Aurélia Chambaz ESSanté Stage d’immuno-hématologie à l’UMT ...essante.ch/uploads/diplomes/TD-AC-CD.pdf · sortes de carte Coombs pour la technique en gel, de comparer la technique

Aurélia Chambaz

47ème volée ESSanté

Stage d’immuno-hématologie à l’UMT, BH-18 CHUV SRTS VD Lausanne 05.11.07-11.04.08

Responsable accompagnante : Mme Jocelyne Conne

Travail de diplôme : Coombs direct vs autocontrôle (EP) Aurélia Chambaz Stage à l’UMT 11.07-04.08

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Résumé Ce travail en immuno-hématologie a pour but d’observer les similitudes et les discordances entre les Coombs directs (CD1) réalisés en tubes et les autocontrôles (EP3) effectués en carte en Coombs indirect (CI2). Ces deux tests sont des techniques de référence à l’UMT4. En effet, il est connu que si un Coombs direct est positif, le Coombs indirect n’est pas interprétable, car il sera forcément lui aussi positif étant donné que les globules rouges sont sensibilisés. Or au mois de septembre 2007, un Coombs direct a été trouvé positif avec un anti-Jka fixé découvert après élution, alors que l’autocontrôle avait été effectué et était négatif. Il n’y avait également pas d’anticorps circulants dans le plasma de la patiente. Il est donc facile de voir l’importance de vérifier la concordance des résultats entre ces deux tests, afin de savoir si les procédures du laboratoire sont efficaces ou si des hématies sensibilisées ne sont fréquemment pas détectées en ne réalisant que l’autocontrôle? Cette analyse a été effectuée sur 200 patients qui avaient un Coombs direct positif selon les analyses effectuées dans l’un ou l’autre des deux laboratoires de l’UMT, ceci sur une durée de 7 semaines. Les résultats obtenus ont montré qu’une divergence entre les résultats du Coombs direct et de l’autocontrôle existait dans près de 25% des cas analysés. L’autocontrôle a donc l’air d’être moins sensible que le Coombs direct, ceci principalement en ce qui concerne la molécule du C3d6 ou lorsque la spécificité est de type IgG5 avec un titre relativement bas. La technique en cartes semble également être moins sensible pour les bébés, mais ceci n’est pas une affirmation étant donné le nombre restreint de bébés analysés au cours de ce travail. En vue de tout cela, on pourrait donc conclure qu’il n’est pas possible de se fier uniquement à l’autocontrôle pour affirmer l’absence d’hématies sensibilisées chez un patient.

Les abréviations ou mots se trouvant en italique avec un numéro en exposant dans le texte sont décrits dans le lexique p. 27.


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Resume This work on immunohaematology aim to observe the similarities and the discordances between the direct Coombs realised in tubes and the auto controls of indirect Coombs effected on cards. These two tests are the technics of reference in the UMT. Actually, it is known that if a direct Coombs is positive, this direct Coombs is not interpretable, because it will be certainly positive also as that the red globules are sensiblized. Therefore, in September 2007, a direct Coombs was found positive with a fixed anti-Jka discovered after elutions, however, the auto control had been done and was negative. There are equally no antibodies which circulate in the plasma of the patient. So it is easy to see the importance to check the concordance the results between the two tests, to know if the procedure of lab is efficient or if the sensible haematins are not frequently detected in only realizing the auto control? This analyse is effected on 200 patients who has a positive direct Coombs according to the analyses effected in one or another of 2 labs of UMT, which had been done during 7 weeks. The result obtained showed that the divergence between the result of direct Coombs and the auto control existed in about 25% of the analysed cases. The auto control seems to be less sensible than the direct Coombs, this presents principally in the molecule of C3d6 or when the specificity is of type IgG5 with a relatively low title. The technic on cards seems equally to be less sensible for the babies, but this isn’t an affirmation for the reason that the restrict number of babies analysed in the current of this work. For all of this, we could conclude that it isn’t possible to confide only in the auto control to affirm the absence of sensibilized haematins of a patient.


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Table des matières 1 Introduction .................................................................................................. 4

1.1 Contexte de ce travail ....................................................................... 4 1.1.1 Présentation du cas : ........................................................................................... 4

1.2 Résumé des analyses effectuées pour ce travail ............................... 5 1.3 Rappel théorique pour la compréhension de ce travail .................... 5

1.3.1 Antigènes :.......................................................................................................... 5 1.3.2 Anticorps : .......................................................................................................... 5 1.3.3 Complément : ..................................................................................................... 6 1.3.4 Test de Coombs :................................................................................................ 6

2 But du travail ................................................................................................ 9 3 Démarche et estimation des coûts pour ce travail..................................... 9 4 Techniques................................................................................................... 10

4.1 Techniques en tubes : ..................................................................... 10 4.1.1 Coombs directs polyspécifique et monospécifique Medion : .......................... 10 4.1.2 Coombs direct polyspécifique DiaMed :.......................................................... 10 4.1.3 Titre d’un Coombs direct IgG : ........................................................................ 10 4.1.4 Elution : ............................................................................................................ 10

4.2 Techniques en cartes :..................................................................... 11 4.2.1 Dépistage et identification d’anticorps : (Cartes LISS/Coombs) ..................... 11 4.2.2 Autocontrôle en Coombs indirect (EP) : (Cartes LISS/Coombs + Cartes

Coombs Anti-IgG)............................................................................................ 11 4.2.3 Coombs direct : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG) .............. 11 4.2.4 Spécificités d’un Coombs direct : (Cartes DC-Screening I) ............................ 11 4.2.5 Titre d’un Coombs direct IgG : (Cartes TDA IgG-Dilution) ........................... 11 4.2.6 Sous-classes d’IgG : (Cartes TDA IgG1/IgG3)................................................. 11

5 Matériel et consommables ......................................................................... 11 5.1 Matériel fixe et appareils ................................................................ 11 5.2 Consommables................................................................................ 12

5.2.1 Matériel : .......................................................................................................... 12 5.2.2 Réactifs et leur composition :........................................................................... 12 5.2.3 Gestion des lots de réactifs :............................................................................. 15

6 Résultats ...................................................................................................... 17 6.1 Explicatif pour les tableaux de résultats se trouvant à l’annexe .... 17 6.2 Tableaux des résultats..................................................................... 18

7 Analyse des résultats .................................................................................. 20 8 Conclusion ................................................................................................... 24

8.1 Difficultés rencontrées.................................................................... 25 8.2 Perspectives .................................................................................... 25

9 Remerciements............................................................................................ 26 10 Bibliographie............................................................................................... 27 11 Lexique ........................................................................................................ 28 12 Annexes........................................................................................................ 29


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1 Introduction

J’effectue mon dernier stage de la formation de technicienne en analyses biomédicales (TAB7) à l’unité de médecine transfusionnelle au CHUV8 à Lausanne. Ce laboratoire appartient au SRTS VD9 et réalise différentes analyses dans le domaine de l’immuno-hématologie, ainsi que la gestion et la distribution des différents produits sanguins labiles. S’agissant de mon dernier stage, je dois réaliser mon travail de diplôme au cours de celui-ci. Le sujet m’a donc été proposé par Mme Jocelyne Conne, avec l’accord du Professeur Jean-Daniel Tissot, et va vous être présenté ci-après.

1.1 Contexte de ce travail L’idée de ce travail de diplôme est survenue suite à la découverte fortuite d’un anti-Jka fixé sur les globules rouges d’un patient (Coombs direct positif IgG avec un anti-Jka fixé après recherche sur l’éluat) alors que la recherche d’anticorps circulants dans son plasma, ainsi que l’autocontrôle réalisé avec ses érythrocytes et son plasma, étaient négatifs. Cette découverte a belle et bien eu lieu par hasard, car dans les procédures du laboratoire de l’UMT, si une recherche d’anticorps circulants est réalisée avec un EP, le CD ne doit pas être effectué. A moins bien sûr que l’EP soit positif, ce qui n’était pas le cas dans cette situation. Je cite, selon la procédure de laboratoire intitulée Choix des tests prétransfusionnels (mai 2007), « En cas de résultat négatif de l’autocontrôle (fait lors de l’identification des anticorps), il n’est pas nécessaire d’effectuer un test direct à l’antiglobuline humaine. » (point 2.1.3, p.2) Les résultats de l’EP et du CD devant en principe concorder, voilà l’importance d’investiguer là-dessus avec ce travail de diplôme. Cela permettra de vérifier si des hématies sensibilisées (et plus particulièrement avec des alloanticorps) ne sont fréquemment pas détectées en suivant les directives de cette procédure ou si ce cas reste exceptionnel.

1.1.1 Présentation du cas : N° de tube : 0473685 N° de malade : 1091978 Patiente de 1941 Découverte du 13.09.2007

Tableau réalisé selon le classeur des résultats d’identification du laboratoire de septembre 2007 RAS Papaïne10 (connu) Eluat : Anti-Jka AGH11 (nouveau) CD : IgG 1/8, EP Nég!!! IgG1

12 nég, IgG312 nég

Phénotype Cc/Ee, K nég, k +, Kpa nég, Kpb + Phénotype Jka et Jkb pas déterminé à l’UMT car il y avait une double population dans le gel Echantillon envoyé à Berne pour phénotypage : Jka nég, Jkb +, Fya nég, Fyb +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 EP Liss/Coombs - - - - - - - - - - - - Plasma en

carte Pap/Coombs (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) / Liss/Coombs - (+) - - (+) (+) - (+) - - (+) / Eluat en

carte Pap/Coombs - +++ - - ++ ++ - + (+) - +++ / N°hématies-test 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 / Plasma en

tube Liss/Coombs - - - - - - - - - - - /


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1.2 Résumé des analyses effectuées pour ce travail Au cours de ce travail, les analyses suivantes vont être réalisées : Pour le travail de diplôme proprement dit, l’autocontrôle (plasma + globules rouges du patient) va être effectué en carte en Coombs indirect pour tous les Coombs directs positifs en tubes, afin de vérifier si les résultats sont identiques ou si des discordances se présentent. Les deux techniques sus-mentionnées font partie des techniques de référence du laboratoire. En parallèle, la direction du centre a profité de l’occasion pour me demander d’effectuer d’autres analyses concernant les Coombs, mais les résultats obtenus suite à ces analyses ne doivent pas être analysés dans ce travail de diplôme. Il s’agit de comparer deux sortes de Coombs polyspécifique pour la méthode en tube, deux sortes de carte Coombs pour la technique en gel, de comparer la technique de Coombs direct en tube et en gel, les spécificités en tube et en gel, et enfin les dilutions de l’IgG en tube et en gel. Les différents réactifs utilisés et comparés seront décrits plus loin dans le travail au point 5.2.2 : Réactifs et leur composition.

