Article original

Pharmacognosie

Évaluation de l’activité antioxydante et antimicrobienne des feuilleset des sommités fleuries deMarrubium vulgare L.

N. Ghedadba1, H. Bousselsela2, L. Hambaba1, S. Benbia2, Y. Mouloud2

1Laboratoire de chimie des matériaux et des vivants : activité et réactivité, département des sciences de la nature et de la vie, faculté des sciences, universitéEl-Hadj-Lakhdar, 05000 Batna, Algérie2Laboratoire de biotechnologie des molécules bioactive et de la physiopathologie cellulaire, département des sciences de la nature et de la vie, faculté dessciences, université El-Hadj-Lakhdar, 05000 Batna, Algérie

Correspondance : viamessi@gmail.com

Résumé : Dans cette étude in vitro, des activités antioxydanteet antimicrobienne des extraits organiques et de l’extraitaqueux des feuilles et des sommités fleuries du Marru-bium vulgare ont été étudiées. L’activité antioxydante a étéévaluée par la méthode de radical-balayage du diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) et le test de blanchiment du β-carotène. L’activité antimicrobienne a été évaluée par laméthode de diffusion en milieu gélosé. L’analyse qualitativedes extraits par la chromatographie sur couche mince (CCM)a indiqué la présence de l’acide gallique, de la quercétine etl’absence d’atropine. D’ailleurs, l’identification préliminairede l’activité antiradicalaire envers le DPPH par CCM indiqueque l’activité est concentrée dans l’extrait méthanolique brut(EMeOH). La quantification des phénols totaux par laméthode de Folin-Ciocalteu et des flavonoïdes par laméthode AlCl3 a donné des valeurs plus élevées avecl’EMeOH, où la valeur la plus élevée est estimée par mesuresau spectrophotomètre : 3,42 ± 0,85 mg EAG/g d’extrait ; 18,0± 0,75 mg EQ/g d’extrait. Marrubium vulgare n’a eu aucuneactivité contre les micro-organismes examinés (Staphylococ-cus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 et Escherichia coli ATCC 25922). La méthode de β-carotène a attiré l’attention sur l’existence de trois temps :« temps de repos, temps de génération et temps d’épuise-ment » dans lequel l’EMeOH a été caractérisé par une activitéantioxydante très élevée (63,77 %). L’évaluation quantitativede l’activité antiradicalaire a prouvé que l’EMeOH est le plusactif (IC50 = 1,5 μg/ml) ; cependant, la quercétine (utiliséecomme témoin) a montré une activité approximativementéquivalente (IC50 = 0,81 μg/ml), ce qui indique la présencede composés efficaces dans la composition biochimique dela plante qui ont une capacité élevée dans la réduction duDPPH. Ces composés sont caractérisés par une polarité élevéeet sont identifiés par chromatographie liquide sous hautepression (HPLC) dans l’EMeOH de la plante ; ces composéss’appellent les « phénylpropanoïdes glycosides ».

Mots clés : Marrubium vulgare – Extraits organiques –Flavonoïdes – Activité antimicrobienne – Activitéantioxydante

Evaluation of the Antioxidant and AntimicrobialActivities of the Leaves and Flowered Topsof Marrubium vulgare L.

Abstract: In the current in vitro study, antioxidant and antimi-crobial activities of the organic solvents and aqueous extracts ofthe leaves and flowered tops ofMarrubium vulgare were inves-tigated. Antioxidant activity was evaluated by 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activityand β-carotene bleaching method, and the antimicrobial acti-vity was evaluated by disc diffusion method. Qualitative analy-sis of the extracts by thin layer chromatography (TLC) revealedthe presence of gallic acid, quercetin and the absence of atro-pin. Moreover, preliminary identification of the radical-scavenging activity toward DPPH by TLC indicated that theactivity is concentrated in the crude methanol extract(MeOHE). Quantification of total phenols by Folin-Ciocalteumethod and flavonoids by AlCl3 method gave higher valueswith the MeOHE, where the highest value estimated by spec-trophotometer measurement: (3.42 ± 0.85 mg GAE/g ofextract; 18.0 ± 0.75 mg QE/g of extract). Marrubium vulgarehad no activity against tested microorganisms (Staphylococ-cus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, andPseudomonas aeruginosa ATCC 27853). The β-carotenemethod focused on the existence of three times: “rest time,generation time, and exhaustion time” with which the MeOHEwas characterized by a very high antioxidant activity (63.77%).The quantitative evaluation of the antiradical activity showedthat the MeOHE is the most active (IC50 = 1.5 μg/ml);however, quercetin (used as standard) showed approximatelyequivalent scavenger activity (IC50 = 0.81 μg/ml), indicatingthe presence of compounds effective in the biochemical

Phytothérapie© Springer-Verlag France 2014DOI 10.1007/s10298-014-0832-z

composition of the plant which have a high capacity in thereduction of DPPH. These compounds are characterized by ahigh polarity and are identified by HPLC in the MeOHE of theplant; these compounds are called “phenylpropanoidsglycosides”.

