Benoît Schubert

Biologie de la Reproduction

Autoconservation des gamètes

Pr Catherine PoirotAssistance Publique-Hôpitaux de ParisGroupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière

AUTOCONSERVATION

Gamètes matures Spermatozoïdes Ovocytes

Tissus gonadiques Ovaire Testicule

Préserver la fertilité

chez l’homme

Historique

1776 - Spallanzani

1940 - Cryoprotecteur/ glycérol

1953 - Grossesse avec sperme congelé

1973 - CECOS en France (G. David)

et - Centres d’AMP intra conjugale

Techniques

Milieux de congélation Glycérol

Agent cryoprotecteur pénétrant Toxique pour la cellule

Contact à basse température

Durée de contact limitée

Ajout en 4 étapes (moins délétère qu’en 1 fois)

Mise en paillettes Extrémités soudés

Techniques

Congélation cristallisation de l’eau extra-cellulaire Concentration relative des solutés augmente Déshydratation du spermatozoïde

Décongélation Retrait du CP en plusieurs étapes Concentration relative des solutés diminue

(milieu hypo-osmotique) Entrée d’eau dans le spermatozoïde Puis sortie du Glycérol Retour à un volume cellulaire normal

Techniques

Congélation ‘lente’: en azote liquide manuelle

Vapeurs d’azote : 8-30 minutes Plonge dans azote liquide

Appareils programmables Descente en température contrôlée

5°C/minute - 10°C 10°C/minute - 25°C 25°C/minute - 150°C

Décongélation rapide -196°C 37°C (en qq minutes)

Effets de la congélation sur les spermatozoïdes

Mobilité : variable, environ 50% Vitalité : variable, environ 50% Membrane :

Gonflements Membrane plasmique Gonflement acrosome perte acrosome

Modification de la composition phospholipidique

Noyau Chromosomes: pas de modification nb, structure, sex ratio Etat de sur-condensation de la chromatine

INDICATIONS

TRAITEMENTS A RISQUES

Chirurgie à risque Pathologies à risque Vasectomie Dégradation caract.

spermatiques Situation à risque …

Cryptozoospermie Spz chirurgicaux Spz médicaux Spz après chirurgie Spz contexte viral …

PREVENTION AMP

L’autoconservation doit être « systématiquement proposée » avant une « thérapeutique ou intervention potentiellement stérilisante »Et peut être proposée « avant ou au cours d’une AMP »

Arrêté du 12/1/1999

0

500

1000

1500

2000

2500

ho

mm

es p

rése

nté

s

Avant Traitement (27182)

Avant vasectomie (7904)

AMP (9618)

Spz chirurgicaux (2662)

FEDERATION DES CECOS : 30 ans d’autoconservation

346

236

884

417

323

124208

1110

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1992 1994 1996 1998 2000 2002

Hodgkin

cancertesticulaire

autrescancers

affectionsnoncancéreuses

FEDERATION DES CECOS : autoconservation maladie

40

50

60

70

80

90

100

110

1983

1985

1987

1989

1991

1993

1995

1997

1999

2001

Pourcentage d’hommes pour lequel la congélation a pu être réalisée

Avant traitement

Avant vasectomie

%

91%91%

97%97%

65%65%

92%92%

Patient Information autoconservation Accueil du patient personnalisé Consultation avec médecin biologiste Méthodes

Masturbation Recherche spermatozoïdes dans les urines

Urgence du traitement : permanence de l’accueil Information des résultats de la congélation

« Le patient doit être informé de la qualité du sperme et du nombre de paillettes » Arrêté du 12/1/1999

Techniques : rares spermatozoïdes

• Mise en paillettes classiques‘haute sécurité’

• Micro-gouttesGuthauser et al., Andrologie 2002

Intérêts : augmenter le nombre de « doses », faciliter la recherche des spermatozoïdes prêts à l’emploi

SPZ

Sécurité

Identité Traçabilité Consentement Interrogation annuelle‘Renouvelable sur demande

écrite’ Utilisation Résultats Destruction « Seul le déposant peut

demander la restitution ou la destruction »

Sérologies HIV, VHB, VHC, Syphilis

Paillette ‘haute sécurité’ Cuve de quarantaine Cuves spécifiques Accès locaux Sécurité azote

