De la graine au modèle acellulaire

Assemblage des protéines de réserve des graines :corpuscules protéiques et vésicules de stockage

INRA Nantes

Prepro-protein

Mature storage protein complex

Biosynthesis

Assembly

TranscriptionDNA

mRNATranslation

Post-translationalModifications

Folding

Oligomerization

Pro-protein

N-terminal signal cleavage

Protein subunits

Mature protein complex

Assembly GeneticsEcophysiology?

Wheat

protein network

dough rheology

Rapeseed Pea

millingproperties

grain fractionation

food/feed properties

endosperm texture

molecular farming

Les Prolamines

protéines de réserve du grain de blé

type y 650 res.

1 or 3 SS intertype x 800 res.

1Dx 5 827 res2 or 4 SS inter

.

LMW 250 - 300 res 2 SS inter

.

γ type 250 - 300 res 4 SS intra

α type 250 - 270 res 3 SS intra

ω type 340-420 res 0 S

HMW gluteninsgliadins

Q G P

Q P

Q P

Q P

Q P

Q G P

Q G P

S-ri

chH

MW

S-p

oor

Low concentration2 µg /mL

High concentration200 µg /mL

STM images of γ-gliadinThomson et al., 1992

Masci et al., 1998

9 x3 nm

1 nm Parchment et al., 2001

Computer modelling ofHMW glutenin subunit

and detail of therepetitive domain

Kasarda, 1994

50 x 2 nm

100 nm 450 nm

Humphris et al., 2000

AFM of reduced and alkylated subunit 1Dx5.

LMW

x-type

y-type

1Dx5

LMW

y-type

LMW

LMW x-type

x-type

HMW?

y-type

y-type

?

Hypothetical structure of wheat glutenin polymers

Shewry et al., 2002

McMaster et al., 2000

A-gliadin fibrilsAFM images of gliadins

1:1 blend of α-and ω−gliadins

McMaster et al., 1999

Les protéines de réserve

des graines de dicotylédones

Asn Gln6360 000Globulines11S

Asn Gln3160 000Globulines

7S

Gln Pro1 ou 21250014500

Albumines2S

AASUMM

Post-translational cleavage of pea legumin and vicilin

H2N COOH 60 000

40 00020 000

SS

α + β

αβ

H2N COOH50 000

α + β + γ

α + β

γ

αβ

33 000

19 000

16 00013 500

Polymorphisme des 12S

980 spotsImmunoblotting et Spectrométrie de Masse

3 10 57 spots correspondantaux polypeptides alpha

15 spots correspondantaux polypeptides béta

Forte variabilité despolypeptides alpha

6 fois plus de polypeptidesque de gènes

Nombreuses modificationspost traductionnelles

10 gènes identifiés portés par 4chromosomes

9.5 nm

4 nm

11S soybean globulin hexamer

Adachi M. et al.,2001, 2003

alpha chain beta chain

2S rapeseed albumin

s 1 2 3 4 5 6 7 8

Rh ~ 2nm

alpha beta

hydrophobic aa

Formation des organitesde stockage dans les graines

Matsuoka and Bednarek, 1998

Location of zein components in maize protein bodyColeman and Larkins, 1999

Accumulation of modified 10Kd Zein in transgenic tobacco leavesRandall et al., 2000

PBs in Maturing α,α’-Conglycinin-Cosuppressing Soybeans.OB, oil body; PB, protein body; PSV, protein storage vacuole; V, vacuole.