Keywords: Marrubium vulgare – Organic extracts –Flavonoids – Antimicrobial activity – Antioxidant activity

Introduction

La résistance aux antibiotiques atteignant le point de crisedans beaucoup d’hôpitaux autour du monde, il y a desbesoins urgents de compléter le niveau de notre arsenald’agents anti-infectieux [6]. De plus, les effets nuisibles dustress oxydant sur la santé des personnes sont devenus unproblème grave. Les antioxydants synthétiques, tels quel’hydroxytoluène butylé (BHT), ont été employés couram-ment comme antioxydants dans l’industrie alimentaire etpeuvent être responsables des dommages du foie et de lacarcinogenèse [8]. Pour cette raison, l’intérêt d’utilisationdes antioxydants et antimicrobiens d’origine naturelle aconsidérablement augmenté. Dans diverses plantes médici-nales, différentes molécules bioactives, telles que les flavo-noïdes, les acides phénoliques, les tanins, les caroténoïdes,les stérols et les terpénoïdes, ont été identifiées [4].

Marrubium vulgare L. (Lamiaceae), généralement connuesous le nom « Horehound », riche essentiellement en com-posés phénoliques, est employée couramment dans la méde-cine traditionnelle pour guérir certaines maladies [4,10,15].Marrubium vulgare possède des effets hypoglycémiants ethypolipidémiants [10] (par une stimulation de sécrétiond’insuline par les cellules β-pancréatique), vasorelaxant etantihypertensif [9], anticholinestérase contre l’acétylcholi-nestérase et butyrylcholinestérase [14], antioxydant et anti-microbien [15], antispasmodique, anti-inflammatoire, anal-gésique [15,20]. Il possède les activités tonique, aromatique,stimulante, expectorante, diaphorétique et diurétique [1].C’est également un ingrédient des pastilles contre la toux,par exemple, Ricola® [15]. Il a été très employé dans lesaffections hépatiques [1]. Le principe actif principal de cetteplante a été identifié en tant que marrubiine, un diterpènelabdane furanique [20]. D’autres composés sont présentsdans la plante, parmi lesquels on peut citer l’acide caffeoyl-L-malique, l’actéoside, l’arénarioside, le forsythoside B et leballotétroside [16], le vulgarol, le β-sitostérol [1], le lupéol,l’apigénol et la ladanéine [13,15].

L’objectif principal de notre étude est d’élucider in vitrol’activité antimicrobienne du Marrubium vulgare (des feuil-les et des sommités fleuries) contre quelques bactéries Grampositives et Gram négatives. Le deuxième but de cette étudeest de déterminer son activité antioxydante au moyen dedeux tests différents : le balayage des radicaux libres deDPPH (2,2′-diphényl-1-picrylhydrazyl) et la méthode deblanchiment du β-carotène.

Matériel et méthodes

Matériel végétal

L’échantillon de la plante de Marrubium vulgare a été ras-semblé pendant le mois d’avril 2011 dans la région de Touf-fana à 52 km de Batna dans le nord-est de l’Algérie. Laplante a été identifiée par M. Hamchi au département debiologie de la faculté des sciences de Batna, et séchée dansune salle foncée pour empêcher la photo-oxydation, puisécrasée en une poudre fine.

Chémicals et réagents

Les solvants suivants ont été employés pour l’extraction :méthanol, éther de pétrole, dichlorométhane. Solvants utili-sés pour la chromatographie préparatoire et l’activité anti-oxydante : chloroforme, acétate éthylique, n-butanol. Desstandards des acides phénoliques (acide gallique) et des fla-vonoïdes (quercétine) ont été obtenus à partir de « SigmaAldrich ». Le réactif des phénols de Folin-Ciocalteu et lechlorure d’aluminium (AlCl3) ont été achetés de « FlukaChemie ». Les réactifs suivants ont été employés dans lesexpériences d’activité antioxydante : tween 60, β-carotène,acide linoléique (pureté CA 99 %), 2,2′-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich Chemie). Leα-tocophérol a été obtenu à partir de l’alcool de laboratoirepharmaceutique API.

