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THESE
présentée à
L’UNIVERSITE DE PAU ET DES PAYS DE L’ADOUR
Ecole Doctorale des Sciences Exactes et de leurs Applications
par Thomas AÜLLO
pour obtenir le grade de
DOCTEUR
Spécialité : Microbiologie
Soutenance le 25 Septembre 2013
Composition du jury :
BERTRAND Jean-Claude Université de la Méditerranée Rapporteur
MENEZ Bénédicte IPGP Rapporteur
OLLIVIER Bernard Aix-Marseille Université Examinateur
PATRIARCHE Delphine STORENGY Invitée
BOESINGER Cécile TIGF Invitée
MAGOT Michel UPPA Directeur de thèse
RANCHOU-PEYRUSE Anthony UPPA Co-directeur de
thèse
Atténuation naturelle potentielle de
BTEX en aquifère de stockage de gaz
naturel
« Ils ne savaient pas que c’était impossible,
alors ils l’ont fait. »
Mark Twain
Je tiens tout d’abord à remercier le Pr Robert Duran pour m’avoir accueilli au sein de son
laboratoire.
Merci à Madame Bénédicte Ménez et Monsieur Jean-Claude Bertrand d’avoir accepté
d’évaluer mon travail. Je remercie également Monsieur Bernard Ollivier d’avoir bien voulu
participer à mon jury de thèse mais également pour ses conseils avisés lors de nos
collaborations.
Un grand merci à Cécile Boesinger et à Delphine Patriarche pour avoir accepté de travailler
avec moi, pour la pertinence de leurs remarques et pour les encouragements.
Un immense merci à Michel Magot pour sa patience, sa grande disponibilité, la qualité de ses
conseils ainsi qui les encouragements qu’il m’a apporté tout au long de cette thèse. Merci
aussi pour les Raffarinades durant la rédaction. Cela aurait été difficile sans votre aide.
Je remercie également Régis Grimaud pour son encadrement au cours de mon Master, sa
disponibilité en cas de besoin et les bonnes blagues ! Merci aussi à Philippe Goulas pour nos
discussions sportives et à Jérôme pour la finesse légendaire de ses blagues. Merci à Laurent
de bien avoir voulu relire mon manuscrit.
Je tiens également à remercier les autres membres permanents du labo qui auront su
m’aiguiller quand je leur ai demandé conseils.
Un grand merci à Steph pour ton aide sur les manips et les rigolades, merci de ne pas trop
m’avoir crié dessus quand je dérangeais ce qui était rangé. Merci également à Flo pour ton
humanité et tes cannelés, à Claire, Maryse et Solange pour votre bonne humeur et votre aide.
Je n’oublie pas la Dream Team des étudiants de l’EEM. Merci à Julie ça aura été top de
partager ses 6 dernières années ensemble. Merci à Fab de m’avoir soutenu dans un bureau
de filles et à Jo, Fanny, Justine d’avoir subi nos TRES bonnes blagues sans trop nous en
vouloir. Merci aussi aux anciens du bureau : Fonfec, JP, PJ et Romain : une bien belle
équipe. Je n’oublie pas les étudiants de l’autre bureau, Txa (Adiouuuu !), Mathilde, Vanessa
et Yannick pour leur bonne humeur. C’était cool de bosser avec vous. Un gros merci à Paul
pour les fous rires, les bonnes blagues et tes super déguisements :D !
Un grand merci aux étudiants de Masters qui nous aurons bien fait rire aussi et bien aidé
dans les manips : une pensée particulière pour Louis, Paola et Yannick. Je vous souhaite à
tous beaucoup de bonheur et de réussite.
Un grand merci à ma famille pour sa générosité, son soutien constant et toute l’aide qu’elle a
pu m’apporter pendant ces années.
Un immense merci au champion des encadrants Tony, j’ai vraiment eu une chance énorme de
bosser avec toi ! Tu m’as permis de réaliser cette thèse dans la bonne humeur, avec un
humour et une disponibilité sans faille (enfin pour l’humour ça se discute). Bref, tu as mis la
barre très haute et il sera difficile de trouver meilleur encadrant par la suite.
Pour finir, je tiens à remercier Isa sans qui il aurait été difficile d’en arriver là. Tu m’as
toujours soutenu même en fin de thèse quand je n’étais pas très disponible et je ne te
remercierai jamais assez pour cela. Merci d’être là.
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION GENERALE ................................................................................... 1
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................ 5
1. Le stockage de gaz naturel en aquifere. ................................................................................. 7
1.1 Généralités sur les stockages de gaz naturel. .............................................................. 7
1.2. Les stockages en aquifères. ........................................................................................ 9
1.3. Fonctionnement d‟un site de stockage. .................................................................... 10
1.3.1. Les puits. 10
1.3.2. Injection et Soutirage : des gisements aux particuliers. 11
1.4. Le gaz naturel et les BTEX. ..................................................................................... 11
1.5. L‟échantillonnage en aquifère de stockage. ............................................................. 12
2. Les BTEX dans l‟environnement. ........................................................................................ 13
2.1. Généralités. ............................................................................................................... 13
2.2. Biodégradation des BTEX. ...................................................................................... 14
2.2.1. Les communautés bactériennes naturelles dégradant les BTEX. 15 2.2.2. Les souches pures capables de dégrader les BTEX. 16 2.2.3. Les espèces responsables de la dégradation des BTEX identifiées par
Stable Isotope Probing (SIP). 18 2.3. Les voies métaboliques de dégradation des BTEX en anaérobiose. ........................ 19
2.3.1. Le benzène. 19 2.3.2. Le toluène. 21 2.3.3. L’éthylbenzène. 23 2.3.4. Le xylène. 24
3. Le genre Desulfotomaculum. ................................................................................................ 25
3.1. Définition du genre. ................................................................................................. 25
3.2. Morphologie. ............................................................................................................ 25
3.3. Physiologie. .............................................................................................................. 26
3.4. Classification. .......................................................................................................... 27
3.5. Les Desulfotomaculum dans les environnements naturels. ..................................... 31
3.5.1. Eaux profondes et sédiments superficiels. 32 3.5.2. Subsurface profonde. 36
ARTICLE 1 : Desulfotomaculum spp. and related Gram-positive sulfate-reducing bacteria in
deep subsurface environments. ................................................................................................ 42
1. The Desulfotomaculum genus. .................................................................................... 43
2. Distribution of Desulfotomaculum spp. in the environment. ...................................... 44
2.1. Deep fresh water lakes. 45 2.2. Marine and oceanic sediments. 47
2.3. Deep subterranean environments. 49
CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES .................................................. 61
1. Techniques de microbiologie. .............................................................................................. 63
1.1. Echantillonnage. ...................................................................................................... 63
1.2. Milieux de culture. ................................................................................................... 64
1.3. Microcosmes pour les tests de biodégradation. ....................................................... 66
1.4. Isolement des microorganismes. .............................................................................. 67
1.5. Caractérisation des souches. .................................................................................... 68
1.5.1. Tests de substrats. 68 1.5.2. Tests d’accepteurs d’électrons. 69 1.5.3. Capacité à fermenter. 70 1.5.4. Ecophysiologie. 70
2. Techniques de dosage. .......................................................................................................... 70
2.1. Suivi de dégradation des BTEX. .............................................................................. 70
2.2. Dosage des sulfures. ................................................................................................ 71
2.3. Dosage protéique. .................................................................................................... 71
3. Techniques de biologie moléculaire. .................................................................................... 72
3.1. Extraction de l‟ADN génomique. ............................................................................ 72
3.2. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR). ......................................................... 72
3.3. PCR quantitative (qPCR) ......................................................................................... 74
3.4. Electrophorèse. ........................................................................................................ 74
3.5. Purification de l‟ADN. ............................................................................................. 74
3.6. Clonage/Séquençage. ............................................................................................... 74
3.7. Analyse des séquences et phylogénie. ..................................................................... 75
3.8. Terminal-Restriction Fragments Length Polymorphism (T-RFLP). ....................... 75
3.9. Technique de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). ........................................ 76
3.10. Stable Isotope Probing (SIP). ................................................................................. 78
3.10.1. Suivi de la dégradation du toluène. 78 3.10.2. Séparation des ADN « lourds » et « légers ». 78 3.10.3. Détection des ADN « lourds » et « légers ». 79 3.10.4. Etude de diversité sur les fractions obtenues. 80
CHAPITRE 3 : CARACTERISATION D’UN CONSORTIUM
MICROBIEN DEGRADANT LES BTEX COMPOSE DE DEUX
NOUVELLES ESPECES DE DESULFOTOMACULUM (SITE C) .............. 81
Préambule ................................................................................................................................. 83
ARTICLE 2: Biodegradation of hydrocarbons in the deep terrestrial subsurface:
characterization of a microbial consortium composed of two new Desulfotomaculum species
originating from a deep geological formation. ......................................................................... 84
INTRODUCTION .......................................................................................................... 86
EXPERIMENTAL PROCEDURES ............................................................................... 87
RESULTS AND DISCUSSION ..................................................................................... 91
Origin of the B1 microcosm. 91 Characterization of metabolic activities and isotopic fractionation studies. 92 Composition of the B1 microcosm. 94 Isolation of strains Bs105 and Bs107. 95 Genetic analyses. 96
CONCLUSION ............................................................................................................... 99
Conclusion du chapitre ........................................................................................................... 104
CHAPITRE 4 : IDENTIFICATION DES MICROORGANISMES
RESPONSABLES DE LA DÉGRADATION DE TOLUÈNE ET
ISOLEMENT D’UNE NOUVELLE ESPÈCE DE MESOTOGA (SITE A)105
Préambule ............................................................................................................................... 107
ARTICLE 3: DNA Stable Isotope Probing highlights the role of a new Desulfotomaculum-
related bacterium from a deep subsurface environment in the degradation of toluene. ......... 108
INTRODUCTION ........................................................................................................ 109
MATERIALS AND METHODS .................................................................................. 110
RESULTS AND DISCUSSION ................................................................................... 112
Biodegradation of 12C- and 13C-toluene. 112 Light and heavy DNA separation and fingerprinting. 113
Identification of labeled 16S rRNA genes. 116 Search of the benzyl-succinate synthase (bssA) gene in VNC1. 117
CONCLUSION ............................................................................................................. 117
ARTICLE 4: Mesotoga infera sp. nov., a novel mesophilic member of the order
Thermotogales, isolated from an underground gas storage in france..................................... 121
Conclusion du chapitre ........................................................................................................... 132
CHAPITRE 5 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION D’UNE
NOUVELLE ESPECE DE DESULFOTOMACULUM (SITE D) .................. 133
Préambule ............................................................................................................................... 135
ARTICLE 5: Desulfotomaculum paucivorans, sp. nov., a sulfate-reducing bacterium
originating from a deep-subsurface aquifer. .......................................................................... 136
Conclusion du chapitre ........................................................................................................... 146
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .................................................................. 147
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................... 155
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE.
Figure 1.1 : Carte des sites de stockage de gaz naturel en France (p 8).
Figure 1.2 : Chroniques simplifiées des volumes de gaz dans le stockage d‟Izaute (p 9).
Figure 1.3 : Structure d‟un site de stockage de gaz en aquifère (p 10).
Figure 1.4 : Schéma de principe d‟un puits d‟exploitation (p 11).
Figure 1.5 : Parcours du gaz lors de l‟injection et du soutirage (p 12).
Figure 1.6 : Structure chimique du benzène, toluène, éthylbenzène, o-, m- et p-xylènes (p 13).
Figure 1.7 : Mécanismes hypothétique d‟activation du benzène en anaérobiose (p 20).
Figure 1.8 : Voie de dégradation anaérobie du toluène chez la souche EbN1 (p 23).
Figure 1.9 : Etape initiale de la dégradation anaérobie de l‟éthylbenzène (p 25).
Figure 1.10 : Photographies au microscope à contraste de phase (A et B) et au microscope
électronique à balayage (C) et à transmission (D) d‟espèces de Desulfotomaculum (p 27).
Figure 1.11 : Arbre phylogénétique du genre Desulfotomaculum basé sur le gène de l‟ARNr 16S (p
30).
Figure 1.12 : Arbre phylogénétique du genre Desulfotomaculum basé sur les gènes dsrAB (p 32).
Figure 1.13 : Cheminée de carbonates de « la Cité Perdue », une source géothermique située près
d‟une dorsale atlantique (p 36).
Figure 1.14 : Contributions relatives des groupes phylogénétiques aux communautés microbiennes
provenant de différents gisements pétroliers en Chine (p 42).
Tableau 1.1 : Bilan des souches isolées dégradant des BTEX (p 18).
Table 1.2 : Main characteristics of Desulfotomaculum species isolated from the deep subsurface (p
54).
CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES.
Figure 2.1 : Concentration de la biomasse du site sur filtre Stérivex (Millipore) (p 65).
Figure 2.2 : Extrapolation par le logiciel ARB de la structure 2D d‟une partie de la molécule d‟ARNr
16S de la souche Bs107 et localisation de la séquence cible de la sonde s107 (p 79).
Tableau 2.1 : Milieux de cultures pour le dénombrement (p 66).
Tableau 2.2 : Composition des différents milieux synthétiques utilisés au cours de cette étude (p 67).
Tableau 2.3 : Composition des microcosmes pour la dégradation des BTEX (p 68).
Tableau 2.4 : Concentrations finales des Substrats et accepteurs d‟électrons utilisés pour la
caractérisation de souche (p 71).
Tableau 2.5 : Amorces utilisées en PCR et qPCR (p 75).
Tableau 2.6 : Programmes utilisés PCR et qPCR (p75).
Tableau 2.7 : Liste des sondes FISH utilisées lors de cette étude (p 79).
CHAPITRE 3 : CARACTERISATION D’UN CONSORTIUM
MICROBIEN DEGRADANT LES BTEX COMPOSE DE DEUX
NOUVELLES ESPECES DE DESULFOTOMACULUM (SITE C).
Figure 3.1 : Degradation of BTE in the B1 microcosm (p 94).
Figure 3.2 : Effects of inhibitors addition on BTE (10 ppm) biodegradation in microcosms originated
from successive enrichments of community B1 (p 95).
Figure 3.3 : δ13
C and δ2H of residual benzene fraction versus benzene degradation rate under sulfate-
reduction (p 96).
Figure 3.4 : Maximum-likelihood tree based on 16s rRNA gene (1115 bases) showing the
phylogenetic relationship between the B1 microcosm sequences and closest relatives (p 97).
CHAPITRE 4 : IDENTIFICATION DES MICROORGANISMES
RESPONSABLES DE LA DÉGRADATION DE TOLUÈNE ET
ISOLEMENT D’UNE NOUVELLE ESPÈCE DE MESOTOGA (SITE A).
ARTICLE 3 :
Figure 4.1 : Biodegradation of fully labeled toluene and production of
13C7-benzylsuccinate (p 115).
Figure 4.2 : Relative abundance of 13
C-labeled and non-labeled 16S rRNA gene from Haladaptus
paucihalophilus measured by qPCR in each gradient fraction (p 116).
Figure 4.3 : Bacterial 16S rRNA gene T-RFLP fingerprints of SIP gradient fractions retrieved from 12
C and 13
C-toluene amended microcosms after 0, 20 and 40% of toluene-degradation (corresponding
to days 0, 14 and 16 and to the production of 0, 150 and 300 ng.L-1
of benzylsuccinate) (p 117).
ARTICLE 4:
Figure 4bis.1 : A: Phase-contrast photomicrograph showing cells of strain VNs100T (bar 10 μm); B:
thin-section electron micrograph of strain VNs100T showing the Gram-negative type of cell wall (bar
0.2 μm) (p 126).
Figure 4bis.2 : Maximum likelihood phylogenetic tree of SSU rRNA (1172 unambiguously aligned
nucleic acid positions analysed) based on Neighbour-Joining method showing the position of strain
VNs100T among the order Thermotogales. Thermoanaerobacter brockii and Ammonifex thiophilus
were used as outgroup (p 130).
Table 4bis.1 : Differential characteristics between strain VNs100T and M. prima (p 128).
Table 4bis.2 : Identification of dominant fatty acids in strain VNs100T and M. prima (p 128).
CHAPITRE 5 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION D’UNE
NOUVELLE ESPECE DE DESULFOTOMACULUM (SITE D)
Figure 5.1 : Maximum-likelihood tree based on 16S rRNA gene (1145 bases) showing the
phylogenetic relationship between strain Ss001 and closest relatives (p 144).
Figure 5.2 : Maximum-likelihood tree based on dsrAB gene (1556 bases) showing the phylogenetic
relationship between strain Ss001T and closest relatives (p 145).
Table 5.1 : Differential characteristics between strain Ss001
T and related Desulfotomaculum species (p
142).
1
Introduction générale
2
La France est dépendante de ses importations en gaz naturel puisque 98% de celui-ci
est importé (source : Commission de régulation de l‟Energie). Comme dans plusieurs autres
pays (Etats-Unis, Canada, Grande Bretagne, Autriche, Allemagne, etc.), le gaz est stocké pour
pallier les variations saisonnières de consommation et sécuriser les approvisionnements vis-à-
vis notamment des aléas climatiques, de crises géopolitiques ou voire de spéculations
boursières. Le stockage est réalisé dans des structures géologiques profondes de très grandes
capacités, comme des aquifères souterrains profonds. Le gaz naturel bien que principalement
composé de méthane contient également des traces d‟autres composés parmi lesquels figurent
les BTEX (benzène, toluène, éthylbenzène et les trois isomères du xylène) qui, bien que
présents dans des concentrations de l‟ordre de quelques parties par milliard (ppb), sont des
composés indésirables dans les eaux. Les deux opérateurs de stockage de gaz naturel en
France, Storengy (12 sites) et TIGF (2 sites), poursuivent depuis 1998 un ambitieux
programme de recherche (GAZELLE, IMPALAS) destiné à évaluer le potentiel d‟atténuation
naturelle de composés hydrocarbures monoaromatiques dans les aquifères de stockage de gaz
naturel.
La connaissance de la microbiologie des milieux profonds est, à ce jour, très
incomplète. Relativement peu d‟études ont été réalisées sur le sujet de par la difficulté à
collecter des échantillons représentatifs de la population indigène à de telles profondeurs.
Néanmoins, dans le cadre de ce projet de recherche, une procédure permettant un
prélèvement représentatif en aquifère de stockage a été mise au point (Basso et al., 2005b).
Cette étape primordiale a permis d‟étudier la diversité microbienne dans l‟aquifère ainsi que
la mise en place d‟expériences de biodégradation des BTEX en microcosmes. Ainsi, des
communautés microbiennes ayant la capacité à dégrader les BTEX ont été obtenues en
laboratoire à partir des eaux de plusieurs sites de stockage de gaz naturel. Ces résultats
suggèrent que la biodégradation contribue à l‟atténuation naturelle des hydrocarbures
monoaromatiques in situ.
Afin de mieux comprendre cette atténuation naturelle, les communautés microbiennes
capables de dégrader les BTEX ont été caractérisées. Des techniques de microbiologie ont
permis de dénombrer les microorganismes et de définir les groupes métaboliques impliqués
dans la dégradation. Les cinétiques de dégradation ont été majoritairement obtenues en
condition de sulfato-réduction, ce qui suggère une forte implication des bactéries sulfato-
réductrices. De plus, depuis le début du programme de recherche, plusieurs souches
3
microbiennes ont été isolées et ont fait l‟objet d‟articles de caractérisation (Basso et al., 2005a
; Klouche et al., 2007 ; Klouche et al., 2009 ; Ben Hania et al., 2013). Cependant, aucune
d‟entre elles n‟a montré une capacité à dégrader les BTEX en culture pure.
Des outils de biologie moléculaire ont également été mis en place afin d‟affiner la
caractérisation et d‟identifier les espèces microbiennes présentes au sein des communautés
d‟intérêt. Ces analyses ont permis de confirmer la présence majoritaire de microorganismes
sulfato-réducteurs dans les microcosmes étudiés et ont fait l‟objet de deux publications (Basso
et al., 2009 ; Berlendis et al., 2010). Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse
s‟inscrivent dans la continuité de ceux réalisés jusqu‟à présent dans le cadre du projet de
recherche IMPALAS. Ils ont pour but de poursuivre la caractérisation des communautés
microbiennes dégradant les BTEX obtenues sur différents sites de stockage (un prélèvement
par an en moyenne), mais également d‟identifier précisément les microorganismes
responsables de la dégradation des BTEX. C‟est via cette identification et la caractérisation
détaillée des microorganismes identifiés que pourront être développés des bio-marqueurs
caractéristiques de la dégradation des BTEX.
Ce manuscrit est composé de plusieurs chapitres dont trois de résultats présentés sous
forme de publications. Le premier chapitre détaille l‟état actuel des connaissances sur les
stockages de gaz en France, sur la biodégradation des BTEX et sur l‟importance du genre
Desulfotomaculum au sein des environnements très profonds. Ce dernier volet a également
fait l‟objet d‟une revue qui est présentée dans ce manuscrit et conclue la fin de ce premier
chapitre.
Le deuxième chapitre détaille les procédures expérimentales employées au cours des
études détaillées dans les chapitres suivants. Le troisième chapitre concerne les prélèvements
réalisés sur le site C en 2000. Un article décrivant une communauté microbienne dégradant les
BTE issue de ce site y est présenté. Cette communauté a fait l‟objet de multiples expériences
depuis son échantillonnage qui ont conduit à sa simplification. La communauté est
aujourd‟hui constituée de seulement deux souches microbiennes qui sont toutes les deux
affiliées au genre Desulfotomaculum. Les travaux présentés dans cet article ont pour but de
mieux comprendre le rôle de ces deux souches au cours de la dégradation.
4
Le quatrième chapitre traite d‟une communauté microbienne dégradant les BTEX
issue du stockage du site A qui a déjà fait l‟objet d‟une publication (Berlendis et al., 2010).
Cependant, les travaux réalisés en 2010 ont permis de décrire la communauté sans toutefois
identifier les microorganismes responsables de la dégradation des BTEX. Le premier article
présenté dans ce chapitre de résultats présente les organismes clés impliqués dans cette
dégradation mis en évidence par la technique de DNA-SIP. Quant au deuxième article, il
décrit la caractérisation d‟une nouvelle espèce isolée à partir de ce site d‟échantillonnage,
« Mesotoga infera ».
Le cinquième et dernier chapitre de résultats décrit la caractérisation de l‟espèce
« Desulfotomaculum paucivorans », une nouvelle espèce isolée à partir d‟une communauté
microbienne dégradant le p-xylène et issue du stockage du site D.
Les conclusions tirées de ces études ainsi que les perspectives qui en découlent sont
commentées en fin de manuscrit.
5
Chapitre 1 : Synthèse
Bibliographique
6
Chapitre 1
7
1. Le stockage de gaz naturel en aquifère.
1.1 Généralités sur les stockages de gaz naturel.
La consommation de gaz naturel en France connait un essor considérable depuis les
années 60. En effet, nous sommes passés de 3 milliards de m3 par an en 1960, à 20 milliards
en 1976, pour en arriver, aujourd‟hui, à une consommation de l‟ordre de 40 milliards de m3
par an. Cependant, les ressources naturelles du pays sont très faibles et plus de 98% du gaz
utilisé est donc importé. Ces importations en provenance de Norvège, de Russie, des Pays-Bas
ou d‟Algérie se font de façon continue tout au long de l‟année via des réseaux de transport
internationaux. En revanche, la consommation n‟est pas constante, elle fluctue en fonction des
saisons. Elle est maximale en hiver lorsque les foyers sont chauffés (7,7 GNm3 par mois
1) et
minimale en été (1,5 GNm3 par mois). Les industriels du gaz en France disposent de sites de
stockage qui permettent de couvrir les besoins en gaz toute l‟année (Fig. 1.1).
Figure 1.1: Carte des sites de stockage de gaz naturel en France (Plaquette TIGF).
Ainsi, le gaz importé en excès d‟Avril à Novembre est stocké puis il est soutiré de
Novembre à Avril, lorsque les importations sont inférieures à la consommation (Fig. 1.2).
1 Le normo mètre cube (Nm
3) est une unité de mesure de quantité de gaz qui correspond au contenu d'un volume
de un mètre cube, pour un gaz se trouvant à 0°C et à pression atmosphérique.
Chapitre 1
8
Figure 1.2 : Chroniques simplifiées des volumes de gaz dans le stockage d‟Izaute. Figure adaptée à
partir d‟un rapport d‟étude réalisée dans le cadre des opérations de Service Public du BRGM
02PIR318 (2003). Rose : période hivernale ; vert : période estivale.
Les stockages de gaz sont réalisés dans des couches géologiques poreuses appelées
« réservoirs » qui doivent répondre à trois exigences principales :
- Le gaz doit y être confiné, sans fuite possible vers la surface ni vers d‟autres couches
géologiques. Pour cela les couches géologiques situées autour du réservoir doivent être
imperméables.
- La capacité du réservoir doit être très grande : de plusieurs centaines de millions à
quelques milliards de m3.
- Il doit être possible d‟y injecter et d‟en soutirer efficacement des quantités
importantes de gaz : plusieurs millions de m3 par jour.
On distingue trois types de structures permettant d‟abriter un stockage de gaz naturel :
les aquifères, les gisements « déplétés » et les cavités salines. Les deux premières sont celles
qui permettent de stocker le plus de gaz mais impliquent de fortes contraintes liées à la
porosité du milieu. Les cavités salines ne présentent pas cet inconvénient, mais ont une
capacité réduite, elles sont donc utilisées pour des besoins immédiats mais ponctuels
(consommation de pointe). Peu de gisements « déplétés » étant recensés en France, le
stockage est donc réalisé en aquifères.
500
1000
1500
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2500
3000
0
Sto
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01
Date
Injection
Soutirage
Chapitre 1
9
1.2. Les stockages en aquifères.
Un aquifère est une couche géologique poreuse (sables, grès, calcaires, …) contenant
de l‟eau à l‟intérieur des pores. Pour pouvoir être utilisé à des fins de stockage, un aquifère
doit être surplombé d‟une couche géologique imperméable et avoir une structure anticlinale
(Fig. 1.3). Ainsi, lorsque le gaz est injecté dans ce réservoir, la pression doit être suffisante
pour repousser l‟eau et emprisonner le gaz entre la couverture imperméable située au-dessus
et l‟eau située en dessous : on parle alors de « bulle de gaz ». De telles structures géologiques
sont généralement trouvées en profondeur (plus de 500 mètres).
Figure 1.3 : Structure d‟un site de stockage de gaz en aquifère. 1 : Station centrale, 2 : Puits
d‟exploitation, 3 : Puits de contrôle de la nappe d‟eau, 4 : Puits de contrôle de l‟aquifère supérieur, 5 :
Aquifère.
0 m
≈ 500 m
≈ 1000 m
1
5
4
3
2
3
Chapitre 1
10
La pression appliquée lors de l‟injection du gaz permet de faire descendre le niveau
d‟eau dans le réservoir. La capacité de ce-dernier est donc d‟autant plus grande que la
pression est forte. Le stockage de gaz en aquifère est règlementé et une augmentation de la
capacité de stockage ne peut se faire sans l‟approbation de l‟état. De plus, il existe une limite
physique à la capacité du réservoir : le point d‟ensellement ou point de fuite. Il s‟agit du
niveau le plus bas que l‟interface eau-gaz puisse atteindre avant que le gaz ne fuie hors de la
structure anticlinale du stockage (Fig. 1.3).
1.3. Fonctionnement d‟un site de stockage.
1.3.1. Les puits.
Le gaz est soutiré et injecté dans le réservoir à travers
plusieurs puits d‟exploitation. Ces puits sont constitués d‟un
assemblage de pièces qui permettent d‟assurer la sécurité du
stockage. Ces pièces sont conçues de manière à pouvoir
contrôler divers mécanismes depuis la surface. Ainsi, diverses
vannes et obturateurs pourront être fermés en cas de fuite ou de
surpression détectée dans la canalisation. Un puits est constitué
de deux tubes concentriques : un « tubing » métallique à
l‟intérieur duquel passe le gaz et un « casing » en ciment pour
le protéger. L‟espace annulaire séparant le métal du ciment est
rempli de saumure (Fig. 1.4). L‟extrémité de la canalisation
située dans le réservoir est constituée de crépine et de sable
calibré. Ainsi, la remontée des petites particules provenant du
réservoir, telles que du sable, est limitée lors du soutirage, ce
qui préserve les conduites de l‟abrasion.
Les puits d‟exploitation, ou puits de type 1, ne sont pas les seuls que l‟on peut trouver
sur un site de stockage (Fig. 1.3). Il existe des puits qui permettent de contrôler la pression
dans la bulle de gaz. D‟autres puits permettent de contrôler la qualité de la nappe d‟eau de
l‟aquifère. D‟autres encore, permettent de surveiller l‟interface gaz/eau et sont des témoins du
niveau d‟eau dans le stockage.
Figure 1.4 : schéma de
principe d‟un puits
d‟exploitation (Plaquette Elf
Aquitaine).
Chapitre 1
11
1.3.2. Injection et Soutirage : des gisements aux particuliers.
Le gaz est importé des pays ayant des ressources naturelles par pipeline (ou par des
navires méthaniers). Ces conduits forment un réseau qui achemine le gaz vers les divers sites
de stockage français. Une fois sur place le gaz est généralement compressé puis injecté dans
l‟aquifère.
Lors du soutirage, le gaz extrait du réservoir est purifié avant d‟être distribué vers les
agglomérations (Fig. 1.5). Dans un premier temps, un séparateur, permet d‟enlever l‟eau libre
(fines gouttelettes) en sortie de puits. Par la suite, le gaz passe par une colonne de
déshydratation qui élimine l‟eau sous forme de vapeur grâce à du triéthylène glycol. Il
traverse ensuite une colonne de désulfuration afin d‟éliminer toutes traces de sulfures. Cette
étape dépend du taux de sulfure mesuré en sortie de puits : sur certains sites, la désulfuration
n‟est utilisée qu‟en fin de soutirage, période durant laquelle les concentrations de sulfure dans
le gaz sont les plus élevées. Enfin, après avoir été odorisé avec du tétrahydrothiophène (THT)
pour des raisons de sécurité, le gaz est compressé et redistribué dans le réseau pour la
consommation.
Figure 1.5 : Parcours du gaz lors de l‟injection et du soutirage (Communication personnelle TIGF).
1.4. Le gaz naturel et les BTEX.
Le gaz naturel injecté dans les sites de stockage est composé en grande majorité de
méthane (teneur minimale de 90% mais variable selon l‟origine), et contient une faible
Tête de
puit
CompressionSéparateur
Colonne de
déshydratation
Colonne de
désulfuration
InjectionSoutirage
Réseau de
transport
Tête de
puit
CompressionSéparateur
Colonne de
déshydratation
Colonne de
désulfuration
InjectionSoutirage
Tête de
puit
CompressionSéparateur
Colonne de
déshydratation
Colonne de
désulfuration
InjectionSoutirage
Réseau de
transport
Chapitre 1
12
proportion d‟hydrocarbures plus lourds (moins de 10%). Parmi ceux-ci, le benzène, le
toluène, l‟éthylbenzène et les trois isomères du Xylène (BTEX) sont présents à l‟état de traces
(Fig. 1.6).
Figure 1.6 : Structure chimique du benzène, toluène, éthylbenzène, ortho-, méta- et para-xylènes.
Ces hydrocarbures aromatiques présentent la particularité d‟être des composés
toxiques et solubles dans l‟eau (voir partie 2.1.). Au contact de l‟eau, dans le réservoir, une
certaine proportion de ces BTEX va être dissoute : cette proportion est variable selon le
composé considéré. Les puits de contrôle de la nappe d‟eau ne détectent que rarement des
traces de BTEX et seulement sur les puits les plus proches de la bulle de gaz. Ceci s‟explique
d‟une part par un déplacement généralement très lent de l‟eau de l‟aquifère profond (de
l‟ordre de 1 mètre par an) et d‟autre part par l‟activité même de stockage (qui génère certes de
fortes variations de pression, mais cycliquement dans les deux sens), attirant et repoussant
alternativement la masse d‟eau, mais maintenant ainsi les composés dissous à proximité de la
bulle de gaz. La dispersion des BTEX dissous dans l‟eau est donc lente et peu étendue.
Cependant, les bilans de matière réalisés sur un site de stockage sur une année (les
concentrations en BTEX sont mesurées en continu lors de l‟injection et du soutirage ; celles-ci
sont pondérés des volumes pour le calcul de matière) montrent qu‟une certaine quantité de
BTEX n‟est pas restituée par le stockage. Cette observation et celle d‟un fractionnement
isotopique du carbone et de l‟hydrogène des BTEX au soutirage suggèrent la dégradation
biologique des BTEX in situ.
1.5. L‟échantillonnage en aquifère de stockage.
De nombreuses études microbiologiques traitent de la dégradation des BTEX par des
microorganismes. Cependant, pour savoir si de tels processus peuvent avoir lieu en aquifères
de stockage, il faut être capable de prélever des microorganismes dans la bulle de gaz ou dans
l‟eau au contact de la bulle de gaz. A ce jour aucun protocole permettant de réaliser un
prélèvement représentatif des microorganismes dans la bulle de gaz n‟a pu être mis en place.
Chapitre 1
13
Ceci est dû aux contraintes de sécurité mises en jeu à de telles pressions. En revanche, il est
désormais possible de récupérer de l‟eau de l‟aquifère en limitant au maximum le risque de
contamination de l‟échantillon.
Des recherches ont été effectuées dans le cadre de la thèse d'Odile Basso afin de
mettre en place un protocole de nettoyage de puits. Au cours de ces travaux, un protocole a
été établi afin de limiter les risques de contamination liés au contact du matériel (puits, tubes)
avec l‟eau échantillonnée (Basso, 2005). En effet, sans nettoyage des équipements du puits
d‟échantillonnage, les risques sont nombreux : contamination par des biofilms développés sur
les surfaces des conduits (Hirsch et Radesrohkohl, 1988 ; Pedersen et al., 1997), injection de
microorganismes exogènes lors de l‟échantillonnage (Gorlatov et Belyaev, 1984). Le
protocole mis au point consiste à purger le système, puis à réaliser un nettoyage mécanique
(brossage avec du matériel élaboré spécifiquement), suivi d‟une nouvelle purge pour éliminer
les plus grosses particules afin d‟éliminer les microorganismes. Trois injections
d‟hypochlorite de sodium en fond de puits sont finalement effectuées avant une ultime purge
pour éliminer les traces de chlore.
Les travaux de Basso (Basso, 2005) ont permis de rendre les échantillonnages d‟eau
représentatifs des communautés des aquifères de stockage. Des études de diversité réalisées
par Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP), ont montré que le
nombre total de bactéries dénombrées dans les échantillons d‟eau décroit au cours de la
procédure de nettoyage. De plus, les bactéries qui apparaissent comme majoritaires dans
l‟échantillon collecté après la purge initiale sont différentes de celles retrouvées après
chlorations (Basso et al., 2009 ; Berlendis et al., 2010).
2. Les BTEX dans l’environnement.
2.1. Généralités.
Les BTEX (Fig. 1.6) ont une origine naturelle, on les retrouve notamment dans le
pétrole brut, le gaz naturel, ou même produits par des microorganismes : c‟est le cas de
Toluomonas auensis qui produit du toluène à partir de phénylalanine (Fischer-Romero et al.,
1996). L‟activité anthropique a néanmoins engendré leur transport et leur accumulation ce qui
peut nuire à l‟environnement en cas de fuites (Widdel et Rabus, 2001). Les BTEX se
caractérisent par leur volatilité et leur relativement grande solubilité dans l‟eau. Parmi ces
Chapitre 1
14
composés le benzène est le plus soluble (1,78 g/L) suivi du toluène (0,515 g/L), des trois
isomères du xylène (de 0,175 à 0,2 g/L) et de l‟éthylbenzène (0,152 g/L) (Agteren et al.,
1998).