A. J. Kinney, R. Jung, and E. M. Herman, 2001SOJA

glycinin labelled PBs

Accumulation of pea legumin in transgenic wheat endosperm

Stöger et al., 2001

500 nm 100 nm

Systèmeacellulaire

SystèmebiomimétiqueGraine

BléBléBléPois

Structures moléculaires etsupra moléculaires

Blé ColzaPoisComposition

Organisation des entitésparticulaires

BléMécanismesphysicochimiques

BléBléDomaines structurauximpliqués

Interactions entremacromolécules

BléBlé ColzaPoisMécanismes biologiques

BléLocalisation des différentsconstituants

Questions et approchesPolym

orphisme génétique

Modifications post-traductionnelles

Environnement cellulaire

Assemblage des protéines deréserve : étude de graines

Assemblage des protéines de réserve : approchesur graines in vivo

Analyse des graines en cours de développement

Ultrastructure, localisation, co-localisation(immunomarquage)

Isolement et caractérisation de corpuscules protéiquespar fractionnement subcellulaire

Obtention de CP pour caractérisation fine, analyseprotéomique

Analyse des grains en cours de développement

Variété RécitalCulture menée sous serre (Inra Rennes, Le Rheu)Etiquetage des épis à la date de floraison

Approche menée sur blé

Triboï et al., J. Exp. Bot., 54 (2003) 1731-1742

Collection de grains à différents stades de développement :de 35°C. j à 770 °C. j soit 1 à 45 DAP

Immunolocalisation des prolamines au MET

158°C. j (X 10 000) 245 °C. j (X 10 000)

Identification de corpuscules protéiques à partir de91°Cj - 158 °Cj soit 4-8 JAF

Diamètre des CP : 0.5 à 2.5 µm

Coupes de grains en développementImmunolocalisation spécifique des différentes prolamines

Co-localisation : présence de Gliadines et Gluténines dans lesmêmes CP ?

Informations sur le passage CP - matrice protéique ?

Projets

Immunolocalisation des prolamines au MET

Isolement et caractérisation de corpuscules protéiques

Approches menées sur blé (2004) , pois (2005)

Etude directe des fractions

imagerie par microscopie (MET)

autres imageries ? Spectroscopie ?

Enrichissement en protéines de réserve pouranalyses immunochimiques ou biochimiques

Protéomique des CP

Caractérisation physico-chimique du contenu (état depolymérisation des prolamines par SE-HPLC)

Grain de blé en coursde développement

Broyage au mortier dans un milieu refroidi à 4°Ccontenant un osmoticum (saccharose 10%) pour

préserver l'intégrité des CP

Elimination des gros débris par filtration sur gaze

Dépôt sur gradient de densité (NycodenzTM) et ultracentrifugation

(18 heures, 275 000 g)

Différentes fractionscontenant descorpuscules

protéiques isolés

Principe du fractionnement subcellulaire

Enrichissement des fractions en prolamines

Solubilisation des prolamines : 70% EtOH, 1% β-mercaptoéthanol, 60°C

(destruction des CP)

Différentes fractions contenant descorpuscules protéiques isolés

Centrifugation (3000g, 20 min)

Elimination du culot

Précipitation des prolamines ( 0.3M NaCl, 4°C)

Fractions enrichies enprolamines solubilisées

Fractions enrichies enprolamines précipitées

0

0 .0 2

0 .0 4

0 .0 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0F ra c t io n s

Act

ivité

enz

ymat

ique

(UA

Fractionnement subcellulaire sur blé (19 DAA)

St Ext. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SU Gluténines HPM

Gliadines

SU Gluténines FPM

Activité enzymatique de laNADH-cytochrome Creductase (marqueur du RE)

Fractions enrichies en prolamines

Gliadins distribution at 31 DAA

0

10

20

30

40

50

60

70

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

Fractions

Prot

ein

dist

ribu

tion

(%) Alpha/Beta Gliadins

Gamma Gliadins

Omega Gliadins

Analyse immunochimique de la composition enprolamines : gliadines

Gamma Gliadins

0

100

200

300

400

500

600

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

Fractions

Prot

ein

accu

mul

atio

n (µ

g)

10 DAA19 DAA31 DAA

Suivi de l'accumulation desprotéines de réserve aucours du développementdu grain

Distribution équivalente desdifférents types de gliadinesdans les fractions

Synthèse : Corpuscules Protéiques isolés

- CP riches en gliadines :

fraction F2 (~ 20% Nycodenz)

Protéines ~ 100 µg/mL

- CP contenant des gluténines HPM :

fraction F7 (~ 40% Nycodenz)

Protéines < 50 µg/mL Présence de gliadines?