Préparation des extraits organiques

Selon Stanković [19], la poudre sèche broyée est d’abordmise en contact avec l’éther de pétrole à raison de 100 mlde solvant pour 10 g de poudre dans un récipient qui estenrobé par la suite par un papier d’aluminium, afin de pré-server l’obscurité, en conservant au maximum les métaboli-tes contre les effets de l’oxydation par les photons. Une agi-tation manuelle simple a été effectuée au début pour assurerque toute la surface de la poudre est imprégnée par le sol-vant, puis une agitation mécanique a été effectuée pour accé-lérer le processus d’extraction. Après une période d’incuba-tion de 24 heures à température ambiante, le mélangehétérogène est filtré sur filtre de papier plissé, et le résidude l’extraction précédente (retentât) a été repris par 100 mlde dichlorométhane et laissé reposé (sous une agitationmanuelle + mécanique) pendant 24 heures, le résidu est ànouveau extrait par 100 ml de méthanol pendant 24 heuresdans les mêmes conditions. À la fin de l’extraction, lesextraits organiques (EEp, EDCM, extrait méthanolique brut[EMeOH]) sont évaporés au moyen d’un évaporateur rotatif(Heidolph Rotavapor) aux températures 40, 35 et 50 °Crespectivement.

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Préparation de l’extrait aqueux

L’extrait aqueux a été obtenu par la macération agitée pen-dant 24 heures de 10 g de l’échantillon de poudre en volumede 100 ml d’eau distillée, la phase aqueuse du macérat a étéalors filtrée sur un papier-filtre et lyophilisée. L’extraitobtenu a été maintenu dans les tubes stériles et stocké dansun réfrigérateur à +4 °C [19].

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Les quatre extraits ont été analysés en utilisant la CCM entant qu’empreinte digitale. Plats du silica-gel (Merck) [60GF254 de taille 20 × 20 cm], en utilisant : n-butanol/acideacétique/eau (60:15:25 ; v/v/v) et : chloroforme/méthanol/eau (65:35:5 ; v/v/v) en tant que systèmes de solvants pourles extraits polaires, tandis que pour les extraits apolaires enutilisant l’éther de pétrole/acétate éthylique (80:20 ; v/v) [7].

Trois témoins ont été employés : la quercétine, l’acidegallique et un alcaloïde : l’atropine (Sigma-Aldrich). LaCCM a été observée après la pulvérisation du réactif : lavanilline sulfurique. La détection des composés ayant unbalayage d’activité de DPPH est effectuée par pulvérisationd’une solution méthanolique de DPPH (2 mg/ml), les tachesjaunes ont indiqué la présence des composés actifs. Le rap-port frontal (Rf) des taches résultant de la séparation a étécalculé et comparé à ceux des témoins, permettant ainsil’identification des divers composés des extraits [7].

Analyse qualitative par chromatographie liquidesous haute pression (HPLC)

L’analyse qualitative des flavonoïdes est réalisée par HPLC (VPShimadzu Liquid Chromatograph). Pour cela, 20 μl de chaqueextrait ont été injectés sur une colonne de type phase inverseC18, de dimensions égales à 125 × 4,6 mm. La phase mobileest constituée de trois éluants : l’eau distillée, le méthanol etl’acide acétique (50:47:2,5 ; v/v/v). Le gradient d’élution appliquéest de type isocratique étalé sur dix minutes. Le débit est de 1 ml/min. La détection a été effectuée par un détecteur UV-Vis à unelongueur d’onde égale à 330 nm [2].

Dosage des polyphénols totaux

Les quatre extraits (200 μl) ont été mélangés à 1 ml de réactifde Folin-Ciocalteu et à 2 ml d’H2O, et incubés à la tempéra-ture ambiante pendant quatre minutes. Après l’addition de0,8 ml de bicarbonate de sodium de 7,5 % au mélange, lespolyphénols totaux étaient déterminés après deux heuresd’incubation à la température ambiante. L’absorbance de lacouleur bleue en résultant a été mesurée au λmax = 765 nmavec un spectrophotomètre de Shimadzu UV-Vis. La quan-tification a été faite en ce qui concerne la courbe standard del’acide gallique. Les résultats ont été exprimés en milligram-mes d’équivalents d’acide gallique (EAG) par gramme d’ex-trait (mg EAG/g d’extrait) [22].

Détermination des flavonoïdes totaux

Une quantité de 1 ml de chaque échantillon et de standard(préparée dans le méthanol) est ajoutée à 1 ml de la solutiond’AlCl3 (2 % dissous au méthanol). Après dix minutes, l’ab-sorbance a été mesurée par rapport au blanc préparé deréactif au λmax = 430 nm. Les concentrations des flavonoï-des ont été déduites à partir de la gamme de la courbe d’éta-lonnage établie avec la quercétine (0–35 μg/ml). Les résul-tats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents dequercétine par gramme d’extrait (mg EQ/g d’extrait) [3].