Patient Générale

Problèmes Age

Limites supérieures Limites inférieures

Puberté, possibilités de masturbation

Maladie de l’homme Urgence Etat du patient

Indications autres Vasectomies Professions Sportifs

Information Patients et médecins

Perspectives

Optimisation des méthodes de congélation

Tissu gonadiques

Meilleure information sur l’autoconservation

•…. Lyophilisation du spermatozoïde !!!Wakayama T. Yanagimachi R., Nature Biotechnology 1998

Préserver la fertilité

chez le garçon prépubère

Introduction

Enfant : préservation de la fertilité A partir de 13-14 ans : spermatozoïdes Avant 13-14 ans

Pas de spermatozoïdes éjaculés Cellules souches germinales mâles : spermatogonies

Testicule Spermatogonies

Pool de réserve : régénération

spermatozoïdes : à partir de la puberté

Préserver la fertilité : spermatogonies

Stratégie de Préservation de la Fertilité des garçons prépubères

Avant le début du traitement stérilisant Prélèvement de spermatogonies

Conservation spermatogonies : congélation

Après guérison Greffe Culture Xénogreffe ? Recherche

Préserver la fertilité des garçons : Espoirs

Geens et al., 2008

Questions

Quel volume de tissu à prélever ? Un testicule entier Fragments de testicule

Quel tissu conserver ? Fragments de tissu Suspension cellulaire

Quel protocole de congélation ?

Questions

Contamination cellules malignes Tri cellules malignes/testiculaires

0,4% cellules malignes Seuil inconnu chez l’homme

Contenu en spermatogonies Faible : 3/10 000 cellules germinales (souris) Enrichissement ?

Effets des traitements sur le testicule

Utilisation

Tissu FRAIS : Allogreffe

Injection spermatogonies dans tubules séminifères, rete testis, canaux efférents, …

Production de spermatozoïdes Chez différentes espèces dont primates

Résultats chez la souris Production de spermatozoïdes Naissances

Xénogreffe Tissu humain prépubère frais souris nude (s/c)

4 et 9 mois après greffe : « qq spermatogonies survivantes » (Goossens et al., 2008)

Utilisation

Tissu CONGELE Survie cellulaire (souris, lapin, humain, …) Xénogreffe sous cutané

production de spz (souris) Survie spermatogonies (humain)

Culture Souris

Multiplication des spermatogonies obtention de spermatozoïdes

Peu de résultats dans d’autres espèces

Autoconservations Spermatogonies

Radford et al., 1999 : 11 hommes Bahadur et al., 2000 : 2 garçons (8 et 13 ans) Keros et al., 2005 : 16 hommes Kvist et al., 2006 : 8 garçons (1 à 5 ans 1/2) Keros et al., 2007 : 5 garçons (2 à 14 ans)

France : 3 centres (+ 20 patients)

En pratique

Préservation de la fertilité chez jeune garçon

Conservation de cellules souches spermatogonies

Utilisation A déterminer Dans 20 ans

En pratique

Indications

Multidisciplinarité

Consentements (parents)

Technique expérimentale

Préserver la fertilité

chez la femme

Mise en péril du stock folliculaire Stock de follicules :

Pas de renouvellement 6.106 (intra-utérin) 1.106 (naissance) 0,5.106 (puberté) ……99% des follicules : atrésie

Temps

Chimiothérapie (Alkylants+++) / Radiothérapie Greffe médullaire : chimio+radio ménopause 92% des cas

(Meirow et al., 2001)

Pathologies malignes : Femmes : K sein, K invasifs du col, leucémies, … Enfance : leucémie, neurob., LH, ostéosarc., sarc.d'Ewing, LNH

Ovariectomie totale ou partielle :Endométriose, kystes bénins récurrents, tumeur

Ménopause précoce prévisible :X (Turner, délétion, inversion), génétiques, …

Préserver la fertilité féminine aujourd'hui

Sans gamètes de la patiente : Don ovocytes Accueil d'embryons Adoption

Avec gamètes de la patiente : Transposition ovarienne Traitement aux analogues du GnRH Congélation d'ovocytes : matures ou immatures FIV embryons, congelés transférés après guérison Cryoconservation du tissu ovarien

Combiner plusieurs solutions

CONGELATION D’OVOCYTES

Congélation d’ovocytes Stimulation de l’ovulation : temps, traitement hormonal Pas de conjoint pas de désir d’enfants immédiat

