieurs si plusieurs séquences ont été alignées de manière

identique à notre séquence « query » (cf exemple ci-dessous),

- le score mentionné plus haut,

- la « E-value » ou Expect pour Expectation value,

- le nombre de nucléotides identiques et le nombre d’indels,

- puis l’alignement tel quel avec l’orientation des brins des séquences

« query » et « subject ».

Séquences « subject »

Page 93: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

93

BIBLIOGRAPHIE

Adekambi, T., Drancourt, M. & Raoult, D. (2009). The rpoB gene as a tool

for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17, 37-45.

Al Masalma, M., Armougom, F., Scheld, W. M., Dufour, H., Roche, P. H.,

Drancourt, M. & Raoult, D. (2009). The expansion of the

microbiological spectrum of brain abscesses with use of multiple 16S

ribosomal DNA sequencing. Clinical Infectious Diseases 48, 1169-1178.

Almuzara, M. N., Palombarani, S., Tuduri, A., Figueroa, S., Gianecini, A.,

Sabater, L., Ramirez, M. S. & Vay, C. A. (2011). First case of

fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J. Clin.

Microbiol. 49, 2333-2335.

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990).

Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410.

Armougom, F., Bittar, F., Stremler, N., Rolain, J. M., Robert, C., Dubus, J.

C., Sarles, J., Raoult, D. & La Scola, B. (2009). Microbial diversity in

the sputum of a cystic fibrosis patient studied with 16S rDNA

pyrosequencing. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 1151-1154.

Baker, G. C., Smith, J. J. & Cowan, D. A. (2003). Review and re-analysis of

domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods 55, 541-555.

Page 94: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

94

Bizzini, A. & Greub, G. (2010). Matrix-assisted laser desorption ionization

time-of-flight mass spectrometry, a revolution in clinical microbial

identification. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1614-1619.

Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod'hom, G. & Greub, G. (2011).

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass

spectrometry as an alternative to 16S rRNA gene sequencing for

identification of difficult-to-identify bacterial strains. J. Clin. Microbiol.

49, 693-696.

Blanc, V., Dalle, M., Markarian, A., Debunne, M. V., Duplay, E.,

Rodriguez-Nava, V. & Boiron, P. (2007). Gordonia terrae: a difficult-

to-diagnose emerging pathogen? J. Clin. Microbiol. 45, 1076-1077.

Blaschke, A. J., Bender, J., Byington, C. L., Korgenski, K., Daly, J., Petti, C.

A., Pavia, A. T. & Ampofo, K. (2007). Gordonia species: emerging

pathogens in pediatric patients that are identified by 16S ribosomal RNA

gene sequencing. Clinical Infectious Diseases 45, 483-486.

Bosshard, P. P., Abels, S., Zbinden, R., Bottger, E. C. & Altwegg, M. (2003).

Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram-positive

rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation). J. Clin.

Microbiol. 41, 4134-4140.

Page 95: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

95

Boudewijns, M., Bakkers, J. M., Sturm, P. D. & Melchers, W. J. (2006). 16S

rRNA gene sequencing and the routine clinical microbiology laboratory: a

perfect marriage? J. Clin. Microbiol. 44, 3469-3470.

Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N. & Alland, D. (2007). A

detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis

of pathogenic bacteria. J. Microbiol. Methods. 69, 330-339.

Chan, J. F., Wong, S. S., Leung, S. S., Fan, R. Y., Ngan, A. H., To, K. K.,

Lau, S. K., Yuen, K. Y. & Woo, P. C. (2012). First report of chronic

implant-related septic arthritis and osteomyelitis due to Kytococcus

schroeteri and a review of human K. schroeteri infections. Infection.

Epub ahead of print.

Cherkaoui, A., Hibbs, J., Emonet, S., Tangomo, M., Girard, M., Francois,

P. & Schrenzel, J. (2010). Comparison of two matrix-assisted laser

desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with

conventional phenotypic identification for routine identification of

bacteria to the species level. J. Clin. Microbiol. 48, 1169-1175.

Clarridge, J. E., III (2004). Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for

Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious

Diseases. Clin Microbiol Rev 17, 840-862.

Page 96: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

96

Coenye, T., Gevers, D., Van de Peer, Y., Vandamme, P. & Swings, J. (2005).

Towards a prokaryotic genomic taxonomy. FEMS Microbiology Reviews

29, 147-167.

Cohen-Bacrie, S., Ninove, L., Nougairede, A., Charrel, R., Richet, H.,

Minodier, P., Badiaga, S., Noel, G., La, S. B., de, L., X, Drancourt, M.