Activité antimicrobienne

Des plats d’agar nutritif stériles ont été préparés et incubés à37 °C pendant 24 heures pour vérifier une éventuelle conta-mination. Des disques de papier-filtre stériles (Wathmanno 1) de 6 mm de diamètre, stérilisés avant avec l’étuve(120 °C pendant 15 minutes) sont imbibés par les diversessolutions (1 g/ml) dissoutes dans le DMSO (diméthylsulfo-xyde) pour les extraits organiques. L’activité antibactériennein vitro des différents extraits de Marrubium vulgare a étéétudiée par la méthode de diffusion de disque contre Esche-richia coli, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aerugi-nosa, en utilisant la gélose de Mueller-Hinton. Les boîtesde Pétri ont été incubées à 37 °C pour 24 heures et le dia-mètre de la zone de l’inhibition mesurée en millimètre [5].

Activité antioxydante

Test de blanchiment du β-carotène

L’activité antioxydante des quatre extraits du Marru-bium vulgare a été mesurée selon le protocole décrit par Kar-tal et al. [12] avec de légères modifications. L’émulsion de β-carotène/d’acide linoléique a été préparée par la solubilisa-tion de 0,5 mg de β-carotène dans 1 ml de chloroforme, 25 μld’acide linoléique et 200 mg de tween 60 ont été ajoutés. Lechloroforme a été complètement évaporé dans le rotavapor à40 °C, ensuite 100 ml d’eau oxygénée ont été ajoutés, l’émul-sion en résultant a été agitée vigoureusement. Cinq centsmicrolitres de solution d’extrait ou d’antioxydant de la réfé-rence (α-tocophérol) [solubilisé dans le méthanol] ont étéajoutés à 2,5 ml de l’émulsion précédente. L’absorbance aété mesurée à 490 nm avant et après le traitement thermiqueavec des intervalles de temps réguliers pendant 48 heures. L’ana-lyse de blanchiment du β-carotène a été calculée comme suit :AAR = [Abst:48h (sample)/Abst:48h (α-toco)] × 100 %.

Effet radical-balayage de DPPH

Afin d’étudier l’activité antiradicalaire des différents extraitsde feuilles et de sommités fleuries de Marrubium vulgare,nous avons utilisé la méthode fondée sur le DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl) comme un radical relativementstable, selon le protocole décrit par Sanchez-Moreno [17].Brièvement, la solution de DPPH a été préparée par la

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solubilisation de 2,4 mg de DPPH dans 100 ml de méthanol.Cinquante microlitres des solutions des extraits du Marru-bium vulgare ou du standard (quercétine) ont été ajoutés à1,95 ml de DPPH, les mélanges ont été incubés dans l’obscuritépendant 30 minutes, et la décoloration comparée au contrôlenégatif contenant seulement la solution de DPPH mesurée à517 nm en utilisant un spectrophotomètre UV/visible type Bio-tech Engineering Management CO. LTD. (UK). L’activité deradical-balayage de DPPH a été calculée comme suit : %(AA)= [(A517 control – A517 échantillon)/A517 control] × 100.

Là où le control A517 est l’absorbance de la réaction decontrol (contenant tous les réactifs, excepté l’échantillond’essai), et l’échantillon A517 est l’absorbance des extraitsou de la référence.

Analyse statistique

Toutes les mesures expérimentales ont été effectuées en tri-ple et sont exprimées en tant que moyenne d’écart-type ± detrois analyses (moyen (SE) ± d’écart-type). L’analyse statis-tique a été exécutée en utilisant l’analyse de la variance àsens unique (Anova). Si la p-valeur globale s’avérait statisti-quement significative (p < 0,05). Toute l’analyse statistiqueet l’importance de la corrélation entre les variables ont étéexécutées en utilisant le logiciel (Graph Pad Prism V 5.00).

Résultats et discussion

Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique des extraits indique la présencedes polyphénols, des flavonoïdes et des tanins dans lesextraits polaires, des stérols et/ou des terpénoïdes dans l’EEpet des saponines dans l’extrait aqueux (EAQ).

CCM

La CCM a montré la probabilité de la présence de l’acidegallique (Rf = 0,80) et de la quercétine (Rf = 0,84) dansl’EMeOH et l’absence de l’atropine dans tous les extraits,ce qui peut être expliqué par l’effet que l’atropine n’ait pasmigré dans différents éluants utilisés, ou que l’atropine aitmigré ; cependant, leur révélation nécessite un révélateurspécifique caractéristique des alcaloïdes comme le réactifde Dragendorff [7]. Avec la connaissance des auteurs, l’acidegallique est identifié pour la première fois comme nouveaucomposé de Marrubium vulgare.