1.3 Rappel théorique pour la compréhension de ce travail

1.3.1 Antigènes : Selon Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot (juillet 2005), « [un antigène est une] substance capable de provoquer une réponse immune, puis de réagir spécifiquement avec le produit de cette réponse (anticorps ou lymphocytes). […] [Les antigènes de groupes sanguins sont soit] des protéines seules, soit des protéines associées à des lipides, soit des protéines glycosylées, ou soit des hydrates de carbone ». (p.15) Un antigène possède des déterminants antigéniques ou épitopes à sa surface. Chacun d’entre eux est capable de réagir avec un anticorps unique et spécifique. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.15).

1.3.2 Anticorps : Les anticorps sont des immunoglobulines présentes dans le plasma. Ils sont synthétisés par les lymphocytes B (ou cellules dérivées) et sont le produit d’une réponse immune. « Au cours de cette réponse immunitaire, les anticorps ont trois fonctions principales :

- se lier à l'antigène - activer le système du complément - recruter des cellules immunocompétentes » (Selon la page web intitulée Anticorps).

Schéma d’une immunoglobuline de type IgG :

http://www.ac-corse.fr/svt/ress_ped/antic/str_ac.htm


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La partie constante des chaînes lourdes détermine selon sa nature, 5 isotypes ou classes d’anticorps (γ → IgG, α → IgA13, μ → IgM14, δ → IgD15, ε → IgE16). Il existe également pour chaque classe des sous-classes. La partie constante des chaînes légères détermine quant à elle 2 types d’anticorps (κ ou λ). Chaque classe d’anticorps peut donc être de l’un ou l’autre de ces types. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.18). 1.3.3 Complément : Selon la page web intitulée Système du complément :

Le système du complément est une cascade biochimique complexe du système immunitaire, entraînant une cytolyse17, une chimiotaxie18, une opsonisation19 et une inflammation20. Le système du complément consiste en plus de 35 protéines membranaires ou circulantes dans le plasma. Parmi elles, 12 sont directement impliquées dans les voies métaboliques du complément, alors que le reste a des fonctions régulatrices. [Pour son activation, le complément a besoin de la présence de Ca++ et de Mg++. Les principales protéines du complément sont notées de C1 à C9, elles migrent en électrophorèse dans la fraction des β-globulines et ont un poids moléculaire de 100 à 200 kDa21]. […] Il y a trois voies biochimiques qui activent le système du complément : - la voie classique du complément - la voie alternative du complément - la voie des lectines liant les mannanes […] Les différentes voies activant le complément aboutissent à la formation d'une C3 convertase, point de départ de la voie effectrice commune qui détruit la cible en formant un canal transmembranaire, permettant l'entrée de molécules d'eau, [de protéines, d’ions] dans la cellule.

La voie classique est spécifique car elle est activée par les complexes antigène-anticorps, les deux autres voies sont activées par la reconnaissance innée des organismes étrangers. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.21).

L’activation du complément après fixation des anticorps sur la membrane érythrocytaire dépend :

- de la quantité d’anticorps - de la classe ou sous-classe de l’anticorps (IgM>IgG3>IgG1) - des propriétés des anticorps.

Les anticorps capables d’activer le complément sont appelés hémolysines. Si l’activation atteint C9, il y a une lyse intravasculaire des globules rouges, si elle atteint C3b, les globules rouges sont détruits par les macrophages du foie et finalement, si les hématies sont simplement sensibilisées par des IgG, les globules rouges sont détruits par les macrophages de la rate. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.22-23).

1.3.4 Test de Coombs : Le test de Coombs, que l’on appelle aussi test à l’antiglobuline, porte le nom d’un scientifique anglais, Sir Robin R. Coombs. Le sérum de Coombs, grâce à l’antiglobuline qu’il contient, permet de mettre en évidence la présence d’anticorps anti-érythrocytaire à la surface de globules rouges.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Syst%C3%A8me_immunitaire

http://fr.wikipedia.org/wiki/Syst%C3%A8me_immunitaire

http://fr.wikipedia.org/wiki/Cytolyse

http://fr.wikipedia.org/wiki/Chimiotaxie

http://fr.wikipedia.org/wiki/Inflammation

http://fr.wikipedia.org/wiki/Prot%C3%A9ine

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Voie_biochimique&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Voie_classique_du_compl%C3%A9ment&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Voie_alternative_du_compl%C3%A9ment&action=edit&redlink=1

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Voie_des_lectines_liant_les_mannanes&action=edit&redlink=1


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Ces anticorps sont reconnus spécifiquement selon l’antiglobuline présente dans le sérum de Coombs utilisé (anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA). Il existe également des sérums de Coombs dirigés contre des fractions du complément (anti-C3d, anti-C3b, …). Les sérums de Coombs polyspécifiques sont composés d’un mélange de différentes spécificités ou d’une immunoglobuline qui reconnaît les chaînes légères κ et λ des anticorps. Il faut au minimum 200 molécules d’IgG sur un globule rouge pour que la réaction puisse être positive.

1.3.4.1 Test de Coombs direct ou TDA1 : Ce test révèle par une agglutination la présence d’hématies sensibilisées22 in vivo par des anticorps incomplets23. Les hématies sont donc directement mises en contact avec le sérum de Coombs. Ce test permet par exemple de diagnostiquer une anémie hémolytique auto-immune, de faire le bilan d’une incompatibilité foeto-maternelle ou d’une réaction transfusionnelle. Schéma du principe :

http://fr.wikipedia.org/wiki/Image:Coombs_test_schematic_fr.png

1.3.4.2 Test de Coombs indirect (CI) ou TIA2 : Ce test révèle quant à lui la présence d’un complexe antigène/anticorps, ceci dans différents cas de figure :

- soit lors de la recherche d’anticorps irréguliers24 incomplets circulants dans le plasma d’un patient, grâce à des hématies connues (hématies-test).

- soit lors de la détermination d’un phénotype de groupe sanguin, grâce à des anticorps connus (sérums-test).

- soit lors de la réalisation du test de compatibilité où le plasma du receveur est mis en contact avec les globules rouges du donneur.

On l’appelle indirect, car dans un premier temps, il faut fixer l’anticorps recherché sur les hématies connues ou vice et versa (fixer un anticorps connu sur les hématies dont on veut déterminer un phénotype de groupe sanguin). Ou encore fixer un anticorps inconnu sur des hématies inconnues (test de compatibilité). Cette première étape se nomme sensibilisation et s’effectue à 37°C.



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Puis ensuite, dans un deuxième temps, le sérum de Coombs peut être ajouté afin d’obtenir ou non une agglutination. Il ne faut encore pas oublier de préciser qu’un test de Coombs indirect ne peut être interprété que si le test de Coombs direct du patient est négatif, ceci dans le cas où l’on utilise ses globules rouges pour le test de Coombs indirect. En effet, si le CD est positif, les globules rouges sont déjà sensibilisés et le CI sera forcément positif. Schéma du principe : (la légende est la même que pour le schéma du principe du CD) anticorps connu (sérum-test)

http://fr.wikipedia.org/wiki/Image:Coombs_test_schematic_fr.png On peut remarquer sur les 2 schémas, qu’une étape de lavage (3x) des hématies sensibilisées est nécessaire, aussi bien pour le CD que pour le CI. Ces lavages permettent de se débarrasser du plasma entourant les globules rouges, et donc ainsi aussi des différentes protéines libres présentent dans ce dernier et qui pourraient neutraliser le réactif de Coombs (anticorps non-fixés). Ceci élimine une bonne partie de faux négatifs. Ces lavages ne sont toutefois pas toujours nécessaires pour les techniques en cartes grâce à la filtration des globules rouges à travers le gel. A l’UMT, les tests de Coombs directs et indirects trouvés négatifs doivent systématiquement être vérifiés au microscope, puis du Coombs contrôle doit y être ajouter (cf. point 5.2.2.4). Les tests de Coombs directs positifs de spécificité IgG doivent être élués, et selon les cas, l’élution peut également être faite s’il s’agit d’autres spécificités. L’élution consiste à détruire les globules rouges afin de détacher les anticorps qui y sont fixés, ceci afin de pouvoir les identifier à l’aide d’un panel d’hématies-test. (Selon Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.29-30 et pages web intitulées Test de Coombs et Antiglobuline).


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2 But du travail

Le but de ce travail de diplôme et d’observer les similitudes et les différences entre les Coombs directs et les autocontrôles en Coombs indirect. En effet, malgré les différences de techniques et de réactifs, chaque patient avec un Coombs direct positif, devrait avoir son autocontrôle en Coombs indirect également positif étant donné que ses globules rouges sont sensibilisés. Or, suite à la découverte d’une discordance, il est facile de voir l’importance de vérifier cela au cours de ce travail de diplôme. Peut-on se fier ou non à l’autocontrôle pour affirmer l’absence d’hématies sensibilisées chez un patient ?