Ces hydrocarbures aromatiques sont utilisés à des fins industrielles. Tous ces
composés entrent, notamment, dans la composition de l‟essence. Par ailleurs, ces molécules
sont également utilisées dans d‟autres domaines tels que la cosmétique et l‟industrie chimique
(production de phénol, de caoutchouc, de TNT, …) pour le toluène ou encore la fabrication de
matériaux tels que le polystyrène (pour l‟éthylbenzène) ou des polymères de type téréphtalate
(pour le xylène). Ainsi, le xylène apparaît dans les 30 produits chimiques les plus produits aux
Etats-Unis en termes de volume (U.S. Department Of Health And Human Services2). En ce
qui concerne le benzène, son utilisation comme solvant a fortement diminué à cause de sa
toxicité élevée.
Ces hydrocarbures mono-aromatiques sont tous considérés comme toxiques,
néanmoins les organes-cibles ne sont pas les mêmes pour tous ces composés. Les BTEX sont
néfastes pour les systèmes nerveux central et respiratoire et le benzène peut également causer
des problèmes sanguins tels que des leucémies. (Fiches toxicologiques INRS3).
De par l‟absence de groupes fonctionnels, les BTEX sont peu réactifs chimiquement.
Cependant, leur biodégradabilité a déjà été mise en évidence dans diverses conditions. Ces
processus biologiques étant largement référencés, ils seront décrits de façon non-exhaustive
dans la partie suivante.
2.2. Biodégradation des BTEX.
Les processus de biodégradation des hydrocarbures aromatiques dépendent de
l‟accepteur terminal d‟électrons utilisé par les microorganismes. La littérature la plus
abondante concerne la dégradation aérobie. Dans ce cas des enzymes appelées mono- ou
dioxygénases permettent d‟incorporer un ou deux atomes d‟oxygène dans le cycle carboné
pour donner des produits hydroxylés. Ce type de réaction est connu depuis le début du 20ème
siècle (Sohngen, 1913 ; Marr et Stone, 1961 ; Gibson, 1970 ; Hopper, 1978).
Les zones contenant des BTEX n‟étant pas toujours pourvues d‟oxygène (réservoirs
pétroliers, aquifères profonds, …), la question d‟une potentielle dégradation de ces composés
2 http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/chem_background/exsumpdf/xylene.pdf
3 http://www.inrs.fr
Chapitre 1
15
en anaérobiose a été soulevée mais elle est longtemps restée sans réponse. Ce n‟est que dans
les années 80 que des preuves de l‟existence de tels processus ont été révélées (Kuhn et al.,
1985 ; Wilson et al., 1986).
2.2.1. Les communautés bactériennes naturelles dégradant les BTEX.
La capacité de certains consortia microbiens à dégrader les BTEX en conditions
anoxiques a été démontrée dans divers environnements, et ce, avec une large gamme
d‟accepteur terminaux d‟électrons. C‟est notamment le cas en sulfato-réduction (Muller et al.,
2009), nitrate-réduction (Van Der Zaan et al., 2012), ferri-réduction (Anderson et al., 1998),
en conditions méthanogènes (Masumoto et al., 2012) ou encore avec des acides humiques
comme accepteurs d‟électrons (Cervantes et al., 2011). La biodégradabilité de tous les BTEX
a déjà été mise en évidence dans des enrichissements bactériens. Ces communautés ont, dans
un premier temps, été caractérisées via des études de microbiologie classique consistant à
cultiver les bactéries présentes dans les écosystèmes contaminés. Ces études ont cependant
peu apporté à la compréhension de la biodégradation des BTEX en anaérobiose. Les
écosystèmes étudiés, sédiments ou aquifères superficiels, contiennent en effet une très grande
variété de microorganismes dont la plupart ne sont probablement pas impliqués directement
dans la biodégradation. Elles ont, toutefois, confirmé assez souvent le rôle de groupes
bactériens particuliers selon les accepteurs d‟électron disponibles :
- Prédominance des β-protéobactéries dans les cas de dénitrification (Rabus et al.,
1999).
- Présence constante des bactéries du genre Geobacter associées à la biodégradation en
condition de réduction du Fer(III) (Rooney-Varga et al., 1999).
- Prédominance des δ-protéobactéries dans les écosystèmes contenant du sulfate (Zarda
et al., 1998).
Loin de simplifier l‟interprétation de ces résultats, l‟introduction des techniques de
biologie moléculaire basées sur l‟étude du gène de l‟ARNr 16S (clonage-séquençage, T-
RFLP, FISH, …) a montré qu‟un très grand nombre de microorganismes des échantillons
étudiés appartiennent à des espèces bactériennes qui n‟ont jamais pu être cultivées, et dont les
propriétés sont en conséquence totalement ignorées (Dojka et al., 1998 ; Phelps et al., 1998 ;
Ficker et al., 1999 ; Rooney-Varga et al., 1999). Néanmoins, des études basées sur ces
techniques permettent d‟émettre quelques hypothèses. Ainsi, dans le cas d‟une communauté
bactérienne sulfato-réductrice dégradant le benzène, Abu Laban et ses collègues (2009) ont
Chapitre 1
16
émis l‟hypothèse que la minéralisation complète du benzène associée à l‟apparition de phénol
pouvait être réalisée par un membre du genre Desulfotomaculum du sous-groupe Ih puisque
ce dernier semblait être dominant selon les profils T-RFLP ainsi que les dénombrements par
la technique FISH. Bien qu‟aucune preuve expérimentale n‟ait pu étayer cette hypothèse, une
syntrophie reste probable dans ce cas puisque les membres du sous-groupe Ih sont de stricts
syntrophes et ont perdu la capacité de réduire les sulfates (Imachi et al., 2006).
Les techniques d‟isolement peuvent permettre d‟étudier les mécanismes de biodégradation
anaérobie des BTEX en détails.
2.2.2. Les souches pures capables de dégrader les BTEX.
Les techniques d‟isolement ont permis de mettre en évidence certaines souches
capables de dégrader seules les BTEX (Tableau 1.1). De nombreux microorganismes
dégradant le toluène ont notamment été découverts, et ce, quel que soit l‟accepteur d‟électron
utilisé. L‟éthylbenzène, le m-xylène et le o-xylène ont également pu être dégradés par
plusieurs souches pures notamment en condition de réduction des nitrates et en sulfato-
réduction.
Les deux autres composés, le benzène et le p-xylène, semblent plus récalcitrants. Si
sept souches pures sont répertoriées à ce jour comme dégradant le benzène, Zhang et ses
collaborateurs affirment que les ferri-réducteurs Geobacter metallireducens, Geobacter sp.
Ben et Ferroglobus placidus sont les seules souches dégradant réellement le benzène en
anaérobiose (Zhang et al., 2012). En effet, selon plusieurs études, la dégradation en nitrate
réduction impliquerait de l‟oxygène et des enzymes de la voie de dégradation aérobie du
benzène (voir partie 2.3.1.1). Par ailleurs, aucune preuve de la biodégradabilité du benzène
par une souche pure sulfato-réductrice n‟a été apportée à ce jour.
Contrairement aux autres isomères du xylène, une seule souche pure a montré une
capacité de dégradation du p-xylène en anaérobiose. Cette dégradation a été observée en
sulfato-réduction chez une souche proche de Desulfosarcina ovata (Higashioka et al., 2012).
La technique d‟isolement permet de poser les jalons d‟une étude approfondie des
processus de dégradation anaérobie des BTEX. C‟est à partir des souches pures isolées que les
enzymes impliquées dans ces voies de dégradation vont pouvoir être étudiées (identification
des gènes, purification des enzymes, réalisation de mutants, …). Cette technique présente
néanmoins l‟inconvénient d‟être basée sur des techniques de cultures qui ne donnent l‟accès
qu‟à une infime partie de la biodiversité des échantillons.
Chapitre 1
17
Tableau 1.1 : Bilan des souches isolées dégradant des BTEX4 (Weelink et al., 2010).
4 Les accepteurs d‟électrons utilisés sont mentionnés en regard de chaque souche.
Souches Nom complet ou microorganisme le plus proche
(% d'identité basée sur le 16S rRNA)
Références
B T E mX pX oX
Strain T Azoarcus sp. strain T NO3- NO3
-Dolfing et al., 1990
GS-15 Geobacter metallireducens Fe3+ Fe3+ Lovley et al., 1990 ;
Zhang et al., 2012
K172 Thauera aromatica NO3- Schocher et al., 1991
T1 Thauera aromatica T1 NO3- Evans et al., 1991
Tol-2 Desulfobacula toluolica SO42- Rabus et al., 1993
8 souchesAzoarcus tolulyticus Tol4, Azoarcus tolulyticus
Td15, Azoarcus toluvorans Td21NO3
- NO3- Fries et al., 1994
4 souches Aromatoleum aromaticum sp. EbN1 NO3- NO3
- NO3- Rabus et al., 1995,
Wohlbrand et al., 2007
EB1 Azoarcus sp. strain EB1 NO3- Ball et al., 1996
PRTOL1 Desulforhabdus amnigenus (96%) SO42- Beller et al., 1996
63 souches Azoarcus toluclasticus NO3- Fries et al., 1997
14 souches Azoarcus tolulyticus (97-98%) NO3- NO3
- Hess et al., 1997
TRM1 Desulfocapsa thiozymogenes (93%) SO42- Meckenstock 1999
oXyS1 Desulfosarcina ovata (98.7%) SO42- SO4
2- Harms et al., 1999b
mXyS1 Desulfococcus multivorans (86.9%) SO42- SO4
2- Harms et al., 1999a
pCyN1 Aromatoleum aromaticum sp. EbN1 (100%) NO3- Harms et al., 1999a
ToP1 Blastochloris sulfoviridis photo Zengler et al., 1999
TACP Geobacter grbiciae TACP Fe3+ Coates et al., 2001a
RCB Dechloromonas aromatica RCB NO3- NO3
- NO3- NO3
- NO3- Chakraborty et al., 2005
JJ Dechloromonas sp. JJ NO3- NO3
- Coates et al., 2001b
SS Thauera aminoaromatica S2 NO3- Mechichi et al., 2002
EbS7 Strain mXyS1 (96%) SO42- Kniemeyer et al., 2003
OX39 Desulfotomaculum sp. R-acetonA170 (96%) SO42- SO4
2- SO42- Morasch et al., 2004
Y5 Desulfosporosinus meridiei (97%) AsO43- Liu et al., 2004
DNT-1 Thauera aminoaromatica (99%) NO3- Shinoda et al., 2004
4 souches Magnetospirillum magneticum AMB-1 (99%) NO3- Shinoda et al., 2005
Souche 480 Desulfosarcina cetonica SO42- Kuever et al., 2005
DN11 Azoarcus evansii (99%) NO3- Kasai et al., 2006
AN9 Azoarcus sp. ToN1 (99%) NO3- Kasai et al., 2006
H3 Desulfotignum toluenicum SO42- Ommedal et al., 2007
G5G6 Georgfuchsia toluolica NO3- NO3
- Weelink et al., 2009
TMJ1 Geobacter toluenoxydans Fe3+ Kunapuli et al., 2010
UKTL Desulfitobacterium aromaticivorans Fe3+ Fe3+ Kunapuli et al., 2010
AEDII12DO Ferroglobus placidus Fe3+ Holmes et al., 2011
4 souchesSedimenticola selenatireducens (96%),
Halomonas salina (99%), Oceanicola sp40 (93%)NO3
- NO3- Alain et al., 2012
PP31 Desulfosarcina ovata (98%) SO42- Higashioka et al., 2012
Ben Geobacter daltonii (99%) Fe3+ Fe3+ Zhang et al., 2012
Croissance en présence de
Chapitre 1
18
2.2.3. Les espèces responsables de la dégradation des BTEX identifiées par
Stable Isotope Probing (SIP).
La technique SIP présente l‟avantage de s‟affranchir des biais des techniques de
culture pour l‟identification de microorganismes responsables de la dégradation primaire des
BTEX (Bastida et al., 2011 ; Cupples, 2011). La majorité des études réalisées via la technique
SIP ont été consacrées au benzène et au toluène. Ainsi, nous savons aujourd‟hui que des
microorganismes affiliés aux Peptococcaceae (Van Der Zaan et al., 2012) et plus
particulièrement aux genres Pelotomaculum (Herrmann et al., 2010 ; Taubert et al., 2012) et
Thermincola (Kunapuli et al., 2007) participent activement à la dégradation du benzène. Ces
résultats corroborent l‟idée d‟une importance majeure des Peptococcaceae dans des milieux
riches en hydrocarbures tels que les gisements pétroliers (voir partie 3.). De plus, certaines
Delta-protéobactéries (Oka et al., 2008 ; Sakai et al., 2009) ou Beta-protéobactéries telles que
Pelomonas (Liou et al., 2008) ou Azoarcus (Kasai et al., 2006), ont également été identifiées
comme des microorganismes participant activement à la dégradation anaérobie du benzène.
En ce qui concerne le toluène, les résultats sont similaires avec notamment l‟identification de
Peptococcaceae telles que des Desulfotomaculum (Winderl et al., 2010) ou encore des Delta-
protéobactéries (Bombach et al., 2010 ; Pilloni et al., 2011 ; Sun et Cupples, 2012). Très peu
d‟études concernant la dégradation de l‟éthylbenzène et du xylène ont été réalisées via la
technique SIP. En effet, celle-ci nécessite un marquage de tous les carbones du substrat utilisé
pour que la sensibilité soit suffisante, et de tels composés ne sont pas disponibles dans les
catalogues de molécules marquées. Néanmoins, un laboratoire allemand a récemment réussi à
identifier des Delta-protéobactéries comme responsables de la dégradation de méta-xylène en
sulfato-réduction (Bozinovski et al., 2012). Pour cela, ils ont utilisé du m-xylène marqué
uniquement sur les deux groupements méthyl et la technique de protein-SIP.
A ce jour, la technique SIP permet donc d‟identifier des microorganismes responsables
de la dégradation de certains BTEX. Cette technique fournit également des indices permettant
d‟affiner les milieux de culture afin d‟isoler plus facilement les souches susceptibles de
dégrader les BTEX en culture pure (Kasai et al., 2006b). En effet, les caractéristiques du
genre ou de l‟espèce identifiée par SIP peuvent être utilisées afin d‟établir une stratégie
d‟isolement. La technique SIP est donc un moyen d‟accélérer la compréhension des voies
métaboliques de dégradation des BTEX en anaérobiose.
Chapitre 1
19
2.3.Les voies métaboliques de dégradation des BTEX en anaérobiose.
2.3.1. Le benzène.
Les voies métaboliques de la dégradation anaérobie du benzène sont toujours
inconnues à ce jour. Cependant, l‟identification de métabolites dans des cultures anaérobies
dégradant le benzène ont conduit à émettre l‟hypothèse de trois voies métaboliques possibles.
Toutes ces voies conduisent au benzoyl-CoA qui a été reconnu comme métabolite central de
la dégradation anaérobie de nombreux composés aromatiques (Harwood et al.). L‟étape
initiale d‟activation du cycle est primordiale et, à ce jour, les études sur le sujet suggèrent une
hydroxylation, une méthylation, ou une carboxylation (Fig. 1.7).
Figure 1.7 : Mécanismes hypothétique d‟activation du benzène en anaérobiose. A : hydroxylation ; B :
méthylation ; C : carboxylation (Weelink et al., 2010).
2.3.1.1. Hypothèse n°1 : une hydroxylation.
L‟activation du benzène via l‟addition d‟un groupement hydroxyle (Fig. 1.7A) a été
suggérée par plusieurs auteurs. La détection de phénol dans des consortia microbiens
dégradant le benzène a été réalisée en conditions méthanogènes (Grbic-Galic, 1986 ; Grbic-
Galic et Vogel, 1987 ; Weiner et Lovley, 1998). Cependant, une étude menée sur un autre
Chapitre 1
20
consortium méthanogène a montré que le phénol ne pouvait pas être un métabolite majeur de
l‟activation anaérobie du benzène (Masumoto et al., 2012). Il semble donc que la voie de
dégradation du benzène via le phénol si elle existe ne soit pas nécessairement liée à la
méthanogenèse.
En revanche, l‟origine du groupement hydroxyle pourrait être affectée par l‟accepteur
final d‟électron présent dans le milieu de culture. En effet, une expérience impliquant des
atomes d‟oxygène marqués 18
O en conditions méthanogènes a pu montrer que le groupement
hydroxyle du phénol provenait des molécules d‟eau (Vogel et Grbic-Galic, 1986). Une
expérience similaire réalisée sur la souche RCB du genre Dechloromonas suggère au
contraire que le groupement hydroxyle n‟est pas issu des molécules d‟eau (Chakraborty et
Coates, 2005). Les auteurs de cette étude soulèvent également l‟hypothèse de l‟intervention
de radicaux non hydroxylés dans la transformation du benzène en phénol. Les hypothèses
émises par Chakraborty et Coates sont néanmoins controversées et de nombreuses études
suggèrent que la dégradation du benzène par Dechloromonas RCB n‟est pas réellement un
processus anaérobie. En effet, le génome de la souche RCB ne semble pas être doté de gènes
permettant la dégradation anaérobie des métabolites intermédiaires tels que le phénol
(Salinero et al., 2009). Les gènes intervenant dans la dégradation aérobie du benzène sont,
eux, bien présents. De plus, des études récentes ont révélé l‟existence de microorganismes,
produisant des molécules d‟oxygène à l‟intérieur de leurs cellules via la réduction de nitrate
(Ettwig et al., 2010 ; Zedelius et al., 2011). L‟ensemble de ces résultats suggère, selon
plusieurs auteurs, que la dégradation du benzène en condition de nitrate-réduction
impliquerait les mécanismes de dégradation aérobie (Weelink et al., 2010 ; Meckenstock et
Mouttaki, 2011 ; Vogt et al., 2011).
En outre, deux études récentes ont montré que dans deux communautés bactériennes
dégradant le benzène, l‟une ferri-réductrice (Kunapuli et al., 2008) et l‟autre sulfato-
réductrice (Abu Laban et al., 2009), le phénol produit n‟était probablement pas d‟origine
biologique. En effet, dans ces deux cultures, ce métabolite proviendrait d‟un processus
abiotique d‟auto-oxydation du benzène liée à un contact avec l‟air durant l‟échantillonnage.
Cela pourrait notamment expliquer pourquoi aucun 18
O n‟est retrouvé sur le groupement
hydroxyle du phénol dans les cultures de Dechloromonas RCB incubée en présence de
benzène et d‟H218
O (Kunapuli et al., 2008). Les études relatant une hydroxylation du benzène
en anaérobiose sont donc à considérer avec précaution.
Chapitre 1
21
2.3.1.2. Hypothèse n°2 : une méthylation.
La méthylation du benzène en toluène (Fig. 1.7B) a récemment été mise en évidence
dans un enrichissement en conditions de nitrate-réduction et de méthanogenèse (Ulrich et al.,
2005). Du toluène dont tous les carbones du cycle étaient marqués a pu être détecté après
addition de benzène marqué au 13
C. La provenance du groupement méthyl n‟est, en revanche,
pas connue. De même, la voie de dégradation empruntée par ce toluène et les enzymes
utilisées ne sont pas connues, et bien que la voie du benzylsuccinate soit privilégiée (Ulrich et
al., 2005), aucun des métabolites associés n‟a pu être détecté.
2.3.1.3. Hypothèse n°3 : une carboxylation.
L‟ultime hypothèse formulée à ce jour pour l‟activation du cycle benzénique en
anaérobiose est une carboxylation qui produirait directement du benzoate (Fig. 1.7C).
Néanmoins, toutes les voies de dégradation anaérobies des hydrocarbures mono-aromatiques
décrites à ce jour empruntent la voie du benzoyl-CoA (Boll, 2005). Ainsi, le benzoate pourrait
être un métabolite central des trois voies métaboliques supposées pour la dégradation du
benzène et sa présence ne serait pas nécessairement liée à une carboxylation directe du
benzène. Ce mécanisme d‟activation a cependant déjà été constaté et l‟origine du groupement
carboxyle est discutée. Au début des années 2000, certaines études ont suggéré que ce
groupement puisse provenir de la dégradation du benzène (Caldwell et Suflita, 2000 ; Phelps
et al., 2001), il s‟agirait donc d‟une carboxylation indirecte. Des études plus récentes semblent
désigner le bicarbonate comme origine du groupement carboxyle du benzoate (Kunapuli et
al., 2008 ; Abu Laban et al., 2009), ce qui impliquerait une carboxylation directe.
Récemment, cette voie métabolique a été retrouvée chez Ferroglobus placidus (Holmes et al.,
2011). Les auteurs ont notamment mis en évidence la surexpression de gènes codant pour des
enzymes catalysant la dégradation anaérobie du benzoate. De plus, de faibles quantités de
benzoate accumulé ont été détectées suggérant que ce dernier est un intermédiaire clé dans la
dégradation du benzène.
2.3.2. Le toluène.
La dégradation anaérobie du toluène a été intensément étudiée depuis une quinzaine
d‟année (Heider et al., 1998 ; Widdel et Rabus, 2001). Plusieurs hypothèses ont été évoquées
Chapitre 1
22
pour l‟étape d‟activation : une hydroxylation directe du groupement méthyl (Frazer et al.,
1995), une hydroxylation d‟un des atomes de carbone du cycle (Langenhoff et al., 1997a ;
Langenhoff et al., 1997b) ou une addition de fumarate conduisant au benzylsuccinate
(Leuthner et Heider, 1998 ; Leuthner et al., 1998). C‟est cette dernière réaction qui a le plus
largement été étudiée. Ainsi, toutes les enzymes et tous les intermédiaires de dégradation du
toluène jusqu‟au benzoyl-CoA ont pu être identifiés (Fig. 1.8). La première étape est
catalysée par la benzylsuccinate synthase (bssABC) et permet de former du benzylsuccinate
par addition de fumarate sur la molécule de toluène (Leuthner et Heider, 1998). Cinq
réactions enzymatiques supplémentaires sont nécessaires pour arriver au benzoyl-CoA. Une
benzoyl-CoA réductase (bcrCABD) poursuit le processus qui se termine par la production de
CO2 chez les microorganismes capables d‟une oxydation complète.
Figure 1.8 : Voie de dégradation anaérobie du toluène chez la souche EbN1. BssABC :
benzylsuccinate synthase ; BbsEF : succinyl-CoA: (R)-benzylsuccinate CoA-transferase ; BbsG : (R)-
benzylsuccinyl-CoA déshydrogénase ; BbsH : phenylitaconyl-CoA hydratase; BbsCD :
2[hydroxy(phenyl)methyl]-succinyl-CoA dehydrogenase; BbsAB : benzoylsuccinyl-CoA thiolase
(Kube et al., 2004).
La voie de la bss a pu être observée chez des microorganismes très variés : des nitrate-
réducteurs appartenant aux genres Azoarcus et Thauera (Biegert et al., 1996 ; Beller et
Spormann, 1997), des ferri-réducteurs tel que Geobacter metallireducens (Kane et al., 2002),
des sulfato-réducteurs tel que Desulfobacula toluolica (Rabus et Heider, 1998), des
méthanogènes (Washer et Edwards, 2007)) ou même des phototrophes tel que Blastochloris
sulfoviridis (Zengler et al., 1999). Cette voie est donc considérée comme la voie majeure de
dégradation anaérobie du toluène.
L‟addition de fumarate n‟intervient pas que dans la dégradation du toluène (Von
Netzer et al., 2013). La famille d‟enzymes catalysant ces réactions, celle des FAE (Fumarate-
Chapitre 1
23
Adding Enzymes), est aussi impliquée dans la dégradation d‟autres composés tels que
l‟éthylbenzène et le xylène (voir 2.3.3 et 2.3.4). Cette famille regroupe également des
alkylsuccinate synthases (ASS, (Callaghan et al., 2008)), qui catalysent l‟activation d‟alcanes
et d‟alcènes à longue ou courte chaîne (Widdel et Grundmann, 2010), mais aussi des
naphtylmethylsuccinate synthase (NMS) qui interviennent dans l‟activation du 2-
méthylnaphtalène (Annweiler et al., 2000). L‟addition de fumarate sur un groupement alkyl
est donc une réaction assez universelle d‟activation des hydrocarbures en anaérobiose.
2.3.3. L’éthylbenzène.
A ce jour, la dégradation anaérobie de l‟éthylbenzène n‟a été démontrée qu‟en
condition de respiration des nitrates (Rabus et Widdel, 1995 ; Ball et al., 1996 ; Weelink et
al., 2009) et de sulfato-réduction (Kniemeyer et al., 2003a). Cependant les voies de
dégradation ne sont pas les mêmes selon l‟accepteur final d‟électron (Fig. 1.9).
L‟étape d‟activation chez les microorganismes réducteurs de nitrate étudiés est réalisée
par une éthylbenzène déshydrogénase (Fig. 1.9, ebdABC). Cette enzyme contient du
molybdène, du fer et du sulfure et fait partie de la famille des DMSO réductases (Hille et al.,
1998 ; Boll, 2005). Ces enzymes catalysent des réactions d‟oxydo-réduction qui impliquent le
transfert d‟un atome d‟oxygène (Johnson et al., 2001). Dans le cas de l‟éthylbenzène, la
réaction catalysée par cette enzyme conduit au (S)-1-phényléthanol. Les étapes suivantes de
cette voie métabolique sont une oxydation donnant de l‟acétophénone et une carboxylation
menant au benzoylacétate (Heider, 2007). Comme pour de nombreux composés aromatiques
le benzoyl-CoA et un intermédiaire central de cette voie de dégradation.
L‟unique bactérie sulfato-réductrice connue pour dégrader l‟éthylbenzène à ce jour est
la souche EbS7 et n‟emprunte pas la même stratégie de dégradation. Dans ce cas, comme pour
le toluène, une addition de fumarate est réalisée pour donner du phényléthyl succinate (Fig.
1.9). L‟enzyme catalysant cette réaction peut donc être classée parmi les Fumarate-Adding
Enzymes mais n‟a pas encore été caractérisée. Cette voie de dégradation passe également par
le benzoyl-CoA et est donc strictement analogue à la voie du benzylsuccinate dans le cas du
toluène.
Chapitre 1
24
Figure 1.9 : Etape initiale de la dégradation anaérobie de l‟éthylbenzène. A : Dégradation par
Aromatoleum aromaticum (Kuhner et al., 2005); B : Dégradation par la souche EbS7 (Philipp et
Schink, 2012).
2.3.4. Le xylène.
Une biodégradation anaérobie des trois isomères du xylène a déjà été démontrée dans
diverses conditions mais peu d‟études se sont penchées sur ces voies métaboliques. Krieger et
ses collaborateurs ont néanmoins démontré que le m-xylène était transformé via un
mécanisme proche de celui de la dégradation du toluène c‟est-à-dire l‟addition de fumarate
chez Azoarcus strain T (Krieger et al., 1999). Le gène bssA a d‟ailleurs pu être détecté dans
plusieurs cultures dégradant du xylène (Herrmann et al., 2009). La recherche de métabolites
homologues de ceux obtenus pour le toluène a donné quelques résultats. Ainsi Morasch et
Meckenstock ont pu extraire du 4-méthylbenzylsuccinate et du 4-méthylphénylitaconate
d‟une communauté sulfato-réductrice dégradant du p-xylène (Morasch et Meckenstock,
2005). De la même façon, du 2-méthylbenzylsuccinate fut détecté dans des cultures
d‟Azoarcus strain T. métabolisant le o-xylène (Beller et Spormann, 1997).
Des métabolites similaires ont pu être détectés chez Desulfotomaculum sp. Ox39 ce qui
confirme cette voie de dégradation (Morasch, et al., 2004). Ces résultats confirment que le
genre Desulfotomaculum ou plus largement la famille des Peptococcaceae peuvent intervenir
dans la dégradation anaérobie des BTEX en sulfato-réduction.
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
H2O 2[H] CO2 (+ATP ?)NAD+ NADH + H+
Acetophenone Benzoyl-acetate Benzoylacetyl-
CoA
(S)-1-phényléthanol
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
HS-CoA (+ATP ?)
Fumarate
OH O O
O OH
O
O S-CoA
O-
O-
O
O
O S-CoA
S-CoA
Phenylethyl
succinate2-Phenylpropionyl-
CoA
Benzoyl-CoA
FAE
ebdABC ped apc 1-5 bal
Chapitre 1
25
3. Le genre Desulfotomaculum.
3.1.Définition du genre.
Les Desulfotomaculum sont des bactéries anaérobies strictes, capables de sporuler et
utilisant le sulfate, le sulfite, ou le thiosulfate comme accepteur d‟électrons qu‟elles réduisent
en sulfure d‟hydrogène. Le nom Desulfotomaculum provient du préfixe « desulfo » utilisé
pour désigner la réduction de composés soufrés et du mot latin tomaculum signifiant saucisse
et lié à sa morphologie. Le genre a été défini par Campbell et Postgate en 1965. L‟espèce type
du genre est Desulfotomaculum nigrificans (Werkman et Weaver, 1927). Initialement
nommée Clostridium nigrificans, cette espèce était dotée de caractéristiques différentes de
celles des Clostridium typiques étudiés jusque-là (coloration de Gram négative ; proportion de
G+C de l‟ADN génomique différente des Clostridium ; présence de cytochromes). Elle a donc
été reclassée dans le nouveau genre Desulfotomaculum.
Selon la classification de Campbell et Postgate, ce genre regroupait alors trois
espèces : Desulfotomaculum nigrificans, Desulfotomaculum ruminis (Coleman, 1960), et
Desulfotomaculum orientis (initialement Desulfovibrio orientis, Adams et Postgate (1959). Le
genre a beaucoup évolué depuis avec 28 espèces et 2 sous-espèces de Desulfotomaculum
décrites à ce jour. De plus, en 1997, l‟analyse de séquences du gène de l‟ARNr 16S a permis
d‟affirmer que Desulfotomaculum orientis se distinguait phylogénétiquement des autres
Desulfotomaculum recensés jusqu‟alors (Stackebrandt et al., 1997). Cette espèce fut donc
renommée Desulfosporosinus orientis et devint l‟espèce type du genre Desulfosporosinus. De
la même façon, Desulfotomaculum auripigmentum fut renommé Desulfosporosinus
auripigmenti (Stackebrandt et al., 2003)
3.2. Morphologie.
Les Desulfotomaculum sont des bâtonnets droits ou incurvés de dimensions 0,3-2,5 x
2,5-15 µm aux extrémités arrondies ou pointues (Fig. 1.10 A et B). Les cellules sont la
plupart du temps isolées mais peuvent constituer des chaînes. Ces microorganismes sont
mobiles grâce à des flagelles péritriches ou polaires (Fig. 1.10 C). Les Desulfotomaculum
sont des microorganismes sporulés dont les spores sont rondes ou ovales et peuvent être
centrales à terminales ce qui peut modifier légèrement la forme des cellules (Fig. 1.10 A et
Chapitre 1
26
B). Les micro-colonies formées par les bactéries de ce genre sont noires surtout en présence
de sels ferreux. La coloration de Gram est négative, mais des observations au microscope
électronique montrent que les Desulfotomaculum ont une paroi extracellulaire épaisse et sont
dépourvus de membrane externe, caractéristiques qui sont celles des bactéries à Gram positif.
3.3. Physiologie.
Les Desulfotomaculum sont des bactéries anaérobies strictes qui peuvent survivre pour
de très longues périodes, dans des conditions oxiques ou de sècheresse grâce à leur capacité à
sporuler. Certaines espèces sont thermophiles comme D. thermosubterraneum (Kaksonen et
al., 2006b) ou D. thermocisternum (Nilsen et al., 1996b) qui ont des optima de croissance
supérieurs à 60°C. Les accepteurs d‟électrons utilisés par les espèces décrites à ce jour sont
notamment le sulfate, le thiosulfate, le sulfite et le soufre élémentaire. En dehors des
composés soufrés, l‟utilisation comme accepteurs d‟électrons des ions Mn(IV), Fe(III), U(VI)
ou Cr(VI) a également été mise en évidence pour « D. reducens » mais peu de travaux ont été
Figure 1.10 : Photographies au
microscope à contraste de phase
(A et B) et au microscope
électronique à balayage (C) et à
transmission (D) d‟espèces de
Desulfotomaculum. A : D.
acetoxidans avec spores
(Widdel, 2006); B : D. ruminis
avec spores (Widdel, 2006) ;
C : D. nigrificans avec flagelles
(Widdel, 2006) ; D : D.
nigrificans, la grande flèche
représente la membrane
plasmique et les trois petites
flèches indiquent la paroi
cellulaire (Widdel, 2006) .
Chapitre 1
27
réalisés sur le sujet (Tebo et Obraztsova, 1998). Par ailleurs, « D. reducens » n‟est pas
formellement décrite à ce jour5.
Desulfotomaculum aeronauticum représente un cas particulier. Elle fut, dans un
premier temps, décrite comme la seule espèce de Desulfotomaculum incapable d‟utiliser du
sulfate comme accepteur d‟électron (Hagenauer et al., 1997). Cependant, il fut démontré
quelques mois plus tard que la sulfato-réduction était possible en présence de ménadione
(Hippe et al., 1997). Cette molécule est un précurseur de la ménaquinone qui est présent chez
tous les membres du genre Desulfotomaculum (Collins et Widdel, 1986) et intervient dans le
transport d‟électrons. Certaines espèces sont également capables de fermenter le pyruvate en
absence de sulfate : c‟est le cas de D. putei (Liu et al., 1997) ou D. ruminis, par exemple
(Campbell et Postgate, 1965). En ce qui concerne les donneurs d‟électrons, le genre fait
preuve d‟une grande versatilité : H2, alcools, acides gras, acides aliphatiques mono ou
dicarboxyliques et aldéhydes aromatiques. Desulfotomaculum sp. Ox39 est, par ailleurs,
capable d‟utiliser certains hydrocarbures mono-aromatiques (voir 2.3.4) (Morasch et al.,
2004).
3.4. Classification.
La classification des microorganismes s‟est longtemps basée sur des critères de
morphologie et de physiologie. Aujourd‟hui l‟espèce bactérienne est définie comme
l‟ensemble des souches présentant plus de 70% d‟homologie de leur génome mesurée par la
technique d‟hybridation ADN/ADN. Par ailleurs, depuis 1994, une équivalence entre la
technique lourde de l‟hybridation génomique et une technique basée sur la comparaison des
séquences des gènes de la sous-unité ribosomique (ARNr 16S) a été proposée par
Stackebrandt et Goebel. Selon cette méthode, aujourd‟hui adoptée dans la majorité des études
de classification, deux souches sont considérées comme n‟appartenant pas à la même espèce
si les séquences de leur ARNr 16S présentent une similarité inférieure à 97%. Cette
classification, place le genre Desulfotomaculum dans le phylum des Firmicutes, la classe des
Clostridia, l‟ordre des Clostridiales et la famille des Peptococcaceae.
La classification phylogénétique des Desulfotomaculum permet de distinguer, 8 sous-
groupes numérotés de Ia à Ih (Fig. 1.11). La possibilité de considérer tous ces sous-groupes
comme autant de genres distincts a été évoquée. Cependant l‟absence de phénotypes
distinctifs maintient la classification des espèces des groupes Ia à Ig dans le genre
5 http://www.bacterio.cict.fr/, mise à jour de Novembre 2012
Chapitre 1
28
Desulfotomaculum (Stackebrandt et al., 1997). Deux autres genres apparaissent également
dans cette classification : le genre Sporotomaculum dans le groupe Ib (Brauman et al., 1998)
et le genre Pelotomaculum qui constitue le groupe monophylétique Ih (Imachi et al., 2006).
La reclassification de ces microorganismes au sein de genres nouveaux est liée à leur
incapacité à utiliser les sulfates comme accepteur d‟électron (Imachi et al., 2002).