& Raoult, D. (2011). Revolutionizing clinical microbiology laboratory

organization in hospitals with in situ point-of-care. PLoS. One. 6,

e22403.

Drancourt, M., Berger, P. & Raoult, D. (2004). Systematic 16S rRNA gene

sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species

associated with humans. J Clin Microbiol 42, 2197-2202.

Drancourt, M. & Raoult, D. (2005). Sequence-based identification of new

bacteria: a proposition for creation of an orphan bacterium repository. J

Clin Microbiol 43, 4311-4315.

Fenollar, F., Roux, V., Stein, A., Drancourt, M. & Raoult, D. (2006).

Analysis of 525 samples to determine the usefulness of PCR amplification

and sequencing of the 16S rRNA gene for diagnosis of bone and joint

infections. J. Clin. Microbiol. 44, 1018-1028.

Fournier, P. E., Thuny, F., Richet, H., Lepidi, H., Casalta, J. P., Arzouni, J.

P., Maurin, M., Celard, M., Mainardi, J. L., Caus, T., Collart, F.,

Page 97: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

97

Habib, G. & Raoult, D. (2010). Comprehensive diagnostic strategy for

blood culture-negative endocarditis: a prospective study of 819 new cases.

Clinical Infectious Diseases 51, 131-140.

Frank, J. A., Reich, C. I., Sharma, S., Weisbaum, J. S., Wilson, B. A. &

Olsen, G. J. (2008). Critical evaluation of two primers commonly used

for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and

Environmental Microbiology 74, 2461-2470.

Gauduchon, V., Chalabreysse, L., Etienne, J., Celard, M., Benito, Y.,

Lepidi, H., Thivolet-Bejui, F. & Vandenesch, F. (2003). Molecular

diagnosis of infective endocarditis by PCR amplification and direct

sequencing of DNA from valve tissue. J Clin Microbiol 41, 763-766.

Gevers, D., Cohan, F. M., Lawrence, J. G., Spratt, B. G., Coenye, T., Feil, E.

J., Stackebrandt, E., Van de Peer, Y., Vandamme, P., Thompson, F.

L. & Swings, J. (2005). Re-evaluating prokaryotic species. Nat. Rev.

Microbiol. 3, 733-739.

Gil-Sande, E., Brun-Otero, M., Campo-Cerecedo, F., Esteban, E., Aguilar,

L. & Garcia-de-Lomas, J. (2006). Etiological misidentification by

routine biochemical tests of bacteremia caused by Gordonia terrae

infection in the course of an episode of acute cholecystitis. J. Clin.

Microbiol. 44, 2645-2647.

Page 98: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

98

Goldenberger, D., Kunzli, A., Vogt, P., Zbinden, R. & Altwegg, M. (1997).

Molecular diagnosis of bacterial endocarditis by broad-range PCR

amplification and direct sequencing. J Clin Microbiol 35, 2733-2739.

Gouriet, F., Fenollar, F., Patrice, J. Y., Drancourt, M. & Raoult, D. (2005).

Use of shell-vial cell culture assay for isolation of bacteria from clinical

specimens: 13 years of experience. J. Clin. Microbiol. 43, 4993-5002.

Greub, G., Lepidi, H., Rovery, C., Casalta, J. P., Habib, G., Collard, F.,

Fournier, P. E. & Raoult, D. (2005). Diagnosis of infectious

endocarditis in patients undergoing valve surgery. Am J Med 118, 230-

238.

Habib, G., Hoen, B., Tornos, P., Thuny, F., Prendergast, B., Vilacosta, I.,

Moreillon, P., de Jesus, A. M., Thilen, U., Lekakis, J., Lengyel, M.,

Muller, L., Naber, C. K., Nihoyannopoulos, P., Moritz, A. &

Zamorano, J. L. (2009). Guidelines on the prevention, diagnosis, and

treatment of infective endocarditis (new version 2009): the Task Force on

the Prevention, Diagnosis, and Treatment of Infective Endocarditis of the

European Society of Cardiology (ESC). Endorsed by the European

Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) and

the International Society of Chemotherapy (ISC) for Infection and

Cancer. Eur. Heart J. 30, 2369-2413.

Page 99: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

99

Iida, S., Taniguchi, H., Kageyama, A., Yazawa, K., Chibana, H., Murata, S.,

Nomura, F., Kroppenstedt, R. M. & Mikami, Y. (2005). Gordonia

otitidis sp. nov., isolated from a patient with external otitis. Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 55, 1871-1876.