L’EMeOH a montré l’activité préliminaire antiradicalaire(tache jaune) après la révélation par une solution méthano-lique de DPPH à 2 mg/ml, qui ont indiqué que les composésantioxydants inclus par l’extrait ont la capacité de réduire leradical de DPPH.

Analyse qualitative par HPLC

Le chromatogramme de HPLC (Bruker 300 UltraShield™)(Fig. 1) de l’extrait méthanolique de Marrubium vulgarepeut être commodément divisé en deux parts différentes :la première de 20,00 à 26,50 minutes est celle où le verbas-coside et ses dérivés complexes de sucre s’éluent, tandis queles flavonoïdes glycosides apparaissent dans la gamme entre26,51 et 42,50 minutes.

La comparaison des temps de rétention des standards(Tableau 1) avec ceux enregistrés dans le chromatogramme(Fig. 1) permet l’identification probable de différents com-posés dans l’extrait méthanolique de Marrubium vulgare.

Les résultats montrent la présence de l’acide gallique(14,5 minutes) qui a été identifié pour la première foiscomme nouveau composé des feuilles de Marrubium vul-gare, la quercétine (35 minutes) et quatre phénylpropanoï-des glycosides : le forsythoside B (20,5 minutes), le balloté-troside (22 minutes), l’arénarioside (23 minutes) et leverbascoside (24,5 minutes).

Dosage des polyphénols et des flavonoïdes

Tout le contenu phénolique dans les extraits examinés de laplante utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu est exprimé entermes d’équivalent d’acide gallique (l’équation standard decourbe : y = 0,0115 x ; r2 = 0,9989). Les valeurs obtenuespour la concentration des phénols totaux sont expriméesen mg EAG/g d’extrait (Tableau 2). Tout le contenu phéno-lique dans les extraits examinés s’est étendu de 1,2 à 3,42 mgEAG/g d’extrait.

La concentration la plus élevée des phénols a été mesuréedans l’extrait méthanolique et aqueux. Tout le contenu phé-nolique dans les extraits du Marrubium vulgare dépend dutype d’extrait, c’est-à-dire de la polarité du solvant utilisédans l’extraction. La solubilité élevée des phénols dans lessolvants polaires donne la concentration élevée de ces com-posés dans les extraits obtenus en utilisant les solvants polai-res pour l’extraction [19].

La concentration des flavonoïdes dans divers extraits duMarrubium vulgare L. était déterminée en suivant laméthode spectrophotométrique avec du chlorure d’alumi-nium. Le contenu des flavonoïdes a été exprimé en termesde mg EQ/g d’extrait, l’équation standard de courbe : y =0,066 x = 0,04 ; r2 = 0,9988 (Tableau 3). La concentrationdes flavonoïdes dans les extraits de Marrubium vulgare s’estéchelonnée de 0,70 à 18,0 mg EQ/g d’extrait : l’extraitméthanolique contenant la concentration de flavonoïde laplus élevée. La concentration des flavonoïdes dans l’extraitde méthanol était 18,0 ± 0,75 mg EQ/g d’extrait : la plusbasse concentration de flavonoïdes a été mesurée dans l’EEp(0,70 ± 0,05 mg EQ/g d’extrait). La concentration des flavo-noïdes dans les extraits de la plante dépend de la polarité dessolvants utilisés dans la préparation d’extrait [19]. Le type destandard utilisé peut également changer les résultats [8].

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Activité antimicrobienne

Les résultats de l’activité antimicrobienne des sommitésfleuries et des feuilles du Marrubium vulgare obtenus sontnégatifs. Aucun extrait n’a eu d’effet contre les bactéries exa-minées (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomo-nas aeruginosa ATCC 27853 et Escherichia coli ATCC25922). Les résultats ont indiqué que plusieurs paramètrespeuvent influer la détermination de l’activité antimicro-bienne comme : le type des micro-organismes ciblés, laméthode d’évaluation de l’activité antimicrobienne, laconcentration, le type de l’extrait et particulièrement lanature et la structure moléculaire des molécules bioactivesdes métabolites secondaires [6].

Tableau 1. Temps de rétention des différents composésstandards.

Temps de rétention (min) Standards

14,5 Acide gallique35 Quercétine20,5 Forsythoside B22 Ballotétroside23 Arénarioside24,5 Verbascoside

Tableau 2. Contenu phénolique total dans les extraitsde Marrubium vulgare.

Extraits Polyphénols totauxa

Éther de pétrole 1,2 ± 0,52Dichlorométhane 1,27 ± 0,94Méthanol 3,42 ± 0,85b

Eau (EAQ) 3,07 ± 0,76

a Équivalent acide gallique (mg EAG/g d’extrait).b Valeur significative (p < 0,05).