L‟espèce D. guttoideum (Gogotova et al., 1983) est un cas particulier de la
classification actuelle. Elle n‟est affiliée à aucun Desulfotomaculum et la séquence de son
ARNr 16S présente une forte identité avec celui des espèces Clostridium sphenoides et
Clostridium celerecrescens (Fig. 1.11, Stackebrandt et al., 1997). De plus l‟espèce D.
guttoideum présente un pourcentage en G+C très proche de celui des membres du genre
Clostridium et elle réduit le sulfite et le thiosulfate mais pas le sulfate. Ainsi, D. guttoideum
semble plus proche du cluster XIVa des Clostridium tel que décrit par Collins et al. (1994)
que du genre Desulfotomaculum. Néanmoins, sa reclassification n‟a pas été proposée à ce
jour.
Certaines espèces du genre Desulfotomaculum présentent de multiples copies
hétérogènes du gène de l‟ARNr 16S (Stackebrandt et al., 1997). Les deux copies de D.
kuznetsovii divergent ainsi de 8,3% (Tourova et al., 2001). Cette divergence est étroitement
liée à l‟existence de larges séquences de plus de 100 bases (120 environ pour D. kuznetsovii)
insérées aux extrémités 5‟ et 3‟ du gène de l‟ARNr 16S (correspondant aux position 68-101 et
1445-1457 du gène chez E. coli (Stackebrandt et al., 1997, Tourova et al., 2001). Ce type
d‟insert a également été détecté chez D. australicum (Patel et al., 1992) D.
thermosubterraneum (Kaksonen et al., 2006b) et chez une autre souche de Desulfotomaculum
(Berlendis et al., 2010). L‟origine de ces séquences est inconnue mais selon Tourova et ses
collaborateurs, leur présence chez d‟autres microorganismes tels que Clostridium paradoxum
(Rainey et al., 1996) ou Thermoanaerobacter siderophilus (Slobodkin et al., 1999), suggère
un transfert horizontal. Les longs inserts observés chez D. kuznetsovii et D. australicum
forment une structure secondaire en hélice. Ce type de structure n‟ayant été observé que chez
des microorganismes thermophiles, les auteurs supposent leur implication dans le
fonctionnement des ribosomes à haute température. La majorité des études de description de
souches du genre Desulfotomaculum ne fournissent pas d‟informations concernant les
différentes copies du gène de l‟ARNr 16S ou d‟éventuels inserts (la majorité des études sont
antérieures à l‟étude de Tourova et ses collaborateurs), il est donc impossible de généraliser
ces caractéristiques à l‟échelle du genre.
Chapitre 1
29
Figure 1.11 : Arbre phylogénétique du genre Desulfotomaculum (à l‟exception de D. antarcticum
pour lequel aucune séquence n‟est disponible et dont la souche peut être considérée perdue selon
(Stackebrandt et al., 1997). L‟arbre, basé sur le gène de l‟ARNr 16S, a été réalisé par Neighbor-
Joining et les valeurs indiquées entre parenthèses sont celles des bootstraps obtenus pour 1000
itérations.
Chapitre 1
30
L‟hétérogénéité des copies du gène de l‟ARNr 16S est néanmoins problématique pour
la classification phylogénétique des Desulfotomaculum et il est conseillé d‟exclure les
séquences hypervariables du gène (notamment les inserts présentés ci-dessus) lors de
l‟analyse (Stackebrandt et al., 1997, Tourova et al., 2001).
Outre, la classification basée sur la séquence du gène de l‟ARNr 16S, certaines
analyses phylogénétiques sont basées sur des gènes fonctionnels. C‟est le cas des gènes
codant les sous-unités A et B de la bisulfite réductase (dsrAB), qui, par leur haut degré de
conservation, offrent une bonne base de comparaison phylogénétique pour les
microorganismes sulfato-réducteurs (Klein et al., 2001). L‟étude des gènes dsrAB avait dans
un premier temps suggéré que ces gènes n‟étaient pas monophylétiques chez les
Desulfotomaculum (Larsen et al., 1999). La séquence de Desulfotomaculum thermocisternum
était, de façon surprenante, très proche de celle portée par Archaeoglobus profundus, une
Archaea sulfato-réductrice thermophile. Plus tard, Klein et ses collaborateurs (2001) ont mis
en évidence une séparation des séquences dsrAB des Desulfotomaculum en deux groupes bien
distincts. L‟un, constitué des sous-groupes phylogénétiques Ia et If, se positionne de la même
manière qu‟avec la classification basée sur l‟ARNr 16S au sein des Firmicutes, alors que
l‟autre, constitué des sous-groupes Ib à Ie se retrouve associé aux Delta-protéobactéries (telles
que des espèces des genres Desulfobulbus ou Desulfovibrio, Fig. 1.12). Néanmoins, les sous-
groupes évoqués ci-dessus conservent leur unité. Plusieurs indices suggèrent que cette
dissociation est liée à un transfert horizontal de gènes plutôt qu‟à une mutation d‟un gène
ancestral commun (Klein et al., 2001). Aux vues du nouvel embranchement des sous-groupes
Ib à Ie, ce transfert horizontal serait intervenu entre Delta-protéobactéries et Firmicutes. Les
Desulfotomaculum n‟étant pas les seuls à avoir subi cette modification (Desulfobacula
toluolica ou Archaeoglobus profundus, par exemple), les gènes dsrAB semblent très sujets au
transfert ce qui pourrait expliquer que la capacité à respirer le sulfate soit très répandue dans
le monde microbien. De plus, il est intéressant de noter que contrairement aux
Desulfotomaculum « ancestraux » (Ia et If), la majorité de ceux qui ont connu ce transfert
horizontal oxydent complètement leurs substrats jusqu‟au CO2 (Klein et al., 2001). Les
auteurs supposent que, de la même façon que pour le gène de la sulfite-réductase, d‟autres
gènes de fonction aient été impliqués dans ce genre de transfert au sein des
Desulfotomaculum. Néanmoins, les analyses de génomes n‟apportent pas d‟informations
complémentaires à ce sujet.
Chapitre 1
31
Figure 1.12 : Arbre phylogénétique du genre Desulfotomaculum basé sur les gènes dsrAB. L‟arbre a
été réalisé par Neighbor-Joinning et les chiffres indiqués sont les valeurs de bootstrap obtenues pour
1000 itérations.
3.5. Les Desulfotomaculum dans les environnements naturels.
Les Desulfotomaculum ont été répertoriés dans divers environnements comme le
rumen, les rizières, les lacs, les sédiments ou les fèces. Comme l‟ensemble des bactéries
sulfato-réductrices (BSR), ces microorganismes jouent un rôle majeur dans les
environnements anoxiques. Ils interviennent notamment en réalisant les étapes finales de la
minéralisation de la matière organique en CO2. Certains auteurs considèrent que la sulfato-
réduction pourrait être responsable de la minéralisation de plus de 50% de la matière
organique en milieu marin (Jorgensen, 1977). De plus, ces microorganismes produisent des
sulfures qui précipitent les métaux éventuellement toxiques dans les écosystèmes anoxiques.
Par leurs capacités physiologiques et métaboliques, les BSR peuvent se développer dans les
zones profondes océaniques et continentales dépourvues d‟oxygène. Néanmoins, les études
réalisées dans ces environnements, montrent généralement une faible diversité des BSR avec
Chapitre 1
32
une prédominance des Desulfotomaculum et une moindre représentation des genres et espèces
du phylum des Proteobacteria (Guan et al., 2013). Ces observations empiriques suggèrent
une adaptation de ce genre aux environnements extrêmes qui pourrait s‟expliquer par les
capacités particulières telles que l‟hyperthermophilie, la sporulation, ainsi que leur capacité à
croître autotrophiquement avec l‟hydrogène et le dioxyde de carbone (Klemps et al., 1985) ou
homoacétogéniquement en absence de sulfate (Kotelnikova et Pedersen, 1997). Les différents
types d‟environnements profonds colonisés par les Desulfotomaculum sont brièvement décrits
ci-dessous.
3.5.1. Eaux profondes et sédiments superficiels.
3.5.1.1. Les milieux lacustres.
Plusieurs études de diversité réalisées en milieu lacustre ont mis en évidence la
présence de Desulfotomaculum. Le lac méromictique Gek-Gel en Azerbaïdjan (Karnachuk et
al., 2006) a des eaux de surface et de profondeur se mélangeant moins d‟une fois par an,
entraînant l‟apparition d‟une zone anoxique en profondeur. Des Desulfotomaculum ont été
détectés dans la colonne d‟eau de ce lac à une profondeur de 31 mètres à partir de laquelle il
n‟y a plus d‟oxygène dissous. En outre, la proportion de Desulfotomaculum dans la colonne
d‟eau déterminée par FISH augmente avec la profondeur (0% des microorganismes totaux à
10 mètres, 7% à 31 mètres et 16% à 70 mètres) alors que les populations des espèces des
genres Desulfovibrio et Desulfomicrobium (des BSR appartenant à la classe des Delta-
protéobactéries) semblent suivre une évolution inverse. Les auteurs supposent donc un rôle
majeur des Desulfotomaculum dans la zone anoxique du lac.
Une souche affiliée au genre Desulfotomaculum a également été isolée à partir de
sédiments du lac Stechlin situé au Nord de Berlin (Sass et al., 1998). Il s‟agit d‟un lac
dimictique (deux brassage des eaux par an, en hiver et en été) qui contient également une zone
anoxique. Dans cette étude, 27 souches ont été isolées dans des sédiments prélevés près du
littoral ou à environ 30 mètres de profondeur au fond du lac. Il est intéressant de noter que
tous les microorganismes à gram positif isolées sont affiliées aux genres Sporomusa et
Desulfotomaculum et proviennent des sédiments prélevés en profondeur. Elles représentent
près de 40% des bactéries isolées au fond du lac. Une autre étude réalisée sur ces échantillons
de sédiments révèle que la communauté microbienne de la couche la plus profonde des
sédiments prélevés au fond du lac était dominée par les Desulfotomaculum (Sass et al., 1997).
Chapitre 1
33
Ces observations sont en accord avec les recherches de Stahl et ses collaborateurs (2002) qui
suggèrent que les BSR à gram-positif sont les principaux microorganismes sulfurogènes dans
les environnements profonds.
Les lacs peuvent constituer un habitat pour les microorganismes anaérobies dans la
mesure où ils sont assez profonds pour posséder une zone anoxique semi-permanente. Sass et
ses collaborateurs (1998) soulignent que la présence de Desulfotomaculum dans ces
environnements n‟est pas surprenante étant donné le faible apport en nutriment dans ces
niches écologiques. Ce genre bactérien peut en effet sporuler et survivre à de longues périodes
de carence. Toutefois, il est intéressant de noter que la capacité à sporuler n‟est peut-être pas
l‟unique raison de la résistance de ces microorganismes dans ces milieux. En effet, dans le lac
Stechlin seules 0,5% des cellules de Desulfotomaculum échantillonnées semblaient sporulées
et ont pourtant survécu à la pasteurisation précédant la mise en culture (Sass et al., 1997). A
l‟opposé, une étude de Bak et Pfennig (1991) montrait que 50% des Desulfotomaculum du lac
Constance (à la frontière entre la Suisse et l‟Allemagne) étaient sporulés. De telles différences
semblent néanmoins difficiles à expliquer sans pouvoir relier la sporulation aux paramètres
physicochimiques détaillés qui ont pu l‟influencer.
La répartition des Desulfotomaculum en milieu lacustre profond telle qu‟elle est
évoquée ci-dessus peut être expliquée de la façon suivante. Les Desulfotomaculum sont
généralement prédominant dans des environnements anoxiques, où la teneur en sulfate n‟est
généralement pas très élevée (Leloup et al., 2005). Ces conditions correspondent à celles que
l‟on retrouve au fond des lacs profonds. De plus, lorsque les donneurs d‟électron viennent à
manquer, la capacité à sporuler des Desulfotomaculum leur permet de survivre en attendant un
nouvel apport de nutriment. Lors du brassage des eaux, ces nutriments sont renouvelés mais la
présence d‟oxygène limite encore la croissance des Desulfotomaculum. Cependant, une fois
que les conditions redox sont à nouveau propices, les microorganismes de ce genre bactérien
peuvent à nouveau se développer.
3.5.1.2. Les milieux marins.
Les fonds marins sont des lieux de minéralisation des substances organiques déposées
par sédimentation où les BSR et le cycle du soufre jouent un rôle majeur (Jorgensen, 1982).
De multiples études réalisées dans divers océans du globe ont montré la présence des
Desulfotomaculum au sein des milieux marins profonds.
Chapitre 1
34
La présence majoritaire (54%) de ce genre bactérien parmi le groupe métabolique des
sulfato-réducteurs a notamment été mise en évidence dans des sédiments de la West Pacific
Warm Pool prélevés sous 1900 mètres d‟eaux. (Wang et al., 2008). Cependant, selon les
dénombrements réalisés par FISH, les BSR ne constitueraient que 0,34 à 1,95% des
microorganismes de l‟écosystème. Les auteurs affirment par ailleurs que ces chiffres sont en
adéquation avec la faible activité sulfato-réductrice observée dans ce type d‟environnement
(Ivanov et al., 1980 ; Canfield, 1991 ; D‟Hondt et al., 2002). Néanmoins, la présence
majoritaire des Desulfotomaculum parmi les BSR dans cet environnement ainsi que leur rôle
dans d‟autres environnements stringents (résidus d‟une mine d‟uranium, Chang et al. 2001 ;
sédiments marin contaminés aux métaux lourds, Tebo et al., 1998) met en exergue la faculté
d‟adaptation du genre, adaptation due selon Wang et ses collaborateurs (2008), à leur capacité
à sporuler ainsi qu‟à leur versatilité métabolique.
En Atlantique, des microorganismes affiliés aux Desulfotomaculum ont également été
trouvés au niveau de sources hydrothermales. C‟est notamment le cas près de la dorsale, au
sommet du massif Atlantis, dans un champ hydrothermal actif situé entre 750 et 800 mètres
de profondeur (Gerasimchuk et al., 2010). Cette zone, découverte en 2000 a été surnommée
« la cité perdue » par les scientifiques qui l‟ont découverte et suscite la curiosité de par les
compositions minérales et chimiques inhabituelles des cheminées et du fluide qui s‟en
échappe (Fig. 1.13). Des preuves d‟une sulfato-réduction biologique au niveau des cheminées
ont été apportées par mesure du fractionnement isotopique du soufre, et l‟étude des gènes de
la sulfite-réductase (dsrAB) a révélé que ce processus est l‟œuvre de microorganismes affiliés
au genre Desulfotomaculum. Les études de Gerasimchuk et al. (2010) et Brazelton et al.
(2006) démontrent, selon les auteurs, que les Desulfotomaculum sont probablement les seuls
microorganismes sulfato-réducteurs dans cet environnement. Les investigations menées par
l‟équipe de recherche russe suggèrent l‟utilisation par ces microorganismes d‟hydrogène
comme donneur d‟électrons et de bicarbonate comme source de carbone. Dans ces
environnements, des Archaea méthanogènes cohabitent avec les Desulfotomaculum.
Cependant la relation entre les deux types de microorganismes reste floue et il est difficile de
déterminer s‟il s‟agit d‟une compétition pour le donneur d‟électrons que constitue l‟hydrogène
ou d‟une coopération avec utilisation par les Desulfotomaculum du méthane produit par les
Archaea.
Chapitre 1
35
Figure 1.13 : Cheminée de carbonates de « la Cité Perdue », une source hydrothermale située près de
la dorsale medio-atlantique. Certaines structures carbonatées atteignent 30 mètres et sont recouvertes
d‟un tapis microbien contenant des Desulfotomaculum spp. et des Methanobacterium spp. (Kelley,
University of Washington, IFE, URI-IAO, NOAA).
En outre, la présence de spores de Desulfotomaculum thermophiles a été mise en
évidence dans des sédiments provenant de la Mer Baltique et de l‟Océan Arctique (Hubert et
al., 2009 ; Hubert et al., 2010a ; De Rezende et al., 2013). La présence de ces spores a été
révélée par des expériences d‟incubation des sédiments à 50°C ou par dénombrement par la
technique du nombre le plus probable à l‟aide d‟un radio-traceur (T-MPN). Les banques de
clones du gène de l‟ARNr 16S réalisées sur ces enrichissements ont permis d‟identifier des
microorganismes affiliés aux espèces D. halophilum, D. reducens, D. thermosapovorans et D.
geothermicum (Hubert et al., 2010a). Une étude a par ailleurs mis en évidence un apport
constant de microorganismes thermophiles dans les eaux nordiques (108 cellules par m² et par
Chapitre 1
36
an à Svalbard dans l‟océan Arctique et 107 cellules par m
2 et par an dans la baie d‟Aahrus en
mer Baltique). La température des eaux étant peu favorable à leur croissance, ces
microorganismes ont sporulé (Hubert et al., 2009). Hubert et ses collaborateurs suggèrent
deux hypothèses concernant la provenance de ces thermophiles. La première concerne les
fluides de la croûte océanique qui abritent des communautés microbienne dont font partie les
Desulfotomaculum (Cowen et al., 2003). Ces dernier pourraient ainsi être transportés
jusqu‟aux dorsales avant d‟être dispersé dans l‟océan via des fumeurs comme ceux de « Lost
City » (Brazelton et al., 2006). La deuxième hypothèse suggère que les spores proviennent de
gisements pétroliers où des Desulfotomaculum ont été identifiés à plusieurs reprises (voir
3.5.2.). La physiologie des bactéries thermophiles de l‟Arctique corrobore l‟idée d‟un
développement dans le sous-sol marin. Selon les auteurs le plancher océanique serait ainsi
connecté à la croute océanique et à des gisements pétroliers via des flux de fluides
océaniques. Le devenir des spores dispersées sur les fonds océaniques fait l‟objet d‟études
contradictoires. Certains auteurs affirment que des bactéries formant des endospores, comme
les Desulfotomaculum, restent viables pendant des millions d‟années (Cano et Borucki, 1995 ;
Parkes et al., 2000 ; Vreeland et al., 2000) et pourraient ainsi survivre jusqu‟à atteindre un
écosystème plus favorable (avec notamment des températures plus élevées). En revanche, une
étude récente de Rezende et ses collaborateurs, indique que dans les sédiments de la mer
baltique le nombre de spores de Desulfotomaculum thermophiles décroit de façon
exponentielle avec la profondeur du sédiment. Le nombre de spores détecté passe en effet de
104 spores par cm
3 de sédiment à la surface à 1 spore par cm
3 à 6,5 mètres de profondeur. A
cette profondeur l‟âge du sédiment est environ de 4500 ans, la demi-vie des spores a ainsi été
estimée à environ 400 ans. Néanmoins, si la survie des spores est si courte que l‟affirment
Rezende et ses collaborateurs il semble difficile d‟interpréter la présence des
Desulfotomaculum à plusieurs kilomètres de profondeur. La présence de ces microorganismes
à de telles profondeurs n‟étant pas anecdotique, les mécanismes d‟accession aux couches les
plus profondes de la subsurface restent incertains.
3.5.2. Subsurface profonde.
Les Desulfotomaculum étant bien représenté dans les profondeurs des lacs et des
océans, on peut émettre l‟hypothèse que ces microorganismes auraient été peu à peu enfouis
par sédimentation dans les couches sédimentaires profondes à l‟échelle des temps
Chapitre 1
37
géologiques. Dans ces milieux, la versatilité de ces bactéries ainsi que leur résistance en
auraient fait des acteurs majeurs des cycles du carbone et du soufre. Cette hypothèse est
corroborée par de nombreuses études du sous-sol profond qui révèlent la présence majoritaire
de Desulfotomaculum dans ces environnements. Les études microbiologiques d‟échantillons
de subsurface profonde sont encore peu nombreuses, le prélèvement d‟échantillons dans ces
couches géologiques étant étroitement lié aux activités anthropiques. En effet, le coût des
forages à de telles profondeurs ne peuvent le plus souvent être assurés que s‟il y a un intérêt
industriel. La plupart de ces études sont donc liées à des activités industrielles et concernent
majoritairement les mines, les gisements pétroliers et les aquifères.
L‟exploitation du minerai permet d‟atteindre des couches géologiques très profondes.
Des études microbiologiques réalisées dans les mines ont permis de mettre en évidence des
Desulfotomaculum qui semblent bien s‟adapter aux conditions extrêmes de ces écosystèmes.
Au Japon, des échantillons provenant d‟une mine (dont la nature de la production n‟est
pas précisée) à une profondeur de 250 mètres ont permis d‟isoler la souche D.
thermosubterraneum (Kaksonen et al., 2006a). Cette souche est thermophile (Température
optimale entre 60 et 65°C), utilise de nombreux donneurs d‟électrons et est notamment
capable de se développer en présence de H2 comme donneur d‟électron et de CO2 comme
source de carbone. Kaksonen et ses collaborateurs suggèrent que le rôle de ces
microorganismes est d‟atténuer naturellement le drainage minier acide en favorisant la
formation de sulfures métalliques.
La présence de certains Desulfotomaculum thermophiles a été mise en évidence dans
le sous-sol profond par deux études réalisées dans deux mines au Japon : la mine Kamaishi
(Ishii et al., 2000) et la mine Toyoha (Nakagawa et al., 2002). Dans la mine Kamaishi des
séquences d‟ARNr 16S affiliées à des espèces thermophiles et mésophiles de
Desulfotomaculum ont été obtenues à partir d‟échantillons d‟eau froide (10 à 15°C) prélevés
entre 400 et 800 mètres de profondeur en zone anoxique. Ces séquences représentent environ
50% des séquences obtenues à ces profondeurs ce qui témoigne de l‟importance des bactéries
sporulées dans cet environnement. Néanmoins, l‟absence de données concernant l‟état
végétatif ou sporulé des cellules limite l‟interprétation en ce qui concerne l‟activité de ces
Desulfotomaculum aux températures mésophiles étudiées. Les séquences d‟ARNr 16S et
dsrAB obtenues dans la mine Toyoha dans des conditions thermophiles (50 à 70°C) indiquent
également la présence de microorganismes proches de D. kuznetsovii, une espèce capable de
croissance autotrophe avec du H2 comme donneur d‟électron et du CO2 comme source de
Chapitre 1
38
carbone. Par ailleurs, la détection de microorganismes affiliés à Hydrogenophilus
thermoluteolus, une bactérie oxydant l‟hydrogène, pourrait indiquer la présence d‟H2 dans
l‟eau échantillonnée. Les Desulfotomaculum identifiés dans cette étude pourraient donc
survivre en autotrophie dans la mine. Selon Nakagawa et ses collaborateurs (2002) la capacité
à croître de façon autotrophe est probablement essentielle en milieu continental profond. La
capacité à sporuler ainsi qu‟un optimum de température élevé seraient également des atouts
très importants dans ce type d‟écosystème.
Des microorganismes ont aussi été retrouvés à des profondeurs bien plus importantes,
comme dans une mine d‟Afrique du Sud où deux genres microbiens Desulfotomaculum et
Methanobacterium représentaient les populations bactériennes dominantes (Moser et al.,
2005). Des banques de clones des gènes de l‟ARNr 16S et de la sulfite-réductase (dsrAB),
ainsi que du gène de la méthyl-coenzyme M réductase (enzyme intervenant dans la
méthanogenèse) ont été réalisées sur des échantillons provenant de 3200 et 3300 mètres de
profondeur. A 3200 mètres les Desulfotomaculum représentent 100% des clones bactériens
(ARNr 16S et dsrAB) et les Methanobacteriaceae représentent 100% des clones Archéen. A
3300 mètres ces tendances se confirment avec des représentativités de 98 et 97%
respectivement. Malheureusement la proportion de Bacteria par rapport aux Archaea n‟a pas
pu être étudiée. Cependant, selon les auteurs, les deux groupes coexistent sans qu‟aucun des
deux ne devienne définitivement dominant. Cela est dû aux conditions particulières qui
règnent dans cet environnement. Contrairement aux conditions observées sous les fonds
marins (Parkes et al., 2000 ; D'hondt et al., 2004) ou dans les sédiments continentaux peu
profonds, le donneur d‟électrons n‟est pas limitant dans cet environnement. En effet, la
quantité de H2 utilisable par les deux groupes métaboliques est largement suffisante. Ainsi,
Moser et ses collaborateurs affirment que les populations de Desulfotomaculum sont limitées
par la faible teneur en sulfate, celles des Methanobacteriaceae étant limitées par la faible
biodisponibilité des carbonates servant d‟accepteurs d‟électrons (pH élevé, forte concentration
en Ca2+
, …) et la faible énergie fournie par la réaction de méthanogenèse dans ces conditions.
La présence de ces deux genres de microorganismes a déjà été répertoriée dans un autre
environnement très sélectif, sur les cheminées de Lost City sur la dorsale Atlantique. De
nombreux points communs, unissent ces deux environnements : la ressemblance des
communautés bactériennes, une température élevée (60 à 75°C), un pH élevé (9 à 11) et de
fortes concentrations en CH4 et H2. Cependant, les deux écosystèmes présentent quelques
différences telles que la salinité (plus élevée en Atlantique que dans la mine), la concentration
Chapitre 1
39
en sulfate (un peu supérieure dans l‟Atlantique) et l‟origine du H2 et du CH4 (bien
qu‟abiotique dans les deux cas) liée à la radiolyse de l‟eau dans de la roche riche en pyrite
dans les mines (Lin et al., 2005), et à la réaction de serpentinisation entre l‟eau et la péridotite
dans l‟Atlantique. Cette étude est en accord avec l‟idée d‟un enfouissement des
Desulfotomaculum qui de par leur grande résistance auraient survécu au fil des âges seraient
aujourd‟hui détectés à de grandes profondeurs.
La découverte récente d‟un autre écosystème intéressant dans la subsurface profonde
de l‟Afrique du Sud alimente cette hypothèse. En effet, c‟est dans une mine d‟Afrique du Sud
que Chivian et ses collaborateurs (2008) ont révélé un écosystème ne contenant qu‟une seule
espèce microbienne, nommée Candidatus Desulforidis audaxviator. Il s‟agit d‟une nouvelle
espèce de BSR à gram positif dont l‟espèce la plus proche dans la classification
phylogénétique est Pelotomaculum thermopropionicum. Le séquençage du génome de ce
microorganisme a permis de mettre en évidence toutes les capacités métaboliques nécessaires
pour la vie autotrophe dans un environnement profond. Son patrimoine génétique lui permet
également de former des spores comme l‟ensemble des Peptococcaceae. En revanche, le
génome de D. audaxviator ne possède pas un système de résistance à l‟oxygène complet, ce
qui suggère un isolement à long terme de l‟espèce (Chivian et al., 2008).
Les aquifères profonds sont, au même titre que les environnements évoqués ci-dessus,
des écosystèmes propices au développement des Desulfotomaculum et des Desulfosporosinus
(Colwell et al., 1997 ; Detmers et al., 2001 ; Stahl et al., 2002 ; Detmers et al., 2004). Des
études réalisées sur un aquifère préservé de l‟activité anthropique ont ainsi montré la présence
de ce genre bactérien dans la formation géologique (Detmers et al., 2004). Huit souches ont
été isolées à partir de ces échantillons parmi lesquelles 6 Firmicutes dont 4 souches affiliées
au genre Desulfotomaculum. Les auteurs suggèrent que ces microorganismes sont indigènes
de ce type de formation. Par ailleurs, la souche Desulfotomaculum sp. Ox39 capable de
dégrader certains BTEX a également été isolée d‟un aquifère (Morasch et al., 2004)
Un autre prélèvement en aquifère a été réalisé par l‟équipe de Itavaara en Finlande
(2011). Les banques de clones réalisés sur des échantillons provenant de trois profondeurs
différentes (0 à 100 m, 900 à 1000 m et 1400 à 1500 m) mettent en évidence une
augmentation de la proportion des Desulfotomaculum avec la profondeur. Ce genre bactérien
représente ainsi 23% des séquences obtenues à 1500 mètres alors que l‟ensemble des
Peptococcaceae ne représente que 8,5 % des clones obtenus à 1000 mètres. Il est intéressant
de noter que les microorganismes sporulés à gram positif désignés par la classe des Clostridia
Chapitre 1
40
dans la banque de clone représentent 75% des séquences obtenues à 1500 mètres. Ces
résultats contribuent à alimenter la thèse d‟une dominance des BSR sporulés en milieu
profond.
Peu d‟études sont publiées sur la diversité microbienne des aquifères. Néanmoins,
dans ce manuscrit, l‟importance des Desulfotomaculum dans ce type d‟environnement est
étudiée (voir partie 2. de l‟étude bibliographique et partie Résultats).
Depuis le début des années 1980, des études microbiologiques ont été réalisées sur des
eaux provenant de gisements pétroliers profonds afin de mieux comprendre les effets
indésirables des microorganismes sulfato-réducteurs sur la production : corrosion des
installations, diminution de la perméabilité des formations géologiques par précipitation des
sulfures de fer, sulfures d‟hydrogène néfastes pour la santé des employés, « souring » des
gisements et pertes de valeurs des bruts pétroliers. Ces recherches ont permis de mettre en
évidence la présence d‟espèces du genre Desulfotomaculum dans des couches géologiques
très profondes dans des sites très éloignés géographiquement.
Les réservoirs situés sous les fonds marins de la mer du Nord ont fait l‟objet d‟un
grand nombre d‟études (Rosnes et al., 1991 ; Nilsen et al., 1996a ; Nilsen et al., 1996b ; Leu
et al., 1998 ; Gittel et al., 2009). Chacune de ces études a montré la présence d‟espèces du
genre Desulfotomaculum dans des réservoirs situés entre 2 et 4 km de profondeur sous les
fonds marins. Ces résultats corroborent l‟hypothèse d‟Hubert et collaborateurs (2010) qui
suggèrent que les microorganismes thermophiles retrouvés dans l‟océan Arctique puissent
provenir des réservoirs pétroliers situés sous la mer du Nord. Par ailleurs, d‟autres
échantillonnages d‟eau provenant de ce type d‟environnement et évoquant la présence de
Desulfotomaculum ont été réalisés en France (Tardy-Jacquenod et al., 1996) mais également
en Asie : en Chine (Liu et al., 2008 ; Lan et al., 2011) et en Inde (Agrawal et al., 2010).
Une étude récente, a mis en évidence une corrélation entre la présence des
Desulfotomaculum et la profondeur de gisement pétroliers chinois (Fig. 1.14, Guan et al.,
2013). La profondeur des échantillonnages est de 1490 m pour S2, 1300 m pour S1, 802 m
pour S3 et 480 m pour S4. La dominance des Desulfotomaculum est la plus importante aux
grandes profondeurs avec 80% des séquences obtenues pour le puits S2. D‟autres corrélations
obtenues par des tests statistiques (avec la concentration en sulfate, acétate et propionate
notamment) sont évoquées par les auteurs mais elles semblent moins évidentes.
Chapitre 1
41
Figure 1.14 : Contributions relatives des groupes phylogénétiques aux communautés microbiennes
provenant de différents gisements pétroliers en Chine. La phylogénie a été étudiée via le gène de
l‟ARNr 16S (Guan et al., 2013).
Aux grandes profondeurs des gisements pétroliers la température peut atteindre 60 à
90°C ; il faut donc que les microorganismes qui vivent dans ces environnements soient très
résistants à la chaleur et à une pression pouvant aller jusqu‟à 80 MPa pour les gisements
situés sous la mer du Nord (Nilsen et al., 1996a). En outre, la toxicité de certains composés du
pétrole comme les BTEX peut également inhiber le développement de certains
microorganismes. Néanmoins, les hydrocarbures issus du pétrole brut peuvent constituer une
source de carbone importante pour les microorganismes capables de les dégrader (voir 2.2).
L‟exposé bibliographique sur les membres du genre Desulfotomaculum rencontrés
dans les environnements de subsurface profonde a fait l‟objet d‟une revue qui a été soumise
dans le journal Frontiers in Microbiology et qui est retranscrite ci-après.
Desulfobacterium
Desullfovibrio
Desulfomicrobium
Desulfobulbus
Desulfobacter
Desulfotomaculum
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1300 m 1490 m 802 m 480 m
Chapitre 1
42
Desulfotomaculum spp. and related Gram-positive sulfate-
reducing bacteria in deep subsurface environments.
Thomas Aüllo1, Anthony Ranchou-Peyruse
1*, Bernard Ollivier
2, Michel Magot
1
1 Equipe Environnement et Microbiologie, Institut des Sciences Analytiques et de Physico-
Chimie pour l‟Environnement et les Matériaux (IPREM UMR 5254), Université de Pau et des
Pays de l‟Adour, Pau, France.
2 Laboratoire de Microbiologie, IRD (CNRS/INSU), Université d‟Aix-Marseille, Marseille,
France.
Abstract
Gram-positive spore-forming sulfate-reducers and particularly members from the genus
Desulfotomaculum are ubiquitous in the deep biosphere as revealed by cultural and
molecular approaches. Available data about Desulfotomaculum spp. and related species
from studies carried out from deep freshwater lakes, marine and oceanic sediments,
oligotrophic and rich in organic matter deep geological settings are discussed in this
review. Considering the specific environmental conditions of the deep subsurface, i.e.
absence of oxygen, temperature, oligotrophic conditions, Desulfotomaculum spp., with
their sulfate-reducing metabolism and their ability to sporulate, are well adapted for the
colonization of the subsurface through a slow sedimentation process. In addition, owing
to their ability to grow autotrophically (H2/CO2) and possibly their homoacetogenic
metabolism, these microorganisms may play a key role in lithoautotrophic microbial
communities found in subsurface ecosystems.
Keywords: Desulfotomaculum, deep subsurface, geomicrobiology, sulfate-reduction,
lithoautotrophic, sporulation
Chapitre 1
43
Our current knowledge of the microbiology of the deep terrestrial subsurface is still
very incomplete for many reasons. The first is the relatively small number of published
studies on this subject, which is obviously related to a major difficulty : collecting
representative samples of deep geological formations to study their native microbial
composition is a considerable challenge (Basso et al., 2009). Although this subject is not
discussed enough in studies of deep subsurface, it is very likely that numerous bacterial
communities described as representative of deep environments have been contaminated by
surface organisms (Ollivier et Magot, 2005). Nevertheless, it seems to emerge from these
studies that Gram positive, spore-forming sulfate-reducers are common inhabitants of the
deep subsurface, and may play an essential role in the dynamics of deeply buried anaerobic
bacterial communities. This review aims to summarize available data and discuss the reasons
of the adaptation of this bacterial group to such environments.
1. The Desulfotomaculum genus.
Most of the data discussed in the present review concern Desulfotomaculum species.
Nevertheless, sulfate-reducing Gram-positive Bacteria also include Desulfosporosinus,
Desulfovirgula spp. and the candidate species “Desulforudis audaxviator”. The few available
data dealing with the presence of these three other genera in the deep subsurface will be
discussed later in this paper when necessary.
Desulfotomaculum spp. are anaerobic bacteria using sulfate as terminal electron
acceptor, which is reduced to sulfide. They are members of the phylum Firmicutes, class
Clostridia, order Clostridiales and family Peptococcaceae (Kuever et Rainey, 2009).
Desulfotomaculum cells are straight or curved rods of dimensions 0.3 to 2.5 x 2.5 to 15
microns with rounded or pointed ends. Moreover, Desulfotomaculum spp. are spore-forming
bacteria with central to terminal round or oval spores, often causing swelling of the cells.
Spores can survive for several months or even years under oxic or other adverse conditions,
and sporulation is known to allow cell survival to desiccation, starvation or other stresses
(Kuever et Rainey, 2009). The genus is composed of 30 species and one subspecies described
to date. Among these, 17 are thermophilic or moderately thermophilic, 3 are halophilic and
one is alkaliphilic.
Chapitre 1
44
Beside sulfate, some species described to date can use other sulfur-containing
compunds including thiosulfate, sulfite and elemental sulfur (Kuever et Rainey, 2009). In
addition, Desulfotomaculum reducens was shown to use metals (e.g. Mn(IV), Fe(III), U(VI)
or Cr(VI)) as terminal electron acceptors (Tebo et Obraztsova, 1998). Numerous species
including D. geothermicum, D. salinum or D. kuznetsovii (Daumas et al., 1988 ; Nazina et al.,
1988 ; Nazina et al., 2005), oxidize H2, but also organic acids and long chain fatty acids.