Janda, J. M. & Abbott, S. L. (2002). Bacterial identification for publication:

when is enough enough? J Clin Microbiol 40, 1887-1891.

Janda, J. M. & Abbott, S. L. (2007). 16S rRNA gene sequencing for bacterial

identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.

Clin. Microbiol. 45, 2761-2764.

Jannat-Khah, D. P., Halsey, E. S., Lasker, B. A., Steigerwalt, A. G.,

Hinrikson, H. P. & Brown, J. M. (2009). Gordonia araii infection

associated with an orthopedic device and review of the literature on

medical device-associated Gordonia infections. J. Clin. Microbiol. 47,

499-502.

Jenkins, C., Ling, C. L., Ciesielczuk, H. L., Lockwood, J., Hopkins, S.,

McHugh, T. D., Gillespie, S. H. & Kibbler, C. C. (2012). Detection and

identification of bacteria in clinical samples by 16S rRNA gene

sequencing: comparison of two different approaches in clinical practice.

Journal of Medical Microbiology 61, 483-488.

Page 100: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

100

Kiratisin, P., Li, L., Murray, P. R. & Fischer, S. H. (2003). Identification of

bacteria recovered from clinical specimens by 16S rRNA gene

sequencing. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 22, 628-631.

Lang, S., Watkin, R. W., Lambert, P. A., Bonser, R. S., Littler, W. A. &

Elliott, T. S. (2004). Evaluation of PCR in the molecular diagnosis of

endocarditis. J Infect 48, 269-275.

Lesens, O., Hansmann, Y., Riegel, P., Heller, R., Benaissa-Djellouli, M.,

Martinot, M., Petit, H. & Christmann, D. (2000). Bacteremia and

endocarditis caused by a Gordonia species in a patient with a central

venous catheter. Emerg. Infect. Dis. 6, 382-385.

Mellmann, A., Cloud, J., Maier, T., Keckevoet, U., Ramminger, I., Iwen, P.,

Dunn, J., Hall, G., Wilson, D., Lasala, P., Kostrzewa, M. & Harmsen,

D. (2008). Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-

of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing

for species identification of nonfermenting bacteria. J. Clin. Microbiol.

46, 1946-1954.

Mignard, S. & Flandrois, J. P. (2006). 16S rRNA sequencing in routine

bacterial identification: a 30-month experiment. J. Microbiol. Methods.

67, 574-581.

Page 101: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

101

Millar, B., Moore, J., Mallon, P., Xu, J., Crowe, M., Mcclurg, R., Raoult, D.,

Earle, J., Hone, R. & Murphy, P. (2001). Molecular diagnosis of

infective endocarditis - a new Duke's criterion. Scand J Infect Dis 33,

673-680.

Mori, Y. & Notomi, T. (2009). Loop-mediated isothermal amplification

(LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for

infectious diseases. J. Infect. Chemother. 15, 62-69.

Olsen, G. J. & Woese, C. R. (1993). Ribosomal RNA: a key to phylogeny.

FASEB J 7, 113-123.

Petti, C. A. (2007). Detection and identification of microorganisms by gene

amplification and sequencing. Clinical Infectious Diseases 44, 1108-

1114.

Petti, C. A., Bosshard, P. P., Brandt, M. E., Clarridge, J. E., III, Feldblyum,

T. V., Foxall, P., Furtado, M. R., Pace, N. & Procop, G. (2008).

Interpretive Criteria for Identification of Bacteria and Fungi by DNA

Target Sequencing; Approved Guideline. In (Anonymous), CLSI.

Petti, C. A., Polage, C. R. & Schreckenberger, P. (2005). The role of 16S

rRNA gene sequencing in identification of microorganisms misidentified

by conventional methods. J. Clin. Microbiol. 43, 6123-6125.

Page 102: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

102

Podglajen, I., Bellery, F., Poyart, C., Coudol, P., Buu-Hoi, A., Bruneval, P.

& Mainardi, J. L. (2003). Comparative molecular and microbiologic

diagnosis of bacterial endocarditis. Emerg Infect Dis 9, 1543-1547.

Rampini, S. K., Bloemberg, G. V., Keller, P. M., Buchler, A. C.,

Dollenmaier, G., Speck, R. F. & Bottger, E. C. (2011). Broad-range

16S rRNA gene polymerase chain reaction for diagnosis of culture-

negative bacterial infections. Clinical Infectious Diseases 53, 1245-

1251.