3 Démarche et estimation des coûts pour ce travail

Pour réaliser ce travail, l’objectif était de prendre en compte tous les Coombs directs trouvés positifs au cours des analyses journalières, ceci aussi bien au laboratoire des urgences d’immuno-hématologie (604) qu’au laboratoire de routine (511) et de les analyser selon la démarche suivante. 1) Pour chaque CD positif en tubes avec le réactif polyspécifique DiaMed, le refaire avec

celui de Medion et vice et versa. 2) Pour chaque CD positif en tubes, un CD ainsi qu’un autocontrôle en Coombs indirect

(EP) seront effectués en gels. (cartes-ID LISS/Coombs)

3) Les mêmes tests seront effectués mais sur une autre sorte de cartes.

(cartes-ID Coombs Anti-IgG) 4) Pour chaque CD positif en tubes, les spécificités seront également effectuées en gels.

(cartes-ID DC-Screening I) 5) Pour chaque CD positif de spécificité IgG en tubes, la dilution sera aussi faite en gels. (cartes-ID TDA IgG-Dilution)

65% des CD positifs sont de spécificité IgG, d’après le rapport annuel.

6) 1 élution avec dépistage en LISS/Coombs et en Coombs Anti-IgG a été comptabilisée par jour, ce qui revient à environ 60 élutions sur la durée fixée pour les analyses. (cartes-ID LISS/Coombs) et (cartes-ID Coombs Anti-IgG)

7) Pour les dépistages positifs d’éluats, une identification sera faite, les sous-classes IgG1

et IgG3 seront également effectuées. (cartes-ID TDA IgG1/IgG3) Les cartes du labo seront utilisées car ces cas sont rares. Pour réaliser ceci, le projet était d’analyser 7 Coombs directs trouvés positifs / 24h, sur une durée de 2 mois, d’où un total de 400 CD positifs traités sur la durée définie. Ci-dessous, un tableau des coûts pour la commande des cartes est présenté. En effet, la direction du centre m’a demandé de m’intéresser uniquement aux cartes pour l’estimation des coûts liés à ce travail. (Il s’agit de la part la plus importante, qui nécessite un budget « extraordinaire », malgré une généreuse participation de la firme DiaMed).


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Prix :

4 Techniques

Voici en quelques mots, les différentes techniques nécessaires pour la réalisation de ce travail de diplôme. (Ces techniques sont décrites plus en détail dans les procédures du laboratoire qui se trouvent en annexes A, pages 28 à 35)

4.1 Techniques en tubes :

4.1.1 Coombs directs polyspécifique et monospécifique Medion : 2 gouttes de sérum de Coombs + 1 goutte d’hématies à tester lavées 3x et mise en suspension 3-5% dans de l’Immusol (couleur framboise). Centrifuger 15 secondes à 2500 tours par minute, puis lire l’agglutination sur une lampe. Vérifier au microscope tout Coombs qui semble être négatif. Si la négativité est confirmée, ajouter 1 goutte de Coombs control (seulement pour les sérums polyspécifiques et le monospécifique anti-IgG), centrifuger de la même manière et lire l’agglutination qui doit être positive. Dans le cas contraire, recommencer la procédure, sinon protocoler les résultats.

4.1.2 Coombs direct polyspécifique DiaMed : Il s’agit de la même procédure que la précédente, sauf qu’il faut mettre 1 goutte de sérum de Coombs.

4.1.3 Titre d’un Coombs direct IgG : Préparer les dilutions géométriques du sérum de Coombs monospécifique anti-IgG dans de l’Immusol. Ensuite la procédure est la même qu’au point 4.1.1, pour chaque dilution jusqu’à que le Coombs devienne négatif (maximum jusqu’à 1/2048). La dernière dilution où une agglutination est observée donne le titre du Coombs.

4.1.4 Elution : Laver 3x les hématies à analyser (1ml), ensuite ajouter 1ml d’Immusol, puis 2ml de chloroforme. Incuber 5 minutes à 56°C en remuant constamment avec une touille en bois. Centrifuger 5 min à vitesse rapide (3500 tours par minute) et récupérer le surnageant (éluat) dans un nouveau tube. Effectuer ensuite le dépistage ou/et l’identification d’anticorps sur l’éluat.

Etape Nombre de cartes Prix

unitaire (CHF)

Prix total

(CHF) 2 140 cartes-ID LISS/Coombs 4.55 637.00 3 140 cartes-ID Coombs Anti-IgG 4.55 637.00 4 400 cartes-ID DC-Screening I 8.05 3220.00 5 260 cartes-ID TDA IgG-Dilution 5.00 1300.00 6 60 cartes-ID LISS/Coombs + 60 cartes-ID Coombs Anti-IgG 4.55 546.00

Total 1060 cartes - 6340.00


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4.2 Techniques en cartes :

4.2.1 Dépistage et identification d’anticorps : (Cartes LISS/Coombs) 50 μl de chaque hématie-test dans le puits correspondant + 25 μl de plasma (ou éluat) à analyser dans chaque puits. Incuber les cartes 15 minutes à 37°C, puis les centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler. Pour l’identification faire un puits supplémentaire avec un autocontrôle (cf. point 4.2.2).

4.2.2 Autocontrôle en Coombs indirect (EP) : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG)

10 μl d’hématies à analyser dans 1 ml de LISS (diluent 2 de DiaMed). Déposer ensuite 50 μl de cette suspension dans un puits et ajouter 25 μl du plasma du même patient. Incuber 15 minutes à 37°C, puis centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler.

4.2.3 Coombs direct : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG) 10 μl d’hématies à analyser dans 1 ml de LISS (diluent 2 de DiaMed). Déposer ensuite 50 μl de cette suspension dans un puits et centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler.

4.2.4 Spécificités d’un Coombs direct : (Cartes DC-Screening I) Il s’agit de la même procédure qu’au point 4.2.3, sauf qu’il faut utiliser les 6 puits de la carte.

4.2.5 Titre d’un Coombs direct IgG : (Cartes TDA IgG-Dilution) Il s’agit de la même procédure qu’au point 4.2.4, sauf qu’il faut laver 3x les hématies à analyser avant de les utiliser.

4.2.6 Sous-classes d’IgG : (Cartes TDA IgG1/IgG3) Laver 3x les hématies à tester, ensuite mélanger 10 μl de ces hématies dans 1 ml de LISS (diluent 2 de DiaMed). Déposer 50 μl de cette suspension dans chaque puits de la carte et centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler.

5 Matériel et consommables

5.1 Matériel fixe et appareils -Pipettes automatiques -Pipette dispenser -Portoirs pour tubes et cartes -Chronomètre -Centrifugeuses (tubes en verre, tubes patients et cartes) -Incubateur à 37°C -Bains-marie 56°C -Laveuse de globules rouges -Microscope -Lampe de lecture


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5.2 Consommables

5.2.1 Matériel : -Tubes en verre standards et à élutions -Petits tubes en plastique (mélanges avec la solution de LISS) -Pipettes en plastique -Touilles pour élutions -Embouts pour pipettes et dispenser

5.2.2 Réactifs et leur composition :

5.2.2.1 Sérum de Coombs polyspécifique DiaMed pour méthode en tube : Ce sérum contient une antiglobuline de lapin de type IgG. Cette IgG n’est pas dirigée spécifiquement contre les chaînes lourdes des IgG humaines, mais réagit également avec les chaînes légères des anticorps, d’où une possible activité supplémentaire anti-IgM et anti-IgA. Il ne contient pas d’anti-complément, ce dernier n’est en effet pas indispensable, car les anticorps qui ne peuvent être détectés que par leur aptitude à se lier au complément sont rares. De plus, cela permet d’éviter l’interférence liée au composant complément fixé non-spécifiquement aux hématies.

5.2.2.2 Sérum de Coombs polyspécifique Medion pour méthode en tube :

Ce sérum contient des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre les IgG humaines, ainsi que des anticorps monoclonaux murins avec une activité anti-C3b et anti-C3d. Ces anticorps se trouvent dans une solution de chlorure de sodium tamponnée contenant de l’albumine bovine et 0,1% d’azide de sodium (NaN3) comme conservateur.

5.2.2.3 Sérums de Coombs monospécifiques (anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, anti-C3d) Medion pour méthode en tube :

Ils contiennent des anticorps polyclonaux de lapin dirigés spécifiquement et respectivement contre les IgG, les IgM, les IgA humaines, ainsi que contre la molécule C3d du complément.

5.2.2.4 Coombs contrôle Medion pour méthode en tube : Ce réactif contient des hématies de groupe sanguin O Rhésus pos sensibilisées avec un anti-D incomplet (IgG) humain en solution isotonique tamponnée et contenant des agents conservateurs (suspension d’hématies à 5±1%). Il sert à vérifier le bon fonctionnement des sérums de Coombs qui ont une activité anti-IgG et l’efficacité des lavages, ceci lorsque l’on a un résultat négatif. En effet, il se produit une agglutination lorsque l’on ajoute le contrôle si l’activité du sérum de Coombs est intacte et si les lavages ont été réalisés correctement. Ceci permet d’éviter des faux-négatifs.


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5.2.2.5 Immusol Compact de Medion pour méthode en tube : Concentré (20x) pour la préparation de 10 litres de solution saline isotonique tamponnée à pH 7,3±0,2. A diluer dans de l’eau déminéralisée. Il contient également 0,4% d’azide de sodium. Cette solution sert à la mise en suspension des hématies, à la réalisation des lavages, ainsi qu’à la dilution des plasmas et sérums.