Some Desulfotomaculum spp. may grow autotrophically on hydrogen (Daumas et al., 1988 ;
Nazina et al., 1988 ; Tasaki et al., 1991) or may oxidize it by reducing CO2 into acetate. This
metabolic process known as homoacetogenesis was only demonstrated for D. gibsoniae
(Kuever et al., 1999), however, it has only been investigated in a few species. Several species
use carbohydrates as electron donors. They include D. putei, D. carboxydivorans or D.
geothermicum (Daumas et al., 1988 ; Liu et al., 1997 ; Parshina et al., 2005). Substrates are
either completely oxidized to CO2 or incompletely oxidized to acetate. In the absence of
sulfate, some species can also grow by fermentation of glucose, fructose or pyruvate. It was
also recently shown that Desulfotomaculum sp. Ox39 was reported to utilize aromatic
compounds (e.g. toluene, m-xylene, o-xylene) as carbon and energy sources (Morasch et al.,
2004). This ability to oxidize monoaromatic hydrocarbons has been also reported for other
undescribed members of this genus (Berlendis et al., 2010).
2. Distribution of Desulfotomaculum spp. in the environment.
Desulfotomaculum spp. have been isolated and retrieved by molecular approaches in
various ecosystems including the bovine rumen, feces, rice fields, but also in subsurface
environments including lacustrine and marine sediments, mines, oil reservoirs, or aquifers.
The frequent discovery of spore-forming sulfate-reducers in deep environmental samples
suggest their particular adaptation to such extreme environments which could be attributed to
their capabilities to (i) sporulate, (ii) to possibly grow autotrophically on hydrogen (Klemps et
al., 1985) by reducing sulfate or CO2 to sulfide and acetate, respectively (Kotelnikova et
Pedersen, 1997), and (iii) grow at high temperature.
Various definitions of the deep subsurface have been proposed in the late 80‟s
(Fliermans et Balkwill, 1989 ; Sinclair et Ghiorse, 1989 ; Pedersen, 1993), suggesting an
upper limit varying from 10 to 100 meters below ground or seabed. From our point of view,
Chapitre 1
45
deep environments should rather be defined as subsurface settings isolated from the current
and direct influence of surface environments. Lacustrine or marine deep waters and shallow
sediments thus did not correspond to these definitions, but their will nevertheless be discussed
below since they can be considered as gateways for microorganisms to the “true” deep
subsurface, i.e. the deep geological formations, through the sedimentation processes.
2.1. Deep fresh water lakes.
The surface and deep waters of the meromictic Lake Gek-Gel in Azerbaijan are mixed
less than once a year, resulting in the formation of a deep anoxic zone (Karnachuk et al.,
2006). Desulfotomaculum spp. were detected in the water column of this lake at depth below
31 meters where there is no more dissolved oxygen. In addition, the proportion of
Desulfotomaculum spp. in the water column determined by FISH increased with depth (0% of
total microorganisms at 10 meters, 7% to 31% at 16 meters to 70 meters), while species of the
genera Desulfovibrio and Desulfomicrobium (Deltaproteobacteria) appear to follow a reverse
trend. These results thus suggested that Desulfotomaculum spp. play a major role in the
anoxic zone of the lake.
Strains related to the genus Desulfotomaculum have also been isolated from sediments
of the oligotrophic Lake Stechlin located in the north of Berlin, Germany (Sass et al., 1998).
This lake is a dimictic lake where the deep anoxic zone and the oxic surface layer mix twice a
year, once in winter and the other in summer. In this study, 27 bacterial strains were isolated
from sediments collected near the coast and approximately 30 meters deep in the lake.
Interestingly, all isolated Gram-positive bacteria were related to the genera Desulfotomaculum
and Sporomusa (Möller et al., 1984). They represented nearly 40% of all bacteria isolated at
depth in this lake. Another study on these sediment samples confirmed that
Desulfotomaculum isolates represented the dominant microbial community within the deepest
layers of sediments (Sass et al., 1997). These results are consistent with data reported by Stahl
and colleagues (2002) suggesting that Gram-positive sulfate-reducing bacteria are the main
sulfidogenic microorganisms in deep environments.
Chapitre 1
46
These two studies illustrated that not only sediments, but also lakes waters can be
habitats for anaerobic microorganisms if they are deep enough to have a permanent or semi-
permanent anoxic deep zone. Sass and colleagues (1997) stated that the presence of
Desulfotomaculum spp. in fresh waters is not surprising given the low nutrient intake in these
niches. Indeed, as mentioned above Desulfotomaculum cells can sporulate and thus survive
long deprivation periods. However the spore-forming ability may not be the only reason for
the resistance of these microorganisms in these environments since only 0.5% of
Desulfotomaculum cells sampled in Lake Stechlin were shown to be sporulated and survived
pasteurization (Sass et al., 1997). In contrast, Bak and Pfennig (1991) showed earlier that
50% of the Desulfotomaculum found in Lake Constance (on the border between Switzerland
and Germany) were spore-formers. Nevertheless, it seems that such differences are difficult to
explain until being able to link sporulation with the detailed physico-chemical conditions
which could have influenced it in the studied lakes.
In this respect, the distribution of Desulfotomaculum in deep lakes can be explained by
the adequacy of their physiological characteristics to particular and changing physicochemical
conditions. According to Leloup et al. (2005), Desulfotomaculum are generally predominant
in anoxic environments where sulfate concentrations are low (e.g. 0.01 to 0.2 mmol.L-1
,
Widdel, 1988). The selection of Desulfotomaculum species entering the sedimentation process
should possibly also concern their metabolic capabilities. Castro et al. (2002) reported that
complete oxidizers represented 95% of the Desulfotomaculum spp. in several eutrophic
environments; whereas in pristine environments all Desulfotomaculum-related sequences
were related to incomplete oxidizing species. From these results authors hypothesized that the
versatility of complete oxidizers allows them to proliferate in substrate-rich environments and
that incomplete oxidizers were more adapted to use specific nutrients in pristine
environments. These conditions correspond to those found at the bottom of deep freshwater
lakes, but specific studies dealing with substrate oxidation in these environments are lacking.
Anyway, we can speculate that during water mixing, although nutrients are renewed in depth,
growth of Desulfotomaculum should be limited due to the presence of oxygen. Once the
favorable redox conditions are back in deep water and shallow sediments, Gram-positive
bacterial spores can germinate and growth of selected Desulfotomaculum starts again.
Chapitre 1
47
2.2. Marine and oceanic sediments.
Mineralization of sedimenting organic matter occurs at the seabed where sulfate-
reducing bacteria play a major role in the carbon and sulfur cycles (Jorgensen, 1977). Many
studies have shown the presence of Gram-positive sulfate-reducing bacteria in deep marine
environments (Reed et al., 2002 ; Zhuang et al., 2003 ; Teske, 2006). In sediments under deep
seawater columns, they seem to predominate among all sulfate-reducers, as shown in the
sediments of the 1900 meters deep West Pacific Warm pool, where they represented 54% of
the sulfate-reducing population (Wang et al., 2008). However, FISH counts showed that
Sulfate-Reducing Bacteria (SRB) only constitute 0.34 to 1.95% of the microorganisms in this
ecosystem. Other low reported SRB counts are also consistent with low in situ sulfate-
reducing activity (Ivanov et al., 1980 ; Canfield, 1991 ; D'hondt et al., 2002).
In the Atlantic Ocean, microorganisms related to the genus Desulfotomaculum were
generally not found at deep-sea hydrothermal vents. The Lost City hydrothermal field near the
mid-Atlantic ridge represents a specific unusual case, where Brazelton et al. (2006)
demonstrated that 16S rRNA clones related to D. halophilum (88% similarity) and D.
alkaliphilum (92% similarity) represented the only sulfate-reducing Bacteria identified in this
environment. These results are in agreement with those of Gerasimchuk et al. (2010), as 16S
rRNA clones distantly related to D. alkaliphilum, D. halophilum and D. thermocisternum
were found in sediments collected from the same site (with sequence similarities between 88
and 91%). Furthermore, the potential ability to reduce sulfate was revealed by the detection of
genes encoding the dissimilatory sulfate reductase (dsrAB) enzyme. These genes sequences
were related with those of incomplete oxidizers Desulfotomaculum spp. as described by Klein
et al. (2001). These informations are consistent with the limitation of carbon observed on the
Lost City chimneys, where oxidized organic compounds originate from synthrophic anaerobic
oxidation of methane (Bradley et al., 2009). This support the hypothesis of a better adaptation
of incomplete oxidizers in oligotrophic ecosystems as already discussed (Castro et al., 2002).
Desulfotomaculum spp. were also detected in northern seas. Desulfotomaculum
arcticum was isolated from sediments of Nordfjorden (under a 100 meters deep water
column) on the west coast of Svalbard in the Arctic Ocean (Vandieken et al., 2006). Since this
species grows optimally at 42°C, it was suggested that it was present as spores in the cold
Chapitre 1
48
sediments. D. arcticum share metabolic traits with most of species of the genus, including the
use of H2 as energy source.
The presence of spores in shallow sediments from the Arctic Ocean was revealed by
endospore germination experiments (Hubert et al., 2009). Small ribosomal subunit RNA
genes clone libraries allowed the identification of thermophilic Firmicutes including
Desulfotomaculum spp. Two hypotheses were proposed to explain their presence in the cold
seabed of the Arctic Ocean. The first refers to the oceanic crust fluids that harbor microbial
communities including Firmicutes species (Cowen et al., 2003). These microorganisms might
be transported to the oceanic ridge before being dispersed into the ocean via hydrothermal
vents such as those of the Lost City (Brazelton et al., 2006). The second hypothesis suggests
that spores come from oilfields in which Desulfotomaculum spp. have often been detected
(see below) either from produced oil reservoirs, or from natural seeps. The physiologic traits
of thermophilic bacteria found in the Arctic Sea support the idea of their adaptation to the hot
subsurface conditions. It is thus suggested that the ocean floor would be connected to the
oceanic crust and the oilfields by oceanic fluids, an idea already suggested by Stetter et al. in
1993. More recently, Hubert et al. (2010) showed that spores of thermophilic microorganisms
scattered on the Arctic seabed are able to mineralize complex organic matter at 50°C in vitro.
This activity was catalyzed via extracellular enzymatic hydrolysis, fermentation and sulfate-
reduction. Four distinct Desulfotomaculum phylotypes were identified. The most abundant
was related to D. halophilum (91%), whereas three other clones were related to D.
geothermicum, D. reducens and D. thermosapovorans (95 to 96%). However, considering the
relatively high phylogenetic distances and the absence of data on metabolic genes, one can
only speculate on the presence of spore-forming sulfate reducers. Nevertheless, this suggests
that similar in situ organic matter mineralization activities could be effective in deep
sediments below the ocean floor, spores being buried in deep layers over time, then being
activated by warmer conditions possibly after thousands years of dormancy. Moreover, the
fate of spores scattered on the ocean floors has been studied and it was argued that endospore-
forming bacteria, such as Desulfotomaculum, might remain viable for millions of years (Cano
et Borucki, 1995 ; Parkes et al., 2000 ; Vreeland et al., 2000). Interestingly, a recent study of
sediments from the Baltic Sea by Rezende and colleagues (2013) indicated that the number of
spores of thermophilic Desulfotomaculum decreased from 104 spores per cm
3 of sediment at
the surface to one spore per cm3 at 6.5 m depth. The sediments age at the deeper level being
Chapitre 1
49
approximately 4500 years, the half-life of spores has consequently been estimated to be about
400 years. Nevertheless, if the survival of spores is as short as De Rezende and colleagues
estimated, it seems difficult to explain the abundant presence of Desulfotomaculum in
geological settings located several kilometers deep. Taking into account these contrasting
results, further investigations are needed to clearly understand the connection of
Desulfotomaculum spp. to shallow and deep sea sediments.
2.3. Deep subterranean environments.
2.3.1. Oligotrophic deep geological settings.
Microbiological studies of deep subsurface samples are scarce. Sampling deep
geological layers is most often closely linked to industrial activities, although specific national
or international scientific programs dedicated to the study of the deep subsurface do exist. The
reason is obviously that the cost of drilling at great depths can generally be assumed only if
there is a commercial interest. Most of these studies are thus related to the industrial
exploitation of the subsurface, including mining, oil production, aquifers, or different types of
storages in the subsurface (e.g. natural gas, nuclear wastes). Although these environments
have many similar physical properties (temperature, pressure …), they are very different
regarding the nutrient availability.
Ore mining gives access to very deep geological layers. Microbiological studies
carried out in the mines often highlighted the presence of Gram-positive sulfate-reducing
Bacteria adapted to the in situ extreme conditions. In Japan, D. thermosubterraneum was
isolated from a geothermally active underground mine at a depth of 250 meters (Kaksonen et
al., 2006). This species is thermophilic (optimum temperature between 60 and 65°C), using a
wide range of electron donors and is notably able to grow autotrophically on H2.
Desulfovirgula thermocuniculi, another Gram-positive sulfate-reducing Bacteria was isolated
from the same mine. This novel thermophilic genus use H2 and various organic acids as
electron donors and may ferment pyruvate and lactate (Kaksonen et al., 2007).
Different Gram-positive SRB were detected in the Kamaishi mine (Ishii et al., 2000).
Their 16S rRNA gene sequences related to both mesophilic and thermophilic Bacteria were
Chapitre 1
50
retrieved from 400 and 800 meters deep anoxic cold water samples (10-15°C). A new
examination of these sequence data shows that the closest relatives were Desulfotomaculum
geothermicum (91% similarity) but also other Gram-positive genera and species including
Desulfosporosinus lacus (91%), Desulfosporosinus acidiphilus (93%), Desulfosporosinus
youngiae (95%), and Candidatus Desulforudis audaxviator (93%). We calculated that these
phylotypes represent approximately 60% of the 16S rRNA genes, demonstrating the
importance of spore-forming bacteria in this environment. However, lack of data on
vegetative vs sporulated cells limits the interpretation regarding the activity of these Bacteria
under the mesothermic in situ conditions.
The importance of Gram-positive SRB in deep environments is also emphasized by
data from the Toyoha mine (Nakagawa et al., 2002). The dsrAB gene sequences from high
temperatures samples (50 to 70°C) indicated the presence of microorganisms closely related
to two autotrophic species, D. kuznetsovii and D. thermocisternum. The Desulfotomaculum
species harbouring these genes could thus possibly thrive autotrophically in the mine, thus
participating to a subsurface lithoautotrophic microbial ecosystem (SLiME) as described by
Stevens and McKinley (1995).
Prokaryotes were also found in much deeper environments, as in a South Africa mine
where two genera, Desulfotomaculum and Methanobacterium, represented the dominant
microflora (Moser et al., 2005). Clone libraries of 16S rRNA, sulfite reductase (dsrAB) and
methyl-coenzyme M reductase genes were constructed from 3200 and 3300 meters deep
samples. At 3200 meters Desulfotomaculum spp. represented 100% of the bacterial clones
(16S rRNA and dsrAB) and Methanobacterium 100% of archaeal clones. At 3300 meters the
trend is the same, with of 98% and 97% respectively. Unfortunately the results obtained by
this type of approach did not allow the estimation the bacteria/archaea balance. However, it
was assumed that both groups coexist without any becoming permanently dominant, due to
the specific conditions prevailing in this environment (Moser et al., 2005). Unlike the
conditions observed in the seabed (Parkes et al., 2000 ; D'hondt et al., 2004) or in the shallow
continental sediments, hydrogen is not a limiting electron donor in this environment. Thus,
Moser and his colleagues argue that Desulfotomaculum populations are limited by the low
sulfate content, whereas the Methanobacteriaceae populations are limited by the low
bioavailability of carbonates used as electron acceptors (high pH, high concentration of Ca2+
Chapitre 1
51
...) and the low energy supplied by methanogenesis in these conditions. As discussed before,
the presence of these two microbial genera has also been reported in the Lost City samples
(Gerasimchuk et al., 2010). Beside microbial diversity, temperature (60-75°C), pH (9-11) and
high concentrations of CH4 and H2 were similar in both environments.
The most extreme case of microbial adaptation to depth was described in the 3 km
underground Mponeng gold mine in South Africa. Chivian and colleagues (2008) revealed an
ecosystem containing a single (or extremely dominant) microbial species, Candidatus
Desulforudis audaxviator. This uncultivated Gram-positive putative sulfate-reducer, whose
closest relative is Pelotomaculum thermopropionicum, is only known by the sequence of its
genome, retrieved from a metagenomic study of a fault water sample. Genes necessary for
autotrophic life and sulfate reduction were shown to be present, in agreement with the
adaptation of D. audaxviator to its deep environment. Its genetic package also includes
sporulation genes. In contrast to studied Desulfotomaculum spp., the genome of D.
audaxviator does not contain the information for a complete system of resistance to oxygen,
suggesting a long-term isolation of the species (Chivian et al., 2008).
Few studies of the microbial diversity of deep aquifers have been published, but deep
water-bearing formations are potentially favorable to the development of Desulfotomaculum
and Desulfosporosinus species (Colwell et al., 1997 ; Detmers et al., 2001 ; Stahl et al., 2002
; Detmers et al., 2004). Studies of an aquifer preserved from human activity have shown the
presence of Desulfotomaculum spp. in the 120 m deep geological formation (Detmers et al.,
2004). Eight strains were isolated from these samples including 6 Firmicutes, among which 4
strains related to the genus Desulfotomaculum. The authors suggested that these
microorganisms were indigenous to this type of geological formation. Other deep aquifer
samples were studied by Itavaara and colleagues in Finland (2011). Clone libraries from three
different depths (0-100 meters, 900-1000 meters and 1400-1500 meters) showed that the
proportion of Desulfotomaculum spp. and Desulfosporosinus spp. increased with depth. They
represented up to 23% of the sequences obtained at 1500 meters and only 8.5% at 1000
meters. It is interesting to note that sporulated Gram-positive Clostidia (the bacterial class
including Desulfotomaculum spp. and Desulfosporosinus spp.) in the clone library account for
75% of the sequences obtained at 1500 meters deep.
Chapitre 1
52
More recently, Desulfotomaculum spp. were shown to represent 25% of the 16S rRNA
sequences retrieved from a 800 meters-deep aquifer of the Paris Basin (Basso et al., 2009).
Four phylotypes related to D. putei (97%), D. geothermicum (95%), D. arcticum (95%) and
D. kuznetsovii (91%) were characterized. Although many Desulfotomaculum-related
sequences were present in the clone library, cultivation experiments were not successful,
highlighting the difficulty to grow and isolate spore-forming sulfate-reducers among fast
growing other bacterial types (e.g. Desulfovibrio spp.).
2.3.2. Deep environments rich in organic matter.
Since the early 1980s, microbiological studies of deep oilfields production waters
allowed to better understand the adverse effects of sulfate-reducing microorganisms in the oil
industry: corrosion of equipments, decrease of the permeability of geological formations by
precipitation of iron sulfides, hydrogen sulfide harmful to the health of employees, "souring"
of reservoirs, and decrease of the crude oil value. These studies highlighted the presence of
many sulfate-reducing bacteria including thus pertaining to the genus Desulfotomaculum in
very deep geological formations in geographically distant locations (Magot et al., 2000 ;
Ollivier et Magot, 2005 ; Ollivier et Alazard, 2010). Particular attention was paid to the North
Sea oilfields (Rosnes et al., 1991 ; Nilsen et al., 1996a ; Nilsen et al., 1996b ; Leu et al., 1998
; Gittel et al., 2009) where the presence of Desulfotomaculum species in reservoirs between 2
and 4 km below the seabed was constantly reported. These observations support the
hypothesis discussed above that thermophilic microorganisms found in the Arctic Ocean
could originate from the North Sea oil reservoirs (Hubert et al., 2010). In addition, the
presence of Desulfotomaculum spp. was also reported in oilfield production water in France
(Tardy-jacquenod et al., 1996), China (Liu et al., 2008 ; Lan et al., 2011) , India (Agrawal et
al., 2010), and in numerous other locations on the planet (Ollivier et Magot, 2005).
Recently, Guan et al. (2013) showed that in four distant Chinese oil reservoirs SRB
diversity was low with a predominance of Desulfotomaculum species and lower
representation of Deltaproteobacteria. A positive correlation was made between the presence
of Desulfotomaculum phylotypes and depth. In wells S4 (480 meters, 28°C), S3 (802 meters,
37°C) and S1 (1300 meters, 62°C), Desulfotomaculum 16S rRNA gene sequences represented
10%, 40% and 70% of the total SRB sequences respectively. In samples from well S2 (1490
Chapitre 1
53
meters, in situ temperature of 58°C) Desulfotomaculum 16S rRNA gene sequences
represented 80% of total SRB phylotypes. Other correlations obtained by statistical tests with
e.g. sulfate, acetate and propionate concentrations seem less convincing and deserve further
investigations.
Four validly described Desulfotomaculum species were originally isolated from oil
field waters: D.kuznetsovii, D. salinum, D. thermocisternum and D. halophilum (Nazina et al.,
1988 ; Nilsen et al., 1996b ; Tardy-Jacquenod et al., 1998 ; Nazina et al., 2005). Interestingly,
both complete and incomplete substrates oxidizers were described (Table 1). This observation
could be analyzed as contradictory with the hypothesis of Castro and colleagues (2002)
suggesting a better adaptation of complete oxidizing Desulfotomaculum to substrate-rich
environments. But the eutrophic environments of the Everglades studied by Castro et al.,
(2002) are extremely different from oil reservoirs where crude oil and its hydrocarbon
components are not easily utilizable substrates under anaerobic conditions.
Table 1.2: Main characteristics of Desulfotomaculum species isolated from the deep
subsurface. Dm = Desulfotomaculum, Dr = Desulfoviridis, Dv = Desulfovirgula, Ds =
Desulfosporosinus, ND = Not Determinated.
Conclusion
Data collected during the past two decades on the microbiology of deep subsurface
environments demonstrate that sulfate-reducing prokaryotes, with a peculiar emphasis for
Desulfotomaculum species and closely related sulfate-reducing spore-formers, are ubiquitous
in the deep biosphere. Several physiologic and metabolic characteristics helped them to
Complete Incomplete H2 SugarsLong chain
fatty-acids
Dm. arcticum Marine sediments SO42-, SO3
2-, S2O32- ND ND + - + Vandieken et al ., 2005
Dm. australicum Aquifer (Great Artesian Basin) SO42-
, SO32-
, S2O32- X + - + Love et al ., 1993
Dm. geothermicum Geothermal groundwater SO42-
, SO32- X + + + Daumas et al ., 1988
Dm. halophilum Oilfield SO42-, SO3
2-, S2O32- X + - - Tardy-Jacquenod et al ., 1998
Dm. kuznetsovii Oilfield SO42-, SO3
2-, S2O32- X + - + Nazina et al ., 1988
Dm. luciae Deep terrestrial drilling SO42-
, S2O32- X + - - Liu et al ., 1997
Dm. salinum Oilfield SO42-
, SO32-
, S2O32- X + - + Nazina and Rozanova, 1978
Dm. putei Deep terrestrial drilling SO42-, SO3
2-, S2O32- X + - - Liu et al., 1997
Dm. sp. OX39 Aquifer (former gas plant) SO42- X - - - Morasch et al ., 2005
Dm. thermocisternum Oilfield SO42-
, S2O32- X + - + Nilsen et al ., 1996
Dm. thermosubterraneum Mine SO42-
, SO32-
, S2O32-
, S0 X + - + Kaksonen et al ., 2006
Dm. varum Aquifer (Great Artesian Basin) SO42-, SO3
2-, S2O32- ND ND + + ND Ogg and Patel, 2011
Dr. audaxviator Mine ? X + ? ? Chivian et al ., 2008
Dv. Thermocuniculi Mine SO42-, SO3
2-, S2O32-, S0 X + - + Kaksonen et al ., 2007
Ds. Lacus Lake SO42-
, SO32-
, S2O32- X + - - Ramamoorthy et al ., 2006
Dm = Desulfotomaculum ; Dr = Desulforudis ; Dv = Desulfovirgula ; Ds = Desulfosporosinus
Species Origin Electron acceptors
Oxidization of substrates
Reference
Chapitre 1
54
invade these isolated ecological niches, and to adapt to their extreme physico-chemical
conditions in terms of temperature, pressure, or low nutrient availability.
It is well documented that spore-formation can help survive transient adverse
conditions, possibly during thousands or millions of years (Vreeland et al., 2000). This also is
putatively one of the key characteristic helping the subsurface colonization through the
sedimentation process by spore-forming, either sulfate-reducing or fermentative bacteria
within the order Clostridiales. It allows survival to long periods of nutrient deprivation,
presence of oxygen, unfavorable temperature or redox conditions, as possibly illustrated by
the microbiology of very deep lakes. At the term of the sedimentary process, extreme
situations can be reached as in the case of the putative spore-forming Candidatus
Desulforudis audaxviator that became the single bacterial autonomous species in its deep
environment.
This specific case is also an illustration of a metabolic key advantage of
Desulfotomaculum spp. and related species in the deep subsurface: their capability to grow
autotrophically at the expense of hydrogen as electron donor and carbon dioxide as carbon
source. It cannot be a coincidence that most if not all Desulfotomaculum spp. isolated from
subsurface environments are autotrophic microorganisms. This metabolic ability allows them
to take advantage of the recognized ubiquitous resource in hydrogen in the deep subsurface
(Lin et al., 2005). In this way, they could be a significant, even major component if the so-
called SLiMEs, Subsurface Lithoautotrophic Ecosystems as defined by Stevens et al. (1995).
Interestingly, some of these SRB may perform a homoacetogenic metabolism by oxidizing
hydrogen and reducing CO2. Consequently, we may expect the delivery of acetate resulting
from this metabolic process as being beneficial to the overall microbial community and
particularly to other hydrogenotrophic sulfate-reducing bacteria, but also hydrogen-oxidizing
methanoarchaea inhabiting subterrestrial ecosystems which require a carbon organic source
for their growth. Besides sulfate reduction, we must also take into account the fact that
Desulfotomaculum spp may also use metals and metalloids as terminal electron acceptors thus
confirming their geomicrobiological significance in the deep biosphere where these mineral
compounds are quite widespread. Data on this point are nevertheless scarce, and deserve more
investigations.
Chapitre 1
55
More exhaustive characterization of the physiology and metabolism of Gram-positive
SRB should help to better understand their adaptation to their environments, or even their role
in the emergence of different forms of life on Earth. As an example, little is known on the
ability of Desulfotomaculum spp. to disproportionate elemental sulfur into sulfide and sulfate.
If this is a common trait in this microbial group, it should be taken into consideration as it
could have played a significant role in the early archaean ecosystems where sulfide could
have originated from sulfur disproportionation rather than from sulfate-reduction (Philippot et
al., 2007 ; Ollivier et Guyot, 2009).
Determining to what extent Desulfotomaculum spp. are essential components for life
in the subsurface remains a major challenge. Collecting microbiologically representative
samples from the deep subsurface is an important technical difficulty. Furthermore, the
objective of achieving the most comprehensive studies, including analysis of microbial
diversity, physiological and metabolic characterization of isolates, and measurements of in
situ activity is actually hard to achieve.
Acknowledgments
Storengy and TIGF are acknowledged for their financial support to this work.
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61
Chapitre 2 : Matériels
et Méthodes
62
Chapitre 2
63
1. Techniques de microbiologie.
1.1. Echantillonnage.
Les communautés microbiennes étudiées proviennent de sites de stockage de gaz
naturel en aquifère profond. Les prélèvements ont été réalisés sur des puits de contrôle de
l‟aquifère préalablement nettoyés selon le protocole décrit par Basso et al. (2005). La collecte
des échantillons a été réalisée à l‟aide d‟un tuyau Norprène A-60-F stérile connecté à la tête
de puits. Ce tuyau a été piqué par des aiguilles Admix Needle® (18 G1 ½TW, Nokor®),
reliées à des flacons stériles et pré-conditionnés, contenant un mélange gazeux (N2: 95%, H2:
5%). Dans le but de récupérer davantage de biomasse, d‟autres échantillons d‟eau ont été
filtrés sur des filtres 0,22 μm en polycarbonate Millipore Stérivex GT (2 ml, Fig. 2.1) et eux
aussi branchés directement sur le tuyau. Les filtres ont été préservés en anaérobiose dans des
sachets Anaerocult® à la fin du prélèvement, puis, de retour au laboratoire, ils sont démontés
dans une chambre anaérobie de façon stérile et resuspendus dans un faible volume d‟eau du
site (200 mL) afin d‟obtenir une biomasse concentrée.
Figure 2.1 : Concentration de la biomasse du site sur filtre Stérivex (Millipore).
Chapitre 2
64
1.2. Milieux de culture.
Des milieux de culture ont été réalisés pour le dénombrement des microorganismes
prélevés lors de l‟échantillonnage. Les milieux anaérobies ont été répartis (9 mL/tube) dans
des tubes de Hungate ou des tubes Bellco pour les milieux contenant du H2/CO2 (80% / 20%).
Les milieux aérobies ont été réalisés en boîte de Pétri. Ces milieux ont été conçus pour obtenir
des conditions de cultures adaptées à la majorité des métabolismes connus. Les différents
milieux de culture et les métabolismes associés sont répertoriés dans le tableau 2.1. Leur
composition minérale est ajustée à celle de l‟eau du site. Les compositions des milieux de
culture spécifique et celles des milieux reproduisant les eaux de sites sont répertoriées dans le
tableau 2. Les dénombrements ont été réalisés dans ces différents milieux de cultures selon les
techniques du Nombre le Plus Probable (NPP) pour les milieux liquides anaérobies et de
l‟Unité Formant Colonie (UFC) pour les milieux solides aérobies.
Les solutions d‟oligoéléments SL12 et de vitamines V7 décrites dans le tableau 2.2 ont été
respectivement préparées selon les protocoles décrits par Eichler & Pfennig (1986) et Pfennig
et al. (1981).
Tableau 2.1: Milieux de cultures pour le dénombrement.
Désignation Groupes bactériens ciblés
Kits Labège BSR® Bactéries sulfato-réductrices
483/2 Bactéries hétérotrophes fermentaires
654 Bactéries oligotrophes
697c Bactéries sulfo-réductrices
783/1 Bactéries thiosulfato-Réductrices
792 Bactéries ferri-réductrices
793 Bactéries dénitrifiantes
860 Bactéries méthanogènes
hydrogénotrophes
861 Bactéries méthanogènes
méthylotrophes
862 Bactéries acétogènes
Chapitre 2
65
Tab
leau
2.2
: C
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lisé
s au
cours
de
cett
e ét
ud
e (e
n g
.L-1
).
Chapitre 2
66
1.3. Microcosmes pour les tests de biodégradation.
Des essais de biodégradation des BTEX ont été réalisés à partir de l‟eau provenant des
aquifères afin d‟évaluer la capacité des communautés microbiennes présentes à dégrader ces
composés. Ces microcosmes ont été réalisés de deux façons: (1) en ajoutant directement les
divers substrats dans des flacons contenant de l‟eau du site en anaérobiose ou (2) en ajoutant
ces substrats dans des flacons contenant de la biomasse concentrée issue de la filtration avec
les filtres Stérivex.
Les microcosmes ont été réalisés dans un volume final de 40 mL dans des flacons
pénicilline d‟une capacité de 60 mL fermés par des bouchons butyl et sertis avec des capsules
en aluminium. L‟ensemble des essais ont été supplémentés avec 10 ppm de chaque BTEX.
Trois flacons sont utilisés pour chacune des conditions testées : deux flacons pour le suivi de
la dégradation et un flacon servant de témoin abiotique (la communauté microbienne étant
inhibée par 5% d‟HCl 10N).
Pour chaque type de microcosme (avec biomasse concentrée ou non), 12 conditions
différentes (soit 36 flacons) ont été testées. Parmi ces conditions quatre métabolismes ont été
ciblés : la sulfato-réduction (21 flacons), la dénitrification (3 flacons), la méthanogenèse (3
flacons) et la ferri-réduction (3 flacons). Trois flacons supplémentaires (pour chaque type de
microcosme) ont été supplémentés avec du sulfate, du nitrate et du fer en même temps. Les
trois derniers n‟ont été supplémentés qu‟avec les BTEX afin de tester une dégradation dite
« spontanée ». Tous les microcosmes, à l‟exception de la condition « spontanée », ont été
supplémentés avec des mélanges de vitamines, d‟oligoéléments (voir paragraphe 1.2.),
d‟ammonium/phosphate ainsi qu‟avec du dithionite de sodium (leur préparation est détaillée
ci-dessous). L‟ensemble des éléments ajoutés dans ces microcosmes est répertorié dans le
tableau 2.3.
Tableau 2.3 : Composition des microcosmes pour la dégradation des BTEX.
Chapitre 2
67
La solution PN évoquée dans le tableau 2.3 est composée de 50 g.L-1
de NH4Cl, 30
g.L-1
de KH2PO4 et 30 g.L-1
de K2HPO4.
L‟ensemble des microcosmes a été ajusté au pH et à la température de l‟aquifère.
Cependant, certains microcosmes supplémentés en sulfate ont été incubés à différentes
températures et différents pH. Les températures testées sont 37, 42 et 60°C et les pH testés
sont 6, 6,5 et 8 (3 flacons par condition et par type de microcosme).
1.4. Isolement des microorganismes.
La souche Ss001 a été isolée à partir d‟un essai de biodégradation réalisé à partir
d‟échantillons issus du site D, incubé à 60°C et dégradant le p-xylène. L‟isolement a été
réalisé par la méthode dite d‟extinction-dilution. Des dilutions successives de la culture ont
été réalisés dans de l‟eau de site supplémentée avec les mêmes solutions que les microcosmes
utilisés pour les tests de dégradation en sulfato-réduction (tableau 3) mais également avec de
l‟extrait de levure (1 g.L-1
) et du p-xylène (34,3 mg.L-1
soit 20 ppm). La dilution la plus
élevée ayant donné lieu à une croissance est conservée. L‟expérience a été répétée 2 fois et la
dernière culture ainsi obtenue a été considérée comme pure.
La souche VNs101 a été isolée à partir d‟un essai de biodégradation réalisé à partir
d‟échantillons issus du site A, incubé à 37°C et dégradant le toluène. L‟isolement a été réalisé
par la méthode des séries de dilution en gélose profonde (Trüper et Pfennig, 1992). La
communauté utilisée dans le cadre de l‟expérience SIP (voir paragraphe 3.10.) a été chauffée
à 80°C pendant 30 min afin de sélectionner les populations sporulées. Après chauffage, la
communauté a été repiquée sur un milieu riche pour sulfato-réducteur (Kit LabègeTM
). Après
croissance, la communauté a de nouveau été chauffée à 80°C puis repiquée sur le même
milieu. Enfin, une culture en gélose profonde a été réalisée en milieu Kit LabègeTM
. Pour cela
une eau gélosée à 30 g.L-1
a été préparée avec de l‟agar préalablement lavée à l‟eau distillée.
Elle a ensuite été distribuée dans des tubes Hungate à raison de 3 mL/tube. Ces tubes ont
ensuite été placés sous atmosphère de N2 avant d‟être autoclavés (120°C pendant 20 min).
Avant utilisation les tubes ont été plongés dans un bain-marie bouillant puis 6 mL de milieu
culture stérile (Kit LabègeTM
) ont été introduits dans le tube. Le tube a alors été maintenu en
surfusion à 45°C avant d‟être ensemencé avec 1 mL de suspension cellulaire. Après
homogénéisation, refroidissement et solidification du milieu, les tubes ont été incubés à 50°C.
Chapitre 2
68
Les colonies se développant dans les tubes gélosés ont ensuite été prélevées à l‟aide d‟une
pipette pasteur effilée, sous une loupe binoculaire, puis resuspendues dans un milieu liquide
(Kit LabègeTM
).