Diamètre environ 1 µm

Isolement et caractérisation de corpuscules protéiques :Projets / Perspectives

- Approche protéomique

confirmation de l'existence de différentstypes de CP

analyse / identification de protéinesmineures liées à l'assemblage (PDI, chaperones, etc…)

- Questions liées à l'organisation supra-moléculaire

Etat de polymérisation des prolamines(études biochimiques)

Organisation des CPs ???Objets possibles : CPs blé / pois

types de structures protéiques différents

Systèmes biomimétiques

Les protéines de réserve suivent les voies de sécrétionvia le RE.

Comment se mettent en place les interactions entre lesdifférentes prolamines (protéines de réserve du blé) en amont,au moment de leur synthèse dans le RE?

Quel est le degré d'organisation des prolamines dans le REet/ou à la sortie de ce compartiment (vésicules ou corpusculesprotéiques)?

Cette organisation est-elle remise en cause dans lescompartiments post-RE?

Mécanisme de formation des vésicules au niveau du RE

Copyright ©2001 by the National Academy of Sciences

Lederkremer, Gerardo Z. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10704-10709

Possible models for the assembly of Sec23p/24p and Sec13p/31p to form a COPII coat

Copyright ©2001 by the National Academy of Sciences

Matsuoka, Ken et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 13705-13709

Sec13/31p shed from the coat

Sec13/31pSec23/24p

Les protéines COP sont-elles responsables de laformulation des vésicules contenant les prolamines?

Si oui, peut-on formuler dans un système biologique,des vésicules contenant des protéines de réserveblé?

Quelles sont les spécificités qui fondentles interactions entre les différentes prolamines?Domaines fonctionnels?

Conservation de la machinerie de confection de vésicules et du trafic vésiculaire à travers l ’arbre de la vie.

Banques ESTs TIGR & Génoplante (blé)

Genes trapping

Confection de banques partielles de cDNAs

Stratégie pour un modèle biomimétique

Complémentation fonctionnellede mutants de S. cerevisiae

Identification fonctionnelle des acteurs dutrafic vésiculaire des protéines de réserve

Genes regulating vesicle trafic

A. thaliana C. elegans Human source

Genome size 108 108 3 x 109 1, 2

Syntaxins (target membrane SNAREs) 24 10 14 1, 2

VAMPs (vesicle SNARES) 14 10 15 1, 2

Total SNARES 53 23 32 1, 2

Sec 1s (syntaxin binding) 6 6 7 1, 2

Rab GTPases (docking and fusion) 60 29 60 2

ARF GTPases (vesicle budding) 45 27 55 3

1: Sanderfoot et al. (2000) Plant Physiol. 124: 1558.2: Bock et al. (2001) Nature 409: 839.3: Venter et al. (2001) Science 291: 1304; The A. Genome initiative (2000) Nature 408: 796

From Assaad FF (2001) Current Op. Plant Biol. 4: 478

Double hybride (Levure et bactérien)

Identification des partenaires manquants spécifiquesdu végétal (ou du blé) par interactions spécifiques

OFFOFF

ON NO

O

NON

Mise en place d ’une machinerie de confection de vésicules chez la levure

Co-expression des gènes spécifiant la machinerieprotéique de confection des vésicules COPII contenantdifférentes familles de prolamines de blé

Caractérisation structurale

Etude du devenir de ces vésiculesdans les compartiments post-RE

Modèles acellulaires pour l’étudede l’agrégation,

de la condensationet de la micro-compartimentation

de protéines de réserve

Démarche générale

Approche mécanistique des processus d'agrégation ou d'assemblage aux différentes échelles d'observation

- échelle moléculaire :UV-Vis, IRTF, DC, fluorescence

- échelle colloïdale: diffusion du rayonnement

- échelle macroscopique: diagramme d’états, microscopie

Approche cinétique des processus d'agrégation/condensation et de micro-compartimentation

Étude des interactions

- ITC, calorimétrie haute sensibilité, résonance plasmonique de surface,IRTF

Caractéristiques des CP à prendre en compte

Densité : 1.268 g/cm3 (blé; mi-maturation) —> 95% protéines (pression osmotique pour maintenir l'intégrité des CP ?)