5.2.2.6 Chloroforme de Merck KGaA pour les élutions : Il s’agit de CHCl3 p.a. (pour analyse), avec une pureté de 99,0-99,4% et une masse molaire de 119,38g/mol.

5.2.2.7 Cartes-ID LISS/Coombs de DiaMed pour méthode en gel : Les 6 puits de cette carte contiennent un gel avec des billes de dextran, ainsi que du sérum de Coombs polyspécifique avec des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre les IgG humaines, ainsi que des anticorps monoclonaux de la lignée cellulaire C 139-9 avec une activité anti-C3d.

5.2.2.8 Cartes-ID Coombs Anti-IgG de DiaMed pour méthode en gel : Les 6 puits de cette carte contiennent quant à eux du sérum de Coombs avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre les chaînes lourdes des IgG humaines, mais ces anticorps réagissent également avec les chaînes légères des anticorps, d’où une activité supplémentaire anti-IgM et anti-IgA.

5.2.2.9 Cartes-ID DC-Screening I de DiaMed pour méthode en gel : 1 puits de la cartes contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-IgG humaines ; le puits suivant contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-IgM humaines ; le suivant contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-IgA humaines ; le puits suivant contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-C3c ; ensuite il y a un puits avec du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps monoclonaux de la lignée cellulaire C 139-9 anti-C3d. Le dernier puits est un contrôle négatif.

5.2.2.10 Cartes-ID TDA IgG-Dilution de DiaMed pour méthode en gel : 5 des 6 puits de cette carte contiennent du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés spécifiquement contre les IgG humaines à des dilutions respectives de 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 et 1:1000. Le dernier puits est un contrôle négatif.


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5.2.2.11 Cartes-ID TDA IgG1/IgG3 de DiaMed pour méthode en gel : Les 2 premiers puits de la carte contiennent un anti-IgG1 monoclonal de la lignée cellulaire M345/795 en 2 dilutions différentes (1:1 et 1:100) ; les 2 puits suivant contiennent un anti-IgG3 monoclonal de la lignée cellulaire M346/805 en 2 dilutions différentes (1:1 et 1:100) ; le 5ème puits contient un anti-IgG polyclonal de lapin à une dilution de 1:10. Le dernier puits est un contrôle négatif.

5.2.2.12 Hématies-tests DiaMed (RAI + ID) pour méthode en gel : ID-DiaScreen est composé d’hématies-tests provenant de donneurs individuels de groupe sanguin O et phénotypées pour les antigènes les plus importants en immuno-hématologie.

Il s’agit de 6 suspensions tamponnées d’hématies à 0,8±0,1% en flacon de 10 millilitres pour le dépistage d’anticorps irréguliers. Les hématies-tests V et VI sont papaïnées. Les conservateurs sont les antibiotiques triméthoprime et sulfaméthoxazole.

ID-DiaPanel et ID-DiaPanel P (papaïné) se composent d’hématies-tests provenant de donneurs individuels de groupe sanguin O et phénotypées pour les antigènes les plus importants en immuno-hématologie.

Il s’agit de 11 suspensions tamponnées d’hématies à 0,8±0,1% en flacon de 4 millilitres pour l’identification d’anticorps irréguliers. Les conservateurs sont les antibiotiques triméthoprime et sulfaméthoxazole.

5.2.2.13 Solution de LISS modifié de DiaMed (ID-Diluent 2) pour méthode en gel :

Il s’agit d’une solution tamponnée de NaCl à pH 6,7, de faible force ionique qui augmente le taux d’association des anticorps sur les antigènes et permet donc de réduire le temps d’incubation. Cette solution a été modifiée par adjonction d’albumine bovine 5%, de glycine et de gélatine. Il sert pour la préparation des suspensions d’hématies. Il contient les antibiotiques triméthoprime et sulfaméthoxazole comme conservateurs.

5.2.2.14 Echantillons de sang : Les échantillons de sang qui ont été utilisés tout au long de ce travail proviennent de patients dont les analyses de laboratoire révélaient un test de Coombs direct positif. Il s’agit de prélèvements effectués sur anticoagulant EDTA. Les analyses nécessaires à ce travail ont été réalisées sur des tubes qui avaient entre 0 et 4 jours (mais décantés et mis au frigo le jour du prélèvement).


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(Les différents explicatifs des réactifs proviennent de leur mode d’emploi, les photos des réactifs DiaMed sont tirées du site de la firme et les photos des autres réactifs ont été faites au laboratoire).

5.2.3 Gestion des lots de réactifs : Les réactifs employés pour la réalisation de ce travail de diplôme avaient le numéro de lot suivant : (se référer aux tableaux des résultats pour les numéros de cas) Sérum de Coombs polyspécifique DiaMed :

Lot : 14710.70.10 Expiration : 11.2008

Labo 511 : A partir du cas n°61 Lot : 14710.71.20 Expiration : 07.2009 Labo 604 : A partir du cas n°90 Lot : 14710.71.20 Expiration : 07.2009 Sérum de Coombs polyspécifique Medion :

Lot : 342.011.3A Expiration : 31.01.2008

Labo 511 : A partir du cas n° 163 Lot : 342.011.5A Expiration : 31.05.2008 Sérums de Coombs monospécifiques Medion : Anti-IgG : Labo 511 : Lot : 334.042.5A Expiration : 31.08.2009 Labo 604 : Lot : 334.042.3A Expiration : 30.04.2009 A partir du cas n°91 Lot : 334.042.5A Expiration : 31.08.2009 Anti-IgM : Lot : 335.030.1A Expiration : 30.09.2009 Anti-IgA : Lot : 336.017.2A Expiration : 30.06.2009 Anti-C3d : Lot : 338.037.1A Expiration : 30.04.2009 Labo 511 : A partir du cas n°74 Lot : 338.037.2A Expiration : 31.08.2009 Labo 604 : A partir du cas n°97 Lot : 338.037.2A Expiration : 31.08.2009 Coombs contrôle Medion : Labo 511 : Lot : 355.414 Expiration : 19.01.2008 A partir du cas n°15 Lot : 355.415 Expiration : 16.02.2008 A partir du cas n°105 Lot : 355.416 Expiration : 15.03.2008 Labo 604 : Lot : 355.415 Expiration : 16.02.2008 A partir du cas n°106 Lot : 355.416 Expiration : 15.03.2008 Immusol Compact Medion :

Lot : 381.036 Expiration : 19.09.2009 Chloroforme (Article 1.02445.1000) Merck:

Lot : K 34809245 528 Expiration : 30.06.2008 A partir du cas n°98 Lot : K 36438145 643 Expiration : 31.08.2009


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Cartes-ID LISS/Coombs DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : 50531.43.10 Expiration : 04.2009 Cartes du labo : Lot : 50531.44.21 Expiration : 05.2009 Labo 511 : A partir du cas n°102 Lot : 50531.44.27 Expiration : 05.2009 Labo 604 : A partir du cas n°106 Lot : 50531.44.27 Expiration : 05.2009 Cartes-ID Coombs Anti-IgG DiaMed :

Cartes pour mon travail : Lot : 50540.54.01 Expiration : 03.2009 Cartes-ID DC-Screening I DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : 50830.44.01 Expiration : 04.2009 A partir du cas n°115 Lot : 50830.45.01 Expiration : 06.2009 Cartes-ID TDA IgG-Dilution DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : 50870.14.01 Expiration : 09.2008 Cartes-ID TDA IgG1/IgG3 DiaMed : Cartes du labo : Lot : 50890.12.01 Expiration : 09.2008 Labo 511 : A partir du cas n°200 Lot : 50890.12.02 Expiration : 12.2008 Hématies-tests DiaMed ID-DiaScreen :

Lot : 45070.30.2 Expiration : 11.02.2008 A partir du cas n°97 Lot : 45070.31.2 Expiration : 17.03.2008 Hématies-tests DiaMed ID-DiaPanel :

Lot : 45161.60.1 Expiration : 11.02.2008 A partir du cas n°97 Lot : 45161.62.1 Expiration : 17.03.2008 Hématies-tests DiaMed ID-DiaPanel P :

Lot : 45171.60.1 Expiration : 11.02.2008 A partir du cas n°97 Lot : 45171.62.1 Expiration : 17.03.2008 Solution de LISS modifié DiaMed (ID-Diluent 2) :

Lot : 05761.66.10 Expiration : 07.2009 Labo 604 : A partir du cas n°53 Lot : 05761.68.10 Expiration : 07.2009 Labo 511 : A partir du cas n°102 Lot : 05761.68.10 Expiration : 07.2009


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6 Résultats

6.1 Explicatif pour les tableaux de résultats se trouvant à l’annexe B La date qui figure en premier correspond au jour où j’ai effectué les analyses, le jour entre parenthèses est celui du prélèvement. Dans la colonne année de naissance, F = Femme et H = Homme. Lorsqu’un numéro entre parenthèses suit le F ou le H, cela veut dire que le patient à déjà été analysé ultérieurement, ceci au numéro correspondant. Pour les colonnes des techniques en tubes, Tout ce qui est écrit uniquement en noir correspond aux analyses que j’ai effectué moi-même car elles n’avaient pas eu besoin d’être faites par les techniciennes du laboratoire. Lorsque un résultat est écrit en noir, mais suivi d’un résultat entre parenthèses en rouge, cela veut dire que j’ai refait l’analyse car elle n’avait pas été réalisée le jour même, mais 1-2 ou 3 jours plutôt. Le résultat en rouge correspond donc à celui obtenu par les TAB le(s) jour(s) précédents. Lorsque le résultat est uniquement écrit en rouge, cela veut dire que les analyses ont été effectuées le jour même, je n’ai donc pas eu besoin de les refaire, le résultat est celui trouvé par l’une des TAB du laboratoire. Dans les colonnes titre IgG et suivantes, NF = Non Fait. Dans la colonne ID plasma, RAI Nég = dépistage d’anticorps négatif ID Nég = identification d’anticorps négatif RAS = Réaction Aspécifique ACA = Anticorps Chauds Aspécifiques AFA = Anticorps Froids Aspécifiques Pap = milieu enzymatique (Papaïne) AGH = milieu à l’antiglobuline humaine (Coombs) α = Anti p.d. = plus décelable look = à l’image de → = jusqu’à Dans la colonne ID éluat, Les résultats entre parenthèses n’ont pas été faits mais, il s’agit de résultats connus suite à une élution ultérieure. Les résultats en rouge sont ceux où j’ai effectué en plus une élution suite aux résultats que j’ai obtenus avec les méthodes testées. (Apparition d’une IgG avec les méthodes en cartes).