La pureté des souches isolées a été vérifiée par des observations microscopiques à
contraste de phase, des ensemencements de milieu riche (LB Broth 20 g.L-1
, extrait de levure
0,1 g.L-1
, lactate 5 mM, pyruvate 5 mM, glucose 1mM) en aérobiose et anaérobiose, ainsi que
le clonage et le séquençage des gènes d‟ARNr 16S et de sous unités de la sulfite réductase
(dsrAB) à partir de plusieurs repiquages successifs.
1.5. Caractérisation des souches.
1.5.1. Tests de substrats.
Les souches provenant de pré-cultures réalisées dans de l‟eau de site supplémentée
avec de l‟extrait de levure (1 g.L-1
) ont été ensemencées dans une fiole de Widdel (inoculum
5%) contenant de l‟eau de site synthétique adaptée (Widdel et Bak, 1992). Le milieu a été
réparti dans des tubes Bellco (20 mL / tube ; bouchon butyl ; sertissage par capsule
d‟aluminium) et les substrats (3 tubes par substrat) ont été ajoutés aux concentrations
souhaitées (Tableau 3). La croissance des souches en présence des différents substrats est
suivie de façon indirecte par dosage des sulfures (voir 2.2.), dosage protéique (voir 2.3.) et par
mesure de densité optique (DO) à 450 nm. La croissance de la souche sur les différents
substrats est comparée à celle de témoins ensemencés sans substrat. Dans le cas des
hydrocarbures disponibles à l‟état solide (naphtalène, 1,3-diméthylnaphtalène), le substrat a
été dissout dans de l‟acétone de façon à avoir une solution la plus concentrée possible. Un
volume de cette solution a ensuite été ajouté dans un tube Bellco vide et stérile afin
d‟atteindre la quantité d‟hydrocarbure souhaitée dans le milieu de culture (Tableau 2.4).
Après évaporation de l‟acétone, le milieu de culture a été ajouté et le tube scellé afin d‟éviter
l‟évaporation de l‟hydrocarbure.
Chapitre 2
69
Tableau 2.4 : Concentrations finales des substrats et accepteurs d‟électrons utilisés pour la
caractérisation de souches.
1.5.2. Tests d’accepteurs d’électrons.
Le protocole expérimental est identique à celui précédemment décrit. Néanmoins, dans
ce cas, le milieu minéral de base est exempt d‟accepteurs d‟électrons. La source de carbone et
d‟énergie utilisée pour ces tests est celle ayant permis la meilleure croissance au cours des
tests de substrats. Les accepteurs d‟électrons testés sont présentés dans le tableau 2.4.
Chapitre 2
70
1.5.3. Capacité à fermenter.
La capacité à fermenter a été testée avec un milieu minéral de base ne contenant ni
accepteur d‟électrons, ni aucune autre source de carbone que celle testée. Les composés testés
pour la fermentation sont présentés dans le tableau 2.4.
1.5.4. Ecophysiologie.
La température optimale de croissance de la souche Ss001 a été testée sur le milieu de
croissance optimal. Tous les tests ont été réalisés en triple, et les tubes ont été ensemencés
avec 10% (v/v) d‟une pré-culture en phase exponentielle de croissance. La croissance est
suivie de façon indirecte par dosage des sulfures (voir 2.2.). Les taux de croissance ont été
calculés pour chaque température testée (37, 42, 45, 50, 55 et 60°C).
Le pH optimal de croissance a été déterminé de la même façon que précédemment et à
température optimale. Les pH testés sont 5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ; 8 et 9.
La salinité optimale a également été déterminée en utilisant un milieu minéral dépourvu de
chlorure de sodium, à température optimale, pH optimal et avec le substrat et l‟accepteur
d‟électrons ayant permis la croissance la plus rapide. Les valeurs testées sont : 0 ; 0,5 ; 1 ;
1,5 ; 2, 4 et 10 g.L-1
de chlorure de sodium.
2. Techniques de dosage.
2.1. Suivi de dégradation des BTEX.
Le suivi de la dégradation des BTEX a été réalisé par SPME/GC/FID à l‟aide d‟un
auto-échantillonneur Combi Pal (CTC Analytics) couplé à un chromatographe 7890A
(Agilent Technologies) équipé d‟un détecteur à ionisation de flamme. Des échantillons de
milieux de culture (300 µL) ont été prélevés périodiquement, transférés dans des flacons à
chromatographie puis acidifiés avec 10 µL d‟HCl (3N). Une fibre SPME (Supelco, 75µm
carboxen-PDMS) a été utilisée pour adsorber les BTEX de la phase gazeuse pendant 10
secondes. Le temps de désorption dans l‟injecteur du chromatographe était de 100 secondes.
Les composés dosés ont été séparés dans une colonne Optima Wax (Macherey-Nagel) de 30
m x 0,32 mm x 0,50 µm. L‟hélium a été utilisé comme gaz porteur à un débit constant de 1
mL.min-1
. Afin de prendre en compte les pertes abiotiques de BTEX liées à des incubations
Chapitre 2
71
prolongées, la biodégradation des BTEX a été estimée en mesurant la différence de
disparition de ces composés dans les essais de biodégradation et dans les témoins abiotiques
acidifiés. Les résultats sont exprimés par le pourcentage résiduel de BTEX calculé de la façon
suivante [BTEX] = (Ce/Ct) x 100, où Ce représente la concentration du composé dans le
microcosme étudié et Ct représente la concentration de ce même composé dans le microcosme
témoin.
2.2. Dosage des sulfures.
Le dosage colorimétrique des sulfures a été adapté de la méthode décrite par Cline
(1969). Les dosages ont été réalisés en triple. Une solution d‟acétate de zinc 40% a été
répartie dans des tubes à hémolyse (24 µL / tube). Puis, 676 µL de l‟échantillon ont été
ajoutés afin de piéger les sulfures (complexés ou solubles). Par la suite, 200 µL de diméthyl p-
phénylène diaminesulfate (DPDS) ont été ajoutés et la réaction a été initiée par ajout de 10 µL
de chlorure de Fer (III) à 10 % (m/v). Après 20 minutes de réaction la DO à 670 nm a été
mesurée, puis la valeur reportée sur une courbe étalon réalisée avec du Na2S.9H2O.
2.3. Dosage protéique.
La méthode utilisée a été celle développée par Lowry et al. (1951). Une gamme étalon
de protéines a été réalisée avec du Sérum d‟Albumine Bovine ainsi que les différents
réactifs suivants:
Réactif A : CuSO4, 5H2O 1% dans H2O
Réactif B : NaK tartrate 2% dans H2O
Réactif C : Na2CO3 2% dans H2O
Réactif D: 100 mL de réactif C +1 mL de réactif A + 1 mL de réactif B
Réactif E : Folin phénol (à diluer ½ dans H2O)
1) 200 µL de culture ont été dilués dans 3 à 5 mL de NaOH (1 M) en fonction de la
concentration protéique présumée et vortexés.
2) La solution a été placée à 100 °C pendant 10 minutes puis remise à température
ambiante.
3) Un aliquot de l‟échantillon (200 µL) a alors été ajouté à 1 mL du réactif D.
Chapitre 2
72
4) Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, 100 µL de Réactif E ont
été additionnés.
5) Après 30 min, la DO a été mesurée à 663 nm.
La réponse de cette technique de dosage est linéaire dans la gamme de 10 à 200 µg de
protéines. Il est important de noter qu‟il existe de nombreux interférents tels que le K+, Mg
2+,
EDTA, phénols, détergents, agents réducteurs.
3. Techniques de biologie moléculaire.
3.1. Extraction de l‟ADN génomique.
Les extractions d‟ADN génomique ont été réalisées après filtration de 10 mL de
culture sur membrane de nitrate-cellulose (porosité = 0,22 µm). Par la suite, les filtres ont été
plongés dans de l‟azote liquide avant d‟être broyés à l‟aide d‟un pilon et d‟un mortier stériles.
L‟extraction d‟ADN a ensuite été réalisée sur le broyat obtenu à l‟aide du kit PowerSoil DNA
isolation (MoBio Laboratories, Inc.) selon les instructions du fabricant.
3.2. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR).
Les amplifications de fragments spécifiques d‟ADN ont été réalisées par PCR avec le
kit « PCR Core Kit Plus » (Roche) selon les instructions du fabricant et en ajoutant 1 unité
d‟Uracyl DNA Glycosylase (Roche) au mélange réactionnel. Les séquences ciblées, les
amorces correspondantes ainsi que les programmes utilisés sont répertoriés dans les tableaux
2.5 et 2.6. Plusieurs thermocycleurs ont été utilisés mais la plupart des amplifications ont été
réalisées avec le modèle « 2720 thermal cycler » (Applied Biosystems). Les codes Bs105,
Bs107 et Bs109 font références à des souches bactériennes provenant du site C. Les amorces
associées à ces codes (Tableau 2.5) sont spécifiques de ces souches.
Chapitre 2
73
Tableau 2.5 : Amorces utilisées en PCR et qPCR
Tableau 2.6 : Programmes utilisés PCR et qPCR
A B C D E
95°C – 30’’
94°C – 1’58°C – 30’’ x572°C – 2’
94°C – 1’58°C – 30’’ x3572°C – 1’30’’
72°C – 3’
95°C – 5’
94°C – 1’58°C – 30’’ x3072°C – 30’’
72°C – 7’
95°C – 5’
94°C – 1’56°C – 30’’ x3072°C – 30’’
72°C – 7’
94°C – 5’
94°C – 30’’58°C – 1’ x3572°C – 1’30’’
72°C – 10’
94°C – 3’
94°C – 30’’58°C – 30’’ x3572°C – 1’
72°C – 5’
F G H I J
94°C – 5’
94°C – 45’’54°C – 45’’ x3572°C – 1’30’’
72°C – 10’
95°C – 10’
95°C – 30’’55°C – 30’’ F x4572°C – 45’’
+ Programme dissociation curve
95°C – 15’
94°C – 15’’60°C – 30’’ x4572°C – 30’’ F
72°C – 7’
+ Programme dissociation curve
95°C – 10’
95°C – 30’’61°C – 30’’ F x4572°C – 45’’
+ Programme dissociation curve
95°C – 10’
95°C – 30’’58°C – 30’’ F x4572°C – 45’’
+ Programme dissociation curve
Chapitre 2
74
3.3. PCR quantitative (qPCR)
La quantification relative des gènes de l‟ARNr 16S a été réalisée par PCR quantitative
(qPCR) avec le kit SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems). Le thermocycleur
Mx3005P (Stratagene) a été utilisé pour cette étude. Les amorces utilisées ainsi que les
programmes correspondant sont répertoriés dans les tableaux 2.5 et 2.6. Dans le tableau 2.6,
la lettre « F » indique l‟étape à laquelle la fluorescence est mesurée pour les programmes de
PCR quantitative (G, H, I et J).
3.4. Electrophorèse.
La qualité des extractions d‟ADN génomique ainsi que des amplifications par PCR a
été vérifiée par migration électrophorétique en gels d‟agarose (QA-Agarose, Q-Biogène) à 1
% (m/v) dans un tampon TBE 1X (Tris-acide borique 89 mM, EDTA 2 mM) auquel a été
ajouté du bromure d‟éthidium (BET) à une concentration finale de 0,5 µg/mL. La migration
des échantillons a été réalisée en parallèle avec un marqueur de poids moléculaire (Smart
Ladder de 200 pb à 10 000 pb, Eurogentec) dans une cuve à électrophorèse sous une tension
de 100 V pendant 30 minutes. La révélation de l‟ADN a été réalisée par fluorescence en
plaçant les gels d‟agarose sous UV.
3.5. Purification de l‟ADN.
Les fragments d‟ADN amplifiés par PCR ont été purifiés à l‟aide du kit « illustra GFX
PCR DNA and Gel Band Purification Kit » (GE Healthcare) selon les instructions du
fabricant.
3.6. Clonage/Séquençage.
Certains fragments d‟ADN amplifiés ont été clonés à l‟aide du kit « TOPO TA cloning
kit » (Invitrogen) dans des cellules compétentes fournies dans le kit « One shot TOP10
chemically competent E. coli » (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Les clones
positifs ont été sélectionnés aléatoirement et repiqués. La présence d‟un insert chez ces clones
a été vérifiée par PCR à l‟aide des amorces M13 (Tableau 2.5). Les produits PCR positifs ont
Chapitre 2
75
été séquencés par Qiagen sequencing services (Allemagne) par des séquenceurs de type ABI
3700 et ABI 3730XL (Applied Biosystems).
3.7. Analyse des séquences et phylogénie.
Les séquences nucléotidiques brutes des gènes étudiés ont été nettoyées et assemblées
en contigs à l‟aide du logiciel Sequencher 4.1.4. (Gene Codes®). Ces séquences ont par la
suite été alignées avec celles des banques de données (NCBI) à l‟aide du logiciel MUSCLE
(Edgar, 2004). Pour les analyses de phylogénie, les séquences ont été ajustées à la taille de la
séquence la plus courte à l‟aide du logiciel ProSeq (Filatov, 2002). L‟ensemble des séquences
a finalement été analysé par Maximum Likelihood à l‟aide du logiciel MEGA5 (Tamura et
al., 2011) et la robustesse des arbres phylogénétiques obtenus a été évaluée par un test de
bootstrap (500 itérations).
3.8. Terminal-Restriction Fragments Length Polymorphism (T-RFLP).
Les gènes de l‟ARNr 16S ont été amplifiés par PCR en utilisant l‟amorce 8F marquée
en 5‟ avec le fluorochrome Fam (5′-tetrachlorofluorescein phosphoramidite-AGA GTT TGA
TCC TGG CTC AG-3′) et l‟amorce 1387R (tableau 3). Néanmoins, dans certains cas une
PCR nichée a été réalisée avec l‟amorce 338F marquée en 5‟ avec du Fam et l‟amorce 907R.
Pour l‟analyse T-RFLP, les fragments PCR marqués au Fam ont été purifiés à l‟aide du kit
« illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit » (GE Healthcare) (voir 3.5.). Ces
fragments ont ensuite été digérés par restriction enzymatique en mélangeant 8,7 µL du produit
PCR purifié (20 ng/µL), 0,3 µl d‟enzyme (3 unités, choix de l‟enzyme déterminée selon
l‟analyse, New England Biolabs) et 1 µL de tampon 10x (correspondant à l‟enzyme selon les
instructions du fabricant) puis en incubant le mélange à la température optimale de l‟enzyme
(indiquée par le fabricant) pendant 3h. Les digestions ont été doublées. Un microlitre de
produit de digestion a été mélangé avec 8,75 µL de formamide déionisée et 0,25 µL d‟un
étalon de taille interne (Genescan Rox-500, Applied Biosystems). Le mélange a ensuite été
dénaturé à 95 °C pendant 5 min puis immédiatement transféré sur de la glace. Les fragments
de restriction ont été analysés à l‟aide d‟un séquenceur 3130xl Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). L‟analyse statistique des données de T-RFLP a été réalisée selon la méthode
Chapitre 2
76
décrite par Abdo et al. (2006). Les séquences issues des clonages et les données de T-RFLP
ont été comparées à l‟aide du logiciel TRiFLe (Junier et al., 2008).
3.9. Technique de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization).
Le protocole a été adapté à partir des travaux de Detmers et al. (2004) et de Pernthaler
et al. (2004). La fixation des cellules a été réalisée en diluant 1 mL de culture (ou 0,1 mL
selon la densité cellulaire) dans 9 mL d‟éthanol 50% (ou 9,9 mL). Le mélange a été placé 2 h
à 4°C puis filtré lentement (dépression de 5 mm Hg maximum) sur membrane de
polycarbonate de 25 mm de diamètre et 22 µm de porosité (Millipore). Le filtre a par la suite
été rincé avec 5 mL de PBS 1X puis déshydraté avec 5 mL d‟une solution de PBS 1X et
éthanol 50%. Les cellules ainsi fixées, le filtre a été découpé en quartiers puis stocké à -20°C.
L‟hybridation avec les sondes nucléotidiques marquées par les fluorochromes a été réalisée en
déposant un quart du filtre sur une lame de verre et en l‟imbibant d‟une solution composée de
18 µL de tampon d‟hybridation (0,9 M de NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), SDS 0,01 % + 30
% de formamide) et de 2 µL de sonde (50 ng/µL). Cette solution est préparée
extemporanément et protégée de la lumière. La lame a ensuite été insérée dans un flacon
hermétique (Falcon 50 mL) et un papier absorbant humidifié avec du tampon d‟hybridation a
été inséré sous la lame. Le flacon a ensuite été plongé dans un bain à 46°C à l‟abri de la
lumière pendant 2h.
Après hybridation, le filtre a été lavé à l‟aide d‟un tampon Tris 20 mM, EDTA 5 mM,
SDS 0,1%, NaCl 28 mM, puis rincé avec de l‟eau stérile. Le filtre a ensuite été séché à l‟air et
à l‟obscurité pendant 20 minutes. Le filtre a ensuite été monté entre lame et lamelle avec une
solution de montage SlowFade Gold Antifade Reagents avec ou sans DAPI (Invitrogen). La
fluorescence a été observée au grossissement x1000 à l‟aide d‟un microscope à
épifluorescence Olympus BX60 équipé d‟une lampe au mercure et d‟une caméra
monochrome 12 bits (QIClick). Seuls deux fluorochromes différents ont été utilisés
simultanément pour limiter les interférences. Les filtres Olympus U-MWIY2 et U-MWB2 ont
été utilisés pour les distinguer.
Les sondes utilisées, leurs cibles, ainsi que les filtres correspondants sont indiqués
dans le tableau 2.7.
Chapitre 2
77
Tableau 2.7 : Liste des sondes FISH utilisées lors de cette étude.
Les sondes s105 et s107 ont été développées dans cette étude contrairement aux
sondes Eub338 (Amann et al., 1990) et Non-Eub (Wallner et al., 1993). Les sondes s105 et
s107 ont été conçues pour s‟hybrider sur l‟ARNr 16S des souches Bs105 et Bs107 dans la
seule zone suffisamment divergente entre les deux séquences pour permettre leur distinction
par la technique FISH. Après traitement de la séquence de Bs107 à l‟aide du logiciel ARB
(www.arb-home.de) afin de modéliser la structure 2D de la molécule d‟ARNr 16S (Figure
2.2), il est à noter que les séquences d‟intérêt se trouvent dans une région difficilement
accessible par les sondes. Si l‟on se réfère à ce que l‟on connait de l‟ARNr 16S d‟Escherichia
coli, il semblerait que les positions des sites ciblés par nos sondes se situent à cheval entre une
zone permettant une fluorescence de 61 à 80% d‟intensité et une autre de 6 à 20% d‟intensité.
Ces résultats n‟étant que théoriques, les sondes ont été testées avec succès sur des cultures
pures ou des mélanges de cultures pures.
Figure 2.2 : Extrapolation par le logiciel ARB de la structure 2D d‟une partie de la molécule
d‟ARNr 16S de la souche Bs107 et localisation de la séquence cible de la sonde s107.
Nom Cible Séquence Fluorochrome Filtre
Eub338 Bacteria 5‟- GTC GCC TCC CGT AGG AGT -3‟ ATTO488 U-MWB2
Non-Eub Témoin négatif 5‟- ACT CCT ACG GGA GGC AGC -3‟ATTO488
ATTO594
U-MWB2
U-MWIY2
s107 Bs107 5‟- AGA ATT CGC AAG CTT CCT TC -3‟ ATTO594 U-MWIY2
s105 Bs105 5‟- GTA TCA CTA GGT TTC AAC TTA AT -3‟ ATTO594 U-MWIY2
Chapitre 2
78
3.10. Stable Isotope Probing (SIP).
L‟identification des bactéries responsables de la dégradation des BTEX dans les
communautés microbiennes étudiées a été réalisée par DNA Stable Isotope Probing (DNA-
SIP).
3.10.1. Suivi de la dégradation du toluène.
Des précultures de la communauté microbienne F1A (site A) dégradant le toluène ont
été réalisées avec 34,7 mg.L-1
(20 ppm) de toluène non-marqué comme seule source de
carbone. Un suivi de la biodégradation a été réalisé périodiquement par SPME/GC/FID. Dès
la disparition totale du toluène, la communauté microbienne a été repiquée dans trois flacons
de 1 L contenant chacun 700 mL d‟eau de site reconstituée. Deux des flacons ont été incubés
avec du toluène 13
C (34,7 mg.L-1
, soit 20 ppm) et le troisième a été incubé avec du toluène 12
C
(34,7 mg.L-1
, soit 20 ppm). La communauté microbienne contenue dans l‟un des deux flacons
contenant du 13
C-toluène a été inactivée par ajout de 5 % d‟HCl (10 N) afin d‟être utilisée
comme témoin abiotique. La dégradation du toluène a été suivie tous les jours durant 30 jours
dans les trois flacons selon le protocole décrit au paragraphe 2.1. Des extractions d‟ADN ont
été réalisées à la même fréquence tout au long de la dégradation (3.1.).
3.10.2. Séparation des ADN « lourds » et « légers ».
Après 30 jours d‟incubation et la disparition totale du toluène, les ADN marqués au
13C (« lourds ») et non marqués (« légers ») ont été séparés selon leur densité par
ultracentrifugation. Pour cela, 20 µL d‟ADN extraits ont été dilués dans 1,222 mL de tampon
de gradient (Tris-HCl 100 mM, EDTA 1 mM, et 3,75 g de KCl dans une solution stock de
500 mL). Les communautés microbiennes étudiées présentant une faible biomasse, la quantité
d‟ADN extrait n‟est pas suffisante pour appliquer un protocole classique de SIP. Ce problème
rend impossible la localisation par qPCR des ADN lourds et légers bactériens dans les
fractions collectées après ultracentrifugation (voir paragraphe 3.10.3.). Le protocole
développé par Gallagher et al. (2005) a donc été utilisé. Il permet de localiser les ADN
bactériens lourds et légers en ajoutant de l‟ADN d‟Archaea marqué (13
C) et non marqué (12
C)
en excès (10 µL de solution d‟ADN à 10 ng/µL) dans le mélange à centrifuger (voir 3.10.3.
Chapitre 2
79
pour la méthode de localisation). Dans cette étude l‟Archaea utilisée a été Haladaptus
paucihalophilus et elle a été cultivée avec du 13
C-pyruvate (marqué sur tous les carbones) ou
du 12
C-pyruvate pour obtenir les deux types d‟ADN nécessaires à l‟expérience. Ce mélange
d‟ADN dilués (d‟un volume total de 1,262 mL) a été ajouté à 4,8 mL d‟une solution de
chlorure de césium (7,163 M). L‟ensemble a ensuite été transféré dans un tube à
ultracentrifugation « Ultracrimp » de 6 mL (Thermo Scientific). Les tubes obtenus (un par
jour de prélèvement et par flacon incubé) sont scellés à l‟aide d‟un Crimper (du Pont de
Nemours). Les tubes ont ensuite été ultra-centrifugés dans un rotor vertical TV-1665 (Thermo
Scientific) à 50,000 rotations par minute (rpm) pendant 37 h à 20°C dans une
ultracentrifugeuse L8-M (Beckman). La décélération a été réalisée sans frein.
A l‟issue de la centrifugation, le fond des tubes a été percé à l‟aide d‟une aiguille (23-
1‟‟) puis de l‟eau milliQ stérile et DNA free a été injectée en haut des tubes en utilisant un
pousse seringue automatique (VIT-FIT, programmable syringe pump, Lambda) réglé avec un
débit de 200 µL.min-1
pour recueillir le contenu du tube au goutte à goutte. Des fractions
d‟environ 250 µL ont ainsi été collectées dans des tubes Eppendorf de 2 mL et 50 µL ont
servi à mesurer leur indice de réfraction à l‟aide d‟un réfractomètre AR200 (Reichert).
3.10.3. Détection des ADN « lourds » et « légers ».
L‟ADN contenu dans chacune des fractions (Bacteria et Archaea) a été précipité par
addition de 1 µL de glycogène pour biologie moléculaire (20 µg, Roche) et de deux volumes
d‟un mélange de PEG6000 (30%, Biosolve®) et de NaCl (1,6 M) en solution. Après une
incubation de deux heures à température ambiante, les fractions ont été centrifugées pendant
30 minutes à 13,000 rpm à température ambiante, puis le surnageant a été éliminé. Le culot a
ensuite été lavé avec 500 µL d‟éthanol à 70 % et une nouvelle centrifugation de 10 minutes à
13,000 rpm a été réalisée. Le surnageant a une nouvelle fois été éliminé puis les culots ont été
séchés au Speedvac (Savant). Une fois sec, les culots ont été resuspendus dans 30 µL de
tampon TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM).
Une PCR quantitative ciblant les ADN d‟Archaea (avec le couple d‟amorces
Arch931F/ArchM1100R, Tableau 5) a été réalisée sur l‟ensemble des fractions afin de
localiser les ADN lourds et légers séparés dans chaque tube. Chaque type d‟ADN (lourds et
légers) étant dispersé dans plusieurs fractions consécutives, celles-ci ont été mélangées afin
Chapitre 2
80
d‟obtenir pour chaque prélèvement et pour chaque condition : une fraction « ADN léger »,
une fraction « ADN lourd » et une fraction intermédiaire.
3.10.4. Etude de diversité sur les fractions obtenues.
Les fractions finales obtenues pour chaque prélèvement et pour les deux conditions
d‟intérêt (incubations avec 12
C-toluène et 13
C-toluène) ont été analysées par T-RFLP. Afin
d‟identifier les microorganismes responsables de la dégradation du toluène, des banques de
clones ont été réalisées sur les fractions d‟ADN marqué dont le profil T-RFLP était le plus
simplifié (deux ou trois pics observés).
81
Chapitre 3 : Caractérisation d’un consortium microbien dégradant
les BTEX composé de deux nouvelles espèces de Desulfotomaculum (Site C)
82
Chapitre 3
83
PREAMBULE
Depuis une quinzaine d‟années des prélèvements microbiologiques sont réalisés en
aquifères profonds sur des puits de contrôle en périphérie de la bulle de gaz dans le cadre du
projet IMPALAS. Afin d‟évaluer les capacités de dégradation des microorganismes présents
au sein de l‟aquifère, une stratégie basée sur la culture de communautés microbiennes en
microcosmes a été mise au point (Berlendis et al., 2010). Ces expériences ont permis
d‟obtenir de nombreux consortia microbiens simplifiés capables de dégrader les BTEX en
conditions de sulfato-réduction. Ces communautés ont été entretenues par de multiples
repiquages sur BTEX afin de conserver cette capacité et d‟étudier les microorganismes
responsables, leurs voies métaboliques de dégradation et les gènes correspondant aux
enzymes impliquées. Ainsi, le consortium B1 capable de dégrader séquentiellement
l‟éthylbenzène, le toluène et le benzène a été entretenu depuis l‟an 2000, date de
l‟échantillonnage initial du site C.
Treize années de repiquages associées à une pression de sélection constante due à
l‟utilisation des BTEX comme seule source de carbone et d‟énergie ont conduit à la
simplification de la communauté. Bien qu‟elle ait conservé sa capacité à dégrader les BTE,
elle n‟est aujourd‟hui plus constituée que de deux phylotypes bactériens appartenant tous
deux au genre Desulfotomaculum. La présence de ce genre microbien dans les
environnements profonds oligotrophes que constituent les aquifères de stockage est cohérente
avec les conclusions de la revue intitulée « Desulfotomaculum spp. and related Gram-positive
sulfate-reducing bacteria in deep subsurface environments » présentée précédemment dans ce
manuscrit. Par ailleurs, la simplicité de la communauté microbienne suggère que les
Desulfotomaculum jouent un rôle majeur dans la dégradation des BTE dans cet aquifère de
stockage. Afin de confirmer cela, les deux souches de Desulfotomaculum, Bs105 et Bs107,
ont été isolées et leur génome a été séquencé afin d‟essayer de mieux comprendre le rôle de
chacune dans cette dégradation.
L‟étude complète de la communauté B1 est présentée dans ce chapitre, de
l‟échantillonnage jusqu‟à l‟analyse des génomes en passant par toutes les phases de
caractérisation de la communauté. Cette étude est présentée sous la forme d‟un article qui
sera soumis très prochainement dans la revue Environmental Science and Technology.
Chapitre 3
84
BIODEGRADATION OF HYDROCARBONS IN THE DEEP
TERRESTRIAL SUBSURFACE: CHARACTERIZATION OF A
MICROBIAL CONSORTIUM COMPOSED OF TWO NEW
DESULFOTOMACULUM SPECIES ORIGINATING FROM A DEEP
GEOLOGICAL FORMATION.
Thomas Aüllo1, Sabrina Berlendis
1, Jean-François Lascourrèges
2, Daniel Dessort
3, Stéphanie
Saint-Laurent1, Blandine Schraauwers
2, Johan Mas
1, Michel Magot
1, Anthony Ranchou-
Peyruse1*.
1 Université de Pau et des Pays de l‟Adour, Equipe Environnement et Microbiologie, Institut
des Sciences Analytiques et de Physico-Chimie pour l‟Environnement et les Matériaux
(IPREM UMR 5254), Pau, France. 2APESA, Hélioparc, 2 avenue du Président Angot, 64053 Pau, France
3TOTAL, CST Jean Feger, avenue Larribau, 64018 Pau, France
*Correspondence : [email protected]
Abstract
Formation water of a deep geological storage of natural gas has been sampled and
BTEX degradation in microcosm was tested with sulfate as terminal electron acceptor.
A bacterial community was shown to degrade sequentially ethylbenzene, toluene and
benzene under sulfate-reducing conditions. Biodegradation was confirmed by isotopic
fractionation studies of carbon and hydrogen. Study of 16S rRNA showed that the
community is composed of two previously undescribed species of the genus
Desulfotomaculum. They represent the first described species of indigenous bacteria
from deep geological settings able to degrade hydrocarbons under anaerobic conditions.
Both strains were isolated, and were unable to use hydrocarbons alone, or when re-
associated in a reconstituted community. In a preliminary study of their respective
genome, no putative genes for hydrocarbon degradation have been found. Considering
the high number of insertion sequences in the genomes, it is hypothesize that loss of
degradation genes was due to high genome plasticity
Chapitre 3
85
INTRODUCTION
The biodegradation of hydrocarbons has long been regarded as a strictly aerobic
process, depending on oxygen availability and the presence of oxygen-respiring bacteria. But
during the last few decades, this situation evolved with the description of hydrocarbon
degradation in anaerobic surface or shallow subsurface environments (Barker et al., 1987 ;
Ball et Reinhard, 1996). Numerous anaerobic consortia and several original bacterial strains
able to degrade specific hydrocarbons in the absence of oxygen have been isolated from
diverse environments, including for example activated sludge, polluted soils, shallow
aquifers, sediments, or oil-water separators (Rabus et al., 1999 ; Coates et al., 2001 ; Da Silva
et Alvarez, 2004 ; Kniemeyer et al., 2007 ; Bombach et al., 2010 ; Adams et al., 2013).
However, very little is known on the bacterial species involved in similar processes in the
deep terrestrial subsurface, in spite of the importance of oil biodegradation for the oil
industry. Actually, the commonly observed oil biodegradation in low temperature petroleum
reservoirs could not be explained by aerobic microbial activity, since mass balance
calculations showed that potential flushing by oxygen-saturated meteoric waters cannot
transport enough oxygen into oil reservoirs to explain the observed phenomena (Horstad et
al., 1992). Moreover, most studies of the indigenous biodiversity in oil reservoirs suggested
that strictly anaerobic bacteria are the dominant microflora in these environments (Magot et
al., 2000). This lead to the current concept that oil biodegradation in petroleum reservoirs, and
by extension in the deep subsurface, is an anaerobic process (Head et al., 2003). But so far,
anaerobic hydrocarbon degraders from the deep subsurface of our planet have never been
cultivated, and their metabolism and its genetic background cannot be studied.
Studying the microbial ecology and microbial activities of the deep subsurface is
difficult mainly because collecting representative samples of these deep environments is
particularly uneasy. In the oil industry, production constraints most often preclude optimal
sampling for microbiological studies. The opportunity to collect representative fluids from the
deep subsurface was recently given by a specific sampling protocol set up for control wells of
natural gas storage in deep aquifers (Basso et al., 2005). It allowed to recently show that
original anaerobic microbial communities collected from a 830 m deep gas storage aquifer are
involved in the natural attenuation of BTEX (Benzene, Toluene, Ethylbenzene and Xylenes)
in these hydrocarbon-impacted environments (Berlendis et al., 2010). Different microbial
consortia were obtained depending on the culture conditions and hydrocarbons used as
Chapitre 3
86
electron donors. Proteobacteria, Firmicutes, Chlorobi, Thermotogales, Bacteroidetes,
Synergistes and methanoarchaea were shown to be present in the BTEX-degrading consortia
by 16S rRNA gene studies, but specific hydrocarbon degradation activity has not been linked
to any specific bacterial species.
The characterization of microbial consortium originating from another 760 m deep gas-
storage aquifer is presented here. It is simply composed of two previously undescribed
sulfate-reducing bacteria of the Desulfotomaculum genus able to degrade benzene and other
monoaromatic hydrocarbons under strictly anaerobic conditions.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Samples.
Anoxic water samples of the deep aquifer formation (-760 m) situated at about 40 km
west of Paris (France) were aseptically collected at the wellhead of a peripheral monitoring
well after a specific cleaning procedure as described previously (Basso et al., 2005). The
samples filtered on-site used in this study were transported to the lab under anaerobic
conditions and processed the day after, as previously described (Basso et al., 2005).
Microcosm experiments.
The concentrated microflora collected on site on thirty SterivexTM
filters was
resuspended in 1 L of formation water as previously described. The 160-fold concentrated
bacterial suspension was supplemented with 9 mM NH4Cl, 2 mM K2HPO4, and 2 mM
KH2PO4, 7 mM Na2SO4, 1 mL of a solution of trace-elements (Eichler et Pfennig, 1986), and
1 mL of vitamin solution (Pfennig et al., 1981). Fifty milliliters aliquots were then distributed
in 100 mL penicillin flasks sealed with butyl rubber stoppers. Three microliters of a BTEX
mixture containing benzene, toluene, ethylbenzene, o-, m-, and p-xylene (final concentration
10 mg.L-1
each) was finally added. For each condition, three microcosms were prepared
including one supplemented with 5% (v/v) of 1M HCl used as abiotic control. All
manipulations were done in the anaerobic glove box (La Calhène, France) under an
atmosphere of 95% N2 and 5% H2. Incubations were carried out under static conditions at
37°C in the dark.
Subcultures were prepared in the same way using synthetic water (7.5 mM NH4Cl ;
0.4 mM MgCl2,6H2O ; 11.3 mM Na2SO4 ; 1.2 mM KCl ; 0.3 mM CaCl2,2H2O ; 6.8 mM
NaCl ; 1.8 mM KH2PO4 ; 1.4 mM K2HPO4 ; pH 7,2), of which composition mimicked that of
Chapitre 3
87
the formation water. Culture media were sterilized by autoclaving for 20 min at 120°C prior
to the addition of vitamins, FeCl2,4H2O solution (final concentration 8 mM) and Na2S,9H2O
(8.5 mM). Subculture media were also supplemented with the same solutions as the original
microflora suspension and a 10 % inoculum was finally added.
Analytical procedure.
Aqueous samples (0.3 mL) were collected with syringes through the stoppers for
monitoring BTEX degradation periodically by SPME/GC/FID with an autosampler Combi
Pal (CTC Analytics) coupled with a gas chromatograph 7890A (Agilent Technologies)
equipped with a flame ionization detector. Samples were transferred to chromatographic vials
and then acidified with 10 μL of a 3 N HCl. A microextraction fiber (SPME, Supelco 75µm
carboxen-PDMS) was used to adsorb BTEX in headspace vials during 10 s. Desorption time
inside the GC injector was 100 s. Compounds were separated through an Optima Wax
(Macherey-Nagel) column (30 m × 0.32 mm × 0.50 μm). Helium was used as a carrier gas
with a constant flow rate of 1 mL min-1
. Since abiotic loss was observed during prolonged
incubation times, BTEX biodegradation was estimated by measuring differential
disappearance of these compounds in the test microcosm and in an acidified control
microcosm prepared under the same conditions. Results are expressed as the residual
percentage of BTEX as (Ct/Cc)*100, where Ct is the compound concentration in the test
microcosm, and Cc the compound concentration in the abiotic control microcosm.