Rovery, C., Greub, G., Lepidi, H., Casalta, J. P., Habib, G., Collart, F. &

Raoult, D. (2005). PCR detection of bacteria on cardiac valves of patients

with treated bacterial endocarditis. J. Clin. Microbiol. 43, 163-167.

Schlaberg, R., Simmon, K. E. & Fisher, M. A. (2012). A systematic approach

for discovering novel, clinically relevant bacteria. Emerg. Infect. Dis. 18,

422-430.

Schmeing, T. M. & Ramakrishnan, V. (2009). What recent ribosome

structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 461,

1234-1242.

Seng, P., Drancourt, M., Gouriet, F., La, S. B., Fournier, P. E., Rolain, J. M.

& Raoult, D. (2009). Ongoing revolution in bacteriology: routine

identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization

Page 103: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

103

time-of-flight mass spectrometry. Clinical Infectious Diseases 49, 543-

551.

Sng, L. H., Koh, T. H., Toney, S. R., Floyd, M., Butler, W. R. & Tan, B. H.

(2004). Bacteremia caused by Gordonia bronchialis in a patient with

sequestrated lung. J. Clin. Microbiol. 42, 2870-2871.

Sontakke, S., Cadenas, M. B., Maggi, R. G., Diniz, P. P. & Breitschwerdt, E.

B. (2009). Use of broad range16S rDNA PCR in clinical microbiology. J.

Microbiol. Methods 76, 217-225.

Stackebrandt, E. & Ebers, J. (2006). Taxonomic parameters revisited:

tarnished gold standards. Microbiology Today , 152-155.

Stackebrandt, E., Frederiksen, W., Garrity, G. M., Grimont, P. A. D.,

Kampfer, P., Maiden, M. C. J., Nesme, X., Rossello-Mora, R., Swings,

J., Truper, H. G., Vauterin, L., Ward, A. C. & Whitman, W. B.

(2002). Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the

species definition in bacteriology. Int J Syst Evol Microbiol 52, 1043-

1047.

Toth, E. M., Schumann, P., Borsodi, A. K., Keki, Z., Kovacs, A. L. &

Marialigeti, K. (2008). Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp.

nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica

(Diptera: Sarcophagidae). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58, 976-981.

Page 104: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

104

Tran-Hung, L., Tran-Thi, N., Aboudharam, G., Raoult, D. & Drancourt,

M. (2007). A new method to extract dental pulp DNA: application to

universal detection of bacteria. PLoS. One. 2, e1062.

Verma, P., Brown, J. M., Nunez, V. H., Morey, R. E., Steigerwalt, A. G.,

Pellegrini, G. J. & Kessler, H. A. (2006). Native valve endocarditis due

to Gordonia polyisoprenivorans: case report and review of literature of

bloodstream infections caused by Gordonia species. J. Clin. Microbiol.

44, 1905-1908.

Vondracek, M., Sartipy, U., Aufwerber, E., Julander, I., Lindblom, D. &

Westling, K. (2011). 16S rDNA sequencing of valve tissue improves

microbiological diagnosis in surgically treated patients with infective

endocarditis. J. Infect. 62, 472-478.

Weile, J. & Knabbe, C. (2009). Current applications and future trends of

molecular diagnostics in clinical bacteriology. Anal. Bioanal. Chem.

394, 731-742.

Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A. & Lane, D. J. (1991). 16S

ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173,

697-703.

Page 105: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

105

Werno, A. M., Anderson, T. P., Chambers, S. T., Laird, H. M. & Murdoch,

D. R. (2005). Recurrent breast abscess caused by Gordonia bronchialis in

an immunocompetent patient. J. Clin. Microbiol. 43, 3009-3010.

Woese, C. R. (1987). Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, 222-270.

Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H. & Yuen, K. Y. (2008). Then and

now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and

discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin.

Microbiol. Infect. 14, 908-934.

Woo, P. C. Y., Ng, K. H. L., Lau, S. K. P., Yip, K. T., Fung, A. M. Y.,

Leung, K. W., Tam, D. M. W., Que, T. L. & Yuen, K. Y. (2003).

Usefullness of the MicroSeq 500 16S ribosomal DNA-based bacterial

identification system for identification of clinically significant bacterial

isolates with ambiguous biochemical profiles. J Clin Microbiol 41,

1996-2001.