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6.2 Tableaux des résultats Ci-dessous les résultats nécessaires à l’analyse de ce travail et qui permettront d’atteindre le but recherché. Au total, 200 cas ont été analysés Les résultats complets se trouvent dans l’annexe B pages 36 à 45.

Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution 41 + + NF 61 + + Nég 42 + + NF 62 + + NF 43 + + NF 63 + - Nég 44 + + NF 64 + + Nég 45 - - Nég 65 + - NF 46 + + NF 66 - - NF 47 + + NF 67 - - Nég 48 + + NF 68 + - NF 49 + + NF 69 + - NF 50 + + Nég 70 + + Nég 51 + - NF 71 + + Nég 52 + + NF 72 + + Nég 53 + - Nég 73 + BB + 54 + + Nég 74 + + NF 55 + + NF 75 + + NF 56 + + + 76 + + NF 57 - + Nég 77 + - Nég 58 + - NF 78 + + Nég 59 - + NF 79 - - Nég 60 - - NF 80 + + Nég

Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution 1 + + NF 21 - - NF 2 + + NF 22 - - NF 3 - - NF 23 - - Nég 4 + - NF 24 - - Nég 5 - - NF 25 + + + 6 + - NF 26 + BB + 7 + - Nég 27 + + NF 8 + + NF 28 + + Nég 9 + + Nég 29 - + Nég 10 - - NF 30 - - NF 11 + + Nég 31 + - NF 12 + + NF 32 + - NF 13 - - NF 33 + - NF 14 + - Nég 34 + + Nég 15 + + NF 35 + BB + 16 + + NF 36 + + NF 17 + - Nég 37 + BB Nég 18 + + + 38 + + Nég 19 + + NF 39 - + Nég 20 + - NF 40 + - NF


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Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution 81 - - Nég 101 + + NF 82 + - Nég 102 + - NF 83 + + NF 103 + + NF 84 + + NF 104 + + Nég 85 + + + 105 + + NF 86 - - Nég 106 + + NF 87 - - Nég 107 + - NF 88 + - Nég 108 + + NF 89 + + NF 109 + - Nég 90 + + Nég 110 + + NF 91 + + + 111 + + NF 92 + + NF 112 + + + 93 + + NF 113 + - NF 94 + + NF 114 + + NF 95 + - Nég 115 + + Nég 96 + + Nég 116 + - Nég 97 + + Nég 117 + + NF 98 + + Nég 118 + + + 99 + - NF 119 + + NF

100 + + Nég 120 + + +

Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution 121 + + NF 141 + + NF 122 + + NF 142 + - NF 123 + + NF 143 - + Nég 124 - - NF 144 + + NF 125 + - Nég 145 + + NF 126 + - Nég 146 + + Nég 127 + BB + 147 + - Nég 128 + + Nég 148 + + NF 129 + + NF 149 + - NF 130 + + NF 150 + - NF 131 + BB + 151 + + Nég 132 + + NF 152 + + NF 133 + + NF 153 + + NF 134 + + Nég 154 + + NF 135 + BB + 155 + + NF 136 + + NF 156 + + Nég 137 + + NF 157 + + Nég 138 + + Nég 158 + + Nég 139 + BB Nég 159 + + Nég 140 + + NF 160 + + Nég


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Concordances et discordances entre le CD et l'EP

71%

24%5%

123

Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution 161 - - Nég 181 + + NF 162 + + Nég 182 + + NF 163 + + NF 183 + + NF 164 + + + 184 + - Nég 165 + + NF 185 + + + 166 + + Nég 186 + - NF 167 + + Nég 187 + BB NF 168 + + NF 188 + + + 169 + + Nég 189 + + + 170 + + NF 190 + - Nég 171 + + NF 191 + - NF 172 + - Nég 192 + - NF 173 + + Nég 193 + + NF 174 - - NF 194 + + NF 175 + + NF 195 + + + 176 + - NF 196 + + Nég 177 + + Nég 197 + - NF 178 - + Nég 198 - - Nég 179 + + NF 199 + + NF 180 + - Nég 200 + BB +

Les résultats des cas inscrits en vert dans les tableaux sont identiques pour le Coombs direct polyspécifique et l’autocontrôle, tandis que les résultats des cas notés en rouge présentent une discordance. Les cas qui figurent en bleu dans les tableaux sont des bébés, pour lesquels l’autocontrôle n’est pas fait. Sous élution, NF veut dire non fait. En effet, pour ces cas l’élution n’a pas dû être faite, ceci selon la procédure du laboratoire. (cf. annexe A, page 29) Les élutions notées en rouge sont celles qui n’auraient pas dû être effectuées par rapport aux résultats obtenus avec la méthode de référence (Coombs direct en tube), mais qui devaient l’être par rapport aux résultats obtenus avec les méthodes testées (Coombs direct et autocontrôle en carte). Dans ces cas là, elles ont donc été faites.

7 Analyse des résultats

1 Les concordances 2 Les discordances 3 EP non fait car bébés Grâce à ce graphique, on peut remarquer que dans environ 70% des cas, les résultats sont identiques pour le Coombs direct et pour l’autocontrôle. Par contre, il y a près du quart des cas qui ont des résultats contraires entre ces deux analyses, ce qui représente quand même un nombre important de divergence.


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Relations entre CD et EP

60%11%

21%

3% 5%12345

En élargissant un peu plus l’analyse, on obtient la répartition suivante des résultats :

CD+, EP+ CD-, EP-

CD+, EP- CD-, EP+

Bébés

Dans les 71% de résultats concordants, il y a 60% des résultats qui étaient positifs pour les deux analyses et 11% qui étaient négatifs. Ces Coombs directs négatifs peuvent sembler étranges étant donné que seuls les CD positifs ont été analysés ! Cela est bien le cas, mais certaines analyses ont été effectuées 1, voire 2 ou 3 jours plus tard (CD positifs découverts les soirs, les nuits, ou les week-ends) ; les résultats du CD se sont donc à priori négativisés durant ce laps de temps. Cette constatation permet de faire ressortir le fait que la durée après le prélèvement est importante pour certaines analyses et certainement également la température de stockage (ces tubes ont été stockés à 4°C durant cet intervalle de temps). En ce qui concerne les 24% de cas où les résultats étaient discordants entre le Coombs direct et l’autocontrôle, il y a 21% des résultats qui étaient positifs pour le CD et négatif pour l’autocontrôle ; et pour 3% des résultats il s’agissait de l’inverse. Maintenant si l’on rajoute à l’analyse du second graphique, un comparatif des spécificités des Coombs trouvées en tubes et en cartes, on obtient les tableaux suivants : (Les résultats de ces spécificités se trouvent dans les tableaux complets de résultats en annexe B). Pour cette analyse, les pourcentages ne vont plus être employés, ils seront convertis en nombre de cas que cela représente. Comme déjà dit précédemment, le nombre total de cas analysés est de 200. Pour les 60% de cas avec CD+, EP+ (125 cas), le tableau est le suivant :

Nombre de cas Remarques 74 Résultats identiques pour les spécificités en tubes et en cartes 37 C3d en moins avec la méthode en cartes 3 IgM en moins avec la méthode en cartes 1 IgA en moins avec la méthode en cartes 1 IgM en plus avec la méthode en cartes 3 IgA en plus avec la méthode en cartes 1 IgG + C3d en tubes, C3d en cartes 2 C3d en tubes, C3d + IgG en cartes 3 C3d en tubes, IgG en cartes


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On peut voir qu’il y a un nombre de cas relativement important où le C3d trouvé en tubes n’apparaît pas en cartes. Il n’y a pas assez de cas avec IgM et IgA pour arriver à une conclusion significative. Pour les deux derniers types de cas où une IgG est apparue en plus avec la technique en cartes, une élution à été faite, mais elle s’est révélée être à chaque fois négative. Pour le cas où une IgG et du C3d ont été trouvés en tubes et que du C3d en cartes, l’élution était positive avec la présence d’ACA ! Pour les 11% de cas avec CD-, EP- (21 cas), le tableau est le suivant :

On peut constater que l’IgA est sortie avec les spécificités en tubes et en cartes alors qu’elle ne sortait pas en Coombs polyspécifique, ceci aussi bien en tubes qu’en cartes. Pour les 21 cas, l’élution n’a soit pas eu besoin d’être faite, soit elle était négative. Pour les 21% de cas avec CD+, EP- (48 cas), le tableau est le suivant :

De nouveau, on peut voir qu’il y a une grande partie des cas où il s’agit de C3d trouvé en tubes qui ne sort pas en cartes. Dans les 7 cas où une IgG a été trouvée en tubes et rien en cartes, il y a 4 bébés, dont 2 avaient quand même une élution positive. Ces 2 cas n’auraient donc pas été dépistés si seule la méthode en cartes était employée. Pour les 2 autres bébés, l’élution était négative. Malheureusement le nombre de cas de bébé est insuffisant pour être significatif. Les 3 cas restants concernent des adultes, dont 2 élutions se sont avérées être négatives et la dernière non faite. Pour tous les autres cas, l’élution n’a soit pas eu besoin d’être faite, soit elle était négative. Enfin pour les 3% de cas avec CD-, EP+ (6 cas), le tableau est le suivant :

De même que précédemment, pour ces 6 cas le Coombs direct a été trouvé négatif cependant il était positif 1 ou 2 jours plutôt étant donné que seuls les cas de Coombs positifs en tube ont été pris en considération et refaits. Ils se sont donc négativisés durant ce laps de temps. Pour tous les cas, l’élution n’a soit pas eu besoin d’être faite, soit elle était négative.