Inhibition tests.
Toluene degradation inhibition tests were carried out by monitoring the biodegradation
periodically in two microcosms and injecting 10 mM sodium molybdate and 2 mM
bromoethanesulfonate (BES) through butyl stoppers just after the beginning of the
biodegradation.
Cell counts.
Total cell counts were carried out by DAPI-staining (4',6‟-diamidino-2-phenylindole)
with an Olympus Bx60 epifluorescence microscope equipped with a monochrome camera (12
bits, QIClick) and with a mercurial light.
Chapitre 3
88
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).
The following 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes were used in this study: EUB338,
targeting most Bacteria (Amann et al., 1990); NON338, the control probe (Wallner et al.,
1993) complementary to EUB338; Novel oligonucleotide probes, s107 (5‟-
AGAATTCGCAAGCTTCCTTC-3‟) and s105 (5‟-GTATCACTAGGTTTCAACTTAAT-3‟)
targeting 16s rRNA of phylotypes Bc105 and Bc107 respectively, were designed by using the
ARB program. Fixation of cells in the enrichment cultures and cell hybridization were
performed as described previously (Pernthaler et al., 2004). The stringency of hybridization
was adjusted by adding formamide to the hybridization buffer (30% [vol/vol] for each probe).
Observation of probe-stained cells was performed with an epifluorescence microscope
(Olympus BX60).
Determination of isotopic fractionation of benzene.
For the determination of isotopic fractionation, the bacterial activity was stopped in
four microcosms at different stages of benzene biodegradation by acidification to pH 2 with
15 % HCl. Flasks were conserved at -20 °C until analysis.
Hydrogen isotope analyses were performed by SPME-GC-TC-IRMS using a Hewlett
Packard 6890 gas chromatograph connected to a Deltaplus
XL mass spectrometer with a
GC/TC interface (Finnigan MAT). The gas chromatograph was equipped with a DB-PETRO
column (100 m x 0.25 mm x 0.5 μm film, J&W Scientific). Helium was used as carrier gas
with a flow rate of 1.7 mL.min-1
for carbon isotope analysis. The temperature program started
at 35 °C for 20 min isothermally, was increased at a rate of 2 °C.min-1
to 315 °C and
maintained isothermally during 50 min. Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW) was
used as the standard for the detection of hydrogen isotope ratios.
Carbone isotope analyses were performed by SPME-GC-C-IRMS using the same GC
as described previously connected to a Deltaplus
XL mass spectrometer with a GC/C interface
(Analytical Precision). The column, carrier-gas and temperature program used were the same
as for hydrogen isotope analyses. Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB) was used as the
standard for the analysis of carbon isotope ratios.
Carbon isotope ratios are expressed in the delta notation δ2H and δ
13C in per mil (‰):
δ2H or δ
13C [‰] = [ Rsample –Rstandard/ Rstandart] * 1000, where R sample and R standard are the
13C/
12C or
2H/
1H ratios of the sample and of the internal standard, respectively.
Chapitre 3
89
DNA extraction, T-RFLP analysis and ssu rRNA clone libraries.
Genomic DNA was extracted in duplicate from the microbial communities using the
Powersoil DNA isolation kit (MoBio Laboratories) by filtering 10 mL from each microbial
cultures on 0.22 µm nitrate-cellulose membranes. Membranes were freezed in liquid nitrogen
and crushed with sterile mortar and pestle before extraction. Bacterial and archaeal ssu rRNA
genes were selectively amplified from genomic DNA using the PCR Core Kit Plus (Roche).
For the construction of 16S bacterial rRNA gene libraries, DNA samples were
amplified with the forward bacterial primer 8F and reverse universal primer U1492R
(Weisburg et al., 1991). DNA amplicons of appropriate sizes were purified using the “illustra
GFX DNA and Gel Band purification kit” (Amersham), cloned with the Topo TA cloning
10F‟ kit (Invitrogen) in TOP10 E. coli cells according to the manufacturer‟s instructions.
Inserts of appropriate size were sequenced by QIAGEN Genomic Services (Hilden,
Germany). Sequences were cleaned and those displaying more than 97 % sequence identity
were assembled as a single phylotype (Stackebrandt and Goebel, 1994) using the Sequencher
4.1.4 software (Gene Codes®). Putative chimera sequences were detected using the Chimera
Check Software of the Ribosomal Database Project (Cole et al., 2007). The selected
phylotypes were analyzed for nearest neighbor by the BLAST software on the National
Center for Biotechnology Information database. Phylogenetic analyses were carried out after
aligning related sequences using the Muscle program (Edgar, 2004). Ambiguous regions were
removed using Gblocks (Castresana, 2000) and phylogenetic trees were constructed using the
maximum-likelihood method implemented in the phyML program v 3.0 (Guindon and
Gascuel, 2003). Reliability for internal branch was assessed using the aLRT test (Anisimova
and Gascuel, 2006).
Isolation of Bs105 and Bs107 strains.
Strain Bs105 was isolated by cultivation in Petri dishes on a solid medium designed
for heterotrophic fermentative bacteria. This medium was composed of yeast extract 10 g.L-1
,
cysteine 1 g.L-1
, biotrypcase 15 g.L-1
and glucose 2.5 g.L-1
. White colonies were subcultured
in a liquid medium with the same composition and were then maintained in a medium for
sulfate-reducers (Kit LabègeTM
, with 1 g.L-1
of NaCl).
Strain Bs107 was also isolated by cultivation in Petri dishes on a solid medium designed for
sulfate-reducers. This medium was composed of NaCl 2 g.L-1
, MOPS 5 g.L-1
, Na2SO4 3 g.L-1
,
Chapitre 3
90
yeast extract 1.25 g.L-1
, tryptase 0.25 g.L-1
and formate 20 mM. Black colonies were
subcultured and maintained in the Kit LabègeTM
, with 1 g.L-1
of NaCl).
Genome analysis.
DNA was sent to MR DNA lab (www.mrdnalab.com). Sequencing was performed
using Ion Torrent (Life Technologies Inc) with IonXpress kits and following manufacturer‟s
instructions.
RESULTS AND DISCUSSION
Origin of the B1 microcosm.
Aquifer water samples were collected in November 2000 from a control well drilled to
a depth of 760 m in an Upper Jurassic aquifer approximately aged about 150 million years.
The aquifer is confined in a poorly carbonated sandstone formation isolated from the surface
by an impermeable geological layer, and located in the Paris Basin, France. In situ
temperature and pH were 37 °C and 8.2, respectively. The total salinity of water was
moderate (1.6 g.L-1
). Samples were returned to the laboratory and immediately stored in the
anaerobic glove box. Microcosm experiments were set up approximately 12 h after sampling
as described in the Materials and Methods section.
A microcosm was shown to sequentially degrade ethylbenzene, toluene and benzene
within 250 days of incubation under sulfate-reducing conditions. Degradation of xylene
isomers was not observed, and degradation was not observed in the abiotic controls. The same
trend was reproducible after two subsequent subcultures. These observations associated with
the non-simultaneous disappearance of benzene, toluene and ethylbenzene (BTE), suggest a
biological rather than physico-chemical process. As spores were observed in the microbial
community, an aliquot was heated at 80 °C for 10 minutes and inoculated with BTEX under
the same conditions in synthetic aquifer water. BTE degradation was shown to resume, and
seven successive enrichments were realized during the five following years. Spores were still
present in the microcosms, suggesting that spore-forming microorganisms played an
important role in the BTE degradation process. As the original one, this selected community,
named B1 microcosm, successively degraded ethylbenzene, toluene and benzene (Fig. 3.1).
The degradation started after a lag phase lasting from 50 to 120 days, depending mainly on
the age of the preculture, and benzene degradation was complete approximately three month
Chapitre 3
91
later. The BTE degradation was associated with a 5-fold increase of the cell population in the
B1 microcosms as shown in figure 1. It must be noted that the biomass obtained at the end of
culture never exceeded 107 cells.mL
-1 (Fig. 3.1), with a shortest doubling time of
approximately 20 days.
Figure 3.1: Degradation of BTE in the B1 microcosm. Filled squares : ethylbenzene, filled
diamonds : toluene, filled triangles : benzene, open triangles : o-xylene and circles: cells.mL-
1.
Characterization of metabolic activities and isotopic fractionation studies.
To better understand the anaerobic respiration process involved in the BTE
degradation, inhibition tests were done by addition of sodium molybdate, a specific inhibitor
of sulfate reduction, or BES, an inhibitor of methanogenesis, in an experiment with BTEX as
electron donors and sulfate as electron acceptor. The injection of molybdate actually stopped
BTE degradation, whereas degradation still proceeded in the presence of BES (Fig. 3.2).
These results strongly suggest that BTE degradation was carried out by sulfate-reducing
microorganisms.
Chapitre 3
92
Figure 3.2: Effects of inhibitors addition on BTE (10 ppm) biodegradation in microcosms
originated from successive enrichments of community B1. Arrows indicate the addition at day
139 of: a) bromoethanesulfonate (BES, 2 mM) ; b) sodium molybdate (MoO4, 10 mM). Filled
squares : ethylbenzene, filled diamonds : toluene, filled triangles : benzene, open triangles :
o-xylene.
Carbon (δ13
C) and hydrogen (δ2H) isotopic fractionation was measured in four
subcultures of B1 with 8 ppm benzene as the only electron donor (1 % uniformly 13
C-
labeled). Each microcosm was sacrificed at a different degradation rate (0, 45, 58 and 75 %
degradation, respectively) and isotopic ratios were measured. Results showed an increase of
δ13
C and δ2H of 4,0 ± 0,2 ‰ and 101,5 ± 2 ‰, respectively (Fig. 3.3), which suggested
biological isotopic fractionation rather than abiotic processes (Meckenstock, 1999).
Moreover, the isotopic fractionation trend given by the δ2H/δ
13C plot during
degradation corresponds to the trend observed for aromatic hydrocarbon biodegradation under
sulfate-reducing or methanogenic conditions rather than denitrifying or aerobic conditions
(Mancini et al., 2008).
Complementary experiments showed that 13
C-benzene degradation was correlated
with 13
CO2 production (data not shown), indicating that benzene was completely oxidized to
CO2. In the same experiment, 13
CH4 was not detected indicating the absence of methanogenic
activity in the community.
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400
(Ct
/ C
c)
x 1
00
time (d)
a
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400
(Ct
/ C
c)
x 1
00
time (d)
bBES MoO4
Chapitre 3
93
Figure 3.3: δ
13C and δ
2H of residual benzene fraction versus benzene degradation rate under
sulfate-reduction. Filled triangle: δ13
C; clear square: δ2H.
Composition of the B1 microcosm.
DNA was extracted from the B1 microcosm and a 16S rRNA genes clone library was
constructed. The DNA sequences of 94 clones were determined, showing the presence of only
two distinct phylotypes, both affiliated to the genus Desulfotomaculum (Fig. 3.4). Phylotype
Bc107 dominated the clone library (92 sequences) and was related to D. putei (96 % sequence
similarity). Phylotype Bc105 represented only 2 % of the clone library (2 sequences) and was
related to D. reducens (96 % sequence similarity).
Phylotype Bc107 had the particularity to exhibit two different sizes of 16s rRNA gene.
This characteristic was due to the presence of a 80 bp palindromic insert in the v1 region of
the gene in 15 % of the Bc107 clones. The presence of inserts in 16S rRNA genes is not
uncommon in this genus, as previously shown for D. kuznetsovii (Tourova et al., 2001) or D.
australicum (Love et al., 1993), but it was only described in thermophilic microorganisms.
Because of such inserts present in the 16s rRNA gene of phylotype Bc107, phylogenetic
analyses were carried out excluding this hypervariable region as previously suggested
(Stackebrandt et al., 1997 ; Tourova et al., 2001).
Chapitre 3
94
Figure 3.4: Maximum-likelihood tree based on 16s rRNA gene (1115 bases) showing the
phylogenetic relationship between the B1 microcosm sequences and closest relatives.
Reliability values (aLRT values) greater than 50 % are given at nodes.
Bs105 and Bs107 specific PCR primers and FISH probes were designed for future
experiments. For FISH experiments, the level of fluorescence could be predicted with the
location of target sequence by comparison with those observed on E. coli hybridization
experiments (Fuchs et al., 1998). As 16S rRNA genes of both strains were highly similar
(95% similarity), there were only few possibilities for the design of specific probes. The target
sequences were finally selected in the hypervariable region V1 with the best brightness level
predicted using the ARB software.
Isolation of strains Bs105 and Bs107.
According to the phylogenetic position of the two members of the B1 microcosm, no
obvious strategy based on differential metabolism or physiology could be defined for their
purification. Numerous isolation attempts were done, most of them resulting in the isolation
of the most abundant partner of the microcosm, named strain Bs107. It was first isolated on
Desulfotomaculum aeronauticum (NR 026348.1)
Clone Bc105 16s rRNA gene
Desulfotomaculum defluvii (AM184185.1)
Desulfotomaculum reducens (U95951.1)
Desulfotomaculum ruminis (NR 036973.1)
Desulfotomaculum varum (GU126374.1)
Desulfotomaculum hydrothermale (NR 044074.1)
Desulfotomaculum putei (NR 024900.1)
Clone Bc107 16s rRNA gene with 80 bp insert
Clone Bc107 16s rRNA gene without 80 bp insert
Desulfotomaculum nigrificans (NR 044832.1)
Desulfotomaculum carboxydivorans (NR 043297.1)
Cluster Ia
Cluster Ib
Cluster Ic
Cluster Id
Pelotomaculum spp.
Cluster Ig
Cluster If
Cluster Ie
Desulfosporosinus spp.
Clostridium spp.
Thermotoga maritima (NR 029163.1)
73
81
65
90
93
97
81
100
81
100
100
79
100
78
99
84
100
92
10089
97
100
99
0.1
Chapitre 3
95
Petri dishes under fermentative conditions, with peptone and glucose as carbon and energy
sources. Micro-colonies (< 1 mm) were white and rounded with slightly irregular edges.
Strain Bs107 was isolated later by cultivation on Petri dishes with lactate and acetate as
carbon and energy sources, and sulfate as terminal electron acceptor. The 16S rRNA gene
sequences of both strains were identical to those of phylotypes Bc105 and Bc107, respectively
(Fig. 3.4).
BTEX-degradation tests were carried out with both strains under various conditions,
including the strictly same conditions as those used for the B1 microcosm. Degradation was
tested on synthetic aquifer water amended with a BTEX (either mixed or supplemented
separately) as the electron donor and carbon source (10 ppm each). Some microcosms were
also supplemented with sulfate, iron (III) or thiosulfate as the electron acceptor. Other
conditions also included the addition of pyruvate or acetate as supplementary electron donors.
BTEX biodegradation tests in sulfate-reducers specific media (Test-Kit LabègeTM
)
supplemented with BTEX were also carried out. No BTE biodegradation was observed for
both strains under all conditions tested. These observations suggested that BTE-degradation
relied on the interaction of strains Bs105 and Bs107 in a syntrophic relationship. Thus, co-
cultures of Bs105 and Bs107 were carried out and biodegradation tests were done.
Surprisingly, the reassociated strains were again unable to achieve BTE-biodegradation under
the various conditions mentioned above, including those used during the initial degradation
experiments with the B1 microcosm.
These observations consequently did not give any indication on the role of each
species in the degradation process, nor the type of their metabolic partnership. To better
understand the reason of this apparent loss of degradation ability consecutive to strain
isolation, it was decided to search for genes of the anaerobic metabolism of monoaromatic
hydrocarbons in the genome of both species.
Genetic analyses.
The addition of fumarate was previously shown to be the mechanism of activation of
toluene and ethylbenzene under sulfate-reducing conditions (Rabus et Heider, 1998 ;
Kniemeyer et al., 2003a). These reactions are catalysed by fumarate-adding enzymes (FAE)
which encompass benzylsuccinate-synthase (bss) and alkylsuccinate-synthase (ass). Actually,
the involvement of bss genes in the B1 microcosm is strongly suggested by the presence of
benzylsuccinate revealed by UPLC-MS-MS analysis (data not shown). Nevertheless, PCR
Chapitre 3
96
amplifications targeting bss and ass genes in Bs105 and Bs107 pure culture, as well as in the
B1 microcosm were unsuccessful using previously described specific primers (Winderl et al.,
2007 ; Von Netzer et al., 2013). The absence of benzylsuccinate-synthase activity being the
less probable hypothesis, it can be postulated that in the B1 microcosm this enzyme and its
genes are different enough from those previously described to prevent gene amplification by
known primers. Similar difficulties have already been reported for the bssA gene in toluene-
degrading communities (Sun et al., 2013) and with the toluene-degrading strain
Desulfotomaculum sp. Ox39 (Winderl et al., 2007). In order to overcome such biases of
specific amplification of the genes involved in BTE-biodegradation, genomes of both strains
were sequenced and blasted with known sequences of the monoaromatic hydrocarbon
biodegradation pathways.
The rough data from genomes sequencing were similar for the two strains : 79 contigs
representing a genome size of 3.57 Mb for Bs105, and 164 contigs corresponding to a genome
of 3.53 Mb for Bs107. Gaps were not covered yet, but these genomes sizes are in the mean of
those reported for other members of the Desulfotomaculum cluster Ia: D. nigrificans (2.94
Mb), D. carboxydivorans (2.89 Mb), D. ruminis (3.97 Mb), D. reducens (3.61 Mb) and D.
hydrothermale (2.7 Mb). Automatic annotation of the genomes revealed the presence of more
coding sequences in Bs105 than in Bs107 (6,345 and 4,739 respectively) but these values
were greater than those of protein coding sequences from the previously sequenced
Desulfotomaculum spp. genomes. Numbers of RNA genes were also similar to known values
for Desulfotomaculum spp., with 68 RNAs for Bs105 and 88 for Bs107. A single copy of the
16S rRNA gene was found in the genome of Bs105 whereas, 6 copies were found in Bs107.
Three copies contained the insert detected in clones Bc107 while the three others did not.
As expected for sporulating sulfate-reducing microorganisms, genes of the
dissimilatory sulfite reductase (dsr), adenylyl-sulfate reductase (aps), and those involved in
sporulation were detected in the genomes of both strains.
In previously studied toluene-degrading anaerobes, the metabolic pathway from
toluene to benzoyl-CoA is driven by two large operons : bssABCDEFGH and
bbsABCDEFGH in various toluene-degrading microorganisms including Azoarcus strain
EbN1 (Kube et al., 2004), Thauera aromatica (Leuthner et Heider, 2000) or Geobacter
metallireducens (Kane et al., 2002). Positions of these operons in genomes are very close, so
Chapitre 3
97
that the whole toluene-degrading pathway to benzoyl-CoA is encoded by a 35 kb sequence in
Azoarcus strain EbN1 (Kube et al., 2004).
No significant DNA or protein homology could be found in Bs105 and Bs107
genomes with any of the enzymes coded by these operons. Even blasts with putative bssA
genes from other Desulfotomaculum species (D. gibsoniae and Desulfotomaculum. sp. OX39)
were unsuccessful. In the Bs105 genome, an enzyme loosely related to bssA was detected, but
apart from the active-site cysteine residue, all the conserved amino acids characteristic of
bssA were not detected (Acosta-González et al., 2013). Moreover this protein had strong
amino-acid identity (84%) with the formate C-acetyltransferase from Clostridium
carboxidivorans strain P7, another glycyl-radical enzyme.
Genes involved in ethylbenzene biodegradation to benzoyl-CoA are also organized in
operons and are encoded by a 55 kb sequence in the sulfate-reducing strain EbN1 (Rabus et
al., 2002). Like for toluene, no homology could be found in the Bs105 and Bs107 genomes
for these genes.
Regarding the anaerobic activation of benzene, three pathways have been suggested to
date : a hydroxylation of benzene to form phenol (Grbic‐Galic, 1986 ; Grbic-Galic and Vogel,
1987), a methylation to form toluene (Ulrich et al., 2005) or a carboxylation to form benzoate
(Caldwell and Suflita, 2000) but the enzymes involved are still unknown. Consequently, no
search for these genes could have been done in the Bs105 and Bs107 genomes. By the way, it
should be mentioned here that, although benzoate is not produced only through benzene
degradation, it was detected by UPLC-MS-MS in the BTE-degrading B1 microcosm (data not
shown).
The absence of the genes known to be directly involved in BTE-activation and
degradation in the Bs105 and Bs107 genomes, and the inability of these isolates to degrade
BTE individually or in co-culture, strongly suggest a loss of the ability to oxidize BTE upon
subculture. The multiple cultures of both strains carried out in rich media during their
isolation may have allowed this phenotypic change by lowering the selective pressure for
BTE degradation. However, the insight in genomes of both strains showed that the loss of the
degrading ability was not due to mere mutations but to the “disappearance” of whole putative
operons.
Loss of a plasmid is the first hypothesis to consider under such circumstances. Various
studies described plasmid-mediated hydrocarbon degradation (Abril et al., 1989 ; Sanseverino
et al., 1993) and the naphthalene degradation ability of Gordonia sp. strain CC-NAPH129-6,
Chapitre 3
98
was recently shown to be held by an operon located in a 97 kb plasmid (Lin et al., 2012),
which loss consequently resulted in the loss of the naphthalene degradation ability. Similarly,
in Bs105 or Bs107 the loss of one or several plasmids upon isolation should have resulted in
the loss of BTE degradation potential. During the course of this study, numerous attempts
were done to isolate both strains with toluene, ethylbenzene or benzene as carbon source to
keep the selection pressure by hydrocarbons and so keep the degradation potential. The fact
that all attempts failed was not a surprise considering the low biomass production and growth
rates with hydrocarbons as carbon and energy sources.
A second hypothesis should be the loss of the BTE-degradation genes or operons from
genomic DNA through transposition-like events. Indeed, catabolic genes are often surrounded
by insertion sequences which increase the possibility of gene exchange (Kulakov et al., 1999 ;
Peters et al., 2004). Interestingly, genomes analyses revealed the presence of 39 putative
transposases in Bs107 and at least 15 in Bs105. So many transposases, particularly in Bs107,
suggest high genome plasticity. This should be an explanation to the loss of aromatic
hydrocarbon degradation upon subculture in rich media.
To decide between these two hypotheses, or invalidate them, a solution should be to
carry out a metagenomic analysis of the BTE-degrading community B1, grown without
interruption on BTEX. This should probably be a challenge considering the low biomass
obtained by culture on BTEX. Anyway, in spite of the close taxonomic position of Bs105 and
Bs107, the reconstruction of complete individual genomes with metagenomic data should be
easy since we will already have the reconstructed genomes of pure strains. But the positioning
of putative degradation operons in either genome could be tricky, and the assignment of
potential plasmids to either strain even more difficult.
CONCLUSION
In this study, it was shown that a bacterial community composed of only two
undescribed Desulfotomaculum species can use toluene, ethylbenzene and benzene as sole
carbon and energy sources. They constitute the simplest model of hydrocarbon-degrading
anaerobes originating from the deep subsurface ever described. This observation highlights
the important role of the genus Desulfotomaculum as significant indigenous populations of
subsurface habitats, but also as important agents in the anaerobic degradation of
Chapitre 3
99
hydrocarbons. The reason why none of the isolated species, nor a consortium reconstituted
after growth in rich culture media can resume degradation ability is still unclear. The presence
of numerous putative transposases in the genome of both isolates seem to reveal a high
plasticity of their genomic DNA, and could possibly explain the rapid loss of the ability to
degrade these compounds once the selection pressure exerted by the BTEX was removed.
Loss of degradation genes carried by one or several plasmids is also an hypothesis which
should be tested.
Acknowledgments
STORENGY and TIGF are acknowledged for funding the IPREM-EEM team for this
research project. The GIP team of STORENGY is warmly thanked for his invaluable
involvement in sampling campaigns on underground gas-storage sites.
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Chapitre 3
103
CONCLUSION DU CHAPITRE
La caractérisation de la communauté B1 dégradant les BTE a permis de démontrer
l‟implication des bactéries sulfato-réductrices et plus particulièrement du genre
Desulfotomaculum dans la dégradation. Si la capacité de dégradation de la communauté ne
fait aucun doute, le rôle de chacune des deux souches de Desulfotomaculum constituant cette
communauté demeure inconnu. En effet, après isolement aucune des deux souches n‟est
parvenue à dégrader les BTE en culture pure et l‟hypothèse d‟un mécanisme synthrophique a
rapidement été mise en doute par l‟absence de dégradation en co-culture par ré-association
des deux souches isolées. Devant le problème posé par l‟approche culturale, la perte de la
capacité à dégrader les BTE après isolement a été étudiée d‟un point de vue génétique. La
recherche des gènes responsables de l‟activation anaérobie du toluène (notamment bss) et de
l‟éthylbenzène s‟est révélée négative et ceux responsables de la dégradation du benzène
demeurent inconnus à ce jour. Cependant, la détection de benzylsuccinate dans la
communauté B1 de départ suggère fortement la présence d‟une benzylsuccinate synthase
(bss). L‟hypothèse la plus probable est donc celle de la perte des gènes impliqués dans la
dégradation (organisés sous forme d‟opérons) lors des cultures des souches en milieu riche, en
absence de pression de sélection par les BTEX. Deux scénarios peuvent être imaginés pour
expliquer ce phénomène : (i) un évènement de transposition dont l‟hypothèse pourrait être
confortée par la mise en évidence de transposases nombreuses dans les génomes des deux
souches, (ii) l‟expression des gènes de dégradation via un plasmide dans la communauté B1,
récemment démontré chez une souche du genre Gordonia (Lin et al., 2012), et la perte de ce
plasmide au cours des repiquages en milieu riche.
L‟étude du métagénome de B1, constamment cultivé en présence de BTEX, pourrait
permettre de confirmer cette hypothèse si des gènes de dégradation y étaient trouvés.
Néanmoins, Bs105 et Bs107 étant proches phylogénétiquement (toutes deux appartiennent au
cluster Ia) il pourrait être difficile de reconstruire les 2 génomes de la communauté, et donc
d‟attribuer ces gènes à l‟une ou l‟autre des souches. La compréhension du rôle de chaque
individu de la communauté B1 doit donc passer par la réalisation de nouveaux isolats en
conservant une forte pression de sélection tout au long du processus. Un isolement en gélose
profonde selon le protocole adapté par Higashioka et al. (2012) pourrait être envisagé.
104
Chapitre 4 : Identification des microorganismes responsables de
la dégradation de toluène et Isolement d’une nouvelle espèce de
Mesotoga (Site A)
105
Chapitre 4
106
PREAMBULE
Des cultures en microcosmes ont été réalisées pour chaque site de prélèvement. Dans
le chapitre précédent, les expériences réalisées à partir d‟échantillons du site C ont montré une
simplification extrême de la communauté B1 au fil des repiquages. Néanmoins, une telle
sélection n‟est pas fréquente et de nombreuses études de dégradation concernent des consortia
bien plus complexes. C‟est le cas du microcosme VNC1 obtenu à partir d‟eau du site A. Cette
communauté microbienne dégradant le toluène et deux isomères du xylène (m- et p-) a déjà
fait l‟objet d‟une étude de diversité démontrant la présence de microorganismes affiliés à au
moins six phyla différents (Berlendis et al., 2010). Néanmoins, les microorganismes
directement impliqués dans la dégradation ne sont pas connus.
Dans le cadre d‟une communauté complexe l‟identification des microorganismes
impliqués dans une dégradation quelle qu‟elle soit par méthode culturale est difficile voire
impossible. Des techniques de biologie moléculaire permettent aujourd‟hui de s‟affranchir de
l‟étape culturale pour ce genre d‟étude. La technique de Stable Isotope Probing permet
notamment de marquer les acides nucléiques (ici l‟ADN) des microorganismes intervenant
directement dans la dégradation de composés carbonés. Pour cela, la communauté étudiée est
incubée avec le substrat d‟intérêt dont l‟ensemble des carbones sont marqués par l‟isotope
lourd 13
C. Parmi les composés dégradés par la communauté VNC1, seule la molécule de
toluène est commercialisée avec l‟ensemble de ses carbones marqués au 13
C. Les isomères du
xylène ne sont disponibles qu‟avec un carbone marqué ce qui ne convient pas à la technique.
L‟identité des dégradeurs primaires de toluène dans la communauté VNC1 a donc été étudiée
par DNA-SIP. Les résultats obtenus sont présentés dans la première partie de ce chapitre sous
la forme d‟un article qui sera prochainement soumis après acquisition des derniers résultats
(séquences bssA).
Parmi les individus présents dans la communauté, l‟un d‟eux présente un intérêt
microbiologique particulier car il ne s‟agit que du troisième représentant connu du nouveau
genre Mesotoga. Il s‟agit de la nouvelle espèce Mesotoga infera qui est décrite en deuxième
partie de ce chapitre. Un article de description a été soumis et accepté dans la revue
International journal of systematic and evolutionary microbiology.
Chapitre 4
107
DNA STABLE ISOTOPE PROBING HIGHLIGHTS THE ROLE OF A
NEW DESULFOTOMACULUM-RELATED BACTERIUM FROM A
DEEP SUBSURFACE ENVIRONMENT IN THE DEGRADATION OF
TOLUENE.
Thomas Aüllo
1, Louis Carles
1, Stéphanie Saint-Laurent
1, Hugues Preud‟homme
2, Michel
Magot1, Anthony Ranchou-Peyruse
1*.
1 Université de Pau et des Pays de l‟Adour, Equipe Environnement et Microbiologie, Institut
des Sciences Analytiques et de Physico-Chimie pour l‟Environnement et les Matériaux
(IPREM UMR 5254), Pau, France. 2Laboratoire de Chimie Analytique, Bio-inorganique et Environnement, Institut des Sciences
Analytiques et de Physico-Chimie pour l‟Environnement et les Matériaux (IPREM UMR
5254), Technopole Hélioparc Pau Pyrénées, 2 avenue du Président Angot, Pau, France
*Correspondence : [email protected]
Abstract
In a previous work, it was shown that a microbial consortium originating from a deep
subsurface gas storage aquifer was able to degrade toluene, m- and p xylene under
sulfate-reducing conditions. It was composed 7 bacterial and 2 archaean phylotypes,
among which a Pelobacter-related species was dominant. The VNC1 community was
subcultured with with 13
C7-labeled toluene under sulfate-reducing conditions, and DNA-
Stable Isotope Probing was used at the early steps of toluene degradation to trace the
toluene-degrading microorganisms. 13
C was incorporated in DNA of a
Desulfotomaculum-related species with a 16S rRNA gene sequences distantly related to
Desulfotomaculum geothermicum. Together with previously published data, the result of
the present study highlights the importance of sulfate-reducing Firmicutes in the
degradation of aromatic hydrocarbons in shallow or deep subsurface aquifers.
Chapitre 4
108
INTRODUCTION
During the seasonal storage of natural gas in deep aquifers, traces of light
hydrocarbons present in the gas, such as BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene, ortho-, meta-
and para-xylenes), can migrate to the aqueous phase because of their solubility. It was
recently shown that these mono-aromatic hydrocarbons can became carbon and electron
sources for subsurface indigenous microorganisms in such a nutrient-limited ecosystem, the
microbial activity consequently resulting in the natural attenuation of BTEX in the subsurface
(Berlendis et al., 2010).
Many studies have been carried out on BTEX-degrading anaerobic microbial
communities, but microorganisms directly involved in the hydrocarbon metabolism were
rarely identified. Linking function with identification relied for a long time on culture based
experiments. Although necessary, this method is limited since, beyond the difficulty to grow
many bacteria in vitro, microorganisms interrelationships generally cannot be taken into
account by this technical approach. These limitations result in the small number of available
pure cultures able to degrade aromatic hydrocarbons under anoxic and more particularly
sulfate-reducing conditions (Higashioka et al., 2012, Ommedal & Torsvik, 2007, Rabus et al.,
1993). The recently developed molecular techniques SIP (Stable Isotope Probing) offer the
opportunity to target microorganisms directly involved in the degradation of potentially any
compound by tracing the fate of stable heavy isotopes of diverse atoms labeling a substrate to
its incorporation in cellular macromolecules. We used this approach to identify bacterial
species involved in the degradation of toluene in a microbial community originating from a
deep gas storage aquifer.
The microbial consortium VNC1 described by Berlendis et al. (2010) was initially
shown to sequentially degrade toluene, m-xylene and p-xylene under sulfate-reducing
conditions. Bacterial 16S rRNA gene clone libraries showed the presence of seven bacterial
phylotypes. One was dominant (68% of the gene library) and related to Pelobacter
acetylenicus (95% identity), a member of the class δ-proteobacteria. The other phylotypes
were affiliated with β-proteobacteria, Firmicutes, Chloroflexi, Thermotogae, Bacteroidetes
and Synergistetes. Two archaean phylotypes were also detected. The large dominance of the
Pelobacter-related phylotype in the clone library suggested that the corresponding strain
should play a major role in the toluene and xylene degradation process. If so, a stable isotope
probing of DNA (DNA-SIP) with fully 13
C-labelled toluene should highlight the early
Chapitre 4
109
involvement of this phylotype during the toluene degradation kinetics. The results of this
experiment, together with additional data on the degradation process, are presented below.
MATERIALS AND METHODS
Samples.
Water samples were collected from a monitoring well of a 820 meters deep gas storage
aquifer, a limestone layer from the upper Jurassic, located in the Paris Basin as described by
Basso et al. (2005).
Microcosms experiments.
Microcosms experiments were carried out as described previously (Berlendis et al.,
2010). For the SIP experiment, microcosms were prepared in 1 L glass flasks sealed with
butyl rubber stoppers under N2 atmosphere. Flasks were filled with 700 mL of synthetic water
mimicking the aquifer water composition (0.01 g L-1
NaF; 1 g L-1
MgCl2 (6H2O); 3.5 g L-1
Na2SO4; 0.09 g L-1
KCl; 0.84 g L-1
CaCl2 (2H2O); 4.7 g L-1
NaCl; 0.87 g L-1
NaHCO3). pH
was adjusted to 7.2. Culture medium was sterilized by autoclaving prior to the addition of
vitamins (Pfennig et al., 1981), FeCl2 solution (0.2 g L-1
) and Na2S (9H2O) (0.08 g L-1
).
Cultures media were finally amended with 20 ppm of either non-labeled (12
C7) or fully
labeled (13
C7) toluene and a 5% inoculum of the VNC1 consortium cultivated with toluene as
electron donor was finally added. Bottles were incubated at 37°C in the dark. Three different
microcosms were prepared: one containing 13
C-toluene, one with 12
C-toluene, and the last
also containing 12
C-toluene was inactivated by addition of HCl to be used as abiotic control.
Analytical techniques.
Toluene concentration was monitored daily in liquid samples (0.3 mL) collected with
syringes through the stoppers, and toluene concentrations were measured by SPME-GC-FID
as described previously (Berlendis et al., 2010). Since abiotic loss was observed during
prolonged incubation, toluene biodegradation was estimated by comparing the two tested
microcosms (amended with either labeled or non-labeled toluene) with the acidified control
microcosm prepared under the same conditions. Results are expressed as the residual
percentage of BTEX as (Ct/Cc)*100, where Ct is the toluene concentration in the test
microcosm, and Cc the compound concentration in the abiotic control microcosm.
Chapitre 4
110
Measurement of partially labeled benzylsuccinate concentration was assessed by
UPLC-MS/MS. The mass spectrometer used here was a triple quadripole mass analyser from
WATERS SAS (Guyancourt, France). The separation was done with an UPLC acquity
(WATERS SAS, Guyancourt) with a BEH C18 reverse phase UHPLC column (2,1 x 50 mm
x 1,8 µm) WATERS, Guyancourt, France). The mobile phase A was ultrapure water grade
(Advantage, MILLIPORE, Guyancourt, France) with 0,1% acetic acid (puriss, 100% Riedel
De Haen) and mobile phase B was acetonitrile (Optima LCMS, Fisher) with 0,1% acetic acid.