Arrangement des sous-unités au sein du CP (maïs) (rôle des interactions intra- et intermoléculaires entre SU ?)

Dépôt des protéines sous forme solubles ou agrégées (ex. blé) (mécanismes de rétention/d'agrégation ? Reconnaissance ?)

Taille : 0.5 – 1.5 mm (origine de la diversité de tailles :génétique , écophysiologique?)

Identification d’autres composés : phospholipides membranaires, protéines membranaires, chaperones, glutathion (rôle dans le repliement et/ou les associations ?)

Ions, type d'ions, force ionique ? (existence d'interactions à courte distance ?)

Les objets d’étude : les gliadines

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

I/I0

q (nm-1)

L=16; d=3.6 nm 2a=22; 2b=3.8 nm

Solubilité :Eau/éthanol > acide acétiqueStructure :Cylindre L=16nm, d=3.6nmComportement en T :UCSTPolymorphisme :Miscibilité totale (γ−ω et γ-LMWG)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

T

ΦA/ΦB

2 phases

1 phase

0.1 1

0.01

0.1

1

10

EtOD/D2O 62/38

I/C (g

-1.c

m2)

q (nm-1)

γ-gliadine ω-gliadine ω - γ 1:1 ω - γ 1:3 ω - γ 3:1 L=18.5 nm; d=3.5 nm

Approche cinétique des processus d’agrégation / condensation :mauvais solvant et/ou choc osmotique

«Solution»de

Gliadines(10 mg/ml)EtOH:H2O

48:52

1

2

3interneexterne

Mauvais solvantETOH:H2O 45:55

35:65 25:75

Choc osmotiquePEG 35000 ≠ Conc.EtOH:H2O 48:52

Mauvais solvant+ choc osmotique

1 2+

Objectifs : création de particules denses mimant lescorpuscules protéiques – approche cinétique desphénomènes d’agrégation/précipitation

Précipitation(mauvais solvant)

Concentration(choc osmotiqueen bon solvant)

Précipitation etconcentration

(choc osmotiqueen mauvais solvant)

0 5 10 15 20 25 300

5

10

15

20

25

30

35

40

2

3

1

Cgl

iadi

nes (

g.l-1

)

temps (h)

Précipité amorphePas de précipitation contre PEG en bon solvant

Approche cinétique des processus d’agrégation / condensation :mauvais solvant et/ou choc osmotique

t = 7h (taille : 3-4.6 µm)t = 1h (taille < 1 µm)

t = 71h (taille : 1.5-6 µm)

Approche cinétique des processusd’agrégation / condensation :

mauvais solvant et/ou choc osmotique

Cinétique de croissancedes particules :processus auto-limitant ?

Coa

cerv

at m

ultiv

ésic

ulai

reet

réar

rang

emen

t int

erne

Inte

ract

ions

(coa

lesc

ence

par

tielle

)et

répu

lsio

n

Inte

ract

ions

et c

oale

scen

ce

Fusion de vésiculesMCBL double marquage

Étude des interactions

10 20 30 40 50-1

0

1

2

3

Hea

t flo

w (m

W)

Temperature (°C)

5.6 10-4mM 5.6 10-3

5.6 10-2

2.8 10-1

4.2 10-1

5.6 10-1

Interaction DMPC – gliadine par micro-DSC

Pré-transition Transitiongel-cristal liquide

Pas ou peu de variation sur les T pré-transition et transitionBaisse de ∆H consécutive à une baisse des interactions hydrophobesentre chaînes acyles des phospholipides (interaction avec gliadine ?)