Fig. 1. Chromatogramme de chromatographie liquide sous haute pression d’extrait méthanolique de Marrubium vulgare, visualisé à λ = 330 nm (les pics 4–9 sont des esters de phénylpropanoïdes)

Tableau 3. Contenu total de flavonoïdes dans les extraitsde Marrubium vulgare.

Extraits Flavonoïdes totauxa

Éther de pétrole 0,70 ± 0,05Dichlorométhane 0,94 ± 0,14Méthanol 18,0 ± 0,75b

Eau (EAQ) 4,34 ± 0,78

a Équivalent quercétine (mg EQ/g d’extrait).b Valeur hautement significative (p < 0,0001).

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La paroi de Pseudomonas aeruginosa et d’Escherichia coli(bactéries Gram négatives) est très riche en lipopolysaccha-rides (LPS) [lipide A, noyau oligosaccharidique et antigèneO], qui empêchent les molécules comme les terpènes hydro-phobes d’adhérer à lui. D’ailleurs, ces micro-organismessont mobiles, il est probablement possible à ces bactériesd’être déplacées profondément dans l’agar nutritif de gélose,et par conséquent d’échapper ainsi à l’action des métabolitescontenus dans les extraits du Marrubium vulgare. La plusgrande résistance du Gram (+) de Staphylococcus aureusvers les extraits peut être expliquée par la structure de paroihétérogène de la bactérie : la présence de l’exopolysaccha-ride contenant une couche externe (glycocalyxe), la pré-sence de certains composants comme l’acide techoique etquelques liens entre les divers composants donnent au poly-mère fortement réticulé de parois une structure tertiaireinconnue [18].

Test de blanchiment du β-carotène

Les activités inhibitrices de peroxydation des lipides par lespolyphénols et les flavonoïdes ont été évaluées par l’essai dublanchiment du β-carotène qui est fondé sur la perte de lacouleur jaune de β-carotène due à sa réaction aux radicauxqui sont constitués par oxydation d’acide linoléique dansune émulsion. La présence de différents antioxydants peutgêner l’ampleur du blanchiment du β-carotène en neutrali-sant le radical libre de linoléate et d’autres radicaux libresformés dans le système [11].

Cette méthode est employée couramment parce que leβ-carotène montre une activité biologique forte et est uncomposé physiologique important [11]. En outre, leβ-carotène est employé comme agent de coloration en bois-sons, et sa décoloration réduirait nettement la qualité de cesproduits [11]. De ce fait, il est employé dans l’évaluation del’activité antioxydante des extraits de Marrubium vulgare.La cinétique de blanchiment du β-carotène selon la présenceou l’absence dans les extraits du Marrubium vulgare, de

l’antioxydant standard (α-tocophérol) est montrée dans laFigure 2.

Comme l’indique la Figure 2, les courbes ont la mêmeallure, ce qui implique la même interprétation :

– au temps (t0) : la densité optique de tous les extraits, le stan-dard et le contrôle (–), étant presque la même et présentantun seuil d’absorbance d’environ 2. Cela est expliqué par lefait qu’à ce moment-là il n’y a aucun RL qui a été formé dansle milieu réactionnel, par conséquent le β-carotène restehautement insaturé, la couleur jaune confère alors uneabsorbance maximale, ce temps peut être nommé « tempsde repos » ;

– au temps (t :2h) : l’absorbance commence à diminuer pro-gressivement pour tous les extraits, le standard et le contrôle(–), ce qui indique sans doute le début de la formation desRLs dans le milieu réactionnel généré par l’acide linoléiquesuite à la rupture des doubles liaisons par le tween 60, onpréfère nommer ce temps « temps de génération » ;

– après ce temps (2h < t ≤ 48h) : l’étude de cinétique de blan-chiment du β-carotène montre que celui-ci diminue gra-duellement avec le temps, pour atteindre un état stationnaireau bout de 48 heures, étant donné que le nombre de RLsdevient important. Après ce temps-là, il reste constant, cequi montre que toutes les doubles liaisons présentes dans leβ-carotène sont dégradées, ce qui s’achève à l’épuisementirréversible de la coloration jaune par la transformation enune couleur blanche, c’est donc le blanchiment total duβ-carotène, ce temps est dit « temps d’épuisement ».

Par ailleurs, d’après la Figure 2, on remarque que lacourbe qui correspond au contrôle (–) diminue d’une façonrapide, car il n’y a aucun antioxydant qui puisse inhiber oudiminuer l’oxydation du β-carotène, ce qui facilite l’actiondes RLs.