The flow in use was 0,450mL/min and the gradient was at 0‟, A:95% and B:5%; at 0.5',
A:95% and B:5%; at 2', A:72% and B:28%; at 4', A:35% and B:65%; at 5' A:5% and B:95%;
at 5,5' A:5% and B:95%, at 6' A:95% and B:5%. The transitions monitored for Benzyl
succinic acid (MRM mode) were: 207->163 and 207->91 (for 13
C compound: 214->170 and
214->98)
DNA extraction and separation.
Three samples were collected in the two test-microcosms containing labeled and non-
labeled toluene, one at the onset of the experiment (time 0), and the others at the beginning of
the toluene degradation process after 14 days (20% degradation) and 16 days (40%
degradation). Ten milliliters of culture medium were collected with syringes and filtered on
nitrate-cellulose membranes (0.22 µm). Filters were frozen in liquid nitrogen and then
crushed with sterile mortar and pestle. DNA extraction was carried out on the crushed filters
using the Powersoil DNA isolation kit (MoBio Laboratories) according to the manufacturer
instructions.
12
C and 13
C carrier DNAs from the Archaea, Haladaptus paucihalophilus (DSMZ
18195, Savage et al. (2007)) were used in this study. The strain was grown on the DSMZ
medium 1125 with either labeled (13
C3) or unlabeled (12
C3) pyruvate as the carbon source.
For light and heavy DNA separation approximately 10 ng of DNA from each
microcosm and 100 ng of each 12
C and 13
C H. paucihalophilus carrier DNA were dissolved in
1.222 mL of gradient buffer (0.1 M Tris, 0.1 M KCl and 1 mM EDTA) and added to 4.8 mL
of a 7.163 M CsCl gradient solution as described by Neufeld et al. (2007b). Centrifugation
was carried out in sealed “Ultracrimp” tubes (6 mL, Thermo Scientific) using a TV-1665
vertical rotor (Thermo Scientific) in a L8-M ultracentrifuge (Beckman) at 50 000 rpm, 20°C
and over 38h. After the run, 25 fractions of approximately 200µL each were collected. To
Chapitre 4
111
check the good completion of the CsCl gradient, buoyant density of the fractions was
calculated by measuring their refractive index (temperature-corrected, nD-TC) using a AR200
refractometer (Reichert) as described previously (Neufeld et al., 2007b). Recovery of DNA
from gradient fractions was carried out as described previously (Neufeld et al., 2007b).
DNA processing.
DNA recovered from the collected fractions was quantified by quantitative PCR using
forward primer Arch931F (5‟-GGAATTGGCGGGGGAG-3‟) and reverse primer
ArchM1100R (5‟-GGGTCTCGCTCGTTRCC-3‟) targeting 16s rRNA genes of the archaean
carrier DNA. SYBR green PCR master mix kit (Applied Biosystems) was used for the
amplification in a Mx3005P thermal cycler (Stratagene). Fractions containing 13
C-DNA
(according to buoyant density and DNA quantification) were pooled as well as those
containing 12
C-DNA.
For T-RFLP analysis, duplicates of fluorescently labeled amplicons were obtained by
nested PCR using primers 8F/1387R (Lane, 1991, Marchesi et al., 1998) for the first reaction
and Fam-338F/907R (Lane, 1991) for the second. After purification using the illustra GFX
PCR DNA purification Kit (GE Healthcare), the PCR products were digested at 75°C during
3 hours using the restriction enzyme PspGI according to the manufacturer instructions (New
England Biolabs). Restricted amplicons were analyzed using a 3130xl Genetic Analyzer
(Applied Biosystems). Genescan Rox-500 (Applied Biosystems) was used as internal size
standard and data evaluation was carried out using Gene Mapper software v4.1.
In order to correlate the obtained T-RFs with 16S rRNA gene sequences, T-RFLP in
silico was carried out with the TRiFLe software (Junier et al., 2008) using clone libraries
sequences from this study and data from Berlendis et al. (2010) as references.
Amplification of the gene coding the α-subunit of benzylsuccinate synthase was
carried out using the “semi-nested” protocol described previously for Desulfotomaculum sp.
OX39 (Winderl et al., 2007).
RESULTS AND DISCUSSION
Biodegradation of 12
C- and 13
C-toluene.
Before the onset of the experiment, consortium VNC1 was subcultured twice with
non-labeled toluene as the only carbon and energy source. After the complete biodegradation
of toluene (within 30 days), the second subculture was used as inoculum for SIP.
Chapitre 4
112
Three microcosms were amended with 380 µM (20ppm) of either fully labeled or non-
labeled toluene: one was used to identify primary users of 13
C-toluene, whereas the others
were used as 12
C and abiotic controls.
In the microcosm amended with labeled toluene, biodegradation started after day 9 and
its concentration fell below detection limit after 21 days (Fig. 4.1). Meanwhile, detection of
labeled metabolites revealed an accumulation of 13
C7-benzylsuccinate at the same time. A
similar toluene biodegradation pattern was observed in the microcosm amended with the
unlabeled molecule whereas 12
C7-benzylsuccinate production could be detected. No depletion
of toluene could be observed in the abiotic control (data not shown).
Figure 4.1 : Biodegradation of fully labeled toluene and production of 13
C7-benzylsuccinate.
Squares: toluene; Triangles: benzylsuccinate. Arrows: DNA samples for the SIP experiments.
Light and heavy DNA separation and fingerprinting.
Liquid samples from 13
C-toluene amended-microcosm were collected for DNA
extraction at times corresponding to 0, 20 and 40% of toluene degradation (Fig. 4.1, arrows).
Although it does not contain labeled substrate, the same was done for the 12
C-toluene
amended microcosm to use it as a control of DNA separation biases. Separation of „light‟ and
„heavy‟ DNA was carried out by gradient centrifugation and 25 fractions by sample were
collected to ensure good resolution of the gradient. The main difficulty of using the technique
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
110%
0 5 10 15 20 25
La
be
led
be
nzyls
uc
cin
ate
c
on
ce
ntr
ati
on
(n
g.L
-1)
Re
sid
ua
l 13C
-to
lue
ne
(%
)
Days
Chapitre 4
113
SIP with the VNC1 microcosms was that its microbial population never exceeded 106
bacterial cells per mL. Moreover, the DNA extractions were difficult because of the presence
of iron sulfide precipitates in the medium. Consequently, bacterial DNA concentration being
too low to be directly detected in the gradient fractions by qPCR, carrier-DNA from the
Archaea Haladaptus paucihalophilus was added prior to centrifugation and archaean 16s
rRNA genes were targeted by qPCR to localize DNA fractions, as described previously
(Gallagher et al., 2005). Good separation of „light‟ and „heavy‟ DNA was observed (Fig. 4.2).
In order to increase DNA amounts and homogeneity, fractions of light density (1.680 to 1.695
g.mL-1
) were pooled. The same was done for the heavy density fractions (1.715 to 1.730
g.mL-1
).
Figure 4.2: Relative abundance of 13
C-labeled and non-labeled 16S rRNA gene from
Haladaptus paucihalophilus measured by qPCR in each gradient fraction.
T-RFLP analysis bacterial DNA in separated fractions showed a community shift in
heavy fractions of the microcosm amended with 13
C-toluene during biodegradation (Fig.
4.3D). After biodegradation of 20% of toluene and the accumulation of 150 ng.L-1
benzyl-
succinate, two T-RFs of 88 and 94 bp appeared to be enriched and become widely dominant
in the heavy fractions from the 13
C-toluene microcosm. Despite biases introduced by the use
of nested PCR prior to T-RFLP, such drastic shift was neither observed in the light fractions
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
1,66 1,67 1,68 1,69 1,7 1,71 1,72 1,73 1,74
Re
lati
ve
Arc
ha
ea
l 1
6s
rR
NA
ge
ne
a
bu
nd
an
ce
(%)
Densité (mg/mL)
12C
13C
Chapitre 4
114
from both microcosms (Fig. 4.3A and 3C), nor in heavy fractions from the 12
C-toluene
microcosm (Fig. 4.3B). These results are robust indications of the incorporation of labeled
carbons in the VNC1 microorganisms characterized by 88 and 94 bp T-RFs (Neufeld et al.,
2007a). Differences observed in fingerprints of light fractions from both microcosms (Fig.
4.3A and B) may be attributed to the use of nested amplification. However, such differences
did not affect interpretation of the results since many T-RFs are common to both conditions at
any time (Fig. 4.3).
Figure 4.3: Bacterial 16S rRNA gene T-RFLP fingerprints of SIP gradient fractions retrieved
from 12
C and 13
C-toluene amended microcosms after 0, 20 and 40% of toluene-degradation
(corresponding to days 0, 14 and 16 and to the production of 0, 150 and 300 ng.L-1
of
benzylsuccinate). T-RF length is given above each block. A: light fractions of 12
C-toluene
microcosm; B: heavy fractions of 12
C-toluene microcosm; C: light fractions of 13
C-toluene
microcosm; D: heavy fractions of 13
C-toluene microcosm.
Interestingly, the 88 and 94 bp T-RFs were also detected in light fractions of the 12
C
amended microcosm at all the degradation steps, whereas in 13
C condition, they were hardly
detectable in light fractions and largely dominant in heavy fractions after 20% of degradation
(day 14). These observations strongly suggest efficient incorporation of 13
C in the 16S rRNA
40 120 200 280 360 440
40 120 200 280 360 440 40 120 200 280 360 440
40 120 200 280 360 440
0%
0%
20%
20%
40%
40%
12C
13C
A B
C D
„Light‟ fractions „Heavy‟ fractions
8894
8894
Chapitre 4
115
genes of the corresponding microorganisms rather than aspecific migration in the density
gradient.
Identification of labeled 16S rRNA genes.
The 88 and 94 bp enriched T-RFs were compared to data of the 16S rRNA gene
clone library analysis carried out on the original VNC1 consortium (Berlendis et al., 2010).
The 94-bp T-RF corresponded to phylotype VNC1B071 (accession number GU339478)
related to the genus Desulfotomaculum (phylum Firmicutes). The corresponding strain might
represent a new species within the phylum Firmicutes since its closest related validly
describes species is Desulfotomaculum geothermicum with 94% sequence similarity. No
VNC1 clone sequence could be associated with the 88-bp T-RF. To confirm these results and
try to identify the 88-bp T-RF, a new 16S rRNA gene clone library was realized from the
heavy fraction of 13
C-toluene microcosm after 40% degradation. Nineteen non-chimeric clone
sequences were obtained and were all related to VNC1B071 phylotype. This result suggested
that only one phylotype incorporated 13
C in its DNA after 16 days of incubation. The presence
of the 88-bp T-RF which could not be related to any clone sequence might probably result
from the multiple distinct 16S rRNA gene copies that were commonly described in many
Desulfotomaculum spp. (Stackebrandt et al., 1997).
Implication of Firmicutes in toluene degradation has already been demonstrated by
SIP experiments by Winderl et al. (2010). Indeed, 13
C-labeled 16S rRNA genes related to
Desulfosporosinus spp. were detected after incubation of tar-oil contaminated aquifer
sediments with 13
C-toluene. In another work on the same aquifer, strain Desulfotomaculum sp.
OX39 was isolated and shown to degrade toluene, m- and o-xylene in pure culture (Morasch
et al., 2004). Interestingly, one of the clone from the VNC1 library analyzed by Berlendis et
al. (2010) was related to strain OX39 (93% identity) but the corresponding 427-bp T-RF was
not enriched during the experiment reported here (Fig. 4.3). Moreover, a new gene coding for
a benzylsuccinate synthase (bssA) was recently discovered in the D. gibsoniae genome
(Acosta-González et al., 2013). Together with these previously published data, the result of
the present study highlights the importance of sulfate-reducing Firmicutes in the degradation
of aromatic hydrocarbons in shallow or deep subsurface aquifers.
Interestingly, clone VNC3B001 identified as the dominant phylotype of the VNC1
community by Berlendis et al. (2010) (68% of the 96 clones), affiliated to Pelobacter
acetylenicus, was poorly represented in our DNA fractions and did not incorporate 13
C during
Chapitre 4
116
the early steps of toluene degradation. The in silico T-RFLP suggested that this phylotype
should correspond to a 396-bp T-RF in the experiment reported here, which was not abundant
as shown in figure 3. Since, its presence was not detected even on day 0, it could be suggested
that this phylotype disappeared during subcultures of the original consortium VNC1 on
toluene. Alternatively, as VNC1 initially degraded toluene and xylene, it could be
hypothesized that phylotype VNC3B001 was involved in xylene but not in toluene
degradation.
Search of the benzyl-succinate synthase (bssA) gene in VNC1.
Benzylsuccinate production during the toluene degradation phase (Fig. 4.1) and the
presence of 7 labeled carbons on the benzylsuccinate molecules strongly suggested that
benzylsuccinate was the first metabolite formed during the toluene degradation process by
consortium VNC1. Fumarate addition by the benzylsuccinate-synthase is to date the only
known mechanism producing benzylsuccinate from toluene (Kube et al., 2004, Leuthner &
Heider, 1998, Leuthner et al., 1998). Amplification of the genes encoding subunit A of this
enzyme (bssA) were carried out on three DNA extractions from the 13
C-toluene amended
microcosm at the end of the degradation. Amplifications could only be achieved using semi-
nested PCR with primer set 7772F/8546R as described for Desulfotomaculum sp. OX39
(Winderl et al., 2007). Acquisition of the sequences is still processing6. Primer set FAE-B
described by Von Netzer et al. (2013), targeting bssA sensu lato was also tested but no
amplification could be obtained. Similar difficulties in amplification of bssA genes were
recently reported (Sun et al., 2013). They suggest a much greater variability of this gene than
previously suspected.
CONCLUSION
A species closely related to the genus Desulfotomaculum was shown to be directly
involved in toluene degradation under sulfate reduction. The mechanism of degradation was
strongly suggested to be the addition of fumarate catalyzed by the benzylsuccinate- synthase.
These results are in agreement with those of recent studies highlighting the role of Firmicutes
in the anaerobic degradation of BTEX (Winderl et al., 2010 ; Morasch et al., 2004, Aüllo et
6 Les amplicons ont été obtenus et ont été envoyés à séquencer. Les résultats devraient être reçus très
prochainement.
Chapitre 4
117
al., 2013a) but also with data suggesting the adaptation of such microorganisms in deep
environment (Aüllo et al., 2013b).
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Chapitre 4
120
IJSEM Papers in Press. Published February 1, 2013 as doi:10.1099/ijs.0.047993-0
MESOTOGA INFERA SP. NOV., A NOVEL MESOPHILIC MEMBER OF
THE ORDER THERMOTOGALES, ISOLATED FROM AN
UNDERGROUND GAS STORAGE IN FRANCE.
Wajdi Ben Hania1,2
, Anne Postec1, Thomas Aüllo
3, Anthony Ranchou-Peyruse
3 , Gaël
Erauso1, Céline Brochier-Armanet
4, Moktar Hamdi
2, Bernard Ollivier
1, Stéphanie
Saint-Laurent3, Michel Magot
3, Marie-Laure Fardeau
1
1 Laboratoire de Microbiologie, IRD, Aix-Marseille Université, Université du Sud Toulon-
Var, CNRS/INSU, IRD, MIO, UM 110, Case 925, 163 Avenue de Luminy, 13288 Marseille
Cedex 9, France.
2 Laboratoire d‟Ecologie et de Technologie Microbienne, Institut National des Sciences
Appliquées et de Technologie, Centre Urbain Nord, BP 676, 1080 Tunis, Faculté des Sciences
de Carthage, Tunisia.
3 Université de Pau et des Pays de l‟Adour IPREM UMR 5254, Equipe Environnement et
Microbiologie, IBEAS, BP1155, F-64013 Pau, France.
4 Université de Lyon; Université Lyon 1; CNRS; UMR5558, Laboratoire de Biométrie et
Biologie Evolutive, 43 boulevard du 11 novembre 1918, F-69622 Villeurbanne, France
Corresponding author: Marie-Laure Fardeau, e-mail: [email protected]
Fax number: 33 4 91 82 85 70
Running title: Mesotoga infera sp.nov.
The subject category for the Contents list: New Taxa –Thermotogales and related organisms
The GenBank/EMBL/DDBJ accession number for the 16S rRNA gene sequence of strain
VNs100T is HE818616.
The GenBank/EMBL/DDBJ accession number for the 29 rpoB gene sequence of strain
VNs100T is JX427664.
Chapitre 4
121
Abstract
Strain VNs100T, a novel mesophilic anaerobic rod-cocoid-shaped bacterium, having a
sheath-like outer structure (toga) was isolated from a water sample collected in the area
of underground gas storage. It was non-motile with cells appearing singly (2-4 μm long x
1-2 μm wide), in pairs, or as long chains and stained Gram-negative. Strain VNs100T
was heterotrophic, able to use arabinose, cellobiose, fructose, galactose, glucose, lactose,
lactate, mannose, maltose, raffinose, ribose, sucrose and xylose as energy sources only in
the presence of elemental sulfur as terminal electron acceptor. Acetate, CO2 and sulfide
were the end-products of sugar metabolism. Hydrogen was not detected. Elemental
sulfur, but not thiosulfate, sulfate and sulfite, were reduced into sulfide. It grew at
temperatures between 30°C and 50°C (optimum 45°C), at pH between 6.2 and 7.9
(optimum 7.3-7.5) and at NaCl concentrations between 0 and 15 g.L-1 (optimum 2 g.L-
1). The DNA G+C content was 47.5 mol%. The main cellular fatty acid was C16:0.
Phylogenetic analysis of the small-subunit (SSU) ribosomal RNA (rRNA) gene sequence
indicated that strain VNs100T had as its closest relatives “Mesotoga sulfurireducens”
(97.1 % similarity) and Mesotoga prima (similarity of 97.1 % and 97.7 % with each of its
two genes respectively) within the order Thermotogales. Hybridization between strain
VNS100T and “Mesotoga sulfurireducens” and between strain VNS100T and Mesotoga
prima is 12.9% and 20.6 %, respectively. Based on phenotypic, phylogenetic and
taxonomic characteristics, strain VNs100T is proposed as a novel species of genus
Mesotoga within the family Thermotogaceae, order Thermotogales. The name Mesotoga
infera, sp. nov. is proposed. 51 The type strain is VNs100T (= DSM 25546 = JCM 154).
Keywords: Mesotoga infera sp. nov., mesophilic, Thermotogales, anaerobic, sulfur-reduction.
Chapitre 4
122
When studying the mesothermic degradation of benzene, toluene, 56 ethylbenzene and
xylenes (BTEX) by indigenous microbial communities from an underground gas storage
aquifer, Berlendis et al. (2010) found that a phylotype representing 24 % of the bacterial
diversity in a benzene-degrading microcosm was affiliated to Thermotogales. Members of the
order Thermotogales have been recognized for long time to grow optimally at high
temperatures ranging from 65 °C to 85 °C. However the existence of mesophilic
microorganisms called Mesotoga, belonging to this order, has been hypothesized several
times from molecular survey of mesothermic environments. Indeed many 16S rRNA genes
from members of the Thermotogales have been detected in high- but also low-temperature
anaerobic digesters and contaminated sediments (Dollhopf et al., 2001 ; Chouari et al., 2005 ;
Nesbø et al., 2006 ; Dipippo et al., 2009). However, it is only recently that the mesophilic trait
of these microorganisms has been established, by cultivating and isolating “Mesotoga
sulfurireducens” (Ben Hania et al., 2011) and Mesotoga prima (Nesbø et al., 2012). While
Mesotoga prima has been reported as using thiosulfate, sulfite and elemental sulfur as
terminal electron acceptors, “Mesotoga sulfurireducens” has been reported as reducing only
elemental sulfur. Interestingly, many of these Mesotoga rRNA genes have been retrieved
from enrichment cultures involved in the degradation of chlorinated compounds (Yan et al.,
2006), or from pollutants impacted sites (e.g. hydrocarbons, heavy metals, etc...), and deep
aquifer formation (Basso et al., 2005 ; Basso et al., 2009 ; Berlendis et al., 2010).
In this study, we describe a novel mesophilic, anaerobic bacterium, designated as strain
VNs100T, originating from a deep aquifer formation and enriched in an anaerobic microcosm
with benzene as sole carbon and energy source. Strain VNs100T displayed phenotypic and
phylogenetic traits allowing its assignment to a novel species of the genus Mesotoga within
the order of Thermotogales.
Anoxic water samples of the deep aquifer formation (−830 m) situated at about 100 km west
of Paris (France) were aseptically collected at the wellhead of a monitoring well after a
specific cleaning procedure as described previously (Basso et al., 2005 ; Basso et al., 2009).
The anaerobic liquids and samples filtered on-site were used to inoculate microcosm
experiments with different BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes) as carbon and
energy sources under anaerobic conditions (Berlendis et al., 2010). 86 Strict anaerobic
procedures were followed for the isolation and culture of microorganisms (Hungate, 1969).
Selective medium for enrichment and isolation of Mesotoga containing 20 mM fructose, 1
g/liter of yeast extract and 10 g/liter was described previously (Ben Hania et al., 2011).
Chapitre 4
123
Aliquots of 5 mL were dispensed into Hungate tubes, degassed under N2–CO2 (80:20 %, v/v)
and subsequently sterilized by autoclaving at 120 °C for 20 min. Prior to culture inoculation,
0.1 mL of 10 % (w/v) NaHCO3, 0.1 mL of 2 % (w/v) Na2S.9 H2O and 20 mM of fructose
from sterile stock solutions were injected into the tubes. A 0.5 mL aliquot of the sample was
inoculated into the Hungate tubes that were subsequently incubated at 37 °C, pH 7. To obtain
pure cultures, the enrichment was subcultured several times under the same growth conditions
prior to isolation. For isolation, the culture was serially diluted tenfold in roll tubes (Miller et
Wolin, 1974) containing the same culture medium supplemented with 1.6 % agar (w/v). The
colonies obtained in roll tubes were round and white. They were 0.5-1 mm in diameter after
one month of incubation at 37 °C. The process of serial dilution was repeated several times
until the isolates were deemed to be axenic. Several well-isolated colonies were picked up and
were shown to be identical on the basis of their cellular morphology and phylogeny (16S
rRNA). The strain designated VNs100T was selected and used for further characterization.
Purity of the strain was assessed under an Optiphot (Nikon) phase-contrast microscope. For
transmission electron microscopy studies, cells were negatively stained with sodium
phosphotungstate, as previously described (Fardeau et al., 1997).
Strain VNs100T was a non-motile rod to coccoid-shaped bacterium with a sheath-like outer
structure ('toga'). Cells were pleiomorphic. The cells had an average size ranging from 2 to 4
μm long by 1-2 μm in width. They were appearing single or in pairs (Fig. 4bis.1A) and
sometimes as chains in older cultures. Spores were not observed. The cell wall structure of
strain VNs100T was of Gram-negative type (Fig. 4bis.1B).
Figure 4bis.1A: Phase-contrast photomicrograph showing cells of strain VNs100T (bar 10 μm); 1B:
thin-section electron micrograph of strain VNs100T showing the Gram-negative type of cell wall (bar
0.2 μm).
Chapitre 4
124
Growth experiments were performed in duplicate, using Hungate tubes containing the basal
medium (Ben Hania et al., 2011). The pH of the medium was adjusted by injecting in
Hungate tubes aliquots of anaerobic stock solutions of 1 M HCl (acidic pHs), 10 % NaHCO3
or 8% Na2CO3 (alkaline pHs) (to test pH between 6.0 and 9.0) and checked after autoclaving.
Water baths were used for incubating bacterial cultures from 20°C to 55 °C, with increments
of 5 °C. To study the requirement of NaCl, NaCl was weighed directly in the tubes (0-10 %
w/v) before the medium was dispensed. Strain VNs100T was anaerobic and did not tolerate O2
above 0.5% in the gas phase. It was mesophilic with an optimal growth temperature 118 at 45
°C (range 30-50 °C; no growth at 30 °C and 50 °C). The optimal growth NaCl concentration
was 2 g.L-1 (range 0-15 g.L
-1). The optimum pH range for growth was 7.3-7.5 (range 6.2-7.9).
Yeast extract was required for growth. To determine the energy sources, and terminal electron
acceptors used by strain VNs100T, the strain was subcultured at least twice under the same
experimental conditions before the growth rates were determined. Bacterial growth was
monitored by measuring the increase in turbidity at 580 nm by insertion of Hungate tubes into
the cuvette holder of a spectrophotometer (Cary 50, Varian). Arabinose, cellobiose, fructose,
galactose, glucose, lactose, maltose, mannose, raffinose, ribose, sucrose, xylose, peptone,
casaminoacids, casein, acetate, propionate, butyrate, fumarate, lactate, succinate, caproate,
methanol, ethanol, isopropanol and biotrypcase were tested in the basal medium at a final
concentration of 20 mM. H2/CO2 (80/20 v/v) or H2/CO2 in the presence of 2 mM acetate as
carbon source was tested at 2 bars. Strain VNs100T grew on arabinose, cellobiose, fructose,
galactose, glucose, lactose, lactate, mannose, maltose, raffinose, ribose, sucrose and xylose,
only in the presence of elemental sulfur as terminal acceptor thus indicating that this
bacterium consumed sugars via an oxidative process rather than a fermentative one. No
growth on sugars was observed in the absence of added electron acceptor, i.e. fermentative
conditions. Hydrogen was never detected in the presence or in the absence of elemental
sulfur.
The end-products of metabolism were measured by high pressure liquid chromatography
(HPLC) and gas chromatography of the gases released after 2 weeks of incubation at 37 °C
(Fardeau et al., 2000). With fructose as energy source in the presence of elemental sulfur,
acetate, CO2 and sulfide were produced. The H2S production was shown photometrically as
colloidal CuS by using the method of Cord-Ruwisch (1985). Elemental sulfur (1 % w/v) was
used as terminal electron acceptor, but not thiosulfate (20 mM), sulfate (20 mM), sulfite (2
mM), nitrate (10 mM) and sodium nitrite (2 mM) (Table 4bis.1).
Chapitre 4
125
The absence of spores was shown by microscopic observation of cultures and pasteurization
tests performed at 80, 90 and 100 °C for 10 and 20 min.
Table 4bis.1: Differential characteristics between strain VNs100T and M. prima (Nesbø et al. 2012).
Cultures of the isolate were stopped at the end of exponential phase and sent to DSMZ for
fatty acid analysis. Fatty acids were extracted using the method of Miller (1982), with the
modifications of Kuykendall et al. (1988), and the profile of cellular fatty acids was analyzed
by gas chromatography using the Microbial Identification System (149 MIDI, Sherlock
Version 6.1; database, TSBA40; gas chromatograph, model 6890N, Agilent Technologies).
The cellular fatty acids present in strain VNs100T were C14:0 (17.2 %), C16:0 (51.1 %),
C16:1 ω9c (4.4), C18:0 (3.8), C18:1 ω9c (8.4 %) (Table 2).
Table 4bis.2: Identification of dominant fatty acids in strain VNs100T and M. prima
Chapitre 4
126
The extraction and purification of total DNA, and the amplification and sequencing of 16S
rRNA gene were described elsewhere (Ben Hania et al., 2011). The 16S rRNA gene sequence
was then compared with available sequences in the Genbank database using the BLASTN
search (Altschul et al., 1997). Evolutionary analyses were conducted in MEGA5 (Tamura et
al., 2011). A multiple alignment was built using the Muscle program (Edgar, 2004)
implemented in MEGA5 then manually refined. Positions of sequences with alignment
uncertainty and gaps were omitted from the analysis. The evolutionary model and parameters
were chosen according to the proposed model tool implemented in MEGA5. An initial tree for
the heuristic search were obtained automatically by applying Neighbor-Join and BioNJ
algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using the Maximum Composite
Likelihood (MCL) approach, and then selecting the topology with superior log likelihood
value. A discrete Gamma distribution was used to model evolutionary rate differences among
sites (5 categories (+G, parameter = 0.4020)). The rate variation model allowed for some sites
to be evolutionarily invariable ([+I], 35.3116% sites). The analysis involved 24 nucleotide
sequences with a total of 1172 positions in the final dataset. Branch robustness of the resulting
ML tree was estimated by the non-parametric bootstrap procedure implemented in MEGA5
(500 replicates of the original dataset). The tree is drawn to scale, with branch lengths
measured in the number of substitutions per site. The resulting trees indicated that the closest
relatives of strain VNs100T were “Mesotoga sulfurireducens” (97.1 % similarity) and
Mesotoga prima (97.7% and 97.1% similarity with both genes), respectively isolated from a
Tunisian wastewater digester (Ben Hania et al., 2011) and sediments from Baltimore Harbor
(Nesbø et al., 2012) (Fig. 4bis.2). This result was confirmed by the phylogenetic analysis of
rpoB gene sequence (see supplementary figure).
The G+C content of the genomic DNA, determined by the DSMZ (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany), is 47.5 mol %. DNA was
isolated and purified by chromatography on hydroxyapatite using the procedure of Cashion et
al. (1977) and the G+C content was determined by using HPLC as described by Mesbah et al.
(1989). DNA-DNA hybridization was carried out at DSMZ services. Hybridization 180
between strain VNs100T and “Mesotoga sulfurireducens” is 12.9% and between strain
VNs100T and Mesotoga prima is 20.6 %.
Chapitre 4
127
Figure 4bis.2: Maximum likelihood phylogenetic tree of SSU rRNA (1172 unambiguously aligned
nucleic acid positions analysed) based on Neighbour-Joining method showing the position of strain
VNs100T among the order Thermotogales. Thermoanaerobacter brockii and Ammonifex thiophilus
were used as outgroup. Numbers at nodes represent bootstrap values expressed in % (values >50 % are
indicated) inferred by MEGA5 from 500 replicates. Scale bar represents the average number of
substitutions per site.
Besides distinct phylogenetic differences and the low DNA-DNA hybridization observed
between strains VNs100T and “M. sulfurireducens” or M. prima, several other distinguishing
phenotypic characteristics were also found. They include the range of substrates and the range
of sulfur-containing electron acceptors to be used (Table 4bis.1). Similarly to “M.
sulfurireducens”, strain VNs100T displayed an oxidative process in the presence of elemental
sulfur as terminal electron acceptor for using sugars. This contrasts clearly with the metabolic
features of M. prima which has been reported to ferment sugars and to utilize not only
elemental sulfur, but also thiosulfate and sulfite as terminal electron acceptors (Table 4bis.1).
Moreover, amongst the Mesotoga species isolated so far, strain VNs100T exhibited the lowest
tolerance to NaCl.
It is noteworthy that strain VNs100T has been recovered from a deep aquifer impacted with
hydrocarbons. Interestingly, many of the Mesotoga which have been detected by molecular
techniques so far originated from enrichment cultures actively degrading pollutants such as
Chapitre 4
128
chlorinated compounds (Yan et al, 2006), but also from anaerobic digester treating various
types of wastes containing heavy metals, or pharmaceutical solvents (Chouari et al, 2005). In
this respect, we can hypothesize that Mesotoga representatives should be of ecological
significance in the remediation of organic and mineral toxic compounds.
Finally, based on comparative phenotypical, physiological, and phylogenetical data, we
propose strain VNs100T to be assigned to a new species of the genus Mesotoga, for which the
name Mesotoga infera sp. nov. is proposed.
Description of Mesotoga infera sp.nov.
Mesotoga infera sp. nov. (in'fe.ra. L. fem. adj. infera, that is below, underneath, lower,
referring to deep aquifer) is a mesophilic anaerobic bacterium.
Cells are short rods that possess a sheath-like outer structure (approximately 2-4 μm long x 1-
2 μm wide). Cells are anaerobic, non spore-forming, staining Gram-211 negative?. The
temperature range for growth is 30-50 °C, with an optimum at 45 °C. The optimum pH for
growth is 7.3-7.5. Grows without NaCl (optimum at 2 g.L-1). Yeast extract is required for
growth. Elemental sulfur was used as terminal electron acceptor, but thiosulfate, sulfate and
sulfite were not used. Strain VNs100T grows on fructose, arabinose, cellobiose, galactose,
glucose, lactose, lactate, mannose, maltose, raffinose, ribose, sucrose and xylose only in the
presence of elemental sulfur as terminal electron acceptor that is reduced in sulfide. The end-
products from fructose oxidation were acetate, CO2 and sulfide. Hydrogen was not produced.
The following substrates were tested but not utilized: casaminoacids, acetate, casein,
fumarate, succinate, propionate, butyrate, ethanol, methanol, isopropanol, caproate, H2/CO2,
H2/CO2 in the presence of acetate as carbon source, and formate.
The predominant cellular fatty acids are composed mainly of C16:0. The G+C content of the
genomic DNA is 47.5 mol %. The type strain, VNs100T (= DSM 25546 = JCM 18154) was
isolated from anoxic water samples of a deep aquifer formation (−830 m) near Paris (France).
Acknowledgments
We thank Dr. Jean Euzéby for checking the Latin etymology of the species name and Manon
Joseph for electronic microscopy. STORENGY and TIGF are acknowledged for funding the
IPREM-EEM team for this research project. The GIP team of STORENGY is warmly
Chapitre 4
129
thanked for his invaluable involvement in sampling campaigns on underground gas-storage
sites.
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Chapitre 4
131
CONCLUSION DU CHAPITRE
L‟identification des microorganismes responsables de la dégradation du toluène a été
réalisée par DNA-SIP sur la communauté VNC1. L‟importance de microorganismes affiliés
au genre Desulfotomaculum a ainsi été révélée. En effet, de nombreux indices suggérant
l‟enrichissement en 13
C des gènes de l‟ARNr 16S affilié aux Desulfotomaculum et plus
précisément au phylotype VNC1B071 (numéro d‟accession GU339478) (Berlendis et al.
2010) ont été mis en évidence. Par ailleurs, la production de (13
C7)-benzylsuccinate
concomitante avec la disparition du toluène a soulevé l‟hypothèse de l‟utilisation de la voie
d‟oxydation anaérobie du benzène dont la première étape est catalysée par la benzylsuccinate
synthase. Cette hypothèse a par la suite été confirmée par la détection de gènes bssA. Cette
étude confirme donc les résultats obtenus sur les échantillons du site C (Chapitre précédent)
concernant l‟importance des Desulfotomaculum dans la dégradation des BTEX.
Par ailleurs, en marge de la publication présentée ici et afin de tenter d‟obtenir une
souche pure susceptible de dégrader le toluène, des isolements ont été réalisés. Le protocole
utilisé visait à sélectionner les microorganismes sporulés devant correspondre au phylotype
VNC1B071. Pour cela des cultures en gélose profonde ont été réalisées après que l‟inoculum
ait été chauffé à 80°C pendant 30 minutes. Trois colonies ont finalement été repiquées sur
milieu riche et le gène de l‟ARNr 16S de chaque colonie a été cloné puis séquencé. Les
séquences obtenues étaient similaires pour les trois colonies repiquées. Ces séquences
n‟étaient néanmoins pas affiliées au phylotype VNC1B071 mais à un autre membre du genre
Desulfotomaculum : le phylotype VNBB004 (Numéro d‟accession GU339481). Le T-RF
théorique de cette souche étant de 370 pb, son gène d‟ARNr 16S ne semble pas avoir été
enrichi en 13
C au cours de l‟expérience. A ce jour, aucune dégradation des BTEX n‟a été
détectée en utilisant cette souche pure.
Dans des travaux parallèles, une souche pure dénommée VNs100 a également été
isolée à partir d‟échantillons provenant du site A. Sa caractérisation a permis de montrer
qu‟elle possédait toutes les caractéristiques phénotypiques et génétiques autorisant sa
classification comme une nouvelle espèce du genre Mesotoga, pour laquelle le nom M. infera
a été proposé.