Page 106: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

106

REMERCIEMENTS

Je souhaite tout d’abord remercier Monsieur le Professeur Jean-Louis

Mege, sans lequel la soutenance de cette thèse n’aurait pas été possible. Je le

remercie de m’avoir fait l’honneur de m’accorder sa confiance dans une

situation particulière et d’avoir accepté de présider ce jury. Je le remercie

également de la sympathie dont il a bien voulu faire preuve à mon égard tout au

long de mon cursus marseillais et après mon départ de Marseille.

Je remercie Monsieur le Professeur Vincent Jarlier, qui m’a fait l’honneur

de me nommer assistante hospitalo-universitaire dans son service. Je le remercie

de m’avoir fait assez confiance pour recruter un élément extérieur au milieu des

microbiologistes parisiens. Je le remercie enfin pour tout le soutien dont il a fait

preuve au cours de l’élaboration de cette thèse.

Je remercie Madame le Professeur Florence Doucet-Populaire, qui a

accepté d’être rapporteur dans mon jury de thèse.

Je remercie Monsieur le Professeur Guillaume Arlet, qui a, lui aussi, bien

voulu être rapporteur dans ce jury de thèse.

Page 107: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

107

Je remercie Monsieur le Professeur Didier Raoult pour tout ce qu’il a bien

voulu me transmettre pendant les six années de mon cursus marseillais.

Je remercie tout particulièrement le Docteur Véronique Roux, qui m’a

initiée puis guidée dans la voie de la biologie moléculaire. Je la remercie pour

son encadrement et sa pédagogie qui ont permis d’aboutir aux publications dont

est constituée cette thèse. Je la remercie enfin pour son amitié et son soutien

pendant mon cursus marseillais.

Je remercie tous les Marseillais, séniors, internes, secrétaires, ingénieurs,

techniciens, qui ont été mes collègues pendant 6 ans. Je vous remercie pour tout

ce que vous m’avez donné et je ne vous oublie pas.

Je remercie mes collègues de la Pitié Salpétrière pour m’avoir accueillie

au sein de leur équipe, pour leur gentillesse et leur disponibilité constante. Je

remercie tout particulièrement le Dr Alexandra Aubry pour avoir bien voulu

relire ce mémoire de thèse et les corrections et remarques critiques qui en ont

découlé. Je remercie également les Drs Florence Brossier, Laurence Drieux et

Stéphanie Petrella pour leurs encouragements constants pendant la période de

rédaction de cette thèse.

Page 108: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

108

Je remercie mes amis les plus proches pour leur soutien et leur amitié

indéfectible : la communauté de l’anneau (Marie, Elisabeth, Jean-Christophe,

Stéphan, Mickaël, Samir, Isa, Yassina), les rickettsiens extérieurs à la

communauté (Oleg, Annick, Catherine, Quentin, Iza, Cristina, Gilles, Fred), les

non rickettsiens (Joëlle, Daniel, Séb, Olivier, Christophe, Nicole, Max,

Laurence, Laurent, Patrick, Diane, Elise, Bernard, Christine, Carole, Aurore) et

tous les autres…

Je remercie et embrasse des milliers de fois ma merveilleuse famille pour

son soutien, son amour et son indéfectible confiance. Mille baisers aux clans

Demari, Ropion, Andrau, Jego, Mugnier, Renvoisé-Marié. E ringraziù tutta a mo

famiglia di Corsica.

Un grand merci à Dell pour le support technique et à Gmail pour les

sauvegardes sans fautes de cette thèse.

Pour Marcelline, ma minette chérie dont les ronrons et l’affection féline

ont accompagné de longues heures de travail.

Page 109: Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d

109

Pour mes grands-parents Renvoisé et Mamie Papa,

pour Papy, Mamie et Mémé Nénette qui me manquent tous les jours,

à mes parents adorés, toujours présents, aimants, dévoués, je dédie cette

deuxième thèse.

�� ������ �� � ��� ��� �� �� ������ ��� ������ �� ��� �� ��� � ��� ��

�������� �� � ����� ��� �������� ����� ������

�� ��� �� ������ �� ��� ���� ����� ���� � ������� � ��� �� � ����� !������

" #��� ��� ����� ���� ��� ��$�� �� ���� ��� �������� ������� ���� ���

���#��� ��� ���� �� ���� ����%��� ��� ������� &��������

������' �� ��� �� ��� �� ����' �� �� ������' �� ( ��� ���� �� �� ����

�� ���� ��� ���#����

)�����' ����� � �� �� ��' � �� �������� � �' ����� � �� �� ��' ������

������� *���� "����� �� *� ��