Les résultats de blanchiment du β-carotène (Fig. 3) ontindiqué que l’activité la plus élevée (dans le système demodèle à l’acide linoléique) a été montrée par l’extrait au

Fig. 2. Cinétique de blanchiment du β-carotène (0,5 mg) à 490 nm des extraits de la partie aérienne du Marrubium vulgare (500 μl) et de l’α-tocophérol. Chaque valeur est la moyenne de trois analyses

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méthanol du Marrubium vulgare (AAR = 63,77 %) et parl’extrait aqueux (AAR = 56,63 %). L’éther de pétrole et ledichlorométhane ont présenté des activités inférieures.

Nos résultats sont en accord avec ceux de Pukalskas et al.[15] qui ont indiqué que le coefficient le plus élevé de l’acti-vité antioxydante du Marrubium vulgare dans le système deblanchiment du β-carotène est apporté par l’extrait métha-nol–eau du marrube. L’analyse statistique montre la pré-sence d’une corrélation linéaire significative entre la teneurde ces extraits en polyphénols totaux, en flavonoïdes et lepourcentage d’inhibition de l’oxydation de l’acide linoléique(r = 0,85 ; r = 0,80, respectivement), ce qui indique la contri-bution de ces composés qui sont les antioxydants dominantsdans ces extraits (pouvoir antioxydant de la plante).

Ces résultats sont en accord avec les résultats de plusieursgroupes de recherche, qui ont rapporté une corrélation posi-tive entre tout le contenu phénolique et l’activité antioxy-dante [15]. L’activité antioxydante dépend de plusieurs fac-teurs, par exemple : la concentration des extraits, la méthoded’évaluation, la sensibilité des antioxydants à la températurede l’essai et la nature hydrosoluble ou liposoluble de l’anti-oxydant [11,15].

Effet scavenger du radical DPPH

L’activité antiradicalaire des différents extraits a été évaluéepar leur activité inhibitrice sur une solution méthanoliquede DPPH, mesurée à 517 nm. Les standards utilisés étaientla quercétine et l’acide ascorbique (vitamine C). L’activitéantiradicalaire des différents extraits de Marrubium vulgare,ainsi que les standards, a été illustrée sur la Figure 4.

D’après la Figure 4, on constate que les extraits de Mar-rubium vulgare possédant une activité antiradicalaire dose-dépendante, les IC50 de chacun des différents extraits ont étédéterminés. Selon Kadri et al. [11], une valeur plus faible del’IC50 (la concentration du substrat qui cause une inhibitionde 50 % de l’activité de DPPH) indique une activité antioxy-dante plus élevée.

L’EMeOH a donc présenté l’activité antiradicalaire la plusélevée (IC50 = 1,5 μg/ml ; APR = 15), en confirmant le résul-tat du CCM de criblage, suivi par l’EAQ avec une IC50 del’ordre de 125 μg/ml et un APR de 0,076 ± 0,90. Par contre,l’activité antiradicalaire la plus faible a été exprimée parl’EDCM et l’EEp (IC50 = 500 μg/ml, 720,1 μg/ml et APRde 0,019 ± 0,22 et 0,012 ± 0,66 respectivement), ce quine présente pas une différence significative de leur activité(p < 0,05).

Nos résultats sont en accord avec ceux de Pukalskas et al.[15] qui ont prouvé que l’extrait méthanolique de Marru-bium vulgare de Pologne s’est avéré pour montrer l’activitéantioxydante remarquable dans le balayage de radical DPPH(IC50 = 1,15 μg/ml).

D’après la Figure 4, on remarque aussi que les courbes ontla même allure qui implique la même interprétation. Plus onaugmente la concentration, plus l’activité antiradicalaireaugmente jusqu’à atteindre un palier. Au-delà de ce maxi-mum, l’activité reste constante.

Nous interprétons ce phénomène par le transfert de(s)électron(s) célibataire(s) qui sont localisés dans l’orbitaleexterne du DPPH, et après avoir atteint une concentration

Fig. 3. Activité antioxydante relative (AAR) des extraits de Marrubium vulgare et de l’α-tocophéroldans le système acide linoléique/β-carotène

Fig. 4. Activité antiradicalaire des extraits de Marrubium vulgare, la quercétine et l’acide ascorbique (chaque valeur représente la moyenne de trois essais ± ET)

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donnée, l’antioxydant va réagir complètement avec le radi-cal, et quand nous augmentons la concentration, l’activitéantioxydante reste constante puisque cela s’accompagnepar la saturation des couches électroniques du radical.