132
133
Chapitre 5 : Isolement et caractérisation
d’une nouvelle espèce de Desulfotomaculum (Site D)
134
Chapitre 5
135
PREAMBULE
Le but du programme de recherche est de mettre en évidence un potentiel
d‟atténuation naturelle des BTEX dans les divers sites de stockage de gaz naturel étudiés.
L‟un des objectifs principaux est ainsi d‟identifier des microorganismes ayant la capacité à
dégrader des BTEX afin de les caractériser et de créer des outils moléculaires spécifiques
permettant de les détecter dans les aquifères de stockage. La biodiversité observée dans les
microcosmes étudiés au cours de cette étude étant très variable, des stratégies d‟études
différentes sont abordées pour chaque microcosme.
Le microcosme étudié dans ce chapitre provient du site D et dégrade le p-xylène en
condition de sulfato-réduction à 60°C. Contrairement à la communauté microbienne étudiée
dans le chapitre précédent, celle étudiée dans ce cinquième volet est extrêmement simplifiée.
En effet, les études de diversité basées sur la séquence du gène de l‟ARNr 16S n‟ont permis
de détecter que 2 souches. L‟une est largement majoritaire (99% de la population) et affiliée
au genre Desulfotomaculum. L‟identification de l‟autre souche est moins précise puisque
l‟identité avec l‟espèce décrite la plus proche n‟est que de 88% : il s‟agit d‟une espèce du
genre Acetobacterium. La communauté microbienne étant très simple, la technique de Stable
Isotope Probing utilisée dans le chapitre précédant n‟est pas adaptée à l‟étude des
microorganismes impliquée dans la dégradation.
L‟implication du genre Desulfotomaculum dans la dégradation des BTEX a déjà été
démontré dans ce manuscrit, que ce soit pour la communauté provenant du site C (Chapitre 3)
ou via la technique SIP pour la communauté A (Chapitre 4). De plus, d‟autres études réalisées
vont dans le même sens (Winderl et al., 2010 ; Taubert et al., 2012). Par ailleurs, la souche
pure Desulfotomaculum sp. Ox39, isolée à partir d‟échantillons d‟un aquifère peu profond, est
capable de dégrader le m-xylène, le p-xylène et le toluène en conditions de sulfato-réduction
(Morasch et al., 2004). Ces études ont contribué au choix d‟une stratégie d‟isolement de la
souche majoritaire détectée par l‟analyse de diversité réalisée sur le microcosme provenant du
site D. La souche Ss001 a donc été isolée et caractérisée. Sa capacité à dégrader les BTEX a
également été testée.
Cette étude est présentée ci-après sous la forme d‟un article de description qui sera
soumis prochainement dans la revue International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology.
Chapitre 5
136
DESULFOTOMACULUM PAUCIVORANS, SP. NOV., A SULFATE-
REDUCING BACTERIUM ORIGINATING FROM A DEEP-
SUBSURFACE AQUIFER.
Thomas Aüllo1, Louis Carles
1, Stéphanie Saint-Laurent
1, Michel Magot
1, Anthony Ranchou-
Peyruse1*.
1 Université de Pau et des Pays de l‟Adour, Equipe Environnement et Microbiologie, Institut
des Sciences Analytiques et de Physico-Chimie pour l‟Environnement et les Matériaux
(IPREM UMR 5254), Pau, France.
*Correspondence : [email protected]
Abstract
A novel anaerobic bacterium, designated Ss001T, was isolated from a well that collected
water from a deep gas storage aquifer at a depth of 866 m in the Paris Basin, France.
Cells were rod-shaped (1.5-4.8 x 0.7-1.4μm) and non-motile. Strain Ss001T grew at
temperatures between 30 and 60 °C (optimum 50 °C) and at pH values between 6.5 and
8.0 (optimum 7). Optimal growth occurred with 0.5 g.L−1
and the strain tolerated up to
20 g NaCl l−1
. In the presence of sulfate, strain Ss001T used yeast extract, peptone,
butyrate, lactate and pyruvate as carbon and energy sources. Fermentative growth
occurred with pyruvate. Sulfate was the only electron acceptor used. Phylogenetic
analysis of the 16S rRNA gene sequence indicated that strain Ss001T was affiliated with
the phylum Firmicutes within the family Peptococcaceae. On the basis of 16S rRNA and
dsrAB gene sequence comparisons, the presence of spores, the Gram positive structure
of its cell envelope, and the use of sulfate as electron acceptor, it is proposed that strain
Ss001T be assigned to the genus Desulfotomaculum, as the representative of a novel
species, Desulfotomaculum paucivorans sp. nov..
Chapitre 5
137
Sulfate-reducing bacteria (SRB) play a major role in anaerobic environments and have
been isolated from various subsurface settings including deep geological formations
(Motamedi & Pedersen, 1998 ; Tardy-Jacquenod et al., 1998 ; Basso et al., 2005a). Spore-
forming Gram-positive sulfate-reducers of the Desulfotomaculum genus were shown to be
present in deep oceanic (Gerasimchuk et al., 2010 ; Hubert et al., 2010) or continental
subsurface environments such as mines (Moser et al., 2005 ; Kaksonen et al., 2006), oilfields
(Tardy-Jacquenod et al., 1998 ; Liu et al., 2008) and aquifers (Detmers et al., 2004 ; Berlendis
et al., 2010). During the course of the study of the natural attenuation of BTEX (Benzene,
Toluene, Ethylbenzene and Xylene) in deep aquifers wherein natural gas is stored, we have
already isolated and characterized several new bacterial species (Basso et al., 2005a ; Klouche
et al., 2007 ; Klouche et al., 2009 ; Ben Hania et al., 2013). We were also intrigued by the
frequent presence of Desulfotomaculum species in our BTEX-degrading anaerobic microbial
communities (Berlendis et al., 2010), an observation also previously reported by other authors
(Morasch et al., 2004 ; Taubert et al., 2012). We describe here a new isolate, strain Ss001T,
originating from a p-xylene-degrading microcosm, which is proposed as the representative of
a new species, Desulfotomaculum paucivorans sp. nov.
Water samples were collected from a deep gas storage aquifer located in the Paris
Basin drilled in a 866 meters-deep sandstone layer from the upper Jurassic with an in situ
temperature of 37°C, pH between 7.2 and 7.5 and redox potential of -300 mV. The detailed
sampling procedure was described earlier (Basso et al., 2005b). Microcosm experiments were
carried out as described by Berlendis et al. (2010) in order to characterize BTEX-degrading
activity.
Under sulfate-reducing conditions a microcosm was shown to degrade p-xylene at
60°C, whereas benzene, toluene, ethylbenzene, m- and o-xylene were not used. A microbial
diversity analysis was carried out on this community by cloning and sequencing its 16S rRNA
genes, showing the strong dominance of a sequence related to the genus Desulfotomaculum
(95 over 96 clones, data not shown). Isolation of the corresponding strain was carried out
using two consecutive dilution-to-extinction series with a basal medium composed of 0.01
g.L-1
NH4CL, 0.04 g.L-1
KCl, 0.138 g.L-1
CaCl2, 1.14 g.L-1
NaHCO3, 0.242 g.L-1
MgSO4.6H2O, 3.431 g.L-1
Na2SO4, K2HPO4, 0.3 g.L-1
, KH2PO4, 0.3 g.L-1
, NH4Cl, 0.5 g.L-1
.
Yeast extract (1 g.L-1
) and p-xylene (34.3 mg.L-1
) were added as carbon and energy sources.
Purity of the strain was checked by phase-contrast microscopy. PCR amplification of its 16S
rRNA gene, cloning and sequence analysis on several subcultures did not reveal the presence
Chapitre 5
138
of any other phylotype. At the end of this purification process, the isolate was named strain
Ss001T.
As observed by phase-contrast microscopy (Olympus BX 60 microscope), strain
Ss001T cells were rod shaped (1.5-4.8 x 0.7-1.4 µm), with pointed ends and non-motile.
Endospore were observed when cultivation conditions were not favorable (with benzene as
the only carbon source or when heated at a temperature higher than 60°C). Spore position was
central to subterminal. Gram staining was negative but KOH lysis test (Gregersen 1978)
suggested a gram-positive structure of the cell wall.
Utilization of carbon and energy sources, electron acceptors, fermentation growth
tests, pH and salinity optima were determined in the basal medium as previously described
(Pfennig et al., 1981 ; Magot et al., 1992 ; Widdel and Bak, 1992 ; Tardy-Jacquenod et al.,
1996 ; Basso et al., 2005a). Results are reported in Table 5.1. Strain Ss001T was a strictly
anaerobic, moderately thermophilic bacterium with an optimal growth observed at 50° (range
37°C to 60°C). No growth was observed at 30°C and 65°C. pH 7 was optimal but growth
could be observed from 6.5 to 8. The optimal NaCl concentration was 0.5 g.L-1
(0 to 15 g.L-1
).
Very few carbon substrates were used as electron donors since good growth was only
observed on yeast extract, peptone, butyrate, lactate and pyruvate with sulfate as the electron
acceptor. Under sulfate-reduction conditions, no growth was observed on formate, malate,
propionate, butanol, methanol, ethanol, propan-2-ol, fructose, glucose, lactose, nor on the
numerous aromatic compounds tested. Under fermentative conditions, strain Ss001T could
only grow on pyruvate but not on formate/acetate, formate, malate and lactate. No growth was
observed with sulfite, thiosulfate, elemental sulfur or nitrate as the electron acceptor and with
lactate as the electron donor. Strain Ss001T could not grow autotrophically with H2 + CO2 as
energy and carbon source.
Chapitre 5
139
Table 5.1: Differential characteristics between strain Ss001T and related Desulfotomaculum
species. Taxa: 1, strain Ss001T; 2, D. thermobenzoicum subsp. thermobenzoicum (Tasaki et
al., 1991); 3, D. thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum (Plugge et al., 2002); 4, D.
thermoacetoxidans (Min and Zinder, 1990); 5, D. sp. Ox39 (Morasch et al., 2004); ND = Not
Determined.
Characteristic 1 2 3 4 5 Morphology Rod Rod Rod Rod Rod Cell diameter (µm) 0.7-1.4 1.5-2 1 0.7 1.5
Cell length (µm) 1.5-4.8 5-8 3-11 2-5 7-8
Temperature range (optimum, °C) 37-60 (50) 40-70 (62) 45-62 (55) 45-65 (55-60) 20-36 (25-30)
pH range; optimum 6.5-8 (7) 6-8 (7.2) 6-8 (7) 6-7.5 (6.5-7) 6.5-7.8 (7.4-7.8)
Salinity range (optimum, g.L-1) 0-15 (0.5) ND ND 0-15 0-35 (15)
Electron donors7
H2/CO2 - + + + -
H2/Acetate - ND ND ND -
Acetate (+) - + + -
Benzoate (+) + + - +
Butyrate + + - + ND
Formate - + ND + -
Fumarate (+) + + ND -
Lactate + + + + -
Malate - + (+) + -
Pyruvate + + + + -
Succinate (+) - - + -
Propionate - + + + -
Benzène - ND ND ND -
Benzylsuccinate - ND ND ND -
Toluène - ND ND ND +
Ethylbenzène - ND ND ND -
o-Xylène - ND ND ND +
m-Xylène - ND ND ND +
p-Xylène - ND ND ND -
Naphtalène - ND ND ND -
1-méthylnaphtalène - ND ND ND -
Phénol - - ND ND -
p-Crésol - ND ND ND -
o-Toluic acid - ND ND ND +
m-Toluic acid - ND ND ND +
Butanol - + - + ND
Ethanol - + - - -
Glycérol (+) ND ND ND ND
Méthanol - - - ND -
Propan-2-ol - + - + ND
Fructose - - - ND ND
Glucose - - - ND -
Lactose - ND ND ND
Peptone + (+) - ND ND
Yeast extract + + + ND +
Fermentation
Formate/Acetate - - ND
Formate - - ND
Lactate - + + + ND
Malate - - ND
Pyruvate + + + + ND
Electron acceptors
Sulfite - + - - -
Thiosulfate - + - + -
Elemental sulfur - ND ND + -
Nitrate - + - - -
7 Other electron donors tested but not used: p-toluic acid and 2,3-dimethylnaphtalene.
Chapitre 5
140
The G+C% content determined by the Identification Service of the DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb, Braunschweig, Germany) using the
method of Mesbah et al. (1989) was XXX%.
Phylogenetic analyses were carried out on the 16S rRNA and dissimilatory sulfite reductase
dsrAB genes. Both genes were amplified using the PCR core kit plus (Roche) according to the
manufacturer instructions with primers 8F/1387R (Lane, 1991 ; Marchesi et al., 1998) for 16S
rRNA and 1F/4R (Wagner et al., 1998) for dsrAB. The PCR products were ligated into TOPO
pCR2.1 vectors and cloned in chemically competent TOPO10 cells. Sixty clones for 16s
rRNA and thirty for dsrAB were randomly selected and the sequence determined by Qiagen
sequencing services (Hilden, Germany). Sequences were manually edited using Bioedit v7
(Hall, 1999) and aligned with related sequences from public databases using the Muscle
program (Edgar, 2004). Ambiguous regions were removed using Gblocks (Castresana, 2000)
and phylogenetic trees were constructed using the maximum-likelihood method implemented
in the phyML program (v 3.0, Guindon & Gascuel, 2003). Reliability for internal branch was
assessed using the aLRT test (Anisimova and Gascuel, 2006). Pairwise evolutionary distances
were calculated using the Kimura 2-parameter model (Kimura, 1980) in MEGA v.5.2.1.
(Tamura et al., 2011).
Phylogenentic analyses based on a 1145 bp sequence of the 16S rRNA gene and a
1546 bp sequence of dsrAB genes both showed that strain Ss001T is affiliated to the genus
Desulfotomaculum, in the family Peptococcaceae (Fig. 5.1 and 2). A 126 nucleotides
sequence was shown to be inserted in the V1 region of the 16S rRNA gene, as it was
previously described for D. kuznetsovii and D. australicum (Love et al., 1993 ; Tourova et al.,
2001). This hypervariable regions was omitted for phylogenetic analyses as previously
suggested (Stackebrandt et al., 1997 ; Tourova et al., 2001). Strain Ss001T showed the
shortest pairwise evolutionary distance with both subspecies of Desulfotomaculum
thermobenzoicum (94.5% identity with subspecies thermobenzoicum and
thermosynthrophicum) isolated from two thermophilic digesters. Nevertheless, unlike these
two subspecies, the 16S rRNA-based tree showed that strain Ss001T cannot be unambiguously
included in Desulfotomaculum cluster Id, nor in any other cluster defined so far (Fig. 5.1).
Then, strain Ss001T could be considered as the first representative of a new
Desulfotomaculum cluster which could be called Ii, since the last described cluster, including
Pelotomaculum species, is Ih (Imachi et al., 2006 ; Imachi et al., 2007).
Chapitre 5
141
Figure 5.1: Maximum-likelihood tree based on 16S rRNA gene (1145 bases) showing the
phylogenetic relationship between strain Ss001 and closest relatives. Reliability values (aLRT
values) are given at nodes.
Klein et al. (2001) showed that dsrAB genes sequences of Desulfotomaculum spp.
were divided into two phylogenetic clusters. One cluster was related with dsrAB genes
sequences of Delta-proteobacteria while the other was only composed of Desulfotomaculum
sequences. These analyses suggested multiple lateral transfers of dsrAB genes between
Desulfotomaculum. and Delta-proteobacteria spp. Strain Ss001T dsrAB genes are a new
example of such relationships, as they are clearly included in the cluster shared by
Desulfotomaculum. and Delta-proteobacteria spp., Desulfotomaculum acetoxidans sequence
being its closest relative.
Considering its main physiologic and phylogenetic characteristics, it is proposed that
strain Ss001T represents a novel species for which the name Desulfotomaculum paucivorans
is proposed.
Desulfotomaculum cluster Ic
Desulfotomaculum thermobenzoicum (NR 042045.1)
Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum
Desulfotomaculum thermoacetoxidans (NR 029336.1)
cluster Id
Strain Ss001T
Desulfotomaculum sp. Ox39 (AJ577273.1)
Desulfotomaculum cluster Ib
Desulfotomaculum cluster Ia
Desulfotomaculum cluster Ie
Desulfotomaculum If
Pelotomaculum spp.
Desulfosporosinus spp.
Thermodesulfovibrio yellowstonii (AB231858.1)
99
95
99
97
79
94
100
100
93
77
94
92
95
61
0.1
Chapitre 5
142
Figure 5.2: Maximum-likelihood tree based on dsrAB gene (1556 bases) showing the
phylogenetic relationship between strain Ss001T and closest relatives. Reliability values
(aLRT values) are given at nodes.
Description of Desulfotomaculum paucivorans sp. nov.
Desulfotomaculum paucivorans (pau.ci.vorans. L. adj. paucus little; L. v. vorare to eat; L.
pres. part. vorans eating; M.L. adj. paucivorans eating little, referring to the few compounds
that are utilized as sole sources of carbon and energy).
Cells of strain Ss001T were rod-shaped, 1.5-4.8 x 0.7-1.4 µm, non-motile, strictly anaerobic.
Gram-staining was negative but KOH lysis test suggested Gram positive wall structure. Cells
were spore-forming with central to subterminal position of the spore. Optimum growth
occurred at 50°C and pH 7 with 0.5 g.L-1
NaCl. Oxidization of substrates was only possible
with sulfate as the electron acceptor. Yeast extract, peptone, lactate, butyrate could be
oxidized and pyruvate could be either oxidized or fermented. The type strain is Ss001T
(=DSM), which was isolated from a water-producing well in France. The DNA G+C content
of the type strain is XXX mol%.
Desulfobacula toluolica (AJ457136)
Desulfovibrio desulfuricans (AF273034.1)
Desulfobulbus propionicus (AF218452.1)
Desulfotomaculum thermobenzoicum (AF273030.1)
Desulfotomaculum thermoacetoxidans (AF271770.1)cluster Id
Desulfotomaculum kuznetsovii (AF273031.1)
Desulfotomaculum thermocisternum (AF074396.1)cluster Ic
Strain Ss001T
cluster IeDesulfotomaculum acetoxidans (AF271768.1)
Desulfotomaculum geothermicum (AF273029.1)
Desulfotomaculum thermosapovorans (AF271769.1)cluster Ib
Desulfosporosinus orientis (AF271767.1)
Desulfosporosinus sp. (DB GU372083.1)
Pelotomaculum propionicicum (AB154391.1)
cluster IfDesulfotomaculum alkaliphilum (AF418195.1)
Desulfotomaculum nigrificans (AF482466.1)
Desulfotomaculum putei (AF273032.1)
Desulfotomaculum defluvii (FM999736.1)
Desulfotomaculum ruminis (U58118.2)
Desulfotomaculum aeronauticum (AF273033.1)
cluster Ia
Archaeoglobus profundus (AF071499)
Thermodesulfovibrio yellowstonii (U58122.2)97
100
99
85
100
100
98
51
90
41
99
99
100
100
100
65
97
100
97
0.1
Chapitre 5
143
Acknowledgments
STORENGY and TIGF are acknowledged for funding the IPREM-EEM team for this
research project. The GIP team of STORENGY is warmly thanked for his invaluable
involvement in sampling campaigns on underground gas-storage sites..
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Chapitre 5
146
CONCLUSION DU CHAPITRE
La souche Ss001T, très majoritaire (99%) au sein d‟un microcosme dégradant le p-
xylène, a été isolée dans le but d‟obtenir une culture pure dégradant ce composé en sulfato-
réduction. Néanmoins, aucune dégradation du p-xylène par Ss001T n‟a pu être observée en
une centaine de jours d‟incubation. Par ailleurs, une croissance n‟a pu être observée que sur
quelques substrats simples (pyruvate, butyrate et lactate) et complexes (yeast extract et
peptone). Le nom proposé pour la souche Ss001T est donc Desulfotomaculum paucivorans
(du latin paucus, peu et vorare, manger pour désigner le peu de substrats utilisés).
Concernant la dégradation du p-xylène, une seule souche décrite à ce jour utilise ce
substrat en anaérobiose, elle est affiliée au genre Desulfosarcina (Higashioka et al., 2012). Si
elle n‟est pas capable d‟utiliser le p-xylène, la souche Desulfotomaculum sp. Ox39 peut, en
revanche, dégrader plusieurs composés aromatiques en culture pure (Morasch et al., 2004).
Ces études ainsi que la forte proportion de la souche Ss001 dans le microcosme de départ
dégradant le p-xylène sont autant d‟arguments en faveur d‟une implication de Ss001 dans la
dégradation. L‟absence de dégradation observée pourrait donc trouver plusieurs explications.
La première pourrait être une durée d‟incubation trop courte, en effet, dans le
microcosme de départ la disparition du p-xylène n‟a eu lieu qu‟après 900 jours. Bien que
toujours en cours, les cultures de la souche en présence de composés aromatiques n‟ont été
incubées que depuis une centaine de jours. Il est donc possible que la dégradation intervienne
plus tard. La seconde pourrait être la nécessité d‟un partenaire (éventuellement celui détecté
via l‟analyse de diversité réalisée sur la communauté de départ) pour la dégradation des
composés aromatiques. La troisième pourrait être la perte des gènes de dégradation au cours
de l‟isolement comme évoquée dans le chapitre 3. Ce phénomène pourrait être dû à la perte
d‟un plasmide contenant les gènes de dégradation ou à des mécanismes de transposition.
Dans le cas où la dégradation n‟interviendrait pas dans les mois à venir, des tests de
dégradation réalisés en co-culture avec des microorganismes méthanogènes pourraient être
envisagés. L‟espèce décrite la plus proche phylogénétiquement de Ss001 est en effet
Desulfotomaculum thermobenzoicum dont une des sous-espèces (subsp.
thermosynthrophicum) est un microorganisme syntrophe. La caractérisation de cette sous-
espèce a en effet montré la dégradation de certains composés uniquement en présence d‟un
partenaire méthanogène : Methanothermobacter thermoautotrophicus (Plugge et al., 2002).
147
Conclusions et Perspectives
148
Conclusions et perspectives
149
L‟objectif du projet de recherche (IMPALAS) dans lequel s‟inscrit le travail présenté
dans ce mémoire était initialement de déterminer si la biodégradation peut être une des
composantes de l‟atténuation naturelle des BTEX dans les aquifères servant pour le stockage
de gaz naturel. Au début du projet, la capacité de dégradation des hydrocarbures par des
microorganismes était connue mais des interrogations subsistaient quant aux conditions
extrêmes pour la vie dans le stockage (anaérobiose, pression, …) et aux répercutions qu‟elles
pourraient avoir sur une éventuelle dégradation. La microbiologie de ces structures
géologiques a donc été étudiée mais a nécessité plusieurs années de mise au point.
La première étape consistait à mettre en place un protocole d‟échantillonnage afin
d‟adapter le matériel industriel utilisé pour le contrôle de l‟aquifère aux études
microbiologiques. Le défi majeur de ce processus était de récolter de l‟eau d‟aquifère
contenant une flore microbienne représentative de celle retrouvée dans le stockage et ce
malgré la traversée de plusieurs centaines de mètres de tubing. Un protocole basé sur des
nettoyages mécaniques (brossage) et chimiques (chloration) des puits servant aux
prélèvements a pu être mis en place et son efficacité prouvée par des études de diversité
microbienne (Basso et al., 2005b).
Le deuxième élément à mettre en place concernait l‟installation de moyens techniques
permettant de suivre la dégradation des BTEX au laboratoire afin de pouvoir sélectionner par
la suite les communautés microbiennes ayant la capacité à dégrader. Le choix de la technique
de SPME-GC-FID a ainsi été fait et celle-ci est aujourd‟hui utilisée en routine.
Ces éléments mis en place, des prélèvements ont été réalisés sur divers sites de
stockage afin d‟en étudier la diversité microbienne. Les échantillons récoltés ont été étudiés
par des techniques culturales afin (i) d‟identifier les groupes métaboliques présents dans les
aquifères et de les dénombrer ; (ii) de sélectionner des communautés microbiennes capables
d‟utiliser les BTEX en réalisant des essais de dégradation de ces hydrocarbures en
microcosmes.
Le premier point a permis de mettre en évidence la présence majoritaire de
microorganismes sulfato-réducteurs dans les aquifères de stockage. L‟avènement des outils de
biologie moléculaire (PCR, T-RFLP, clonage-séquençage) a ensuite permis de confirmer les
résultats culturaux via des analyses de diversité (Basso et al., 2009 ; Berlendis et al., 2010).
Les dénombrements ont également montré la faible biomasse présente dans les sites de
stockage ce qui laissait présager de cinétiques lentes de dégradation.
Conclusions et perspectives
150
De telles cinétiques ont été confirmées par les tests de dégradation microcosme avec
des dégradations parfois mises en évidence après plus d‟un an d‟incubation. La lenteur du
processus a nécessité un travail d‟entretien à long terme des communautés via des repiquages
ainsi qu‟un suivi mensuel de la dégradation. Le rythme de prélèvement, annuel, a implémenté
le nombre de microcosmes étudiés qui est aujourd‟hui de plusieurs centaines.
Ces études ont permis de montrer une dégradation in vitro des BTEX à partir
d‟échantillons d‟eau provenant des aquifères de stockage de gaz naturel ce qui répondait à la
question initiale du projet : les bactéries indigènes des aquifères de stockage ont-elles la
capacité de dégrader les BTEX en anaérobiose, dans des conditions proches de celles des
formations géologiques ? Néanmoins, la lenteur des dégradations in vitro en font un outil de
diagnostic peu adapté. Des réponses plus rapides sont attendues et peuvent être apportées
grâce à des bio-indicateurs. Leur développement nécessite de comprendre le mode de
fonctionnement du métabolisme des BTEX et d‟identifier les cibles moléculaires des voies de
dégradation. Pour cela, il faut tout d‟abord identifier et caractériser des microorganismes
directement responsables de la dégradation au sein des communautés. C‟est dans cet objectif,
que le volet microbiologique du projet IMPALAS s‟est inscrit durant les trois dernières
années (sans pour autant déroger au processus d‟entretien des communautés sélectionnées au
fil des années et évoqué ci-dessus).
Les travaux présentés dans les trois chapitres précédents présentent trois façons
différentes mais complémentaires d‟aborder cette problématique. Les chapitres 3 et 5
décrivent l‟étude de deux communautés extrêmement simplifiées (sites C et D) alors que le
chapitre 4 décrit l‟approche utilisée pour une communauté complexe (site A).
Ces trois volets présentent des caractéristiques communes. La plus frappante est la
présence du genre Desulfotomaculum au sein des trois communautés alors que les sites de
prélèvement sont distincts géographiquement : la communauté provenant du site C n‟est
seulement composée que de deux souches de Desulfotomaculum, celle du site D est composée
de deux populations dont une appartenant également au genre Desulfotomaculum et largement
majoritaire (99 % de la communauté), et enfin la troisième communauté issue du site A
contient également des microorganismes appartenant à ce genre. Cette particularité souligne
une bonne adaptation de ces sulfato-réducteurs du phylum Firmicutes aux conditions
extrêmes de survie dans les aquifères profonds. Nous ne pensons pas que cette redondance ne
soit que le fruit du hasard et c‟est pour cela que la troisième partie de l‟exposé
bibliographique, ainsi qu‟une revue discutant de la présence de ce genre dans les écosystèmes
Conclusions et perspectives
151
de subsurface ont été présentées dans ce manuscrit (Chapitres 1). Un grand nombre d‟études
menées sur différents écosystèmes de subsurface profonde suggèrent une grande importance
des sulfato-réducteurs Gram positif tels que les Desulfotomaculum dans les environnements
profonds. La prépondérance de ces microorganismes en milieu profond (par rapport à d‟autres
sulfato-réducteurs) est sans doute liée à leur capacité à sporuler ainsi qu‟à leur versatilité
métabolique. C‟est ce deuxième point qui a été mis en valeur dans le cadre de cette étude car
les résultats obtenus indiquent une forte implication des Desulfotomaculum dans la
dégradation des BTEX. Néanmoins, une dégradation par une souche pure n‟a pas pu être
obtenue à ce jour.
La communauté provenant du site C échantillonnée en 2000 est aujourd‟hui
uniquement constituée d‟espèces de ce genre qui ont été sélectionnées naturellement au fil des
repiquages en utilisant les BTEX comme seule source d‟énergie. Elle dégrade
séquentiellement l‟Ethylbenzène, le Toluène et le Benzène (BTE). Il y a donc une grande
probabilité que ces microorganismes soient impliqués dans la dégradation. Néanmoins, de par
leur ressemblance métabolique, l‟isolement des deux souches s‟est avéré fastidieux. De ce
fait, la pression de sélection (exercée par l‟utilisation de BTEX comme seule source
d‟énergie) n‟a pas été maintenue durant tout le processus, ce qui a causé la perte des gènes de
dégradation.
La communauté du site D, largement dominée par une espèce du genre
Desulfotomaculum, dégrade le p-Xylène. La présomption sur la capacité à dégrader de
l‟espèce dominante est donc forte mais ne peut être confirmée que par des expériences de
dégradation en culture pure. L‟isolement et la caractérisation de cette souche ont été réalisés
mais les cinétiques de dégradation de la communauté de départ (plus de 1000 jours) n‟ont pas
permis d‟obtenir de résultats définitifs sur ce point pendant la durée de ce travail. Néanmoins,
la caractérisation phénotypique et phylogénétique de la souche Ss001 se justifie par l‟apparent
éloignement de ce microorganisme des sous-clusters déjà identifiés au sein du genre
Desulfotomaculum.
La communauté du site A n‟est pas dominée par les Desulfotomaculum mais une étude
de biologie moléculaire basée sur la technique d‟ADN-SIP a permis de mettre en évidence
leur implication directe dans la dégradation du toluène. En effet, le phylotype VNC1B071
(numéro d‟accession GU339478) (Berlendis et al., 2010) affilié à ce genre a incorporé des
carbones marqués (13
C) provenant de molécules de toluène ce qui suggère sa participation aux
Conclusions et perspectives
152
premières étapes de la dégradation. L‟isolement de cette souche devrait être réalisé dans les
mois à venir.
L‟obtention de souches pures dégradant les BTEX est une étape primordiale pour
définir un ensemble de bio-indicateurs moléculaires utilisables pour un diagnostic rapide de
l‟atténuation naturelle des BTEX dans les aquifères profonds. Cette étape permettra à court
terme d‟identifier les gènes impliqués dans la dégradation des BTEX par l‟utilisation des
outils moléculaires disponibles à ce jour tels que le séquençage de génome. Un tel outil a pu
être utilisé sur les souches isolées du site C et semble indiquer la perte de gènes de
dégradation au cours des repiquages des souches en milieu riche. Ce résultat porte un
éclairage nouveau sur les raisons pour lesquelles si peu de souches pures anaérobies dégradant
les BTEX ont été caractérisées à ce jour. Dans ce cas précis, l‟étude du métagénome de la
communauté B1 de départ pourrait permettre d‟obtenir les informations recherchées sans
passer par un isolement dans la mesure où cette communauté n‟est composée que de deux
espèces. Ces outils permettront de cibler les gènes de dégradation directement en sortie de
puits (PCR avec amorces spécifiques, par exemple). De tels outils existent déjà pour certains
gènes tels que celui de la sous-unité α de la benzylsuccinate synthase (bssA) catalysant la
dégradation de toluène. Néanmoins, ces bio-marqueurs ne sont pas adaptés à tous les genres
microbiens (Sun et al., 2013) et nécessitent d‟être modifiés afin de cibler les microorganismes
présents dans les aquifères de stockage. Des bio-marqueurs ciblant la dégradation des autres
BTEX pourront également être développés au fur et à mesure des découvertes scientifiques.
D‟autres bio-marqueurs ont une fonction différente et permettent l‟identification
rapide de microorganismes particuliers en ciblant le gène de l‟ARNr 16s. Les espèces de
Desulfotomaculum identifiées au cours de cette étude pourraient ainsi être détectées in situ via
des sondes FISH, par exemple. Cette identification pourrait donner des indices concernant le
potentiel de dégradation. Néanmoins, la nature des microorganismes et leurs fonctions ne sont
pas indissociables dans le monde de la microbiologie. Plusieurs paramètres peuvent entrer en
compte (comme la pression des sites de stockage comparée à celle des microcosmes) et
l‟identification d‟un microorganisme dégradant les BTEX en laboratoire n‟impliquera pas
nécessairement sa dégradation in situ.
L‟ensemble de ces outils devraient permettre de mener à bien les objectifs du projet
IMPALAS et permettre à terme, via la modélisation numérique de l‟historique d‟un site de
stockage prenant en compte le processus de biodégradation, de proposer une simulation
prospective de la disparition des composés traces dans le stockage considéré. Afin d‟affiner
Conclusions et perspectives
153
ces modèles, le fait de disposer de souches bactériennes pures issues des formations
géologiques concernées pourrait permettre d‟aborder plus simplement qu‟avec des
communautés microbiennes le sujet des cinétiques de dégradation.
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Résumé
La France est dépendante en gaz naturel dont elle importe 98% de sa consommation.
Comme pour plusieurs autres pays (Etats-Unis, Canada, Grande Bretagne, Autriche,
Allemagne, etc.), le stockage de gaz est principalement réalisé afin de pallier aux variations
saisonnières de consommation. Grâce aux spécificités géologiques de notre territoire, ce
stockage se fait essentiellement aux niveaux d‟aquifères très profonds (-500 à 1000 mètres).
Le gaz naturel contient en majorité du méthane mais également des traces d‟autres
composés tels que les BTEX (Benzène, Toluène, Ethylbenzène et les trois isomères du
Xylène) qui sont connus pour leur toxicité. Ces hydrocarbures monoaromatiques peuvent se
solubiliser dans l‟eau de formation aux niveaux des interfaces eau/gaz. Leur biodégradation
est bien moins rapide en anaérobiose qu‟en aérobiose mais un potentiel d‟atténuation naturelle
des BTEX par les communautés microbiennes indigènes a déjà pu être démontré lors de
travaux antérieurs. Cependant, bien que de nombreuses études aient été réalisées sur le sujet,
les voies de dégradation anaérobie ne sont que partiellement connues et les connaissances
concernant les microorganismes impliqués sont réduites, voire inexistantes.
A terme, l‟obtention de biomarqueurs moléculaires in situ doit permettre d‟évaluer
rapidement le potentiel de dégradation des microorganismes d‟un aquifère. Pour atteindre cet
objectif, il est indispensable d‟acquérir une meilleure compréhension des mécanismes de
dégradation et donc, d‟isoler les microorganismes impliqués dans la dégradation de ces
composés. Au cours de cette étude, des communautés microbiennes provenant d‟échantillons
d‟eau de formation issue de trois aquifères distincts (nommés dans ce travail A, C et D) ont
été étudiées à l‟aide de trois approches différentes de microbiologie environnementale. Ainsi,
des études culturales et moléculaires ont permis de caractériser une communauté extrêmement
simplifiée (deux souches de Desulfotomaculum) capable de dégrader les BTE sur le site C.
Une étude moléculaire réalisée par DNA-SIP (Stable Isotope Probing) a permis d‟identifier un
phylotype, également affilié au genre Desulfotomaculum, comme responsable de la
dégradation du toluène dans le site A. Enfin, l‟espèce majoritaire d‟une communauté
dégradant le para-xylène a été isolée à partir du site D et affiliée une nouvelle fois au genre
Desulfotomaculum.
L‟ensemble de ces résultats ainsi que ceux de la littérature suggèrent l‟ubiquité des
bactéries sulfato-réductrices à Gram positif tels que les Desulfotomaculum dans les
environnements profonds. Les résultats obtenus lors de ce travail de doctorat suggèrent le rôle
prépondérant de microorganismes affiliés au genre Desulfotomaculum dans la dégradation des
BTEX en aquifères très profonds et représentent une avancée dans la compréhension des
phénomènes d‟atténuation naturelle des BTEX dans ce type d‟environnement.