Micro-compartimentation

Encapsulation de gliadines dans des liposomes

Thèse GDR INRA Nantes-CNRS CRPP

domaine très dilué

domaine concentré

domaine très concentréd aqueuse < 2xRg

Effet de l’insertion des protéines de réserve sur les propriétés de laphase lamellaire : modifications de la structure, déformations de lamembrane, apparition de défauts

Conséquences sur la structure et sur les propriétés dynamiques de laprotéine : effet du confinement , diffusion de la protéine, localisation dela protéine, modification de sa conformation, quantité de protéinespouvant être insérée

d aq

ueus

e

Etudes bioinformatiques

Analyse des données de ponts disulfures

• Démarche:– Analyser les données de ponts disulfures issues des banques

et en extraire des « connaissances » et/ou des motifsintéressants

• 2 angles d’observation :– Caractérisation des cystéines libres / liées– Caractérisation des ponts disulfures

Mise en place d’un processus de datamining pour l’étude des ponts disulfures

Banques dedonnées

biologiques

Ponts

1010110001101000101000101010100100111110

Base dedonnées

personnelle

Donnéescibles

Donnéespréparées

Informationsextraites

Connaissances

Recensement,Récupération, Stockage

Sélection

Préparation

Règle d’Association

Data Mining

Interprétation

Données et Banques de données

C C C C C CSignal

Préprotéine :-Peptide signal

Préprotéine :-Séquence

C C CC C C

Chaîne 1D :-Profil d’hydrophobie-Séquence

Cystéines :-Positions-Conservation

Ponts Disulfures :- Intra moléculaires- Inter moléculaires

Protéine mature :-Localisationsubcellulaire

Cystéines :-Voisinage spatial-Accessibilité au solvant

C C

C C

C C

C C

C C

C C

Protéine mature :-StructuresSecondaires-Mode d ’expression

Règles d’association pertinentes pour caractériser les cystéines libresou impliquées dans des ponts disulfures:

If signal=yes AND conservation = 100/100 AND Number of cysteines is even

THEN Cysteine is bonded Confidence : 1 – [729/732]

IF location=Extracellular AND Number of cysteines is even

THEN Cysteine is bonded Confidence : 0.99 – [918/924]

IF signal=yes THEN cysteine is bonded Confidence : 0.97 – [1308/1349]

Quelques règles d’association

Tessier et al., 2004

A développer

Analyse bioinformatique des domainesd’association

En cours

Prediction des ponts disulfures

Conclusion

Assemblage des protéines de réserve:

Protéines agrégatives de caractéristiques variables+

Mécanismes biologiques et physicochimiques au sein de la cellule

Combiner les approchesBiologiquesStructurales

Physicochimiques

Systèmes protéiques concentrés organiséslimités par des membranes

Modélisation moléculaireModélisation supramoléculaire

Simulation d’associations

Système acellulaire :contrôle total, simplification

extrême, [sorties nonbiologiques possibles]

Graine :objet d’étude

complexité extrême,nombreuses interactions

Système cellulaire :système manipulable,permet l’analyse de

mécanisme biologiques

Corpuscules

Co-localisationMédiateursValidation

Vésicules

Partenaires d’interactionMécanismesbiologiques

ParticulesInterfaces

AgrégationStructure

Interactions

In silico

Organisationaux différentes

échelles

Graine

Jacques GuéguenColette Larré

Yves PopineauCécile Mangavel

Vanessa DevougesCéline Loussert

Système Biomimétique

Khalil Elmorjani

Bioinformatique

Dominique Tessier

PF RIO SM

Hélène Rogniaux

Système acellulaire

Denis Renard

CRPP CNRS Pessac

Laurence Navailles

Thématique Assemblage des Protéines de Réserve à l’INRA Nantes

doctorant GDR

Dicotylédone / Monocotylédone