L’activité antiradicalaire de l’EEp (0,012 ± 0,66) pourraitêtre expliquée par la présence des terpénoïdes ayant étérévélée auparavant dans les tests préliminaires avec le mêmeextrait (voir les tests de criblage phytochimique). Plusieursauteurs ont rapporté que l’activité antioxydante de Marru-bium vulgare est due aux huiles essentielles qui ont unecapacité importante d’agir comme donateurs d’atomes d’hy-drogènes ou d’électrons, d’où la transformation réductive deDPPH • en DPPH-H, et par conséquent la formation de lacoloration jaune était attribuée à la présence de nombreusesmolécules bioactives telles que : les monoterpènes oxygénés,le mélange de mono- et ses quiterpènes hydrocarbures, β-citronellol, thujones, camphre, β-bisabolène et l’eugénol[11,14]. Ainsi, Kadri et al. [11] ont mentionné qu’uneconcentration de 300 μg/ml de l’hydrodistillat de Marru-bium vulgare donne une inhibition de 79,00 ± 3,00 % contreDPPH.

Par ailleurs, d’après la Figure 4, on constate aussi quel’EMeOH a un pouvoir antiradicalaire important (APR =15 ± 0,00) et proche à celui de la quercétine (APR = 16,74± 0,00), cela ne peut être expliqué que si on se réfère à lacomposition biochimique de Marrubium vulgare où ontrouve que l’espèce renferme également des phénylpropa-noïdes glycosylés (voir HPLC), qui sont des puissants anti-oxydants [4]. Les plus importants sont le forsythoside B (4)le ballotétroside (5), l’arénarioside (7) et l’actéoside (verbas-coside ou kusagénine) [8] (Fig. 5) [15,16,21].

Sahpaz et al. [16] ont pu isoler quatre phénylpropanoïdesà partir de l’extrait méthanolique deMarrubium peregrinumdont le forsythoside B, le ballotétroside et le verbascoside,des flavones dont la cosmosiine (apigénine-7-glycoside) etla ladanéine (5,6-dihydroxy-7,4’-diméthoxyflavone) puisévaluer leur activité antiradicalaire sur une solution métha-nolique de DPPH en utilisant le Trolox comme standard. Ilsont remarqué que les flavones testées montrent une certaineactivité, mais insuffisante pour qu’une IC50 puisse être éta-blie, en revanche tous les phénylpropanoïdes testés se sontrévélés très actifs [21].

Selon Sahpaz et al. et Wojdylo et al. [16,21], les groupe-ments ortho-diphénoliques des phénylpropanoïdes (Fig. 5)

leur confèrent une activité antioxydante bien supérieure àcelle des flavones. Cela peut être dû à un transfert de radicalentre les deux OH de façon intramoléculaire, qui permet uneforte stabilisation et évite un transfert intermoléculaire [16].

En outre, Marrubium vulgare contient un autre phénylpro-panoïde mais cette fois non glycosylé, il s’agit de : l’acide (+)(E)-caffeoyl-L-malique qui peut participer dans l’activité antira-dicalaire de la plante comme illustré sur la Figure 6 [16].

Conclusion

Les résultats de notre étude suggèrent l’importance de l’es-pèce du Marrubium vulgare d’Algérie pour l’usage dans lapharmacie et la phytothérapie. Si l’on se fonde sur cetteinformation, on pourrait conclure que cette plante est l’unedes sources naturelles de substances antioxydantes d’impor-tance élevée. L’analyse qualitative par la CCM et l’HPLC amontré la présence de l’acide gallique qui a été identifié pourla première fois comme nouveau composé des feuilles deMarrubium vulgare. La concentration la plus élevée descomposés phénoliques a été obtenue en utilisant des sol-vants de polarité croissante. L’extrait méthanolique a donnéla plus grande valeur en composés phénoliques et en flavo-noïdes. Le contenu élevé des composés phénoliques et lacorrélation linéaire significative entre les valeurs de laconcentration des composés phénoliques et l’activité anti-oxydante ont indiqué que ces composés contribuent à l’acti-vité antioxydante. Les résultats obtenus pour l’activité anti-microbienne sont négatifs, ils pourraient être expliqués parl’influence de plusieurs facteurs : structure des parois desbactéries, leur mobilité dans l’agar nutritif de la gélose, laconcentration des extraits, la nature et la structure des subs-tances actives dans les extraits, la méthode employée pourl’évaluation et la matrice biologique (les parties de la plante)qui font l’objet de l’étude.

Des études plus approfondies in vivo seraient nécessairesdans les années à venir pour mieux comprendre le méca-nisme d’action des molécules bioactives, leur dose thérapeu-tique ainsi que leur site d’action au niveau de la cellule. Celapermettrait de préparer des produits pharmaceutiques degrand intérêt thérapeutique.

Fig. 5. Structure chimique des phénylpropanoïdes glycosides de Marrubium vulgare et leur activité antioxydante [15,16]

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Conflit d’intérêt :

les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêt.

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Fig. 6. Activité antiradicalaire de l’acide (+) (E)-caffeoyl-L-malique par piégeage du DPPH [16]

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