Nombre de cas Remarques 12 Tout négatif 1 Tout négatif sauf spécificité IgA en tubes et en gels 5 CD-, EP-, mais CD et spécificités en cartes positifs 2 CD-, EP-, mais spécificités en cartes positives 1 CD-, EP-, mais CD en cartes positif

Nombre de cas Remarques 21 CD+ C3d en tubes, rien en cartes 7 CD+ IgG en tubes, rien en cartes 6 CD+ C3d en tubes, EP-, mais CD et spécificités positifs en cartes 14 CD+ IgG en tubes, EP-, mais CD et spécificités positifs en cartes

Nombre de cas Remarques 6 CD-, EP+, CD et spécificités en cartes positifs


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10 6

184

0

50

100

150

200

Nombre de patients

Répartition selon l'âge

Bébés (< 6 mois)Enfants (6 mois à 18 ans)Adultes (> 18 ans)

D’une manière générale, tous les cas pour lesquels l’élution s’est avérée positive ont été décelé avec la méthode en tubes et la méthode en cartes. Exception faite de quelques cas de bébés, ainsi que d’un cas d’ACA fixés. Pour terminer, voici un graphique qui montre le nombre de cas en fonction de l’âge des patients : Sur les 10 cas de bébés, 5 cas étaient positifs IgG en tubes et en cartes, avec une élution positive. 2 cas étaient positifs IgG en tubes, négatifs en cartes, et l’élution était positive. 2 cas étaient positifs IgG en tubes, négatifs en cartes, et l’élution était négative. 1 cas était positif C3d en tubes, négatif en cartes, et l’élution était négative. Il est difficile de tirer des conclusions par rapport à ces résultats car le nombre de résultats de bébés recueillis durant ce travail est insuffisant. Pour ce qui est des enfants, 4 cas étaient âgés de 2 à 6 ans, avec un Coombs direct positif C3d en tubes, rien en cartes et rien à l’élution. Les 2 derniers cas concernent la même patiente, une jeune fille de 17 ans, dont les tests en tubes et en cartes concordaient et l’élution montrait des ACA. De même que pour les bébés, le nombre de cas d’enfants est trop bas pour être significatif.


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8 Conclusion

Au terme de ce travail, les similitudes et les différences entre le Coombs direct en tubes et l’autocontrôle en Coombs indirect en cartes ont pu être observées et certaines conclusions ont pu être tirées. Tout d’abord, on se rend bien compte qu’il y a quand même un bon nombre de cas (~25%) où les résultats de ces 2 tests sont discordants, ce qui est interpellant. Parmi ces discordances, une grande partie concerne les cas où le Coombs direct en tube était de spécificité C3d et l’autocontrôle négatif. Les cartes semblent donc être moins sensibles à la molécule du C3d, en effet seuls les cas où le Coombs C3d était relativement fort en tubes, sortaient en cartes. Par contre, les cartes semblent être un peu plus sensibles pour l’IgG. En effet, pour certains cas, l’IgG sortait en cartes (CD et spécificités) et pas en tubes. Mais cependant, dans aucun de ces cas l’élution s’est avérée être positive. Par contre, l’EP en lui même semble un peu moins sensible que le CD en tubes. Il avait tendance à être négatif en général lorsque le CD en tubes était de spécificité IgG à faible titre. Pour les spécificités IgM et IgA, il n’y a pas assez de cas pour pouvoir tirer des conclusions. Pour les bébés, la technique en cartes aurait laissé passer 4 CD positifs dont 2 qui avaient une élution positive sur un total de 10 bébés analysés. En dehors de ces 2 bébés, toutes les élutions qui ont été trouvées positives avaient un CD en tubes et un autocontrôle en cartes positifs et de spécificité IgG, à l’exception d’un cas. Ce dernier était positif IgG au CD en tubes, C3d en carte et présentait des ACA à l’élution. On peut donc conclure qu’on ne peut pas se fier à l’autocontrôle pour affirmer l’absence d’hématies sensibilisées chez un patient, cependant aucune élution de ces hématies sensibilisées n’a révélé la présence d’un alloanticorps fixé. Le cas qui a incité ce travail n’a donc pas été retrouvé au cours de ces recherches, mais il pourrait l’être sur une durée plus longue, vu le nombre de discordances rencontrées entre le CD et l’autocontrôle. Quelques mots encore par rapport à la divergence entre le nombre de cas à analyser cité dans le projet (400 cas) et le nombre réel obtenu (200 cas)! Cette diminution est liée à plusieurs facteurs. Tout d’abord le travail a débuté 2 semaines plus tard que fixé, les négociations avec la firme DiaMed ont duré plus longtemps que prévu. Les cartes sont donc arrivées avec un léger retard. Ensuite contrairement à ce qui était prévu, les cas de Coombs direct positif n’ont pas tous été repris pour ce travail. En effet, pour certains patients, en particulier pour ceux provenant du service de Beaumont (traitant les leucémiques), les analyses sont effectuées tous les 3 jours. Ces cas n’ont donc pas été repris à chaque fois. Enfin, le titre d’IgG en carte n’a pas été réalisé pour tous les CD positifs IgG, mais seulement pour ceux qui avait un titre en tubes supérieur à 1/4. En effet, cela aurait été inutile de les faire pour des titres inférieurs ou égaux à 1/4, étant donné que la première dilution de la carte est de 1/10.


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8.1 Difficultés rencontrées Au cours de la réalisation de ce travail, il y a quand même eu certaines difficultés qui ont été rencontrées. Le fait de travailler avec les CD trouvés positifs dans les deux laboratoires n’était pas toujours facile à gérer, notamment pour la gestion des lots de réactifs. Cela a également été difficile de reprendre les analyses qui ont été effectuées les soirs, les nuits et les week-ends. Par exemple, il n’y avait plus de matériel à disposition pour certains cas où l’élution a été trouvée positive le week-end. Le lundi, les tubes de globules rouges du vendredi ont parfois été jetés avant que je puisse les mettre de côté pour faire mes tests. Tout cela est lié au fait qu’il y a beaucoup de TAB qui travaillent à l’UMT 24h/24 et réparties entre 2 laboratoires, donc il est difficile de faire en sorte que chacune soit au courant de tout ce qu’il fallait relever ou garder, et surtout y pensent...!

8.2 Perspectives Grâce à tous les résultats qui ont été récoltés, ce travail soulève de nombreuses questions et discussions. Par exemple :

- Analyser la variation des résultats du CD au cours des jours qui suivent le prélèvement.

- Analyser si cela est influencé par la température de stockage des globules rouges. - Analyser s’il y a une différence de sensibilité entre les deux réactifs de Coombs au

niveau de leur spécificité commune. - Analyser si la procédure devrait être différente pour les bébés. - Analyser si la procédure concernant les autocontrôles et les Coombs directs ne devrait

pas être modifiée. Elle pourrait stipuler que le Coombs direct doit être fait du moment que des anticorps circulants sont détectés, ceci même si l’autocontrôle est négatif !

Toutes ces questions et analyses remettent en question les procédures actuelles du laboratoire, en vue d’éventuelles modifications. En ce qui concerne les méthodes employées, des analyses peuvent également être faites :

- Comparer de manière plus approfondie les spécificités trouvées en tubes et celles trouvées en cartes.

- Comparer les titres obtenus en tubes et en gels. - Comparer les résultats obtenus avec les CD en tubes et ceux obtenus avec les CD en

cartes. - Comparer les cartes DiaMed LISS/Coombs et Coombs Anti-IgG. - Etc.

Ces questions soulèvent quant à elles le problème d’un possible changement complet de technique dans le laboratoire.

Les résultats obtenus permettent donc un large spectre de réflexion pour le laboratoire, qui devra entre autre procéder à une analyse de risques avant de pouvoir prendre de quelconques décisions.

Et pour moi, cela m’a permis d’avoir de la variation entre les différentes analyses que j’ai effectué et surtout d’enrichir mes connaissances en immuno-hématologie.


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9 Remerciements

Arrivée au terme de ce travail de diplôme, je tiens à dire un grand merci à Mme Jocelyne Conne pour m’avoir proposé le sujet de ce travail et m’avoir suivi tout au long de son élaboration. Mes remerciements vont également au Professeur Jean-Daniel Tissot pour son soutien. La firme DiaMed ayant généreusement participé à l’élaboration de ce travail grâce à leur don, je leur adresse donc mes sincères remerciements. Et pour terminer, un grand merci à toutes les techniciennes en analyses biomédicales de l’unité de médecine transfusionnelle qui m’ont encouragé et aidé du mieux qu’elles le pouvaient tout au long de ce travail.