Ovocyte : cellule particulière, différente de l’embryon volumineux cytoplasme membrane plasmique

protocole de congélation particulier

Congélation lente Vitrification

Effets de la congélation/décongélation: Dégranulation prématurée des granules corticaux durcissement de

la Z.P. Dépolymérisation du réseau de tubuline du fuseau méiotique et

repolymérisation aneuploidies, polyploidies ? Incubation de quelques heures pour permettre repolymérisation

Congélation d’ovocytes

Résultats Congélation lente

1ère grossesse : Chen et al., 1986 532 enfants nés (1986-2008)

Implantation/100ovocytes décongelés : 2,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 2,3-2,2 (Oktay et al., 2006;2008)

Vitrification 392 enfants nés (1986-2008)

Implantation/100ovocytes décongelés : 6,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 4,5-5,8 (Oktay et al., 2006;2008)

Vitrification Technique prometteuse en évaluation

LA FECONDATION IN VITRO

La F.I.V.

Stimulation de l’ovulation Temps Traitement hormonal

Conjoint

Désir d’enfants précipité ?

LA CRYOCONSERVATION DE TISSU OVARIEN

La cryoconservation du tissu ovarien

Pas de stimulation de l’ovulation Pas de conjoint Désir d’enfants différé

Femme < 35 ans Enfant Prélèvement per coelioscopique :

Selon le risque estimé de castration : 1 ovaire entier ou ½ ovaire

Transport au laboratoire dans l’heure

La cryoconservation du tissu ovarien

Garde cortex ovarien uniquement: réserve folliculaire 1-2 mm épaisseur Médullaire ôtée

Découpe en bandelettes (5 x 10 mm) Conservation :

Milieu cryoprotecteur (PROH, sucrose, …) Cryotubes Descente en température

contrôlée -196°C

Utilisation du tissu ovarien congelé

Seuls les follicules primordiaux et primaires résistent à la congélation

Maturation : GREFFE

Autogreffe : Orthotopique, pelvienne : restauration de la fertilité naturelle Hétérotopique : sous cutané, intra-musculaire , … : FIV

Xénogreffe : Souris immunodéprimées (nude, SCID, …)

CULTURE IN VITRO COMBINAISON greffe/culture in vitro ?

Greffe de tissu ovarien congelé/décongelé

Autogreffe : Avantages

"Simple" de réalisation Revascularisation ‘spontanée’ Succès chez animal et l’humain

Inconvénients : Risque de transmission de cellules cancéreuses Destruction folliculaire

Congélation/décongélation (survie 10 à 70%) Ischémie post greffe (+++)

September 24, 2004

5 naissances rapportées à ce jour Donnez et al., 2004 Meirow et al., 2005 Demeestere et al., 2007 Andersen et al., 2008 Silber et al., 2008

Résultats

Culture in vitro Avantages :

Zone pellucide : exclue toute cellule, métastatique

Techniques : plusieurs étapes Fragments de cortex ovarien : initiation de croissance

( follicule préantral) Isole le follicule du cortex ( follicule antral) Isole l'ovocyte ‘immature’ (follicule > 2 mm) maturation

finale

Culture in vitro Résultats :

Follicule primordial ovocyte mature :Une espèce : Souris Eppig and O'Brien, 1996 : 1 souris vivante

décès prématuré troubles neurologiques et hépatiques, obésité

O’Brien et al., 2003 : 48 souriceaux vivants en bonne santé

Femme : Follicule primordial secondaire (2 semaines !) Follicule secondaire antral Follicule antral ovocyte mature fécondable Maturation in vitro : 1ère naissance : Veeck et al., 1983

Association xénogreffe puis culture in vitro ?

Copyright restrictions may apply.

Telfer, E. E. et al. Hum. Reprod. 2008 23:1151-1158; doi:10.1093/humrep/den070

Histological sections of in vitro grown human follicles cultured first in cortical strips for 6 days (Step 1) then subsequently isolated at the pre-antral stage and cultured for a further 4 days (step 2) in the presence (A and B) or absence (C and D) of 100 ng/ml of activin A. TISSU FRAIS

Préserver la fertilité féminine ?

BALANCE: Altération de la fertilité par le traitement

Altération de la fertilité par le prélèvement d’ovaire (ovariectomie unilatérale ne divise pas le stock par deux)

Conjoint ? Désir d’enfants ?

Associer les différentes techniques Congélation cortex ovarien Congélation ovocytes immatures (follicules antraux)

Enfant : information aux parents