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10 Liste de références bibliographiques

(19 janvier 2008). Anticorps [Page Web]. Accès: http://fr.wikipedia.org/wiki/Anticorps (page consultée le 23 janvier 2008) (16 novembre 2007). Antiglobuline [Page Web]. Accès: http://fr.wikipedia.org/wiki/Antiglobuline (page consultée le 25 janvier 2008) (Septembre 2007). Cas clinique provenant du Classeur des résultats d’identification du laboratoire. Conne, J. (2001, 2006, 2007) Procédures du laboratoire Feuillet d’immuno-hématologie de DiaMed Firme DiaMed. (2006) Catalogue de produits DiaMed-ID Micro Typing System : Sérologie de groupes sanguins Firme DiaMed. (2006) Liste des prix DiaMed-ID Micro Typing System Firme DiaMed. (2007). [Page Web]. Accès: http://diamed.com/products.aspx?mode=prod_type&id=1&NavId=7 Pour les photos des réactifs. (17 janvier 2008). Image: Coombs test schematic fr.png [Fichier Web]. http://fr.wikipedia.org/wiki/Image:Coombs_test_schematic_fr.png (page consultée le 25 janvier 2008) Images Modes d’emploi qui accompagnent les différents réactifs Jeauc, MN. Structure d’une immunoglobuline [Page Web]. Accès: http://www.ac-corse.fr/svt/ress_ped/antic/str_ac.htm (page consultée le 23 janvier 2008) Image (26 août 2007). Système du complément [Page Web]. Accès: http://fr.wikipedia.org/wiki/Syst%C3%A8me_du_compl%C3%A9ment (page consultée le 30 janvier 2008) (17 janvier 2008). Test de Coombs [Page Web]. Accès: http://fr.wikipedia.org/wiki/Test_de_Coombs (page consultée le 25 janvier 2008) Queloz P.-A., Siegenthaler M.A., Conne J., Schneider Ph. & Tissot J.-D. (juillet 2005). Immuno-hématologie : Bases de médecine transfusionnelle (quatrième édition).

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http://fr.wikipedia.org/wiki/Antiglobuline


http://www.ac-corse.fr/svt/ress_ped/antic/str_ac.htm

http://fr.wikipedia.org/wiki/Syst%C3%A8me_du_compl%C3%A9ment

http://fr.wikipedia.org/wiki/Test_de_Coombs


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11 Lexique 1 CD = Coombs Direct ou Test Direct à l’Antiglobuline = TDA 2 CI = Coombs Indirect ou Test Indirect à l’Antiglobuline = TIA 3 EP = Erythrocytes du Patient ou autocontrôle 4 UMT = Unité de Médecine Transfusionnelle 5 IgG = Immunoglobuline G (70-75%) 6 C3d = molécule du système du complément qui provient de la dégradation de la molécule

C3b 7 TAB = Technicienne en Analyses Biomédicales 8 CHUV = Centre Hospitalier Universitaire Vaudois 9 SRTS VD = Service Régional Vaudois de Transfusions Sanguines 10 RAS Papaïne = Réactions Aspécifiques en milieu enzymatique 11 AGH = AntiGlobuline Humaine (Anticorps anti-anticorps humains) 12 IgG1 et IgG3 = Sous-classes hémolysantes des IgG 13 IgA = Immunoglobuline A (15-20%) 14 IgM = Immunoglobuline M (10%) 15 IgD = Immunoglobuline D (<1%) 16 IgE = Immunoglobuline E (<1%) 17 Cytolyse = Dégénérescence cellulaire par rupture de la membrane plasmique, caractérisée

par une disparition de toutes les structures figurées de la cellule qui semble littéralement se dissoudre.

18 Chimiotaxie = Réaction de locomotion orientée et obligatoire d'organismes mobiles, déclenchée et entretenue par une substance chimique diffusant dans le milieu, et s'effectuant soit dans sa direction (chimiotaxie positive), soit dans la direction opposée (chimiotaxie négative).

19 Opsonisation = Augmentation de la vulnérabilité à la phagocytose. 20 Inflammation = Réponse fondamentale du corps humain envers une série d'agents

exogènes ou endogènes. 21 kDa = kilo Dalton = Unité employée pour mesurer la masse des atomes et des molécules,

égale à 1/12 de la masse d'un atome de l'isotope 12 du carbone. 22 Hématies sensibilisée = Globules rouges sur lesquels des anticorps ou des molécules du

complément sont fixés. 23 Anticorps incomplets = Anticorps de type IgG, chauds, non agglutinants, actifs à 37°C, en

milieu Coombs indirect, produits à la suite d’un transfert d’antigènes, donc immuns. 24 Anticorps irréguliers = Anticorps qui ne sont pas présents de manière constante dans le

plasma d’un patient.


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12 Annexes

A Procédures de laboratoire Test direct à l’antiglobuline humaine (approuvé janvier 2007) 1. Contexte et objectif 1.1 But du document

Ce document fixe les indications et la manière d’effectuer un test direct à l’antiglobuline humaine (TDA), permettant de mettre en évidence des anticorps ou du complément à la surface des hématies. Il établit la marche à suivre face à un autocontrôle ou un TDA positif.

1.2 Destinataires Techniciennes en analyses biomédicales (TAB) de l’UMT.

1.3 Modifications apportées (par rapport à la version précédente) Remplace : IT - RE - Test de Coombs direct_V05

2. Mode opératoire .............................................................................................................. 29 2.1 Généralités ................................................................................................................. 29 2.2 Indications ................................................................................................................. 29 2.3 Principes .................................................................................................................... 30 2.4 TDA polyspécifique .................................................................................................. 30

2.4.1 Technique en tubes : Serum de Coombs avec anti-C3d (Medion) ........................ 30 2.4.2 Technique en tubes : Serum de Coombs sans anti-C3d (Diamed)......................... 31 2.4.3 Technique en gel .................................................................................................... 31

2.5 Spécificité d’un TDA................................................................................................. 31 2.5.1 Technique en tubes ................................................................................................ 31

2.6 Titre d’un TDA IgG................................................................................................... 32 2.6.1 Technique en tubes ................................................................................................ 32 2.6.2 Interprétation.......................................................................................................... 32

2.7 Détermination des sous-classes IgG.......................................................................... 32 2.7.1 Technique en gel .................................................................................................... 32

3. Documents liés + références ........................................................................................... 33 2. Mode opératoire 2.1 Généralités

Toutes les procédures décrites dans cette instruction de travail sont effectuées par une TAB de l’UMT, selon les disponibilités. Pour plus de détails concernant l’exécution des analyses et l’interprétation des résultats, respectivement les échantillons et réactifs à utiliser, se référer aux documents (1,2).

Les résultats d’analyse sont protocolés sur les listes de travail comme décrit dans le document (3). 2.2 Indications

Situations nécessitant un TDA avec recherche de C3d : Examen demandé par un client (même si déjà effectué depuis moins de 3 jours) Echantillon de donneur (examen demandé par le médecin de l’UCA) Echantillon fœtal Echantillon de nouveau-né Patient devant subir une greffe Investigation de réactions transfusionnelles


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Situations nécessitant un TDA sans recherche de C3d : Test prétransfusionnel accompagnant un dépistage d’anticorps irréguliers Détermination d’antigènes érythrocytaires par la technique en Coombs indirect Titration des anticorps irréguliers

Situations nécessitant directement une recherche des spécificités :

Dernier résultat du TDA positif Demande spécifique d’un Coombs IgA Présence d’agglutinines froides de spectre thermique > 22°C Auto-contrôle positif

2.3 Principes

• Pas d’antériorités => sérum de Coombs polyspécifique (avec ou sans C3d selon §2.2). • Résultats positif => détermination des spécificités IgG, -C3d, -IgM, -IgA.

Le réactif anti-IgG dilué est utilisé en parallèle (permet de prévenir un effet de zone). • Résultat(s) positif(s) => analyses supplémentaires :

Spécificité Analyses complémentaires

C3d Dépistage d’anticorps irréguliers (4) IgG (seule ou non) Titre IgG

Elution [1] (4) Dépistage d’anticorps irréguliers

Détermination des sous-classes [2] IgM ou IgA

Elution [1] (4)

Dépistage d’anticorps irréguliers (4) [1] : L’élution doit être faite si :

◊ Le cas est inconnu. ◊ Un nouvel alloanticorps circulant a été mis en évidence. ◊ Le titre du TDA a augmenté d’au moins trois dilutions. ◊ La dernière demande date de plus de six mois (quel que soit l’évolution du titre de

Coombs). ◊ La dernière détermination du TDA n’était pas de spécificité IgG. ◊ Une hémolyse est suspectée ou que le sérum est très ictérique (dans les cas

douteux, demander l’avis du médecin de l’UMT).

[2] : Les sous-classes IgG doivent être déterminées lorsque : ◊ L’élution est positive. ◊ Il s’agit d’un nouveau-né (même si l’élution est négative).

2.4 TDA polyspécifique La technique de référence est la technique en tubes. La technique en gel ne doit pas être utilisée en routine.

2.4.1 Technique en tubes : Serum de Coombs avec anti-C3d (Medion) Réactifs spécifiques :

• Sérum de Coombs (polyspécifique) • Hématies contrôles pour le test de Coombs


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Procédure : 1. Laver 3 fois les hématies à tester 2. Préparer une suspension d’hématies à 3-5 % dans du NaCl à 0.9 % 3. Distribuer 2 gouttes de sérum de Coombs et une goutte de suspension érythrocytaire dans

un tube 4. Centrifuger, lire 5. Vérifier les résultats négatifs au microscope puis ajouter une goutte d’hématies contrôles 6. Centrifuger, lire 7. Si la réaction est négative, recommencer la procédure 8. Protocoler les résultats.

2.4.2 Technique en tubes : Serum de Coombs sans anti-C3d (Diamed)

Réactifs spécifiques : • Sérum de Coombs (polyspécifique) • Hématies contrôles pour le test de Coombs

Procédure :

1. Laver 3 fois les hématies à tester 2. Préparer une suspension d’hématies à 3-5 % dans du NaCl à 0.9 % 3. Distribuer une goutte de sérum de Coombs et une goutte de suspension érythrocytaire

dans un tube 4. Centrifuger, lire 5. Vérifier les résultats négatifs au microscope puis ajouter une goutte d’hématies contrôles 6. Centrifuger, lire 7. Si la réaction est négative, recommencer la procédure 8. Protocoler les résultats

2.4.3 Technique en gel Réactifs spécifiques :

• Cartes Diamed : « LISS-Coombs » • Diluent Diamed : ID-Diluent 2

Procédure :

1. Mélanger 20 μl de sang total ou 10 μl de concentré érythrocytaire dans 1 ml de diluent 2 2. Distribuer 50 μl de la suspension érythrocytaire dans chaque puits 3. Centrifuger, lire, protocoler les résultats

2.5 Spécificité d’un TDA La seule technique utilisée à l’UMT est la technique en tubes.

2.5.1 Technique en tubes Réactifs spécifiques :

• Sérum de Coombs (monospécifique) • Hématies contrôles pour le test de Coombs


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Procédure : 1. Laver 3 fois les hématies à tester 2. Préparer une suspension d’hématies à 3-5 % dans du NaCl à 0.9 % 3. Mettre 2 gouttes de sérum de Coombs monospécifique dans un tube et ajouter une goutte

de suspension d’hématies 4. Centrifuger, lire, contrôler au microscope les résultats négatifs 5. Si tout est négatif, ajouter une goutte d’hématies contrôles dans le tube « anti-IgG » 6. Centrifuger, lire. Si négatif, recommencer la procédure 7. Protocoler les résultats

2.6 Titre d’un TDA IgG

La seule technique utilisée à l’UMT est la technique en tubes. 2.6.1 Technique en tubes

Réactifs spécifiques : • Sérum de Coombs monospécifique anti- IgG • Hématies contrôles pour le test de Coombs

Procédure : 1. Laver 3 fois les hématies à tester 2. Préparer une suspension d’hématies à 3-5 % dans du NaCl à 0.9 % 3. Préparer des dilutions géométriques du sérum de Coombs monospécifique IgG avec du

NaCl physiologique 4. Distribuer 2 gouttes de sérum de Coombs monospécifique de chaque dilution (jusqu’à

1/128) et une goutte de suspension érythrocytaire dans un tube 5. Mélanger, centrifuger, lire (contrôler les résultats négatifs au microscope) 6. Protocoler les résultats 7. Si le résultat est toujours positif avec une dilution de 1/128, poursuivre les dilutions

(jusqu’à 1/2048) 2.6.2 Interprétation

La dernière dilution à laquelle une agglutination est observée donne le titre du test de Coombs. 2.7 Détermination des sous-classes IgG

La technique de référence est la technique en gel. 2.7.1 Technique en gel

Réactifs spécifiques : • Cartes Diamed : « DAT IgG1/IgG3 » • Diluent Diamed : ID-Diluent 2

Procédure :

1. Laver 3 fois les hématies à tester 2. Mélanger 10 μl d’hématies concentrées et lavées dans un ml de diluent 2 3. Distribuer 50 μl de la suspension érythrocytaire dans chaque puits 4. Centrifuger, lire, protocoler les résultats.


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3 Documents liés + références 1. IT - RE - Interprétation des résultats en immuno-hématologie 2. IT - RE - Analyses immuno-hématologiques_réactifs 3. PO - RE - Traçabilité de la demande au résultat d'analyse 4. IT - RE - Recherche et caractérisation des anticorps anti-érythrocytaires

GESTION DU DOCUMENT

Auteur(s) : Jocelyne Conne

Validation : Giorgia Canellini Lilly Habegger Jean-Daniel Tissot

Approbation : Jocelyne Conne

Libération par le service AQ : Jocelyne Conne Christel Bonny


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Recherche et caractérisation des anticorps anti-érythrocytaires (approuvé février 2008) 1 Contexte et objectif

1.1 But du document Décrire les techniques permettant l’identification d’anticorps anti-érythrocytaires autres que les hétéroanticorps du système ABO. 1.2 Destinataires Extrait du document officiel pour le travail de diplôme de Aurélia Chambaz (fait par J. Conne le 26.03.08)

12 Mode opératoire 12.1 Recherche d’anticorps irréguliers

Les techniques acceptées sont la technique en gel (technique de premier choix) et, selon le type d’anticorps recherché, la technique en tubes.


• Cartes Diamed : 6 puits « Liss - Coombs » • Hématies-test Diamed

Procédure :

1. Pipeter 50 μl de chaque suspension d’hématies-test dans le puits correspondant 2. Distribuer 25 μl de plasma (sérum) dans chaque puits 3. Incuber 15 min à 37°C 4. Centrifuger, lire, protocoler les résultats

12.3.2 Interprétation Une réaction négative n’écarte pas de manière absolue la présence d’anticorps (dirigés contre des antigènes rares ou absents des hématies-test, ou en concentration trop faible). Une réaction positive lors du test de dépistage nécessite d’identifier le ou les anticorps présents. La comparaison de l’agglutination obtenue avec le tableau d’agglutination des hématies-tests permet d’orienter le diagnostic.

12.2 Identification des anticorps irréguliers Les techniques en gel et en tubes sont acceptées. La technique en gel est le premier choix, mais selon le type d’anticorps recherché, la technique en tubes peut être utilisée.


• Diluent ID 2 • Cartes Diamed « LISS/Coombs » • Hématies-tests ID DiaPanel et ID DiaPanel P (papaïnées)

Procédure :

Lorsque la recherche d’anticorps irréguliers n’est positive qu’avec les hématies papainées, l’identification d’anticorps est réalisée uniquement avec les hématies papainées. Si la recherche d’anticorps irréguliers n’est positive qu’avec les hématies en LISS, l’identification d’anticorps se fait avec les deux séries d’hématies.

1. Préparer 4 cartes « LISS/Coombs »


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2. Préparer les hématies “ patient ” (1 ml de diluent 2 + 10 μl d’hématies) 3. Pipetter les hématies-tests : 50 μl dans le puits correspondant 4. Pipetter les hématies « patient » dans un des deux derniers puits (autocontrôle) 5. Ajouter le sérum (plasma) : 25 μl 6. Incuber 15 min. à 37°C 7. Centrifuger, lire, protocoler les résultats

12.2.2 Interprétation En Coombs indirect : réaction positive avec des anticorps IgG.

En milieu enzymatique - Coombs : réaction positive avec des anticorps dont l’action est rehaussée par le milieu enzymatique (anticorps du système Rhésus, anti-Jka, anti-Jkb, anti-Lea, anti-Leb). Par contre d’autres anticorps ne peuvent être mis en évidence en raison de l’altération des déterminants antigéniques par l’enzyme (anti-M, -N, -S, -Fya, -Fyb).

En milieu salin (technique en tubes) : réaction positive à 22°C avec des anticorps IgM tels que anti-Lea, anti-Leb, anti-P1, anti-M, anti-N, anti-Lua.

La solution de Liss (technique en tubes) accélère la réaction antigène-anticorps, ce qui permet de diminuer le temps d’incubation et favorise l’agglutination.

Les panels d’identification ne permettent pas la mise en évidence des anticorps dirigés contre certains antigènes privés ni des anticorps anti-A et anti-B (ne pas oublier d’ajouter des hématies A et B lors d’élution de patients greffés non isogroupe).

L’identification des anticorps peut nécessiter l’emploi de plusieurs milieux et des températures d’incubation différentes ou de techniques supplémentaires (absorption, élution). La TAB décide des investigations complémentaires à effectuer, de cas en cas. Les cas douteux ou difficiles doivent être soumis au médecin assigné à l’UMT. L’identification d’un anticorps nécessite la vérification du phénotype antigénique correspondant des hématies du sujet : l’antigène correspondant doit être absent de la surface des hématies sauf s’il s’agit d’un autoanticorps ou il s’agit de double population.

12.3 Elution Le but de l’élution est de récupérer in vitro des anticorps fixés in vivo ou in vitro sur les hématies. La libération de l’anticorps peut être obtenue de différentes manières : par chaleur à 56°C, par traitement au chloroforme, par traitement à l’éther, etc... La technique de référence est la technique au chloroforme.

12.3.1 Technique d’élution au chloroforme Procédure :

1. Laver 3 fois les hématies à analyser 2. Centrifuger (1 min. vitesse rapide) et éliminer le surnageant 3. Ajouter un volume de NaCl aux hématies bien sédimentées 4. Ajouter deux volumes de chloroforme 5. Incuber pendant 5 min. à 56°C en remuant avec un bâtonnet de bois 6. Centrifuger (4 min. à vitesse rapide) 7. Prélever l’éluat à l’aide d’une pipette et le transférer dans un tube propre (après la

centrifugation on observe 3 couches distinctes : la couche supérieure contenant l’hémoglobine et l’anticorps élué, la couche intermédiaire contenant les érythrocytes et la couche inférieure est constituée de chloroforme

8. Procéder à l’identification du (des) anticorps soit à l’aide des panels d’hématies-tests soit à l’aide d’hématies-tests A1 et B (si un anticorps dans le système ABO)


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13 Documents liés + références 1. IT - RE - Interprétation des résultats en immuno-hématologie 2. IT - RE - Analyses immuno-hématologiques_réactifs 3. PO - RE - Traçabilité de la demande au résultat d'analyse Gestion du document Auteur(s) : Jocelyne Conne

Validation : Giorgia Canellini

Approbation : Jocelyne Conne

Libération par le service AQ : Jocelyne Conne Christel Bonny